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WO2013089252A1 - ヘルパーｔ細胞誘導性ポリペプチドの改変 - Google Patents

ヘルパーｔ細胞誘導性ポリペプチドの改変 Download PDF

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WO2013089252A1
WO2013089252A1 PCT/JP2012/082573 JP2012082573W WO2013089252A1 WO 2013089252 A1 WO2013089252 A1 WO 2013089252A1 JP 2012082573 W JP2012082573 W JP 2012082573W WO 2013089252 A1 WO2013089252 A1 WO 2013089252A1
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amino acid
cells
peptide
single bond
pro
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PCT/JP2012/082573
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French (fr)
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恵子 宇高
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Kochi University NUC
Original Assignee
Kochi University NUC
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Publication date
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    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification

Definitions

  • the present invention relates to a variant of a helper T cell (Th) -inducible polypeptide, an antitumor agent containing the variant, and the like.
  • Th helper T cell
  • CD8 + cytotoxic T lymphocytes play a major role as effectors that kill tumor cells.
  • Th helper T
  • Th1 type Th cells are essential for efficient anti-tumor immunity activity induction.
  • APCs antigen-presenting cells
  • NPC 5 antigen-presenting cells
  • Non-patent Documents 8 and 9 Anti-apoptotic effect on CTLs and APCs (Non-patent Documents 8 and 9) ), Functions to help proliferation of memory CD8 T cells and maintenance and expansion of the peripheral pool (Non-Patent Documents 10 and 11), induction of CTL infiltration into tumor tissues (Non-Patent Documents 12 and 13), and the like are known.
  • Non-Patent Document 14 Particularly in anti-tumor immunity, since the target antigen is a tumor antigen that naturally occurs in the body of the subject, the immune system regards the tumor antigen as its own component and usually does not easily cause an aggressive response.
  • T cells that recognize and react strongly with self-antigens die before they become immature, and remain as self-antigens.
  • T cells that react moderately or weakly are also in a functionally suppressed state.
  • Treg is induced by inadvertently administering a tumor antigen, and it is highly possible to suppress the immune response against the tumor.
  • the inventor used a non-tumor antigen pertussis vaccine as an adjuvant to HLA class I binding tumor antigen polypeptide that induces CTL as a third party antigen, Bordetella pertussis.
  • Patent Document 1 It has succeeded in inducing anti-tumor immunity by a method of inducing Th cells against the tumor cells and causing them to grow tumor antigen-specific CTLs. Particularly, since the pertussis whole cell vaccine is used in the method, Th1-type Th cells having high CTL-inducing activity can be efficiently induced. However, as for the induction of tumor antigen-specific Th1 cells, there is a problem of regulatory T cells as described above, and there is no reliable induction method at present.
  • An object of the present invention is to provide a variant of a tumor antigen-specific Th-inducible polypeptide and to provide an antitumor agent using the same.
  • the conventional immunization method that induces CTLs by immunizing with MHC (Major Histocompatibility Complex) class I-binding peptide does not provide sufficient antitumor activity.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • the inventor has realized that even if CTLs are present, it is a major problem that they do not fully penetrate the tumor tissue. Therefore, we studied the mechanism of tumor-specific T cells invading tumor tissue. When solid tumors degenerate in vivo, not only CTL but also Th cell infiltration was commonly observed in tumor tissues. I noticed that This point is common to past reports. Usually, T cells (Th and CTL) ride on blood and travel around the entire body, so they are blocked by vascular endothelial cells and are not in direct contact with tumor tissue.
  • the inventor captures tumor-specific Th cells in tumor tissue by capturing apoptotic tumor cells in the vicinity of vascular endothelial cells and presenting a tumor antigen-derived polypeptide on MHC class II of the vascular endothelial cells. I found out for the first time. Furthermore, the expression of chemokines I-TAC, IP-10, and Mig is induced in vascular endothelial cells by IFN- ⁇ secreted by Th that has invaded the tumor tissue. It was observed that CTLs that highly express CXCR-3, which is a receptor for sex chemokines, were promoted to infiltrate tumors, and as a result, solid tumors degenerated.
  • the tumor-specific Th cells are Th1-type Th. From this discovery, it has become obvious that the development of a method for efficiently inducing tumor antigen-specific Th cells is a key technology for developing an immunization method for degenerating solid tumors. Therefore, in this case, attention has been focused on adding a modification that imparts digestion resistance to enzymes that degrade these polypeptides to MHC class II-binding polypeptides that induce Th. As a result, the Th induction efficiency can be increased several hundred times as described later.
  • Th induction efficiency can be dramatically increased by adding the modification to the polypeptide according to the recognition efficiency of the MHC class II-binding polypeptide of the Th cell.
  • the present invention [1] A variant of an isolated polypeptide that is derived from a tumor-specific antigen and binds to an MHC class II molecule; [2] The variant according to [1], wherein the modification is addition of several amino acids to the C-terminal side and / or the N-terminal side of the isolated polypeptide; [3] The amino acid added to the C-terminal side of the isolated polypeptide is represented by the following formula (I): X1-X2-X3-X4 (I) (Where (1) X1 represents biotinylated Lys, X2 represents several amino acids or single bonds, X3 represents one amino acid or single bond, and X4 represents one amino acid or carboxyl group (provided that X3 is Pro) X4 represents one amino acid) (2) X1 represents one amino acid or single bond excluding biotinylated Lys, X2 represents several amino acids or single bonds, X3 represents Pro, X4 represents one amino acid, or (3) X1 represents biotin
  • a composition comprising an isolated polypeptide that binds to an MHC class I molecule and an adjuvant; [18] Use of the variant according to any one of [1] to [10] or the isolated polypeptide according to [11] for producing an antitumor agent; [19] The subject-derived antigen-presenting cell population and the variant according to any one of [1] to [10] are cultured, and the subject confirms the binding between the antigen-presenting cell population and the variant.
  • a method for examining whether or not an MHC class II molecule binds to an isolated polypeptide contained in the body [20] An antigen-presenting cell that expresses a specific MHC class II molecule and an arbitrary peptide modified at the N-terminus and / or C-terminus are cultured, and the binding of the antigen-presenting cell to the peptide is confirmed. A method for examining whether or not the peptide can bind to a cell; Etc.
  • tumor-specific antigens can be presented on MHC class II molecules of antigen-presenting cells significantly more efficiently than before, and more efficiently.
  • Tumor antigen-specific Th cells can be induced.
  • tumor antigen-specific Th cells can be infiltrated into the tumor tissue.
  • the CTL can infiltrate the tumor tissue and kill the tumor cells.
  • the upper row is a graph showing the number of infiltrating solid tumors (EL4 tumor and E.G7 (EL4 expressing OVA gene) tumor) with PKH-labeled DO11.10.
  • the lower row shows the number of PKH positive cells in the spleen.
  • KO is an MHC class II (IA ⁇ b ) KO mouse;
  • KO ⁇ F1 is a mouse in which the bone marrow of an MHC class II KO mouse is transplanted into a CBF1 mouse;
  • F1 ⁇ KO is an opposite bone marrow chimeric mouse .
  • EL4 is an EL4 tumor transplanted in each immunized mouse; EG7 is an EG7 tumor transplanted into the same mouse; OVA-I is a CTL-inducing peptide; OVA-II is a Th-inducing peptide; ⁇ is a third party Antigen peptide is shown.
  • FIG. 3 is a graph showing the number of PKH-labeled OT-1 cells infiltrating into a G7-OVA (EG7) tumor.
  • CXCR3 - is CXCR3 gene deficient CTL; IFN- ⁇ - shows the IFN-gamma gene-deficient Th cells.
  • FIG. 6 shows growth of DO11.10 cells with each biotinylated or non-biotinylated OVII variant. It is a figure which shows the digestive tolerance of each modified variant of OVII with respect to serum peptidase. a. -D. Mouse serum as serum, e. Then, human serum as serum, f. Then, the MCC peptide was used in place of the OVII peptide in the core peptide portion.
  • FIG. 3 is a graph showing the ratio of IFN- ⁇ positive Th cells by in vivo immunization using a modified WA36. It is a figure which shows the in vitro induction activity of W332 reactive Th cell in the human peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) which has HLA-DR15 using the modification of W332. Intracellular IFN ⁇ staining and CD4 staining were performed and analyzed by a flow cytometer, and the ratio of intracellular IFN ⁇ positive cells in CD4 positive cells is shown.
  • B It is a graph which shows the average value of the growth curve of the tumor which each five mice
  • C A graph showing a tumor growth curve of FBL3 erythroleukemia cells inoculated into CBF1 mice immunized only with an adjuvant pertussis whole cell vaccine (Bordetella pertussis whole cell vaccine: Wc).
  • D is a graph showing the growth curve of FBL3 tumor in mice immunized with W332 peptide that induces Wc and WT1 tumor antigen-specific Th cells.
  • E is a graph showing the growth curve of FBL3 tumor in mice immunized with Db126 peptide that induces CTL recognizing Wc and WT1 tumor antigens.
  • F FBL3 tumor growth curve in mice immunized with both Wc, W332 and Db126.
  • Figure 3 shows a binding competition test of the binding activity of peptides to MHC class II molecules on live antigen presenting cells. It is a figure which shows the binding competition test of the peptide binding activity to the HLA-DR4 molecule
  • the present inventor has recognized for the first time that tumor-specific Th cells migrate to tumor tissue by recognizing tumor-specific antigen-derived polypeptides presented on MHC class II molecules of vascular endothelial cells.
  • the antigen-presenting cells APCs
  • the APCs take up and digest the tumor-specific antigen protein under physiological conditions. It needs to be presented to cellular HLA class II molecules. It is also possible to bypass this digestion step and add the synthetic peptide directly to the APC to present it to the HLA class II molecule.
  • the present invention provides an isolated polypeptide (hereinafter referred to as a polypeptide that is derived from a tumor-specific antigen and binds to an MHC class II molecule).
  • a modified form (which may be referred to as an antigenic peptide of the present invention) (sometimes referred to as a modified form of the present invention).
  • the peptide or protein has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation.
  • tumor refers to solid malignant tumors such as digestive organ cancer including kidney cancer, lung cancer, esophageal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, brain tumor, head and neck tumor, and sarcoma. Or a leukemia or a hematological malignancy is mentioned, Among these, the tumor which expresses a tumor specific antigen is mentioned preferably. These tumors may be staged tumors.
  • a tumor-specific antigen is not only expressed in normal tissue or normal cells, but is expressed not only in an antigen that is expressed in tumor tissue or tumor cells, but also in the normal expression level in tumor tissue or tumor cells. An antigen that is significantly higher than the expression level of the tissue or normal cells may also be included.
  • tumor-specific antigens examples include proteins (peptides) having an activity of inducing immune responses such as antibody production and cellular immunity. Among them, cytotoxic T lymphocytes (CTL) are used. Tumor-specific antigens that allow the processed and fragmented polypeptides to be recognized by MHC class II molecules are more preferred to induce stimulating T cells (Th1 cells).
  • An isolated polypeptide derived from a tumor-specific antigen and that binds to an MHC class II molecule is about 7-20 amino acids long, more preferably about 9-17 amino acids long, more preferably 9-15 amino acids long A long one is used.
  • tumor-specific antigens that are recognized by the MHC class II molecule after being processed include WT1 (Wilms' tumor-1), PSA (prostate specific antigen), MAGE-3, CEA, survivin, and tyrosinase.
  • WT1 is preferred.
  • another tumor-specific antigen recognized by the MHC class II molecule may be a protein derived from a virus that causes the tumor by infecting mammals including humans.
  • antigens include proteins derived from virus groups that are strongly associated with the development of malignant tumors, such as those derived from virus groups that are strongly associated with the development of malignant tumors such as hepatitis C virus and EB virus.
  • the polypeptide specific to a tumor-specific antigen may be a full-length protein, but may be a partial peptide as long as it has immunogenicity as an antigen.
  • a tumor-specific antigen specifically, in the case of WT1, those described in WO00 / 06602, WO00 / 26249, WO2006 / 030770 and the like can be preferably used. More specifically, examples of the polypeptide derived from the WT1 antigen include W332 (KRYFKLSHLQMHSRKH; SEQ ID NO: 1), WA36 (PVLDFAPPGASAYGS; SEQ ID NO: 2) and the like.
  • PSA 221-240 (GVLQGITSWGSEPCALPERP; SEQ ID NO: 3), MAGE-3 derived polypeptide 243-258 (KKLLTQHFVQENLYLEY; SEQ ID NO: 4), CEA derived polypeptide 321-333 (LWWVNNQSLPVSP; SEQ ID NO: 5), 653-667 (YACFVSNLATGRNNS; SEQ ID NO: 6), 97-111 (TLGEFLKLDRERAKN; SEQ ID NO: 7) as a survivin-derived polypeptide, 175-185 (EIWRDIDFAHE; sequence as a Tyrosinase-derived polypeptide) No.
  • hepatitis C virus peptide a sequence number described in WO 2005/105993 etc. 184 amino acids number 789-797 (ALYGVWPLL; SEQ ID NO: 9) and amino acid number 111-130 (DPRRRSRNLGKVIDTFTCGL; SEQ ID NO: 10), amino acid numbers 161-180 (SVNYATGNLPGCSFSIFLLA; SEQ ID NO: 11) may be used preferably.
  • LMP-1 159-175 YLQQNWWTLLVDLLWLL; SEQ ID NO: 12
  • SEQ ID NO: 12 can be preferably used as the EB virus peptide.
  • the variant of the present invention is an MHC class II molecular binding modified so that it is not degraded or hardly degraded by a protein (peptide) degrading enzyme when the antigen peptide of the present invention is administered in vivo or added in vitro.
  • Sex isolated polypeptide examples include angiotensin I converting enzyme (ACE), dipeptidyl peptidase IV (DPPIV; CD26), aminopeptidase N (CD13), aminopeptidase P and the like.
  • ACE has the activity of releasing a dipeptide from the C-terminus of the peptide chain, but cannot release a dipeptide consisting of Pro-X.
  • DPPIV has an activity of releasing a dipeptide (X-Pro) containing a proline residue from a peptide having a proline residue second from the N-terminus of the peptide chain.
  • CD13 has the activity of releasing amino acids from the N-terminus of the peptide chain, but cannot cleave X-Pro.
  • Aminopeptidase P has an activity of releasing amino acids from the N-terminus of the peptide chain and also cleaves X-Pro.
  • the modification applied to the antigenic peptide of the present invention is that the modified substance is resistant to proteolytic (peptide) degrading enzymes and is presented as an antigen by an MHC class II molecule.
  • the complex of the antigen peptide of the invention is recognized by the TCR of the Th cell, there is no particular limitation.
  • deletion of several amino acids from the antigen peptide of the present invention several to the antigen peptide of the present invention
  • Addition of several amino acids to the antigenic peptide of the present invention substitution of several amino acids of the antigenic peptide of the present invention with other amino acids, or combinations thereof
  • substitution of several amino acids of the antigenic peptide of the present invention with other amino acids, or combinations thereof.
  • the term “several” means one or more (about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids.
  • the amino acids to be added, inserted or substituted include 20 kinds of natural amino acids (Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Arg, Lys, Glu, Gln, Asp, Asn, Cys, Met, His, Pro, Phe, Tyr, Thr, Ser, Trp) or modified or unnatural amino acids (eg, biotinylated amino acids (eg, biotinylated Lys (Lys Lys) in which biotin is covalently bonded to the ⁇ -amino group, N ⁇ -biotinylated amino acid, acetylated amino acid (amino acid in which the N-terminal amino group is acetylated), 2-aminoadipic acid, 3-aminoadipic acid , ⁇ -Ala, 2-aminobutyric acid, 4-aminobutyric acid, 6-aminocaproic acid, 2-a
  • ⁇ -amino acids for example, ⁇ -Ala
  • ⁇ -amino acids may be hydrophobic or hydrophilic, but are hydrophilic amino acids.
  • the hydrophobic amino acid means Ile, Leu, Val, Ala, Phe, Pro, Met, Trp, Tyr and Gly
  • the basic amino acid means Arg, Lys and His, and is acidic.
  • the amino acid means Asp and Glu
  • the hydrophilic neutral amino acid means Asn, Gln, Ser, Thr and Cys.
  • the ⁇ -amino acid may be L-form or D-form, and both may be mixed, but is preferably L-form, and when an amino acid is added to an antigenic peptide
  • the position of addition is not particularly limited as long as it is resistant to degradation by a peptide degrading enzyme and is presented as an antigen by an MHC class II molecule, but is usually N-terminal and / or C of the antigenic peptide of the present invention. It is a terminal.
  • the several amino acids (peptides) to be added may be linear peptides or branched (dendrimer type) peptides.
  • a branched chain is formed by linking the amino group to a carboxyl group of another amino acid or peptide. can do.
  • the modified product of the present invention contains an amino acid having a carboxyl group in the side chain such as Glu or Asp
  • a branched chain is formed by binding the carboxyl group to an amino group of another amino acid or peptide. can do.
  • Cys a branched chain can also be formed through a disulfide bond with another Cys or a peptide containing the same.
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the antigenic peptide of the present invention is as described above, but preferably the following formula (I): X1-X2-X3-X4 (I) (Where (1) X1 represents biotinylated Lys, X2 represents several amino acids or single bonds, X3 represents one amino acid or single bond, and X4 represents one amino acid or carboxyl group (provided that X3 is Pro) X4 represents one amino acid) (2) X1 represents one amino acid or single bond excluding biotinylated Lys, X2 represents several amino acids or single bonds, X3 represents Pro, X4 represents one amino acid, or (3) X1 represents biotin 1 amino acid or single bond excluding lysylated Lys, X2 is several amino acids or single bonds, X3 is one amino acid or single bond excluding Pro, and X4 is ⁇ -Ala) Is an amino acid sequence represented by Note that in this specification, Xn is a single bond
  • X1 is biosylated Lys
  • X2 is a single bond
  • X3 is Pro
  • X4 is ⁇ -Ala.
  • the amino acid sequence is biosylated Lys-Pro- ⁇ -Expressed as the amino acid sequence of Ala.
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the antigenic peptide of the present invention is represented by the formula (I): (1) X1 is biosylated Lys, X2 is one amino acid or single bond, X3 is one amino acid or single bond, X4 is one amino acid or carboxyl group (provided that when X3 is Pro, X4 Is one amino acid), or (2) X1 is a single bond, X2 is a single bond, X3 is Pro, X4 is one amino acid, Is an amino acid sequence represented by
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the antigenic peptide of the present invention is represented by the formula (I):
  • X1 is biosylated Lys
  • X2 is a single bond
  • X3 is a single bond
  • X4 is a Gly or carboxyl group
  • X1 is a single bond
  • X2 is a single bond
  • X3 is Pro
  • X4 is Ala or ⁇ -Ala
  • X1 is biosylated Lys
  • X2 is a single bond
  • X3 Pro
  • X4 is ⁇ -Ala
  • the amino acid sequence represented by etc. is mentioned.
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the antigenic peptide of the present invention is, in formula (I), X1 is biosylated Lys, X2 is a single bond, X3 is Pro, and X4 is ⁇ -Ala. Is an amino acid sequence represented by
  • the amino acid that may be added to the N-terminal side of the antigenic peptide of the present invention is as described above, but preferably the following formula (II): Y1-Y2-Y3 (II) (Where (1) Y1 is Pro, Y2 is several amino acids or single bonds, Y3 is one amino acid or single bond, or (2) Y1 is one amino acid or amino group excluding Pro, Y2 is several Amino acid or single bond, Y3 represents biosylated Lys) (Except for the amino acid sequence in which the second amino acid from the N-terminal is Pro).
  • Yn being a single bond is the same as the case where Xn is a single bond.
  • the amino acid that may be added to the N-terminal side of the antigenic peptide of the present invention is represented by the formula (II): (1) Y1 is Pro, Y2 is one amino acid or single bond, Y3 is one amino acid or single bond, or (2) Y1 is one amino acid or amino group excluding Pro, Y2 is one amino acid Or single bond, Y3 is biosylated Lys (Except for the amino acid sequence in which the second amino acid from the N-terminal is Pro).
