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WO2011118765A1 - 生菌数の測定方法及び培地 - Google Patents

生菌数の測定方法及び培地 Download PDF

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WO2011118765A1
WO2011118765A1 PCT/JP2011/057337 JP2011057337W WO2011118765A1 WO 2011118765 A1 WO2011118765 A1 WO 2011118765A1 JP 2011057337 W JP2011057337 W JP 2011057337W WO 2011118765 A1 WO2011118765 A1 WO 2011118765A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
medium
longum
bifidobacterium
species
arabinose
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2011/057337
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正達 武藤
文明 阿部
智子 八重島
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Original Assignee
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morinaga Milk Industry Co Ltd filed Critical Morinaga Milk Industry Co Ltd
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Priority to DK11759569.4T priority patent/DK2554676T3/en
Priority to JP2011539834A priority patent/JP5401558B2/ja
Priority to EP11759569.4A priority patent/EP2554676B1/en
Priority to CN201180003859.2A priority patent/CN102510901B/zh
Priority to US13/390,859 priority patent/US8859226B2/en
Publication of WO2011118765A1 publication Critical patent/WO2011118765A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/045—Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/36—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the viable count of only longum species from a test bacterium containing bifidobacteria by a culture method, and a medium useful as a selective medium for the measurement method.
  • Bifidobacteria are widely known as one of useful enteric bacteria, and there are many reports on their physiological significance. For example, the effects of producing organic acids such as lactic acid and acetic acid in the intestine and suppressing the growth of harmful bacteria, production of vitamins, activation of immunity, etc. have been clarified. For this reason, various bifidobacterial viable preparations have been proposed (Non-Patent Document 1). In addition, various foods containing bifidobacteria such as fermented milk such as yogurt, confectionery, beverages, and health foods have been developed for the purpose of maintaining health by ingesting bifidobacteria.
  • Non-patent Document 2 discloses a non-patent Document for infants inoculated with breast milk. Since infants inoculated with breast milk become dominant in bifidobacteria during infancy, infant formula containing bifidobacteria and lactic acid bacteria has been developed outside of Japan. Currently, longum species are listed as bifidobacteria species mainly added to foods in the global market, and there are also products that use breve species together (Non-patent Document 2).
  • the sample is smeared on a medium obtained by adding sterile defibrillated blood to a BL agar medium, and anaerobically cultured.
  • a method of determining from the form of colonies (color, shape, etc.) formed by growing on a culture medium by the above or the form of bacteria by Gram staining method (Non-patent Document 3).
  • Non-Patent Document 3 requires specialized knowledge to determine the bacterial species when the colony form and the fungus shape are similar. Therefore, it is sometimes very difficult to measure the viable count of individual bacterial species. In many countries, it is impossible to obtain sterile defibrillated blood. In such a country, a blood-containing BL agar medium cannot be prepared, and the above method cannot be performed.
  • the present invention has been made in order to solve the above problems, and from a test bacterium containing bifidobacteria, a measuring method that can easily measure the viable count of only the longum species by using a specific culture method, Another object of the present invention is to provide a medium that is useful as a selective medium for the measurement method and that can be easily prepared.
  • the present inventors have developed a BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology, 1986, Vol. 2, page 1428, Table 15.51 and The saccharides described in Table 15.54 were examined in detail.
  • the present inventors have determined that two types of longum species, animalis species, among longum species, animalis species, breve species, and infantis species, are used when measuring the number of viable cells by the culture method. It was found that L-arabinose has sugar assimilation properties.
  • the measuring method and medium of the present invention for solving the above problems have the following modes. [1] Using a culture medium, measure the number of viable bacteria only from microorganisms belonging to Bifidobacterium longum subsp.
  • the content of the peptone in the medium is 6.0 to 14.0 g / 1000 mL in 1000 mL of the medium, the content of the meat extract is 6.0 to 14.0 g / 1000 mL, and the yeast extract The method according to [1] or [2], wherein the content is 1.8 to 4.2 g / 1000 mL.
  • the test bacterium belongs to the microorganism belonging to the Bifidobacterium longum sub-species longum and the microorganism belonging to Bifidobacterium breve.
  • infantis comprising at least one microorganism selected from the group consisting of: [6]
  • Microorganisms belonging to Bifidobacterium longum, subspecies longum from test bacteria containing microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium used in the method according to any one of [1] to [6] Medium for measuring the number of viable bacteria only.
  • Bifidobacterium refers to a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium.
  • longum species indicate microorganisms belonging to Bifidobacterium longum subsp. Longum, and Breve species belong to Bifidobacterium breve.
  • Animalis species indicates microorganisms belonging to Bifidobacterium animalis
  • Lactis species indicates microorganisms belonging to Bifidobacterium animalis subsp. Lactis, and microorganisms belonging to Bifidobacterium animalis subsp.
  • Bacterial powder refers to powdered bacteria.
  • the number of viable bacteria of only the longum species can be easily measured by using a specific culture method, and useful as a selective medium for the measurement method
  • a medium that can be easily prepared can be provided.
  • the viable cell count of only the longum species is measured from a test bacterium containing bifidobacteria.
  • the medium will be described in detail later.
  • the bifidobacteria contained in the test bacterium may be only longum species, but in terms of usefulness of the present invention, in addition to the longum species, at least one other bifidobacteria other than the longum species should be contained. Is preferred.
  • the bifidobacteria other than the longum species are not particularly limited, and examples thereof include bifidobacteria that are generally widely used as probiotics.
  • the size of the colonies formed in the medium is small and can be easily distinguished from the longum colonies, it preferably contains at least one selected from Breve, lactis, and Infantis. .
  • it is selected from the Breve species / ATCC 15700 T strain, the Breve species / M-16V strain (Accession number: BCCM / LMG23729), the Lactis species / DSM 10140 T strain, the Infantis species / ATCC 15697 T strain. It is preferable to include at least one kind, and it is particularly preferable to include a Breve type M-16V strain.
  • the specimen containing the test bacterium for measuring the viable cell count according to the present invention is not particularly limited as long as it contains the test bacterium. Specifically, fermented milk, confectionery, beverages, health foods, foods such as infant formula, products such as pharmaceuticals, livestock feed, etc., those subjected to processing such as grinding, dilution with a diluent, etc. Etc.
  • a known culture method conventionally used for measuring the number of viable microorganisms by a culture method can be used except that the medium of the present invention is used as a medium.
  • the culture method include a solid culture method (a culture method in which culture is performed on an agar medium).
  • the solid culture method includes a pour method, a flat plate coating method, and a spiral method.
  • the pour method is a method in which a test sample (a sample or a diluted product obtained by diluting a sample with a diluent) is mixed with an agar medium that has been dissolved by heating, solidified by cooling, and cultured.
  • the plate smearing method is a method in which a test sample is smeared on an agar medium and cultured.
  • the spiral method is a method in which a test sample is plated on a medium with a concentration gradient using an instrument or the like.
