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WO2019215873A1 - 生菌数の測定方法 - Google Patents

生菌数の測定方法 Download PDF

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WO2019215873A1
WO2019215873A1 PCT/JP2018/018132 JP2018018132W WO2019215873A1 WO 2019215873 A1 WO2019215873 A1 WO 2019215873A1 JP 2018018132 W JP2018018132 W JP 2018018132W WO 2019215873 A1 WO2019215873 A1 WO 2019215873A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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bacteria
medium
bifidobacterium
breve
viable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/018132
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直子 野村
正達 武藤
宮内　浩文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Original Assignee
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morinaga Milk Industry Co Ltd filed Critical Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority to JP2020517701A priority Critical patent/JP7084474B2/ja
Priority to PCT/JP2018/018132 priority patent/WO2019215873A1/ja
Publication of WO2019215873A1 publication Critical patent/WO2019215873A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • This technique relates to a method for measuring the viable count of Bifidobacterium, and a medium used for the method.
  • Bifidobacterium genus bacteria live a lot in the intestinal tract before weaning, and contribute to maintaining the intestinal environment of the infant well. It is considered.
  • Known physiological functions of bifidobacteria include an intestinal infection-protecting action on a host, an immune function-enhancing action, nutrition, an intestinal decay-inhibiting action, and the like. Focusing on the usefulness of bifidobacteria as described above, adding bifidobacteria to infant formula and administering the formulated bifidobacteria to humans prevents infections or promotes treatment of allergic diseases It has been devised. In addition to bifidobacteria, lactic acid bacteria are also expected to have a probiotic effect.
  • probiotic effects When probiotic effects are expected for bifidobacteria and / or lactic acid bacteria, the probiotic effects often depend on the bacterial species or strain used. For this reason, probiotic products (for example, bacterial powders, foods and drinks, feeds, etc.) added by selecting one or more bacterial species or strains capable of expressing the expected effect from bifidobacteria and / or lactic acid bacteria are added. It is manufactured and commercially available (see Table 1 of Non-Patent Document 1). For example, products with Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum subspecies longum, Bifidobacterium longum subspecies Infantis) added to food as Bifidobacterium are often marketed. There are also products that use Bifidobacterium breve.
  • a method in which a medium in which sterile defibrinated blood is added to a BL agar medium is used to measure Bifidobacteria belonging to multiple bacterial species from the shape of colonies formed by smear culture. .
  • a medium containing only L-arabinose as a sugar source the viable count of Bifidobacterium longum, subspecies longong only from a test sample containing a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium has been proposed (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 it is known that Bifidobacterium longum subspecies Infantis M-63 has high streptomycin resistance.
  • Bifidobacterium longum sub-species Infatis and Bifidobacterium longum sub-species longum in BL agar medium supplemented with sterile defibrinated blood Specifically described below.
  • Bifidobacterium longum sub-species longum has a yellowish brown, hemispherical bulge with a smooth colony shape in a sterile defibrinated blood-added BL agar medium; in Bifidobacterium breve , Raised in a perfect circle, hemisphere, smooth on the surface and periphery, milky brown with a central brownish brown to brownish color; Bifidobacterium longum In Subspecies Infantis, it has a round shape, a hemispherical shape, a milky brown colony shape with a light brown color in the center.
  • a more uniform measurement result is desired without being influenced by the experience of the measurer or individual differences.
  • aseptic defibrosis distinguishes Bifidobacterium longum subspecies longum, Bifidobacterium longum subspecies infantis and Bifidobacterium breve from colony shape
  • Aseptic defibrinated blood is not readily available.
  • the main object of the present technology is to provide a method for measuring the viable count of a specific bifidobacteria that is simple and accurate from a specimen containing one or more types of bacteria.
  • the present inventors have used a medium in which the basal medium composition is adjusted to a high osmotic pressure. It was found that the viable count of only breve (hereinafter also referred to as “Bifidobacterium breve” or “breve”) can be measured. Furthermore, the present inventors use a medium containing streptomycin in the basal medium composition, so that even if the subject has multiple types of Bifidobacteria, Bifidobacterium longum subspecies -It was found that the viable count of only Infantis (hereinafter also referred to as "Bifidobacterium longum subspecies Infantis" or "Infantis”) can be measured.
  • the present inventors can increase the number of viable Bifidobacterium breve and The inventors have found that the viable count of Bifidobacterium longum subspecies infantis can be selectively and easily measured with high accuracy, and have completed the present invention as follows.
  • [1] A method for measuring the viable count of Bifidobacterium breve from a specimen containing one or more types of bacteria, A culture step of culturing the subject using a hyperosmotic medium; A determination step of identifying a colony formed on the medium as a Bifidobacterium breve.
  • [2] The method according to [1] above, wherein the osmotic pressure of the high osmotic pressure medium is 890 mOsm or more.
  • the hyperosmotic medium contains at least salts and / or saccharides.
  • the viable count of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum subspices infantis is measured from a specimen containing one or more types of bacteria by the following (A) and (B) And how to (A) a step of measuring the viable count of Bifidobacterium breve by the method of measuring the viable count of Bifidobacterium breve according to any one of [1] to [5]; (B) Using a streptomycin-containing medium for a specimen containing one or more types of bacteria, the colonies formed are counted as Bifidobacterium longum subspecies infants, and the number of viable bacteria is determined by the dilution factor.
  • One or more kinds of bacteria contained in the subject are a group consisting of Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum subspecies infantitis and Bifidobacterium longum subspecies longum
  • a hyperosmotic medium composition for measuring the viable count of Bifidobacterium breve [10] The medium composition according to [10] above, wherein the osmotic pressure of the hyperosmotic medium composition is 890 mOsm or more.
  • the present technology it is possible to provide a method for measuring the number of viable bacteria of a specific bifidobacteria that is simple and accurate from a specimen containing one or more types of bacteria.
  • the effect described here is not necessarily limited, and may be any effect described in the present technology.
  • Method for measuring the viable count of Bifidobacterium breve> This technique is a method for measuring the viable count of Bifidobacterium breve from a specimen containing one or more types of bacteria, A culture step of culturing the subject using a hyperosmotic medium; And a determination step for identifying colonies formed in the medium as Bifidobacterium breve.
  • the specimen used in the present technology is not particularly limited as long as it contains one or more types of bacteria (test bacteria).
  • test bacteria for example, food and drink (for example, fermented milk, bacterial powder, confectionery, beverage, health food, functional food, functional display food, food for specified health use, infant formula, etc.), products such as pharmaceuticals and livestock feed, Examples include products obtained by subjecting products to processing such as pulverization and dilution with a diluent. From the viewpoint of the necessity of quality control, a product in which the number of viable bacteria is prepared is preferable, for example, a food or drink or a pharmaceutical product is preferable.
  • Products such as foods and health foods to which the method for measuring the viable cell count of the present technology can be applied are not particularly limited as long as they are bacteria-containing products.
  • useful bacteria such as bifidobacteria and / or lactic acid bacteria are mixed. Examples include foods and health foods. More specific examples of products containing the useful bacteria include infant formula, infant formula, fermented milk, beverages and foods that contain or do not contain milk components, bacterial powder, chocolate, tablets, Capsules, sachets and the like can be mentioned.
  • Gram positive bacteria are suitable for one or more types of bacteria to which the viable cell count according to the present technology can be applied.
  • the present technology is preferably a useful bacterium that can be used for food and drink from the viewpoint that it can be used for the presence or absence of Bifidobacterium breve in the product or for measuring and displaying the number of viable bacteria.
  • useful bacteria are found in commercially available products, useful bacteria that are preserved as culture collections at microorganism preservation institutions, useful bacteria that are preserved as trustees at international depositories under the Budapest Treaty, and will be found in the future Useful bacteria etc. are mentioned.
  • useful gram positive bacteria are preferable among the bacteria used as the test bacteria of the present technology, and among these, bifidobacteria and / or lactic acid bacteria are preferable from the viewpoint of display recommendation or display obligation of viable bacteria. Further, it is preferable that the bacterium that is the test bacterium of the present technology is Bifidobacterium, from the viewpoint that the present technology can easily determine the presence or absence of breve and can accurately measure the number of viable bacteria.
  • the Bifidobacterium genus bacteria (hereinafter also referred to as “Bifidobacterium”) to which the viable cell count measurement according to the present technology can be applied are not particularly limited, but a more specific example of the Bifidobacterium is Bifidobacterium.
  • Bifidobacterium Bifidobacterium breve (hereinafter also referred to as “breve”); Bifidobacterium bifidum; Bifidobacterium animalis; Bifidobacterium adolescentis, etc.
  • the bifidus bacteria including a plurality of types may be measured as test bacteria, desirable.
  • Bifidobacterium longum (hereinafter also referred to as “Bifidobacterium longum”) and Bifidobacterium containing Bifidobacterium breve are to be measured as test bacteria. It is desirable from the viewpoint of simplicity of measurement and accuracy.
  • Bifidobacterium longum include Bifidobacterium longum sub-species longum and Bifidobacterium longum sub-species Infantis.
  • the lactic acid bacteria to which the viable cell count measurement according to the present technology can be applied are not particularly limited, bacteria of the genus Lactobacillus, Lactococcus, and Streptococcus are preferable. More specific examples of the lactic acid bacteria include Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus obagaserri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus acidophilus (Lactobacillus acidophilus), Lactobacillus cilbulgaricus (Lactobacillus bulgaricus), Lactobacillus salivarius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum), (Lactobacillus jensenii), Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus reuteri Lactobac
  • the present technology when using the hyperosmotic medium and / or the streptomycin-containing medium of the present technology, (1) Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum subspices infantis covered. Or (2) Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum subspecies Infantis and Bifidobacterium longum subspecies longum as test bacteria It is preferable from the viewpoint of simplicity of measurement and accuracy.
  • the present technology has an advantage that the number of each of these two or three types of viable bacteria can be measured more easily and accurately.
  • Bifidobacterium longum NITE BP-02621 also known as BB536 or Bifidobacterium longum subsp.
  • Longum ATCC [2] Bifidobacterium infantis NITE BP-02623 (also known as M-63 or Bifidobacterium longum subsp.
  • BB536, M-63, and M-16V are included in products sold by Morinaga Milk Industry Co., Ltd. It is desirable to use the measurement method of the present technology for a product containing one or more such bacteria. It is also possible to collect BB536, M-63, and M-16V from commercially available products.
  • One or more selected from the group consisting of -02622 are those that are used as useful bacteria in the product and using this technology, it is simple and accurate. From the viewpoint of measuring each viable count, it is preferable.
  • Bifidobacterium longum BB536 (NITE BP-02621) is an independent administrative agency, National Institute for Product Evaluation Technology, Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) -5-8 Room 122) was deposited on January 26, 2018 under the deposit number NITE BP-02621 under the Budapest Treaty.
