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WO2005045027A1 - Ｗｔ１由来のｈｌａ−ｄｒ結合性抗原ペプチド - Google Patents

Ｗｔ１由来のｈｌａ−ｄｒ結合性抗原ペプチド Download PDF

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WO2005045027A1
WO2005045027A1 PCT/JP2004/016336 JP2004016336W WO2005045027A1 WO 2005045027 A1 WO2005045027 A1 WO 2005045027A1 JP 2004016336 W JP2004016336 W JP 2004016336W WO 2005045027 A1 WO2005045027 A1 WO 2005045027A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
cells
amino acid
cancer
hla
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/016336
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English (en)
French (fr)
Inventor
Haruo Sugiyama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
International Institute of Cancer Immunology Inc
Original Assignee
International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to JP2005515303A priority patent/JP4621142B2/ja
Priority to US10/578,183 priority patent/US20080070835A1/en
Priority to CA2544214A priority patent/CA2544214C/en
Priority to EP04799497A priority patent/EP1696027A4/en
Priority to KR1020137011325A priority patent/KR20130062368A/ko
Application filed by International Institute of Cancer Immunology Inc filed Critical International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority to KR1020127013720A priority patent/KR101522079B1/ko
Publication of WO2005045027A1 publication Critical patent/WO2005045027A1/ja
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Priority to US15/920,121 priority patent/US11027003B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an HLA-DRB1 * 0405-binding antigen peptide derived from WT1.
  • the WT1 gene (Wilms' tumor gene 1) has been identified as one of the causative genes of Wilms tumor, a childhood renal tumor (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990).
  • the WT1 gene encodes the transcription factor WT1, which plays an important role in cell proliferation, differentiation, apoptosis, and organ formation (Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998).
  • the WT 1 gene was positioned as a tumor suppressor gene, but subsequent studies have found expression in various solid tumors including leukemia, lung cancer and breast cancer, but rather as an oncogene that promotes cancer growth.
  • peptide-specific cytotoxic T cells are induced by in vitro stimulation of HLA-A * 0201-positive or HLA-A * 2402-positive peripheral blood mononuclear cells with WT1-derived peptides. These CTLs have been shown to damage cancer cells of leukemias and solid tumors that endogenously express WT1.
  • WT1 is a promising target molecule for cancer immunotherapy (cancer vaccine therapy) (Int. J. Hematol 76: 127, 2002) 0
  • helper T cells specific to cancer antigen are reported to be important (Cancer Res 62:.. 6438 , 2002) 0
  • Helper T cells (CD4 positive T cells) are induced (proliferated) by recognizing a complex of MHC class II molecules of antigen-presenting cells and an antigen peptide.
  • Activated helper sputum cells produce cytoplasmic ins such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, or interferon, and assist in B cell proliferation, differentiation, and maturation.
  • Active helper T cells have the function of promoting the proliferation, differentiation, and maturation of other subsets of T cells (Tc, TD cells, etc.). In this way, active helper T cells have the function of activating the immune system by promoting the proliferation and activation of B cells and T cells.
  • MHC class Hell under the action of II-binding antigenic peptide (also called helper peptide) It is considered useful to enhance the function of par T cells and enhance the effects of cancer vaccines (J. Immunother., 24: 195, 2001).
  • An object of the present invention is to provide an HLA-DRB1 * 0405-binding antigen peptide derived from WT1 and use of the peptide as a cancer vaccine action enhancer.
  • WT1-derived MHC class II-binding antigen peptide helper peptide
  • helper peptide WT1-derived MHC class II-binding antigen peptide
  • WT1 has an antigenic peptide part that binds to HLA-DRB 1 * 0405 and induces helper T cells among many MHC class II subclasses. I found it. This finding has made possible a new treatment that can induce and enhance WT1-specific helper T cells for HLA-DRB1 * 0405 positive cancer patients.
  • helper peptide can bind to a plurality of HLA-class II molecules and induce a helper CD4 positive T cell, that is, the existence of a promiscuous helper peptide (British J. cancer, 85 (10), pl527-1534 (2001), J. Immunol., 169, p557-565 (2002)) o Therefore, the present inventor found as one of the HLA_DRB1 * 0405 binding antigen peptides (helper peptides). He WT1 force promiscuous
  • WT1 was HLA-DRB1 * 0405
  • helper peptide WT1 of the present invention has HLA-DRB1 * 0405.
  • WT1 has an antigenic peptide that binds to HLA_DRB1 * 1502 and induces helper T cells among many existing MHC class II subclasses. I found that there was a minute!
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • SEQ ID NO: 2 The amino acid residue at position 1, position 4, position 6, and position Z or position 9 of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NO: 23 is replaced with another amino acid residue.
  • SEQ ID NO: 2 The amino acid residue at position 1, position 4, position 6, and position Z or position 9 of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 23 is selected from the following: The peptide according to (4) above, comprising an amino acid sequence substituted with any amino acid residue:
  • 4th place Palin, isoleucine, leucine, methionine, aspartic acid, glutamic acid, 6th place: asparagine, serine, threonine, glutamine, lysine, aspartic acid, 9th place: aspartic acid, glutamic acid, glutamine,
  • SEQ ID NO: 46 containing the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NO: 56, the peptide according to (7),
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of (1) and (10), the expression vector according to (12) or the cell according to (13), and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition comprising a combination of the peptide according to any one of (1) and (9) above and a cancer antigen peptide,
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of (1) and (9) above and a pharmaceutically acceptable carrier, and a pharmaceutical composition comprising a cancer antigen peptide and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a kit for the treatment or prevention of cancer comprising
  • a method for treating or preventing cancer comprising combining the peptide according to any one of (1) and (9) above and a cancer antigen peptide, and administering it to a subject in need thereof , Regarding.
  • the present invention provides a WT1-derived HLA-DRB1 * 0405-binding antigen peptide, a polynucleotide encoding the peptide, an inducer of helper T cells containing these peptides and polynucleotides, and the like.
  • the helper T cell inducer of the present invention is useful as an enhancer of cancer vaccine action.
  • the cancer vaccine action enhancer of the present invention is applicable to many HLA-DRB1 * 0405-positive cancer patients, and is particularly useful as a WT1 vaccine action enhancer.
  • the present invention is a peptide consisting of 10-25 amino acids in the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1, and binds to HLA-DRB1 * 0405 to induce helper T cells.
  • a peptide that is derived is provided.
  • the N-terminal amino acid residue and / or the C-terminal amino acid residue may be modified, or a specific amino acid residue may be modified.
  • helper T cells a peptide that induces helper T cells (a peptide that induces CD4 positive T cells)” may be referred to as “helper peptide”.
  • amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1 is a known sequence described in Cell, 60: 509, 1990, NCBI database Accession No. XP — 034418 and Accession No. P19544.
  • the peptide of the present invention is a partial peptide of WT1 consisting of continuous 10-25 amino acids in the amino acid sequence of human WT1 set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the definition of “10-25 amino acids” is based on the fact that the MHC class II binding peptide strength is generally 10-25 amino acids (Immunogenetics, 41,178-228 (1995), Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85 -101 (1996), Immunology, 96, l-9 (1999), Peptides, Vol.19, 179-198 (1998),
  • a peptide having a continuous 13-17 amino acid strength in the amino acid sequence of human WT1 is mentioned.
  • the peptide of the present invention is described in SEQ ID NO: 1.
  • the candidate peptide binds to HLA_DRB1 * 0405 to induce helper T cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • rod-shaped cells adhered cells
  • helper T cells CD4 positive T cells
  • helper T cells were induced (activated) in response to peptide stimulation.
  • (1) Proliferation activity of the helper T cells and (2) Cytoforce-in production activity of helper T cells are measured.
  • the proliferation activity of (1) can be specifically examined by measuring the amount of [] -thymidine incorporated into helper T cells.
  • the cytoforce-in production activity of (2) can be examined by measuring the amount of site force-ins such as IFN- ⁇ produced by active helper T cells by enzyme immunoassay (ELISA) or the like. it can.
  • the peptide is immobilized in the peptide-containing groove because the side chains of amino acid residues on the peptide bind to the peptide-containing groove and the amino acid residues that are well conserved in the peptide-containing groove of all MHC class II molecules. This is due to the bond between the side chain of the group and the peptide main chain.
  • the peptide-containing groove has polymorphisms in the amino acid residues that constitute the large and small pots in the peptide-containing groove for each MHC class II molecule.
  • the motif of the amino acid residue of the peptide that binds to the pocket portion of the tide-containing groove can be deduced. Since a peptide with a binding motif of about 9 amino acid residues binds in the peptide-containing groove and both ends of the peptide can protrude from both ends of the groove, the peptide that can bind to the MHC class II molecule
  • the length is considered to be unlimited in principle. However, in many cases, long peptides are often cleaved with peptidases to a length of 13-17 amino acids (immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)).
  • the first, fourth, sixth, and ninth amino acid residues of the 9 amino acid HLA (MHC) binding moiety have the following regularity: (See Immunogenetics, 41,178-228 (1995), Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85-101 (1996)).
  • WT1 (SEQ ID NO: 1) has an antigen peptide portion that binds to HLA-DRB1 * 0405 (one of MHC class II) and induces helper T cells.
  • the 9 amino acid portion predicted to have binding to HLA-DRB1 * 0405 includes, for example, the 9 amino acid portion of WT1 described in SEQ ID NOs: 2-23 be able to. That is, as a specific example of the peptide of the present invention, a peptide containing the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2—SEQ ID NO: 23 and binding to HLA-DRB1 * 0405 to induce helper T cells. Is mentioned.
  • the peptide is a partial peptide of WT1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2-23, and has an activity of inducing helper T cells by binding to HLA-DRB 1 * 0405 As long as the length is not particularly limited. As described above, since the peptide having about 9 amino acid residues having the binding motif structure binds to the peptide-containing groove and both ends of the peptide can protrude from both ends of the groove, MHC class II molecules In principle, there is no limitation on the length of the peptide that can be bound to.
  • the MHC class II-binding peptides reported to date have a length of about 10-25 amino acids (Immunogenetics, 41,178-228 (1995). ), Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85-101 (1996), Immunology, 96, 1-9 (1999), Peptides, Vol. 19, 179-198 (1998), immunobiology, 5th Edt., 116—117, Garland Publishing (2001)) o
  • the peptides of the present invention are preferably about 10-25 amino acids long, more preferably about 13-17 amino acids long.
  • the preferred form of the peptide of the present invention containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2—SEQ ID NO: 23 is as follows: SEQ ID NO: 2—SEQ ID NO: 23 A partial peptide of WT1 consisting of 10-25 amino acids (preferably 13-17 amino acids) containing the amino acid sequence described in 1. and a peptide having an activity of inducing helper T cells by binding to HLA-DRB1 * 0405 Can be mentioned.
  • a more preferred form is a partial peptide of WT1 consisting of 10-25 amino acids (preferably 13-17 amino acids) containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, comprising HLA-DRB1 * 0405 And a peptide having an activity of inducing helper T cells by binding to.
  • a more preferred form is a partial peptide of WT1 consisting of 16-25 amino acids (preferably 16-17 amino acids) containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, and HLA-DRB1 * 0405 Peptides having the activity of binding to induce helper T cells can be mentioned.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24 is a partial peptide of WT1 having a capacity of 16 amino acids containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12.
  • a more preferred form includes a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24.
  • the peptide of the present invention may be appropriately modified within a range that retains activity.
  • modification of amino acid residues means substitution, deletion and Z or addition of amino acid residues (including addition of amino acids to the N-terminal and C-terminal of peptides), preferably amino acid residues Substitution.
  • the number and position of amino acid residues to be substituted are arbitrary as long as the activity as a helper peptide is maintained. Since the length of the peptide to be bound is about 10-25 amino acids, the range of 1 to several is preferred.
  • Such a peptide according to the substitution of the present invention include the first, fourth, sixth and Z of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 2—SEQ ID NO: 23.
  • 4th place Palin, isoleucine, leucine, methionine, aspartic acid, glutamic acid, 6th place: asparagine, serine, threonine, glutamine, lysine, aspartic acid, 9th place: aspartic acid, glutamic acid, glutamine,
  • substitution of the amino acid residues at the 1st, 4th, 6th and Z or 9th positions is, for example, in the natural type helper peptide of the present invention consisting of the partial sequence of WT1 shown above. It can be performed for the purpose of enhancing its binding to HLA-DRB1 * 0405 or enhancing its activity. Substituted 1st, 4th, 6th, and any part other than Z or 9th
  • the natural sequence ie, the partial sequence of WTl
  • further modification may be performed as long as the activity is maintained.
  • the first, fourth, sixth and / or ninth amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 are
  • 6th place asparagine, serine, threonine, glutamine, lysine, aspartic acid
  • 9th place aspartic acid, glutamic acid, glutamine
  • the WT1 partial peptide (SEQ ID NO: 24) having the amino acid sequence of 16 amino acids containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, the 3rd, 6th, 8th and / or Or the 11th amino acid residue is
  • 8th place asparagine, serine, threonine, glutamine, lysine, aspartic acid
  • 11th place aspartic acid, glutamic acid, glutamine
  • a peptide having an amino acid sequence power substituted with any amino acid residue is exemplified. Further, it may be a peptide having 16-25 amino acidity containing the substituted amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the present invention also provides a peptide (so-called “epotope peptide”) containing the helper peptide (natural peptide, modified peptide) of the present invention and a cancer antigen peptide.
  • CTLs are efficiently induced by an epitope peptide obtained by linking a cancer antigen peptide (also referred to as a CTL epitope) and a helper peptide (also referred to as a helper epitope).
  • helper T cells CD4 positive T cells activated by helper peptides are used to induce and maintain CTL differentiation, macrophages, etc.
  • helper T cells CD4 positive T cells activated by helper peptides are used to induce and maintain CTL differentiation, macrophages, etc.
  • CTL epitope cancer antigen peptide consisting of 280 to 288 of melanoma antigen gplOO
  • helper epitope T helper epitope derived from tetanus toxin
  • Such an epitope peptide containing the helper peptide of the present invention and a cancer antigen peptide can also be exemplified as a specific example of the peptide of the present invention.
  • any conventionally known cancer antigen peptide can be used, and preferably a cancer antigen peptide derived from WT1 (natural peptide, modified peptide) is used.
  • WT1 naturally peptide, modified peptide
  • HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -All, -A24, —A31, —A6801, -B7, —B8, -B2705, -B37, derived from WT1 — Cw0401, -Cw0602, etc. include restricted cancer antigen peptides.
  • cancer antigen peptide derived from WT1 include activity as a cancer antigen peptide among peptides listed in Tablell-TableXLVI of International Publication No. 2000/18795 pamphlet and modified peptides thereof (binding to HLA antigen). Peptides having activity of inducing CTLs).
  • cancer antigen peptides include, for example, the following cancer antigen peptides:
  • the peptides described in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29 are peptides that bind to HLA-A24 antigen and HLA-A2 antigen, and are described in SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45. These peptides are peptides that bind to the HLA-A2 antigen. Other peptides are peptides that bind to the HLA-A24 antigen.
  • the cancer antigen peptide according to any one of SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 is exemplified.
  • the epitope peptide of the present invention is, for example, a part of WT1 consisting of 10-25 amino acids containing the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NO: 2—SEQ ID NO: 23.
  • an epitope peptide containing a helper peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24 and a cancer antigen peptide described in any one of SEQ ID NOs: 27-45 can be mentioned. More preferred is an epitope peptide containing a helper peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 24 and a cancer antigen peptide described in any of SEQ ID NOs: 27-30, 44, and 45.
  • Such an epitope peptide can be produced by a general peptide synthesis method as described above. It can also be produced using conventional DNA synthesis and genetic engineering techniques based on the sequence information of a polynucleotide encoding an epitope peptide obtained by linking these epitopes. That is, the polynucleotide is inserted into a well-known expression vector, a transformant produced by transforming a host cell with the obtained recombinant expression vector is cultured, and a plurality of target epitopes are ligated from the culture. It can be produced by collecting the epitope peptide. These methods are based on the methods described in the literature as described above (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985) and the methods described later. It can be carried out.
  • the epitopic peptide has activity as a helper peptide.
  • the epitope peptide has activity as a cancer antigen peptide, for example, WO 02/47474 and Int J.
  • the epitope peptide of the present invention comprises a helper T cell (CD4 positive T cell) activated by a helper peptide moiety contained in the epitope peptide, which induces and maintains CTL differentiation, macrophages, etc.
  • helper T cell CD4 positive T cell
  • a helper peptide moiety contained in the epitope peptide which induces and maintains CTL differentiation, macrophages, etc.
  • the induction of CTL by the cancer antigen peptide contained in the epitope peptide can be further enhanced and thus can be used for more effective treatment or prevention of cancer.
  • amino group of the N-terminal amino acid or the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the peptide of the present invention may be modified. That is, peptides in which the N-terminal amino acid residue and / or the C-terminal amino acid residue are modified are also included in the category of the peptide of the present invention.
  • examples of the modifying group of the amino group of the N-terminal amino acid include 1 to 3 carbon atoms of 1 to 6
  • examples of the acyl group include alkanoyl groups having 1 to 6 carbon atoms and alkanoyl groups having 1 to 6 carbon atoms substituted with the full group.
  • a carbocyclic group substituted by a cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms an alkyl sulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms, a phenol sulfonyl group, or an alkoxy carboxylic group having 2 to 6 carbon atoms.
  • an alkoxy carbo yl group substituted with a phenol group a carbo yl group substituted with a cycloalkoxy having 5 to 7 carbon atoms, a phenoxy carbo ol group and the like.
  • Examples of the peptide in which the carboxyl group of the C-terminal amino acid is modified include an ester form and an amide form.
  • Specific examples of the ester form include substitution with an alkyl ester having 1 to 6 carbon atoms and a phenol group.
  • Specific examples of amide compounds include one or two of an amide, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the like. Substituted amides, amides substituted with 1 or 2 carbon atoms substituted with a phenyl group, 5- to 7-membered azacyclos containing the nitrogen atom of the amide group Examples include amides that form alkanes.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the peptide of the present invention (natural peptide, modified peptide or epitope peptide).
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention may be in the form of DNA or RNA.
  • These polynucleotides of the present invention can be easily produced based on the amino acid sequence information of the peptide of the present invention and the sequence information of the DNA encoded thereby. Specifically, it can be produced by ordinary DNA synthesis or PCR amplification.
  • a polynucleotide encoding the epitope peptide can be mentioned. More specifically, for example, a partial peptide of WT1 consisting of 10-25 amino acids containing the amino acid sequence described in any of SEQ ID NO: 2—SEQ ID NO: 23, which binds to HLA-DRB1 * 0405. And a polynucleotide encoding an epitope peptide containing a helper peptide that induces helper T cells and the cancer antigen peptide of any one of SEQ ID NOs: 27-45.