  • a test sample (a sample or a diluted product obtained by diluting a sample with a diluent) is cultured in the medium of the present invention containing agar at a concentration of about 1.5%.
  • the number of colonies having a certain size (for example, a diameter of 0.7 mm or more) among the formed colonies can be counted.
  • the number of colonies counted at this time corresponds to the viable count of longum species contained in the test sample cultured on the agar medium. Therefore, the viable count (/ g) of the longum species contained in the specimen is obtained from the value and the dilution rate.
  • the diluent is not particularly limited, and known diluents such as physiological saline, the diluent (A) described in Non-Patent Document 3 described above (anaerobic specimen diluent described in the guidelines for food hygiene inspection), and the like. Available.
  • known culture conditions can be used as culture conditions for the longum species. Counting the number of colonies is usually carried out visually after culturing at 37 ° C. for about 48 hours under anaerobic conditions.
  • the medium used in the measurement method of the present invention contains only L-arabinose as a sugar source.
  • the concentration of L-arabinose is preferably 2 to 3% by mass with respect to the total mass of the medium. 2 to 2.5% by mass is more preferable.
  • sugar sources other than the L-arabinose include glucose, starch, sucrose, raffinose, galactose, sorbitol, mannitol and the like.
  • the medium may contain components other than L-arabinose.
  • components other than L-arabinose, which is the only sugar source and constitutes the medium will be referred to as basal medium components.
  • basal medium components include nitrogen sources such as yeast extract, meat extract and peptone; sodium salts such as sodium chloride, sodium acetate and sodium propionate; salts such as L-cysteine hydrochloride, phosphate and sulfate; can do.
  • the culture medium used for the measurement method of the present invention contains a yeast extract, meat extract, and peptone as a nitrogen source.
  • yeast extract is a nutrient source that is appropriately decomposed by autolysis enzyme or the like using yeast as a raw material, and specific examples thereof include Yeast Extract (manufactured by BD).
  • Meat extract is a nutrient source obtained from meat leachate, and supplements the properties of peptone nutrients by adding essential elements such as minerals, phosphoric acid, and energy sources that peptone does not have. .
  • 'LAB-MEMCO' powder manufactured by OXOID
  • Peptone is obtained by partially hydrolyzing milk casein, animal meat, soy protein, etc.
  • the yeast extract content is preferably 1.8 to 4.2 g / 1000 mL. More preferably, it is 2.7 to 4.2 g / 1000 mL.
  • the content of the meat extract is preferably 6.0 to 14.0 g / 1000 mL. More preferably, it is 9.0 to 14.0 g / 1000 mL.
  • the peptone content is preferably 6.0 to 14.0 g / 1000 mL. More preferably, it is 9.0 to 14.0 g / 1000 mL.
  • Each content (g / 1000 mL) of the said yeast extract, meat extract, and peptone shows the solid content (g) contained in 1000 mL of culture media.
  • the medium used in the present invention preferably contains the salts from the viewpoint of osmotic pressure.
  • the salts sodium salts are preferable, and sodium chloride and sodium acetate are particularly preferable.
  • the content of the salts in the medium is preferably 5 to 15 g / 1000 mL in 1000 mL of the medium.
  • the medium used for the measurement method of the present invention does not contain either magnesium sulfate or manganese sulfate in the medium. That is, it is preferable that neither magnesium sulfate nor manganese sulfate is contained in order to grow a colony of longum species into a size that can be distinguished (for example, a diameter of 0.7 mm or more).
  • the culture medium of the present invention may contain other components other than those described above as necessary, as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the other components are not particularly limited, and can generally include components added to the medium.
  • a solid culture method is used as a culture method when measuring the number of viable bacteria
  • agar is added. Agar is usually blended so that the concentration in the finally obtained medium is about 1.5%.
  • the size of the colonies is even smaller.
  • the medium composition reduces the colony forming ability of Bifidobacterium species other than Longham species. Therefore, when cultivating a product containing multiple types of bifidobacteria including longum species using the medium of the present invention, it is possible to measure the number of colonies that have grown greatly without distinguishing the form of colonies and fungi. It is easy to identify only the species and measure the number of viable bacteria.
  • the measured value is as accurate as that of an existing medium such as a medium in which sterile defibrillated blood is added to the BL agar medium. Therefore, the culture medium of the present invention is useful as a selective medium for measuring the viable count of longum species in a product in which a plurality of types of bifidobacteria including longum species coexist by a culture method. Furthermore, the medium of the present invention does not require difficult-to-obtain materials such as sterile defibrillated blood, so that it can be easily prepared. In obtaining the above effect, it is important that the components of peptone, meat extract, and yeast extract are combined at a predetermined concentration as a nitrogen source. In order to improve colony growth, it is preferable that magnesium sulfate and manganese sulfate are not contained in the medium of the present invention.
  • the production method of the medium is not particularly limited, and can be produced using a known method.
  • a basal medium is prepared by adding water together with optional components such as agar, sodium chloride, sodium acetate and L-cysteine hydrochloride to yeast extract, meat extract and peptone and dissolving them.
  • the concentration of each component in the basal medium at this time is about 1.25 times calculated from the final concentration.
  • the basal medium is sterilized at 121 ° C. for 15 minutes by an autoclave.
  • a sugar solution is prepared by dissolving sugar (L-arabinose) with water. The sugar concentration in the sugar solution at this time is about 5 times calculated from the final concentration.
  • the sugar solution is sterilized by filter sterilization. Then, by mixing the basal medium and the sugar solution at a ratio (volume ratio) of 4: 1, a medium containing each component at a desired concentration can be obtained.
  • the culture medium of 1000 mL represents a basal medium component and sugar diluted with water to a total volume of 1000 mL.
  • the medium used for the method for measuring the viable count of only the longum species from the test bacteria containing bifidobacteria is the longum species selection medium, the longum species containing only L-arabinose as the sugar source. It can also be described as a selection medium or the like.
  • a sugar solution was prepared by dissolving L-arabinose with water so that the final concentration in the medium was the sugar concentration shown in Table 1. Then, media 1-1 to 1-4 were prepared by mixing the basal medium and the sugar solution. In Table 1, “%” represents “% by mass”.
  • the viable cell count was measured according to the following procedure.
  • BB536 bacterial powder manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., containing 1.2 ⁇ 10 11 / g
  • 0.85% physiological saline was used as a diluent for diluting the test sample when measuring the viable cell count.
  • a test sample (BB536 bacterial powder) was diluted with a diluent (0.85% physiological saline) to prepare a measurement sample.
  • the measurement sample was spread on a plate by a pour method together with a medium (1-1 to 1-4) dissolved in advance by heating at 45 ° C., and after agar solidified to form a medium, it was 37 ° C.
  • the colonies formed were small in the culture medium 1-1 to 1-2 where the L-arabinose concentration was 1.0 to 1.5% of the total mass of the culture medium. It was relatively difficult to do.
  • the diameter 0.8 to 0.9 mm that can be easily measured visually.
  • the number of viable bacteria measured was also close to the actual number of bacteria (1.2 ⁇ 10 11 / g).