  • Longum ATCC BAA-999 No .: ATCC BAA-999
  • ATCC BAA-999 which is the same bacterium, is available as ATCC BAA-999 from the American Type Culture Collection (ATCC) (see, for example, JP-A 2012 -223134 etc.).
  • BCCM LMG 23728 (number: BCCM / LMG 23728), which is the same bacterium, is available as BCCM / LMG 23728 from BELGIAN CO-ORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS (BCCM) (for example, JP, 2012-223134, etc.).
  • BCCM MICRO-ORGANISMS
  • Bifidobacterium breve M-16V NITE BP-02622 is an independent administrative agency, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) (Address: Kazusa Kamaji, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818) No. 2-5-8 122) was deposited on January 26, 2018 under the deposit number of NITE BP-02622 under the Budapest Treaty.
  • the present technology includes a culture process in which the above-described subject is cultured using a medium containing a hyperosmotic medium composition.
  • the “osmotic pressure” of the “high osmotic pressure medium” used in the present technology is the osmotic pressure at the time of [medium composition / 1 L of water] before heating and dissolving the agar powder in the medium.
  • the “high osmotic pressure medium” used in the present technology is a medium medium composition / weight ratio when compared with the osmotic pressure of [medium composition / water 1 L] before heating and dissolving agar powder of a general basal medium.
  • the osmotic pressure at the time of 1 L of water is high. In this technology, this high osmotic pressure is defined as “high osmotic pressure”.
  • a medium composition containing agar and water are mixed to prepare [medium composition / 1 L of water] in which the agar powder is not dissolved by heating;
  • the osmotic pressure of [medium composition / 1 L of water] in which the powder is not dissolved by heating is measured with an osmotic pressure measuring device.
  • the water temperature at the time of preparation may be a temperature at which the agar powder is not dissolved by heating, and is, for example, about 5 to 50 ° C.
  • the osmotic pressure device include an advance osmometer 3250 (freezing point osmometer: Advance).
  • the osmotic pressure of a general basal medium is 400 to 600 mOsm when the agar powder is prepared in [medium composition / 1 L of water] without dissolving it by heating.
  • the high osmotic pressure medium of the present technology is preferably 890 mOsm or more when the osmotic pressure is [medium composition / water 1 L].
  • the osmotic pressure is more preferably 950 mOsm or more, and further preferably 1050 mOsm or more.
  • the upper limit when the osmotic pressure is [medium composition / water 1 L] is preferably 1450 mOsm or less, more preferably 1350 mOsm or less. Further, the range for the osmotic pressure [medium composition / water 1 L] is preferably 890 to 1350 mOsm from the viewpoint that colonies of only breve can be formed and the survival rate of the breve is high.
  • the high osmotic pressure adjusting component used in the high osmotic pressure medium composition of the present technology is not particularly limited as long as it is a substance that can increase the osmotic pressure.
  • salts for example, inorganic salts, organic salts, etc.
  • saccharides for example, Monosaccharides / oligosaccharides, reduced products thereof
  • amino acids / peptides organic acid salts, and the like.
  • the high osmotic pressure adjusting component of the present technology is preferable because a water-soluble substance is easy to work, dissolve and adjust the osmotic pressure.
  • the salts generally used for a culture medium are preferable.
  • an anion salt formed with any acidic group for example, halogen, carboxyl
  • a cation salt formed with any basic group for example, alkali metal, amino
  • the salt may be either an inorganic salt or an organic salt. Examples of the salts include metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, and salts with organic acids. .
  • examples of the metal salt include alkali metals (for example, sodium and potassium), alkaline earth metals (for example, calcium and magnesium), zinc, copper, iron and aluminum. More specific examples of the halogen include chlorine, bromine, and fluorine.
  • alkali metal salts and alkaline earth salts are preferable from the viewpoint of easy adjustment of osmotic pressure, and alkali metal halide salts (for example, sodium chloride and potassium chloride) are preferable from the viewpoint of water solubility.
  • alkali metal halide salts for example, sodium chloride and potassium chloride
  • One or more types can be selected from the group of these salts.
  • organic acid used as a high osmotic pressure adjustment component by this technique
  • the organic acid etc. of a citric acid circuit system are mentioned.
  • the organic acid include pyruvic acid, lactic acid, acetic acid, oxaloacetic acid, citric acid, isocitric acid, oxalosuccinic acid, ⁇ -ketoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, and the like.
  • the inorganic acid used in the present technology is not particularly limited.
  • examples of the inorganic acid include nitric acid, sulfuric acid, and phosphoric acid.
  • One or more kinds can be selected from the group of these organic acids and / or inorganic acids, and these organic acids and / or inorganic acids may form a cation salt or an anion salt by adjusting the pH.
  • amino acids and peptides used as the high osmotic pressure adjusting component in the present technology are not particularly limited.
  • the amino acids include alanine, arginine, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, phenylalanine, tyrosine and the like.
  • Peptides include those in which these amino acid residues are the same or different and have about 2 to 10 peptide bonds.
  • One or more types can be selected from the group of these amino acids and peptides, and these may form a cation salt or an anion salt by adjusting the pH.
  • the saccharide used as the high osmotic pressure adjusting component in the present technology is not particularly limited, and examples thereof include monosaccharides and oligosaccharides, and reduced products thereof (such as sugar alcohols).
  • the monosaccharide may be either aldose or ketose, and may be an amino sugar, deoxy sugar, or uronic acid in which the OH group of the sugar is an amino group, deoxy group, or carbonyl group in addition to a neutral sugar.
  • neutral sugars include aldose such as glyceraldehyde, erythrose, threitol, xylose, ribose, arabinose, glucose, galactose, mannose, and ketose such as fructose.
  • amino sugars examples include glucosamine and galactosamine; deoxy sugars such as fucose and rhamnose; and uronic acids such as glucuronic acid and galacturonic acid.
  • sugar alcohols of these reduced products may be used, and examples thereof include sorbitol (glucositol), galactitol, mannitol, gluconic acid and the like.
  • the oligosaccharide include maltooligosaccharide (for example, maltose), isomaltoligosaccharide, fructooligosaccharide, galactooligosaccharide, mannan oligosaccharide, sucrose, lactose, raffinose and the like.
  • Disaccharides to tetrasaccharides are preferred.
  • reducing oligosaccharides of these reduced products may be used, and examples thereof include reduced maltose (maltitol).
  • glucose-containing products for example, isomerized sugar, starch syrup, starch hydrolyzate, etc.
  • monosaccharides and oligosaccharides may be used as saccharides.
  • One or more types can be selected from the group of these saccharides.
  • the high osmotic pressure medium of the present technology preferably contains at least salts and / or saccharides from the viewpoint of easy adjustment of the osmotic pressure.
  • the salt content in the medium is preferably 11 to 30 g / medium 1 L, and more preferably 15 to 25 g / medium 1 L.
  • the saccharide content in the medium is preferably 130 to 220 g / L of medium, and more preferably 140 to 190 g / L of medium.
  • these amounts can be adjusted so as to achieve the above-described suitable high osmotic pressure.
  • the production method of the hyperosmotic medium composition used in the hyperosmotic medium of the present technology is not particularly limited.
  • the osmotic pressure may be increased by adding the above-described hyperosmotic pressure adjusting component to the basic medium composition. It is preferable to obtain a hyperosmotic medium composition by adjusting.
  • the basal medium composition used by this technique should just be generally used as a medium composition in which bacteria can grow.
  • a basal medium composition for lactic acid bacteria and / or bifidobacteria in which lactic acid bacteria and / or bifidobacteria can grow is preferable, and commercially available products can be used as the basal medium composition.
  • an arbitrary medium component of the basal medium composition an arbitrary antibiotic may be added within a range that does not affect the number of colonies and the number of viable bacteria of the target bacterial species.
  • a basal medium composition for bifidobacteria is further preferable. Since it is for bifidobacteria, the viable count of breve of this technology can be measured more accurately.
  • components that can be used in a basic medium composition for Bifidobacterium include nitrogen sources such as yeast extract, meat extract, pefton; sodium salts such as sodium chloride, sodium acetate, sodium propionate, and L-cysteine. Salts such as hydrochloride, phosphate, sulfate and the like; sugar sources such as glucose, starch, sucrose, raffinose, galactose, and the like can be used, and one or more of these can be used.
  • the product or culture medium composition marketed as a basic medium composition for bifidobacteria examples include TOS propionate agar medium composition (hereinafter also referred to as “TOS agar medium composition”), enhanced Clostridium agar medium composition (hereinafter also referred to as “RCM agar medium composition”), and the like. Is mentioned. Among these, the TOS agar medium composition and the RCM agar medium composition are preferable.
  • the “medium composition” may be a medium component before solidification or a solidified medium, but unless otherwise specified, is a medium component before solidification.
  • components such as agar powder
  • a hyperosmotic medium for determination of each species of Bifidobacterium and the number of viable bacteria can be obtained.
  • the adjusted high osmotic pressure medium composition can be sterilized by heating and injected into a petri dish or the like to prepare a high osmotic pressure medium.
  • the agar powder is blended in the medium so that it becomes 1 to 3% (about 1.5%) in the finally obtained medium.
  • a hyperosmotic medium composition for measuring the viable count of Bifidobacterium breve can be provided.
  • the high osmotic pressure medium composition of the present technology is preferably 890 mOsm or more from the viewpoint of easily measuring the viable count of Bifidobacterium breve.
  • the osmotic pressure is preferably set in the range of mOsm described above.
  • the hyperosmotic medium composition of the present technology preferably uses each component of the hyperosmotic medium composition described above, and preferably contains at least salts and / or saccharides.
  • the culture process of this technique can be implemented using the culture method (solid culture method) performed with an agar medium.
  • the method includes: diluting the suspension with a stepwise dilution to obtain each dilution. Incubate each dilution using agar medium. The number of colonies formed in this agar medium is counted. The number of colonies formed at this time corresponds to the number of viable microorganisms contained in the dilution. Therefore, the number of viable bacteria contained in the diluted solution is obtained from the value of the number of colonies and the dilution rate.
  • the dilution ratio of the diluted solution so that the total number of colonies is 30 to 300 / medium and the total area is 60 cm 2 . From the number of viable bacteria in the suspension thus obtained and the amount of the sample contained in the suspension, the number of viable bacteria contained in the sample (CFU / g) is obtained.
  • a commonly used diluent can be used as a solution for diluting the suspension.
  • the general diluent include 0.85% physiological saline, 0.1% peptone-added physiological saline, Mitsuoka buffer, buffered peptone water, and the like.
  • an anaerobic specimen diluent described in the Food Sanitation Inspection Guidelines is recommended for the diluent.