  • an epitope peptide comprising a helper peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24 and a cancer antigen peptide set forth in any one of SEQ ID NOs: 27-45
  • the polynucleotide which codes is mentioned.
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention includes a polynucleotide that is hybridized under stringent conditions with a complementary sequence of the polynucleotide and that encodes a peptide having the same activity as the peptide of the present invention. included.
  • hybridization used here is, for example, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T. Molecular Cloning 2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory press (Cold Spring Harbor Laboratory press), etc.
  • stringent conditions means, for example, 6 X SSC (a solution containing 1.5 M NaCl and 0.15 M trisodium citrate is set to 10 X SSC), and 45 ° in a solution containing 50% formamide. List the conditions such that a hybrid is formed in C and then washed with 2 X SSC at 50 ° C (Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6). Can do.
  • a recombinant expression vector for expressing the peptide of the present invention can be prepared.
  • the expression vector used here can be appropriately selected according to the host to be used, purpose, etc., and includes plasmids, phage vectors, virus vectors and the like.
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and phage vectors such as ⁇ ⁇ ⁇ and gtll.
  • examples of the vector include pYES2, pYEUra3 and the like.
  • the host is an insect cell, pAcSGHisNT-A and the like can be mentioned.
  • plasmid vectors such as pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, and pRc / CMV
  • viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors can be used. Can be mentioned.
  • the vector is a gene encoding a promoter capable of inducing expression and a signal sequence.
  • factors such as a selection marker gene and a terminator may be appropriately included.
  • a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, or GST (Dartathione S-transferase) may be added to facilitate isolation and purification.
  • a GST fusion protein vector such as PGEX4T
  • PGEX4T that has an appropriate promoter (such as lac, tac, trc, trp, CMV, or SV40 early promoter) that functions in the host cell
  • a vector that has a tag sequence such as Myc or His.
  • pcDNA3.1 / Myc-His a vector that expresses a fusion protein with thioredoxin and His tag can be used.
  • a transformed cell containing the expression vector By transforming a host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
  • Examples of the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • E. coli include E. coli K-12 strains HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, AD494 (DE3) strain, and the like.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae.
  • animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and the like. Insect cells include s! 9.
  • a normal method suitable for the host cell may be used. Specifically, the calcium phosphate method, DEAE-dextran method, electo-poration method, lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin;
  • a transformed cell in which the expression vector is introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
  • the peptide of the present invention can be produced.
  • the obtained peptide can be further isolated and purified by a general biochemical purification means.
  • the purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography and the like.
  • the polypeptide of the present invention is expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, These proteins can be isolated and purified by a purification method using the properties of the fusion protein or tag
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to the peptide of the present invention.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or an monoclonal antibody using the peptide of the present invention as an immunogen without any particular limitation on its form!
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to the peptide of the present invention as described above. Specifically, the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2—SEQ ID NO: 23 is used. And an antibody that specifically binds to a helper peptide that binds to HLA-DRB1 * 0405 and induces helper T cells. Preferred examples include antibodies that specifically bind to a helper peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24.
  • a non-human animal such as a rabbit can be immunized and obtained from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • the peptide of the present invention can be obtained from hyperidoma cells prepared by immunizing a non-human animal such as a mouse and fusing the obtained spleen cells and myeloma cells. eSaru (and urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 1.11.11).
  • Preparation of an antibody against the peptide of the present invention can also be carried out by enhancing immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surfaces such as lysolecithin, pull-mouth polyol, polyion, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Active substances human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette Guerin) and Corynebaterum-Parvum.
  • an antibody that recognizes the peptide and an antibody that neutralizes the activity can be easily prepared.
  • Applications of antibodies include affinity chromatography, immunological diagnosis, and the like.
  • the immunological diagnosis can be appropriately selected from immunoblotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (E LISA), fluorescence or luminescence assay.
  • RIA radioimmunoassay
  • E LISA enzyme immunoassay
  • fluorescence or luminescence assay is a cancer in which the WT1 gene is expressed, that is, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovary Effective in diagnosing cancer
  • the present invention relates to a peptide of the present invention (natural peptide, modified peptide, epitope peptide), an expression vector containing the polynucleotide of the present invention, or a cell containing the expression vector of the present invention, And a pharmaceutical composition containing an acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition can be effectively used as a helper T cell inducer or cancer vaccine action enhancer. This will be specifically described below.
  • Helper T cell inducer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient
  • the peptide of the present invention has the ability to induce helper T cells, and the induced helper T cells can induce cancer through induction and maintenance of CTL differentiation and activation of single cells such as macrophages.
  • the CTL-inducing activity which is the action of a vaccine, can be further enhanced. That is, the present invention provides a cancer vaccine action enhancer (pharmaceutical composition as a cancer vaccine action enhancer) containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the action enhancer of the present invention When the action enhancer of the present invention is administered to an HLA-DRB1 * 0405 positive and WT1 positive patient, the peptide of the present invention is presented to the HLA-DRB1 * 0405 antigen of the antigen-presenting cell, and the peptide is combined with the HLA_DRB1 * 0405 antigen.
  • Specific helper T cells CD4 positive T cells
  • CD4 positive T cells that recognize the body are induced and activated to induce and maintain CTL differentiation, and to exert the activity of effector cells such as macrophages Therefore, it is possible to enhance the CTL induction activity that is an effect of a cancer vaccine.
  • the cancer vaccine effect-enhancing agent of the present invention is a cancer with an increased expression level of the WT1 gene, for example, hematological cancers such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma Can also be used in the prevention or treatment of solid cancers such as stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, etc.
  • hematological cancers such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma
  • solid cancers such as stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, etc.
  • the cancer vaccine action enhancer of the present invention can be administered simultaneously with the cancer vaccine, or can be administered before or after the cancer vaccine administration.
  • the cancer vaccine action enhancer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient may be a single helper peptide as an active ingredient or an epitope linked to a cancer antigen peptide (CTL epitope). It may be one containing a peptide as an active ingredient. As described above, in recent years, it has been shown that CTL is efficiently induced by an epitope peptide obtained by linking a cancer antigen peptide (CTL epitope) and a helper peptide (helper epitope).
  • CTL epitope cancer antigen peptide
  • helper epitope helper epitope
  • helper peptide When administered in the form of such an epitope peptide, the helper peptide is taken up into the antigen-presenting cell and then undergoes intracellular degradation, and the helper peptide is MHC class II antigen (HLA- DRB1 * 0405) and a cancer antigen peptide bind to MHC class I antigen to form a complex, and the complex is presented at a high density on the surface of the antigen-presenting cell.
  • MHC class II antigen HLA- DRB1 * 0405
  • Helper T cell recognizes complex of HLA-DRB1 * 0405 antigen and helper peptide, induces and maintains CTL differentiation, and activates effector cells such as macrophages. Further enhances the activity.
  • CTL recognizes and proliferates the complex of cancer antigen peptide and MHC class I antigen and destroys cancer cells. Therefore, the pharmaceutical yarn composition comprising the epitope peptide of the present invention as an active ingredient is used as a cancer vaccine action enhancer and also as a cancer vaccine itself.
  • the cancer vaccine action enhancer comprising the peptide of the present invention as an active ingredient is administered together with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, an appropriate adjuvant, or particles so that cellular immunity is effectively established.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or particles so that cellular immunity is effectively established.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or particles so that cellular immunity is effectively established.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or particles so that cellular immunity is effectively established.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or particles so that cellular immunity is effectively established.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or particles so that cellular immunity is effectively established.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, an appropriate adjuvant, or particles so that cellular immunity is effectively established.
  • the adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) and the like
  • Examples of the administration method include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like.
  • the dosage of the peptide of the present invention in the preparation can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the patient's age, body weight, etc.
  • O.OOOlmg—1000 mg preferably O.OOlmg—1000 mg, more preferably O .lmg—10 mg, preferably administered once every few days or months.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a combination of the peptide of the present invention and a cancer antigen peptide.
  • a pharmaceutical composition comprising a combination of the peptide of the present invention and a cancer antigen peptide.
  • the cancer antigen peptide's action as a cancer vaccine is enhanced by the peptide of the present invention, and cancer treatment or prevention is achieved more effectively. Can do.
  • “Combination” includes administration of the peptide of the present invention and cancer antigen peptide in a mixed form and administration in separate forms.
  • a premixed formulation can be used, or a separately formulated formulation can be used as needed.
  • cancer antigen peptide cancer vaccine
  • cancer vaccine action enhancer it is possible to administer the cancer antigen peptide after administering the peptide of the present invention (cancer vaccine action enhancer), or to administer the cancer antigen peptide (cancer vaccine). Then, the peptide of the present invention (cancer vaccine action enhancer) may be administered.
  • the kit can be shown in column f.
  • cancer antigen peptide used in combination with the peptide of the present invention a cancer antigen peptide derived from WT1 (natural peptide, modified peptide), preferably any known cancer antigen peptide can be used.
  • the cancer antigen peptide described in SEQ ID NOs: 27-45 can be mentioned, and the cancer antigen peptide described in any of SEQ ID NOs: 27-30, 44, 45 is preferable.
  • Helper T cell inducer comprising the expression vector of the present invention as an active ingredient Not only the peptide of the present invention but also an expression vector containing a polynucleotide encoding the peptide has a helper ⁇ cell-inducing activity and can be used as an active ingredient of a cancer vaccine action enhancer. That is, the present invention provides a cancer vaccine action enhancer (pharmaceutical composition as a cancer vaccine action enhancer) containing, as an active ingredient, an expression vector containing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention.
  • polynucleotide encoding the epitope peptide of the present invention into an appropriate expression vector, it can be used as an active ingredient of a cancer vaccine action enhancer.
  • the expression vector containing the polynucleotide of the present invention is applied as an active ingredient of a cancer vaccine action enhancer, the following method can be used.
  • a viral vector method and other methods As a method for introducing an expression vector containing the polynucleotide of the present invention into a cell, a viral vector method and other methods (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), experimental medicine special edition, 12 (15), (1994), and cited references thereof, etc.) can be applied.
  • Examples of the method using a viral vector include DNA viruses or RNA viruses such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, vaccinia viruses, box viruses, polioviruses, and synbis viruses.
  • An example is a method of introducing DNA.
  • methods using retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, etc. are particularly preferred.
  • DNA vaccine method direct administration of the expression vector into the muscle
  • ribosome method lipofectin method
  • microinjection method calcium phosphate method
  • electoral position method is preferred, and the DNA vaccine method and the ribosome method are particularly preferred.
  • an in vivo method When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease, symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneously, intradermally, intramuscularly. When administered by an in vivo method, for example, it can take a pharmaceutical form such as a solution, but is generally an injection containing the expression vector of the present invention, which is an active ingredient, and is used as needed. May be added.
  • liposomes or membrane fusion ribosomes containing the expression vector of the present invention are in the form of ribosome preparations such as suspensions, freezing agents, and centrifugal concentrated freezing agents. be able to.
  • the content of the expression vector of the present invention in the preparation can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient. Usually, O.OOOlmg—100 mg, preferably O.OOlmg—10 mg of the present invention.
  • the expression vector is preferably administered once every few days to several months.
  • the expression vector of the present invention as described above is administered to an HLA-DRB1 * 0405-positive and WT1-positive patient, the peptide of the present invention is presented to the HLA-DRB 1 * 0405 antigen of the antigen-presenting cell.
  • a specific helper T cell CD4 positive T cell
  • CD4 positive T cell that recognizes the complex of HLA-DRB1 * 0405 antigen is induced and activated, and induces and maintains CTL differentiation, and effects such as macrophage It can exert cell activity and thus enhance CTL inducing activity, which is an effect of cancer vaccine.
  • the cancer vaccine action potentiator comprising an expression vector containing the polynucleotide of the present invention as an active ingredient is a cancer associated with an increase in the expression level of the WT1 gene, such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma
  • WT1 gene such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma
  • blood cancer such as gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, etc. Can be used for this purpose.
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding an epitope peptide is administered as described above, it is incorporated into an antigen-presenting cell and then subjected to intracellular degradation.
  • helper peptides are MHC class II antigens (
  • HLA-DRB1 * 0405 and the cancer antigen peptide bind to MHC class I antigen to form a complex, and the complex is displayed at a high density on the surface of the antigen-presenting cell.
  • the helper T cell recognizes the complex of HLA-DRB1 * 0405 antigen and helper peptide, and is an effect of cancer vaccine through the induction and maintenance of CTL differentiation and the effect of effector cells such as macrophages. Further enhances CTL inducing activity.
  • CTL recognizes and proliferates the complex of cancer antigen peptide and MHC class I antigen and destroys cancer cells. Therefore, a pharmaceutical composition comprising an expression vector containing a polynucleotide encoding the epitope peptide of the present invention as an active ingredient is used as a cancer vaccine action enhancer and also as a cancer vaccine itself. .
  • the present invention relates to a peptide consisting of 10 to 25 amino acids in the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1, which binds to HLA-DRB1 * 1502 and induces a helper T cell.
  • the HLA-DRB1 * 1502 binding antigen peptide of the present invention may be modified at its N-terminal amino acid residue and / or C-terminal amino acid residue or at a specific amino acid residue. .
  • the synthesis and activity measurement of the HLA-DRB1 * 1502-binding antigen peptide of the present invention can be performed by the same method as the HLA-DRB1 * 0405-binding antigen peptide of the present invention.
  • the HLA-DRB1 * 1502-binding antigen peptide of the present invention is a partial peptide of WT1 having a continuous 10-25 amino acid power in the amino acid sequence of human WT1 described in SEQ ID NO: 1.
  • Preferable is a peptide having a continuous 13-17 amino acid force in the amino acid sequence of human WT1.
  • human WT1 has an antigenic peptide part that induces helper T cells by binding to HLA_DRB1 * 1502, and is a force MHC class II binding sequence prediction program ProPred (Bioinformatics 17: 1236,2001), 9 amino acid moieties predicted to have binding to HLA-DRB1 * 1502 (9 amino acid moieties capable of binding in the peptide-containing groove of MHC class II molecules) SEQ ID NO: 46—described in SEQ ID NO: 56 The 9 amino acid part of WT1.
  • HLA-DRB1 * 1502 binding antigen peptide of the present invention contains the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 56 and binds to HLA_DRB1 * 1502. Peptides that induce T helper cells.
  • the peptide is preferably about 10-25 amino acids long, more preferably about 13-17 amino acids long.
  • it is a partial peptide of WT1 having 10 to 25 amino acids (preferably 13 to 17 amino acids) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50, which binds to HLA_DRB1 * 1502 to helper T Examples thereof include peptides having cell-inducing activity.
  • it is a partial peptide of WT1 having 16-25 amino acids (preferably 16-17 amino acids) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, which binds to HLA_DRB1 * 1502 and helps Peptides having an activity to induce T cells can be mentioned.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24 is a partial peptide of WT1 having 16 amino acid strength containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 50.
  • WT1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24
  • the WT1 peptide is composed of only HLA-DRB1 * 0405 molecules.
  • helper peptide that can be applied not only to patients having HLA_DRB1 * 0405 but also to patients having HLA_DRB1 * 1502, and is useful from the viewpoint of wide application range of patients.
  • the epitope peptide, polynucleotide, antibody and pharmaceutical composition relating to the HLA_DRB1 * 1502 binding antigen peptide of the present invention should be carried out in the same manner as in the case of the HLA-DRB1 * 0405 binding antigen peptide of the present invention. Can do.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • X-VIVO 15 TM medium (Camblex) containing 1% AB serum, seeded on a 6-well culture plate, and cultured for 2 hours. After culturing, floating cells were removed, and the attached cells were washed with Hanks solution.
  • Adherent cells were cultured with X-VIVO 15 TM medium containing 1% AB serum, lOOOU / ml IL-4 and lOOOU / ml GM-CSF. On days 2 and 4, half of the culture was removed and fresh culture was added. On the 6th day, TNF-a was added so as to be lOOU / ml. The cells on day 7 were used as rodent cells in the experiment.
  • a rosette set (Stemcell), an antibody cocktail for CD4 positive T cell separation, was added to about 100 ml of blood diluted 2-fold with RPMI medium, and left at room temperature for 20 minutes. Thereafter, CD4-positive T cells were collected by FicoU-Paque density gradient centrifugation.
  • the rod-shaped cells prepared in (1) above were seeded in a 24-well culture plate at 3 X 10 5 per well, and the peptide of SEQ ID NO: 24 was added to 50 g / ml. After 4 hours of incubation, the cells were stopped growing by irradiation with 25 Gy X-rays. Next, 3 ⁇ 10 6 CD4 positive cells prepared in (2) were added per well, and mixed culture was performed with rod-shaped cells. X-VIVO 15 TM culture medium containing 1% AB serum was used as the culture medium. Half of the culture medium was changed every 2 days from the start of the culture, and IL-2 was added to 20 U / ml.
  • T cells were collected on the 7th and 14th day from the start of the culture, Seed 3 x 10 6 cells per well in a 24-well plate, pulsed with 20 ⁇ g / ml peptide (SEQ ID NO: 24), and then X-irradiated with 25 Gy 3x 10 Five cells were added and mixed culture was performed.
  • the culture medium used was X-VIVO 15 TM culture medium containing 1% AB serum and 20 U / ml IL-2.
  • T cells after the third stimulation were collected and seeded at 3 x 10 4 per well in a 96-well culture plate. Further, 3 ⁇ 10 4 rod-shaped cells pulsed with 20 g / ml peptide (SEQ ID NO: 24) and then irradiated with X-rays at 25 Gy were added and cultured.
  • SEQ ID NO: 24 20 g / ml peptide
  • X-rays at 25 Gy were added and cultured.
  • As a negative control a group in which peptides were pulsed and V-like, and rod-shaped cells were mixed and cultured with T cells, and a group in which 0.2% PHA was added instead of rod-shaped cells as a positive control were set.
  • the rod-shaped cells prepared by the method described in Example 1 were seeded in a 96-well plate at 10 4 cells per well, and CD4 positive T cells induced with the peptide WT1 of SEQ ID NO: 24 were further added to the 96-well plate.
  • the culture medium used was X-VIVO 15 TM culture medium containing 1% AB serum, 20 U / ml IL-2, and 5 g / ml PHA.
  • G2 cell line a CD4 positive T cell line was established and named “G2 cell line”.
  • the reactivity of the G2 cell line to the rods that were pulsed with the peptide was measured in the same manner as in Example 1. The result is shown in figure 2.
  • the G2 cell line can be obtained by mixing and culturing with WT1 peptide-pulsed rod cells.
  • the G2 cell line is a CD4-positive T cell specific for the WT1 peptide.
  • peripheral blood mononuclear cells were collected from the blood collected from healthy human volunteers who were positive for HLA-DRB1 * 0405 by FicoU-Paque density gradient centrifugation. 10 7 PBMCs were seeded per well in a 24-well plate.