  • Table 3 shows basal medium A, B, B-1, or B-2 containing each basal medium component shown in Table 2 and the concentration of each component in each basal medium (1.0 times the concentration).
  • the concentration of the active ingredient in the basal medium was examined by using the concentration of the magnification.
  • the magnification of the concentration shown in Table 3 is the same as that of Table 2 in 1000 mL of basal medium when the concentration of each basal medium component shown in Table 2 is used as the standard (1.0 times) in 1000 mL of basal medium.
  • concentration of each basal medium component is shown.
  • the viable count of bifidobacteria includes RCA medium (Reinformed Crossed Medium Agar), MRS medium (de Man Rogosa and Sharpe) and mMRS medium (modified MRS medium) in which L-cysteine hydrochloride is added. in use. Therefore, basal media each containing the basal medium components shown in Table 2 were prepared with reference to the medium composition of RCA medium and mMRS medium.
  • a basal medium containing 1.8 to 4.2 g of yeast extract, 6.0 to 14.0 g of meat extract and 6.0 to 14.0 g of peptone in 1000 mL is effective as the basal medium in the present invention. It was determined that In the media 2-7 to 2-9 using the same composition as the basal medium B, the diameter of the formed colonies is small and it is relatively difficult to measure visually, and the viable cell count is also 7. It was 5 ⁇ 10 10 / g or less. Therefore, it was found that the composition of the basal medium B is not suitable as a basal medium for measuring the number of viable bacteria using the utilization of sugar.
  • the colony diameter was 0.9 mm
  • the basal medium B- In basal medium B-2 to which magnesium sulfate and manganese sulfate were added to 1 the colony diameter was 0.6 mm. From this, it was considered that longum seeds were not mainly added with magnesium sulfate and manganese sulfate as a factor that allowed colonies to grow to sizes that could be distinguished.
  • ⁇ Test Example 3 Examination of separability due to differences in bifidobacteria species> As Bifidobacteria, Breve species ATCC 15700 T strain, Breve species M-16V strain, Longham species ATCC 15707 T strain, Longham species BB536 strain, and Lactis species DSM 10140 T strain were used. The superscript T indicates that it is a reference stock. Among them, the Breve type M-16V strain is deposited under the accession number: BCCM / LMG23729, and the Longum species BB536 strain is deposited under the accession number: ATCC BAA-999. Table 4 shows the assimilation properties of L-arabinose of Breve, Infantis, Longham, and Lactis.
  • Basal medium A 3 g yeast extract, 10 g meat extract, 10 g peptone, 5 g sodium chloride, 3 g sodium acetate and 0.5 g L-cysteine hydrochloride
  • the basal A basal medium was prepared by diluting the medium A so that the concentration of each component of the basal medium A (concentration of 1.0 times) was the concentration (0.1 to 0.9 times) shown in Table 5.
  • agar is added so that the final concentration (concentration after addition of L-arabinose) is 1.5% by mass with respect to the total mass of the medium, and D-glucose as a sugar, or
  • Each medium 3-1 to 3-14 was prepared by adding L-arabinose. At this time, D-glucose was added so that the final concentration was 1% by mass relative to the total mass of the medium, and L-arabinose was added so that the final concentration was 2% by mass.
  • Each of the above strains was subcultured in an mMRS culture solution at a seed intake of 3% at 37 ° C. for 15 hours.
  • a culture solution that was confirmed to be stably grown was diluted to an appropriate concentration with 0.85% physiological saline.
  • the diluted culture solution is spread on a plate together with a medium (3-1 to 3-14) dissolved by heating to 45 ° C. in advance, and after the agar has solidified, it is 37 ° C. and 48 ° under anaerobic conditions. Culture was performed for ⁇ 2 hours. After the culture, the diameter (mm) of the colonies grown on the medium was measured in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in Table 5.
  • N.I. T.A. Indicates that the test (culture and measurement of colony diameter) was not performed.
  • “%” represents “mass%”.
  • both of the two longum species have colonies with a diameter of 0.8 mm or more. Formed.
  • only a small colony was formed with any of the other bacterial species. For example, the maximum was 0.6 mm for lactis DSM10140 T strain having L-arabinose utilization, and 0.3 mm or less for other strains. From these results, by using a medium in which a specific amount of L-arabinose is added to a specific basal medium, even if other Bifidobacteria having L-arabinose utilization such as lactis are mixed. It was shown that only the longum species can be identified and the number of viable bacteria can be easily measured. That is, by using the said culture medium, it was shown that only a longum colony is formed large and the number of viable bacteria can be easily measured.
  • ⁇ Test Example 4> As a test sample, the culture solution of the Longum ATCC 15707 T strain prepared in Test Example 3 was used, and as the culture medium, the media 3-8 to 3-14 prepared in Test Example 3 and the RCA medium were used. In the same manner as above, the number of viable bacteria was measured by a culture method. The results are shown in Table 6. In Table 6, “%” represents “% by mass”.
  • the viable cell values measured by culturing in the medium 3-8 having a basal medium component concentration of 0.1 times were the same as the viable cell values measured by culturing in the RCA medium. .
  • This basal medium component concentration of 0.1 times is lower than the lower limit of the basal medium component concentration of 0.6 to 1.4 times that is the necessary concentration obtained from the result of Test Example 2. Therefore, a medium containing a nitrogen source (protein, peptide, etc.) at a concentration 0.6 to 1.4 times that of basal medium component A shown in Table 2, that is, 1.8 to 4.2 g of yeast in 1000 mL of medium.
  • Example 1 A powdered milk product was prepared that was known to contain both the powder of the Longgam BB536 strain and the powder of the Breve M-16V strain.
  • a culture medium BL agar medium containing horse defibrillated blood (medium that has conventionally been regarded as a medium that can be distinguished by colony shape), RCA medium (a medium in which two strains of bifidobacteria colonies are known to form) ), And the number of viable bacteria in each powdered milk product was measured in the same manner as in Test Example 1 using three kinds of mediums of the following basal medium supplemented with 2% L-arabinose (invention medium). did.
  • Basal medium in 1000 mL of medium, 2.5 g yeast extract, 8.2 g meat extract, 8.2 g peptone, 4.1 g sodium chloride, 4.1 g sodium acetate, 0.41 g L-cysteine hydrochloride Basal medium containing salt and 15 g agar.
  • Basal medium in 1000 mL of medium, 2.5 g yeast extract, 8.2 g meat extract, 8.2 g peptone, 4.1 g sodium chloride, 4.1 g sodium acetate, 0.41 g L-cysteine hydrochloride Basal medium containing salt and 15 g agar.
  • longum seeds and breve seeds were separated and measured by the shape of colonies grown on the BL medium and microscopic examination. The total value was displayed as the total number of viable bacteria.
  • the number of viable bacteria was counted from the number of colonies obtained by growth.
  • “-” indicates that the colony size was not counted because it was less than 0.2 mm.