  • the anaerobic specimen dilution solution was KH 2 PO 4 : 4.5 g, Na 2 HPO 4 : 6.0 g, L-cysteine HCl ⁇ H 2 O: 0.5 g, Tween 80: 0.5 g, agar: 1.0 g
  • Purified water a liquid consisting of 1,000 mL and widely used for detecting anaerobic bacteria present in the intestinal flora.
  • the anaerobic specimen diluent may be used as a primary diluent and 0.85% saline may be used as a secondary diluent.
  • the culture method includes a pour method, a plate smear method, and a spiral method.
  • the pour method is a method in which an appropriately diluted suspension is mixed with an agar medium that has been dissolved by heating, solidified by cooling, and cultured.
  • the plate smearing method is a method in which an appropriately diluted suspension is smeared on an agar medium and cultured.
  • the spiral method is a method in which a test sample is plated with a concentration gradient using an instrument or the like. Of these, the plate smearing method and the pour method are preferable, and the pour method is more preferable.
  • agar medium used for the culture and the culture conditions can be used according to the microorganism to be measured.
  • the microorganism to be measured can grow as the agar medium. It may be anything.
  • the colony count is mainly performed after anaerobic culture at 37 ° C. for 72 hours.
  • a colony formed in or on the hyperosmotic medium is identified as a breve.
  • the breve can be preferentially colonized. For this reason, this technique can measure the presence or absence (that is, identification) and presence of viable bacteria from the number of colonies formed.
  • Total viable count (CFU / product 1 g) dilution ratio ⁇ total number of colonies formed in or on the medium / ml of application / measured weight of product.
  • the number of colonies is preferably 30 to 300 per total area of 60 cm 2 of medium.
  • a partial area of the medium may be arbitrarily set, and the total number of colonies in the total area of the medium may be calculated based on the total number of colonies in the area and the area ratio of (partial area / total area).
  • Method for measuring the number of viable bacteria of Bifidobacterium longum, Subspecies Infantis a specimen containing one or more types of bacteria is measured using a streptomycin-containing medium, and the formed colonies are measured as Bifidobacterium longum subspecies infantis, and the viable bacteria are determined by the dilution factor. By including the determination step of calculating the number, it is possible to provide a method for measuring the number of viable bacteria of Infantis. By using the streptomycin-containing medium of the present technology, even when using a specimen containing one or more types of bacteria, Bifidobacterium longum subspecies Infantis and other bacterial species Can be easily and accurately distinguished.
  • streptomycin-containing medium used in the present technology is preferably a mixture of the above-described basal medium composition and streptomycin. Thereby, the viable count of Bifidobacterium longum subspecies infantis can be selectively measured preferentially.
  • the streptomycin content in the streptomycin-containing medium is preferably 50 mg / medium 1 L or more, more preferably 60 mg / medium 1 L or more, as a lower limit, in order to form colonies of only Infantis with high accuracy.
  • the upper limit value of the streptomycin content in order to easily form a colony of Bifidobacterium longum subspices infantis, it is preferably 2000 mg / medium 1 L or less, more preferably 1700 mg / medium 1 L or less, More preferably, it is 1500 mg / liter of culture medium or less.
  • the range of the streptomycin content is more preferably 50 to 2000 mg / medium 1 L, further preferably 60 to 1700 mg / medium 1 L, and more preferably 60 to 1500 mg / medium 1 L.
  • the present inventors have found that Infantis can colonize even in a wide range of streptomycin concentrations. For this reason, in the present technology, it is easy to adjust the concentration of streptomycin in the medium, so that the measurement results can be easily homogenized.
  • the method for measuring viable bacteria of Bifidobacterium longum subspecies infantis of the present technology is the same as the above-described method for measuring the viable count of breve except that a medium composition containing streptomycin is used.
  • the culturing step and the determination step are performed, and the viable cell count of Bifidobacterium longum subspices infantis can be measured.
  • This technique can determine the number of colonies formed using a streptomycin-containing medium as the number of Bifidobacterium longum subspecies infantis and the number of viable bacteria without observing the morphology of special colonies. For this reason, even when the skill level is low, identification of Infantis and the number of viable bacteria can be measured easily and accurately. Moreover, since this technique has little influence by a measurement person's skill level or an individual difference, it can also make a measurement result more uniform. Furthermore, as described later, it is preferable to perform a method using a hyperosmotic medium and a method using a streptomycin-containing medium in the same subject because the number of each type of viable bacteria can be measured easily and accurately.
  • a streptomycin-containing medium composition for measuring the viable count of Bifidobacterium longum subspecies infantis can be provided.
  • a subject containing one or more types of bacteria is subjected to the following measuring methods or measuring steps (1) and (2); (1) Using a hyperosmotic medium, count the formed colonies as Bifidobacterium breve and measure the number of viable bacteria; and (2) Use the streptomycin-containing medium to Each of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum subspecies infantis by measuring as viable bacteria longum subspecies infantis and measuring viable counts It is possible to provide a method for measuring the number of viable bacteria. The above ⁇ 1.
  • the description of the configuration common to the method for measuring the viable count of Bifidobacterium longum, subspecies, and infantis> (for example, the subject and the basal medium composition) is omitted.
  • the hyperosmotic medium of the present technology By using the hyperosmotic medium of the present technology, only Bifidobacterium breve can be preferentially identified even when using a specimen containing multiple or multiple types of bacteria. The viable count of the Bifidobacterium breve can be easily and accurately measured. Furthermore, by using the streptomycin-containing medium of the present technology, only Bifidobacterium longum subspices infantis is given priority even when using a specimen containing one or more types of bacteria. And the viable cell count of the Bifidobacterium longum subspecies infantis can be easily and accurately measured. In the case of this combination, it is preferable to use the same subject because the number of each type of viable bacteria can be measured easily and accurately. This combination allows the technology to specifically distinguish Bifidobacterium breve and / or Bifidobacterium longum subspices infantis and more accurately count each viable cell count. It can be measured easily.
  • this technology is less affected by the skill level of the measurer and individual differences, so the measurement results of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum subspices infantis can be homogenized. .
  • the use of image analysis or the like is advantageous from the standpoint that colony determination can be automated and calculation of the number of viable bacteria in a subject can be automated.
  • a subject containing one or more types of bacteria is measured using the following measuring steps or measuring methods (1) to (3); (1) Using a high osmotic pressure medium, measuring the formed colonies as a breve and measuring the number of viable bacteria; (2) Using a streptomycin-containing medium, the formed colonies are counted as Bifidobacterium longum subspecies Infantis to determine the number of viable bacteria; (3) (i) Using a BL agar medium without the addition of sterile defibrinated blood, the Bifidobacterium longum subspecies longum colony formed is designated as Bifidobacterium longum subspecies longum.
  • the basal medium described above preferably a basal medium for bifidobacteria
  • the types of bacteria contained in the subject are preferably two types, Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum.
  • Bifidobacterium longum Bifidobacterium longum subspecies infants and Bifidobacterium longum subspecies longum are preferable.
  • three types of Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum subspecies Infantis and Bifidobacterium longum subspecies longum are more preferable.
  • basal medium preferably basal medium for bifidobacteria
  • the total number of colonies formed is counted as all bacteria, and the number of viable bacteria of all bacterial species is measured. Furthermore, the number of viable bacteria of Bifidobacterium longum, subspices and longum is calculated by subtracting the result of the number of viable bacteria using each medium of (1) and (2) from the total number of colonies. can do.
  • the number of colonies formed using a normal medium can be determined as the number of viable bacteria of all bacterial species without observing the morphology of special colonies.
  • the hyperosmotic medium and the streptomycin-containing medium of the present technology finally, even when the skill level is low, the identification and production of Bifidobacterium longum, subspices, longum can be performed easily and accurately.
  • the number of bacteria can be measured.
  • this technique has little influence by a measurement person's skill level or an individual difference, it can also make a measurement result more uniform.
  • a general basic medium is used in the present technology, it is easy to obtain and a determination medium can be easily produced, so that the measurement results can be easily homogenized.
  • the number of each viable cell is measured in a subject containing Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum subspecies Infatis and Bifidobacterium longum subspecies longum.
  • Bifidobacterium breve Bifidobacterium longum subspecies Infatis
  • Bifidobacterium longum subspecies longum Bifidobacterium longum subspecies longum.
  • BL agar medium supplemented with sterile defibrinated blood was used.
  • Method for producing a composition containing one or more types of bacteria according to the present technology> As another aspect of the present technology, the above ⁇ 1. Method for measuring the viable count of Bifidobacterium breve>, ⁇ 2. Method for measuring the viable count of Bifidobacterium longum subspecies Infantis>, ⁇ 3. Method for measuring the number of viable bacteria of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum subspices infantis>, or ⁇ 4.
  • Bifidobacterium breve Bifidobacterium longum sub-species Infantitis and Bifidobacterium longum sub-species longum
  • the number of viable bacteria It is also possible to provide a method for producing a composition containing the bacterium. The above ⁇ 1. Method for measuring the viable count of Bifidobacterium breve> to ⁇ 4. Method for measuring the number of viable bacteria of Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum sub-species Infantitis and Bifidobacterium longum sub-species longong> Omitted.
  • composition in the production method of the composition of the present technology is not particularly limited as long as it is a composition that can be used for the subject of the present technology, and may be a product or a prototype.
  • any of food and beverage composition, pharmaceutical composition, feed composition, etc. may be used, but the above ⁇ 1.
  • a method described in “Method of measuring viable count of breve”> [subject] is preferable.
  • the method for producing a composition of the present technology is a method for producing a composition containing one or more types of bacteria, and (1) ⁇ 1. Method for measuring the viable count of Bifidobacterium breve>, ⁇ 2 Method for measuring the viable count of Bifidobacterium longum subspices infantis>, ⁇ 3. Method for measuring the number of viable bacteria of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum subspices infantis>, or ⁇ 4.
  • Method for measuring the number of viable bacteria of Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum sub-species Infantitis and Bifidobacterium longum sub-species longong> Viable count of at least one of Measuring the number of viable bacteria of each bacterial group (may be each bacterial group) in the composition to be tested using the measurement method according to the above; the viable bacteria of each bacteria in the measured composition Based on the number, including the step of adjusting and designing the amount of each bacterium in the composition to achieve the target viable count, Based on the design of the amount of each bacterium, it is preferable to obtain a composition containing the one or more types of bacteria.
  • the measuring step of the viable cell count of (1) above is ⁇ 1.
  • the viable cell count measurement step of (1) described above ⁇ 1.
  • the composition to be the subject is one type or a plurality of types, and in the case of a plurality of types, it is preferable that the same lot, the production time are the same period, and the production raw materials are the same.
  • the target viable count may be one type or a plurality of types.