  • As the culture solution RPMI1640 culture solution containing 10% FCS and 55 M of 2ME was used. After adding a culture solution containing Epstein-Barr virus (Epstein-Barr virus: EBV) and culturing for 4 weeks, an EBV-transformed B cell line was established, and B-LCL (—) cells and Named. EBV was prepared from the culture supernatant of cell line B95-8 (JCRB cell bank No.
  • B- LCL (—) cells Adjust B- LCL (—) cells to 3 ⁇ 10 7 cells / mL, add culture medium containing virus that expresses the WT1 gene, and then add polypropylene to a final concentration of 8 g / mL. Then, 1 mL was seeded on a 24-well plate. After culturing for 16 hours, 1 mL of a new culture solution was added and the culture was continued. G418 (neomycin) was added at 0.7 g / mL, and the cells were cultured for 5-7 days to select cells into which the gene had been introduced. The B cell line expressing WT1 selected in this way was named B-LCU +) cells.
  • B-LCL (—) cells and B-LCU +) cells The expression level of WT1 gene in B-LCL (—) cells and B-LCU +) cells was measured by RT-PCR. The method was converted according to the literature (Blood, 89: 1405, 1997), assuming that the expression level of the positive control K562 cells was 1. As a result, B-LCL (-) cells, whereas it is 1.6 X 10- 4, B-LCU +) cells was 3.2, that WT1 gene is highly expressed was confirmed. The reactivity of G2 cells to B-LCL (+) cells was examined in the same manner as in Example 2. To confirm HLA-DR binding, a group was also established in which B-LCU +) was treated with anti-HLA-DR antibody before mixing with G2 cells. The results are shown in Figure 3.
  • Peptide-specific CD4-positive T cell line G2 shows a proliferative response in mixed culture with B-LCU + cells that endogenously express WT1 gene, and this reaction is inhibited by anti-HLA-DR antibody It was shown that. These results indicate that the WT1 peptide is generated from the WT1 protein in the cell and is endogenously converted to the HLA-DR molecule.
  • Example 4 Establishment of WT1 peptide-specific CD4-positive T cell line E04.1
  • rod-shaped cells were prepared using blood from which healthy volunteers who were positive for HLA-DRB1 * 0405 were also collected.
  • TNF- ⁇ added on the 6th day was adjusted to a final concentration of 200 IU / ml.
  • blood collected from the same healthy volunteer force used for the preparation of rod cells was used.
  • CD4 positive T cells were isolated according to the package insert of RosetteSep (StemCell).
  • CD4 positive T cells specific for the WT1 peptide (SEQ ID NO: 24: WT1) were induced in the same manner as in Example 1 using the above-described rod cells and CD4 positive T cells. This WT1 pep
  • the CD4 positive T cell line E04.1 was established by culturing the CD4 positive T cells specific to the chid by the limiting dilution method.
  • PBMCs prepared by the method described in Example 1 as feeder cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 per well after X-ray irradiation.
  • X-VIVO 15 TM medium containing 20 IU / ml IL-2 and 5 g / ml PHA was used as a culture solution.
  • E04.1 cells can be mixed and cultured with rod-shaped cells pulsed with WT1 peptide.
  • E04.1 cells are WT1 peptide specific
  • CD4 positive T cell line was revealed.
  • Example 4 E04.1 cells established in Example 4 were seeded at 1 ⁇ 10 4 per well of a 96-well culture plate.
  • Example 3 after pulsing WT1 peptide at a concentration of 20 ⁇ g / ml into BLA strain B-LCL (-) cells established in HLA_DRB1 * 0405 positive healthy volunteer blood force
  • WT1 peptide was irradiated with X-rays after pulse.
  • B-LCL (-) cells were treated with 20 ⁇ g / ml anti-HLA-DR antibody (G46.6, BD ParMingen)
  • a group was also set which was treated with HLA-classl antibody (G46-2.6, BD ParMingen) and anti-HLA-DQ antibody (SPVL3, Immunotech) for 30 minutes and then mixed with E04.1 cells.
  • HLA-classl antibody G46-2.6, BD ParMingen
  • SPVL3, Immunotech anti-HLA-DQ antibody
  • E04.1 cells are mixed and cultured with B-LCL (-) cells pulsed with WT1 peptide
  • E04.1 cells are proliferative responses in WT1 peptide-pulsed B-LCL (-) cells treated with other antibodies.
  • PBMCs were prepared in the same manner as in Example 4 from the blood of healthy volunteers who were positive or negative for HLA-DRB1 * 0405. Pulse this PBMC with 20 ⁇ g / ml WT1 peptide.
  • X-irradiation was performed, and 3 ⁇ 10 4 cells were seeded per well of a 96-well culture plate. Further, E04.1 cells were seeded in a 96-well culture plate and IX 10 4 cells per well were mixed and cultured. In addition, as a negative control, a group in which peptide was pulsed and PBMC and E04.1 cells were mixed and cultured was also used.
  • WT1 peptide is a polymorphic HLA-DRB1 molecule.
  • Example 3 HLA-DRB1 * 0405 positive healthy volunteer blood force established B cell line B-LCL (-) and WT1-expressing B cell line B-LCL (+) after X-irradiation, 3 X 10 4 cells per well, were mixed culture by inoculating 1 X 10 4 cells of E04.1 cells. Thereafter, proliferation of E04.1 cells was measured in the same manner as in Example 4. The results are shown in FIG. E04.1 cells showed a proliferative response when mixed with WT1-expressing B cell line B-LCL (+), and did not show a proliferative response when mixed with B-LCL (-) that did not express WT1.
  • the 332-347 peptide was degraded from the WT1 protein in the cells of B-LCL (+) cells and then presented to HLA-DRB1 * 0405, which was shown to induce proliferation of E04.1 cells. .
  • Induction of apoptosis of B-LCL (-) and B-LCL (+) cells was performed by osmotic shock.
  • 1 X 10 6 cells were suspended in 500 ⁇ 1 hyperosmotic medium (RPM medium containing 0.5 M sucrose, 10% w / v polyethylene glycol 1000, 10 mM HEPES, pH 7.2), and then at 37 ° C. Let stand for 10 minutes. Thereafter, the mixture was diluted 30-fold with a low osmotic pressure medium (60% RPMI, 40% water) preliminarily set at 37 ° C. and allowed to stand at 37 ° C. for 2-3 minutes.
  • RPM medium hyperosmotic medium
  • 60% RPMI, 40% water preliminarily set at 37 ° C. and allowed to stand at 37 ° C. for 2-3 minutes.
  • Example 8 The cells were collected by centrifugation at room temperature for 5 minutes and used as apoptosis-inducing cells. Induction of apoptosis was confirmed by fluorescent dye Propidium Iodide and phosphatidylserine binding reagent Annexin V for staining dead cells. [0084] Example 8
  • E04.1 cells were mixed with rod cells that were not pulsed with a peptide was also set.
  • Brefeldin A was added to a final concentration of 10 / z g / ml to inhibit exocytosis of E04.1 cells.
  • CD4 positive T cells were recovered, fixed with PBS containing 2% formaldehyde, and treated with a permeabilization solution containing 0.1% saponin to increase the cell membrane permeability of the antibody.
  • E04.1 cells are rod-shaped cells pulsed with WT1 peptide
  • Th-1 type site force in IL-4 production was not induced by the mixed culture with Th-1 type site force in IFN- ⁇ .
  • E04.1 cells were reacted with anti-CD4 antibody and anti-CXCR3 antibody, stained, and analyzed by a flow cytometer. The result is shown in FIG. Over 90% of E04.1 cells were shown to be CD4-positive and CXCR3-positive Th-1-type CD4-positive T cells.
  • CXCR3 is a chemokine receptor and is known to be highly expressed in Th-1 type immune cells.
  • WT1 peptide is a WT1 peptide-specific CD4 positive cell line E04.1 cell.
  • WT1 peptide (20 ⁇ g / ml) + E04.1 cells (1.5 X 10 6 / well)
  • Yohi 04.1 cells were added and cultured at 37 ° C for 7 days.
  • X-VIVO 15 TM medium containing 10% AB serum was used as the medium.
  • the WT1 peptide used here is HLA-A * 2402.
  • Fig. 11 shows the results of analysis using a meter. PBMC were stimulated with WT1 peptide
  • the cells were fixed and treated with a permeabilization solution to enhance cell membrane permeability in the same manner as in Example 8, and then the inside of the cells was stained with PE-labeled anti-IFN- ⁇ antibody.
  • a permeabilization solution to enhance cell membrane permeability in the same manner as in Example 8, and then the inside of the cells was stained with PE-labeled anti-IFN- ⁇ antibody.
  • APC-labeled anti-mouse IgG antibody (BD PharMingen) was also performed, and IFN-v positive and mouse IgG positive cell population was excluded as non-specific staining.
  • the ratio of activated WT1 peptide-specific CTL was 17.0%.
  • the percentage of activated WT1 peptide-specific CTL increased to 39.0%.
  • the WT1 peptide increased the induction and activation of WT1-specific CTL precursors.
  • helper ⁇ cells that enhance the activation of WT1-specific CTLs, and are mediated by WT1 peptides.
  • WT1 peptide also binds to HLA-DRB 1 * 1502 molecule
  • Promiscuous helper peptide capable of inducing WT1-specific CD4-positive T cells
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • HLA-DRB1 * 1502/1403 healthy blood donors
  • 1% AB type serum Naabi, Miami, FL
  • X-VIVO 15 culture solution Cambrex
  • 1000 IU / ml IL-4 PeproTech
  • 1000 IU / ml GM-CSF PeproTech
  • 1% type AB serum X-VIVO 15 medium In culture.
  • CD4 positive T cells were separated using the same blood donor power RosetteSep (StemCell) for CD4 positive T cell separation. Place each CD4 positive T cell (3 X 10 6 cells) into each well of a 24-well plate, pulse it with 20 ⁇ g / ml of WT1 peptide, and irradiate it with 25 Gy.
  • the cells were stimulated with dendritic cells (3 ⁇ 10 5 cells), and IL-2 was added at 20 IU / ml the day after stimulation.
  • Stimulated CD4 positive T cells were similarly pulsed with WT1 peptide at 20 ⁇ g / ml every other week.
  • Stimulation was performed using cultured rod cells. After the second stimulation, the medium was changed every other day with a medium containing IL-2. CD4 positive T cells induced by a total of 3 stimuli were used in the experiment.
  • Proliferation assay was performed by [ 3 H] -thymidine incorporation method.
  • Peptide-stimulated and induced CD4 positive T cells (3 x 10 4 responders) and WT1, WT1, WT1
  • CD4-positive T cells and stimulator were co-cultured in the same manner as in the growth assay, and after 2 hours, Brefeldin A was added. After 4 hours, cells were collected, fixed / permeated, stained with FITC-labeled anti-IL-4 antibody (BD Pharmingen) and PE-labeled anti-IFN-y antibody (BD Pharmingen), and flow cytometry was performed. .
  • CD4 positive T cells which were separated from healthy blood donors (HLA-DRB1 * 1502/1403), were stimulated a total of three times using their own rod-shaped cells pulsed with WT1 peptide.
  • Peptide specificity of induced CD4 positive T cells is measured by WT1, WT1, WT1
  • Induced CD4-positive T cells can be obtained in the absence of peptide or upon stimulation with WT1 or WT1.
  • CD4-positive T cells were shown to have WT1 specificity.
  • E15.2 subline was stimulated by WT1 peptide, and secreted IL-4 and IFN- ⁇ were
  • IL-4 which is a Th-1 type site force-in
  • IL-4 which is a Th-2 type site force-in
  • WT1-specific proliferation response of the E15.2 subline is dependent on the concentration of WT1.
  • WT1 peptide was pulsed to the peripheral blood mononuclear cells of one HLA-DRB1 * 1502-positive healthy person (1502/0901) and one HLA-DRB1 * 1502-negative healthy person (1302/0803).
  • E15.2 which is a WT1 peptide-specific Th-1-type CD4-positive T cell line
  • WT1 is the most common HLA-DRB1 * 0405 molecule in Japanese by subline analysis
  • the present invention provides a WT1-derived HLA-DRB1 * 0405-binding antigen peptide, a polynucleotide encoding the peptide, an inducer for helper T cells containing these peptides and polynucleotides, and the like.
  • the helper T cell inducer of the present invention is useful as an enhancer of cancer vaccine action.
  • the cancer vaccine action enhancer of the present invention is applicable to many HLA-DRB1 * 0405-positive cancer patients, and is particularly useful as a WT1 vaccine action enhancer.
  • FIG. 1 CD4 positive T cells (helper T cells) stimulated with WT1-derived peptide WT1
  • WT1 pulse refers to rod-shaped cells pulsed with WT1 peptide.
  • WT1 response is the reaction with rod-shaped cells pulsed with WT1 peptide.
  • Each shows sex.
  • the vertical axis shows the amount of [] -thymidine taken up by CD4 positive T cells ( cpm).
  • Non-treatment is the result of pulsing the peptide and using the spider cells
  • WT1 pulse is the result of using the WT1 pulsed spider cells.
  • the vertical axis indicates the amount of [] -thymidine (cpm) incorporated into the G2 cell line.
  • FIG. 3 shows the results of examining the reactivity of the G2 cell line to B-LCU + cells expressing the WT1 gene.
  • B-LCL (-) indicates the results using B-LCL ( ⁇ ) cells that do not express the WT1 gene
  • B_LCL (+) indicates B-LCU +) cells that express the WT1 gene.
  • the results used and “B-LCL (+) + anti-HLA-DR antibody” show the results using B-LCL (+) treated with anti-HLA-DR antibody.
  • the vertical axis indicates the amount of [] -thymidine (cpm) incorporated into the G2 cell line.
  • the vertical axis represents the amount of [ 3 H] -thymidine (cpm) incorporated into the E04.1 cell line.
  • FIG. 5 Stimulated cells pulsed with WT1-derived peptide WT1 were treated with various HLA-inhibiting antibodies.
  • B-cell line B-LCL (-) cells established in Example 3 in which healthy human volunteers with positive HLA-DRB 1 * 0405 positive blood force were used as stimulating cells.
  • “-” indicates the result of using the stimulating cell without pulsing the peptide
  • “332” indicates the result of using the stimulating cell pulsed with the WT1 peptide.
  • a -classlj is a stimulator cell treated with WT1 peptide and anti-HLA-class I antibody
  • 332 + -DRJ is a stimulator cell treated with WT1 peptide and anti-HLA-DR antibody.
  • the “332 + mIgG” is a negative control for WT1 peptide and inhibitory antibody.
  • the result using the stimulation cell processed with the mouse IgG antibody is shown.
  • the vertical axis represents the amount of [ 3 H] -thymidine (cpm) incorporated into the E04.1 cell line.
  • Donor's HLA-DRB1 genotype is Donor 1
  • HLA-DRBl * 0405/0803 Donor 2 (HLA-DRB1 * 0405/0101), Donor3 (HLA-DRB1 * 0101/1001) and Donor 4 (HLA-DRBl * 1201/0802).
  • the vertical axis represents the amount of [ 3 H] -thymidine (cpm) incorporated into the E04.1 cell line.
  • FIG. 7 shows the results of examining the reactivity of the E04.1 cell line against B-LCL (+) cells expressing the WT1 gene.
  • B-LCL (-) is the result of using B-LCL ( ⁇ ) cells that do not express WT1 as stimulating cells
  • ⁇ -LCL (+) is the B-LCL that expresses WT1 gene.
  • LCL (+) cells as stimulating cells are shown.
  • the vertical axis represents the amount of [] -thymidine (cpm) incorporated into the E04.1 cell line.
  • FIG. 8 shows the results of examining the reactivity of the E04.1 cell line to rod-shaped cells pulsed with B-LCL (+) cells that induced apoptosis.
  • apoptotic B-LCL (+) indicates a case in which apoptosis is induced in B-LCL (+) cells expressing the WT1 gene and then pulsed into rod cells.
  • Apoptotic B-LCL ( ⁇ ) indicates a case in which apoptosis is induced in B-LCL ( ⁇ ) cells that do not express the WT1 gene and then pulsed into rod cells.
  • E04.1 + represents the case where E04.1 cells were mixed and cultured with rod-shaped cells
  • ⁇ 04.1-] represents the case where E04.1 cells were not mixed and cultured.
  • the vertical axis shows the amount of [] -thymidine (cpm) incorporated into the E04.1 cell line.
  • the results using rod-shaped cells pulsed with 332-347 peptide are shown.
  • the vertical axis shows the percentage of E04.1 cells in which IL-4 (white bar) or IFN- ⁇ (black bar) production was observed.
  • FIG. 10 shows the results of staining the E04.1 cell line with anti-CD4 antibody and anti-CXCR3 antibody and analyzing with a flow cytometer.
  • the horizontal axis represents CD4 positive cells
  • the vertical axis represents CXCR3 positive cells.
  • the percentage of CD4 positive and CXCR3 positive cells was 90.1%.
  • the vertical axis represents WT1 peptide / HLA-A * 2402-positive cells.
  • the horizontal axis indicates anti-mouse IgG antibody positive cells.
  • E is the WT1 page.
  • F is WT1 peptide + WT1 peptide
  • G is WT1 peptide + E04.1
  • H shows the results of stimulation with WT1 peptide + WT1 peptide + E04.1 cells
  • FIG. 13 CD4 positive T cells stimulated with WT1-derived peptide WT1 and various rod-shaped cells
  • the vertical axis represents the amount of [] -thymidine (cpm) incorporated into the separated cell line.
  • A) shows the results when the E15.1 cell line is used, and B) shows the results when the E15.2 cell line is used. ** in the figure indicates that a statistically significant difference was observed between the experimental groups.
  • FIG. 16 E15.2 cell line against autologous PBMC pulsed with WT1-derived peptide WT1
  • V-shaped rod cells show that 332 is self-pulsed with WT1 peptide.
  • the result using PBMC is shown.
  • the vertical axis shows the percentage of E15.2 cells in which production of IL-4 (white bar) or IFN- ⁇ (black bar) was observed.
  • the vertical axis shows the amount of [] -thymidine (cpm) incorporated into the E15.1 cell line.
  • the horizontal axis shows the pulse concentration of WT1 peptide to autologous PBMC.
  • A) shows the case of using PBMC derived from HLA-DRB1 * 1502-positive healthy persons
  • B shows the case of using PBMC derived from HLA-DRB1 * 1502-negative healthy persons.
  • the vertical axis shows the amount of [] -thymidine (cpm) incorporated into the E15.2 cell line.