  • “%” represents “mas
  • the viable cell value measured using the medium of the present invention was equivalent to the viable cell value of Longum species measured using the BL medium containing horse defibrillated blood. Therefore, by using the culture medium of the present invention, it is possible to identify only the longum species and measure the viable cell value, and the viable cell value is also an accurate value almost the same as that when the BL medium is used. It has been shown.
  • the viable cell count measured using the RCA medium was equivalent to the total viable cell count of the longum and breve species measured using the BL medium containing horse defibrillated blood. Therefore, when the RCA medium was used, it was not possible to distinguish the viable counts of the longum species and the breve species.
  • the number of viable bacteria of only the longum species can be easily measured by using a specific culture method, and useful as a selective medium for the measurement method
  • a medium that can be easily prepared can be provided.

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Abstract

　本発明は、糖源としてＬ－アラビノースのみを含有する培地を使用して、ビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する被検菌から、ロンガム種のみ、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのみを識別して、その生菌数を測定する方法に関する。また、前記測定方法に用いられる選択培地として有用であり、調製も容易な培地を提供することができる。

Description

生菌数の測定方法及び培地
　本発明は、ビフィズス菌を含有する被検菌からロンガム種のみの生菌数を培養法により測定する方法、及び前記測定方法用の選択培地として有用な培地に関する。
　本願は、２０１０年３月２６日に、日本に出願された特願２０１０－７２３６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ビフィズス菌は有用な腸内細菌の一つとして広く知られており、その生理学的意義については多数の報告がある。たとえば腸内において乳酸、酢酸等の有機酸を生産し、かつ有害菌の増殖を抑制する作用、ビタミンの産生、免疫力の賦活化等が明らかにされている。
　そのため、従来、種々のビフィズス菌生菌製剤が提案されている（非特許文献１）。また、ビフィズス菌を摂取することにより健康を維持することを目的として、ビフィズス菌を含有する種々の食品、たとえばヨ－グルトなどの発酵乳、菓子、飲料、健康食品等が開発されている。また、乳幼児期において、母乳を接種する乳幼児はビフィズス菌が優勢になることから、日本外ではビフィズス菌・乳酸菌を含んだ育児用粉乳なども開発されている。現在、世界市場において食品に主に添加されているビフィズス菌種としてロンガム種が挙げられ、ブレーベ種を併用した製品も存在する（非特許文献２）。
　製品中に添加されている有用菌の生菌数を個別に表示することは、消費者にとって製品の情報量が多く表示される観点から、有益なことであると考えられる。また、生菌数の表示に関して、インドネシア国では製品中に添加される有用菌について、菌種ごとに生菌数を表示する法律が成立している。
　現在のところ、ビフィズス菌と乳酸菌を両方含む製品からいずれかの菌の生菌数を測定する方法として、ビフィズス菌のみが生育する培地を用いる方法や、好気培養により乳酸菌のみを培養する方法が既に確立されている。
　また、ビフィズス菌もしくは乳酸菌を複数種含む製品中のビフィズス菌の菌種、及びその生菌数を測定する方法としては、ＢＬ寒天培地に無菌脱繊血液を加えた培地上に塗抹し、嫌気培養により培地上に生育させて形成したコロニーの形態（色、形状等）、又はグラム染色法による菌の形態などから判定する方法がある（非特許文献３）。
光岡知足編著、「ビフィズス菌の研究」、財団法人日本ビフィズス菌センタ－、１９９４年、第２６６－２６７頁 光岡知足編著、「ビフィズス菌の研究」、財団法人日本ビフィズス菌センタ－、１９９４年、第２８２－２８３頁 「はっ酵乳・乳酸菌飲料中のビフィズス菌の菌数測定法」、社団法人全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会　ビフィズス菌検査法検討委員会、２０００年３月、第１－１３頁
　しかし、上記非特許文献３に記載されるような方法では、コロニーの形態や菌の形状が近似している場合には菌種の判別に専門的な知識を必要とする。したがって、個々の菌種の生菌数の測定が時に非常に困難である。また、海外においては無菌脱繊血液を入手することが不可能である国も多い。このような国においては、血液入りのＢＬ寒天培地を作成できず、前記方法を行うことが不可能である。
　現在、上述したようにロンガム種とブレーベ種とが配合されている製品が存在すること、ロンガム種とアニマリス種（ラクティス種を含む）は一部糖の資化性が近似していることなどから、ロンガム種と、その他のビフィズス菌種（ブレーベ種、アニマリス種等）が混在する製品中から、培養法によってロンガム種のみの生菌数を容易に測定することができる技術が求められている。
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、ビフィズス菌を含有する被検菌から、ロンガム種のみの生菌数を特定の培養法を用いることにより容易に測定できる測定方法、及び前記測定方法用の選択培地として有用で、且つ調製も容易な培地を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１９８６年，第２巻，第１４２８頁，表１５．５１及び表１５．５４記載の糖類を詳細に検討した。本発明者らは、鋭意検討を行った結果、培養法による生菌数測定の際に、ロンガム種、アニマリス種、ブレーベ種、インファンティス種の中で、ロンガム種、アニマリス種の２種がＬ－アラビノースに対し糖の資化性を有することが分かった。さらに、本発明者らは、Ｌ－アラビノースを唯一の糖源として特定濃度含有させ、且つ糖以外の培地成分（タンパク質、ペプチド等）として特定の成分を特定濃度含有させた培地を用いると、ロンガム種、及びアニマリス種のうち、ロンガム種のみが大きいコロニーを形成することを見出し、本発明を完成させた。
　上記課題を解決する本発明の測定方法、及び培地は、以下の様態を有する。
　［１］培地を用いてビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する被検菌からビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum）に属する微生物のみの生菌数を測定する方法であって、前記培地が以下の１）～３）を満たすこと、及び前記生菌数の測定が前記培地に形成される直径０．７ｍｍ以上のコロニーを計測することを特徴とする方法：