  • the amino acid that may be added to the N-terminal side of the antigenic peptide of the present invention is represented by the formula (II): Y1 is Pro, Y2 is Ser, Y3 is a single bond, Y1 is an amino group, Y2 is Ser, Y3 is biosylated Lys, or Y1 is Pro, Y2 is Ser, Y3 is biotinylated Lys Is an amino acid sequence represented by Most preferably, the amino acid that may be added to the N-terminal side of the antigen peptide of the present invention is an amino acid sequence represented by Formula (II), wherein Y1 is Pro, Y2 is Ser, and Y3 is biosylated Lys. is there.
  • variant of the present invention is obtained by adding the above amino acid sequence to the N-terminus and / or C-terminus of the antigen peptide (W332, WA36) derived from the WT1 antigen, for example. It is what Specifically, an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 40 is exemplified as a variant of the present invention.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁇ ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
  • R in the ester for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; 14 aralkyl group; pivaloyloxymethyl group and the like are used.
  • the modified substance of the present invention has a carboxyl group (or a carboxylate) other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue eg, methionine residue
  • has a protecting group eg, C 1-6 alkanoyl such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group).
  • a group protected by an acyl group, biotinylation, etc., an N-terminal glutamine residue produced by cleavage in vivo is pyroglutamine oxidized
  • a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule for example, ⁇ OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.
  • suitable protecting groups for example, C 1-6 acyl groups such as C 1-6 alkanoyl groups such as formyl group, acetyl group, etc.
  • protected polypeptides or complex polypeptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
  • the modified form of the present invention may be a free form or a salt form.
  • the salt of the modified substance of the present invention include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid.
  • the variant of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the intended modified form can be produced by removing the protecting group.
  • the condensation and the removal of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the methods described in the following (i) to (v).
  • the thus obtained variant can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the modified form obtained by the above method is a free form
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the modified form is obtained as a salt.
  • the salt can be converted to a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • resins for protein synthesis can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl.
  • an amino acid in which the ⁇ -amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target modification according to various known condensation methods.
  • the modified product of the present invention is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired modified product of the present invention.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • carbodiimides include DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, and the like.
  • a protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric acid anhydride, HOBt ester or HOBt ester. Can then be added to the resin.
  • a racemization inhibitor for example, HOBt, HOBt
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide, etc.
  • Examples include sulfoxides, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for protein bond forming reactions, and is usually selected appropriately from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl—Z, Br—Z, adamantyloxycarbonyl, and trifluoroacetyl. Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc, and the like.
  • the carboxyl group may be, for example, alkyl esterified (eg, linear, branched or cyclic alkyl ester such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl).
  • alkyl esterified eg, linear, branched or cyclic alkyl ester such as methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl.
  • Aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification eg, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxy It can be protected by carbonyl hydrazation, trityl hydrazation or the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups suitable for esterification include groups derived from carbonic acid such as lower alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups.
  • groups suitable for etherification include benzyl group, tetrahydropyranyl group, t-butyl group and the like.
  • protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoro.
  • Acid treatment with romethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • Examples of the activated carboxyl group of the raw material include the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and HOBt).
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and HOBt).
  • alcohol eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, And esters thereof with cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and HOBt.
  • a modified amide for example, first, the ⁇ -carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid is protected by amidation, and then the peptide (protein) chain is extended to the desired chain length on the amino group side. Thereafter, a protein or the like from which only the protecting group of the ⁇ -amino group at the N-terminal of the peptide chain was removed and a protein or the like from which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminal was removed were prepared. In a mixed solvent. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected variant obtained by condensation, all the protecting groups can be removed by the above method to obtain the desired variant.
  • This variant can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain the desired variant amide.
  • the ⁇ -carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired modified ester is obtained in the same manner as the modified amide. You can get a body.
  • the variant thus obtained has MHC class II molecular binding properties according to the method described in Examples below, but other known methods can also be used.
  • the variant of the present invention is resistant to degradation by a protein (peptide) degrading enzyme, and can efficiently present the variant (or antigen peptide) to antigen-presenting cells. Accordingly, the present invention also provides an anti-tumor agent comprising an isolated variant of a polypeptide (a variant of the present invention) that is derived from a tumor-specific antigen and binds to an MHC class II molecule.
  • the tumor to be treated with the antitumor agent of the present invention is a tumor that expresses the antigenic peptide of the present invention contained in the antitumor agent.
  • a tumor include kidney cancer, Examples include lung cancer, digestive organ cancer including esophageal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, brain tumor, head and neck tumor, sarcoma and other solid malignant tumors or leukemia and hematological malignancies.
  • the animals to which the antitumor agent of the present invention is applied are mammals having an immune mechanism, that is, mammals other than humans and humans.
  • mammals other than humans include monkeys, cows, horses, pigs, sheep, rabbits. Dogs, cats, mice, rats, hamsters and guinea pigs. Among these, humans are preferably applied.
  • the antitumor agent containing the modified substance of the present invention has low toxicity, and is orally or transmucosally (instillation, spraying to the nasal mucosa) as a solution or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form. , Aerosol inhalation, etc.), transdermally, or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, etc.).
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the modified substance of the present invention and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient, surfactant and the like.
  • Such pharmaceutical compositions are provided as dosage forms suitable for oral, transmucosal, transdermal, or parenteral administration. Moreover, in order to provide release property, you may adsorb
  • injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • the modified product of the present invention can be prepared by dissolving, suspending or emulsifying in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injection.
  • an aqueous solution for injection for example, an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) additive of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier and excipient for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a dosage unit form suitable for the dose of the active ingredient.
  • Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • As the content of the modified substance it is preferable that usually 1 to 3 mg of the modified substance is contained per dosage unit dosage form.
  • the antitumor agent containing the modified form of the present invention varies depending on the administration subject, the target cancer type, symptoms, administration route, etc.
  • the modified form of the present invention is used as a single dose.
  • about 0.001 mg to 10 g is conveniently administered by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day.
  • an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antitumor agent of the present invention may contain other active ingredients as long as an undesirable interaction is not caused by blending with the variant of the present invention.
  • the antitumor agent of the present invention includes other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antimetabolites (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer antibiotics (eg, For example, mitomycin, adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carboplatin, etopoxide, irinotecan and the like.
  • the antitumor agent of the present invention and the above agent may be administered to the patient at the same time or at different times.
  • the antitumor agent of the present invention may further contain an isolated polypeptide that is derived from a tumor-specific antigen and binds to MHC class I molecules.
  • an MHC class I molecule-binding polypeptide derived from a tumor-specific antigen not only Th cells but also CTLs can be induced simultaneously.
  • the MHC class I molecule-binding tumor-specific antigen may be a tumor-specific antigen in which a polypeptide that has been processed and fragmented is recognized by the MHC class I molecule.
  • HER-2 / neu for example, HER-2 / neu, MART-1, NY-ESO-1, Gp-100, MUC-1, p53, prostate specific antigen (PSA), hTERT, WT1, survivin, CEA, MAGE-3, malignant
  • PSA prostate specific antigen
  • hTERT hTERT1
  • WT1 survivin
  • CEA MAGE-3
  • malignant examples include proteins derived from a group of viruses that are strongly associated with tumor development.
  • a specific antigen derived from the same tumor as the antigenic peptide of the present invention is preferable, and examples thereof include WT1.
  • the tumor-specific antigen-derived polypeptide may be a full-length protein, but may be a partial peptide as long as it has immunogenicity as an antigen.
  • polypeptide derived from the WT1 antigen include W10 (ALLPAVPSL; SEQ ID NO: 13), W302 (RVPGVAPTL; SEQ ID NO: 14), and W292 (GVFGIQDV; SEQ ID NO: 15).
  • the amino acid sequence length of the isolated polypeptide derived from the tumor-specific antigen of the present invention and binding to the MHC class I molecule is not particularly limited as long as it is an amino acid length capable of presenting the antigen by the MHC class I molecule. Usually about 8 to about 11 amino acids, preferably about 9 amino acids.
  • an isolated polypeptide that is derived from a tumor-specific antigen and binds to an MHC class I molecule is a variant that has been modified so that it is not subject to degradation by a peptidase as in the variant of the present invention. It may be.
  • the mode of modification may be the same as that of the above-described variant of the present invention, and the synthesis / separation of the variant may also be performed according to the synthesis method / separation method described in the above-described variant of the present invention. it can.
  • the antitumor agent of the present invention may further contain an adjuvant.
  • Adjuvants include pertussis vaccine, tuberculosis cell wall skeleton (BCG-CWS), unmethylated deoxyCpG, imiquimod, poly-IC, LPS, peptidoglycan, Toll-like receptor ligand, Flt3, ⁇ Gal-Cer, mineral oil, vegetable oil, Examples include alum, aluminum compound, bentonite, silica, muramyl dipeptide derivative, thymosin, interleukin and the like.
  • Pertussis vaccine includes whole cell pertussis vaccine containing cell wall fragments of Bordetella pertussis treated with formaldehyde or heat treatment, components semi-purified or purified from Bordetella pertussis (eg, pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, etc.) And a cell-free pertussis vaccine.
  • a method for preparing a pertussis vaccine a known method can be used without limitation.
  • a pertussis vaccine may use a commercial item, for example, can be obtained from BIOFARMA (Indonesia) etc.
  • the variant of the present invention can be used for testing whether the antigen-presenting cells of a subject express an MHC class II molecule that can bind to the antigen peptide of the present invention contained in the variant. .
  • the present invention also cultivates a subject-derived antigen-presenting cell population and a variant of the present invention, and confirms the binding between the antigen-presenting cell population and the variant, wherein the subject binds to the antigenic peptide of the present invention.
  • a method is provided for testing whether a molecule has II.
  • the subjects for whom the inspection method of the present invention is carried out include tumor patients to be treated with the above-described antitumor agents, or those who are judged to be suspected of such tumors.
  • the antigen-presenting cell population used in the test method of the present invention is not particularly limited as long as it is collected from the subject.
  • Examples of such an antigen-presenting cell population include body fluids such as whole blood, lymph fluid, and cerebrospinal fluid, or fractions thereof. Blood, lymph, and the like are particularly preferable from the viewpoints that they can be collected quickly and easily and are less invasive to the subject.
  • These antigen-presenting cell populations are most preferably fresh living cells, but may be lightly fixed with 0.1-1% paraformaldehyde or the like.
  • cells that express MHC class II molecules of different genotypes or cell populations that do not express MHC class II molecules can be used as a control.
  • the variant of the present invention and the antigen-presenting cell population are, for example, brought into contact with each other, cultured for several hours to overnight, removed free peptides, and then bound to biotin peptides bound to MHC class II molecules on the cell surface. Furthermore, it can be confirmed whether it couple
  • the present invention also cultures an antigen-presenting cell expressing a specific MHC class II molecule and any peptide modified at the N-terminus and / or C-terminus, and confirms the binding between the antigen-presenting cell and the peptide.
  • a method for examining whether or not the peptide can bind to the antigen-presenting cell is provided.
  • the antigen-presenting cell expresses a specific MHC class II molecule, it may be collected from mammals (preferably human) or may be established. These antigen-presenting cells are most preferably fresh living cells, but may be lightly fixed with 0.1-1% paraformaldehyde or the like.
  • peptide As an arbitrary peptide, one having a length of about 7-20 amino acids, more preferably about 9-17 amino acids, and still more preferably about 9-15 amino acids is used.
  • the peptide is modified at the N-terminus and / or C-terminus, and the above-described modifications are applied as such modifications.
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the peptide is preferably the following formula (I): X1-X2-X3-X4 (I) (Where (1) X1 represents biotinylated Lys, X2 represents several amino acids or single bonds, X3 represents one amino acid or single bond, and X4 represents one amino acid or carboxyl group (provided that X3 is Pro) X4 represents one amino acid) (2) X1 represents one amino acid or single bond excluding biotinylated Lys, X2 represents several amino acids or single bonds, X3 represents Pro, X4 represents one amino acid, or (3) X1 represents biotin 1 amino acid or single bond excluding lysylated Lys, X2 is several amino acids or single bonds, X3 is one amino acid or single bond excluding Pro, and X4 is ⁇ -Ala) Is an amino acid sequence represented by
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the peptide is represented by the formula (I): (1) X1 is biosylated Lys, X2 is one amino acid or single bond, X3 is one amino acid or single bond, X4 is one amino acid or carboxyl group (provided that when X3 is Pro, X4 Is one amino acid), or (2) X1 is a single bond, X2 is a single bond, X3 is Pro, X4 is one amino acid, Is an amino acid sequence represented by
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the peptide is represented by the formula (I): X1 is biosylated Lys, X2 is a single bond, X3 is a single bond, X4 is a Gly or carboxyl group, X1 is a single bond, X2 is a single bond, X3 is Pro, X4 is Ala or ⁇ -Ala, or X1 is biosylated Lys, X2 is a single bond, X3 is Pro, and X4 is ⁇ -Ala
  • the amino acid sequence represented by etc. is mentioned.
  • the amino acid that may be added to the C-terminal side of the peptide is represented by X1 is biosylated Lys, X2 is a single bond, X3 is Pro, and X4 is represented by ⁇ -Ala. Amino acid sequence.
  • the amino acid that may be added to the N-terminal side of the peptide is as described above, but preferably the following formula (II): Y1-Y2-Y3 (II) (Where (1) Y1 is Pro, Y2 is several amino acids or single bonds, Y3 is one amino acid or single bond, or (2) Y1 is one amino acid or amino group excluding Pro, Y2 is several Amino acid or single bond, Y3 represents biosylated Lys) (Except for the amino acid sequence in which the second amino acid from the N-terminal is Pro).
  • the amino acid that may be added to the N-terminal side of the peptide is represented by the formula (II): (1) Y1 is Pro, Y2 is one amino acid or single bond, Y3 is one amino acid or single bond, or (2) Y1 is one amino acid or amino group excluding Pro, Y2 is one amino acid Or single bond, Y3 is biosylated Lys (Except for the amino acid sequence in which the second amino acid from the N-terminal is Pro).
  • the amino acid that may be added to the N-terminal side of the peptide is represented by the formula (II): Y1 is Pro, Y2 is Ser, Y3 is a single bond, Y1 is an amino group, Y2 is Ser, Y3 is biosylated Lys, or Y1 is Pro, Y2 is Ser, Y3 is biotinylated Lys Is an amino acid sequence represented by Most preferably, the amino acid that may be added to the N-terminal side of the peptide is an amino acid sequence represented by Formula (II), wherein Y1 is Pro, Y2 is Ser, and Y3 is biotinylated Lys.
  • Formula (II) Formula (II)
  • the method for contacting the antigen-presenting cell with any peptide having the modification or the culture method may be the method described in the above-described test method. That is, by adding the modification of the present invention to any peptide and imparting resistance to digestive enzymes and biotin modification as an indicator peptide, it is bound to an antigen-presenting cell, and, for example, a fluorescently labeled streptavidin is bound to the indicator peptide. Can be quantitatively measured. Furthermore, by adding a modified peptide without biotin modification with digestion resistance to this binding measurement system and competitively inhibiting the binding of the indicator peptide, the modified peptide of any amino acid sequence has the binding activity to MHC class II molecules. Comparative quantification is possible.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • cDNA complementary deoxyribonucleic acid
  • A adenine T: thymine
  • G guanine
  • C cytosine RNA: ribonucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • dATP deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP deoxythymidine triphosphate
  • dGTP deoxyguanosine tri
  • Phosphate dCTP deoxycytidine triphosphate ATP: adenosine triphosphate
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Gly glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine
  • Ile isoleucine
  • Ser threonine
  • CyrM threonine : Methionine
  • Glu Glutamic acid
  • DO11.10 cells which are CD4 T cell clones, were derived from DO11.10 TCR transgenic mice (DO11.10 tg) (Murphy, K. et al., Science 250: 1720-1723, 1990). DO11.10 cells were radiation treated BALB / c-derived spleen cells incubated with 0.75 ⁇ M OVAII peptide (ISQAVHAAHAEINEAGR) in 10% FCS DMEM containing 2% rat ConA supernatant (RCS) once a week.
  • CH1 cells were purchased from ATCC and maintained in 10% FCS-Iscove's MDM (IMDM).
  • IMDM FCS-Iscove's MDM
  • CH1-IA d and CH1-IA b cells were prepared by retrotransduction using pMX (assigned from Dr. Kitamura) as an expression vector. These were all inserted in IA ⁇ and IA ⁇ chain cDNAs in tandem in this order, with the IRES sequence in between.
  • F-2 ⁇ (F2) cells were purchased from BioResource Center (Tsukuba City) as a UV-transformed cell line derived from CBF1 mice.
  • F2-IA d cells were established in the same manner as the above-described CH1-IA d cells.
  • OVII ISQAVHAAHAEINEA; SEQ ID NO: 17
  • IA d binding epitope OVAII 323-339
  • IQAVHAAHAEINEAGR SEQ ID NO: 16
  • ovalbumin Shimmonevitz, R. et al., J Immun 7: 13. 2074, 1984
  • MCC (NERADLIAYLKQATK; SEQ ID NO: 42) is the 89th to 103rd amino acid sequence of the IA k- binding cytochrome C peptide (Bus, S. et al, Science 235: 1353-1358, 1987). Manual synthesis by the Fmoc method and purification to a purity of 95% or higher by reverse phase HPLC using a C18 column. Peptide concentrations were determined by MicroBCA assay (Pierce, Rockford, IL) using BSA as a standard. Biotinylated peptides were synthesized using Fmoc-Lys (Biot) -OH. The synthesized peptides are shown in Table 1.
  • EL4 cells were first opsonized with RGD peptide. The cytoplasm was then loaded with 5 mg / ml OVA protein by osmotic loading. After thorough washing, 2 ⁇ 10 6 EL4 cells were added to a confluent culture of 24-well plates of F2-IA d cells (previously cultured for 2 days in the presence of 500 U / ml rmIFN- ⁇ ). As a control, EL4 and EG7 loaded with mock PBS were RGD modified in the same manner and used. EL4 other target cells, in addition to F2-IA d, was the cell mixture was cultured for 24 hours.
  • F2-IA d cells were directly loaded with OVAII peptide
  • the cells were pulsed with peptide for 2 hours at the end of the culture. After removing floating cells and dead cell debris, the surface of the adhered F2-IA d cells was thoroughly washed.
  • 100 ⁇ M chloroquine was added 30 minutes before the addition of EL4, EL4 loaded with OVA, or 0.25 mg / ml OVA protein.
  • F2-IA d cells were cultured for 3 days in the continuous presence of chloroquine.
  • F2-IA d cells presented the target antigen polypeptide on the cell surface was determined by monitoring the expression of CD69 in DO11.10 cells.
  • Antigen-presented F2-IA d cells and DO11.10 cells were mixed, centrifuged, and brought into contact with each other, and then stained with biotin-labeled anti-CD69 mAb (H1.2F3, BD Biosciences) after 6 and 24 hours.
  • the expression of CD69 in DO11.10 cells positively stained with FITC-labeled KJ1.26, an anti-clonotypic TCR mAb was detected by flow cytometry.
  • F2-IA d cells were cultured to confluence on the inserts of Transwell plates (BD Labware, Billerica, CA). The last 3 days of culture were cultured in the presence of 500 U / ml rmIFN- ⁇ . Also, F2-IA d cells were pulsed with various concentrations of OVAII peptide for the last 2 hours of culture. After culturing, F2-IA d cells were washed and isolated from DO11.10 transgenic spleen cells by negative selection (Dynamic mouse CD4 negative isolation kit (Invitrogen)) so that CD4 + cells had a purity of 95% or more. This was added 4 ⁇ 10 6 per hole.
  • CH1-IA d or CH1-IA b cells were suspended in 2% BSA IMDM to 2 ⁇ 10 6 cells / ml. 100 ⁇ l of this cell suspension was added to 100 ⁇ l of serially diluted peptides in IMDM without serum. After incubating at 37 ° C. for 2, 6, or 16 hours, the cells were washed and stained with FITC-streptavidin. The amount of peptide bound to the cells was measured by flow cytometry.
  • Example 1 Infiltration of tumor-specific Th cells into tumors planted in bone marrow chimeric mice CBF1 mice irradiated with 10 Gy of ⁇ -rays, IA ⁇ b KO mice irradiated with 9.5 Gy or bone marrow chimeras From the day before 1.5 ⁇ 10 7 bone marrow transplants to mice (bone marrow chimeric mice transplanted with IA ⁇ b KO bone marrow into CBF1 mice, bone marrow chimeric mice transplanted with CBF1 mouse bone marrow into IA ⁇ b KO mice) Up to 14 days after transplantation, 1.5% oxytetracycline (DENKA Seiken) was added to drinking water.