  • the target viable cell count is not particularly limited, and can be set arbitrarily by the manufacturer, and is the viable cell count added to the composition at the time of manufacture.
  • the target viable cell count the viable cell count set as the standard at the time of production; the viable cell count immediately after production minus the viable cell count at the time of production storage is corrected to compensate for the decrease in the viable cell count. Examples include the number of bacteria.
  • test bacteria of the present technology are not particularly limited, but are preferably Bifidobacterium, more preferably Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum, still more preferably Bifidobacterium breve, There are two or three types selected from Fidobacterium longum subspecies infantis and Bifidobacterium longum subspecies longum.
  • the survival rate of one type of bacteria or each of the plurality of types of bacteria in the composition changes with time. For this reason, in the quality control of the composition containing bacteria, it is also necessary to take measures to adjust the compounding amount and the bacteria ratio of each bacteria, assuming this change when stored for a long period of time. In the present technology, it is possible to more accurately adjust the blending amount and blending ratio of such bacteria.
  • the method of measuring the number of viable bacteria using a special component causes a lower survival rate than the true survival rate due to the influence of the special component.
  • the remaining rate is easy to calculate and there is a risk of lack of accuracy.
  • the medium composition of the present technology can reduce the risk.
  • changes in the number of viable bacteria and the percentage of bacteria in the composition due to storage can be monitored and accurately grasped.
  • the monitoring result is fed back to the manufacturing process, and the number of viable bacteria and the proportion of bacteria in the composition in the manufacturing process are adjusted (increased or decreased), whereby the composition after storage for a certain period of time.
  • the number of viable bacteria and the ratio of bacteria can be achieved.
  • the method of the present technology and the result thereof and / or the method of producing the result and the composition the control unit including the CPU of the apparatus, the storage medium (USB memory, HDD, CD, network server, etc.), etc. It can also be stored as a program in the hardware resources provided and realized by the control unit. Further, the present technology may be a program for causing a computer to function as the method of the present technology and / or the result and the method of manufacturing the composition.
  • Example etc. which are demonstrated below show an example of the typical Example of this technique, and, thereby, the range of this technique is not interpreted narrowly.
  • B. longum subsp. Longum BB536 (hereinafter also referred to as “Longham BB536”), B. breve M-16V (hereinafter also referred to as “Breve M-16V”), B. longum subsp. Infantis used in this example.
  • M-63 (hereinafter also referred to as “Infantis M-63”) can be collected from products commercially available from Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
  • Bifidobacterium longum NITE BP-02621 which is the same bacterium as longum BB536, and [2] Bifidobacterium breve NITE BP-02622, which is the same bacterium, as [2] Breve M-16V, [3] Bifidobacterium infantis NITE BP-02623, which is the same bacterium as Infantis M-63, may be used.
  • the osmotic pressure of each medium composition is a value obtained by measuring [medium composition / water 1 L] before dissolving the agar powder with an advanced osmometer 3250 (freezing point osmometer: Advance).
  • “Before dissolution of agar powder [medium composition / water 1 L]” is a mixture of a medium composition containing agar powder before heat sterilization (autoclave sterilization at 100 ° C. or more for 15 minutes) with 1 L of water.
  • “before dissolution of agar powder [medium composition / 1 L of water]” is sterilized by heating in an autoclave.
  • the medium dissolved by heating in an autoclave is poured into a petri dish (1 petri dish; diameter 9 cm) according to the pour method or flat plate smearing method, and solidified by cooling. Culture is performed after solidification, and the number of colonies formed in the petri dish is measured.
  • Example 1 High osmotic pressure medium composition and its adjustment component
  • Example 1-1 Measurement of viable count of breve M-16V (high osmotic pressure component: saccharide)
  • the powder containing cfu / g was prepared and diluted appropriately.
  • a medium (1 L of liquid before dissolution of agar powder) containing a TOS agar medium composition in which sucrose was added at 160.0 g / L and the osmotic pressure was increased to 1084 mOsm was prepared.
  • the cells were cultured on the plate.
  • pour culture was performed using each of these media. After culturing at 37 ° C. for 72 hours in an anaerobic state, the number of colonies formed was measured, and the number of bacteria of the bifidobacteria-containing powder was calculated from the dilution rate.
  • Table 1 shows the number of bacteria per 1 g of a test sample of longum BB536, Breve M-16V, Infantis M-63 obtained using a TOS agar medium supplemented with 160.0 g / L of sucrose, and sucrose. The survival rate was shown in comparison with the number of bacteria determined using a non-TOS agar medium.
  • Example 1-2 Measurement of viable count of breve M-16V (high osmotic pressure component: alkali metal halide salt)]
  • the powder containing cfu / g was prepared and diluted appropriately.
  • the previous liquid 1L) was prepared. Plates using the TOS agar medium supplemented with 20.0 g / L of potassium chloride, the TOS agar medium supplemented with 20.0 g / L of sodium chloride, and the TOS agar medium supplemented with neither potassium chloride nor sodium chloride as controls The pouch was cultured above. For each test sample of each bacterium, pour culture was performed using each of these media.
  • Table 2 shows the number of bacteria per 1 g of the test sample of longum BB536, Breve M-16V, Infantis M-63 obtained using TOS agar medium supplemented with 20.0 g / L of potassium chloride or sodium chloride, and The survival rate compared with the number of bacteria calculated
  • Example 1-1 and Example 1-2 if a method using a hyperosmotic medium composition is used, the breve can be easily and selectively identified, and the viable count of the breve can be measured. . Furthermore, if the method using the hyperosmotic medium composition is used, Breve and Bifidobacterium longum sub-species longum, Bifidobacterium longum sub-species Infantis can be easily distinguished, and The viable count of only breve can be measured. Moreover, since it is made into the high osmotic pressure by making it contain highly, even if it is saccharide
  • the high osmotic pressure adjusting component is not particularly limited as long as it is a substance capable of adjusting the high osmotic pressure, and may be a saccharide or a salt.
  • the state of the osmotic pressure of the medium can also be understood by appropriately measuring the content of the water-soluble high osmotic pressure component contained in the agar medium. For example, it is conceivable to measure the osmotic pressure with a freezing point depression osmometer after pulverizing and stirring with 1 L of agar medium / water.
  • Example 2 Adjustment of osmotic pressure
  • Example 2-1 Measurement of viable count of breve M-16V (range of osmotic pressure)
  • powder containing 1.1 ⁇ 10 7 cfu / g of longum BB536, powder containing 1.4 ⁇ 10 7 cfu / g of Brave M-16V, 6.4 ⁇ 10 6 of Infantis M-63 The powder containing cfu / g was prepared and diluted appropriately.
  • the mixture was cultured on a plate using a TOS agar medium added with 220.0 g / L sucrose and an osmotic pressure increased to 1310 mOsm, and a TOS agar medium without sucrose as a control.
  • the bacterial test sample was subjected to pour culture using each of these media. After culturing at 37 ° C. for 72 hours in an anaerobic state, the number of colonies formed was measured, and the number of bacteria of the bifidobacteria-containing powder was calculated from the dilution rate.
  • Table 3 shows the number of bacteria per 1 g of the test sample of longum BB536, Breve M-16V, Infantis M-63 obtained using TOS agar medium supplemented with 220.0 g / L of sucrose, and sucrose. The survival rate was shown in comparison with the number of bacteria determined using a non-TOS agar medium.
  • Example 2-2 Measurement of breve M-16V viable count (osmotic pressure range)]
  • the powder containing cfu / g was prepared and diluted appropriately.
  • the mixture was cultured on a plate using an RCM agar medium with sucrose added at 150.0 g / L and an osmotic pressure increased to 895 mOsm, and an RCM agar medium without sucrose added as a control.
  • Example 2-1 and Example 2-2 if the osmotic pressure of the medium containing the hyperosmotic medium composition is at least 895 mOSm, Bifidobacterium longum subspecies longum, Bifidobacterium -Since a colony can make undetectable longum subspecies infantitis, a breve can be identified selectively and the viable count of a breve can be measured.
  • the osmotic pressure of the medium containing the hyperosmotic medium composition is up to 1310 mOsm or less, the survival rate of the breve can be ensured, so that the breve can be easily and selectively identified, Numbers can be measured.
  • the osmotic pressure is within the range of 895 to 1310 mOsm, the brebe and Bifidobacterium longum subspecies longum, Bifidobacterium longum subspecies infantis can be easily distinguished, Furthermore, the viable count of only the breve can be measured. Furthermore, from Example 1 and Example 2, if the basal medium composition used for the hyperosmotic medium composition is a commercially available product capable of growing Bifidobacterium, it is easy to use Breve, Bifidobacterium longum subspecies, Longum and Bifidobacterium longum subspecies infantis can be easily distinguished, and the viable count of only breve can be measured.
  • Example 3 Streptomycin-containing medium composition and amount thereof]
  • Example 3-1 Measurement of viable count of Infantis M-63
  • powder containing 9.0 ⁇ 10 6 cfu / g of longum BB536, powder containing 1.1 ⁇ 10 7 cfu / g of Brave M-16V, and 7.3 ⁇ 10 6 of Infantis M-63 The powder containing cfu / g was prepared and diluted appropriately.
  • PTO culture was performed on a plate using a TOS agar medium supplemented with 60.0 mg / L of streptomycin and a TOS agar medium supplemented with no streptomycin as a control.
  • Table 5 shows the number of bacteria per 1 g of the test sample of longum BB536, Breve M-16V, Infantis M-63 and streptomycin obtained using TOS agar medium supplemented with 60.0 mg / L of streptomycin. The survival rate compared to the number of bacteria determined using no TOS agar medium was shown.
  • Infantis M-63 survived 100% in the medium supplemented with 60.0 mg / L of streptomycin, while Longham BB536 and Breve M-16V survived less than 0.4%. It was found that only Infantis M-63 could be detected on the same plate. In addition, if this method is used, Infantis M-63 is contained in Bifidobacteria, such as longum BB536, Brave M-16V, and Infantis M-63. Even in the case of a large proportion of products, only Infantis M-63 and its viable count can be detected accurately.
  • Example 3-2 Measurement of number of viable bacteria of Infantis M-63
  • the powder containing cfu / g was prepared and diluted appropriately. Pour-culture was performed on plates using an RCM agar medium supplemented with 1500.0 mg / L of streptomycin and an RCM agar medium supplemented with no streptomycin as a control. For each test sample of each bacterium, pour culture was performed using each of these media. After culturing at 37 ° C.
  • Table 6 shows the number of bacteria per 1 g of the test sample of longum BB536, Breve M-16V, Infantis M-63 and streptomycin obtained using RCM agar medium supplemented with 1500.0 mg / L of streptomycin. The survival rate compared to the number of bacteria determined using no RCM agar medium was shown.