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Abstract

　WT1由来のHLA-DRB1*0405結合性抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むヘルパーT細胞の誘導剤などを提供する。配列番号：１に記載のヒトWT1のアミノ酸配列における連続する10～25アミノ酸からなる部分ペプチドであって、HLA-DRB1*0405に結合してヘルパーＴ細胞を誘導するペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらペプチドやポリヌクレオチドを含むヘルパーT細胞の誘導剤等に関する。

Description

明 細 書
WT1由来の HLA— DR結合性抗原ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、 WT1由来の HLA— DRB1*0405結合性抗原ペプチドに関する。
背景技術
[0002] WT1遺伝子（Wilms' tumor gene 1)は、小児の腎腫瘍である Wilms腫瘍の原因遺 伝子の 1つとして同定された（Cell 60: 509, 1990、 Nature 343: 774, 1990)。 WT1遺 伝子は、細胞の増殖 ·分ィ匕 ·アポトーシスおよび臓器の形成などに関する重要な働き をする転写因子 WT1をコードしている（Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998)。当初、 WT 1遺伝子は、癌抑制遺伝子と位置付けられていたが、その後の研究により白血病お よび肺癌や乳癌を含む種々の固形癌で発現が認められ、むしろ癌の増殖を促進す る癌遺伝子としての作用を有することが示された。また、 WT1由来のペプチドで HLA-A*0201陽性または HLA-A*2402陽性の末梢血単核球を in vitroで刺激すること により、ペプチド特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)が誘導され、これらの CTLは、内 因性に WT1を発現する白血病や固形癌の癌細胞を傷害することが示された。これら の結果より、 WT1は癌免疫療法 (癌ワクチン療法)の有望な標的分子であることが示 された（Int. J. Hematol 76: 127, 2002) 0
[0003] CTLが有効に誘導されるためには、癌抗原に特異的なヘルパー T細胞の存在が重 要であることが報告されている（Cancer. Res. 62:6438, 2002) 0
ヘルパー T細胞 (CD4陽性 T細胞）は、抗原提示細胞の MHCクラス II分子と抗原べ プチドとの複合体を認識して誘導 (増殖） '活性化される。活性化されたヘルパー Τ細 胞は IL-2、 IL- 4、 IL-5、 IL- 6、あるいはインターフェロンなどのサイト力インを産生し、 B 細胞の増殖、分化、成熟を介助する。また活性ィ匕ヘルパー T細胞は、 T細胞の他の サブセット (Tc、 TD細胞など)の増殖、分化、成熟を促進する機能を有する。このよう に活性ィ匕ヘルパー T細胞は B細胞、 T細胞の増殖'活性化を促進することにより免疫 系を活性ィ匕する機能を有することから、癌免疫療法 (癌ワクチン療法）において、 MHCクラス II結合性の抗原ペプチド（ヘルパーペプチドとも言う）の作用を受けヘル パー T細胞の機能を増強し、癌ワクチンの効果を増強することは有用であると考えら れている (J.Immunother., 24:195, 2001)。
WT1に関しては、 MHCクラス II分子のサブタイプの 1種である HLA-DRB1*0401に結 合する 1種類の抗原ペプチドに関する報告（Cancer. Immunol. Immunother. 51 : 271, 2002)があるが、それ以外のサブタイプにつ!ヽては報告されて!ヽな!、。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、 WT1由来の HLA— DRB1*0405結合性抗原ペプチド、および 当該ペプチドの癌ワクチン作用増強剤としての使用を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者は、癌免疫療法において癌ワクチンの作用を増強できる、 WT1由来の MHCクラス II結合性抗原ペプチド (ヘルパーペプチド）にっき鋭意検討を行った。そ の結果、 WT1には、多数存在する MHCクラス IIサブクラスのうち、 HLA-DRB 1*0405に 結合してヘルパー T細胞を誘導する作用を持つ抗原ペプチド部分が存在して ヽるこ とを初めて見出した。そしてこの知見により、 HLA-DRB1*0405陽性の癌患者に対し、 WT1特異的ヘルパー T細胞を誘導 ·増強することのできる新たな治療法が可能となつ た。
ところで近年の報告によると、一つのヘルパーペプチドが複数の HLA-classII分子 に結合し、ヘルパー CD4陽性 T細胞を誘導しうること、すなわち promiscuous helper peptideの存在が分かってきている（British J. cancer, 85(10),pl527-1534(2001)、 J.Immunol.,169,p557-565(2002)) oそこで本発明者は、前記 HLA_DRB1*0405結合性 抗原ペプチド（ヘルパーペプチド）の 1つとして見出した WT1 力 promiscuous
332-347
helper peptideである可能性につ!、て検討したところ、 WT1 は HLA- DRB1*0405
332-347
分子だけでなぐ HLA-DRB1*1502にも結合する promiscuous helper peptideであるこ とが示された。よって本発明のヘルパーペプチド WT1 は、 HLA- DRB1*0405を有
332-347
する患者だけでなぐ HLA_DRB1*1502を有する患者に対しても適用可能なヘルパー ペプチドである。併せて、 WT1には、多数存在する MHCクラス IIサブクラスのうち、 HLA_DRB1*1502に結合してヘルパー T細胞を誘導する作用を持つ抗原ペプチド部 分が存在して!/ヽることを初めて見出した。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
(1) 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列における連続する 10— 25ァミノ 酸からなるペプチドであって、 HLA— DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘 導するペプチド、
(2) 配列番号： 2—配列番号： 23のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前 記（1)記載のペプチド、
(3) 配列番号： 24に記載のアミノ酸配列を含有する、前記（2)記載のペプチド、
(4) 配列番号： 2—配列番号： 23のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 1位、第 4位 、第 6位および Zまたは第 9位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたァミノ 酸配列を含有する 10— 25アミノ酸からなるペプチドであって、 HLA— DRB1*0405 に結合してヘルパー T細胞を誘導するペプチド、
(5) 配列番号： 2—配列番号： 23のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 1位、第 4位 、第 6位および Zまたは第 9位のアミノ酸残基がそれぞれ以下の中から選択される ヽ ずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、前記 (4)記載のぺプチ ド、：
第 1位：フエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、メ チォニン、
第 4位：パリン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、 第 6位：ァスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジン、ァスパラギン酸、 第 9位:ァスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、
(6) 配列番号 : 24に記載のアミノ酸配列の第 3位、第 6位、第 8位および Zまたは第 11位のアミノ酸残基がそれぞれ以下の中から選択される！、ずれかのアミノ酸残基に 置換されたアミノ酸配列を含有する、前記（5)記載のペプチド：
第 3位：フエ二ルァラニン、トリプトファン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、 第 6位:パリン、イソロイシン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、
第 8位：ァスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジン、ァスパラギン酸、 第 11位:ァスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、
(7) 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列における連続する 10— 25ァミノ 酸からなるペプチドであって、 HLA— DRB1*1502に結合してヘルパー T細胞を誘 導するペプチド、
(8) 配列番号: 46—配列番号： 56のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、 前記（7)記載のペプチド、
(9) 配列番号： 24に記載のアミノ酸配列を含有する、前記（7)記載のペプチド、
(10) 前記（1)一（9)いずれか記載のペプチドと癌抗原ペプチドとを含有するぺプ チド、
(11) 前記（ 1)一（ 10) 、ずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(12) 前記（ 11)記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
(13) 前記（12)記載の発現ベクターを含有する細胞、
(14) 前記（13)記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特 徴とする、前記（1)一（10) 1、ずれか記載のペプチドの製造方法、
(15) 前記（1)一（9)いずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
(16) 前記（1)一（10)いずれか記載のペプチド、前記（12)記載の発現ベクターま たは前記（13)記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(17) 癌の治療剤または予防剤である、前記（16)記載の医薬組成物、
(18) 前記（1)一（9)のいずれか記載のペプチド、前記（1)一（9)のいずれか記載 のペプチドにかかる前記（12)記載の発現ベクター、または前記（1)一 (9)の 、ずれ か記載のペプチドにかかる前記（13)記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含 有する、ヘルパー T細胞誘導剤である、前記（16)記載の医薬組成物、
(19) 前記（1)一（9)のいずれか記載のペプチド、前記（1)一（9)のいずれか記載 のペプチドにかかる前記（12)記載の発現ベクター、または前記（1)一 (9)の 、ずれ か記載のペプチドにかかる前記（13)記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含 有する、癌ワクチンの作用増強剤である、前記（16)記載の医薬組成物、
(20) 前記（10)記載のペプチド、前記（10)記載のペプチドにかかる前記（12)記 載の発現ベクター、または前記（10)記載のペプチドにかかる前記（13)記載の細胞 と、薬学的に許容される担体とを含有する、癌の治療剤または予防剤である、前記（1 6)記載の医薬組成物、
(21) 前記（1)一（10)のいずれか記載のペプチド、前記（12)記載の発現ベクター 、または前記（13)記載の細胞の、癌の治療または予防剤の製造における使用、
(22) 癌を治療または予防するための方法であって、前記（1)一（10)のいずれか 記載のペプチド、前記（12)記載の発現ベクター、または前記（13)記載の細胞を、そ れを必要とする対象に投与する方法、
(23) 前記（1)一 (9)の 、ずれか記載のペプチドと癌抗原ペプチドを組み合わせて なる医薬組成物、
(24) 癌を治療または予防するための、前記（23)記載の医薬組成物、
(25) 前記（1)一（9)のいずれか記載のペプチドおよび薬学的に許容される担体を 含有する医薬組成物と、癌抗原ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含有する 医薬組成物とを含む、癌の治療または予防のためのキット、
(26) 前記（1)一（9)のいずれか記載のペプチドと癌抗原ペプチドとの組み合わせ の、癌の治療または予防剤の製造における使用、ならびに
(27) 癌を治療または予防するための方法であって、前記（1)一（9)のいずれか記 載のペプチドと癌抗原ペプチドとを組み合わせて、それを必要とする対象に投与する 方法、に関する。
発明の効果
[0007] 本発明により、 WT1由来の HLA-DRB1*0405結合性抗原ペプチド、当該ペプチドを コードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むヘルパー T細胞 の誘導剤などが提供される。本発明のヘルパー T細胞の誘導剤は、癌ワクチンの作 用増強剤として有用である。本発明の癌ワクチンの作用増強剤は、 HLA-DRB1*0405 陽性の多くの癌患者に適用可能であり、特に WT1ワクチンの作用増強剤として有用 である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明は、配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列における連続する 10— 25 アミノ酸からなるペプチドであって、 HLA- DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘 導するペプチドを提供する。本発明のペプチドは、その N末端アミノ酸残基および/ま たは C末端のアミノ酸残基が修飾されていても良ぐまた特定アミノ酸残基が改変され ていてもよい。
以下「ヘルパー T細胞を誘導するペプチド (CD4陽性 T細胞を誘導するペプチド)」 のことを、「ヘルパーペプチド」と称することもある。
配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列は、 Cell, 60:509, 1990、 NCBIデータ ベース Accession No.XP_034418および Accession No. P19544に記載された公知の配 列である。
[0009] 本発明のペプチドは、配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列における連続す る 10— 25アミノ酸からなる WT1の部分ペプチドである。ここで「10— 25アミノ酸」との定 義は、 MHCクラス II結合性ペプチド力 一般的に 10— 25アミノ酸力もなることに基づく (Immunogenetics, 41,178-228(1995)、 Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85-101 (1996)、 Immunology,96,l-9 (1999)、 Peptides, Vol.19, 179-198 (1998)、
immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001》。好ましくは、ヒト WT1 のアミノ酸配列における連続する 13— 17アミノ酸力 なるペプチドが挙げられる。 本発明のペプチドは、配列番号： 1に記載のアミノ酸配列における連続する 10— 25 アミノ酸力もなるペプチド (候補ペプチド）を合成し、該ペプチドが HLA-DRB1*0405に 結合してヘルパー T細胞を誘導できる力否かをアツセィすることにより、同定すること ができる。
[0010] ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法 に準じて行うことができる。該合成方法としては、文献 (ぺプタイド'シンセシス（
Peptide synthesis ) , Interscience, New York, 1966 ;サ'プロアインズ u'he Proteins) , Vol 2 , Academic Press Inc. , New York, 1976 ;ペプチド合成，丸善（株）， 1975 ;ぺ プチド合成の基礎と実験、丸善 (株)， 1985 ;医薬品の開発 続 第 14卷'ペプチド合 成，広川書店， 1991)などに記載されている方法が挙げられる。
[0011] 候補ペプチドが HLA_DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘導することは、例 えば Cancer. Immunol. Immunother. 51 : 271 (2002)に記載の方法や実施例記載の方 法、また以下に記載の方法などにより調べることができる。 [0012] まず、 HLA- DRB1*0405陽性のヒトから末梢血単核球（PBMC)を回収し、浮遊細胞を 除去することにより榭状細胞 (付着細胞)を調製する。また別途、同一の HLA-DRB1* 0405陽性のヒトから FicoU-Paqueの密度勾配遠心法等によりヘルパー T細胞（CD4陽 性 T細胞)を調製する。
次に、前記榭状細胞に対して候補ペプチドを添加して培養した後、この榭状細胞と 前記ヘルパー T細胞とを混合培養する。その後ヘルパー T細胞を回収し、これを候補 ペプチドをパルスした榭状細胞で同様に何回力刺激する。ペプチド刺激に反応して ヘルパー T細胞が誘導 (活性化）されたことは、例えば (1)当該ヘルパー T細胞の増殖 活性や、（2)ヘルパー T細胞によるサイト力イン産生活性を測定することにより、調べる ことができる。ここで (1)の増殖活性としては、具体的にはヘルパー T細胞内に取り込 まれた [ ]-チミジン量を測定することにより調べることができる。また (2)のサイト力イン 産生活性は、活性ィ匕ヘルパー T細胞が産生する IFN- γなどのサイト力インの量を酵 素免疫測定法 (ELISA)等により測定することによって調べることができる。
[0013] MHCクラス I分子や MHCクラス II分子に結合して提示される抗原ペプチドの配列に は規則性 (モチーフ）が存在している。 MHCクラス I分子と結合するペプチドの両端に は、 MHC分子と結合するために重要なアミノ酸残基が存在する力 MHCクラス II分子 に結合するペプチドの両端には、そのようなものは存在せず、この部分は MHCクラス II分子とは結合していない。しかし、ペプチドは MHCクラス II分子のペプチド収容溝に 沿って細長くはまり込み、固定される。ペプチドがペプチド収容溝の中に固定される のは、ペプチド収容溝にペプチド上のアミノ酸残基の側鎖が結合することと、すべて の MHCクラス II分子のペプチド収容溝によく保存されたアミノ酸残基の側鎖とぺプチ ド主鎖とが結合することによる。ペプチド収容溝は MHCクラス II分子ごとに、ペプチド 収容溝にある大小のポットを構成するアミノ酸残基に多型性がある。
[0014] 今までの X線結晶構造解析からは、最小の MHCクラス II結合性ペプチドの第 1、 4、 6 、 9番目のアミノ酸残基の側鎖力 これらの結合ポケットにはまり込んでいることが示さ れている。
異なる対立遺伝子由来の MHCクラス II分子のそれぞれについて、結合するぺプチ ドに共通するアミノ酸残基のパターンを解析することにより、 MHCクラス II分子のぺプ チド収容溝のポケット部分に結合するペプチドのアミノ酸残基のモチーフを推定でき る。結合モチーフをもった約 9個のアミノ酸残基力もなるペプチドがペプチド収容溝の 中に結合し、ペプチドの両端は溝の両端からはみ出すことができるために、 MHCクラ ス II分子に結合できるペプチドの長さには原則的に制限はないと考えられている。し かし多くの場合、長いペプチドはぺプチダーゼで切られ、 13— 17個のアミノ酸の長さ になっていることが多い（immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001))。
[0015] HLA-DRB1*0405に結合性を有するペプチドに関しては、 9アミノ酸からなる HLA( MHC)結合部分のうちの第 1、 4、 6、 9番目のアミノ酸残基が、以下に示す規則性 (モ チーフ）を有することが予測されている（Immunogenetics, 41,178-228(1995)、 Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85-101 (1996)参照）。
[0016] 第 1位：フエ-ルァラニン (F)、チロシン (Y)、トリプトファン (W)、ノ リン (V)、イソロイシン (1)、ロイシン (L)、メチォニン (M)、
第 4位:パリン (V)、イソロイシン (1)、ロイシン (L)、メチォニン (M)、ァスパラギン酸 (D)、 グルタミン酸 (E)、
第 6位：ァスパラギン (N)、セリン (S)、スレオニン (T)、グルタミン (Q)、リジン )、ァスパ ラギン酸 (D)、
第 9位:ァスパラギン酸 (D)、グルタミン酸 (E)、グルタミン (Q)。
[0017] 近年、これらの規則性に基づき、 MHCクラス II抗原に結合可能と予想されるぺプチ ド配列を、インターネット上、 MHCクラス II結合配列予測プログラム ProPred (
Bioinformatics 17: 1236, 2001)を使用することにより検索することができる。
[0018] 本発明は、 WT1 (配列番号： 1)が HLA- DRB1*0405 (MHCクラス IIの 1種）に結合して ヘルパー T細胞を誘導する抗原ペプチド部分を有していることを見出したものである 1S 当該 WT1のアミノ酸配列のうち、 HLA-DRB1*0405に結合性を有すると予測される 前記 9アミノ酸部分としては、例えば配列番号: 2— 23に記載の WT1の 9アミノ酸部分 を挙げることができる。すなわち本発明のペプチドの具体例としては、配列番号: 2— 配列番号： 23のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有し、かつ HLA- DRB1*0405に結 合してヘルパー T細胞を誘導するペプチドが挙げられる。 [0019] 当該ペプチドは、配列番号： 2— 23のいずれか記載のアミノ酸配列を含有する WT1 の部分ペプチドであり、かつ HLA-DRB 1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘導する 活性を有する限り、その長さは特に限定されない。前述のように、当該結合モチーフ 構造を有する約 9個のアミノ酸残基力 なるペプチドがペプチド収容溝の中に結合し 、ペプチドの両端は溝の両端からはみ出すことができるために、 MHCクラス II分子に 結合できるペプチドの長さには原則的に制限はない。しかしながら長いペプチドはぺ プチダーゼで切断されるため、現在までに報告されて ヽる MHCクラス II結合性ぺプチ ドは 10— 25アミノ酸程度の長さを有している（Immunogenetics, 41,178-228 (1995)、 Biochimica et Biophysica Acta 1316, 85—101 (1996)、 Immunology, 96, 1-9 (1999)、 Peptides, Vol.19, 179—198 (1998)、 immunobiology, 5th Edt., 116—117, Garland Publishing (2001)) oこれと同様に、本発明のペプチドは 10— 25アミノ酸程度の長さで あることが好ましぐ 13— 17アミノ酸程度の長さであることがより好ましい。
[0020] 従って、配列番号： 2—配列番号： 23の 、ずれか記載のアミノ酸配列を含有する本 発明のペプチドの好まし 、形態としては、配列番号： 2—配列番号： 23の 、ずれかに 記載のアミノ酸配列を含有する 10— 25アミノ酸 (好ましくは 13— 17アミノ酸)からなる WT1の部分ペプチドであって、 HLA- DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘導 する活性を有するペプチドが挙げられる。