　１）糖源としてＬ－アラビノースのみを含有する、
　２）窒素源としてペプトン、肉エキス、及び酵母エキスを含有する、
　３）培地中に、硫酸マグネシウム、及び硫酸マンガンのいずれも含有しない。
　［２］前記培地中の前記Ｌ－アラビノースの濃度が、培地の総質量に対し、２～３質量％である［１］に記載の方法。
　［３］前記培地中の前記ペプトンの含有量が、培地１０００ｍＬ中、６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ、前記肉エキスの含有量が６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ、及び前記酵母エキスの含有量が１．８～４．２ｇ／１０００ｍＬである、［１］又は［２］に記載の方法。
　［４］前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムに属する微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム・ＢＢ５３６株である［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
　［５］前記被検菌が、前記ビフィドバクテリウム属に属する微生物として、前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムに属する微生物と、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）に属する微生物、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）に属する微生物、及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）に属する微生物からなる群から選択される少なくとも１種の微生物と、を含有する［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］前記ビフィドバクテリウム・ブレーベに属する微生物が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ・Ｍ－１６Ｖ株である［５］に記載の方法。
　［７］［１］～［６］のいずれかに記載された方法に用いられるビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する被検菌からビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムに属する微生物のみの生菌数を測定するための培地。
　［８］糖源としてＬ－アラビノースのみを含有し、前記Ｌ－アラビノースの濃度が、培地の総質量に対し、２～３質量％であり、培地１０００ｍＬ中、酵母エキスを１．８～４．２ｇ／１０００ｍＬ、肉エキスを６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ、及びペプトンを６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ含有してなる［７］に記載の培地。
　本明細書及び特許請求の範囲において、濃度（％）はｗ／ｖ（質量／体積）による値である。
　ビフィズス菌はビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物を示す。
　また、本明細書中、ロンガム種はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｌｏｎｇｕｍ）に属する微生物を示し、ブレーベ種はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）に属する微生物を示し、アニマリス種はビフィドバクテリウム　アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｉｍａｌｉｓ）に属する微生物を示し、ラクティス種はビフィドバクテリウム　アニマリス　サブスピーシーズ　ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｉｍａｌｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）に属する微生物を示し、インファンティス種はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　ｉｎｆａｎｔｉｓ）に属する微生物を示す。
　「菌末」は、菌を粉末化したものを示す。
　本発明によれば、ビフィズス菌を含有する被検菌から、ロンガム種のみの生菌数を、特定の培養法を用いることにより容易に測定できる測定方法、及び前記測定方法用の選択培地として有用で、且つ調製も容易な培地を提供できる。
　本発明の測定方法では、糖源としてＬ－アラビノースのみを含有する培地を使用して、ビフィズス菌を含有する被検菌からロンガム種のみの生菌数を測定する。
　培地については詳しくは後述する。
　ロンガム種の菌株としては特に制約はなく、これまで、ロンガム種に属するものとして公的な微生物保存機関（ＡＴＣＣ、ＮＴＣＣ、ＪＣＭ、ＤＳＭＺ、ＢＣＣＭ、ＬＭＧ等）に寄託されている公的機関寄託株であってもよく、公知の方法により自然界から分離した分離株であってもよい。公的機関寄託株としては、たとえば、ＡＴＣＣ１５７０７Ｔ株、ＢＢ５３６株（受託番号：ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９９９にて寄託。ＢＢ５３６菌末として森永乳業（株）から市販）等が挙げられる。上付文字Ｔは基準株を意味する。
　被検菌が含有するビフィズス菌は、ロンガム種のみであってもよいが、本発明の有用性の点では、ロンガム種に加えて、ロンガム種以外の他のビフィズス菌を少なくとも１種含有することが好ましい。
　前記ロンガム種以外の他のビフィズス菌としては、特に限定されず、たとえば一般的にプロバイオティクスとして広く用いられているようなビフィズス菌が挙げられる。これらの中でも、前記培地に形成されるコロニーの大きさが小さく、ロンガム種のコロニーと区別しやすいことから、ブレーベ種、ラクティス種、インファンティス種から選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。なかでも、ブレーベ種・ＡＴＣＣ　１５７００Ｔ株、ブレーベ種・Ｍ－１６Ｖ株（受託番号：ＢＣＣＭ／ＬＭＧ２３７２９にて寄託）、ラクティス種・ＤＳＭ　１０１４０Ｔ株、インファンティス種・ＡＴＣＣ　１５６９７Ｔ株から選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、ブレーベ種・Ｍ－１６Ｖ株を含むことが特に好ましい。
　本発明により生菌数を測定する被検菌を含有する検体としては、前記被検菌を含むものであれば特に限定されない。具体的には、発酵乳、菓子、飲料、健康食品、育児用粉乳等の食品、医薬品、家畜用飼料等の製品、前記製品に対して粉砕、希釈液による希釈等の処理を施したもの、等が挙げられる。
　前記検体の培養は、培地として本発明の培地を用いる以外は、従来、培養法による微生物の生菌数の測定に用いられている公知の培養法が利用できる。前記培養法としては固体培養法（寒天培地にて培養を行う培養法）が挙げられる。
　固体培養法として具体的には、混釈法、平板塗沫法、スパイラル法等が挙げられる。混釈法は、試験試料（検体又は検体を希釈液で希釈した希釈物）を、加温溶解した寒天培地と混和し、冷却固形化して培養する方法である。平板塗沫法は、試験試料を、寒天培地上に塗抹して培養する方法である。スパイラル法は、試験試料を、機器等を使用して濃度勾配を付けて培地上にプレーティングする方法である。
　本発明の測定方法は、具体的には、試験試料（検体又は検体を希釈液で希釈した希釈物）を、寒天を１．５％程度の濃度で含有させた本発明の培地にて培養し、形成されたコロニーのうち、一定以上の大きさ（たとえば直径０．７ｍｍ以上）のコロニーの数をカウントすることにより実施できる。このときカウントされたコロニー数が、前記寒天培地で培養した試験試料中に含まれるロンガム種の生菌数に該当する。そのため、その値と希釈倍率とから、検体中に含まれるロンガム種の生菌数（／ｇ）が求められる。