  • DENKA Seiken oxytetracycline
  • Th transfer experiments were performed at least 28 days after bone marrow transplantation.
  • the complete replacement of donor-derived bone marrow-derived cells is that peripheral blood mononuclear cells are transformed into anti-L d mAb (30-5-7S), anti-K b mAb (Y3), anti-IA d mAb (39 -10-8) and anti-IA b mAb (25.9-3).
  • the tumor was removed and a 5 ⁇ m-thick section was prepared.
  • the number of PKH positive cells was counted using one sample for every three consecutive sections (FIG. 1). The number of PKH positive cells seen in 20 fields of a 400 ⁇ fluorescence microscope was counted for 10 slices and accumulated.
  • Example 2 Verification of Antigen Presentation by Vascular Endothelial Cells
  • polyendothelial cells EC: endothelial cells
  • EC endothelial cells
  • apoptotic tumor cells decompose cytoplasmic antigens in the tumor cells and are degradation products thereof. It was verified whether peptides could be bound to MHC class II molecules and presented.
  • the extent of antigen presentation by F2-IA d cells was examined by monitoring the expression of CD69, an early activation marker on reactive DO11.10 cells. As shown in FIG. 2, endothelial cells pulsed with OVAII peptide were able to stimulate DO11.10 cells.
  • F2-IA d cells were incubated with opsonized EL4 or EG7, approximately 30% of the cells took up apoptotic tumor cells. However, opsonized EG7 did not induce CD69 expression in DO11.10 cells even after several trials. This seemed in part because the concentration of OVA protein in EG7 cells may be low.
  • the purity of DO11.10 cells isolated from spleen cells by negative selection used in this Example was 85% or more positive for KJ1.26 (a mAb specific for DO11.10 clonotypic TCR), and all medium CD4 Over 95% of the cells were KJ1.26 positive.
  • Example 3 Effect on antigen presentation by inhibiting antigen presentation of the extrinsic pathway of endothelial cells Since the tumor antigen of the incorporated tumor cells is presented by MHC class II molecules, it is mediated via the extrinsic pathway. Since antigen processing was expected to occur, the inventors examined whether antigen presentation was sensitive to chloroquine, an inhibitor of antigen presentation via endosomes. As shown in FIGS. 3 and 4, when F2-IA d cells were treated with chloroquine, the presentation of OVA protein known to be presented by the extrinsic pathway was reduced. The antigen presentation of EL4 loaded with OVA was also sensitive to chloroquine. Thus, antigen presentation by F2-IA d of OVA protein present in the cell of EL4 was suggested that primarily through extrinsic pathway.
  • Example 4 Examination of whether vascular endothelial cells induce migration of Th cells The inventor made the migration activity of DO11.10 CD4 T cells to pass through the endothelial cell layer by causing the endothelial cells to present an antigen. It was verified whether it could be guided.
  • F2-IA d cells Prior to contact with DO11.10 cells, F2-IA d cells were previously seeded on the transwells of the plate and pulsed with OVAII peptide. As shown in FIG. 5, when the pulsed OVAII peptide concentration was high, DO11.10 cells strongly adhered to F2-IA d cells, were activated in situ, and migrated through the F2-IA d cell layer. I didn't do it.
  • Example 5 Infiltration test of Th cells under endothelial cells isolated from solid tumors EL4-EGFP or EG7-EGFP cells were inoculated into CBF1 mice. Growing solid tumors were harvested and digested with 2.5 mg / ml collagenase D (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) in 20% FCS HBSS (GIBCO, Carlsbad, Calif.) For 3 hours. CD45 positive cells were removed twice with Dynabeads M-280 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Coated with anti-CD45 mouse antibody 30-F11 (Biolegend, San Diego, Calif.). Single cell suspensions were cultured on collagen Type I coated base dishes (AGC Techno Glass Co.
  • DiI-labeled acetylated LDL (Invitrogen) was added at 20 ⁇ g / ml, and the endothelial cells were endocytosed at 37 ° C. for 4-5 hours. After washing with acetylated LDL, cells were stained with biotinylated 30-F11 and Alexa 647 labeled streptavidin (Molecular Probes, Carlsbad, Calif.). Endothelial cells take up DiI labeled LDL and appear stained red.
  • Endothelial cells that have taken up tumor cells have tumor cell remnants that emit green fluorescence of EGFP in the cells and can be identified as cells that do not stain magenta (CD45 positive cells) (black arrows). . Endothelial cells that have not taken up tumor cells are indicated by white arrows.
  • DO11.10 cells were added and fluorescent images were taken every 15 seconds at 37 ° C. for 1 hour at 37 ° C. using a confocal laser microscope FV1000D IX81 (Olympus, Tokyo, Japan). The movement was observed. A microscopic image is shown in FIG. In addition, FIG. 7 shows the number of DO11.10 cells submerged under the endothelial cells.
  • Example 6 Comparison of anti-tumor activity by in vivo tumor antigen polypeptide immunization
  • the inventor CTL only 2.
  • CTL and third party antigen-specific Th cells The immunization protocol for inducing CTL and tumor-specific Th cells was compared.
  • antigen-presenting cells LPS blasts of spleen cells were used, and each peptide was added singly or mixed and bound, and injected once a week three times a week.
  • tumor induction could be controlled only to a limited extent only by induction of tumor antigen-specific CTL by OVA-I peptide.
  • ⁇ -specific Th cells are induced using ⁇ peptide, which is a third-party antigen, together with CTL
  • tumor growth was delayed compared with CTL induction alone, Died.
  • OVA-I a surrogate tumor antigen, together with OVA-I, tumors could be better controlled. In some mice the tumor disappeared completely.
  • Example 7 Evaluation of Promotion of Invasion of Tumor in Tumor of CTL ELF or EG7 were planted on the left and right backs of CBF1 mice in the same manner as in Example 1, and PKH-labeled OT-1 (OVA peptide 257-264 was K b on day 7 ).
  • CTL cytotoxic T cells
  • mice injected with 1 ⁇ 10 6 DO11.10 intravenously significant OT-1 infiltration into EG7 was observed (FIG. 9).
  • mice transfected with 2 ⁇ 10 7 DO11.10 non-specific infiltration into EL4 increased and specific infiltration into EG7 tended to decrease.
  • IFN- ⁇ gene-deficient DO11.10 was transferred, DO11.10-dependent increase in intratumoral infiltration of OT-1 was not observed.
  • CXCR3 gene-deficient OT-1 was transferred, the number of tumor infiltrates decreased, and even when DO11.10 was transferred, there was almost no increase.
  • VSV8 which is a CD8-positive CTL clone that has different antigen specificity and recognizes the VSV8 peptide in a Kb- restricted manner
  • VSV8 which is a CD8-positive CTL clone that has different antigen specificity and recognizes the VSV8 peptide in a Kb- restricted manner
  • DO11.10 The effect of promoting the invasion of CTL into EG7 by HT was found to be less than that of OT-1.
  • Example 8 Th or CTL or the left and right back of study CBF1 mice antitumor effect by adoptive of both, planted 4x10 6 pieces of EL4 and 3x10 6 cells of EG7 tumor diameter after 6 days 5- When it reached 7 mm, adoptive transfer of DO11.10 or OT-1 was started. 1 ⁇ 10 6 DO11.10 were first intravenously injected and OT-1 was intravenously injected 2 ⁇ 10 6 the next day. Tumor diameter was measured every 2 days. Thereafter, adoptive transfer of DO11.10 and OT-1 was repeated every 5 days (FIG. 10).
  • Example 9 Design of modified peptide using OVA epitope peptide From the above Examples 1 to 8, the inventors secreted IFN- ⁇ by Th that invaded the tumor tissue and received IFN- ⁇ dependency. It was thought that CTL that highly expresses CXCR-3, which is a chemokine receptor, was promoted to infiltrate the tumor, and as a result, the solid tumor was degenerated. Based on such a mechanism, the inventor increases the Th induction efficiency by adding a modification that imparts digestion resistance to a degrading enzyme to an MHC class II-binding polypeptide that induces Th, and efficiently activates antitumor immunity.
  • CXCR-3 which is a chemokine receptor
  • OVII ovalbumin
  • DO11.10 CD4 T cells IA d -binding ovalbumin (OVA) peptide recognized by DO11.10 CD4 T cells.
  • OVII 323-337) is a peptide containing an epitope obtained by removing 2 amino acids from the original OVAII peptide (323-339). Considering the ease of synthesis, OVII was used as a wild-type peptide.
  • Angiotensin I converting enzyme ACE has been reported to be the major serum protease involved in the processing of precursor peptides of MHC class I binding peptides (Sherman, L. et al., J Exp Med 175).
  • ACE is a dipeptidyl carboxypeptidase
  • the inventor added an amino acid to the C-terminus of OVII, in particular to inhibit degradation by the ACE enzyme.
  • Peptides with Pro second from the C-terminus were designed (Table 1).
  • aminopeptidases having cleavage specificity for N-terminal Pro have not been identified among the enzymes of mammals (Vanhof, G. et al., FASEB J 9: 736-744, 1995).
  • Pro-Ser dipeptide was added to the N-terminus (Table 1). Since Ser is water-soluble and has a small side chain, it was assumed that there is little possibility of physically hindering antigen recognition by Th, and was put in as a spacer. Two proline-specific aminopeptidases, dipeptidyl peptidase IV and aminopeptidase P, expressed on immune cells have been reported to degrade using N-terminal X-Pro as a substrate (Vanhof, G. et. al., FASEB J 9: 736-744, 1995; Yu, D. et al., FEBS J 277: 1126-1144, 2010).
  • Sensitization activity of each modified peptide was measured as an indicator of growth curves of DO11.10 cells recognizing OVA epitope I-A d -restricted.
  • the sensitizing activity of the peptide (POVII) having Pro introduced at the N-terminus increased by about 5-fold compared to OVII.
  • Peptides modified at the C-terminus resulted in a greater increase in sensitizing activity.
  • ACE-resistant OVIIPA showed almost 100-fold sensitizing activity compared to OVII.
  • Peptides modified C-terminally with ⁇ -Ala were similar to OVIIPA, but only slightly less active.
  • N-terminal acetylation (ac-OVII) had little effect on sensitizing activity.
  • Example 10 Examination of peptide modification using ACE inhibitors Because only the C-terminal domain of ACE was reported to be sensitive to thermal inactivation of enzyme activity (Voronov, S. et al., FEBS). Lett 522: 77-82, 2002), the inventor conducted an inhibition test using captopril, which has a strong specific inhibitory effect on both the N-terminal domain and the C-terminal domain of ACE (Dalkas, G. et al. et al., J Pept Sci 16: 91-97, 2009). As shown in FIGS. 14 and 15, the addition of 2.5 mM captopril improved the sensitizing activity of OVII to a level close to that of the C-terminal protected OVIIPA peptide.
  • ACE was originally produced as a membrane-bound extracellular enzyme CD143 and has been reported to be released by proteolytic enzymes. Endothelial cells strongly express ACE, but other cells are also known to partially express ACE (Coates, D. Int J Biochem Cell Biol 35: 769-773, 2003). The inventor predicted that some antigen-presenting cells (APCs) expressed ACE on the cell surface. Among immune cells, human dendritic cells have been reported to express ACE (Lapteva, N. et al., Biochem Biophys Res Commun 296: 194-200, 2002), but against antigen presentation. Whether or not there is any involvement has not been reported yet. It has also been reported that monocytes and lymphocytes express only negligible ACE (Danilov, S. et al., Exp Hematol 31: 1301-1309, 2003).
  • Example 11 Examination of peptide modification in serum-free medium
  • the Th-inducing activity of peptides was tested in serum-free AIM-V medium. Since DO11.10 spleen cells tend to be brittle and adhere to the wall in the AIM-V medium, the cells hardly encounter each other, and as a result, the cell growth becomes dull and uneven. Therefore, in this example, more stable data was obtained using 3 times more DO11.10 cells per well.
  • removal of protease in serum shifted the titration curve of OVII and overlapped with POVII having a modification only at the N-terminus. However, other variant peptides still showed high induction activity.
  • Example 12 High Sensitization Activity of Biotinylated OVII Peptide
  • the inventors introduced biotinylated Lys (K bio ) inside the N-terminus and / or C-terminus of the peptide for labeling purposes.
  • this biotinylated peptide showed high sensitizing activity and induced significant proliferation of Th cells.
  • the inventor designed various biotinylated peptides (Table 1) and further studied. Since biotinylated peptides generally tended to have low solubility, the design was based on OVII + in which Arg was added to the C-terminus of OVII.
  • the sensitizing activity was increased 100 times. Furthermore, addition of Pro- ⁇ -Ala to the C terminus had no effect. On the other hand, when Pro was added to the N-terminus, the activity was further increased 5-fold. The change in activity due to biotinylation was also observed when DO11.10 cells were cultured under serum-free conditions (FIG. 16).
  • PbOVIIbP ⁇ showed the highest activity with modifications of K bio on both ends, Pro on the N-terminal side and Pro- ⁇ -Ala on the C-terminal side. Since K bio provides additional activity in addition to the N-terminal Pro of PbOVIIbP ⁇ , K bio may have contributed to increased sensitizing activity for reasons other than protease resistance.
  • PbOVIIbP ⁇ showed a 5-fold higher activity than POVIIP ⁇ (FIG. 16).
  • the inventor also verified whether or not the sensitizing activity of the biotinylated OVII peptide is due to the effect of lysine.
  • KOVII + or KOVII + K to which lysine was added respectively at the N-terminus or both ends of OVII + had no difference in sensitizing activity as compared with OVII +.
  • Example 13 Peptide digestion resistance to serum peptidase From the results of the examination of the previous examples, it is highly possible that the modification imparts peptidase resistance to the peptide. Therefore, the inventor examined the digestive resistance of peptides in 10% fresh mouse serum in vitro. The remaining amount of undigested peptide was quantified by HPLC. As shown in FIG. 21, 40% of OVII was digested within 2 hours, and no undigested peptide remained after 6 hours. It was found that when ⁇ -Ala (OVII ⁇ ) at the C-terminus or Pro (OVIIPA) second from the C-terminus was introduced, about half of the peptide that would have been digested within 4 hours alone was protected from digestion.
  • OVII ⁇ OVII ⁇
  • OVIIPA Pro
  • the C-terminal K bio was generally more effective in protecting against peptidases.
  • the digestive resistance of the modified product having both N-terminal and C-terminal biotinylation, and the modified product combined with the above-mentioned N-terminal Pro and C-terminal Pro- ⁇ -Ala was additionally increased.
  • the degree of preservation of epitope in serum is almost the same between POVIIP ⁇ and PbOVIIbP ⁇ with K bio added thereto, the Th-inducing activity in FIG. 16 and the Th-inducing activity in serum-free medium are the same. In either case, the reason why PbOVIIbP ⁇ is about 5 times higher is unknown.
  • Example 14 Effect of Peptidase Inhibitor on Peptide Digestion
  • the inventor examined the effect of peptidase inhibitor on peptide digestion in order to find out what peptidase in serum was.
  • captopril a specific inhibitor of ACE
  • the reason why the inhibitory activity was partial at a low concentration was considered that the C-terminal active site of ACE was more sensitive to ACE than the N-terminal active site.
  • Example 15 Effect of inhibitors on ACE activity of antigen-presenting cells CH1-IA d cells were suspended in PBS and incubated in advance at 37 ° C for 20 minutes in the presence of 2.5 mM o-phenanthroline or captopril. 10 ⁇ M Abz-FRK (Dnp) P—OH (Sigma, St. Louis) was added and incubated at 37 ° C. for the indicated times. The reaction was stopped by placing on ice and centrifuged, and the fluorescence in the supernatant was measured at an excitation wavelength of 320 nm and a measurement wavelength of 420 nm (FIG. 25).
  • Dnp Abz-FRK
  • P—OH Sigma, St. Louis
  • captopril which is a specific inhibitor of ACE
  • o-phenanthroline which is an inhibitor of metallopeptidase to which ACE belongs. I understood.
  • Example 16 Effect of peptide modification in in vivo immunization
  • the inventors examined the Th-inducing activity of the modified peptide in in vivo immunization. As shown in FIG. 26, it was found that peptidase-resistant POVIIP ⁇ efficiently activates DO11.10 Th cells by in vivo immunization compared to OVII. PbOVIIbP ⁇ in which K bio was added to POVIIP ⁇ more efficiently induced activation. Furthermore, even when immunized with the WT1-derived WA36 peptide, which is a natural tumor antigen, it was extremely difficult to induce Th cells with WA36 alone. However, using a biotinylated terminal-modified peptide, although weak, It was found that Th cells can be induced (FIG. 27).
  • Example 17 Tumor Antigen Peptide Inducing Activity from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • Human-derived peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) having HLA-DR15 were treated with W332 peptide or PbW332bP ⁇ peptide in DMEM medium containing 10% AB serum. Stimulated at each concentration. 20 U / ml recombinant human IL-2 and 0.1 ⁇ g / ml phytohemagglutinin (PHA) were added to the medium.
  • PHA phytohemagglutinin
  • each peptide at the above concentrations was added again, the cells were stimulated for 4 hours, brefeldin A was added and further cultured for 1 hour, and then intracellular IFN ⁇ staining and CD4 staining were performed. Analyzed with The ratio of intracellular IFN ⁇ positive cells in CD4 positive cells is shown (FIG. 28).
  • Example 18 In vivo anti-tumor activity when immunized with MHC class I peptide and MHC class II peptide in tumor-bearing mice
  • the inventors identified Th cells that recognize Wilms' Tumor 1 (WT1), a natural tumor antigen.
  • WT1 Wilms' Tumor 1
  • In vivo anti-tumor activity by induction was examined. Care must be taken to induce Th cells against natural tumor antigens. This is because, as a result of inducing Th cells against a natural tumor antigen, there is a possibility of inducing regulatory T cells (Treg: regulatory T cells) that may attenuate the antitumor activity.
  • Treg regulatory T cells
  • the amino acid sequence of W332 also has the same sequence in the corresponding mouse WT1 tumor antigen.
  • the IA gene which is one of the mouse MHC class II genes, is known to be an ortholog of the human HLA-DR gene. Therefore, binding experiments were attempted in consideration of the possibility that W332 also binds to mouse IA molecules if they are peptides that commonly bind to multiple human MHC class II molecules. After adding PbW332bP ⁇ to CH1-IA d cells and culturing for 5 hours, FITC-streptavidin was added for staining, and analysis was performed by flow cytometry.
  • PbW332bP ⁇ a biotinylated W332 peptide
  • CH1-DR4 cells expressing HLA-DR molecules FIG. 29A
  • mice were immunized with PbW332bP ⁇ peptide as a Th-inducing peptide and Db126 peptide as a CTL-inducing peptide.
  • FBL3 erythroleukemia cells that naturally express WT1 tumor antigen were used as a tumor to be inoculated into mice.
  • FBL3 is a cell line that has become tumorized because it has been infected with Friend leukemia virus, and is likely to express viral antigens.
  • Example 19 Development of quantitative measurement method for binding ability to MHC class II molecule
  • a method for measuring the binding activity of an MHC class II molecule-binding peptide there is a method in which an unlabeled peptide is added to an MHC class II molecule on a living cell to compete for the binding of a biotinylated indicator peptide to the MHC class II molecule.
  • the unlabeled peptide is rapidly digested due to the peptidase activity of living antigen-presenting cells, but the biotinylated indicator peptide is difficult to digest, and the binding cannot be measured by a competition test.
  • Example 20 Quantitative measurement method for peptide binding ability to HLA-DR4 molecule, which is a human MHC class II molecule
  • a method for measuring peptide binding activity to live antigen-presenting cellular MHC class II molecule Is possible not only for the mouse MHC class II molecule I-Ad molecule shown in Example 19, but also for the human MHC class II molecule, the MHC class II molecule.
  • a device was added so that the binding activity of a peptide could be measured by incubation for 4 hours by adding p-chlorophenol (PCP).
  • PCP p-chlorophenol
  • CH1-DRB1 * 04 05 cells (CH1-DR4 cells) were suspended in 20% FCS IMDM (Iscove's minimum essential medium) at 2 ⁇ 10 6 / ml, and 50 ⁇ l (1 ⁇ 10 6 ) was added to 1 hole of a 96-well U plate. 5 / hole).