  • Example 2-1 and Example 2-2 when a medium containing streptomycin was used, Bifidobacterium longum subspecies infantis was easily and selectively identified, and Bifidobacterium ⁇ The viable count of Longham Subspecies Infantis can be measured. Further, if the method using a medium composition containing streptomycin is used, Bifidobacterium longum subspecies Infantis, Bifidobacterium breve and Bifidobacterium longum subspecies longum and Can be easily distinguished, and the viable count of only Bifidobacterium longum, Subspecies Infantis can be measured.
  • the streptomycin concentration of the medium composition is at least 60.0 mg / L, breve and Bifidobacterium longum sub-species longum can be made undetected in colonies. Longum subspecies infantis can be selectively identified and the viable count of Bifidobacterium longum subspecies infantis can be measured. In addition, if the streptomycin concentration of the medium composition is up to 1500.0 mg / L or less, the survival rate of infantis can be ensured, so that Bifidobacterium longum subspecies Infantis can be easily obtained. Can be selectively identified, and the viable count of Bifidobacterium longum subspecies infantis can be measured.
  • Example 4 Storage period in which viable count can be measured]
  • Example 4-1 Measurement of viable count of Brave M-16V stored at 25 ° C for 2 years
  • a powder containing 1.7 ⁇ 10 11 cfu / g of Brave M-16V stored at 25 ° C. for 2 years was prepared and diluted appropriately.
  • the mixture was cultured on a plate using a TOS agar medium added with 160.0 g / L of sucrose and an osmotic pressure increased to 1084 mOsm, and an RCM agar medium without sucrose as a control.
  • pour culture was performed using each of these media. After culturing at 37 ° C.
  • Table 7 shows the number of bacteria per gram of the Brave M-16V obtained using the TOS agar medium supplemented with 160.0 g / L of sucrose, and the RCM agar medium supplemented with no sucrose. The survival rate compared with the number of bacteria was shown. As shown in Table 7, M-16V could be accurately detected even in the brave M-16V stored at 25 ° C. for 2 years.
  • Example 4-2 Measurement of number of viable bacteria of Infantis M-63 stored at 25 ° C. for two and a half years
  • a powder containing 6.7 ⁇ 10 10 cfu / g of Infantis M-63 stored at 25 ° C. for two and a half years was prepared and diluted appropriately.
  • PTO culture was carried out on a plate using a TOS agar medium supplemented with 80.0 mg / L of streptomycin and a TOS agar medium supplemented with no streptomycin as a control.
  • pour culture was performed using each of these media. After culturing at 37 ° C.
  • Table 8 shows the number of bacteria per gram of Infantis M-63 obtained using a TOS agar medium supplemented with 80.0 mg / L of streptomycin, and a TOS agar medium supplemented with no streptomycin. The survival rate compared with the obtained number of bacteria was shown. As shown in Table 8, Infantis M-63 was also accurately detected in Infantis M-63 stored at 25 ° C. for two and a half years.
  • Example 4-1 when the storage period of the product containing the breve is several years, the viable count of the breve can be accurately measured even using the high-pressure osmotic medium of the present technology. From the results of Example 4-2, when the storage period of the product containing Bifidobacterium longum sub-species Infantis extends for several years, the medium containing streptomycin of the present technology can be used even when the medium containing the streptomycin is used. The viable count of Umm Longham Subspecies Infantis can be accurately measured.
  • breve and Bifidobacterium longum subspices infantis are selectively identified by solid culture using a hyperosmotic medium and a streptomycin-containing medium, respectively.
  • the viable count of each of Breve and Bifidobacterium longum subspecies infantis can be measured.
  • using the basic culture medium for the growth of Bifidobacteria measure the total number of viable bacteria consisting of Breve, Bifidobacterium longum subspecies Infantis and Bifidobacterium longum subspecies longum.
  • Example 5 Measurement of individual viable count in powder containing 3 fungi
  • a powder containing Longum BB536, Infantis M-63, and Brave M-16V was used as a test sample and diluted as appropriate.
  • Table 9 shows the number of bacteria of Longham BB536, Infantis M-63, and Brave M-16V per 1 g of the test sample obtained by the following culture methods.
  • the above dilution was subjected to pour culture on a plate using a BL agar medium supplemented with sterile defibrinated blood. Cultured at 37 ° C. for 72 hours under anaerobic conditions, and counted the number of colonies for each bacterial species formed. From the dilution rate, Longham BB536, Breve M-16V, Infantis M-63, The number of bacteria was calculated. The results are shown in Table 9.
  • the number of breve bacteria obtained using a combination of a basic basal medium for the growth of bifidobacteria, a BL agar medium without addition of sterile defibrinated blood, and a medium containing streptomycin is as follows. It was confirmed that the number of bacteria was the same as the number of bacteria detected in the added BL medium.
  • a basic basal medium for growth of bifidobacteria a BL medium without addition of sterile defibrinated blood, a medium containing streptomycin, and a medium containing a hyperosmotic medium composition are used.
  • a medium containing streptomycin a medium containing streptomycin
  • a medium containing a hyperosmotic medium composition it is possible to measure the viable counts of breve, Bifidobacterium longum subspecies infants and Bifidobacterium longum subspices longum. It was confirmed that the number of bacteria was equivalent to that detected in the BL medium supplemented with defibrinated blood.
  • the number of viable bacteria in a product stored for a long time can be measured, so that changes in the number of viable bacteria over time can be monitored. It is also possible to design by adjusting the ratio of the number of viable bacteria at the time of production so as to be the ratio of the number of each viable cell at the time of preservation by monitoring.
  • Bifidobacterium longum NITE BP-02621 (Accession number: NITE BP-02621) (Accession date: January 26, 2018), Contractor: Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818 2-5-8 Room 122, National Institute for Product Evaluation Technology (NPMD).
  • Bifidobacterium breve NITE BP-02622 (Accession number: NITE BP-02622) (Accession date: January 26, 2018), Contractor: Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818 2-5-8 Room 122, National Institute for Product Evaluation Technology (NPMD).
  • NITE BP-02623 (Accession number: NITE BP-02623) (Accession date: January 26, 2018), Contractor: Kazusa, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818 2-5-8, Kamafoot Room 122, National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center (NPMD).

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Abstract

１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、簡便でありながら精度のよい特定のビフィズス菌の生菌数の測定方法を提供すること。　１種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、　前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、　当該培地に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程を含む、方法。

Description

生菌数の測定方法
　本技術は、ビフィドバクテリウム属細菌の生菌数の測定方法、並びに当該方法に使用する培地に関する。
　ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、「ビフィズス菌」ともいう）は離乳前の乳児腸管内に多く生息しており、乳児の腸内環境を良好に維持することに貢献していると考えられている。ビフィズス菌が有する生理的機能として、宿主に対する腸管感染防御作用、免疫機能の増強作用、栄養、腸内腐敗抑制作用等が知られている。上記のようなビフィズス菌の有用性に着目し、育児用粉乳にビフィズス菌を添加すること、並びに、製剤化したビフィズス菌をヒトに投与することで感染症を防ぐこと若しくはアレルギー疾患の治療を促進することが考案されている。また、ビフィズス菌の他、乳酸菌もプロバイオティクス効果が期待されるものである。