　希釈液としては、特に限定されず、生理食塩水、上述した非特許文献３に記載の希釈液（Ａ）（食品衛生検査指針に記載された嫌気性検体希釈液）等の公知の希釈液が利用できる。
　本発明における培養条件は、ロンガム種の培養条件として公知の培養条件を利用できる。
　コロニー数のカウントは、通常、嫌気条件下、３７℃で４８時間程度培養した後に、目視にて行う。
　前記本発明の測定方法に用いられる培地は、糖源としてＬ－アラビノースのみを含有する。
　前記培地において、Ｌ－アラビノースの濃度は、培地の総質量に対し、２～３質量％であることが好ましい。２～２．５質量％がさらに好ましい。
　なお、本発明の培地に含まれない、前記Ｌ－アラビノース以外の糖源としては、例えばグルコース、デンプン、スクロース、ラフィノース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール等が挙げられる。
　前記培地は、Ｌ－アラビノース以外の成分を含有してもよい。以下、前記培地を構成する、糖源として唯一含まれるＬ－アラビノース以外の成分を基礎培地成分と記載する。
　基礎培地成分としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の窒素源；塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム等のナトリウム塩、Ｌ－システイン塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の塩類；を例示することができる。これらのうち、前記本発明の測定方法に用いられる培地は、窒素源として酵母エキス、肉エキス、及びペプトンを含有する。
　酵母エキス、肉エキス、ペプトンとしては、それぞれ、通常、微生物の培養のために用いられるものが利用できる。
　酵母エキスは、酵母を原料として自己消化酵素などによって適度に分解された栄養源であり、具体的には、Yeast Extract（ＢＤ社製）等を例示することができる。肉エキスは、肉の浸出液から得られる栄養源であり、ペプトンに備わっていないミネラル、リン酸、エネルギー源等の必須な要素を付与することにより、ペプトンの栄養素の特性を補完する栄養源である。具体的には、'LAB-MEMCO' powder（ＯＸＯＩＤ社製）等を例示することができる。ペプトンは、牛乳カゼイン、獣肉、大豆タンパク質等をタンパク質分解酵素又は酸で部分的に加水分解したものである。具体的には、BactoTM peptone（ＢＤ社製）等を例示することができる。
　培地１０００ｍＬ中、酵母エキスの含有量は、１．８～４．２ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは２．７～４．２ｇ／１０００ｍＬである。
　肉エキスの含有量は、６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは９．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬである。
　ペプトンの含有量は、６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬが好ましい。より好ましくは９．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬである。
　上記酵母エキス、肉エキス、ペプトンそれぞれの含有量（ｇ／１０００ｍＬ）は、培地１０００ｍＬ中に含まれる固形分量（ｇ）を示す。
　本発明に用いられる培地は、浸透圧の観点から、前記塩類を含むことが好ましい。前記塩類としては、ナトリウム塩が好ましく、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウムが特に好ましい。
　培地中、前記塩類の含有量は、培地１０００ｍＬ中、５～１５ｇ／１０００ｍＬが好ましい。
　ただし、本発明の測定方法に用いられる培地は、培地中に、硫酸マグネシウム、及び硫酸マンガンのいずれも含有しない。すなわち、硫酸マグネシウム、及び硫酸マンガンをいずれも含有されていないことが、ロンガム種のコロニーを判別可能な大きさ（たとえば直径０．７ｍｍ以上）に生育させるために好ましい。
　本発明の培地は、必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、上記以外の他の成分を含有してもよい。
　前記他の成分としては、特に限定されず、一般的に培地に添加されている成分を含有できる。たとえば生菌数測定の際に培養法として固体培養法を用いる場合は、寒天が配合される。寒天は、通常、最終的に得られる培地中の濃度が１．５％程度となるように配合される。
　なお、ロンガム種のコロニー生育と生菌数への影響を及ぼさない範囲で、任意の抗生物質を添加することが可能である。
　上記のように、ロンガム種が資化性を有するＬ－アラビノースを唯一の糖源として含有させた培地を用いることで、ロンガム種を含む複数種のビフィズス菌が混在する製品中から、ロンガム種のみを識別して、その生菌数を容易に測定できる。つまり、かかる培地においては、ロンガム種のみが大きいコロニーを形成する。
　たとえば、同じくＬ－アラビノースの資化性を有するアニマリス種（ラクティス種）であっても、本発明の培地において形成されるコロニーの大きさは、ロンガム種よりも小さいものとなる。
　Ｌ－アラビノースの資化性を有さないビフィズス菌種（たとえばブレーベ種、インファンティス種等）の場合、前記コロニーの大きさはさらに小さいものとなる。コロニーの大きさに違いが生じる理由としては、上記培地組成が、ロンガム種以外のビフィズス菌種のコロニー形成能を低下させることが考えられる。
　そのため、ロンガム種を含む複数種のビフィズス菌が混在する製品を本発明の培地を用いて培養すると、コロニーや菌の形態を判別しなくても、大きく生育したコロニー数を計測することで、ロンガム種のみを識別して、その生菌数を測定でき、簡便である。また、その測定値は、前記ＢＬ寒天培地に無菌脱繊血液を加えた培地のような既存の培地と同程度正確なものである。
　したがって、本発明の培地は、ロンガム種を含む複数種のビフィズス菌が混在する製品中のロンガム種の生菌数を培養法により測定するための選択培地として有用である。
　さらに本発明の培地は、無菌脱繊血液のように入手困難な材料を必要としないため、調製も容易である。
　上記効果を得るうえでは、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母エキスの各成分が所定濃度で組み合わされることが重要である。
　なお、硫酸マグネシウム、及び硫酸マンガンは、本発明の培地中に含有されないことが、コロニーの生育を良好にさせるために好ましい。
　培地の作製方法は、特に限定されず、公知の方法を利用して作製できる。
　具体例を挙げると、まず、酵母エキス、肉エキス及びペプトンに、寒天、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｌ－システイン塩酸塩等の任意成分と共に水を加えて溶解して基礎培地を調製する。この時点の基礎培地中の各成分濃度は、最終濃度から計算して１．２５倍程度とする。次に前記基礎培地に対し、オートクレーブにより１２１℃１５分間の滅菌処理を行う。
　別途、糖（Ｌ－アラビノース）を水で溶解させることにより糖溶液を調製する。この時点の糖溶液中の糖濃度は、最終濃度から計算して５倍程度とする。次にフィルター滅菌により前記糖溶液の滅菌処理を行う。
　そして、前記基礎培地と糖溶液とを４：１の割合（体積比）にて混合することにより、各成分を所望の濃度で含む培地が得られる。本明細書中、培地１０００ｍＬとは、基礎培地成分及び糖を、水で希釈して全量が１０００ｍＬとしたものを表す。
　なお、本発明において、ビフィズス菌を含有する被検菌からロンガム種のみの生菌数を測定する方法に用いられる培地は、ロンガム種選択用培地、糖源としてＬ－アラビノースのみを含有するロンガム種選択用培地等として記載することも可能である。
　次に、試験例及び実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜試験例１：Ｌ－アラビノース濃度についての検討＞