  • FCS IMDM Iscove's minimum essential medium
  • biotinylated index peptide bTR174 PSK bio REFKLSKVWRDQK bio P ⁇ A: SEQ ID NO: 41
  • IMDM containing 8 mM PCP are put in 50 ⁇ l per well
  • CH1 -DR4 cells were placed in 50 ⁇ l (1 ⁇ 10 5 / well) and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Free peptides were removed by centrifugation, stained with FITC-streptavidin, and measured with a flow cytometer.
  • tumor-specific antigens can be presented on MHC class II molecules of antigen-presenting cells significantly more efficiently than before. And can induce tumor antigen-specific Th cells more efficiently.

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Abstract

　本発明は、効率的に抗原提示可能な腫瘍抗原特異的Ｔｈ誘導性ポリペプチド、それを用いた抗腫瘍剤を提供する。

Description

ヘルパーＴ細胞誘導性ポリペプチドの改変
　本発明は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）誘導性ポリペプチドの改変体および該改変体を含む抗腫瘍剤などに関する。
　腫瘍に対する免疫においては、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が腫瘍細胞を殺傷するエフェクターとして主要な役割を果たす。また、ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ：ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ）細胞、特にＴｈ１タイプのＴｈ細胞は効率的な抗腫瘍免疫の活性誘導に必須であることが報告されている（非特許文献１～４）。抗腫瘍免疫におけるＴｈ細胞の役割は、これまでに種々の報告がなされており、ＣＴＬの分化・増殖を誘導する（非特許文献５）、抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）を、直接ＣＴＬを活性化させる能力のある状態にさせる、あるいはＡＰＣに抗原を交差提示させることにより、ＣＴＬを活性化する（非特許文献６、７）、ＣＴＬやＡＰＣに対する抗アポトーシス効果（非特許文献８、９）、メモリーＣＤ８Ｔ細胞の増殖や末梢プールの維持拡大を助ける機能（非特許文献１０、１１）、ＣＴＬの腫瘍組織への浸潤誘導（非特許文献１２、１３）などが知られている。
　抗腫瘍免疫を利用した悪性腫瘍の治療方法については、多くの研究がなされている。例えば、ＣＴＬを誘導するＨＬＡ（ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ：ヒト白血球抗原；後述のＭＨＣのヒトのものをＨＬＡと呼ぶ）クラスＩ結合性腫瘍抗原特異的ポリペプチドを使う免疫療法では、該ポリペプチドを単独で、あるいは非メチル化デオキシＣｐＧ、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドまたはＦｌｔ３のようなアジュバントと共に投与することが、行われている。しかし、かかる方法によっては、ＣＴＬは増殖をしてもエフェクターとして十分な状態には活性化されにくく、治療効果が限られる。また、新しい抗腫瘍免疫療法として、ＣＴＬを誘導するＨＬＡクラスＩ結合性腫瘍抗原ポリペプチドと、Ｔｈ細胞を誘導するＨＬＡクラスＩＩ結合性腫瘍抗原ポリペプチドを用いた免疫療法も検討されている。しかし、かかる方法は腫瘍抗原特異的Ｔｈ細胞を活性化するとは限らず、代わりに、その腫瘍抗原に対する免疫を抑える制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する可能性があり、結果として抗腫瘍免疫を抑制してしまう懸念がある（非特許文献１４）。特に抗腫瘍免疫においては、標的とする抗原が自己の体内に自然に生じる腫瘍抗原であるため、免疫系は腫瘍抗原を自己の成分とみなして、通常、攻撃的応答は起こしにくい。これは、生体内に備わったＴ細胞の自己反応性を防ぐ“自己寛容”のしくみによって、自己抗原を認識して強く反応するＴ細胞は未熟なうちに細胞死に至り、残された自己抗原に中程度に、あるいは弱く反応するＴ細胞も機能的な抑制状態にあるためである。このため、不用意に腫瘍抗原を投与することにより、Ｔｒｅｇを誘導し、腫瘍に対する免疫応答をかえって抑制する可能性も高い。かかる可能性を排除するため、発明者は、かつてＣＴＬを誘導するＨＬＡクラスＩ結合性の腫瘍抗原ポリペプチドに、アジュバントとして、非腫瘍抗原である百日咳ワクチンを用いて第三者抗原である百日咳菌に対するＴｈ細胞を誘導し、これに腫瘍抗原特異的ＣＴＬを育てさせる方法で、抗腫瘍免疫を誘導することに成功している（特許文献１）。特にその方法では百日咳全菌体ワクチンを使うため、ＣＴＬ誘導活性の高いＴｈ１タイプのＴｈ細胞を効率よく誘導できる。しかし、腫瘍抗原特異的Ｔｈ１細胞の誘導については、前述の通り制御性Ｔ細胞の問題があるため、未だ確実な誘導方法がないのが現状である。
WO2008/096831
Fallarino et al., J Immunol 165, 5495-5501, 2000 Jin et al., Int J Cancer 111, 558-567, 2004 Nishimura et al., J Exp Med 190, 617-627, 1999 Xie et al., J Exp Med 207, 651-667, 2010 Keene and Forman, J Exp Med 155, 768-782, 1982 Bennett et al., Nature 393, 478-480, 1998 Ridge et al., Nature 393, 474-478, 1998 Kennedy and Celis, J Immunol 177, 2862-2872, 2006 Mueller et al., J Immunol 176, 7379-7384, 2006 Janssen et al., Nature 852-856, 2003 Shedlock and Shen, Science 300, 337-339, 2003 Marzo et al., J Immunol Methods 165, 6047-6055, 2000 Wong et al., J Immunol 3112-3131, 2008 Yamazaki et al., Blood 110, 4293-4302, 2010
　本発明の目的は、腫瘍抗原特異的Ｔｈ誘導性ポリペプチドの改変体を提供し、それを用いた抗腫瘍剤を提供することである。
　これまでの、ＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ：主要組織適合性複合体）クラスＩ結合性ペプチドを免疫してＣＴＬの誘導をはかる免疫方法では、十分な抗腫瘍活性が得られない理由として、腫瘍特異的ＣＴＬが存在しても、それらが腫瘍組織に十分に侵入していないことが大きな問題であることに発明者は気づいた。そこで、腫瘍特異的Ｔ細胞が腫瘍組織に侵入するメカニズムを研究したところ、ｉｎ　ｖｉｖｏで固形腫瘍の縮退が生じた際には、腫瘍組織にはＣＴＬだけでなく、Ｔｈ細胞の浸潤が共通に観察されることに気がついた。過去の報告においても、この点が共通している。通常、Ｔ細胞（ＴｈおよびＣＴＬ）は血液に乗って全身を巡るため、血管内皮細胞に阻まれ、腫瘍組織と直接接触できる状況にはない。発明者は、血管内皮細胞が近傍に存在するアポトーシスを起こした腫瘍細胞を取り込み、血管内皮細胞のＭＨＣクラスＩＩ上に腫瘍抗原由来のポリペプチドを提示することで、腫瘍特異的Ｔｈ細胞を腫瘍組織に呼び込んでいることを初めて見出した。さらに、腫瘍組織に侵入したＴｈが分泌するＩＦＮ－γにより、血管内皮細胞にケモカインであるＩ－ＴＡＣやＩＰ－１０、Ｍｉｇの発現が誘導されること、それを受けて、これらＩＦＮ－γ依存性ケモカインのレセプターであるＣＸＣＲ－３を高発現するＣＴＬの腫瘍内浸潤が促され、その結果、固形腫瘍が縮退することを観察した。従って、この活性のためには、腫瘍特異的Ｔｈ細胞はＴｈ１タイプのＴｈであることが望ましい。かかる発見から、腫瘍抗原特異的Ｔｈ細胞を効率よく誘導する方法を開発することが、固形腫瘍を縮退させる免疫方法を開発するための要の技術となることが自明となった。そこで本件では、Ｔｈを誘導するＭＨＣクラスＩＩ結合性ポリペプチドに、これらのポリペプチドを分解する酵素に対する消化耐性を付与する修飾を加えることに着目した。その結果、後述のようにＴｈ誘導効率を数百倍に高めることが可能となった。この効果は、特に腫瘍抗原ポリペプチドを用いて生体をｉｎ　ｖｉｖｏ免疫する場合に顕著な有利性があり、通常ではＴｈ細胞を誘導しにくい自己抗原である腫瘍抗原に対するＴｈ細胞を誘導する際には、必要な修飾であることが明らかとなった。すなわち、Ｔｈ細胞のＭＨＣクラスＩＩ結合性ポリペプチドの認識効率に応じて、ポリペプチドに該改変を加えることにより、Ｔｈ誘導効率を飛躍的に上げることが可能であることを示した。発明者は、これらの着想に基づいて研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドの改変体；
［２］該改変が、該単離されたポリペプチドのＣ末端側および／またはＮ末端側への数個のアミノ酸の付加である、［１］に記載の改変体；
［３］該単離されたポリペプチドのＣ末端側に付加されるアミノ酸が、下式（Ｉ）：
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４　（Ｉ）
（式中、
（１）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基を示す（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す）、
（２）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す、または
（３）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４はβ－Ａｌａを示す）
によって表されるアミノ酸配列である、［２］に記載の改変体；
［４］該単離されたポリペプチドのＣ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（Ｉ）において、
（１）Ｘ１がビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸）、または
（２）Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３がＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸、
によって表されるアミノ酸配列である、［３］に記載の改変体；
［５］該単離されたポリペプチドのＣ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（Ｉ）において、
Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３は単結合、Ｘ４はＧｌｙまたはカルボキシル基、
Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はＡｌａまたはβ－Ａｌａ、または
Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はβ－Ａｌａ
によって表されるアミノ酸配列である、［４］に記載の改変体；
［６］該単離されたポリペプチドのＮ末端側に付加されるアミノ酸が、下式（ＩＩ）：
Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３　（ＩＩ）
（式中、
（１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合を示す、または
（２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓを示す）
によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である、［２］－［５］のいずれか１項に記載の改変体；
［７］該単離されたポリペプチドのＮ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（ＩＩ）において、
（１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合、または
（２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である、［６］に記載の改変体；
［８］該単離されたポリペプチドのＮ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（ＩＩ）において、
Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３は単結合、
Ｙ１はアミノ基、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ、または、
Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
によって表されるアミノ酸配列である、［７］に記載の改変体； 
［９］該単離されたポリペプチドが、ＷＴ１、ＰＳＡ、ＭＡＧＥ－３、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＣＥＡ、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＥＢウイルスに由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を含む、［１］－［８］のいずれか１項に記載の改変体；
［１０］該単離されたポリペプチドが、ＷＴ１に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を含む、［９］に記載の改変体；
［１１］配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：４０によって示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド；
［１２］［１］－［１０］のいずれか１項に記載の改変体または［１１］に記載の単離されたポリペプチドを含む、抗腫瘍剤；
［１３］更に腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドを含む、［１２］に記載の抗腫瘍剤；
［１４］更にアジュバントを含む、［１２］または［１３］に記載の抗腫瘍剤；
［１５］アジュバントが百日咳ワクチンであることを特徴とする、［１４］に記載の抗腫瘍剤；
［１６］［１２］－［１５］のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤を患者に有効量投与することを含む、腫瘍の治療方法；
［１７］腫瘍の治療に使用するための、［１］－［１０］のいずれか１項に記載の改変体または［１１］に記載の単離されたポリペプチド、腫瘍特異的抗原に由来しＭＨＣクラスＩ分子に結合する単離されたポリペプチドおよびアジュバントを含む組成物；
［１８］抗腫瘍剤を製造するための［１］－［１０］のいずれか１項に記載の改変体または［１１］に記載の単離されたポリペプチドの使用； 
［１９］被験者由来の抗原提示細胞集団と［１］－［１０］のいずれか１項に記載の改変体を培養し、抗原提示細胞集団と該改変体の結合を確認する、被験者が該改変体に含まれる単離されたポリペプチドに結合するＭＨＣクラスＩＩ分子を持つか否かを検査する方法；
［２０］特定のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞とＮ末端および／またはＣ末端が改変された任意のペプチドを培養し、該抗原提示細胞と該ペプチドの結合を確認する、該抗原提示細胞に該ペプチドが結合しうるか否かを検査する方法；
などを提供する。
　本発明の腫瘍抗原特異的Ｔｈ誘導性ポリペプチドの改変体を用いることで、従来よりも顕著に効率的に抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子上に腫瘍特異的抗原を提示させ、より効率的に腫瘍抗原特異的Ｔｈ細胞を誘導することができる。その結果、腫瘍組織へ腫瘍抗原特異的Ｔｈ細胞を浸潤させることができる。さらに、Ｔｈ細胞が腫瘍組織に浸潤することによって、ＣＴＬが腫瘍組織に浸潤し、腫瘍細胞を殺傷させることができる。
上段は、ＰＫＨ標識ＤＯ１１．１０の固形腫瘍（ＥＬ４腫瘍およびＥ．Ｇ７（ＯＶＡ遺伝子を発現するＥＬ４）腫瘍）への浸潤数を示す図である。下段は、脾臓内のＰＫＨ陽性細胞数を示す図である。ＫＯは、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ－Ａβ ｂ）ＫＯマウス；ＫＯ→Ｆ１は、ＭＨＣクラスＩＩ　ＫＯマウスの骨髄を、ＣＢＦ１マウスに移植したマウス；Ｆ１→ＫＯは、その逆の骨髄キメラマウスを示す。 各腫瘍細胞を２日間捕食させたＦ２－ＩＡｄ細胞、あるいはＯＶＡＩＩでパルスしたＦ２－ＩＡｄ細胞とＤＯ１１．１０細胞を２４時間インキュベーションした後の、ＣＤ６９陽性細胞の割合を示す図である。 クロロキンの存在下、非存在下で３日間ＯＶＡを抗原提示させたＦ２－ＩＡｄ細胞と、ＤＯ１１．１０細胞を２４時間インキュベーションした後の、ＣＤ６９陽性細胞の割合を示す図である。 クロロキンの存在下、非存在下で、各腫瘍細胞を２日間捕食させたＦ２－ＩＡｄ細胞、あるいはＯＶＡＩＩでパルスしたＦ２－ＩＡｄ細胞とＤＯ１１．１０細胞を２４時間インキュベーションした後の、ＣＤ６９陽性の割合を比較した図である。 各種濃度のＯＶＡＩＩでパルスしたＦ２－ＩＡｄ細胞の層を透過して遊走したＤＯ１１．１０細胞の細胞数および、同様に処理したＦ２－ＩＡｄ細胞を認識してＣＤ６９陽性となったＤＯ１１．１０細胞の割合を示す図である。 ＥＬ４－ＥＧＦＰ細胞またはＥＧ７－ＥＧＦＰ細胞を取り込んだ内皮細胞の顕微鏡写真像を示す図である。黒矢印は、細胞内にＥＧＦＰの緑の蛍光を発する腫瘍細胞の残骸を有する内皮細胞を示す。白矢印は、細胞内にＥＧＦＰの緑の蛍光を発する腫瘍細胞を取り込んでいない内皮細胞を示す。 内皮細胞の下に潜り込んだＤＯ１１．１０細胞数を示すグラフである。数えた内皮細胞の総数をｎで示す。縦棒は、標準偏差（ＳＤ）の範囲を示す。計測数にＳｔｕｄｅｎｔのｔ－検定により、Ｐ＜０．０５の有意差が認められた組み合わせをアステリスクで示す。 ＴｈあるいはＣＴＬを活性化するＯＶＡ由来ポリペプチド免疫を施したマウスにおける抗腫瘍効果を示す図である。ＥＬ４は、それぞれの免疫マウスの移植したＥＬ４腫瘍；ＥＧ７は、同じマウスに移植したＥＧ７腫瘍；ＯＶＡ－Ｉは、ＣＴＬ誘導性ペプチド；ＯＶＡ－ＩＩは、Ｔｈ誘導性ペプチド；λは、第三者抗原ペプチドを示す。 ＣＢＦ１マウスのＥＬ４またはＥ．Ｇ７－ＯＶＡ（ＥＧ７）腫瘍内に浸潤したＰＫＨ標識ＯＴ－１細胞数を示す図である。ＣＸＣＲ３－は、ＣＸＣＲ３遺伝子欠損ＣＴＬ；ＩＦＮ－γ－は、ＩＦＮ－γ遺伝子欠損Ｔｈ細胞を示す。 腫瘍塊を形成したマウスに、ＴｈあるいはＣＴＬ、またはその両方の養子免疫を開始した場合の抗腫瘍効果を示す図である。評価に用いたマウスの数は、ＰＢＳ注射群が７、ＤＯ１１．１０単独移入群が７、ＯＴ－１単独移入群が８、ＤＯ１１．１０とＯＴ－１の両方を移入した群が８である。 各ＯＶＩＩの改変体を認識したＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 ＦＣＳを熱不活化していない培養液を用いた場合の、各ＯＶＩＩの改変体を認識したＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 ＦＣＳを熱不活化した培養液を用いた場合の、各ＯＶＩＩの改変体を認識したＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 カプトプリル非含有培地を用いた、各ＯＶＩＩの改変体によるＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 カプトプリル含有培地を用いた、各ＯＶＩＩの改変体によるＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 無血清培地を用いた、各ＯＶＩＩの改変体によるＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 ＣＨ１－ＩＡｄ細胞上に発現するＩ－Ａｄ分子への各ビオチン化ＯＶＩＩの改変体の結合性を示す図である。 各ビオチン化ＯＶＩＩの改変体によるＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 各ビオチン化ＯＶＩＩの改変体によるＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 各ビオチン化または非ビオチン化ＯＶＩＩの改変体によるＤＯ１１．１０細胞の増殖を示す図である。 血清ぺプチダーゼに対する各ＯＶＩＩの改変体の消化耐性を示す図である。ａ．－ｄ．では血清としてマウス血清、ｅ．では血清としてヒト血清、ｆ．ではコアペプチドの部分をＯＶＩＩペプチドに代えてＭＣＣペプチドを用いた。 カプトプリル含有緩衝液を用いた、ＯＶＩＩペプチドの消化実験を示す図である。 ｏ－フェナントロリン含有緩衝液を用いた、ＯＶＩＩペプチドの消化実験を示す図である。 ベスタチン含有緩衝液を用いた、ＯＶＩＩペプチドの消化実験を示す図である。 抗原提示細胞が持つＡＣＥ活性に対して、阻害剤を用いた、基質ペプチドの消化実験を示す図である。横軸は基質添加後のインキュベーション時間、縦軸は蛍光ユニットを示す。 各ＯＶＩＩの改変体を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ免疫による、ＣＤ６９陽性ＤＯ１１．１０細胞の割合を示す図である。 ＷＡ３６の改変体を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ免疫による、ＩＦＮ－γ陽性Ｔｈ細胞の割合を示す図である。 Ｗ３３２の改変体を用いた、ＨＬＡ－ＤＲ１５を有するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）中の、Ｗ３３２反応性Ｔｈ細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ誘導活性を示す図である。細胞内ＩＦＮγ染色とＣＤ４染色を行いフローサイトメーターで解析し、ＣＤ４陽性細胞中の細胞内ＩＦＮγ陽性細胞の割合を示している。 Ａ：ＰｂＷ３３２ｂＰβが、ＨＬＡ－ＤＲ分子を発現するＣＨ１－ＤＲ４細胞に結合することを示す図である。Ｂ：Ｃ―Ｆに示す、それぞれ５匹のマウスが示す腫瘍の成長カーブの平均値を示すグラフである。腫瘍の長径とそれに直交する最大の短径の積を縦軸に示す。縦棒は、標準偏差（ＳＤ）の範囲を示す。Ｃ：アジュバントである百日咳全菌体ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　ｖａｃｃｉｎｅ：Ｗｃ）のみを免疫したＣＢＦ１マウスに接種したＦＢＬ３　ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ細胞の腫瘍成長カーブを示すグラフである。Ｄ：ＷｃとＷＴ１腫瘍抗原特異的Ｔｈ細胞を誘導するＷ３３２ペプチドを免疫したマウスにおけるＦＢＬ３腫瘍の成長カーブを示すグラフである。Ｅ：ＷｃとＷＴ１腫瘍抗原を認識するＣＴＬを誘導するＤｂ１２６ペプチドを免疫したマウスにおけるＦＢＬ３腫瘍の成長カーブを示すグラフである。Ｆ：ＷｃとＷ３３２とＤｂ１２６の両方を免疫したマウスおけるＦＢＬ３腫瘍の成長カーブを示すグラフである。 生きた抗原提示細胞上におけるＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチドの結合活性の結合競合試験を示す。 生きた抗原提示細胞上におけるＨＬＡ－ＤＲ４分子へのペプチド結合活性の結合競合試験を示す図である。
　本発明者は、血管内皮細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に提示された腫瘍特異的抗原由来ポリペプチドを認識して、腫瘍特異的Ｔｈ細胞が腫瘍組織に移行することを初めて見出した。生体内において特定の腫瘍抗原を認識するＴｈ細胞を活性化するためには、生理条件下では抗原提示細胞（ＡＰＣ）に腫瘍特異的抗原タンパク質が取り込まれ、消化されてできるポリペプチドが、抗原提示細胞のＨＬＡクラスＩＩ分子に提示される必要がある。この消化のステップをバイパスし、ＡＰＣに直接合成ペプチドを加えて、ＨＬＡクラスＩＩ分子に提示させることも可能である。しかし、実際に腫瘍特異的抗原由来ポリペプチドを対象に投与した場合、血液中または抗原提示細胞表面に存在するタンパク質（ペプチド）分解酵素によって、該ポリペプチドが分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に充分に該ポリペプチドが提示されない可能性を示唆する結果が得られた。そこで、腫瘍特異的抗原由来ポリペプチドを抗原提示細胞上に効率的に提示させるため、本発明は、腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、単離されたポリペプチド（以下、本発明の抗原ペプチドと表記する場合がある）の改変体（本発明の改変体と表記する場合がある）を提供する。