[0021] より好ましい形態としては、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含有する 10— 25ァ ミノ酸（好ましくは 13— 17アミノ酸）からなる WT1の部分ペプチドであって、 HLA-DRB1 *0405に結合してヘルパー T細胞を誘導する活性を有するペプチドが挙げられる。さ らに好ましい形態としては、配列番号: 24に記載のアミノ酸配列を含有する 16— 25ァ ミノ酸（好ましくは 16— 17アミノ酸）からなる WT1の部分ペプチドであって、 HLA-DRB1 *0405に結合してヘルパー T細胞を誘導する活性を有するペプチドが挙げられる。な お、ここで配列番号: 24に記載のアミノ酸配列は、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列 を含有する 16アミノ酸力もなる WT1の部分ペプチドである。
さらに好ましい形態としては、配列番号: 24に記載のアミノ酸配列からなるペプチド が挙げられる。
[0022] 本発明のペプチドは、活性を保持する範囲内で、適宜改変されていても良い。ここ でアミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失および Zまたは付加（ぺプ チドの N末端、 C末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の 置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基 の数および位置は、ヘルパーペプチドとしての活性が維持される限り、任意であるが 、前記したように通常、 HLAクラス II分子に結合するペプチドの長さが 10— 25アミノ酸 程度であることから、 1個から数個の範囲が好ま 、。
[0023] 当該置換に係るアミノ酸残基の改変においては、 HLA-DRB1*0405に対する結合モ チーフ構造を有する 9個のアミノ酸力もなるペプチドのうちの、第 1位、第 4位、第 6位 および/または第 9位のアミノ酸残基の置換が好ましい。
このような本発明の置換に係るペプチドの具体的な態様としては、配列番号: 2—配 列番号: 23のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 1位、第 4位、第 6位および Zまたは 第 9位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する 10— 25アミノ酸からなるペプチドであって、 HLA- DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞を 誘導するペプチドが挙げられる。
[0024] 好ましくは、配列番号: 2—配列番号: 23のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 1位 、第 4位、第 6位および/または第 9位のアミノ酸残基が、
第 1位：フエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、メチ ォニン、
第 4位：パリン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、 第 6位：ァスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジン、ァスパラギン酸、 第 9位:ァスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する 10 一 25アミノ酸からなるペプチドであって、 HLA- DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞 を誘導するペプチドが挙げられる。
[0025] 当該第 1位、第 4位、第 6位および Zまたは第 9位のアミノ酸残基の置換は、例えば 前記に示した WT1の部分配列からなる本発明の天然型のヘルパーペプチドにおい て、その HLA-DRB1*0405への結合性を高める、若しくは活性を増強する目的で行う ことができる。置換を施した第 1位、第 4位、第 6位および Zまたは第 9位以外の部分は 、天然型の配列のまま (すなわち WTlの部分配列のまま)であっても良ぐまた活性を 保持する限りさらなる改変を施しても良 ヽ。
[0026] より好ましくは、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列の第 1位、第 4位、第 6位および /または第 9位のアミノ酸残基が、
第 1位：フエ二ルァラニン、トリプトファン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、 第 4位:パリン、イソロイシン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、
第 6位：ァスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジン、ァスパラギン酸、 第 9位:ァスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、
の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する 10 一 25アミノ酸からなるペプチドであって、 HLA- DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞 を誘導するペプチドが挙げられる。
[0027] さらに好ましくは、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含有する 16アミノ酸力 なる WT1の部分ペプチド (配列番号: 24)において、その第 3位、第 6位、第 8位および/ま たは第 11位のアミノ酸残基が、
第 3位：フエ二ルァラニン、トリプトファン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、 第 6位:パリン、イソロイシン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、
第 8位：ァスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジン、ァスパラギン酸、 第 11位:ァスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、
の中力 選択される 、ずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列力 なるぺプ チドが例示される。また当該配列番号: 24の置換アミノ酸配列を含有する 16— 25ァミノ 酸力もなるペプチドであっても良い。
[0028] 本発明はまた、前記本発明のヘルパーペプチド (天然型ペプチド、改変ペプチド） と癌抗原ペプチドとを含有するペプチド ( ヽゎゆる「ェピトープペプチド」 )を提供する
[0029] 近年、癌抗原ペプチド（CTLェピトープとも言う）とヘルパーペプチド（ヘルパーェピ トープとも言う）とを連結させたェピトープペプチドにより、効率的に CTLが誘導される ことが報告されている。すなわち、ヘルパーペプチドにより活性ィ匕されたヘルパー T 細胞 (CD4陽性 T細胞）は、 CTLの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどの エフェクター細胞の活性ィ匕作用を発揮するため、癌抗原による CTLの誘導をより増強 すると考えられて 、る。このようなヘルパーペプチドと癌抗原ペプチドとを連列したぺ プチドの具体例として、例えば Journal of Immunology 1999, 162: 3915- 3925には、 HBV由来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束性抗原ペプチド 3種類 、およびヘルパーペプチドより構成されるェピトープペプチドをコードする DNA (ミニ ジーン）力 イン'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に誘導したこと が記載されている。また実際に、 CTLェピトープ (メラノーマ抗原 gplOOの第 280位一 288位からなる癌抗原ペプチド）とヘルパーェピトープ (破傷風毒素由来 Tヘルパー ェピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-3024)。
[0030] このような本発明のヘルパーペプチドと癌抗原ペプチドとを含有するェピトープぺ プチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここで癌抗原ペプチドとしては、従来公知の如何なる癌抗原ペプチドも用いることが できるが、好ましくは WT1由来の癌抗原ペプチド (天然型ペプチド、改変ペプチド）が 挙げられる。具体的には WT1由来の HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -All, -A24,— A31,— A6801, -B7,— B8, -B2705, -B37,— Cw0401, -Cw0602などに拘束性の癌抗原ペプチドが挙げられる。
[0031] 当該 WT1由来の癌抗原ペプチドとしては、例えば国際公開第 2000/18795号パンフ レットの Tablell— TableXLVIに列挙されたペプチドおよびその改変ペプチドのうち癌 抗原ペプチドとしての活性 (HLA抗原に結合して CTLを誘導する活性)を有するぺプ チドが挙げられる。
[0032] より具体例には、例えば以下の癌抗原ペプチドが例示される：
Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 27)
Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 28)
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 29)
Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 30)
Ser Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 31)
Ala Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 32) Abu Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 33)
Arg Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (酉己列番号： 34)
Lys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 35)
[0033] Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 36)
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (配列番号： 37)
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (配列番号： 38)
Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (配列番号： 39)
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (配列番号： 40)
Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Lys Lys Phe (配列番号： 41)
Arg Tyr Pro Ser Ala Gin Lys Lys Phe (配列番号： 42)
Arg Tyr Pro Ser Abu Gin Lys Lys Phe (配列番号： 43)
Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val (配列番号： 44)
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val (配列番号： 45)
(ここで Abuは a -ァミノ酪酸である）
[0034] このうち配列番号： 27および配列番号： 29に記載のペプチドは HLA-A24抗原およ び HLA-A2抗原に結合性のペプチドであり、配列番号： 44および配列番号： 45に記 載のペプチドは HLA-A2抗原に結合性のペプチドである。またそれ以外のペプチド は HLA-A24抗原に結合性のペプチドである。
好ましくは、前記配列番号: 27、配列番号: 28、配列番号: 29、配列番号: 30、配列 番号： 44または配列番号： 45の 、ずれかに記載の癌抗原ペプチドが挙げられる。
[0035] 本発明のェピトープペプチドとして、より具体的には、例えば配列番号: 2—配列番 号: 23のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する 10— 25アミノ酸よりなる WT1の部 分ペプチドであって、 HLA-DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘導するへルパ 一ペプチドと、前記配列番号： 27— 45の 、ずれかに記載の癌抗原ペプチドとを含有 するェピトープペプチドが挙げられる。
好ましくは、配列番号: 24に記載のアミノ酸配列からなるヘルパーペプチドと、配列 番号： 27— 45の 、ずれかに記載の癌抗原ペプチドとを含有するェピトープペプチド が挙げられる。 より好ましくは、配列番号: 24に記載のアミノ酸配列力 なるヘルパーペプチドと、配 列番号： 27— 30、 44、 45のいずれかに記載の癌抗原ペプチドとを含有するェピトープ ペプチドが挙げられる。
[0036] このようなェピトープペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製 造することができる。またこれら複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを コードするポリヌクレオチドの配列情報に基づ!/、て、通常の DNA合成および遺伝子 工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の 発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作 製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のェピトープを連結させたェピ トープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のよ うに文献記載の方法 (Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、 DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985》や後述の方法などに準じて行うことが できる。
[0037] 当該ェピトープペプチドがヘルパーペプチドとしての活性を有することは、前述の 方法にて確認することができる。また前記ェピトープペプチドが癌抗原ペプチドとして の活性を有することは、例えば WO 02/47474号公報および Int J.
Cancer: 100,565-570 (2002)に記述のヒトモデル動物に供すること等により確認するこ とがでさる。
本発明のェピトープペプチドは、当該ェピトープペプチドに含まれるヘルパーぺプ チド部分により活性ィ匕されるヘルパー T細胞 (CD4陽性 T細胞）が CTLの分ィ匕の誘導 や維持およびマクロファージなどのエフェクター細胞の活性ィ匕作用を発揮するため、 当該ェピトープペプチドに含まれる癌抗原ペプチドによる CTLの誘導をより増強し、 よってより効率的な癌の治療または予防に使用できると考えられる。
[0038] 以上に示した本発明のペプチド (天然型ペプチド、改変ペプチドおよびェピトープ ペプチド)の N末端アミノ酸のアミノ基、または C末端アミノ酸のカルボキシル基は、修 飾されていても良い。すなわち、当該 N末端のアミノ酸残基および/または C末端のァ ミノ酸残基が修飾されたペプチドも、本発明のペプチドの範疇に含まれる。
[0039] ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基としては、例えば 1一 3個の炭素数 1から 6 のアルキル基、フ -ル基、シクロアルキル基、ァシル基が挙げられ、ァシル基の具 体例としては炭素数 1から 6のアルカノィル基、フ -ル基で置換された炭素数 1から 6のアルカノィル基、炭素数 5から 7のシクロアルキル基で置換されたカルボ-ル基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホ-ル基、フエ-ルスルホ-ル基、炭素数 2から 6のァ ルコキシカルボ-ル基、フエ-ル基で置換されたアルコキシカルボ-ル基、炭素数 5 力 7のシクロアルコキシで置換されたカルボ-ル基、フエノキシカルボ-ル基等が挙 げられる。
[0040] C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体お よびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数 1から 6のアルキルェ ステル、フエ-ル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル、炭素数 5から 7 のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数 1 力 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、フエ-ル基で置換された炭 素数 0から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子 を含んで 5から 7員環のァザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
[0041] 本発明はまた、前記本発明のペプチド (天然型ペプチド、改変ペプチドまたはェピ トープペプチド）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコード するポリヌクレオチドは、 DNAの形態であっても RNAの形態であっても良い。これら本 発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコ ードされる DNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常 の DNA合成や PCRによる増幅などによって、製造することができる。
[0042] 具体的には、例えば前記ェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げら れる。より具体的には、例えば配列番号: 2—配列番号: 23のいずれかに記載のァミノ 酸配列を含有する 10— 25アミノ酸よりなる WT1の部分ペプチドであって、 HLA-DRB1* 0405に結合してヘルパー T細胞を誘導するへルパープチドと、前記配列番号： 27— 45のいずれかに記載の癌抗原ペプチドとを含有するェピトープペプチドをコードする ポリヌクレオチドが挙げられる。
好ましくは、配列番号: 24に記載のアミノ酸配列からなるヘルパーペプチドと、配列 番号： 27— 45の 、ずれかに記載の癌抗原ペプチドとを含有するェピトープペプチド をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
より好ましくは、配列番号: 24に記載のアミノ酸配列力 なるヘルパーペプチドと、配 列番号： 27— 30、 44、 45のいずれかに記載の癌抗原ペプチドとを含有するェピトープ ペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドには、当該ポリヌクレオチドの相補配 列とストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドであって本発明の ペプチドと同等の活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。ここ に、「ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする」に関して、ここで使用されるハイ ブリダィゼーシヨンは、例えば、 Sambrook J., Frisch E. F.， Maniatis T.著、モレキユラ 一クロー-ング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition)、コールド スプリング ハーバ 一 ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press)等に記載される通常の 方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、 6 X SSC (1. 5M NaCl、0. 15M クェン酸三ナトリウムを含む溶液を 10 X SSCとする）、 50% ホルムアミドを含む溶液中で 45°Cにてハイブリッドを形成させた後、 2 X SSCで 50°C にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)等を挙げることができる。
[0043] 前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、 本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。 ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択するこ とができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。
[0044] 例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pCR3等のプラスミドベクター、 λ ΖΑΡΠ、 gtllなどのファージベクターが挙げられる 。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。宿主が 昆虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合に は、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3.1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミドベクタ 一や、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター などのウィルスベクターが挙げられる。
[0045] 前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子 、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。 また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST (ダルタ チオン S-トランスフェラーゼ)等との融合タンパク質として発現する配列が付加されて いても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター (lac、 tac、 trc、 trp、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクベクター（ PGEX4Tなど）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisな ど）、さらにはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ pET32a)などを用いることができる。
[0046] 前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現べクタ 一を含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げら れる。大腸菌としては、 E.coli K- 12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 α株、 AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス'セルビジェなど が挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 CHO細 胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては s!9などが挙 げられる。