　ビフィズス菌及び／又は乳酸菌にプロバイオティクス効果を期待する場合、プロバイオティクス効果は使用する菌種又は菌株に依存することが多い。このため、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌のなかから期待する効果が発現できる菌種又は菌株を１種類又は複数種類選択し添加されたプロバイオティクス製品（例えば、菌末、飲食品や飼料等）が製造され、市販されている（非特許文献１の表１参照）。例えば、食品にビフィズス菌としてビフィドバクテリウム・ロンガム（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス）が添加された製品がよく市販されており、さらにビフィドバクテリウム・ブレーベを併用した製品も存在する。
　そして、近年、消費者が製品成分を直接確認したいという要望が強まっている。このため、製品中に含まれる有用菌の菌種ごとに生菌数を製品に表示しようとする動きがある。また、国によって、製品中に含まれている有用菌について、菌種ごとに生菌数を表示することが、義務化又は推奨されている。
　一方で、複数種類のビフィズス菌の菌種を配合した製品が増えている。このため、簡便でかつ正確な個別のビフィズス菌の菌種ごとの生菌数の同定方法及び測定方法が求められている。
　例えば、ＢＬ寒天培地に無菌脱繊血を添加した培地を使用し、塗抹培養することで形成されたコロニーの形状から、複数菌種のビフィドバクテリウム属細菌を測り分ける方法が知られている。
　また、糖源としてＬ－アラビノースのみを含有する培地を使用して、ビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する被検試料から、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのみの生菌数を測定する方法が提案されている（特許文献１）。
　また、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＭ－６３のストレプトマイシン耐性が高いことが知られている（非特許文献１）。
ＷＯ２０１１／１１８７６５
Antibiotic Susceptibility of Bifidobacterial Strains Distributed in the Japanese Market.(Biosci, Biotechnol, Biochem, Jin-zhong Xiao et al.、２０１０年、第７４号第２巻、３３６－３４２頁)
　ビフィズス菌の菌種ごとの測定方法として、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地を使用しコロニー形状で見分ける方法が知られている。しかし、各菌種のコロニーの見分け方には専門的な知識及び高い熟練度が必要とされる。このため、熟練度が低い者はこれらのコロニー形状の見分けが難しい場合があり、また測定者ごとにばらつきも生じやすい。
　無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地におけるビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのコロニー形成の違いについて、具体的に以下に述べる。無菌脱繊血添加ＢＬ寒天培地において、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムでは、黄褐色、半球状に隆起し、周縁が平滑なコロニー形状となっている；ビフィドバクテリウム・ブレーベでは、正円、半球状に隆起し、表面・周縁とも平滑、乳褐色で中心部淡褐色～茶褐色を呈するコロニー形状となっている；ビフィドバクテリウム・ロンガムのうちさらにビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスでは、正円、半球状に隆起し、乳褐色で中心部淡褐色を帯びたコロニー形状となっている。 
　しかし、菌種及び菌数の品質管理の観点からすると、測定者の経験や個人差等に影響されることなく、より均質化された測定結果が望まれる。
　また、ＢＬ寒天培地において、無菌脱繊血は、コロニー形状からビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ブレーベを見分けるのに必要な成分であるが、無菌脱繊血を容易に入手できない国や地域が存在する。
　このような実情から、無菌脱繊血を使用しなくても、複数種類の菌体を含む被験体から、特定のビフィズス菌の生菌数を簡便に測定できる方法が求められている。
　そこで、本技術は、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、簡便でありながら精度のよい特定のビフィズス菌の生菌数の測定方法を提供することを主な目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、基礎培地組成物を高浸透圧に調整した培地を用いることによって、ビフィズス菌が複数種類存在する被検体であっても、このなかからビフィドバクテリウム・ブレーベ（以下、「ビフィドバクテリウム・ブレーベ」又は「ブレーベ」ともいう）のみの生菌数を測定できることを見出した。
　さらに、本発明者らは、基礎培地組成物にストレプトマイシンを含ませた培地を用いることによって、ビフィズス菌が複数種類存在する被検体であっても、このなかからビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（以下、「ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス」又は「インファンティス」ともいう）のみの生菌数を測定できることを見出した。
　本発明者らは、上述した高浸透圧培地及び／又はストレプトマイシン含有培地を用いることで、被検体にビフィズス菌が複数種類存在する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を選択的に簡便にかつ精度良く測定できることを見出し、本発明を以下のように完成させた。
〔１〕
　１種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、
　前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、
　当該培地上に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程、を含む、方法。
〔２〕
　前記高浸透圧培地の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕
　前記高浸透圧培地が、少なくとも塩類及び／又は糖類を含む、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕
　前記判定工程は、さらに形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出することを含む、前記〔１〕～〔３〕の何れか１つ記載の方法。
〔５〕
　前記被験体が、少なくともビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムの細菌を含むものである、前記〔１〕～〔４〕の何れか１つ記載の方法。
〔６〕
　１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、以下の（Ａ）及び（Ｂ）によって、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定する方法であり、
　（Ａ）前記〔１〕～〔５〕の何れか１つ記載のビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法により、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する工程；
　（Ｂ）１種類又は複数種類の細菌を含む被検体をストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出する判定工程、を含むことにより、前記インファンティスの生菌数を測定する工程；を含む、方法。
〔７〕
　前記ストレプトマイシン含有培地が、ストレプトマイシン６０ｍｇ／Ｌ以上のものである、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕
　前記被験体に含まれる１種類又は複数種類の細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムからなる群から選択される１種又は２種以上である、前記〔６〕又は〔７〕に記載の方法。
〔９〕
　単数又は複数の細菌を含む組成物の製造方法であり、
　前記〔１〕～〔８〕の何れか１つに記載の組成物中の前記細菌の生菌数を測定する方法にて、前記組成物中の各細菌の生菌数を測定する工程、
　前記測定された組成物中の各細菌の生菌数に基づき、前記組成物に対して目的生菌数になるように各細菌の配合量の調整を行う工程を含み、
　前記各細菌の配合量の設計に基づき、前記単数または複数種類の細菌を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
〔１０〕
　ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定するための高浸透圧培地組成物。
〔１１〕
　前記高浸透圧培地組成物の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、前記〔１０〕記載の培地組成物。
　本技術によれば、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、簡便でありながら精度のよい特定のビフィズス菌の生菌数の測定方法を提供することができる。
　なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
　次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞
　本技術は、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、
　前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、
　当該培地に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程、を含む、生菌数の測定方法である。
　〔被検体〕
　本技術に用いる被検体は、１種類又は複数種類の細菌（被検菌）を含むものであれば特に限定されない。例えば、飲食品（例えば、発酵乳、菌末、菓子、飲料、健康食品、機能性食品、機能性表示食品、特定保健用食品、育児用粉乳等）、医薬品、家畜用飼料等の製品、前記製品に対して粉砕、希釈液による希釈等の処理を施した製品等が挙げられる。品質管理の必要性の観点から、生菌数の調製がされている製品が好ましく、例えば、飲食品又は医薬品が好ましい。
　本技術の生菌数測定方法が適用されうる、食品、健康食品等の製品は、細菌を含む製品であれば特に限定されないが、例えば、有用菌であるビフィズス菌及び／又は乳酸菌が配合される食品、健康食品等が挙げられる。当該有用菌が含まれる製品として、より具体的な例を挙げれば、乳児用粉乳、幼児用粉乳、発酵乳、乳成分を含む又は乳成分を含まない飲料や食品、菌末、チョコレート、タブレット、カプセル、サシェット等が挙げられる。
　〔被検体中の細菌〕
　本技術による生菌数測定が適用されうる１種類又は複数種類の細菌は、グラム陽性菌が好適である。本技術は、製品中のビフィドバクテリウム・ブレーベの有無を又はこの生菌数を測定し表示する等に利用できる観点から、飲食品に利用可能な有用菌であることが好ましい。当該有用菌は、市販の製品に含まれる有用菌、微生物保存機関でカルチャー・コレクションとして保存されている有用菌、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関で受託菌として保存されている有用菌、将来見出される有用菌等が挙げられる。
　さらに、本技術の被検菌となる細菌のうち、有用なグラム陽性菌が好ましく、このうちビフィズス菌及び／又は乳酸菌が生菌数の表示推奨又は表示義務の観点から好ましい。さらに本技術の被検菌となる細菌がビフィズス菌であることが、本技術がブレーベの有無を判定し易く、また生菌数を精度よく測定できる観点から、好ましい。
　本技術による生菌数測定が適用されうるビフィドバクテリウム属細菌（以下、「ビフィズス菌」ともいう）は特に限定されないが、当該ビフィズス菌として、より具体的な例を挙げれば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum）；ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis（以下、「インファンティス」ともいう）；ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve（以下、「ブレーベ」ともいう）；ビフィドバクテリウム・ビヒィダム（Bifidobacterium bifidum）；ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）；ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）等が挙げられる。このうち１種類又は複数種類を含むビフィズス菌を被検菌として測定対象とすることが、望ましい。
　本技術において高浸透圧培地を用いる場合、Bifidobacterium longum（以下、「ビフィドバクテリウム・ロンガム」ともいう）及びビフィドバクテリウム・ブレーベを含むビフィズス菌を被検菌として測定対象とすることが、測定の簡便さ及び精度の観点から、望ましい。
　なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムには、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス等が挙げられる。
　本技術において、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム BB-536、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム NCC2705（CNCM I-2618）、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムATCC51870、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ATCC15700、ビフィドバクテリウム・ブレーベ M-16V、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ATCC15700、ビフィドバクテリウム・ブレーベ BP-11175、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス M-63等を用いることが特に好ましい。
　本技術による生菌数測定が適用されうる乳酸菌は特に限定されないが、好適にはLactobacillus属、Lactococcus属、Streptococcus属の細菌である。当該乳酸菌として、より具体的な例を挙げれば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gaserri）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ジェンセニ（Lactobacillus jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）等が挙げられる。
　さらに本技術において、本技術の高浸透圧培地及び／又はストレプトマイシン含有培地を用いる場合、（１）ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの２種類を被検菌とすること、又は（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの３種類を被検菌とすることが、測定の簡便さ及び精度の観点から好適である。本技術は、これら２又は３種類の各生菌数をより簡便に精度良く測定できる利点を有する。
　本技術による生菌数測定が適用されうるビフィズス菌のうち、さらにより好適な具体例として、例えば、　［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２１（別名：ＢＢ５３６又はBifidobacterium longum subsp. longum ATCC BAA-999）；　［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２３（別名：Ｍ－６３又はBifidobacterium longum subsp. infantis BCCM LMG 23728）；　［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２２（別名：Ｍ－１６Ｖ）；これら［１］～［３］の３種類の菌は、有用菌として製品に使用されている観点、及び本技術を用いれば各菌の区別が容易でかつ正確に測定できる観点から、好ましい。