　なお、本明細書におけるペプチドまたはタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
　本明細書において腫瘍とは、例えば、腎臓がん、肺がん、食道がんをはじめとする消化器がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、肉腫などの固形悪性腫瘍または白血病や血液悪性腫瘍が挙げられるが、そのうち腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍が好ましく挙げられる。これらの腫瘍はステージの進行した腫瘍であってもよい。また、腫瘍特異的抗原とは、正常組織または正常細胞においては発現が見られないが、腫瘍組織または腫瘍細胞においては発現が見られる抗原だけでなく、腫瘍組織または腫瘍細胞における発現量が、正常組織または正常細胞の発現量と比較して有意に高い抗原も含んでよい。そのような腫瘍特異的抗原としては、例えば、抗体産生、細胞性免疫等の免疫反応を誘導する活性を有するタンパク質（ペプチド）が挙げられるが、なかでも、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激するＴ細胞（Ｔｈ１細胞）を誘導するべく、プロセシングを受けて断片化したポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に認識されるような腫瘍特異的抗原がより好ましい。腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する単離されたポリペプチドとしては、７－２０アミノ酸長程度、より好ましくは、９－１７アミノ酸長程度、さらに好ましくは、９－１５アミノ酸長程度のものが用いられる。プロセシングを受けて、ＭＨＣクラスＩＩ分子に認識される腫瘍特異的抗原としては、例えば、ＷＴ１（Ｗｉｌｍｓ’　ｔｕｍｏｒ－１）、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅなどが挙げられ、好ましくはＷＴ１である。あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に認識される別の腫瘍特異的抗原としては、ヒトをはじめとする哺乳動物に感染することにより、前記腫瘍を引き起こすウイルスに由来するタンパク質であってもよい。そのような抗原としては、例えば、悪性腫瘍の発生に強く関連するウイルス群由来のタンパク質をいい、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスやＥＢウイルスをはじめとする悪性腫瘍の発生に強く関連するウイルス群由来のタンパク質もしくはそのアミノ酸配列の一部を含むペプチドをいう。また、腫瘍特異的抗原由来ポリペプチドは全長タンパク質であってもよいが、抗原としての免疫原性を有する限り、部分ペプチドであってもよい。そのような腫瘍特異的抗原としては、具体的には、ＷＴ１であれば、ＷＯ００／０６６０２、ＷＯ００／２６２４９、ＷＯ２００６／０３０７７０等に記載のものが好ましく用いられ得る。より具体的には、ＷＴ１抗原由来のポリペプチドとしてＷ３３２（ＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨ；配列番号：１）、ＷＡ３６（ＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳ；配列番号：２）等が挙げられる。ＰＳＡ由来のポリペプチドとしてＰＳＡ２２１－２４０（ＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰ；配列番号：３）、ＭＡＧＥ－３由来のポリペプチドとして２４３－２５８（ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ；配列番号：４）、ＣＥＡ由来のポリペプチドとして３２１－３３３（ＬＷＷＶＮＮＱＳＬＰＶＳＰ；配列番号：５）、６５３－６６７（ＹＡＣＦＶＳＮＬＡＴＧＲＮＮＳ；配列番号：６）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ由来のポリペプチドとして９７－１１１（ＴＬＧＥＦＬＫＬＤＲＥＲＡＫＮ；配列番号：７）、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ由来のポリペプチドとして、１７５－１８５（ＥＩＷＲＤＩＤＦＡＨＥ；配列番号：８）、また、具体的には、Ｃ型肝炎ウイルスペプチドとしては、ＷＯ　２００５／１０５９９３等に記載の配列番号１８４のアミノ酸番号７８９－７９７（ＡＬＹＧＶＷＰＬＬ；配列番号：９）やアミノ酸番号１１１－１３０（ＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧＫＶＩＤＴＦＴＣＧＬ；配列番号：１０）、アミノ酸番号１６１－１８０（ＳＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧＣＳＦＳＩＦＬＬＡ；配列番号：１１）が好ましく用いられ得る。ＥＢウイルスペプチドとしては、ＬＭＰ－１　１５９－１７５（ＹＬＱＱＮＷＷＴＬＬＶＤＬＬＷＬＬ；配列番号：１２）が好ましく用いられ得る。
　本発明の改変体は、本発明の抗原ペプチドをｉｎ　ｖｉｖｏで投与またはｉｎ　ｖｉｔｒｏで添加した際に、タンパク質（ペプチド）分解酵素によって分解されない、または分解されにくいように改変されたＭＨＣクラスＩＩ分子結合性の単離されたポリペプチドである。ここで、ペプチド分解酵素としては、アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ；ＣＤ２６）、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、アミノペプチダーゼＰなどが挙げられる。ＡＣＥは、ペプチド鎖のＣ末端からジペプチドを遊離する活性を持つが、Ｐｒｏ－Ｘからなるジペプチドを遊離させることはできない。ＤＰＰＩＶは、ペプチド鎖のＮ末端から２番目にプロリン残基を有するペプチドからプロリン残基を含むジペプチド（Ｘ－Ｐｒｏ）を遊離させる活性を持つ。ＣＤ１３は、ぺプチド鎖のＮ末端からアミノ酸を遊離させる活性を持つが、Ｘ－Ｐｒｏを切断することはできない。アミノペプチダーゼＰは、ぺプチド鎖のＮ末端からアミノ酸を遊離させる活性を持ち、Ｘ－Ｐｒｏも切断する。本発明の抗原ペプチドに施される改変は、改変体がタンパク質（ペプチド）分解酵素に対して耐性があり、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって抗原提示され、ＭＨＣクラスＩＩ分子－本発明の改変体（あるいは本発明の抗原ペプチド）の複合体がＴｈ細胞のＴＣＲに認識される限り特に制限はないが、例えば、本発明の抗原ペプチドからの数個のアミノ酸の欠失、本発明の抗原ペプチドへの数個の付加、本発明の抗原ペプチドへの数個のアミノ酸の挿入、本発明の抗原ペプチドの数個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、またはそれらの組み合わせも含まれるが、好ましくは、本発明の抗原ペプチドへの数個の付加が挙げられる。また、ここで数個とは、１または２個以上（１～３０個程度、好ましくは１～１０個程度、さらに好ましくは数（１～５）個）のアミノ酸をいう。
　本発明の抗原ペプチドへ数個のアミノ酸を付加、挿入または置換する場合、付加、挿入または置換されるアミノ酸としては、２０種類の天然アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ）あるいは修飾もしくは非天然アミノ酸（例えば、ビオチン化されたアミノ酸（例えば、ビオチン化されたＬｙｓ（Ｌｙｓのεアミノ基にビオチンを共有結合させたＬｙｓ）、Ｎα－ビオチン化アミノ酸、アセチル化されたアミノ酸（Ｎ末端アミノ基をアセチル化させたアミノ酸）、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、β－Ａｌａ、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン等）であってよい。また、天然に存在する２０種のα－アミノ酸のほか、β－アミノ酸（例えば、β－Ａｌａ）、γ－アミノ酸などをも含んでよい。また、これらのアミノ酸は、疎水性であっても親水性であってもよいが、親水性アミノ酸である方が好ましい。ここで疎水性アミノ酸とは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＧｌｙを意味し、塩基性アミノ酸とは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓを意味し、酸性アミノ酸とは、Ａｓｐ、Ｇｌｕを意味し、親水性中性アミノ酸とは、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＣｙｓを意味する。これらのアミノ酸のうち、α―アミノ酸はＬ体であってもＤ体であってもよく、両者が混在していてもよいが、好ましくはＬ体である。また、抗原ペプチドにアミノ酸が付加される場合、その付加される位置は、ペプチド分解酵素による分解耐性であり、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって抗原提示されるものである限り特に制限はないが、通常、本発明の抗原ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端である。
　また、付加される数個のアミノ酸（ペプチド）は直鎖ペプチドであっても分枝鎖（デンドリマー型）ペプチドであってもよい。例えば、本発明の改変体がＡｒｇやＬｙｓなどの側鎖にアミノ基を有するアミノ酸を含有する場合、該アミノ基と他のアミノ酸もしくはペプチドのカルボキシル基とを結合させることにより、分枝鎖を形成することができる。また、本発明の改変体がＧｌｕやＡｓｐなどの側鎖にカルボキシル基を有するアミノ酸を含有する場合、該カルボキシル基と他のアミノ酸もしくはペプチドのアミノ基とを結合させることにより、分枝鎖を形成することができる。さらに、本発明の改変体がＣｙｓを含有する場合には、他のＣｙｓもしくはそれを含むペプチドとのジスルフィド結合を介して分枝鎖を形成することもできる。
　本発明の抗原ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、前述のアミノ酸の通りであるが、好ましくは下式（Ｉ）：
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４　（Ｉ）
（式中、
（１）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基を示す（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す）、
（２）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す、または
（３）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４はβ－Ａｌａを示す）
によって表されるアミノ酸配列である。
　なお、本明細書においてＸｎが単結合であるとは、実質的にＸｎにアミノ酸が存在せず、Ｘ（ｎ－１）のアミノ酸の不斉炭素原子に結合したカルボキシル基とＸ（ｎ＋１）のアミノ酸の不斉炭素原子に結合したアミノ基がペプチド結合による単結合によって連結されていることをいう。従って、例えば、式（Ｉ）において、Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏおよびＸ４はβ－Ａｌａであるとは、そのアミノ酸配列はビオチン化されたＬｙｓ－Ｐｒｏ－β－Ａｌａのアミノ酸配列として表現される。
　より好ましくは、本発明の抗原ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（Ｉ）において、
（１）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸）、または
（２）Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３がＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸、
によって表されるアミノ酸配列である。
　さらに好ましくは、本発明の抗原ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（Ｉ）において、
Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３は単結合、Ｘ４はＧｌｙまたはカルボキシル基、
Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はＡｌａまたはβ－Ａｌａ、または
Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はβ－Ａｌａ
によって表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
　最も好ましくは、本発明の抗原ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（Ｉ）において、Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はβ－Ａｌａによって表されるアミノ酸配列である。
　また、本発明の抗原ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、前述のアミノ酸の通りであるが、好ましくは下式（ＩＩ）：
Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３　（ＩＩ）
（式中、
（１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合を示す、または
（２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓを示す）
によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である。
　なお、本明細書においてＹｎが単結合であるとは、上記のＸｎが単結合である場合と同様である。
　より好ましくは、本発明の抗原ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（ＩＩ）において、
（１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合、または
（２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である。
　さらに好ましくは、本発明の抗原ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（ＩＩ）において、
Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３は単結合、
Ｙ１はアミノ基、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ、または、
Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
によって表されるアミノ酸配列である。
　最も好ましくは、本発明の抗原ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（ＩＩ）において、Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓによって表されるアミノ酸配列である。
　また、本発明の改変体の一例としては、例えば、前記のＷＴ１抗原に由来する抗原ペプチド（Ｗ３３２、ＷＡ３６）のＮ末端および／またはＣ末端に、上記のようなアミノ酸配列を付加することによって得られるものである。具体的には、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：４０によって示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが、本発明の改変体として挙げられる。
　また、本発明の改変体は、Ｃ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチルなどのＣ１－６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３－８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのＣ６－１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－Ｃ１－２アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－Ｃ１－２アルキル基などのＣ７－１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　本発明の改変体がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
　さらに、本発明の改変体には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アルカノイルなどのＣ１－６アシル基、またはビオチン化など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－ＯＨ、－ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ポリペプチドなども含まれる。
　本発明の改変体は遊離体であってもよいし、塩の形態であってもよい。本発明の改変体の塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
　本発明の改変体は、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。
　ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明の改変体を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする改変体を製造することができる。
　ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（ｉ）～（ｖ）に記載された方法に従って行われる。
（ｉ）Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
　このようにして得られた改変体は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
　上記方法で得られる改変体が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に改変体が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
　本発明の改変体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４－ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４－メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４－ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４－（２’，４’－ジメトキシフェニル－ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４－（２’，４’－ジメトキシフェニル－Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂、ＰＥＧ－Ｗａｎｇ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α－アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする改変体の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から本発明の改変体を切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的の本発明の改変体を取得する。
　上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
　保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約－２０℃～５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５～４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
　原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
　原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４－メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ－Ｚ、Ｂｒ－Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２－ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
　カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２－アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４－ニトロベンジルエステル、４－メトキシベンジルエステル、４－クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
　セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ－ブチル基などである。
　チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２－Ｂｚｌ、２－ニトロベンジル、Ｂｒ－Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
　ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
　保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ－黒あるいはＰｄ－炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約－２０℃～４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４－ブタンジチオール、１，２－エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４－ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２－エタンジチオール、１，４－ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
　原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５－トリクロロフェノール、２，４－ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ－ヒドロキシスクシミド、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
　改変体のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα－カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα－アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質等とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質等とを製造し、この両タンパク質等を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護改変体を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の改変体を得ることができる。この改変体は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の改変体のアミド体を得ることができる。
　改変体のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα－カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、改変体のアミド体と同様にして、所望の改変体のエステル体を得ることができる。
　このようにして得られた改変体がＭＨＣクラスＩＩ分子結合性を有することは、例えば、後述の実施例に記載の方法に従って確認することができるが、公知の他の手法を用いることもできる。