[0047] 宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の 導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofectin;
Gibco-BRL社)を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常 の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質 転換細胞を選択することができる。
[0048] 以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより 、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学 的精製手段により、さらに単離'精製することができる。ここで精製手段としては、塩析 、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフ ィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述 のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、こ れら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離'精製することができる
[0049] 本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体 は、その形態に特に制限はなぐ本発明のペプチドを免疫原とするポリクローナル抗 体であっても、またモノクローナル抗体であっても良!、。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば 特に制限されないが、具体的には、配列番号: 2—配列番号: 23のいずれかに記載 のアミノ酸配列を含有する 10— 25アミノ酸よりなる WT1の部分ペプチドであって、 HLA-DRB1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘導するヘルパーペプチドに特異的 に結合する抗体を挙げることができる。好ましくは、配列番号: 24に記載のアミノ酸配 列からなるヘルパーペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。
[0050] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造すること; 0できる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12一 11.13、 Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989)。
[0051] 具体的には、本発明のペプチドを免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し 、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル 抗体の場合には、本発明のペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓 細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリドーマ細胞の中から得ること 力 eさる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4一 11.11)。
[0052] 本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用い て免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、 フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン 、プル口-ックポリオル、ポリア-オン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットへモ シァニンおよびジニトロフエノールのような表面活性物質、 BCG (カルメット ゲラン桿 菌）やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。 [0053] 以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、 ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。 抗体の用途としては、ァフィユティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられ る。免疫学的診断は、ィムノブロット法、放射免疫測定法 (RIA)、酵素免疫測定法 (E LISA)、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は 、 WT1遺伝子が発現している癌、すなわち胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮 膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の診断において有効である
[0054] 本発明は、本発明のペプチド (天然型ペプチド、改変ペプチド、ェピトープペプチド )、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、または本発明の発現ベクター を含有する細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。 当該医薬組成物は、ヘルパー T細胞の誘導剤、癌ワクチンの作用増強剤として有効 に使用できる。以下具体的に説明する。
[0055] (1)本発明のペプチドを有効成分とするヘルパー T細胞の誘導剤（癌ワクチンの作用 増強剤）
本発明のペプチドは、ヘルパー T細胞の誘導能を有するものであり、誘導されたへ ルパー T細胞は、 CTLの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのェフエクタ 一細胞の活性化作用を介して癌ワクチンの作用である CTL誘導活性をさらに増強す ることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌 ワクチンの作用増強剤 (癌ワクチンの作用増強剤としての医薬組成物)を提供する。 本発明の作用増強剤を HLA-DRB1*0405陽性かつ WT1陽性の患者に投与すると、 抗原提示細胞の HLA-DRB1*0405抗原に本発明のペプチドが提示され、ペプチドと HLA_DRB1*0405抗原との複合体を認識する特異的ヘルパー T細胞 (CD4陽性 T細 胞）が誘導'活性ィ匕されて CTLの分ィ匕の誘導や維持、およびマクロファージなどのェ フエクタ一細胞の活性ィ匕作用を発揮することができ、従って、癌ワクチンの作用である CTLの誘導'活性ィ匕を増強することができる。
[0056] 本発明の癌ワクチン作用増強剤は、 WT1遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例 えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌 や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮 癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療において使用することができる
[0057] 本発明の癌ワクチンの作用増強剤は、癌ワクチンと同時に投与することもできれば 、癌ワクチン投与前または癌ワクチン投与後に投与することも可能である。
[0058] 本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン作用増強剤は、単一のヘルパーぺ プチドを有効成分とするものであっても、また癌抗原ペプチド (CTLェピトープ）と連結 したェピトープペプチドを有効成分とするものであっても良 、。前述したように近年、 癌抗原ペプチド（CTLェピトープ）とヘルパーペプチド（ヘルパーェピトープ）とを連結 させたェピトープペプチドにより、効率的に CTLが誘導されることが示されている。こ のようなェピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、 その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドのうち、ヘルパーペプチド は MHCクラス II抗原（HLA-DRB1*0405)と、また癌抗原ペプチドは MHCクラス I抗原と 結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示される。
HLA-DRB1*0405抗原とヘルパーペプチドとの複合体をヘルパー T細胞が認識し、 CTLの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター細胞の活性化 作用を介して癌ワクチンの作用である CTL誘導活性をさらに増強する。一方、癌抗原 ペプチドと MHCクラス I抗原との複合体を CTLが認識して増殖し、癌細胞を破壊する。 従って、本発明のェピトープペプチドを有効成分とする医薬糸且成物は、癌ワクチンの 作用増強剤として使用されると共に、癌ワクチンそのものとして使用される。
[0059] 本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンの作用増強剤は、細胞性免疫が効 果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバント とともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては 、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能であり、 具体的には、菌体由来成分、サイト力イン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水 酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面 活性剤、ポリア-オン、ペプチド、または油乳濁液 (ェマルジヨン製剤）などを挙げるこ とができる。また、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤 、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。
[0060] 投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げら れる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重 等により適宜調整することができる力 通常 O.OOOlmg— 1000mg、好ましくは O.OOlmg 一 1000mg、より好ましくは O.lmg— 10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与す るのが好ましい。
[0061] 本発明はまた、本発明のペプチドと癌抗原ペプチドとを組み合わせてなる医薬組 成物を提供する。本発明の組み合わせにより、癌抗原ペプチドが有する癌ワクチンと しての作用（CTLの誘導'活性化作用）が本発明のペプチドにより増強され、癌の治 療または予防をより効果的に達成することができる。
「組み合わせ」とは、本発明のペプチドおよび癌抗原ペプチドの両者を混合した形 態で投与すること、および別々の形態で投与することを包含する。
混合した形態で投与する場合、予め混合して製剤化されたものを使用することもで きれば、別々に製剤化されたものを要時に混合して使用することもできる。
一方、別々の形態で投与する場合は、別々に製剤化されたものを、時間差をおい て別々に投与することもできれば、同時に投与することもできる。時間差をおいて投 与する場合、本発明のペプチド (癌ワクチンの作用増強剤)を投与した後に癌抗原べ プチド (癌ワクチン)を投与しても良ぐまた癌抗原ペプチド (癌ワクチン)を投与した後 に本発明のペプチド (癌ワクチンの作用増強剤）を投与しても良い。
本発明にかかる本発明ペプチドと癌抗原ペプチドとの組み合わせの一態様として、 キットを f列示することができる。
本発明のペプチドと組み合わせて用いられる癌抗原ペプチドとしては、従来公知の 如何なる癌抗原ペプチドも用いることができる力 好ましくは WT1由来の癌抗原ぺプ チド (天然型ペプチド、改変ペプチド）が挙げられる。具体的には、配列番号: 27— 45 に記載の癌抗原ペプチドが挙げられ、好ましくは配列番号： 27— 30、 44、 45のいずれ かに記載の癌抗原ペプチドが挙げられる。
[0062] (2)本発明の発現ベクターを有効成分とするヘルパー T細胞の誘導剤（癌ワクチンの 作用増強剤） 前記本発明のペプチドのみならず、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含 有する発現ベクターもまた、ヘルパー τ細胞誘導活性を有し、癌ワクチンの作用増強 剤の有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードす るポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチンの作 用増強剤 (癌ワクチンの作用増強剤としての医薬組成物)を提供する。
[0063] 近年、癌抗原ペプチド（CTLェピトープ)とヘルパーペプチド（ヘルパーェピトープ） とを連結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド力 in vivoで効率的 に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、 HBV由来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束 性抗原ペプチド 3種類、およびヘルパーェピトープを連結したェピトープペプチドを コードする DNA (ミニジーン） 1S イン'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効 果的に誘導したことが記載されて 、る。
[0064] 従って、前記本発明のェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当な 発現ベクターに組み込むことにより、癌ワクチン作用増強剤の有効成分とすることが できる。
[0065] 本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを癌ワクチン作用増強剤の有効 成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを細胞内に導入する方法として、 ウィルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月刊薬事， 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、およびこれ らの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
[0066] ウィルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウィル ス、シンビスウィルス等の DNAウィルスまたは RNAウィルスに本発明の DNAを組み 込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ワクシニアウィルス等を用いた方法が特に好ま 、。
その他の方法としては、発現ベクターを直接筋肉内に投与する方法 (DNAワクチン 法）、リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法 、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、特に DNAワクチン法、リボソーム法が好ま しい。
[0067] 本発明の発現ベクターを実際に医薬として作用させるには、当該発現ベクターを直 接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で発現べクタ ーを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス， 1994 年 4月号， 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、 およびこれらの引用文献等)。 in vivo法がより好ましい。
[0068] in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経 路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することが できる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一 般的には有効成分である本発明の発現ベクターを含有する注射剤等とされ、必要に 応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明の発現ベクターを含有するリポソ一 ムまたは膜融合リボソーム (センダイウィルス (HVJ) -リボソーム等）においては、懸濁 剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤の形態とすることができる。 製剤中の本発明の発現ベクターの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等 により適宜調整することができる力 通常、 O.OOOlmg— 100mg、好ましくは O.OOlmg— 10mgの本発明の発現ベクターを、数日ないし数月に 1回投与するのが好ましい。
[0069] 以上のような本発明の発現ベクターを HLA-DRB1*0405陽性かつ WT1陽性の患者 に投与すると、抗原提示細胞の HLA-DRB 1*0405抗原に本発明のペプチドが提示さ れ、ペプチドと HLA-DRB1*0405抗原との複合体を認識する特異的ヘルパー T細胞（ CD4陽性 T細胞）が誘導'活性ィ匕されて CTLの分ィ匕の誘導や維持、およびマクロファ ージなどのエフェクター細胞の活性ィ匕作用を発揮することができ、従って、癌ワクチン の作用である CTL誘導活性を増強することができる。本発明のポリヌクレオチドを含 有する発現ベクターを有効成分とする癌ワクチン作用増強剤は、 WT1遺伝子の発現 レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リ ンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、 膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のた めに使用することができる。 [0070] 前記にお!ヽてェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現べク ターを投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて 生じた個々の抗原ペプチドのうち、ヘルパーペプチドは MHCクラス II抗原（
HLA-DRB1*0405)と、また癌抗原ペプチドは MHCクラス I抗原と結合して複合体を形 成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示される。 HLA-DRB1*0405抗原 とヘルパーペプチドとの複合体をヘルパー T細胞が認識し、 CTLの分化の誘導や維 持、およびマクロファージなどのエフェクター細胞の活性ィ匕作用を介して癌ワクチン の作用である CTL誘導活性をさらに増強する。一方、癌抗原ペプチドと MHCクラス I 抗原との複合体を CTLが認識して増殖し、癌細胞を破壊する。従って、本発明のェピ トープペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とす る医薬組成物は、癌ワクチンの作用増強剤として使用されると共に、癌ワクチンその ものとして使用される。
[0071] さらに本発明は、配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列における連続する 10 一 25アミノ酸からなるペプチドであって、 HLA- DRB1*1502に結合してヘルパー T細胞 を誘導するペプチドを提供する。本発明の HLA-DRB1*1502結合性抗原ペプチドは、 その N末端アミノ酸残基および/または C末端アミノ酸残基が修飾されていても良ぐま た特定アミノ酸残基が改変されて 、ても良 ヽ。
本発明の HLA-DRB1*1502結合性抗原ペプチドの合成および活性測定は、前記本 発明の HLA-DRB1*0405結合性抗原ペプチドと同様の手法により行うことができる。 本発明の HLA-DRB1*1502結合性抗原ペプチドは、配列番号： 1に記載のヒト WT1 のアミノ酸配列における連続する 10— 25アミノ酸力 なる WT1の部分ペプチドである 。好ましくは、ヒト WT1のアミノ酸配列における連続する 13— 17アミノ酸力 なるぺプチ ドが挙げられる。
本発明は、ヒト WT1が HLA_DRB1*1502に結合してヘルパー T細胞を誘導する抗原 ペプチド部分を有して 、ることを見出したものである力 MHCクラス II結合配列予測プ ログラム ProPred(Bioinformatics 17:1236,2001)を用いた検索により、 HLA- DRB1*1502 に結合性を有すると予測される 9アミノ酸部分 (MHCクラス II分子のペプチド収容溝の 中に結合し得る 9アミノ酸部分）としては、例えば配列番号: 46—配列番号: 56に記載 の WT1の 9アミノ酸部分を挙げることができる。すなわち本発明の HLA-DRB1*1502結 合性抗原ペプチドの具体例としては、配列番号： 46—配列番号： 56の 、ずれかに記 載のアミノ酸配列を含有し、かつ HLA_DRB1*1502に結合してヘルパー T細胞を誘導 するペプチドが挙げられる。
当該ペプチドは、 10— 25アミノ酸程度の長さであることが好ましぐ 13— 17アミノ酸程 度の長さであることがより好ましい。より好ましい形態としては、配列番号: 50に記載の アミノ酸配列を含有する 10— 25アミノ酸 (好ましくは 13— 17アミノ酸)力 なる WT1の部 分ペプチドであって、 HLA_DRB1*1502に結合してヘルパー T細胞を誘導する活性を 有するペプチドが挙げられる。さらに好ましい形態としては、配列番号: 24に記載のァ ミノ酸配列を含有する 16— 25アミノ酸 (好ましくは 16— 17アミノ酸)力 なる WT1の部分 ペプチドであって、 HLA_DRB1*1502に結合してヘルパー T細胞を誘導する活性を有 するペプチドが挙げられる。なお、ここで配列番号: 24に記載のアミノ酸配列は、配列 番号: 50に記載のアミノ酸配列を含有する 16アミノ酸力 なる WT1の部分ペプチドで ある。
さらに好ましい形態としては、配列番号: 24に記載のアミノ酸配列からなる WT1
332-347 ペプチドが挙げられる。
当該 WT1 ペプチドは、前記したように、 HLA- DRB1*0405分子だけでなぐ
332-347
HLA-DRB1*1502にも結合する promiscuous helper peptideである。よって WT1 は
332-347
、 HLA_DRB1*0405を有する患者だけでなぐ HLA_DRB1*1502を有する患者に対して も適用可能なヘルパーペプチドであり、患者の適用範囲が広いという観点から有用 である。
本発明の HLA_DRB1*1502結合性抗原ペプチドに関するェピトープペプチド、ポリ ヌクレオチド、抗体、および医薬組成物については、前記本発明の HLA-DRB1*0405 結合性抗原ペプチドの場合と同様にして実施することができる。
[0072] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例
[0073] 実施例 1 1.榭状細胞の調製
HLA-DRB1*0405陽性の健常人ボランティアから採取した血液から FicoU-Paqueの 密度勾配遠心法により末梢血単核球 (PBMC)を回収した。得られた 8 X 106個の PBMCを 1%の AB血清を含む X- VIVO 15™培養液 (Camblex社) 2mlに懸濁し、 6穴培 養プレートに播種して 2時間培養した。培養後、浮遊細胞を除去し、 Hanks液で付着 細胞を洗った。付着細胞は、 1%の AB血清、 lOOOU/mlの IL-4および lOOOU/mlの GM- CSFを含む X- VIVO 15™培養液を用いて培養した。 2日目と 4日目に培養液の 半量を除き、新しい培養液を加えた。 6日目に lOOU/mlとなるように TNF- aを添加し た。 7日目の細胞を榭状細胞として実験に使用した。