　基礎培地として、１．８ｇの酵母エキス（Yeast Extract、ＢＤ社製）、６．０ｇの肉エキス（'LAB-LEMCO' powder、ＯＸＯＩＤ社製）、６．０gのペプトン（Bacto peptone、ＢＤ社製）、３．０ｇの塩化ナトリウム、１．８ｇの酢酸ナトリウム、０．３ｇのＬ－システイン塩酸塩、１５ｇの寒天を秤量し、これに水を加えたものを基礎培地として使用した。
　Ｌ－アラビノースを、培地中の最終濃度が表１に示す糖濃度となるように、水で溶解させて糖溶液を調整した。そして前記基礎培地と糖溶液を混合することにより、培地１－１～１－４を調製した。表１中、「％」は「質量％」を表す。
　調製した培地を用い、培養法（混釈法）による生菌数測定を以下の手順で実施した。
　試験試料として、ＢＢ５３６菌末（森永乳業社製、１．２×１０１１／ｇ含有品）を使用した。
　生菌数測定の際に試験試料を希釈する希釈液としては、０．８５％生理食塩水を用いた。
　試験試料（ＢＢ５３６菌末）を希釈液（０．８５％生理食塩水）で希釈して測定試料を調製した。
　前記測定試料を、予め４５℃に加熱して溶解させた培地（１－１～１－４）とともに混釈法によりプレートに撒き、寒天が固まり培地を形成した後、嫌気条件下にて３７℃、４８時間の培養を行った。培養後、培地に生育したコロニー数を目視により測定し、前記測定値から、試験試料中の生菌数値を算出した。
　その結果を表３に示す。また、前記コロニーの直径（ｍｍ）を０．１ｍｍ目盛のスケールにより測定し、その平均値を求めた。前記平均値を「コロニー直径」として表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１による結果に示すとおり、Ｌ－アラビノース濃度が、培地の総質量に対し、１．０～１．５％の培地１－１～１－２では、形成されたコロニーが小さく、目視で計測することが比較的困難であった。Ｌ－アラビノース濃度が、培地の総質量に対し、２．０～３．０質量％の培地１－３～１－４では、目視で容易に計測することができる直径０．８～０．９ｍｍのコロニーが形成され、測定された生菌数値も実菌数（１．２×１０１１／ｇ）に近い値であった。
＜試験例２：基礎培地についての検討＞
　表２に示す各基礎培地成分を含む基礎培地Ａ、Ｂ、Ｂ－１、又はＢ－２であって、各基礎培地中の各成分の濃度（１．０倍の濃度）を表３に示す倍率の濃度としたものを用いることにより、基礎培地における有効成分濃度の検討を行った。表３に示す濃度の倍率は、基礎培地１０００ｍＬ中、表２に示す各基礎培地成分の濃度を基準（１．０倍）とした場合に、基礎培地１０００ｍＬ中、表２の配合比を維持しながら各基礎培地成分の濃度を変更した割合を示す。
　一般的に、ビフィズス菌の生菌数測定には、ＲＣＡ培地（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ａｇａｒ）、ＭＲＳ培地（ｄｅ　Ｍａｎ　Ｒｏｇｏｓａ　ａｎｄ　Ｓｈａｒｐｅ）にＬ－システイン塩酸塩を添加したｍＭＲＳ培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＲＳ培地）などが使用されている。そこで、ＲＣＡ培地、ｍＭＲＳ培地の培地組成を参考に、表２に示す基礎培地成分をそれぞれ含む基礎培地を調製した。
　上記の各基礎培地に、寒天を最終濃度（Ｌ－アラビノース添加後の濃度）が、培地の総質量に対し、１．５質量％になるように添加し、さらにＬ－アラビノースを最終濃度が、培地の総質量に対し、２質量％になるように添加して各培地２－１～２－１１を調製した。
　得られた培地を用いて、試験例１と同様にして、培養法による生菌数の測定を行った。
その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、基礎培地Ａと同じ組成を用いた例のうち、濃度が０．６～１．４倍の培地２－１～２－４では、目視で容易に観察することができる直径０．７ｍｍ以上のコロニーが形成され、生菌数値も８．１～９．９×１０１０／ｇと安定していた。
　一方、濃度が１．６～１．８倍の培地２－５～２－６では、コロニーが５．０×１０９未満であり、生菌数値も実菌数に比べて大幅に低い値となっていた。よって、基礎培地として、基礎培地Ａの各成分の濃度が０．６倍～１．４倍の範囲内である基礎培地が有効であることが確認された。
　この結果から、１０００ｍＬ中に１．８～４．２ｇの酵母エキス、６．０～１４．０ｇの肉エキス、６．０～１４．０ｇのペプトンを含む基礎培地が本発明における基礎培地として有効であると判断された。
　また、基礎培地Ｂと同じ組成を用いた培地２－７～２－９では、形成されたコロニーの直径が小さく、目視で計測することが比較的困難なものであり、生菌数値も７．５×１０１０／ｇ以下であった。
　よって、基礎培地Ｂの組成は、糖の資化性を利用した生菌数測定の基礎培地としては不適であることが分かった。
　また、基礎培地Ｂからポルソルベート、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、クエン酸アンモニウム、Ｌ－システイン塩酸塩を除去した基礎培地Ｂ－１では、コロニー直径が０．９ｍｍであったのに対し、基礎培地Ｂ－１に硫酸マグネシウム、硫酸マンガンを添加した基礎培地Ｂ－２では、コロニー直径が０．６ｍｍであった。
　このことから、ロンガム種は、主に硫酸マグネシウム、及び硫酸マンガンを添加しないことがコロニー直径を判別可能な大きさに生育させる要因であると考えられた。
　これらの結果から、公知の組成の培地における糖源を単にＬ－アラビノースに変換すれば、ロンガム種の生菌数測定を容易かつ精度よく行うことができるという訳ではなく、窒素源として、ペプトン、肉エキス、酵母エキスの各成分が所定濃度で組み合わされることが必須であること、硫酸マグネシウム、及び硫酸マンガンを添加しないことが有効であること、がそれぞれ示された。
＜試験例３：ビフィズス菌種の違いによる分離性についての検討＞
　ビフィズス菌として、ブレーベ種　ＡＴＣＣ　１５７００Ｔ株、ブレーベ種　Ｍ－１６Ｖ株、ロンガム種　ＡＴＣＣ　１５７０７Ｔ株、ロンガム種　ＢＢ５３６株、ラクティス種　ＤＳＭ　１０１４０Ｔ株を用いた。上付き文字Ｔは基準株であることを示す。
　上記のうち、ブレーベ種　Ｍ－１６Ｖ株は受託番号：ＢＣＣＭ／ＬＭＧ２３７２９にて寄託されており、ロンガム種　ＢＢ５３６株は受託番号：ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－９９９にて寄託されている。
　表４にブレーベ種、インファンティス種、ロンガム種、ラクティス種のＬ－アラビノースの資化性を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　１０００ｍＬ中に前記基礎培地Ａ（３ｇの酵母エキス、１０ｇの肉エキス、１０ｇのペプトン、５ｇの塩化ナトリウム、３ｇの酢酸ナトリウム及び０．５ｇのＬ－システイン塩酸塩）を含有する培地、及び前記基礎培地Ａを希釈して基礎培地Ａの各成分の濃度（１．０倍の濃度）を表５に示す倍率（０．１倍～０．９倍）の濃度とした基礎培地を調製した。
　上記の各基礎培地に、寒天を最終濃度（Ｌ－アラビノース添加後の濃度）が、培地の総質量に対し、１．５質量％になるように添加し、さらに、糖としてＤ－グルコース、又はＬ－アラビノースを添加して、各培地３－１～３－１４を調製した。このとき、Ｄ－グルコースは最終濃度が、培地の総質量に対し、１質量％になるように添加し、Ｌ－アラビノースは最終濃度が２質量％になるように添加した。
　上記の各菌株を、ｍＭＲＳ培養液にて、摂種量３％、３７℃にて１５時間の継代培養を行った。安定的に生育が確認された培養液を、０．８５％生理食塩水にて適等な濃度に希釈した。
　希釈した培養液を、予め４５℃に加熱して溶解させた培地（３－１～３－１４）とともに混釈法によりプレートに撒き、寒天が固まった後、嫌気条件下にて３７℃、４８±２時間の培養を行った。培養後、培地に生育したコロニーの直径（ｍｍ）を試験例１と同様に測定した。その結果を表５に示す。
　表５中、Ｎ．Ｔ．は試験（培養、及びコロニー直径の測定）を行っていないことを示す。また、表５中、「％」は「質量％」を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５による結果に示すとおり、糖を添加していない培地（３－１～３－４）の場合、試験したいずれの菌株でも、直径０．３ｍｍ以下のコロニーしか生育しなかった。