　なお、ＢＢ５３６、Ｍ－６３、Ｍ－１６Ｖは、森永乳業株式会社等から市販されている製品に含まれるものである。本技術の測定方法をこのような菌が単独又は複数種類含まれている製品に用いることが望ましい。また、市販品から、ＢＢ５３６、Ｍ－６３、Ｍ－１６Ｖとして、採取することも可能である。
　さらに、本技術において、前記［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２１、前記［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２３、及び［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２２からなる群から選ばれる１種又は２種以上（より好適にはこれら３種類のビフィズス菌）が、これらは有用菌として製品に使用されている観点及び本技術を用いれば簡便で精度よく各生菌数を測定できる観点から、好適である。
　［１］　ビフィドバクテリウム・ロンガム　ＢＢ５３６（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２１）は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２１の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。これと同一の細菌であるBifidobacterium longum subsp. longum ATCC BAA-999（番号：ATCC BAA-999）は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から、ATCC BAA-999として入手可能である（例えば、特開2012-223134等参照）。
　［２］　ビフィドバクテリウム・インファンティスＭ－６３（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２３）
は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２３の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。これと同一の細菌であるBifidobacterium longum subsp. infantis BCCM LMG 23728（番号：BCCM／LMG 23728）は、BELGIAN CO-ORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS（ＢＣＣＭ）から、BCCM／LMG 23728として入手可能である（例えば、特開2012-223134等参照）。
　［３］　ビフィドバクテリウム・ブレーベ　Ｍ‐１６Ｖ（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２２は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２２の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。
＜培養工程＞
　本技術は、上述した被検体を、高浸透圧培地組成物を含む培地を用いて培養する、培養工程を含むものである。
＜培地＞
〔高浸透圧培地〕
　本技術の高浸透圧培地を用いることにより、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ブレーベと他の菌種とを簡便に精度良く区別できる。そして、高浸透圧培地に形成されたコロニー数に基づきブレーベのみを同定することができ、ブレーベの生菌数をより精度よく簡便に測定することができる。
　本技術で用いる「高浸透圧培地」の「浸透圧」とは、培地中の寒天末を加熱溶解する前の〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの浸透圧である。
　本技術で用いる「高浸透圧培地」は、一般的な基礎培地の寒天末を加熱溶解する前の〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの浸透圧と比較したときに、〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの浸透圧が高い。この浸透圧が高いことを「高浸透圧」と本技術において定義している。
　本技術の「浸透圧」を測定する場合、寒天を含む培地組成物と水とを混合し、寒天末が加熱溶解されていない状態の〔培地組成物／水１Ｌ〕を調製する；そして、寒天末が加熱溶解されていない状態の〔培地組成物／水１Ｌ〕の浸透圧を、浸透圧測定装置にて測定する。この調製するときの水温は、寒天末が加熱溶解されない温度であればよく、例えば５～５０℃程度である。
　浸透圧装置として、例えば、アドバンス　オズモメータ３２５０（氷点降下法浸透圧計：アドバンス社）等が挙げられる。
　なお、後記〔実施例〕に示すように、一般的な基礎培地の浸透圧は、寒天末を加熱溶解せずに〔培地組成物／水１Ｌ〕に調製したときに、４００～６００ｍＯｓｍである。
　本技術の高浸透圧培地は、浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときに８９０ｍＯｓｍ以上であることが好適である。浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときに８９０ｍＯｓｍ以上にすることで、培地に形成されたコロニーの状態によってブレーベと他の菌種とを簡便に精度良く区別できる。これにより、ブレーベの生菌数をより精度よく測定することができる。
　当該浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの下限値は、より好ましくは９５０ｍＯｓｍ以上、さらに好ましくは１０５０ｍＯｓｍ以上である。当該浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの上限値は、好ましくは１４５０ｍＯｓｍ以下であり、より好ましくは１３５０ｍＯｓｍ以下である。また、当該浸透圧〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの範囲は、８９０～１３５０ｍＯｓｍであることが、ブレーベのみのコロニーが形成できるとともに当該ブレーベの生残率が高い観点から、好ましい。
　本技術の高浸透圧培地組成物に使用する高浸透圧調整成分として、浸透圧を高くできる物質であれば特に限定されず、例えば、塩類（例えば、無機塩類、有機塩類等）、糖類（例えば、単糖類・オリゴ糖類、これらの還元物）、アミノ酸類・ペプチド類、有機酸塩等が挙げられ、本技術において、これらを１種又は２種以上使用することができる。また、本技術の高浸透圧調整成分は、水溶性物質が作業性、溶解性及び浸透圧調整が容易なため、好ましい。
　本技術で高浸透圧調整成分として用いられる塩類として、特に限定されないが、一般的に培地に使用されている塩類が好ましい。
　前記塩類として、例えば任意の酸性基（例えば、ハロゲン、カルボキシル）で形成されるアニオン塩、又は任意の塩基性基（例えば、アルカリ金属、アミノ）で形成されるカチオン塩のいずれでもよい。
　前記塩類には、無機塩及び有機塩のいずれでもよく、また、前記塩類として、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。
　前記金属塩として、より具体的には、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）、亜鉛、銅、鉄、アルミニウム等が挙げられる。また、前記ハロゲンとして、より具体的には、例えば、塩素、臭素、フッ素等が挙げられる。
　本技術において、浸透圧の調整が容易な観点から、アルカリ金属塩及びアルカリ土類塩が好ましく、易水溶性の観点から、ハロゲン化アルカリ金属塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）が好ましい。
　これら塩類の群から１種又は２種以上を選択することができる。
　本技術で高浸透圧調整成分として用いられる有機酸として、特に限定されないが、例えばクエン酸回路系の有機酸等が挙げられる。当該有機酸として、例えば、ピルビン酸、乳酸、酢酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、αケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等が挙げられる。
　本技術で用いられる無機酸として、特に限定されない。当該無機酸として、例えば、硝酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。
　これら有機酸及び／又は無機酸の群から１種又は２種以上選択することができ、またこれら有機酸及び／又は無機酸はｐＨ調整によってカチオン塩又はアニオン塩を形成してもよい。
　本技術で高浸透圧調整成分として用いられるアミノ酸類・ペプチド類として、特に限定されない。当該アミノ酸類として、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン等が挙げられる。また、ペプチド類は、これらアミノ酸残基が同じに又は異なって２～１０個程度でペプチド結合しているものが挙げられる。
　これらアミノ酸類・ペプチド類の群から１種又は２種以上選択することができ、またこれらはｐＨ調整によってカチオン塩又はアニオン塩を形成してもよい。
　本技術で高浸透圧調整成分として用いられる糖類は、特に限定されないが、例えば、単糖及びオリゴ糖並びにこれらの還元物（糖アルコール等）が挙げられる。
　前記単糖として、アルドース及びケトースのいずれでもよく、中性糖の他、糖のＯＨ基がアミノ基、デオキシ基、カルボニル基になっている、アミノ糖、デオキシ糖、ウロン酸でもよい。中性糖として、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレイトール、キシロース、リボース、アラビノース、グルコース、ガラクトース、マンノース等のアルドース及びフルクトース等のケトース等が挙げられる。また、例えば、アミノ糖として、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン等；デオキシ糖として、例えば、フコース、ラムノース等；ウロン酸として、例えば、グルクロン酸、ガラクツロン酸等が挙げられる。さらに、これらの還元物の糖アルコールであってもよく、例えば、ソルビトール（グルコシトール）、ガラクチトール、マンニトール、グルコン酸等が挙げられる。
　前記オリゴ糖として、例えば、マルトオリゴ糖（例えば、マルトース等）、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、スクロース、ラクトース、ラフィノース等が挙げられる。二糖類～四糖類等が好適である。さらにこれらの還元物の還元オリゴ糖であってもよく、還元麦芽糖（マルチトール）等が挙げられる。
　また、糖類として、単糖及びオリゴ糖を含むブドウ糖含有製品（例えば、異性化糖、水飴、デンプン加水分解物等）であってもよい。
　これら糖類の群から１種又は２種以上選択することができる。
　本技術において、上述した塩類等の高浸透圧調整成分を複数組み合わせて用いる場合には、培地組成物に水を加えて寒天末が加熱溶解しない状態で、上述した高浸透圧の範囲になるように高浸透圧調製成分を配合しつつ浸透圧測定装置にて調整できる。本技術では、加熱殺菌前に高浸透圧を調整できるので作業も容易であることから、測定結果の均質化が図りやすい。
　本技術の高浸透圧培地は、少なくとも塩類及び／又は糖類を含むものが、浸透圧を調整し易い観点から、好適である。塩類及び糖類は易水溶性物質が多く存在するので、寒天末を加熱溶解しない状態で高浸透圧を調整し易い利点がある。
　本技術において、前記培地中の塩類の含有量は、１１～３０ｇ／培地１Ｌが好ましく、１５～２５ｇ／培地１Ｌがより好ましい。
　本技術の高浸透圧培地組成物において、前記培地中の糖類の含有量は、１３０～２２０ｇ／培地１Ｌが好ましく、１４０～１９０ｇ／培地１Ｌがより好ましい。
　本技術の高浸透圧培地組成物において、前記培地中の塩類及び糖類を複数含有させる場合、これらの量は、上述の好適な高浸透圧になるように、調整できる。
　本技術の高浸透圧培地に用いる高浸透圧培地組成物の製造方法は特に限定されないが、例えば、基礎培地組成物に、上述した高浸透圧調整の成分を加えて高浸透圧になるように調整することによって高浸透圧培地組成物を得ることが好適である。
　なお、本技術で用いられる基礎培地組成物は、一般的に細菌が生育可能な培地組成物として使用されているものであればよい。
　前記基礎培地組成物として、乳酸菌及び／又はビフィズス菌が生育可能な、乳酸菌及び／又はビフィズス菌用の基礎培地組成物が好ましく、当該基礎培地組成物は、市販品を使用できる。
　なお、基礎培地組成物の任意培地成分として、測定目的の菌種のコロニー数及び生菌数に影響を及ぼさない範囲で、任意の抗生物質を添加してもよい。
　前記基礎培地組成物のうち、さらにビフィズス菌用の基礎培地組成物が好ましい。ビフィズス菌用であるため本技術のブレーベの生菌数をより正確に測定できる。
　一般的に、ビフィズス菌用の基礎培地組成物に使用されうる成分としては、酵母エキス、肉エキス、ぺフトン等の窒素源；塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム等のナトリウム塩、L－システイン塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の塩類；グルコース、デンプン、スクロース、ラフィノース、ガラクトース等の糖源等が挙げられ、これらを１種又は２種以上使用することができる。
　また、ビフィズス菌用の基礎培地組成物として、市販されている製品又は培地組成物を使用してもよい。前記基礎培地組成物として、例えば、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地組成物（以下、「ＴＯＳ寒天培地組成物」ともいう）、強化クロストリジウム寒天培地組成物（以下、「ＲＣＭ寒天培地組成物」ともいう）等が挙げられる。このうち、ＴＯＳ寒天培地組成物、ＲＣＭ寒天培地組成物が好ましい。なお、本技術で「培地組成物」は、固化させる前の培地成分であってもよいし固化された培地であってもよいが、特に言及しなければ固化させる前の培地成分である。
　そして、本技術では、上述した高浸透圧調整成分及び基礎培地組成物を含む培地組成物を加熱殺菌にて寒天末等の成分を溶解する。この寒天末溶解物をシャーレ等の容器に注入し冷却することによって、ビフィズス菌の各菌種及び生菌数の判定用の高浸透圧培地を得ることができる。
　また、本技術では、寒天末溶解前の基礎培地組成物に高浸透圧調整成分を配合して当該組成物の浸透圧を調整してもよい。そして、調整された高浸透圧培地組成物を加熱殺菌してシャーレ等に注入して高浸透圧培地を作製できる。
　なお、固体培養法を用いる場合、寒天末が、最終的に得られる培地中に１～３％（約１．５％程度）となるように培地に配合されることが好ましい。
　本技術の別の態様として、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定するための高浸透圧培地組成物を提供することができる。
　本技術の高浸透圧培地組成物は、８９０ｍＯｓｍ以上になることが、よりビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定し易い観点から、好適である。当該浸透圧は、上述したｍＯｓｍの範囲に設定することが好ましい。
　本技術の高浸透圧培地組成物は、上述した高浸透圧培地組成物の各成分を使用することが好ましく、少なくとも塩類及び／又は糖類を含むものが好適である。
　本技術の培養工程は、寒天培地にて行う培養方法（固体培養法）を用いて実施することができる。
　本技術の培養工程において、培地で培養する前に、前記被検体を適宜希釈することが、より正確な生菌数を計測する観点から、望ましい。
　前記方法は、具体的には；懸濁液を段階的に希釈する液にて希釈して各希釈物を得る。寒天培地を用いて各希釈物を培養する。この寒天培地中に形成されたコロニー数を計測する。このとき形成されたコロニー数が、希釈物中に含まれる微生物の生菌数に該当する。
　そのため、コロニー数の値と希釈倍率とから、希釈液中に含まれる細菌の生菌数が求められる。コロニー数３０～３００個／培地の全面積６０ｃｍ２になるように、希釈液の希釈倍率を調整することが好適である。
　このようにして求められた懸濁液中の生菌数と、当該懸濁液中に含まれる検体量から、当該検体中に含まれる細菌の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）が求めれれる。
　上記の方法において、懸濁液を希釈する液は、一般的に使用されている希釈液を使用することができる。
　前記一般的な希釈液としては、例えば、０．８５％生理食塩水、０．１％ペプトン加生理食塩水、光岡バッファー、バッファードペプトンウォーター等が挙げられる。