[0074] 2. CD4陽性 T細胞（ヘルパー T細胞）の調製
上記（1)と同一の健常人ボランティア力 力も採取した血液を用いた。 RPMI培養液 で 2倍に希釈した血液約 100mlに CD4陽性 T細胞分離用抗体カクテルのロゼットセッ プ（Stemcell社）を添加して室温で 20分間放置した。その後、 FicoU-Paqueの密度勾 配遠心法により CD4陽性 T細胞を回収した。
[0075] 3. WT1ペプチドに特異的な CD4陽性 T細胞の誘導
WT1蛋白質のアミノ酸配列（NCBIデータベース Accession No. P19544、 XP.034418 、配列番号： 1)より HLA_DRB1*0405に結合する可能性のあるペプチドを予測プログ ラム ProPred (Bioinformatics 17: 1236, 2001)を用いて 3種類選んで、合成した。それ らの配列は、 WT1アミノ酸配列の第 172位から 186位の PNHSFKHEDPMGQQG (WT1 、配列番号： 25)、第 225位から 243位の NLYQMTSQLECMTWNQMNL (WT1
172-186
、配列番号： 26)、第 332位から第 347位の KRYFKLSHLQMHSRKH (WT1 、
225-243 332-347 配列番号: 24)であった。
[0076] 上記（1)で調製した榭状細胞を 24穴培養プレートに 1穴当たり 3 X 105個播種し、配 列番号: 24のペプチドを 50 g/mlになるように添カ卩して 4時間培養した後、 25Gyの X 線を照射して細胞の増殖を止めた。次に（2)で調製した CD4陽性細胞を 1穴当たり 3 X 106個添加して榭状細胞と混合培養した。培養液は、 1%の AB血清を含む X-VIVO 15™培養液を用いた。培養開始から 2日おきに培養液を半量交換するとともに 20U/mlになるように IL- 2を添カ卩した。培養開始から 7日目、 14日目に T細胞を回収し、 24穴プレートに 1穴当たり 3 X 106個に調整して播種し、 20 μ g/mlのペプチド（配列番 号: 24)でパルスした後 25Gyで X線照射した榭状細胞を 3 X 105個添加して混合培養を 行った。培養液は 1%の AB血清、 20U/mlの IL- 2を含む X- VIVO 15™培養液を用い た。
[0077] 3回目の刺激をした後の T細胞を回収し、 96穴培養プレートに 1穴当たり 3 X 104個播 種した。さらに 20 g/mlのペプチド (配列番号: 24)でパルスした後 25Gyで X線照射し た榭状細胞を 3 X 104個加えて混合培養した。陰性対照としてペプチドをパルスして Vヽな 、榭状細胞を T細胞と混合培養した群、陽性対照として榭状細胞の代わりに 0.2 %の PHAを添加した群を設定した。 80時間培養後、 1穴当たり 37kBqの [ ]-チミジン を添加して更に 16時間培養を行った後、細胞に取り込まれた [ ]-チミジンを |8 -シン チレーシヨンカウンタ一にて測定した。結果を図 1に示した。 WT1の第 332位力も 347 位のペプチド (WT1 、配列番号： 24)で刺激した CD4陽性 T細胞は、 WT1 を
332-347 332-347 パルスした榭状細胞と混合培養することにより増殖反応を示した。また、この CD4陽 性 T細胞は、ペプチドをパルスしていない榭状細胞、配列の異なる配列番号 25や配 列番号 26のペプチドをパルスした榭状細胞との混合培養では増殖反応が認められ なかった。これらの結果より、配列番号 24のペプチド WT1 は、抗原ペプチドとし
332-347
て特異的 CD4陽性 T細胞を誘導していることが明らかになった。
[0078] 実施例 2
WT1ぺプチ Wこ特虽的な CD4陽件 T細胞株の榭
実施例 1に記載の方法で調製した榭状細胞を 96穴プレートに 1穴当たり 104個ずつ 播種し、さらに配列番号 24のペプチド WT1 で誘導した CD4陽性 T細胞を 96穴プ
332-347
レートに 1穴当たり、 103個ずつ播種した。培養液は、 1%の AB血清、 20U/mlの IL-2、 5 g/mlの PHAを含む X- VIVO 15™培養液を用いた。培養を続けることにより、 CD4 陽性 T細胞株を榭立し、「G2細胞株」と命名した。ペプチドをパルスした榭状細胞に 対する G2細胞株の反応性を実施例 1と同様の方法で測定した。結果を図 2に示す。 G2細胞株は、 WT1 のペプチドをパルスした榭状細胞と混合培養することにより
332-347
増殖反応を示したが、ペプチドをパルスして 、な 、榭状細胞との混合培養では増殖 反応が認められな力つた。 これらの結果より、 G2細胞株は、 WT1 のペプチドに特異的な CD4陽性 T細胞
332-347
株であることが明ら力となった。
[0079] 実施例 3
WT1ペプチドの HLA-DR分子への抗原提示
実施例 1と同様の方法で、 HLA-DRB1*0405陽性の健常人ボランティア力も採取した 血液から FicoU-Paqueの密度勾配遠心法により末梢血単核球（PBMC)を回収した。 PBMCを 24穴プレートに 1穴当たり 107個播種した。培養液は、 10%の FCS、 55 Mの 2MEを含む RPMI1640培養液を用いた。ェプスタイン-バーウィルス（ Epstein- Barr virus： EBV )を含む培養液を添カ卩して、 4週間培養し、 EBVでトランスフォームされた B細胞株を榭立し、 B-LCL (—)細胞と命名した。 EBVは、 EBVを産生する細胞株 B95-8 (JCRB細胞バンク No. 9123)の培養上清より調製した。 B- LCL (—)細胞を 3 X 107個 /mLに調整し、 WT1遺伝子を発現するウィルスを含む培養液を添加後、更にポリプレ ンを最終濃度が 8 g/mLになるように添カ卩して、 24穴プレートに lmLずつ播種した。 16時間培養した後に新 、培養液を lmLずつ添加して培養を継続した。 G418 (ネオ マイシン)を 0.7 g/mLで添加し、 5-7日間培養し、遺伝子が導入された細胞を選択 した。このようにして選択された WT1を発現する B細胞株を B-LCU+)細胞と命名した 。 B-LCL (—)細胞と B-LCU+)細胞の WT1遺伝子の発現量を RT-PCR法で測定した。 方法は、文献（Blood, 89:1405, 1997)に従い、陽性コントロールの K562細胞の発現 量を 1として換算した。その結果、 B-LCL (—)細胞は、 1.6 X 10— 4であるのに対して、 B-LCU+)細胞は 3.2であり、 WT1遺伝子が高発現しているのが確認された。 B-LCL( +)細胞に対する G2細胞の反応性を実施例 2と同様の方法で検討した。 HLA-DR拘 束性を確認するために G2細胞と混合する前に B-LCU+)を抗 HLA-DR抗体で処理 した群も設定した。結果を図 3に示す。ペプチド特異的 CD4陽性 T細胞株 G2は内因 的に WT1遺伝子を発現している B-LCU+)細胞との混合培養で増殖反応を示すこと 、また、この反応は抗 HLA-DR抗体により阻害されることが示された。これらの結果よ り、 WT1 のペプチドが細胞内で WT1蛋白質から生じ、内因性に HLA-DR分子に
332-347
抗原提示されて ヽることが示された。
[0080] 実施例 4 WT1 ペプチド特異的な CD4陽性 T細朐株 E04.1の榭立
332-347
実施例 1と同様の方法で、 HLA-DRB1*0405陽性の健常人ボランティア力も採取した 血液を用いて、榭状細胞を調製した。ただし、 6日目に添加する TNF- αは、終濃度 200 IU/mlとなるようにした。 CD4陽性 T細胞の調製は、榭状細胞の調製に用いた同 一の健常人ボランティア力も採取した血液を用いた。 CD4陽性 T細胞分離用
RosetteSep (StemCell社)の添付文書に従って CD4陽性 T細胞を分離した。
上記の榭状細胞と CD4陽性 T細胞を用いて、実施例 1と同様の方法で WT1ペプチド (配列番号 24:WT1 )に特異的な CD4陽性 T細胞を誘導した。この WT1 ぺプ
332-347 332-347 チド特異的な CD4陽性 T細胞を限界希釈法により培養を継続して、 CD4陽性 T細胞 株 E04.1を榭立した。なお、限界希釈法には、フィーダ一細胞として実施例 1に記載 の方法で調製した PBMCを X線照射後に 1穴当たり 1 X 105個ずつ播種した。培養液は 、 20 IU/mlの IL- 2および 5 g/mlの PHAを含む X- VIVO 15™培地を用いた。
WT1 ペプチドをパルスした榭状細胞に対する E04.1細胞株の増殖反応を、実
332-347
施例 1と同様の方法 (但し [ ]-チミジン添加後 18時間培養)で測定した。結果を図 4に 示す。 E04.1細胞は、 WT1 ペプチドをパルスした榭状細胞と混合培養することに
332-347
より増殖応答を示すが、ペプチドをパルスしな ヽ榭状細胞との混合培養では増殖応 答が認められないことが示された。以上より、 E04.1細胞は WT1 ペプチド特異的
332-347
な CD4陽性 T細胞株であることが明らかとなった。
実施例 5
WT1 ペプチドの HLA-DRへの特異的結合
332-347
実施例 4で榭立した E04.1細胞を 96穴培養プレートの 1穴あたりに 1 X 104個ずっ播 種した。実施例 3にお 、て HLA_DRB1*0405陽性の健常人ボランティア血液力 榭立 した B細胞株 B-LCL (-)細胞に WT1 ペプチドを 20 μ g/ml濃度でパルスした後に
332-347
X線照射し、 96穴培養プレートの 1穴あたりに 3 X 104個加えて E04.1細胞と混合培養し た。陰性コントロールとして、ペプチドパルスをしない B-LCL (-)細胞を E04.1細胞と混 合培養した群も設定した。
HLA-DR拘束性を確認するため、 WT1 ペプチドをパルス後に X線照射した
332-347
B-LCL (-)細胞を 20 μ g/mlの抗 HLA- DR抗体 (G46.6, BD ParMingen社)、抗 HLA- classl抗体 (G46- 2.6, BD ParMingen社)、抗 HLA- DQ抗体 (SPVL3, Immunotech 社）で 30分間処理した後に E04.1細胞と混合培養する群も設定した。また、抗体処理 の陰性コントロールとして、抗 mouse IgG抗体で同様に処理した後に E04.1細胞と混 合培養した群も設定した。
混合培養後、実施例 4と同様の方法で E04.1細胞の増殖を測定した。結果を図 5に 示す。 E04.1細胞は、 WT1 ペプチドをパルスした B-LCL (-)細胞と混合培養する
332-347
ことにより増殖反応を示した。しかし、 WT1 ペプチドをパルスした B-LCL (-)細胞
332-347
を抗 HLA-DR抗体で処理した場合、増殖が抑制されることが示された。さらに、 E04.1 細胞は他の抗体で処理した WT1 ペプチドパルス B-LCL (-)細胞では増殖応答
332-347
を示すこと、ペプチドパルスしていない B-LCL (-)細胞では増殖応答が認められない ことも示された。以上より、 WT1 ペプチドは HLA分子のなかでも HLA-DRに特異
332-347
的に結合して、 WT1 ペプチド特異的 CD4陽性細胞株 E04.1の増殖を誘導するこ
332-347
とが示された
実施例 6
Figure imgf000031_0001
HLA-DRB1*0405陽性または陰性の健常人ボランティア血液から、実施例 4と同様 の方法で PBMCを調製した。この PBMCを 20 μ g/mlの WT1 ペプチドでパルスし
332-347
た後に X線照射し、 96穴培養プレート 1穴あたりに 3 X 104個播種した。さらに、 E04.1細 胞を 96穴培養プレートに 1穴あたりに I X 104個播種して混合培養した。また、陰性コン トロールとして、ペプチドをパルスして 、な 、PBMCと E04.1細胞を混合培養した群も i ¾しプこ。
混合培養後、実施例 4と同様の方法で E04.1細胞の増殖を測定した。結果を図 6に 示す。 Donor 1 (HLA- DRB 1*0405/0803)および Donor 2 (HLA- DRB1*0405/0101)は HLA-DRB1*0405陽性であり、 E04.1細胞は WT1 ペプチドをパルスした両者由来
332-347
の PBMCとの混合培養により増殖応答を示した。一方、 Donor3 (HLA-DRB 1* 0101/1001)および Donor 4 (HLA- DRBl*1201/0802)は HLA- DRB1*0405陰性であり 、 WT1 ペプチドをパルスした両者由来の PBMCとの混合培養においても増殖応
332-347
答は認められな力つた。また、ペプチドパルスしていない PBMCでは全て増殖応答が 認められなかった。以上より、 WT1 ペプチドは多型を示す HLA-DRB1分子の中
332-347
でも、 HLA-DRB1*0405に特異的に結合して、 WT1 ペプチド特異的 CD4陽性細
332-347
胞株 E04.1の増殖を誘導することが示された。
実施例 7
WT1 332-347ぺプチ の HLA- DRBl^iMOSへの fi S^
実施例 3において HLA- DRB1*0405陽性の健常人ボランティア血液力 樹立した B 細胞株 B-LCL (-)と WT1発現 B細胞株 B-LCL (+)を X線照射後に、 96穴培養プレート の 1穴あたりに 3 X 104個、 E04.1細胞を 1 X 104個播種して混合培養した。その後、実施 例 4と同様の方法で E04.1細胞の増殖を測定した。結果を図 7に示す。 E04.1細胞は WT1発現 B細胞株 B-LCL (+)との混合培養により増殖応答を示し、 WT1を発現しない B-LCL (-)との混合培養では増殖応答が認められな力つた。
次に、アポトーシスを誘導した B- LCL (-)または B- LCL (+)細胞 1 X 105個を、実施例 4と同様の方法で HLA-DRB1*0405陽性の健常人ボランティア血液力 誘導した榭状 細胞 3 X 104個と 16時間培養後、 96穴培養プレートの 1穴に播種して、 1 X 104個の E04.1細胞と混合培養した。その後、実施例 1と同様の方法で E04.1細胞の増殖を測 定した。結果を図 8に示す。 E04.1細胞はアポトーシスした B-LCL (+)をパルスした榭 状細胞との混合培養により増殖応答を示し、アポトーシスした B-LCL (-)をパルスした 榭状細胞との混合培養では増殖応答は認められな力つた。以上より、 WT1
332-347ぺプ チドは B-LCL (+)細胞の細胞内で WT1蛋白質から分解された後に、 HLA-DRB1* 0405へ提示されて、 E04.1細胞の増殖を誘導することが示された。
なお、 B- LCL (-)および B-LCL (+)細胞のアポトーシスの誘導は、浸透圧ショックに より行った。 1 X 106個の細胞を 500 μ 1の高浸透圧培地（0.5 M sucrose, 10% w/v polyethylene glycol 1000, 10 mM HEPESを含む RPMI培地， pH 7.2)に懸濁後、 37°C で 10分間静置した。その後、あらかじめ 37°Cにした低浸透圧培地（60% RPMI, 40% water)によって 30倍希釈して 37°Cで 2-3分間静置した。その後、室温で 5分間遠心し て細胞を回収してアポトーシス誘導細胞として用いた。アポトーシスが誘導されたこと は、死細胞染色用蛍光色素 Propidium Iodideおよびホスファチジルセリン結合試薬 AnnexinVによって確認した。 [0084] 実施例 8
WT1 ペプチドによる E04.1細胞の活性化
332-347
実施例 4と同様の方法で HLA_DRB1*0405陽性の健常人ボランティア血液力も誘導 した榭状細胞に WT1 ペプチドをパルスし、 E04.1細胞と混合して 24時間培養した
332-347
。また、陰性コントロールとしてペプチドをパルスしない榭状細胞と E04.1細胞と混合 する群も設定した。 24時間培養後、終濃度 10 /z g/mlとなるように Brefeldin Aを添加し て E04.1細胞のェクソサイト一シスを阻害した。さらに 6時間培養後に、 CD4陽性 T細 胞を回収して 2%ホルムアルデヒドを含む PBSで細胞を固定し、 0.1%サポニンを含む permeabilization溶液で処理することで抗体の細胞膜透過性を高めた。その後、処理 した細胞に PE標識抗 IFN- γ抗体 (BD PharMingen社)および FITC標識抗 IL-4抗体 (BD PharMingen社)を反応させて細胞内部を染色した。フローサイトメーターを用いて 解析した結果を図 9に示す。 E04.1細胞は、 WT1 ペプチドをパルスした榭状細胞
332-347
との混合培養によって Th-1型のサイト力イン IFN- γの産生が強く誘導される力 Th-2 型のサイト力イン IL-4の産生は誘導されないことが示された。
また、未刺激状態の E04.1細胞に抗 CD4抗体および抗 CXCR3抗体を反応させて染 色後、フローサイトメーターによって解析した。結果を図 10に示す。 E04.1細胞は 90% 以上が CD4陽性かつ CXCR3陽性の Th-1型 CD4陽性 T細胞であることが示された。な お、 CXCR3はケモカインレセプターであり Th-1型免疫細胞に高発現することが知ら れている。
以上より、 WT1 ペプチドは WT1 ペプチド特異的 CD4陽性細胞株 E04.1細
332-347 332-347
胞を活性化して、 Th-1型のサイト力インである IFN- γの産生を誘導することが分かつ た。この結果から、 WT1 ペプチドは、 CD4陽性 T細胞を Th-1型に分化'活性ィ匕さ
332-347
せることが示された。
[0085] 実施例 9
WT1 ペプチドによる WT1特異的 CTLの誘導および活性化の増強
332-347
E04.1細胞を榭立した同一の健常人ボランティア (HLA-A*2402/1101, DRB1* 0405/0803)の血液を用いて、実施例 4と同様の方法で調製した PBMCを 24穴培養プ レートの 1穴あたりに 3 X 104個播種し、 WT1 ペプチド (配列番号： 27
235-243 、 20 μ g/ml)、 WT1 ペプチド (20 μ g/ml) + WT1 ペプチド (20 μ g/ml)、 WT1 ペプチド
235-243 332-347 235-243
(20 μ g/ml) + E04.1細胞（1.5 X 10個/ well)または WT1 ペプチド (20 μ g/ml) +
235-243
WT1 ペプチド (20 μ g/ml) + E04.1細胞（1.5 X 106個/ well)となるようにペプチドお
332-347
よひ Έ04.1細胞を添加して 37°Cで 7日間培養した。培地には 10% AB血清を含む X-VIVO 15™培地を用いた。なお、ここで用いた WT1 ペプチドは、 HLA-A*2402
235-243
拘束性の CTL誘導活性を有する癌抗原ペプチドである（WO2004/024175号公報)。 培養 7日間後に細胞を回収し、半量を抗 CD8抗体 (BD PharMingen社)および WT1 ペプチド/ HLA- A*2402特異的 PE標識テトラマーを用いて染色した。フローサイト
235-243
メーターによる解析結果を図 11 (A- D)に示す。 PBMCを WT1 ペプチドで刺激した
235-243
場合、 CD8陽性かつ WT1 ペプチド/ HLA-A 402陽性の WT1 ペプチド特異
235-243 235-243
的 CTL前駆体が誘導されることが報告されて!/ヽる (Cancer Immunol Immunother, 51， P614-620 (2002))。 PBMCを WT1 ペプチドのみで刺激した結果、 WT1 ぺプ
235-243 235-243 チド特異的 CTL前駆体の割合は 0.12%であった (図 11- A)。 WT1 ペプチドおよび
235-243
WT1 ペプチドで刺激した結果、 WT1 ペプチド特異的 CTL前駆体の割合は
332-347 235-243
0.69%に上昇した (図 11-B)。 WT1 ペプチドおよび E04.1細胞で刺激した結果、
235-243
WT1 ペプチド特異的 CTL前駆体の割合は 4.51%に上昇した (図 U_C)。 WT1
235-243 235-243 ペプチド、 WT1 ペプチドおよび E04.1細胞で刺激した結果、 WT1 ペプチド
332-347 235-243
特異的 CTL前駆体の割合は 7.12 こ上昇した (図 11- D)。
次に、回収した残りの細胞 3 X 105個を、 WT1 ペプチドでパルスした後に 30 Gy
235-243
の X線を照射した樹状細胞と 6時間混合培養した。培養 1時間後に、 Brefeldin Aを添 加して細胞のェクソサイト一シスを阻害した。さらに 5時間培養後、細胞を抗 CD8抗体 およ t Tl ペプチド/ HLA- A*2402特異的 PE標識テトラマーを用 、て染色した。
235-243
その後、実施例 8と同様の方法で細胞に固定処理および permeabilization溶液による 細胞膜透過性亢進処理を行った後、 PE標識抗 IFN- γ抗体により細胞内部を染色し た。なお陰性コントロールとして、 APC-標識抗マウス IgG抗体 (BD PharMingen社)によ る染色も行い、 IFN- v陽性かつマウス IgG陽性の細胞集団は非特異的染色として除 外した。
結果を図 12(A- D)に示す。 WT1 ペプチド特異的 CTL前駆体を WT1 ぺプ
235-243 235-243
訂正された用紙 （規則 91) チドで 6時間刺激すると、 CD8陽性かつ WT1 ペプチド/ HLA- A*2402陽性かつ
235-243
IFN- γ陽性の活性化 WT1 ペプチド特異的 CTLが誘導される。 WT1 ぺプチ
235-243 235-243 ドのみで刺激した結果、活性化 WT1 ペプチド特異的 CTLの割合は 17.0%であつ
235-243
た (図 12- Α：)。 WT1 ペプチドおよひ WT1 ペプチドで刺激した結果、活性化
235-243 332-347
WT1 ペプチド特異的 CTLの割合は 23*3%に上昇した (図 12- B)。 WT1 ぺプチ
235-243 235-243 ドおよび E04.1細胞で刺激した結果、活性化 WT1 ペプチド特異的 CTLの割合
235-243
は 25.7%に上昇した (図 12 - C)。 WT1 ペプチド、 WT1 ペプチドおよび E04.1細
235-243 332-347
胞で刺激した結果、活性化 WT1 ペプチド特異的 CTLの割合は 39.0%に上昇し
235-243
た (図 12 - D)。
以上の結果より、 WT1 ペプチドは WT1特異的 CTL前駆体の誘導と活性化を増
332-347
強するヘルパーペプチドであることが示された。同様に、 Ε04·1細胞は WT1特異的 CTLの活性化を増強するヘルパー Τ細胞であり、 WT1 ペプチドによってそのへ
332-347
ルパー機能は大幅に上昇して WT1特異的 CTLの活性化を増強することも示された。 実施例 10
WT1 ぺプチドの Dromiscuous性の検討
332 - 347
WT1 ペプチドが、日本人に多いとされる HLA - DRB 1*1502分子にも結合し、
332-347
WT1 特異的 CD4陽性 T細胞を誘導することのできる promiscuous helper peptide
332-347
であるカゝどうか 析した。
1.実験方法
1)樹状細胞 (DC)の作製
健常人の血液提供者 (HLA-DRB1*1502/1403)の末梢血から末梢血単核球（ PBMC)を分離し 1%AB型血清 (Nabi, Miami, FL)、 X- VIVO 15培養液 (Cambrex社） を用いて 6穴プラスチックプレートに I X 107 cells/well播き 2時間培養した。その後、浮 遊細胞を除去し、残った付着細胞を 1000 IU/ml IL- 4 (PeproTech社）、 1000 IU/ml GM- CSF(PeproTech社）、 1%AB型血清、 X- VIVO 15培養液で培養した。 2日目と 4 日目に培養交換を行い IL- 4と GM-CSFを添加し、 6日目に TNF- αを 100 IU/ml加え、 樹状細胞を成熟化させた。
2) WT1 特異的 CD4陽性 T細胞の誘導
332-347
訂正された用紙 （規則 91) 同じ血液提供者力 CD4陽性 T細胞分離用 RosetteSep (StemCell社）を用いて CD4 陽性 T細胞を分離した。 24穴プレートの各ゥエルに、この CD4陽性 T細胞 (3 X 106個） を入れ、これを WT1 ペプチド 20 μ g/mlでパルスし 25Gy放射線照射した自己榭
332-347
状細胞 (3 X 105個）で刺激し、刺激の次の日に IL-2を 20IU/ml添加した。刺激された CD4陽性 T細胞は、同じように一週間おきに WT1 ペプチドを 20 μ g/mlでパルスし