　１質量％のＤ－グルコースを添加した培地（３－５～３－７）の場合、培地成分濃度に比例して、形成されるコロニー直径が大きくなっており、培地成分濃度が０．６倍以上の培地ではいずれの菌種でも直径０．７ｍｍ以上のコロニーが形成されたが、菌種間の差は見られなかった。
　２質量％のＬ－アラビノースを添加した培地（３－８～３－１４）の場合、培地濃度が０．４５倍以上の時に、２株のロンガム種がいずれも直径０．８ｍｍ以上のコロニーを形成した。一方、他の菌種ではいずれの菌株でも小さなコロニーしか形成されなかった。たとえばＬ－アラビノースの資化性を有するラクティス種のＤＳＭ１０１４０Ｔ株でも最大０．６ｍｍであり、他の菌株では０．３ｍｍ以下であった。
　これらの結果から、特定の基礎培地に所定量のＬ－アラビノースを添加した培地を用いることによって、ラクティス種のようなＬ－アラビノースの資化性を有する他のビフィズス菌種が混在していても、ロンガム種のみを識別して、その生菌数を容易に測定できることが示された。
　つまり、上記培地を用いることにより、ロンガム種のコロニーのみを大きく形成させ、その生菌数を容易に測定できることが示された。
＜試験例４＞
　試験試料として、試験例３で調製したロンガム種　ＡＴＣＣ　１５７０７Ｔ株の培養液を用い、培地として、試験例３で調製した培地３－８～３－１４、及びＲＣＡ培地を用いて、試験例１と同様にして、培養法による生菌数の測定を行った。その結果を表６に示す。表６中、「％」は「質量％」を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６による結果に示すように、基礎培地成分濃度０．１倍の培地３－８で培養して測定した生菌数値と、ＲＣＡ培地で培養して測定した生菌数値とは同等であった。この０．１倍という基礎培地成分濃度は、試験例２の結果より得られた必要濃度である０．６～１．４倍の基礎培地成分濃度の下限よりも低い。
　よって、表２に示した基礎培地成分Ａの０．６～１．４倍の濃度で窒素源（タンパク質、ペプチド等）を含む培地、つまり、培地１０００ｍＬ中、１．８～４．２ｇの酵母エキス、６．０～１４．０ｇの肉エキス、及び６．０～１４．０ｇのペプトンを含有する基礎培地に、Ｌ－アラビノースを特定量添加した培地を用いることで、公知の培地と同程度正確に、ロンガム種の生菌数を測定することが可能であることが示された。
＜実施例１、比較例１～２＞
　ロンガム種ＢＢ５３６株の菌末及びブレーベ種Ｍ－１６Ｖ株の菌末の両方を配合していることが分かっている粉ミルク製品を用意した。
　培地として、馬脱繊血液入りのＢＬ寒天培地（従来、コロニー形状による区別が可能な培地とされている培地）、ＲＣＡ培地（２株のビフィズス菌のコロニーが形成することが知られている培地）、下記の基礎培地にＬ－アラビノースを２％添加した培地（本発明培地）、の３種を用いて、前記粉ミルク製品中の各菌種の生菌数を、試験例１と同様に測定した。ただしＢＬ培地のみ、混釈法ではなく塗沫法により培養を行った。
　基礎培地：培地１０００ｍＬ中に、２．５ｇの酵母エキス、８．２ｇの肉エキス、８．２ｇのペプトン、４．１ｇの塩化ナトリウム、４．１ｇの酢酸ナトリウム、０．４１ｇのＬ－システイン塩酸塩、及び１５ｇの寒天を含む基礎培地。
　ＢＬ培地を用いた例では、前記ＢＬ培地上に生育させたコロニーの形状、検鏡により、ロンガム種とブレーベ種を分離して計測した。その合算値を２種合計の生菌数値として表示した。
　ＲＣＡ培地、及び本発明培地を用いた例では、生育して得られたコロニー数から生菌数を計測した。
　なお、表７中、「－」は、コロニーの大きさが０．２ｍｍ未満であったためカウントしなかったものを示す。また、表７中、「％」は「質量％」を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７による結果に示すとおり、本発明の培地を用いて測定された生菌数値は、馬脱繊血液入りのＢＬ培地を用いて測定されたロンガム種の生菌数値と同等であった。よって、本発明の培地を用いることで、ロンガム種のみを識別して、その生菌数値を測定でき、その生菌数値も前記ＢＬ培地を用いた場合とほぼ同程度の正確な値であることが示された。
　一方、ＲＣＡ培地を用いて測定された生菌数値は、馬脱繊血液入りのＢＬ培地を用いて測定されたロンガム種及びブレーベ種の合計の生菌数値と同等であった。よって、ＲＣＡ培地を用いた場合、ロンガム種、及びブレーベ種の生菌数を区別することができなかった。
　本発明によれば、ビフィズス菌を含有する被検菌から、ロンガム種のみの生菌数を、特定の培養法を用いることにより容易に測定できる測定方法、及び前記測定方法用の選択培地として有用で、且つ調製も容易な培地を提供できる。

Claims (8)

  1. 　培地を用いてビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する被検菌からビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum）に属する微生物のみの生菌数を測定する方法であって、前記培地が以下の１）～３）を満たすこと、及び前記生菌数の測定が前記培地に形成される直径０．７ｍｍ以上のコロニーを計測することを特徴とする方法：
    　１）糖源としてＬ－アラビノースのみを含有する、
    　２）窒素源としてペプトン、肉エキス、及び酵母エキスを含有する、
    　３）硫酸マグネシウム、及び硫酸マンガンのいずれも含有しない。
  2. 　前記培地中の前記Ｌ－アラビノースの濃度が、培地の総質量に対し、２～３質量％である請求項１に記載の方法。
  3. 　前記培地中の前記ペプトンの含有量が、培地１０００ｍＬ中、６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ、前記肉エキスの含有量が６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ、及び前記酵母エキスの含有量が１．８～４．２ｇ／１０００ｍＬである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムに属する微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム・ＢＢ５３６株である請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記被検菌が、前記ビフィドバクテリウム属に属する微生物として、前記ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムに属する微生物と、
    ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）に属する微生物、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）に属する微生物、及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）に属する微生物からなる群から選択される少なくとも１種の微生物と、を含有する請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記ビフィドバクテリウム・ブレーベに属する微生物が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ・Ｍ－１６Ｖ株である請求項５に記載の方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載された方法に用いられるビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する被検菌からビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムに属する微生物のみの生菌数を測定するための培地。
  8. 糖源としてＬ－アラビノースのみを含有し、前記Ｌ－アラビノースの濃度が、培地の総質量に対し、２～３質量％であり、
    培地１０００ｍＬ中、酵母エキスを１．８～４．２ｇ／１０００ｍＬ、肉エキスを６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ、及びペプトンを６．０～１４．０ｇ／１０００ｍＬ含有してなる請求項７に記載の培地。
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