　本発明の改変体は、タンパク質（ペプチド）分解酵素による分解に耐性があり、効率的に抗原提示細胞に該改変体（または抗原ペプチド）を抗原提示させることができる。従って、本発明はまた、腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドの改変体（本発明の改変体）を含む、抗腫瘍剤を提供する。
　本発明の抗腫瘍剤の治療対象となる腫瘍としては、該抗腫瘍剤に含まれる本発明の抗原ペプチドを発現する腫瘍が対象となるが、そのような腫瘍としては、例えば、腎臓がん、肺がん、食道がんを含む消化器がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、肉腫などの固形悪性腫瘍または白血病や血液悪性腫瘍が挙げられる。
　本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる動物は、免疫機構を持つ哺乳動物、即ちヒトおよびヒト以外の哺乳動物であり、ヒト以外の哺乳動物としてはサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどがあげられる。その中でも、ヒトが好ましく適用対象となる。
　本発明の改変体を含有する抗腫瘍剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトに対して経口的、経粘膜的（点眼、鼻粘膜への噴霧、エアロゾルの吸引など）、経皮的、または非経口的（例、血管内投与、皮下投与、皮内投与など）に投与することができる。
　投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の改変体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤、界面活性剤などを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口的、経粘膜的、経皮的、または非経口的投与に適する剤形として提供される。また、除放性を付与するために、基材に吸着あるいは包埋してもよい。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の改変体を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記改変体を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
　経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
　上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。改変体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常１～３ｍｇの上記改変体が含有されていることが好ましい。
　本発明の改変体を含有する抗腫瘍剤は、投与対象、対象とする癌種、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の場合には、本発明の改変体を１回量として、通常０．００１ｍｇ～１０ｇ程度を、１日１～５回程度、好ましくは１日１～３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
　前記した抗腫瘍剤は、本発明の改変体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。例えば、本発明の抗腫瘍剤は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５－フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗腫瘍剤および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
　また、本発明の抗腫瘍剤は、さらに腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドを含んでも良い。ＭＨＣクラスＩ分子結合性の腫瘍特異的抗原由来ポリペプチドを含むことで、Ｔｈ細胞だけでなく、ＣＴＬを同時に誘導することができる。ここで、ＭＨＣクラスＩ分子結合性の腫瘍特異的抗原は、プロセシングを受けて断片化したポリペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に認識されるような腫瘍特異的抗原であってよく、そのような抗原としては、例えば、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＡＲＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｇｐ－１００、ＭＵＣ－１、ｐ５３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ－３、悪性腫瘍の発生に強く関連するウイルス群由来のタンパク質などが挙げられるが、そのなかでも本発明の抗原ペプチドと同じ腫瘍由来の特異的抗原であることが好ましく、例えばＷＴ１が挙げられる。また、腫瘍特異的抗原由来ポリペプチドは全長タンパク質であってもよいが、抗原としての免疫原性を有する限り、部分ペプチドあってもよい。具体的には、ＷＴ１抗原由来のポリペプチドとしてＷ１０（ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ；配列番号：１３）、Ｗ３０２（ＲＶＰＧＶＡＰＴＬ；配列番号：１４）、Ｗ２９２（ＧＶＦＲＧＩＱＤＶ；配列番号：１５）などが挙げられる。
　本発明の腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドのアミノ酸配列長は、ＭＨＣクラスＩ分子によって抗原提示可能なアミノ酸長であれば特に制限はないが、通常約８～約１１アミノ酸であり、好ましくは約９アミノ酸である。
　さらに、腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドは、本発明の改変体と同様にペプチド分解酵素によって分解を受けないように修飾された改変体であってよい。修飾の態様は、前述した本発明の改変体における態様と同様であってよく、該改変体の合成・分離についても、前述した本発明の改変体に記載した合成法・分離法に従って行うことができる。
　また、本発明の抗腫瘍剤は、さらにアジュバントを含んでも良い。アジュバントとしては、百日咳ワクチン、結核菌細胞壁骨格（ＢＣＧ－ＣＷＳ）、非メチル化デオキシＣｐＧ、イミキモド、ｐｏｌｙ－ＩＣ、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、Ｆｌｔ３、αＧａｌ－Ｃｅｒ、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等が挙げられる。百日咳ワクチンは、ホルムアルデヒド処理または加熱処理した百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の細胞壁断片を含む全菌体百日咳ワクチン、百日咳菌から半精製または精製した成分（例、百日咳毒素、繊維状赤血球凝集素など）を含む無細胞百日咳ワクチンなどが挙げられる。百日咳ワクチンの調製方法は、公知の方法が限定なく使用できる。また、百日咳ワクチンは、市販品を用いてもよく、例えば、ＢＩＯＦＡＲＭＡ社（インドネシア）などから入手できる。
　また、本発明の改変体は、被験者のもつ抗原提示細胞が、該改変体に含まれる本発明の抗原ペプチドが結合しうるＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しているか否かの検査に用いることができる。本方法により、被験者が本発明の改変体を含む本発明の抗腫瘍剤の投与対象となり得るか否かを判断することができる。従って、本発明はまた、被験者由来の抗原提示細胞集団と本発明の改変体を培養し、抗原提示細胞集団と該改変体の結合を確認する、被験者が本発明の抗原ペプチドに結合するＭＨＣクラスＩＩ分子を持つか否かを検査する方法を提供する。
　本発明の検査方法が実施される被験者は、前記の抗腫瘍剤の治療対象となる腫瘍患者、またはそれら腫瘍の疑いがあると判断される者が含まれる。
　本発明の検査方法に用いられる抗原提示細胞集団としては、上記被験者から採取されるものであれば特に制限されない。そのような抗原提示細胞集団としては、例えば、全血、リンパ液、脳脊髄液等の体液もしくはそのフラクションなどが挙げられる。迅速且つ簡便に採取することができ、被験者への侵襲が少ないなどの点から、血液、リンパ液等が特に好ましい。これらの抗原提示細胞集団は、新鮮な生きた細胞が最も好ましいが、０．１－１％パラフォルムアルデヒドなどで軽く固定したものでもよい。また、対照に用いる細胞集団として、異なる遺伝子型のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞や、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない細胞集団を用いることができる。
　本発明の改変体と抗原提示細胞集団は、例えば両者を接触させたのち、数時間から一晩培養し、遊離のペプチドを除いたのち、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したビオチンペプチドに、さらに蛍光標識したアビジン試薬を結合させ、細胞に結合した蛍光量をフローサイトメトリーによって測定することで、結合するか否かを確認できる。
　また、本発明の抗原ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に施される改変を用いれば、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞に、該改変を施した任意のペプチドが結合しうるか否か検査することができる。従って、本発明はまた、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞とＮ末端および／またはＣ末端が改変された任意のペプチドを培養し、該抗原提示細胞と該ペプチドの結合を確認する、該抗原提示細胞に該ペプチドが結合しうるか否かを検査する方法を提供する。
　抗原提示細胞は、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現していれば、哺乳類（好ましくはヒト）などから回収されたものであってもよいし、株化されたものであってもよい。これらの抗原提示細胞は、新鮮な生きた細胞が最も好ましいが、０．１－１％パラフォルムアルデヒドなどで軽く固定したものでもよい。
　任意のペプチドとしては、７－２０アミノ酸長程度、より好ましくは、９－１７アミノ酸長程度、さらに好ましくは、９－１５アミノ酸長程度のものが用いられる。該ペプチドはＮ末端および／またはＣ末端に改変を施されるが、そのような改変としては、上記した改変が適用される。
　即ち、該ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、好ましくは下式（Ｉ）：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４　（Ｉ）
（式中、
（１）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基を示す（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す）、
（２）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す、または
（３）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４はβ－Ａｌａを示す）
によって表されるアミノ酸配列である。
　より好ましくは、該ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（Ｉ）において、
（１）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸）、または
（２）Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３がＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸、
によって表されるアミノ酸配列である。
　さらに好ましくは、該ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（Ｉ）において、
Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３は単結合、Ｘ４はＧｌｙまたはカルボキシル基、
Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はＡｌａまたはβ－Ａｌａ、または
Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はβ－Ａｌａ
によって表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
　最も好ましくは、該ペプチドのＣ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（Ｉ）において、Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はβ－Ａｌａによって表されるアミノ酸配列である。
　また、該ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、前述のアミノ酸の通りであるが、好ましくは下式（ＩＩ）：
Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３　（ＩＩ）
（式中、
（１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合を示す、または
（２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓを示す）
によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である。
　より好ましくは、該ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（ＩＩ）において、
（１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合、または
（２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である。
　さらに好ましくは、該ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（ＩＩ）において、
Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３は単結合、
Ｙ１はアミノ基、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ、または、
Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
によって表されるアミノ酸配列である。
　最も好ましくは、該ペプチドのＮ末端側に付加されてもよいアミノ酸は、式（ＩＩ）において、Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓによって表されるアミノ酸配列である。
　抗原提示細胞と該改変を施した任意のペプチドの接触方法や、培養方法については、上述した検査方法に記載の方法に従ってよい。即ち、任意のペプチドに本発明の改変を加えて消化酵素に対する耐性とビオチン修飾を付与したものを指標ペプチドとして抗原提示細胞に結合させ、それにたとえば蛍光標識したストレプトアビジンを結合させることにより、指標ペプチドの結合量を定量測定することができる。さらにこの結合測定系に、消化耐性をもたせたビオチン修飾のない改変ペプチドを加えて、指標ペプチドの結合を競合阻害させることにより、任意のアミノ酸配列の改変ペプチドについて、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する結合活性を比較定量することができる。
　本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
　ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
　ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
　　Ａ　　　　　　：アデニン
　　Ｔ　　　　　　：チミン
　　Ｇ　　　　　　：グアニン
　　Ｃ　　　　　　：シトシン
　ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
　ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
　ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
　ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
　ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
　ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
　ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
　ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
　ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
　Ｇｌｙ 　　　　 ：グリシン
　Ａｌａ　　　　　：アラニン
　Ｖａｌ　　　　　：バリン
　Ｌｅｕ　　　　　：ロイシン
　Ｉｌｅ　　　　　：イソロイシン
　Ｓｅｒ　　　　　：セリン
　Ｔｈｒ　　　　　：スレオニン
　Ｃｙｓ　　　　　：システイン
　Ｍｅｔ　　　　　：メチオニン
　Ｇｌｕ　　　　　：グルタミン酸
　Ａｓｐ　　　　　：アスパラギン酸
　Ｌｙｓ　　　　　：リジン
　Ａｒｇ　　　　　：アルギニン
　Ｈｉｓ　　　　　：ヒスチジン
　Ｐｈｅ　　　　　：フェニルアラニン
　Ｔｙｒ　　　　　：チロシン
　Ｔｒｐ　　　　　：トリプトファン
　Ｐｒｏ　　　　　：プロリン
　Ａｓｎ　　　　　：アスパラギン
　Ｇｌｎ　　　　　：グルタミン
　ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
　Ｓｅｃ　　　　　：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
　β－Ａｌａ　　　：β－アラニン
　以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
（細胞とマウス）
　腫瘍細胞としてＥＬ４およびＥＬ４にＯＶＡ遺伝子を導入してＯＶＡタンパク質を発現するようになったＥ．Ｇ７－ＯＶＡ（ＥＧ７）をＨ．Ｎ．Ｅｉｓｅｎ博士より譲渡された。ＣＤ４　Ｔ細胞クローンであるＤＯ１１．１０細胞はＤＯ１１．１０　ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＤＯ１１．１０ｔｇ）由来のものを用いた（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：１７２０－１７２３，１９９０）。ＤＯ１１．１０細胞は、２％ラットＣｏｎＡ上清（ＲＣＳ）を含む１０％　ＦＣＳ　ＤＭＥＭ中で、０．７５μＭ　ＯＶＡＩＩペプチド（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ）とインキュベートしたＢＡＬＢ／ｃ由来脾臓細胞を放射線処理したもので週一回刺激をして、培養した。また、Ｉ－Ａｋ拘束性にＭＣＣペプチドを認識する、ＡＮＤ　ＴＣＲｔｇをＮａｋａｎｏ博士より譲渡された。ＣＨ１細胞はＡＴＣＣより購入し、１０％ＦＣＳ－Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　ＭＤＭ（ＩＭＤＭ）中で維持した。ＣＨ１－ＩＡｄおよびＣＨ１－ＩＡｂ細胞は、発現ベクターとしてｐＭＸ（Ｋｉｔａｍｕｒａ博士より譲渡）を用いて、レトロトランスダクションによって調製した。これらはいずれも、Ｉ－ＡβおよびＩ－Ａα鎖のｃＤＮＡに、この順番でタンデムに並び、その間にＩＲＥＳ配列が入るように挿入した。Ｆ－２♀（Ｆ２）細胞は、ＣＢＦ１マウス由来のＵＶ形質転換細胞株としてバイオリソースセンター（つくば市）より購入した。また、Ｆ２－ＩＡｄ細胞は上記のＣＨ１－ＩＡｄ細胞と同様の手法で樹立した。
（ペプチド）
　ＯＶＩＩ（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡ；配列番号：１７）は、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ由来の既報のＩ－Ａｄ結合性エピトープＯＶＡＩＩ　３２３－３３９（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ；配列番号：１６）（Ｓｈｉｍｏｎｋｅｖｉｔｚ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３３：２０６７－２０７４，１９８４）から、３２３－３３７番目のアミノ酸配列を抜き出したペプチドである。ＭＣＣ（ＮＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＱＡＴＫ；配列番号：４２）は、Ｉ－Ａｋ結合性蛾ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃペプチドの８９－１０３番目のアミノ酸配列である（Ｂｕｕｓ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：１３５３－１３５８，１９８７）。Ｆｍｏｃ法で手動合成し、Ｃ１８カラム用いた逆相ＨＰＬＣによって９５％以上の純度に精製した。ペプチド濃度は、ＢＳＡを標準として用いてＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって決定した。ビオチン化ペプチドは、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｉｏｔ）－ＯＨを用いて合成した。合成したペプチドを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（血管内皮細胞の抗原提示）
　ＥＬ４細胞は最初にＲＧＤペプチドでオプソニン化した。次に、浸透圧負荷によって５ｍｇ／ｍｌのＯＶＡタンパク質を細胞質に負荷した。充分に洗浄した後、２４ｗｅｌｌプレートのＦ２－ＩＡｄ細胞（５００Ｕ／ｍｌのｒｍＩＦＮ－γの存在下、予め２日間培養した）のコンフルエント培養液に２×１０６のＥＬ４細胞を加えた。コントロールとして、ＰＢＳをｍｏｃｋ負荷したＥＬ４およびＥＧ７を同様の方法でＲＧＤ修飾し、用いた。ＥＬ４その他の標的細胞を、Ｆ２－ＩＡｄに加え、この細胞混合液を２４時間培養した。Ｆ２－ＩＡｄ細胞を直接ＯＶＡＩＩペプチドで負荷したコントロールｗｅｌｌについては、培養の最後に２時間、細胞をペプチドでパルスした。浮遊細胞と死細胞の残骸を除去後、接着したＦ２－ＩＡｄ細胞の表面充分に洗浄した。また、クロロキンを用いた抗原提示阻害実験では、ＥＬ４、ＯＶＡで負荷したＥＬ４または０．２５ｍｇ／ｍｌＯＶＡタンパク質を加える３０分前に１００μＭクロロキンを加えた。さらにクロロキンの持続的存在下でＦ２－ＩＡｄ細胞を３日間培養した。
（抗原提示マーカーの検出）
　Ｆ２－ＩＡｄ細胞が該細胞表面上に標的抗原ポリペプチドを抗原提示したか否かは、ＤＯ１１．１０細胞のＣＤ６９の発現をモニターすることで判定した。抗原提示したＦ２－ＩＡｄ細胞とＤＯ１１．１０細胞を混ぜて遠心し、細胞同士を接触させたのち、６時間および２４時間後に、ビオチン標識抗ＣＤ６９　ｍＡｂ（Ｈ１．２Ｆ３，ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、フローサイトメトリーによってＤＯ１１．１０細胞（抗ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ　ＴＣＲ　ｍＡｂであるＫＪ１．２６をＦＩＴＣ標識したもので陽性に染色される）のＣＤ６９の発現を検出した。
（細胞遊走試験）
　Ｆ２－ＩＡｄ細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート（ＢＤ　Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＣＡ）のインサート上でコンフルエントになるまで培養した。培養の最後３日間は５００Ｕ／ｍｌのｒｍＩＦＮ－γの存在下で培養した。また、培養の最後２時間は、種々の濃度のＯＶＡＩＩペプチドでＦ２－ＩＡｄ細胞をパルスした。培養後、Ｆ２－ＩＡｄ細胞を洗浄し、ＤＯ１１．１０トランスジェニック脾臓細胞からネガティブセレクション（Ｄｙｎａｌ　ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により、ＣＤ４＋細胞が純度９５％以上になるように単離し、これを、１穴あたり、４×１０６個加えた。３７℃でインキュベートし、６時間後までにチャンバーの下に遊走したＤＯ１１．１０の数を数えた。
（ペプチド結合アッセイ）