332-347
た榭状細胞を用いて刺激を行った。また、 2回目の刺激以降は 1日おきに IL-2入りの 培地で培地交換を行った。計 3回の刺激により誘導された CD4陽性 T細胞を実験に 用いた。
3)増殖アツセィ
増殖アツセィは [3H]- thymidine incorporation法により行った。ペプチドで刺激、誘導 された CD4陽性 T細胞（3 X 104個; responder)と、 WT1 、 WT1 、 WT1 の
332-347 172-186 225-243 各ペプチドをそれぞれパルスし放射線照射した PBMC (1 X 105個）を stimulatorとして 、 96穴プレートで共培養した。また、ネガティブコントロールとしてペプチドをパルスし て!ヽな 、DC (—)を用いた。共培養して 80時間後に [3H]-thymidine (Amersham
Biosciences社）を 37kBq/wellで添カ卩し、さらに 16時間インキュベーションして j8シンチ レーシヨンカウンターで測定した。単位は count per minute(cpm)で表し、すべてのアツ セィは triplicateでおこなつた。
4)フローサイトメトリーによるサイト力イン産生の解析
増殖アツセィと同様に CD4陽性 T細胞と stimulatorを共培養し、 2時間後 Brefeldin A を加えた。その 4時間後に細胞を回収し、 fixation/permeationを行い、 FITC標識抗 IL- 4抗体（BD Pharmingen社）と PE標識抗 IFN- y抗体（BD Pharmingen社）で染色し、 フローサイトメトリーを行った。
5) ELISA法
自己1¾\«：(6 105個）に WT1 ペプチドをパルスしたものとしないものを用意し、
332-347
これらを 25Gyで放射線照射して、それぞれを WT1 で誘導した CD4陽性 T細胞 (6
332-347
X 105個）と共培養した。そして 72時間培養後に上清を回収し、 ELISAで上清 300 1 中の IL-4、 IFN- γを測定した。
6) TCRレノ トァアツセィ TCR V j8 repatoire Kit (BECKMAN COULTER社）、 FACsort (BECTON
DICKINSON社）を用いて、 WT1 ペプチドで誘導した CD4陽性 T細胞の T cell
332-347
receptorの j8鎖のレパトァを解析した。
2.実験結果
健常人の血液提供者 (HLA-DRB1*1502/1403)力も分離した CD4陽性 T細胞を、 WT1 ペプチドをパルスした自己の榭状細胞を用いて計 3回刺激した。これにより
332-347
誘導された CD4陽性 T細胞のペプチド特異性を WT1 、 WT1 、 WT1 の
172-186 225-243 332-347 各ペプチドを用いて増殖アツセィにて検討した。その結果、 WT1 ペプチドで誘
332-347
導された CD4陽性 T細胞は、ペプチドがない場合や WT1 や WT1 の刺激で
172-186 225-243 は増殖しなかったが、 WT1 で刺激すると約 10倍に増殖した（図 13)。この結果より
332-347
、誘導された CD4陽性 T細胞は WT1 特異性を有することが示された。
332-347
この WT1 ペプチドで誘導された CD4陽性 T細胞の TCRレパトァアツセィを行つ
332-347
た。結果を図 14に示す。 V β 3を有するものと V β 20を有するものがそれぞれ全体の 10%存在し、ドミナントとなっていた。
これらのドミナントとなっていた CD4陽性 Τ細胞をソーティングにより分離し、 V |8 3を 有するものを E15.1 subline、 V j8 20を有するものを E15.2 sublineと命名した。この 2つ の株のうち E15.2 sublineの方がより WT1 ペプチドに対する反応性が高かった（図
332-347
15)。
さらに、 E15.2 sublineを WT1 ペプチドにより刺激し、分泌される IL-4と IFN- γを
332-347
Intracelluler stain法によって測定した。その結果、 Th- 2型サイト力インである IL- 4では なぐ Th-1型サイト力インである IFN- γを顕著に産生することが明ら力となった（図 16) 。また、 E15.2 sublineの WT1 特異的な増殖反応は WT1 の濃度依存性であ
332-347 332-347
つた（図 17)。これらの結果から、 E15.2 sublineは WT1 特異的 Th_l型 CD4陽性 T
332-347
細胞株であることが明らかとなった。
以上のように、 HLA- DRB1*1502分子陽性かつ HLA- DRB1*0405分子陰性の健常人 の CD4陽性 T細胞から、 WT1 特異的な Th-1型 CD4陽性 T細胞株を誘導すること
332-347
ができた。これにより、この CD4陽性 T細胞は細胞性免疫に関与し、サイト力インの分 泌により CTLを活性ィ匕できると考えられる。このように、 CTLを活性ィ匕する HLA- classl 拘束性 WT1ペプチド (癌抗原ペプチド）に WT1 を併用することで、抗腫瘍効果を
332-347
さらに増強できることが示された。
[0089] 次に HLA-DRB1*1502陽性の健常人 (1502/0901)1名と、 HLA- DRB1*1502陰性の健 常人 (1302/0803)1名の末梢血単核球に WT1 ペプチドをパルスしたものを
332-347
stimulatorとして E15.2 sublineと共培養し、 WT1 特異的な増殖を増殖アツセィに
332-347
より調べた。結果を図 18に示す。 HLA-DRB1*1502陽性の健常人では WT1 特異
332-347 的な増殖が見られた力 HLA-DRB1*1502陰性の健常人では増殖は見られな力つた (図 18)。このことから、 E15.2 sublineの WT1 特異的な増殖は HLA- DRB1*1502拘
332-347
束性であることが示された。
以上のように、 WT1 ペプチド特異的な Th-1型 CD4陽性 T細胞株である E15.2
332-347
sublineを用いた解析により、 WT1 は日本人に最も多い HLA-DRB1*0405分子だ
332-347
けでなく、日本人に 3番目に多い HLA-DRB1*1502分子にも結合する promiscuous helper peptideであることか示された。
産業上の利用可能性
[0090] 本発明により、 WT1由来の HLA-DRB1*0405結合性抗原ペプチド、当該ペプチドを コードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むヘルパー T細胞 の誘導剤などが提供される。本発明のヘルパー T細胞の誘導剤は、癌ワクチンの作 用増強剤として有用である。本発明の癌ワクチンの作用増強剤は、 HLA-DRB1*0405 陽性の多くの癌患者に適用可能であり、特に WT1ワクチンの作用増強剤として有用 である。
図面の簡単な説明
[0091] [図 1]WT1由来のペプチド WT1 で刺激した CD4陽性 T細胞（ヘルパー T細胞）と
332-347
各種榭状細胞との反応性を調べた結果を示す。図中、「無処理」はペプチドをパルス して 、な 、榭状細胞との反応性を、 ΓΡΗΑ]は榭状細胞の代わりに PHAで処理した CD4陽性 T細胞の結果を、 「WT1 ノ レス」は WT1 ペプチドをパルスした榭状
172-186 172-186
細胞との反応性を、「WT1 パルス」は WT1 ペプチドをパルスした榭状細胞と
225-243 225-243
の反応性を、「WT1 ノ レス」は WT1 ペプチドをパルスした榭状細胞との反応
332-347 332-347
性をそれぞれ示す。また縦軸は、 CD4陽性 T細胞に取り込まれた [ ]-チミジン量（ cpm)を示す。
[図 2]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした榭状細胞に対する G2細胞株の反
332-347
応性を調べた結果を示す。図中、「無処理」はペプチドをパルスして ヽな ヽ榭状細胞 を用いた結果を、「WT1 パルス」は WT1 をパルスした榭状細胞を用いた結
332-347 332-347
果を示す。また縦軸は、 G2細胞株に取り込まれた [ ]-チミジン量 (cpm)を示す。
[図 3]WT1遺伝子を発現する B-LCU+)細胞に対する G2細胞株の反応性を調べた結 果を示す。図中、「B- LCL( -)」は WT1遺伝子を発現していない B- LCL (-)細胞を用い た結果を、「B_LCL(+)」は WT1遺伝子を発現する B-LCU+)細胞を用いた結果を、ま た「B-LCL(+) +抗 HLA-DR抗体」は抗 HLA-DR抗体で処理した B-LCL(+)を用いた結 果を示す。また縦軸は、 G2細胞株に取り込まれた [ ]-チミジン量 (cpm)を示す。
[図 4]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした榭状細胞に対する E04.1細胞株の
332-347
反応性を調べた結果を示す。図中、「-」はペプチドをパルスして 、な 、榭状細胞を 用いた結果を示し、「332」は WT1 ペプチドをパルスした榭状細胞を用いた結果
332-347
を示す。縦軸は、 E04.1細胞株に取り込まれた [3H]-チミジン量 (cpm)を示す。
[図 5]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした刺激細胞を各種 HLA阻害抗体で処
332-347
理した場合の E04.1細胞株の反応性を調べた結果を示す。刺激細胞には実施例 3に おいて HLA-DRB 1*0405陽性の健常人ボランティア血液力 樹立した B細胞株 B-LCL (-)細胞を用いた。図中、「-」はペプチドをパルスして 、な 、刺激細胞を用 ヽ た結果を、「332」は WT1 ペプチドをパルスした刺激細胞を用いた結果を示す。「
332-347
332+ a -classljは WT1 ペプチドと抗 HLA-classI抗体で処理した刺激細胞、「
332-347
332+ -DRJは WT1 ペプチドと抗 HLA- DR抗体で処理した刺激細胞、「332+
332-347
-DQJは WT1 ペプチドと抗 HLA-DQ抗体で処理した刺激細胞を用いた結果を示
332-347
す。なお、「332+mIgG」は WT1 ペプチドと阻害抗体の陰性コントロールとして抗
332-347
マウス IgG抗体で処理した刺激細胞を用いた結果を示す。縦軸は、 E04.1細胞株に取 り込まれた [3H]-チミジン量 (cpm)を示す。
[図 6]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした HLA-DRB1*0405陽性または陰性の
332-347
PBMCに対する E04.1細胞株の反応性を調べた結果を示す。図中、「-」はペプチドを パルスして 、な 、PBMCを用いた結果を、「332」は WT1 ペプチドをパルスした
332-347 PBMCを用いた結果を示す。 Donorの HLA-DRB1の遺伝型は、 Donor 1
(HLA- DRBl*0405/0803)、 Donor 2 (HLA- DRB1*0405/0101)、 Donor3 (HLA- DRB1* 0101/1001)および Donor 4 (HLA- DRBl*1201/0802)である。縦軸は、 E04.1細胞株 に取り込まれた [3H]-チミジン量 (cpm)を示す。
[図 7]WT1遺伝子を発現する B-LCL (+)細胞に対する E04.1細胞株の反応性を調べ た結果を示す。図中、「B-LCL ( -)」は WT1遺伝子を発現していない B-LCL (-)細胞 を刺激細胞に用いた結果を、 ΓΒ-LCL (+)」は WT1遺伝子を発現する B-LCL (+)細胞 を刺激細胞に用いた結果を示す。縦軸は、 E04.1細胞株に取り込まれた [ ]-チミジ ン量 (cpm)を示す。
[図 8]アポトーシスを誘導した B-LCL (+)細胞をパルスした榭状細胞に対する E04.1細 胞株の反応性を調べた結果を示す。図中、「apoptotic B-LCL (+)」は WT1遺伝子を 発現する B-LCL (+)細胞にアポトーシスを誘導後、榭状細胞にパルスする場合を示 す。「apoptotic B-LCL (-)」は WT1遺伝子を発現しない B- LCL (-)細胞にアポトーシ スを誘導後、榭状細胞にパルスする場合を示す。図中、「E04.1+」は E04.1細胞を榭 状細胞と混合培養した場合を、 ΓΕ04.1-]は E04.1細胞を混合培養しな 、場合を示す 。縦軸は、 E04.1細胞株に取り込まれた [ ]-チミジン量 (cpm)を示す。
[図 9]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした榭状細胞に対する E04.1細胞株の
332-347
サイト力イン産生について調べた結果を示す。図中、「-」はペプチドをパルスしてい な 、榭状細胞を用いた結果を、「332」は WT1
332-347ペプチドをパルスした榭状細胞を 用いた結果を示す。縦軸は、 IL-4(白棒)または IFN- γ (黒棒)の産生が認められた E04.1細胞の割合を示す。
[図 10]E04.1細胞株を抗 CD4抗体および抗 CXCR3抗体で染色してフローサイトメータ 一で解析した結果を示す。図中、横軸は CD4陽性細胞を、縦軸は CXCR3陽性細胞 を示す。 CD4陽性かつ CXCR3陽性細胞の割合は、 90.1%であった。
[図 11]WT1由来のペプチド WT1 が WT1特異的 CTLの誘導に与える影響を検討
332-347
した結果を示す。健常人ボランティア (HLA-A*2402/1101， DRBl*0405/0803)由来 PBMCを、 WT1 ペプチド (A)、 WT1 ペプチド + WT1 ペプチド (B)、 WT1
235-243 235-243 332-347
ペプチド + E04.1細胞（C)および WT1 ペプチド + WT1 ペプチド + E04.1
235-243 235-243 332-347 細胞（D)の刺激条件で 7日間培養した。その後、回収した細胞の半量を用いて、 WT1 特異的 CTL前駆体の割合をフローサイトメーターにより解析した。横軸は CD8陽
235-243
性の細胞を示し、縦軸は WT1 ペプチド/ HLA-A*2402陽性の細胞を示す。
235-243
[図 12]WT1由来のペプチド WT1 が WT1特異的 CTLの活性ィ匕に与える影響を検
332-347
討した結果を示す。前記図 11に示す実験にぉ 、て回収した残り半量の細胞を WT1 ペプチドにより 6時間刺激した後に、細胞内 IFN- γを染色した。縦軸は細胞内
235-243
IFN- y陽性細胞、横軸は抗マウス IgG抗体陽性細胞を示す。図中、 Eは WT1 ぺ
235-243 プチド、 Fは WT1 ペプチド + WT1 ペプチド、 Gは WT1 ペプチド + E04.1
235-243 332-347 235-243 細胞、 Hは WT1 ペプチド + WT1 ペプチド + E04.1細胞による刺激の結果を
235-243 332-347
示す。
[図 13]WT1由来のペプチド WT1 で刺激した CD4陽性 T細胞と各種榭状細胞との
332-347
反応性を調べた結果を示す。図中、「一」はペプチドをパルスして ヽな ヽ榭状細胞と の反応性を、「332」は WT1 ペプチドをパルスした榭状細胞との反応性を、「172」
332-347
は WT1 ペプチドをパルスした樹状細胞との反応性を、「225」は WT1 ぺプチ
172-186 225-243 ドをパルスした榭状細胞との反応性をそれぞれ示す。縦軸は、 CD4陽性 T細胞に取り 込まれた [3H]-チミジン量 (cpm)を示す。実験群間で統計的な有意差が認められた場 合は * *、有意差が認められな力つた場合は n.s.と表示した。
[図 14]WT1由来のペプチド WT1 で刺激した CD4陽性 T細胞の TCRレパトァ解析
332-347
の結果を示す。 TCRの各種 V |8鎖特異的な抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリ 一で分析した。上図では、 4分割した領域の右下の細胞集団が V |8 3陽性細胞を示 す。また、下図では 4分割した領域の右下の細胞集団が V |8 20陽性細胞を示す。
[図 15]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした自己 PBMCに対する E15.1細胞株
332-347
または E15.2細胞株の反応性を調べた結果を示す。図中、「-」はペプチドをパルスし て！ヽな 、自己 PBMCを用いた結果を示し、「332」は WT1 ペプチドをパルスした自
332-347
己 PBMCを用いた結果を示す。縦軸は、分離した細胞株に取り込まれた [ ]-チミジ ン量 (cpm)を示す。 A)は E15.1細胞株を用いた場合、 B)は E15.2細胞株を用いた場合 の結果を示す。図中 * *は、実験群間で統計的な有意差が認められたことを示す。
[図 16]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした自己 PBMCに対する E15.2細胞株
332-347 のサイト力イン産生について調べた結果を示す。図中、「-」はペプチドをパルスして
Vヽな ヽ榭状細胞を用いた結果を、「332」は WT1 ペプチドをパルスした自己
332-347
PBMCを用いた結果を示す。縦軸は、 IL-4(白棒)または IFN- γ (黒棒)の産生が認め られた E15.2細胞の割合を示す。
[図 17]WT1由来のペプチド WT1 の自己 PBMCへのパルス濃度と E15.2細胞株
332-347
の反応性について調べた結果を示す。縦軸は、 E15.1細胞株に取り込まれた [ ]-チ ミジン量 (cpm)を示す。横軸は自己 PBMCへの WT1 ペプチドのパルス濃度を示
332-347
す。
[図 18]WT1由来のペプチド WT1 をパルスした HLA-DRB1*1502陽性または陰性
332-347
の PBMCに対する E15.2細胞株の反応性を調べた結果を示す。図中、「-」はペプチド をパルスして 、な 、PBMCを用いた結果を、「332」は WT1 ペプチドをパルスした
332-347
PBMCを用いた結果を示す。 A)は HLA-DRB1*1502陽性の健常人由来の PBMCを用 いた場合、 Bは HLA-DRB1*1502陰性の健常人由来の PBMCを用いた場合を示す。 縦軸は、 E15.2細胞株に取り込まれた [ ]-チミジン量 (cpm)を示す。実験群間で統計 的な有意差が認められた場合は * *、有意差が認められな力つた場合は n.s.と表示 した。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号： 1に記載のヒト WT1のアミノ酸配列における連続する 10— 25アミノ酸か らなるペプチドであって、 HLA— DRB 1*0405に結合してヘルパー T細胞を誘導する ペプチド。
[2] 配列番号： 2— 23のいずれか記載のアミノ酸配列を含有する、請求項 1記載のぺプ チド。
[3] 配列番号： 24に記載のアミノ酸配列を含有する、請求項 2記載のペプチド。
[4] 配列番号 : 2— 23のいずれか記載のアミノ酸配列の第 1位、第 4位、第 6位および Z または第 9位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有す る 10— 25アミノ酸からなるペプチドであって、 HLA— DRB1*0405に結合してヘル パー T細胞を誘導するペプチド。
[5] 配列番号 : 2— 23のいずれか記載のアミノ酸配列の第 1位、第 4位、第 6位および Z または第 9位のアミノ酸残基がそれぞれ以下の中から選択される 、ずれかのアミノ酸 残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、請求項 4記載のペプチド：
第 1位：フエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、メ チォニン；
第 4位：パリン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸； 第 6位：ァスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジン、ァスパラギン酸； 第 9位:ァスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン。
[6] 配列番号: 24に記載のアミノ酸配列の第 3位、第 6位、第 8位および Zまたは第 11 位のアミノ酸残基がそれぞれ以下の中から選択される!、ずれかのアミノ酸残基に置 換されたアミノ酸配列を含有する、請求項 5記載のペプチド：
第 3位：フエ二ルァラニン、トリプトファン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、 第 6位:パリン、イソロイシン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、 第 8位：ァスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジン、ァスパラギン酸、 第 11位:ァスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン。
[7] 請求項 1一 6の ヽずれか記載のペプチドと癌抗原ペプチドとを含有するペプチド。
[8] 請求項 1一 7のいずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[9] 請求項 8記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
[10] 請求項 9記載の発現ベクターを含有する細胞。
[11] 請求項 10記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とす る、請求項 1一 7 、ずれか記載のペプチドの製造方法。
[12] 請求項 1一 6のいずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
[13] 請求項 1一 7のいずれか記載のペプチド、請求項 9記載の発現ベクター、または請 求項 10記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[14] 癌の治療剤または予防剤である、請求項 13記載の医薬組成物。
[15] 請求項 1一 6のいずれか記載のペプチド、請求項 1一 6のいずれか記載のペプチド にかかる請求項 9記載の発現ベクター、または請求項 1一 6のいずれか記載のぺプ チドにかかる請求項 10記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する、ヘル パー T細胞誘導剤である、請求項 13記載の医薬組成物。
[16] 請求項 1一 6のいずれか記載のペプチド、請求項 1一 6のいずれか記載のペプチド にかかる請求項 9記載の発現ベクター、または請求項 1一 6のいずれか記載のぺプ チドにかかる請求項 10記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する、癌ワク チンの作用増強剤である、請求項 13記載の医薬組成物。
[17] 請求項 7記載のペプチド、請求項 7記載のペプチドにかかる請求項 9記載の発現べ クタ一、または請求項 7記載のペプチドにかかる請求項 10記載の細胞と、薬学的に 許容される担体とを含有する、癌の治療剤または予防剤である、請求項 13記載の医 薬組成物。
[18] 請求項 1一 7のいずれか記載のペプチド、請求項 9記載の発現ベクター、または請 求項 10記載の細胞の、癌の治療または予防剤の製造における使用。
[19] 癌を治療または予防するための方法であって、請求項 1一 7のいずれか記載のぺ プチド、請求項 9記載の発現ベクター、または請求項 10記載の細胞を、それを必要と する対象に投与する方法。
[20] 請求項 1一 6の 、ずれか記載のペプチドと癌抗原ペプチドを組み合わせてなる医 薬組成物。
[21] 癌を治療または予防するための、請求項 20記載の医薬組成物。
[22] 請求項 1一 6の 、ずれか記載のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含有す る医薬組成物と、癌抗原ペプチドおよび薬学的に許容される担体を含有する医薬組 成物とを含む、癌の治療または予防のためのキット。
[23] 請求項 1一 6のいずれか記載のペプチドと癌抗原ペプチドとの組み合わせの、癌の 治療または予防剤の製造における使用。
[24] 癌を治療または予防するための方法であって、請求項 1一 6のいずれか記載のぺ プチドと癌抗原ペプチドとを組み合わせて、それを必要とする対象に投与する方法。
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