　ＣＨ１－ＩＡｄまたはＣＨ１－ＩＡｂ細胞を２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように２％ＢＳＡ　ＩＭＤＭ中に懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌを、血清を含まないＩＭＤＭ中で連続的に希釈したペプチド１００μｌに加えた。３７℃で２時間、６時間あるいは１６時間インキュベートし、細胞を洗浄後、ＦＩＴＣ－ストレプトアビジンで染色した。細胞に結合したペプチドの量をフローサイトメトリーで計測した。
（ＣＤ４　Ｔ細胞の増殖）
　２％ＲＣＳを含有する１０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ中で段階希釈をして濃度傾斜をつけた各ＯＶＩＩ改変ペプチドと共に、９６穴Ｕプレートに、１穴あたり１ｘ１０５個のＤＯ１１．１０ｔｇまたはＡＮＤｔｇ由来の脾臓細胞を入れてインキュベートし、該脾臓細胞の増殖を測定した。３７℃で７２時間インキュベートし、３Ｈ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、シンチレーションカウントのため２４時間後に細胞を回収した。特に記載をした実験では、ＦＣＳは５６℃で３０分間の熱不活化を行った。特に記載をした実験では、カプトプリルを培地中に添加した。いくつかの実験では、ＡＩＭ－Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）培地を用いた。それらの実験では、３ｘ１０５個のＤＯ１１．１０の脾臓細胞／ｗｅｌｌを各ＯＶＩＩ改変ペプチドで刺激した。
（ペプチドの分解）
　１０％の新鮮マウス血清または新鮮ヒト血清を含むＴＢＳ中でペプチドを消化した。３７℃で示された時間インキュベート後、多様な血清タンパク質を沈殿して除くため、１％トリフルオロ酸を添加した。短い遠心分離の後、可溶性画分を、Ｃ１８分析用カラムを用いた逆相ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ毎にロードしたペプチドの総量の振れを補正するため、内部コントロールとして血清に含まれる非蛋白性の２２０ｎｍの波長で吸収されるピークを使った。未消化ペプチドのピーク面積をＣｈｒｏｍａｔｏｐａｃ　Ｃ－Ｒ８Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｃｏｒｐ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で定量的にモニターし、残存ペプチド量を計算した。
（ＡＣＥ活性の測定）
　細胞表面のＡＣＥの活性をＳａｂａｔｉｎｉ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　３６３：２５５－２６２，２００７に記載の方法を改変して測定した。
（Ｔｈ細胞誘導性ペプチドを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ免疫）
　ＣＢＦ１マウスを、Ｔｈエピトープペプチドとしてλリプレッサーペプチド（ＬＥＤＡＲＲＬＫＡＩＹＥＫＫＫ；配列番号：３９）またはＯＶＡＩＩペプチドのいずれかとＣＴＬ誘導性ペプチドであるＫｂ－結合性ＯＶＡ－Ｉペプチドでパルスした脾細胞のＬＰＳブラストで免疫した。１つの脾臓由来のＬＰＳブラストをペプチドでパルスしたものを、２匹のマウスに腹腔内注射して免疫した。３回目の免疫の翌日に、９×１０６個のＥＬ４細胞および１．２×１０７個のＥＧ７細胞をマウスの背面皮膚に対になるように皮内移植した。腫瘍サイズを一日おきに計測した。免疫は腫瘍移植から２週間後にもう一度行った。
（改変ペプチドを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ免疫）
　ＰＢＳに溶解したペプチドと１ｘ１０７個の熱不活化百日咳全菌体ワクチンを直前に混合し、足蹠に皮下注射してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。翌日（２４時間後）、膝窩および鼠径リンパ節を摘出し、ＣＤ６９＋（Ｈ１．２Ｆ３，ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）陽性ＤＯ１１．１０（ａ　ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ　ａｎｔｉ－ＴＣＲ　ｍＡｂ　ＫＪ１．２６＋）細胞をフローサイトメトリーで計測した。
実施例１：骨髄キメラマウスに植えた腫瘍内への腫瘍特異的Ｔｈ細胞の浸潤
　１０Ｇｙのγ線照射をしたＣＢＦ１マウスあるいは、９．５Ｇｙの照射をしたＩ－Ａβ ｂＫＯマウスまたは、骨髄キメラマウス（Ｉ－Ａβ ｂＫＯ骨髄をＣＢＦ１マウスに移植した骨髄キメラマウス、ＣＢＦ１マウス骨髄をＩ－Ａβ ｂＫＯマウスに移植した骨髄キメラマウス）に、１．５ｘ１０７個の骨髄移植の前日から移植後１４日まで、１．５％ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（ＤＥＮＫＡ生研）を飲み水に加えた。Ｔｈ移入実験は、骨髄移植から、少なくとも２８日以降に行った。完全にドナー由来の骨髄由来細胞に置き代わっていることは、末梢血単核細胞を抗Ｌｄ　ｍＡｂ（３０－５－７Ｓ）、抗Ｋｂ　ｍＡｂ（Ｙ３）、抗Ｉ－Ａｄ　ｍＡｂ（３９－１０－８）および、抗Ｉ－Ａｂ　ｍＡｂ（２５．９－３）で染色して確認した。ＰＫＨ標識ＤＯ１１．１０は、腫瘍細胞（４ｘ１０６個のＥＬ４、および３ｘ１０６個のＥＧ７）を、それぞれ１匹のＣＢＦ１マウスの背部の、左右の皮内に植えて６日目に腫瘍径が５－７ｍｍ程度になった頃に、２ｘ１０７個移入した。２日後に腫瘍を摘出し、５μｍ厚さの切片を作製した。細胞の重複計数を防ぐため、連続切片の３枚ごとに１枚を標本にしてＰＫＨ陽性細胞の数を数えた（図１）。４００倍の蛍光顕微鏡の２０視野に見えたＰＫＨ陽性細胞の数を、１０スライスについて数え、積算した。
実施例２：血管内皮細胞による抗原提示の検証
　発明者は、アポトーシスした腫瘍細胞を取り込んだ血管内皮細胞（ＥＣ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ）が、腫瘍細胞中の細胞質抗原を分解し、その分解産物であるポリペプチドをＭＨＣクラスＩＩ分子に結合させ、提示することが出来るか否かを検証した。Ｆ２－ＩＡｄ細胞による抗原提示の程度は、反応性ＤＯ１１．１０細胞上の早期活性化マーカーであるＣＤ６９の発現をモニターすることにより調べた。図２に示すように、ＯＶＡＩＩペプチドをパルスした内皮細胞はＤＯ１１．１０細胞を刺激することができた。Ｆ２－ＩＡｄ細胞をオプソニン化ＥＬ４またはＥＧ７と共にインキュベートした場合、約３０％の細胞がアポトーシス腫瘍細胞を取り込んだ。しかし、オプソニン化ＥＧ７は数回の試行を繰り返しても、ＤＯ１１．１０細胞中のＣＤ６９の発現を誘導しなかった。このことは一部には、ＥＧ７細胞中のＯＶＡタンパク質の濃度が低い可能性があると思われた。０．１μＭのＯＶＡＩＩでパルスしたＦ２－ＩＡｄ細胞は、ＯＶＡを負荷したＥＬ４（ＯＶＡ－ｌｏａｄｅｄ　ＥＬ４）を取り込んだ場合と同程度に、ＤＯ１１．１０細胞にＣＤ６９の発現を誘導した。Ｆ２－ＩＡｄ細胞のごく一部の細胞のみがＯＶＡを負荷したＥＬ４を取り込んだが、ＤＯ１１．１０細胞のＣＤ６９発現誘導するに充分な抗原提示があった。本実施例に使った、脾臓細胞からネガティブセレクションで単離したＤＯ１１．１０細胞の純度は、８５％以上がＫＪ１．２６（ＤＯ１１．１０のｃｌｏｎｏｔｙｐｉｃ　ＴＣＲに特異的ｍＡｂ）陽性であり、中全ＣＤ４細胞中では９５％以上がＫＪ１．２６陽性であった。
実施例３：内皮細胞の外因経路の抗原提示を阻害することによる抗原提示への影響
　取り込まれた腫瘍細胞が持つ腫瘍抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって抗原提示されることから、外因経路を介した抗原プロセシングが起こっていると予想されたため、発明者はエンドソーム経由の抗原提示の阻害剤であるクロロキンに抗原提示が感受性であるか否かを検証した。図３、４に示す通り、Ｆ２－ＩＡｄ細胞をクロロキンで処理した場合、外因経路で提示されることが知られているＯＶＡタンパク質の提示は低下した。ＯＶＡを負荷したＥＬ４の抗原提示もまた、クロロキンに対して感受性であった。従って、ＥＬ４の細胞内に存在するＯＶＡタンパク質のＦ２－ＩＡｄによる抗原提示は、主に外因経路を介していると示唆された。
実施例４：血管内皮細胞が、Ｔｈ細胞の遊走を誘導するかどうかの検討
　発明者は、内皮細胞に抗原提示させることによってＤＯ１１．１０　ＣＤ４　Ｔ細胞に内皮細胞層を貫いて通過する遊走活性を誘導できるか否かを検証した。ＤＯ１１．１０細胞との接触前に、予めＦ２－ＩＡｄ細胞をプレートのｔｒａｎｓｗｅｌｌ上に播種し、ＯＶＡＩＩペプチドでパルスした。図５に示したように、パルスしたＯＶＡＩＩペプチド濃度が高かった場合、ＤＯ１１．１０細胞はＦ２－ＩＡｄ細胞に強く接着し、その場で活性化され、Ｆ２－ＩＡｄ細胞層を貫いて遊走することはしなかった。パルスしたＯＶＡＩＩペプチド濃度が低かった（０．１μＭ以下）場合、ＤＯ１１．１０細胞は活発に遊走し、Ｆ２－ＩＡｄ細胞層を通過した。また、該範囲の低濃度のＯＶＡＩＩペプチドでは、ＣＤ６９の発現誘導はほとんど確認できなかった。先に調べたＯＶＡを負荷したＥＬ４を取り込んだ内皮細胞による抗原提示により、いくらかＣＤ６９の発現誘導が起こっており（図２）、それに匹敵するＣＤ６９の発現誘導は、０．１μＭのＯＶＡＩＩペプチドでパルスした内皮細胞による抗原提示で起こっているため、おそらく、ＯＶＡを負荷したＥＬ４を取り込んだ内皮細胞では、０．１μＭのＯＶＡＩＩペプチドでパルスした内皮細胞に匹敵する密度で抗原が提示されていることが推測される。その程度の密度で抗原を提示した内皮細胞を認識してＤＯ１１．１０が高い遊走活性を示すことから、ＯＶＡを負荷したＥＬ４を取り込んだ内皮細胞でも、同程度にＤＯ１１．１０の遊走活性が誘導されると推定される。
実施例５：固形腫瘍から単離された内皮細胞の下へのＴｈ細胞の潜り込み試験
　ＥＬ４－ＥＧＦＰまたはＥＧ７－ＥＧＦＰ細胞をＣＢＦ１マウスに接種した。成長した固形腫瘍を採取し、２０％ＦＣＳ　ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に溶かした２．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で３７℃、３時間、消化した。抗ＣＤ４５マウス抗体３０－Ｆ１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）でコートしたＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、ＣＤ４５陽性細胞の除去を２回行った。コラーゲンＴｙｐｅＩコートベースディッシュ（ＡＧＣ　Ｔｅｃｈｎｏ　Ｇｌａｓｓ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）上で単一細胞懸濁液を培養し、付着した細胞を顕微鏡観察に用いた。ＤｉＩ標識アセチル化ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μｇ／ｍｌで添加し、３７℃で４－５時間、内皮細胞にエンドサイトーシスさせた。アセチル化ＬＤＬ洗浄後、細胞をビオチン化３０－Ｆ１１およびＡｌｅｘａ　６４７標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色した。内皮細胞は、ＤｉＩ標識ＬＤＬを取り込み、赤色に染まって見える。内皮細胞のうち、腫瘍細胞を取り込んだものは、細胞内にＥＧＦＰの緑の蛍光を発する腫瘍細胞の残骸を有し、マゼンタ色（ＣＤ４５陽性細胞）に染まらない細胞として同定できる（黒の矢印）。腫瘍細胞を取り込んでいない内皮細胞は、白い矢印で示した。ＤＯ１１．１０細胞を添加し、共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ１０００Ｄ　ＩＸ８１（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、３７℃で１時間、１５秒ごとに蛍光像を撮影することによって、ＤＯ１１．１０細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ移動を観察した。顕微鏡像を図６に示す。また、内皮細胞の下に潜り込んだＤＯ１１．１０細胞数を図７に示す。
実施例６：ｉｎ　ｖｉｖｏ腫瘍抗原ポリペプチド免疫による抗腫瘍活性の比較
　発明者は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける腫瘍特異的Ｔｈ細胞誘導の抗腫瘍効果を検証すべく、１．ＣＴＬのみ、２．ＣＴＬと第三者抗原特異的Ｔｈ細胞、３．ＣＴＬと腫瘍特異的Ｔｈ細胞を誘導する免疫プロトコルを比較した。抗原提示細胞としては、脾臓細胞のＬＰＳブラストを用い、それぞれのペプチドを単独あるいは混合して加えて結合させたものを毎週１回、３回腹腔注射した。３回目の免疫の日に、背中の対側に、９ｘ１０６個のＥＬ４および１．２ｘ１０７個のＥＧ７腫瘍を植え、４日目から腫瘍径を測定した。図８に示す通り、ＯＶＡ－Ｉペプチドによる腫瘍抗原特異的ＣＴＬの誘導のみでは限られた程度までしか腫瘍のコントロールが出来なかった。また、ＣＴＬと共に、第三者抗原であるλペプチドを用いてλ特異的Ｔｈ細胞を誘導する免疫法では、ＣＴＬ単独誘導に比べ、腫瘍増殖を遅らせることはできたが、最終的にはマウスは死亡した。一方、ＯＶＡ－Ｉと共に、代理腫瘍抗原であるＯＶＡＩＩペプチドでマウスを免疫した場合は、よりよく腫瘍をコントロールすることができた。一部のマウスでは腫瘍が完全に消失した。
実施例７：ＣＴＬの腫瘍内浸潤促進の評価
　ＣＢＦ１マウスの左右の背部にＥＬ４またはＥＧ７を実施例１と同様に植え、７日目にＰＫＨ標識したＯＴ－１（ＯＶＡペプチド２５７－２６４がＫｂに結合したものを認識するＴＣＲを発現するトランスジェニックマウスからクローニングしたＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ））を２ｘ１０７個、単独あるいはＤＯ１１．１０と共に静脈注射をし、その２日目に腫瘍を摘出した。凍結標本を作り、５μｍ厚の切片中のＰＫＨ陽性細胞数を計測した。ＤＡＰＩで核染色を加えた。計数の重複を防ぐため、連続した３枚のうち１枚を標本にした。ＤＯ１１．１０を１ｘ１０６個静脈注射したマウスでは、ＥＧ７への顕著なＯＴ－１の浸潤が観察された（図９）。ＤＯ１１．１０を２ｘ１０７個移入したマウスでは、ＥＬ４への非特異的浸潤が増え、ＥＧ７内への特異的浸潤はかえって減少する傾向があった。ＩＦＮ－γ遺伝子欠損ＤＯ１１．１０を移入した場合には、ＤＯ１１．１０依存性のＯＴ－１の腫瘍内浸潤の増加が見られなくなった。一方、ＣＸＣＲ３遺伝子欠損ＯＴ－１を移入すると、腫瘍内浸潤数が減少し、ＤＯ１１．１０を移入してもほとんど増加しなかった。また、抗原特異性が異なり、ＶＳＶ８ペプチドをＫｂ拘束性に認識するＣＤ８陽性ＣＴＬクローンであるＶＳＶ８を移入した場合には、ＥＬ４とＥＧ７腫瘍への浸潤数の違いはなかったが、ＤＯ１１．１０によるＣＴＬのＥＧ７への浸潤の促進効果が、ＯＴ－１の場合より程度は少なかったが、みられた。
実施例８：ＴｈあるいはＣＴＬ、またはその両者の養子免疫による抗腫瘍効果の検討
　ＣＢＦ１マウスの背部の左右に、４ｘ１０６個のＥＬ４および３ｘ１０６個のＥＧ７腫瘍を植え、６日後に直径が５－７ｍｍになった頃に、ＤＯ１１．１０あるいはＯＴ－１の養子移入を開始した。１ｘ１０６個のＤＯ１１．１０をまず静脈注射し、ＯＴ－１はその翌日に２ｘ１０６個静脈注射した。２日ごとに腫瘍径を測定した。以降、それぞれ５日おきにＤＯ１１．１０とＯＴ－１の養子移入を繰り返した（図１０）。
実施例９：ＯＶＡ　ｅｐｉｔｏｐｅペプチドを用いた修飾ペプチドの設計
　発明者は、上記実施例１～８から、腫瘍組織に侵入したＴｈがＩＦＮ－γを分泌し、それを受けて、ＩＦＮ－γ依存性ケモカインのレセプターであるＣＸＣＲ－３を高発現するＣＴＬの腫瘍内浸潤が促され、その結果、固形腫瘍が縮退すると考えた。発明者は、かかるメカニズムに基づいて、Ｔｈを誘導するＭＨＣクラスＩＩ結合性ポリペプチドに、分解酵素に対する消化耐性を付与する修飾を加えることでＴｈ誘導効率を高め、抗腫瘍免疫を効率的に活性化する戦略を考案した。
　発明者は、ＤＯ１１．１０　ＣＤ４　Ｔ細胞によって認識されるＩ－Ａｄ結合性ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）ペプチドを基本にして、プロテアーゼに対して耐性となるようなＮ末端またはＣ末端の修飾について検討した。ＯＶＩＩ（３２３－３３７）は、元々のＯＶＡＩＩペプチド（３２３－３３９）から２アミノ酸を取り除いたエピトープを含むペプチドである。合成の容易さを勘案し、野生型ペプチドとしてＯＶＩＩを用いた。アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）は、ＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドの前駆体ペプチドのプロセシングに関わる、血清中の主要プロテアーゼであることが報告されている（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１７５：１２２１－１２２６，１９９２；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１７５：１４１７－１４２２，１９９２）。ＡＣＥはジペプチジルカルボキシペプチダーゼであるため（Ｂｅｒｓａｎｅｔｔｉ，Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４３：１５７２９－１５７３６，２００４）、発明者はＯＶＩＩのＣ末端にアミノ酸を付加、特にＡＣＥ酵素による分解を阻害するためにＣ末端から２番目にＰｒｏを有するペプチドを設計した（表１）。また、Ｎ末端Ｐｒｏに対する切断特異性を持つようなアミノペプチダーゼは哺乳類が持つ酵素の中には同定されていないことから（Ｖａｎｈｏｏｆ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ　９：７３６－７４４，１９９５）、Ｎ末端にＰｒｏ－Ｓｅｒジペプチドを付加した（表１）。Ｓｅｒは水溶性であり、また側鎖が小さめであることから、Ｔｈによる抗原認識を物理的に妨げる可能性が少ないと推測してｓｐａｃｅｒとして入れた。プロリン特異的アミノペプチダーゼとして、免疫細胞上に発現されるジペプチジルペプチダーゼＩＶおよびアミノペプチダーゼＰの２種類は、Ｎ末端のＸ－Ｐｒｏを基質として分解することが報告されている（Ｖａｎｈｏｏｆ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ　９：７３６－７４４，１９９５；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｊ　２７７：１１２６－１１４４，２０１０）。各改変ペプチドの感作活性はＩ－Ａｄ拘束性にＯＶＡエピトープを認識するＤＯ１１．１０細胞の増殖カーブを指標として測定した。
　図１１に示す通り、Ｎ末端にＰｒｏを導入したペプチド（ＰＯＶＩＩ）は、ＯＶＩＩよりも感作活性が約５倍増加した。Ｃ末端を修飾したペプチドはより大きな感作活性の増大をもたらした。ＡＣＥ耐性のＯＶＩＩＰＡは、ＯＶＩＩに比してほぼ１００倍の感作活性を示した。β－ＡｌａによってＣ末端修飾したペプチドは、ＯＶＩＩＰＡと類似するが、若干低い活性を示した程度であった。また、Ｎ末端のアセチル化（ａｃ－ＯＶＩＩ）は感作活性にほとんど影響を与えなかった。Ｎ末端およびＣ末端の両方を修飾しても、さらに感作活性を高めることはできなかった。これら修飾の効果が血清中のぺプチダーゼに対する耐性によるものか否かを検討するためＦＣＳの熱不活化をしたが、滴定曲線には全く影響が見られなかった（図１２、１３）。
実施例１０：ＡＣＥ阻害剤を用いたペプチド修飾の検討
　酵素活性の熱不活化に対して、ＡＣＥのＣ末端ドメインのみが感受性であることが報告されていたため（Ｖｏｒｏｎｏｖ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　５２２：７７－８２，２００２）、発明者はＡＣＥのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの両ドメインに対して強力な特異的阻害効果があるカプトプリルを用いて阻害試験を行った（Ｄａｌｋａｓ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｓｃｉ　１６：９１－９７，２００９）。図１４、１５に示す通り、２．５ｍＭのカプトプリルの添加によって、ＯＶＩＩの感作活性はＣ末端保護されたＯＶＩＩＰＡペプチドに近い水準にまで改善された。ＤＯ１１．１０細胞は５ｍＭカプトプリル存在下では生存できなかったため、高濃度のカプトプリルについては試験を行わなかった。ＡＣＥは元々膜結合性の細胞外酵素ＣＤ１４３として産生され、タンパク分解酵素によって遊離されることが報告されている。内皮細胞は強くＡＣＥを発現しているが、その他の細胞も一部ＡＣＥを発現していることが知られている（Ｃｏａｔｅｓ，Ｄ．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　３５：７６９－７７３，２００３）ことから、発明者は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の中にも細胞表面にＡＣＥを発現している細胞があると予想した。免疫細胞のうち、ヒト樹状細胞はＡＣＥを発現していることが報告されてはいるものの（Ｌａｐｔｅｖａ，Ｎ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　２９６：１９４－２００，２００２）、抗原提示に対してなんらかの関与があるか否かは未だ報告されてはいない。また、単球やリンパ球は無視できるほどのＡＣＥしか発現していないことが報告されている（Ｄａｎｉｌｏｖ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ　３１：１３０１－１３０９，２００３）。
実施例１１：無血清培地中でのペプチド修飾の検討
　血清のプロテアーゼ活性を排除するため、無血清ＡＩＭ－Ｖ培地中でペプチドのＴｈ誘導活性を試した。ＤＯ１１．１０脾臓細胞は、ＡＩＭ－Ｖ培地中では脆く壁に付着する傾向があったため、細胞同士の出会いが起こりにくく、結果として細胞増殖が鈍く不均一となった。そこで、本実施例では、ｗｅｌｌ当たり３倍数のＤＯ１１．１０細胞を用いて、より安定したデータを得た。図１６に示す通り、血清中のプロテアーゼの除去によって、ＯＶＩＩの滴定曲線がシフトし、Ｎ末端にのみ修飾を持つＰＯＶＩＩと重なった。しかし、他の改変体ペプチドは依然高い誘導活性を示した。このことは、血清中のプロテアーゼ（おそらくＡＣＥ）はペプチドの提示にある程度の影響があるが、修飾ペプチドの活性の大部分は抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＴｈ細胞に直接依存していることを示唆している。また、ビオチン化バリアントＰｂＯＶＩＩｂＰβは最も高い活性を示した。ビオチン化ペプチドは以降の実施例においてさらに検討した。
実施例１２：ビオチン化ＯＶＩＩペプチドの高い感作活性
　本実施例において、発明者は標識目的で、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の内側にビオチン化Ｌｙｓ（Ｋｂｉｏ）を導入した。予想外にも、このビオチン化ペプチドは高い感作活性を示し、Ｔｈ細胞の著明な増殖を誘導した。この理由を探るため、発明者は種々のビオチン化ペプチドを設計し（表１）、さらに検討を行った。ビオチン化ペプチドは、一般に溶解性が低い傾向にあったため、ＯＶＩＩのＣ末端にＡｒｇを加えたＯＶＩＩ＋を基本にデザインを行った。Ａｒｇの付加は、Ｉ－Ａｄ分子への結合活性には影響しなかった（図１７）。図１８、１９に示す通り、ビオチン化ペプチドは、末端にＰｒｏまたはβ－Ａｌａが存在するか否かに関わらず、非常に高い活性を示し、Ｋｂｉｏそれ自体に感作活性を高める効果があることがわかった。Ｎ末端から２番目のアミノ酸の位置にＫｂｉｏを導入するだけで、感作活性は３倍高まった（ｂＯＶＩＩ＋）。Ｃ末端側へのＫｂｉｏの導入（ｂＯＶＩＩ＋ｂ）はより大きな効果を持ち、Ｃ末端から２番目のＰｒｏおよび／またはＣ末端のβ－Ａｌａで修飾したペプチド（ＯＶＩＩβ、ＯＶＩＩＰＡ、図１１）と比して、感作活性を１００倍高めた。さらにＣ末端にＰｒｏ－β－Ａｌａを付加しても効果はなかった。一方、Ｎ末端にＰｒｏを付加するとさらに５倍活性が高まった。ビオチン化による上記のような活性の変化は、ＤＯ１１．１０細胞を無血清条件下で培養した場合においても見られた（図１６）。ＰｂＯＶＩＩｂＰβは、両端にＫｂｉｏ、Ｎ末端側にＰｒｏおよびＣ末端側にＰｒｏ－β－Ａｌａの修飾を有し、最も高い活性を示した。Ｋｂｉｏは、ＰｂＯＶＩＩｂＰβのＮ末端Ｐｒｏに加えて付加的な活性を与えているため、Ｋｂｉｏはプロテアーゼ耐性以外の理由で感作活性の増大に貢献した可能性もある。ＡＩＭ－Ｖ無血清培地においても、ＰｂＯＶＩＩｂＰβはＰＯＶＩＩＰβより５倍高い活性を示した（図１６）。
　また、発明者は、ビオチン化ＯＶＩＩペプチドの感作活性はリジンの効果によるものか否かについても併せて検証を行った。その結果、ＯＶＩＩ＋のＮ末端または両末端それぞれリジンを付加したＫＯＶＩＩ＋またはＫＯＶＩＩ＋Ｋは共に、ＯＶＩＩ＋と比較すると感作活性に差がなかった。一方、ビオチン化リジンをＯＶＩＩ＋のＮ末端に付加したｂＯＶＩＩ＋、両末端に付加したｂＯＶＩＩ＋ｂはそれぞれＫＯＶＩＩ＋およびＫＯＶＩＩ＋Ｋに対して、前者で２倍程度、後者で１０倍程度、ＤＯ１１．１０　Ｔｈ細胞の増殖を誘導する活性が高かった（図２０）。
実施例１３：血清ぺプチダーゼに対するペプチドの消化耐性
　これまでの実施例の検討結果から、修飾がペプチドにぺプチダーゼ耐性を与えている可能性が高い。そこで発明者は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで１０％の新鮮マウス血清中でのペプチドの消化耐性を調べた。未消化ペプチドの残存量は、ＨＰＬＣで定量した。図２１に示す通り、ＯＶＩＩの４０％が２時間以内に消化され、６時間後には、未消化ペプチドは残っていなかった。Ｃ末端にβ－Ａｌａ（ＯＶＩＩβ）もしくはＣ末端から２番目にＰｒｏ（ＯＶＩＩＰＡ）を導入すると、単独でも４時間以内に消化されるはずのペプチドの約半分が消化から守られることがわかった。その両方を容れたＰｒｏ－β－ＡｌａをＣ末端にすると（ＯＶＩＩＰβ）、保護効果がさらに高まり、１６時間後の残存ペプチド量が増した。Ｎ末端のａｃｅｔｙｌ化（ａｃ－ＯＶＩＩ）は、上記Ｃ末端側のＰｒｏ－Ｘもしくはβ－Ａｌａの単独修飾より、保護効果が大きかった。Ｎ末端をＰｒｏにすると、非常に強い酵素耐性がみられ（ＰＯＶＩＩ）、ほぼ７０％が１６時間後においても消化を受けずに残っていた。Ｎ末端Ｐｒｏの消化保護効果は、Ｃ末端をＰｒｏ－β－Ａｌａにするより強力で、このＮ、Ｃ末端修飾を両方とももつペプチドでは、さらに相加的な保護効果が観察された（ＰＯＶＩＩＰβ）。この結果は、図１１に示すＴｈの増殖誘導活性と、やや食い違うようにみえる。例えば、ａｃ－ＯＶＩＩは、ＯＶＩＩＰＡやＯＶＩＩＰβより消化耐性が高かったが、Ｔｈ誘導活性はＯＶＩＩと差がなかった。ところが、ＯＶＩＩＰＡやＯＶＩＩＰβの消化実験では、それぞれ主要な分解産物のピークが現れることがわかった。これらのピークを質量分析により解析したところ、いずれもＮ末端のＩｌｅが欠け、ｅｐｉｔｏｐｅは温存しているペプチドであることがわかった。これらのピークと未消化のピークを合わせた残存ｅｐｉｔｏｐｅの量を図２１ａに点線で示す。これらのＣ末端保護ペプチドにＴｈ増殖誘導活性が高かった理由がこれで説明できる。ＰＯＶＩＩは、血清中での消化耐性は高かったが、Ｔｈ増殖試験では活性が低かった。Ｎ末端を保護したａｃ－ＯＶＩＩ、ＰＯＶＩＩのどちらもＴｈ増殖誘導活性が低く、Ｃ末端保護の方が著明なＴｈ増殖誘導活性を持つ理由のひとつとして、ＤＯ１１．１０が主としてＣ末端側のｅｐｉｔｏｐｅを認識しているＴ細胞であることがあげられるかもしれない（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６４：４７０６－４７１２，２０００）。これらの結果は、血清中のぺプチダーゼ活性がＴｈへの抗原提示効率に影響する一方、血清以外、おそらくは抗原提示細胞に付随するぺプチダーゼ活性が、ペプチドの抗原提示に大きく影響することを示唆している。
　発明者は次に、ビオチン化ペプチドの消化耐性を調べた。同様にマウス血清中でインキュベートすると、図２１ｂに示すように、Ｃ末端側にＫｂｉｏを加えた改変体は、消化耐性を持つことがわかった。Ｎ末端側にのみＫｂｉｏをもつｂＯＶＩＩ＋では、一見消化耐性がまったくないように見えたが、前述の解析同様、主要な分解産物が長く存在するため、そのピークを質量分析により解析した結果、両端から１個または２個のアミノ酸が削られたものの、コアｅｐｉｔｏｐｅは完全に残った分解産物であることがわかった。すべてのビオチン化ペプチドに共通にみられたのは、ビオチンを１個失った産物であった。この産物は、イオントラップ質量分析により、少なくともＰｂＯＶＩＩ＋ｂＰβでは、ほとんどすべてＮ末端側のビオチンが失われたものであった。その他、ｂＯＶＩＩ＋ではＣ末端のＡｒｇが欠けたもの、ｂＯＶＩＩｂＰβとＯＶＩＩ＋ｂＧではＮ末端のＳｅｒが欠けたもの、ｂＯＶＩＩ＋ｂでは、Ｃ末端のＲＫｂｉｏが欠けた産物が主に観察された。これらの主要分解産物のピークを未消化ペプチドのピークと合算すると、ｅｐｉｔｏｐｅの残存量は図２１ｃ、ｄの点線のようであった。これらｅｐｉｔｏｐｅの残存量は、図１８、１９のＴｈ誘導活性によく対応する。ペプチドの分解においては、一般にＣ末端のＫｂｉｏの方がよりぺプチダーゼに対する保護効果が強かった。また、Ｎ末端、Ｃ末端のビオチン化を両方とも持つ改変体、さらに前記のＮ末端ＰｒｏおよびＣ末端Ｐｒｏ－β－Ａｌａと組み合わせたデザインの改変体では、相加的に消化耐性が高まった。ただし、血清中でのｅｐｉｔｏｐｅの保存の程度は、ＰＯＶＩＩＰβとこれにＫｂｉｏを加えたＰｂＯＶＩＩｂＰβでほとんど変わらないにもかかわらず、図１６のＴｈ誘導活性および、無血清培地中でのＴｈ誘導活性が、いずれもＰｂＯＶＩＩｂＰβの方が５倍程度高い理由はわかっていない。ＡＰＣに付随するぺプチダーゼによる影響か、消化耐性以外の活性による抗原提示の効率化の可能性が残される。
　同様の結果はヒト血清でも得られた（図２１ｅ）。また、コアペプチドをＭＣＣに変えたペプチドでも、同様の保護効果がみられた（図２１ｆ）。
実施例１４：ぺプチダーゼ阻害剤のペプチド消化に対する効果
　上記実施例を受けて、発明者は、血清中のぺプチダーゼが何かを探るため、ぺプチダーゼ阻害剤のペプチド消化に対する効果を調べた。マウス血清を用いたＯＶＩＩペプチドの消化実験にＡＣＥの特異的阻害剤であるカプトプリルを加えると、図２２のように、濃度依存性にペプチドの消化が抑えられた。低濃度で阻害活性が部分的である理由として、ＡＣＥのＣ末端の活性部位の方がＮ末端の活性部位よりＡＣＥに対する感受性が高いことが考えられた。（Ｄａｌｋａｓ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｓｃｉ　１６：９１－９７，２００９）さらに、ＡＣＥや血清中のアミノペプチダーゼが属するメタロペプチダーゼに対する阻害剤であるｏ－フェナントロリンを加えたところ、濃度依存性にペプチダーゼ活性がほとんど完全に阻害された（図２３）。次に、Ｍ１ファミリーのアミノペプチダーゼに対する選択的阻害剤であるベスタチンを加えたところ、濃度依存性に約半分程度のぺプチダーゼ活性が抑制された（図２４）。このことから、血清中のぺプチダーゼ活性は、アミノペプチダーゼとＡＣＥによるものであることが明らかとなった。
実施例１５：抗原提示細胞が持つＡＣＥ活性に対する阻害剤の影響
　ＣＨ１－ＩＡｄ細胞をＰＢＳに懸濁し、あらかじめ２．５ｍＭのｏ－フェナントロリンまたはカプトプリルの存在下で３７℃２０分インキュベートをした後、１０μＭのＡｂｚ－ＦＲＫ（Ｄｎｐ）Ｐ－ＯＨ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を加えて指定の時間、３７℃でインキュベートした。氷上に乗せて反応を止めて遠心し、上清中の蛍光を、励起波長３２０ｎｍ、測定波長４２０ｎｍで計測した（図２５）。この結果、生きた細胞に会合したペプチド分解酵素活性が確認され、さらにその活性は、ＡＣＥの特異的阻害剤であるカプトプリルおよびＡＣＥが属するメタロペプチダーゼの阻害剤であるｏ－フェナントロリンにより阻害されることがわかった。
実施例１６：ｉｎ　ｖｉｖｏ免疫におけるペプチド修飾の効果
　発明者はｉｎ　ｖｉｖｏ免疫における修飾ペプチドのＴｈ誘導活性を検討した。図２６に示す通り、ぺプチダーゼ耐性のＰＯＶＩＩＰβは、ｉｎ　ｖｉｖｏ免疫でＯＶＩＩに比べて効率よくＤＯ１１．１０　Ｔｈ細胞の活性化を起こすことがわかった。ＰＯＶＩＩＰβにＫｂｉｏを加えたＰｂＯＶＩＩｂＰβは、さらに効率よく活性化を誘導した。さらに、自然な腫瘍抗原であるＷＴ１由来のＷＡ３６ペプチドで免疫した場合も、ＷＡ３６単独では極めてＴｈ細胞の誘導が困難であったが、ビオチン化末端修飾ペプチドを使えば、弱いながらも、腫瘍抗原に対するＴｈ細胞を誘導できることがわかった（図２７）。
実施例１７：ヒト末梢血単核細胞からの腫瘍抗原ペプチド誘導活性
　１０％ＡＢ血清含有ＤＭＥＭ培地中で、ＨＬＡ－ＤＲ１５を有するヒト由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）をＷ３３２ペプチドまたはＰｂＷ３３２ｂＰβペプチドの各濃度で刺激した。培地中には２０Ｕ／ｍｌ組み換えヒトＩＬ－２および０．１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を添加した。１週間後、同じ人のＰＢＭＣｓに同様にペプチドを加えて、ペプチドを結合させた抗原提示細胞を用いて、上記の細胞に２度目の抗原刺激を行った。その４日後に、再度上記の各濃度のそれぞれのペプチドを加えて、細胞を４時間刺激培養し、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ　Ａを加えてさらに１時間培養した後、細胞内ＩＦＮγ染色とＣＤ４染色を行いフローサイトメーターで解析した。ＣＤ４陽性細胞中の細胞内ＩＦＮγ陽性細胞の割合を示す（図２８）。
実施例１８：担癌マウスにおけるＭＨＣクラスＩペプチドとＭＨＣクラスＩＩペプチドを免疫した場合のｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
　発明者は、自然な腫瘍抗原であるＷｉｌｍｓ’　Ｔｕｍｏｒ　１（ＷＴ１）を認識するＴｈ細胞を誘導することによるｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を調べた。自然な腫瘍抗原に対するＴｈ細胞を誘導することには慎重を期する必要がある。自然な腫瘍抗原に対するＴｈ細胞を誘導する結果、抗腫瘍活性をかえって減弱させる可能性のある制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）を誘導する可能性もあるからである。そこで、本実施例では、免疫賦活活性の高い、百日咳全菌体ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｗｈｏｌｅ　ｃｅｌｌ　ｖａｃｃｉｎｅ：Ｗｃ）を加えて免疫し、Ｔｈ１細胞の誘導を促す工夫をした。
　これまでに、マウスのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＷＴ１由来のペプチドは同定されていない。そこで発明者は、それを探索することからはじめた。ヒトのＷＴ１腫瘍抗原由来のＷ３３２ペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５分子結合性で、ヒトのＴｈ細胞を誘導することが知られている。その後、Ｗ３３２は、ヒトのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１，ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２，ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０９：０１にも共通に結合することが報告された。また、Ｗ３３２のアミノ酸配列は、対応するマウスＷＴ１腫瘍抗原においても同一の配列を持つ。マウスのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子のひとつであるＩ－Ａ遺伝子は、ヒトのＨＬＡ－ＤＲ遺伝子のオルソログであることがわかっている。そこで、ヒトの複数のＭＨＣクラスＩＩ分子に共通に結合するペプチドであれば、Ｗ３３２がマウスのＩ－Ａ分子にも結合する可能性を考えて、結合実験を試みた。ＣＨ１－ＩＡｄ細胞にＰｂＷ３３２ｂＰβを加えて５時間培養した後、ＦＩＴＣ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを加えて染色をし、フローサイトメトリーにて解析をした。ビオチン化したＷ３３２ペプチドであるＰｂＷ３３２ｂＰβは、ＨＬＡ－ＤＲ分子を発現するＣＨ１－ＤＲ４細胞に結合することがわかった（図２９Ａ）。
　そこで、マウスを用いた免疫実験は、ＰｂＷ３３２ｂＰβペプチドをＴｈ誘導性ペプチドとして、Ｄｂ１２６ペプチドをＣＴＬ誘導性ペプチドとしてマウスに免疫することとした。マウスに接種する腫瘍としては、ＷＴ１腫瘍抗原を自然に高発現するＦＢＬ３赤白血病細胞を用いた。ＦＢＬ３は、Ｆｒｉｅｎｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓに感染されたために腫瘍化した細胞株であり、ウイルス抗原も発現する可能性が高い。実際、２ｘ１０７個のＦＢＬ３細胞をマウスの廃部に皮内注射すると、固形腫瘍として成長したが、いったん腫瘍径が大きく成長した後、自然に縮小する傾向がみられた。しかし、興味深いことに、縮小はするが、完全に拒絶されることはなく、腫瘍接種後１ヶ月以上にわたり、小さな固形腫瘍が残存する。やがて、その腫瘍が急速に成長することも長期観察例では見られることがあった。
　あらかじめ、ＣＢＦ１マウスの背中の上下左右４箇所に、５０ｎｍｏｌｅｓのＤｂ１２６ペプチド単独、あるいは、Ｄｂ１２６ペプチドと、５０ｎｍｏｌｅｓのＷ３３２ペプチドを皮下注射して免疫した。対照のＰＢＳ接種群を含むすべての免疫群に、アジュバントとして、５ｘ１０７個のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ全菌体ワクチンを加えた。マウスは、毎週一回、３回免疫をした後、背中に２ｘ１０７個のＦＢＬ３細胞を皮下注射した。
　Ｗ３３２とＤｂ１２６ペプチドを用いて免疫をすると、Ｄｂ１２６ペプチド単独免疫よりも、強い抗腫瘍活性が見られた。興味深いことに、Ｗ３３２とＤｂ１２６ペプチドを両方免疫したマウスの群では、Ｗｃのみ、または、Ｄｂ１２６、あるいはＷ３３２単独免疫群では長期にわたって残存する腫瘍が、縮小する傾向にあることがわかる（図２９Ｂ－Ｆ）。このことから、腫瘍特異的Ｔｈ細胞をＣＴＬとともに誘導することで、より効果的なｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍活性が得られることが示唆された。
実施例１９：ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合能の定量的測定方法の開発　
　ＭＨＣクラスＩＩ分子結合性ペプチドの結合活性を測定する方法として、生きた細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に、非標識ペプチドを加えてビオチン化指標ペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を競合させる方法があるが、この方法では生きた抗原提示細胞が有するｐｅｐｔｉｄａｓｅ活性により、非標識ペプチドは速やかに消化されるが、ビオチン化指標ペプチドは消化されにくいせいで、結合が競合試験で測定できない。そこで発明者は、競合させる非標識ペプチドの末端にｐｅｐｔｉｄａｓｅ耐性を付与するような修飾を加えることにより、競合試験が可能にならないか、調べた。ＣＨ１－ＩＡｄ細胞にビオチン化指標である５μＭのＰｂＯＶＩＩｂＰβと連続希釈したＰＯＶＩＩＰβペプチドをそれぞれ加えて一晩インキュベーションした後、細胞をＰＥ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを加えて染色し、フローサイトメーターにより計測した。その結果、加えたＰＯＶＩＩＰβペプチドの濃度依存性に、ビオチン化指標ペプチドの結合が低下していることが確認できた（図３０Ａ）。また、ＰＥ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をグラフ化すると、３０μＭの濃度で半阻害が起こった（図３０Ｂ）。
実施例２０：ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ－ＤＲ４分子へのペプチド結合能の定量的測定方法
　本実施例では、生きた抗原提示細胞状のＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド結合活性を測定する方法は、実施例１９で示した、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子であるＩ－Ａｄ分子について可能であるばかりではなく、ヒトのＭＨＣクラスＩＩ分子であるＭＨＣクラスＩＩ分子にてついても、同様の測定が可能であることを示す。また、本実施例では、ｐ－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＰＣＰ）を加えることにより、４時間のインキュベーションでペプチドの結合活性が測定できるよう工夫を加えた。
　ＣＨ１－ＤＲＢ１＊０４：０５細胞（ＣＨ１－ＤＲ４細胞）を２ｘ１０６／ｍｌになるように２０％ＦＣＳ　ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁し、９６穴Ｕプレートの１穴に５０μｌ（１ｘ１０５／穴）ずつ入れるように調製した。次に、２０μＭのｂｉｏｔｉｎ化指標ペプチドであるｂＴＲ１７４（ＰＳＫｂｉｏＲＥＦＫＬＳＫＶＷＲＤＱＫｂｉｏＰβＡ：配列番号４１）を、１穴あたり１００μｌいれ、さらに８ｍＭ　ＰＣＰを含むＩＭＤＭを１穴あたり５０μｌ入れ、最後に、ＣＨ１－ＤＲ４細胞を５０μｌ（１ｘ１０５／穴）入れて３７℃で４時間インキュベーションした。遊離のペプチドを遠心により除いたのち、ＦＩＴＣ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎで染色し、フローサイトメーターで測定した。ＰＣＰの濃度依存性に、内在性にもとよりＨＬＡ－ＤＲ４分子に結合していたペプチドをｂｉｏｔｉｎ標識ｂＴＲ１７４ペプチドが置換し、結合したｂｉｏｔｉｎ標識ｂＴＲ１７４ペプチドの量を定量的に測定できることがわかった（図３１）。この実験系に、非標識ペプチドの末端にｐｅｐｔｉｄａｓｅ耐性配列を加えたものを競合ペプチドとして加えることにより、非標識ペプチドの結合活性を定量測定することが可能になった。
　本発明のＭＨＣクラスＩＩ分子結合性の腫瘍特異的抗原由来ポリペプチドの改変体を用いることで、従来よりも顕著に効率的に抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子上に腫瘍特異的抗原を提示させることができ、より効率的に腫瘍抗原特異的Ｔｈ細胞を誘導することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１１－２７３９２２（出願日：平成２３年１２月１４日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (20)

  1. 　腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドの改変体。
  2. 　該改変が、該単離されたポリペプチドのＣ末端側および／またはＮ末端側への数個のアミノ酸の付加である、請求項１に記載の改変体。
  3. 　該単離されたポリペプチドのＣ末端側に付加されるアミノ酸が、下式（Ｉ）：
    Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４　（Ｉ）
    （式中、
    （１）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基を示す（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す）、
    （２）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸を示す、または
    （３）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｘ３はＰｒｏを除く１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４はβ－Ａｌａを示す）
    によって表されるアミノ酸配列である、請求項２に記載の改変体。
  4. 　該単離されたポリペプチドのＣ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（Ｉ）において、
    （１）Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ３は１個のアミノ酸または単結合、Ｘ４は１個のアミノ酸またはカルボキシル基（但し、Ｘ３がＰｒｏの場合、Ｘ４は１個のアミノ酸）、または
    （２）Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３がＰｒｏ、Ｘ４は１個のアミノ酸、
    によって表されるアミノ酸配列である、請求項３に記載の改変体。
  5. 　該単離されたポリペプチドのＣ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（Ｉ）において、
    Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３は単結合、Ｘ４はＧｌｙまたはカルボキシル基、
    Ｘ１は単結合、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はＡｌａまたはβ－Ａｌａ、または
    Ｘ１はビオチン化されたＬｙｓ、Ｘ２は単結合、Ｘ３はＰｒｏ、Ｘ４はβ－Ａｌａ
    によって表されるアミノ酸配列である、請求項４に記載の改変体。
  6. 　該単離されたポリペプチドのＮ末端側に付加されるアミノ酸が、下式（ＩＩ）：
    Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３　（ＩＩ）
    （式中、
    （１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合を示す、または
    （２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は数個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓを示す）
    によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である、請求項２－５のいずれか１項に記載の改変体。
  7. 　該単離されたポリペプチドのＮ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（ＩＩ）において、
    （１）Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３は１個のアミノ酸または単結合、または
    （２）Ｙ１はＰｒｏを除く１個のアミノ酸またはアミノ基、Ｙ２は１個のアミノ酸または単結合、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
    によって表されるアミノ酸配列（但し、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がＰｒｏであるアミノ酸配列は除く）である、請求項６に記載の改変体。
  8. 　該単離されたポリペプチドのＮ末端側に付加されるアミノ酸が、該式（ＩＩ）において、
    Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３は単結合、
    Ｙ１はアミノ基、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ、または、
    Ｙ１はＰｒｏ、Ｙ２はＳｅｒ、Ｙ３はビオチン化されたＬｙｓ
    によって表されるアミノ酸配列である、請求項７に記載の改変体。
  9. 　該単離されたポリペプチドが、ＷＴ１、ＰＳＡ、ＭＡＧＥ－３、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＣＥＡ、ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＥＢウイルスに由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を含む、請求項１－８のいずれか１項に記載の改変体。
  10. 　該単離されたポリペプチドが、ＷＴ１に由来し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の改変体。
  11. 　配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：４０によって示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  12. 　請求項１－１０のいずれか１項に記載の改変体または請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを含む、抗腫瘍剤。
  13. 　更に腫瘍特異的抗原に由来し、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する、単離されたポリペプチドを含む、請求項１２に記載の抗腫瘍剤。
  14. 　更にアジュバントを含む、請求項１２または１３に記載の抗腫瘍剤。
  15. 　アジュバントが百日咳ワクチンであることを特徴とする、請求項１４に記載の抗腫瘍剤。
  16. 　請求項１２－１５のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤を患者に有効量投与することを含む、腫瘍の治療方法。
  17. 　腫瘍の治療に使用するための、請求項１－１０のいずれか１項に記載の改変体または請求項１１に記載の単離されたポリペプチド、腫瘍特異的抗原に由来しＭＨＣクラスＩ分子に結合する単離されたポリペプチドおよびアジュバントを含む組成物。
  18. 　抗腫瘍剤を製造するための請求項１－１０のいずれか１項に記載の改変体または請求項１１に記載の単離されたポリペプチドの使用。
  19. 　被験者由来の抗原提示細胞集団と請求項１－１０のいずれか１項に記載の改変体を培養し、抗原提示細胞集団と該改変体の結合を確認する、被験者が該改変体に含まれる単離されたポリペプチドに結合するＭＨＣクラスＩＩ分子を持つか否かを検査する方法。
  20. 　特定のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞とＮ末端および／またはＣ末端が改変された任意のペプチドを培養し、該抗原提示細胞と該ペプチドの結合を確認する、該抗原提示細胞に該ペプチドが結合しうるか否かを検査する方法。
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