　また、一般社団法人全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会が推奨する方法では、希釈液について、食品衛生検査指針に記載された嫌気性検体希釈液が推奨されている。当該嫌気性検体希釈液は、ＫＨ２ＰＯ４：４．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４：６．０ｇ、Ｌ－システインＨＣｌ・Ｈ２Ｏ：０．５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０：０．５ｇ、寒天：１．０ｇ、精製水：１，０００ｍＬからなる液体であり、腸内フローラ中に存在する嫌気性菌検出の際に、広く使用されている。当該嫌気性検体希釈液を一次希釈液として使用し、０．８５％生理食塩水を二次希釈液として使用してもよい。
　前記培養方法として、具体的には、混釈法、平板塗抹法、スパイラル法等が挙げられる。混釈法は、適宜希釈した懸濁液を、加温溶解した寒天培地と混和し、冷却固形化して培養する方法である。平板塗抹法は、適宜希釈した懸濁液を、寒天培地上に塗抹して培養する方法である。スパイラル法は、試験試料を、機器等を使用して濃度勾配を付けてプレーティングする方法である。
　このうち、好ましくは平板塗抹法及び混釈法であり、さらに好ましくは混釈法である。
　培養に用いる寒天培地の種類、培養条件（培養温度、培養時間等）については、測定対象の微生物に応じて公知の培養条件を利用でき、例えば、寒天培地としては、測定対象の微生物が生育可能なものでもよい。ビフィズス菌の場合、コロニー数カウントは、主に３７℃で７２時間嫌気培養した後に行われる。
＜判定工程＞
　本技術の判定工程において、上述のようにして培養後、高浸透圧培地中又は上に形成されたコロニーをブレーベとして同定する。
　本技術の高浸透圧培地を用いて培養した場合、ブレーベが優先的に選択的にコロニー形成できる。このため、本技術は、形成されたコロニー数から、ブレーベの存在の有無（すなわち同定）及び生菌数を測定することができる。
　従来の生菌数測定方法は、特殊なコロニー形態（例えば、特殊な発色、立体的な形状、平面的な大きさや形状等）の観察を行う場合がある。しかし、このような場合高い熟練度が必要であり、また同一の者であってもデータのばらつきがあった。
　これに対し、本技術は、特殊なコロニーの形態観察を行わずとも、高浸透圧培地を用いて形成されたコロニー及びその数をブレーベ及びその生菌数として判定できる。このため、熟練度が少ない場合でも簡便にかつ精度よくブレーベの同定及びその生菌数を計測できる。また、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、測定結果のさらなる均質化を図ることも可能である。
　また、本技術であれば、形成されたコロニー数を計測すればよく高度な経験に基づいたコロニー形態を判定しなくともよいので、カメラ（ＣＣＤ等）を用いて画像解析にて行うことも可能である。画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
　本技術の生菌数の計測方法は、本技術の培地を用いる以外は公知の計測方法を利用できる。
　本技術において以下のように算出されることが好ましい。
　全生菌数（ＣＦＵ／製品１ｇ）＝希釈倍率×培地中に又は上に形成された全コロニー数／塗布量ｍＬ／製品の測定重量。
　コロニー数３０～３００個／培地の全面積６０ｃｍ２あたりとするのが好ましい。
　なお、培地の一部エリアを任意設定し、このエリア内の全コロニー数及び（一部エリア／全エリア）の面積比により、培地の全面積の全コロニー数を算出してもよい。
＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞
　本技術では、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体をストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出する判定工程、を含むことにより、前記インファンティスの生菌数の測定方法を提供することができる。
　本技術のストレプトマイシン含有培地を用いることより、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスと他の菌種とを簡便に精度良く区別できる。そして、ストレプトマイシン含有培地に形成されたコロニー数に基づき、インファンティスのみを同定することができ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数をより精度良く簡便に測定できる。
　なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞と共通する構成（例えば、被検体及び基礎培地組成物等）についてはその説明を省略する。
〔ストレプトマイシン含有培地〕
　本技術に用いるストレプトマイシン含有培地は、上述した基礎培地組成物とストレプトマイシンとを混合したものであることが好適である。これにより、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を優先的に選択的に測定することができる。
　前記ストレプトマイシン含有培地中のストレプトマイシンの含有量は、下限値として、インファンティスのみのコロニーを精度良く形成させるため、好ましくは５０ｍｇ／培地１Ｌ以上であり、より好ましくは６０ｍｇ／培地１Ｌ以上である。また当該ストレプトマイシン含有量の上限値として、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのコロニーを容易に形成させるために、好ましくは２０００ｍｇ／培地１Ｌ以下、より好ましくは１７００ｍｇ／培地１Ｌ以下、さらに好ましくは１５００ｍｇ／培地１Ｌ以下である。当該ストレプトマイシン含有量の範囲として、より好ましくは５０～２０００ｍｇ／培地１Ｌ、さらに好ましくは６０～１７００ｍｇ／培地１Ｌであり、より好ましくは６０～１５００ｍｇ／培地１Ｌである。
　このようにインファンティスが広範囲のストレプトマイシン濃度でもコロニー形成することができることを本発明者らは見出した。このことから、本技術では、培地中のストレプトマイシン濃度の調整作業も容易であることから、測定結果の均質化が図りやすい。
　本技術のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌測定方法は、ストレプトマイシンを含む培地組成物を使用した以外は上述したブレーベの生菌数の測定方法の＜培養工程＞＜判定工程＞と同様にして、培養工程及び判定工程を行い、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。
　本技術は、特殊なコロニーの形態観察を行わずとも、ストレプトマイシン含有培地を用いて形成されたコロニー数をビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びその生菌数として判定できる。このため、熟練度が低い場合でも簡便にかつ精度よくインファンティスの同定及びその生菌数を計測できる。また、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、測定結果のより均質化を図ることも可能である。さらに、後述するように、同一被験体で高浸透圧培地を用いる方法及びストレプトマイシン含有培地を用いる方法を行うことが、簡便で精度良く各種類の生菌数を測定できるので、好適である。
　また、本技術であれば、形成されたコロニー数を計測すればよく高度な経験に基づいたコロニー形態を判定しなくともよいので、カメラ（ＣＣＤ等）を用いて画像解析にて行うことも可能である。画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
　なお、本技術の別の態様として、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定するためのストレプトマイシン含有培地組成物を提供することができる。
＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞
　本技術では、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を、以下の（１）及び（２）の測定方法又は測定工程；
　（１）高浸透圧培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして計測し生菌数を測定すること、及び（２）ストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し生菌数を測定すること；を含むことにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのそれぞれの生菌数の測定方法を提供することができる。
　なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞及び＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞と共通する構成（例えば、被検体及び基礎培地組成物等）についてはその説明を省略する。
　本技術の高浸透圧培地を用いることにより、種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ブレーベのみを優先的に選択的に同定することができ、当該ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を簡便に精度よく測定することができる。
　さらに、本技術のストレプトマイシン含有培地を用いることより、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのみを優先的に選択的に同定することができ、当該ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を簡便に精度よく測定することができる。
　この併用の場合、同一被験体を用いることが、簡便に精度良く各種類の生菌数を測定できるので好ましい。
　この併用により、本技術は、特に、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスをより明確に区別することができ、それぞれの生菌数をより正確に簡便に測定することができる。
　この併用により、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの測定結果の均質化を図れる。また、画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動的化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞
　本技術では、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を、以下の（１）～（３）の測定工程又は測定方法；
（１）高浸透圧培地を用いて、形成されたコロニーをブレーベとして計測し生菌数を測定すること；
（２）ストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し生菌数を測定すること；
（３）（i）無菌脱繊血添加なしのＢＬ寒天培地を用いて、形成されたビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム特有のコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムとして計測し生菌数を測定すること、及び／又は（ii）上述した基礎培地（好適にはビフィズス菌用基礎培地）を用いて、形成された全コロニー数を全ての細菌として計測し全菌種の生菌数を測定すること；
を含むことにより、ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのそれぞれの生菌数の測定方法を提供することができる。
　なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞、＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞、＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞と共通する構成（例えば、被検体及び基礎培地組成物等）についてはその説明を省略する。
　前記被験体に含まれる細菌の種類が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムの２種類であることが好ましい。当該ビフィドバクテリウム・ロンガムのうち、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムであることが好ましい。
　本技術において、より好ましくは、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの３種類である。
　前記（３）（i）無菌脱繊血添加なしのＢＬ寒天培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムとして計測し生菌数を測定する。本培地での形態観察により、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムを見分けることが可能である。
　前記（３）（ii）基礎培地（好適にはビフィズス菌用基礎培地）を用いて、形成された全コロニー数を全ての細菌として計測し全菌種の生菌数を測定する。さらに、当該全コロニー数から、前記（１）及び（２）の各培地を用いた各生菌数の結果を差し引くことで、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの生菌数を算出することができる。
　本技術は、特殊なコロニーの形態観察を行わずとも、通常培地を用いて形成されたコロニー数を全菌種の生菌数として判定できる。このため、本技術の高浸透圧培地及びストレプトマイシン含有培地を用いることで、最終的に、熟練度が低い場合でも簡便にかつ精度よくビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの同定及びその生菌数を計測できる。また、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、測定結果のより均質化を図ることも可能である。
　また、前記（１）及び（２）の各培地、さらに（３）（i）の培地を用いてもよい。これら各結果を考慮して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数を判定してもよい。
　また、本技術では、一般的な基本培地を使用するので、入手も容易でありまた判定用培地を容易に作製であることから、測定結果の均質化が図りやすい。
　従来、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムが含まれている被験体においてこれら各生菌数を測定する場合、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地を用いていた。しかしながら、本技術により、無菌脱繊血を用いなくともよく、さらにより簡便に精度よくこれら各生菌数を測定することができる。
＜５．本技術の１種類又は複数種類の細菌を含む組成物の製造方法＞
　本技術は、別の側面として、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞、＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞、＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞、又は＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞を用いて、１種類又は複数種類の細菌を含む組成物の製造法を提供することも可能である。
　なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞～＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞と共通する構成についてはその説明を省略する。
　本技術の組成物の製造方法の「組成物」は、特に限定されず、本技術の被検体に使用可能な組成物であればよく、製品であってもよく試作品であってもよい。例えば、飲食品組成物、医薬品組成物、飼料組成物等の何れでも良いが、上記＜１．ブレーベの生菌数を測定する方法＞〔被験体〕にて説明した製品が好適である。
　本技術の組成物の製造方法は、１種類又は複数種類の細菌を含む組成物の製造方法であり、（１）上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞、＜２ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞、＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞、又は＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞の少なくとも何れか１つの生菌数の測定方法を用いて、被検体となる組成物中の各細菌グループ（各細菌グループであってもよい）の生菌数を測定する工程；前記測定された組成物中の各細菌の生菌数に基づいて、目的生菌数になるように組成物中の各細菌の配合量を調整し設計する工程を含み、
　前記各細菌の配合量の設計に基づき、前記１種類又は複数種類の細菌を含む組成物を得ることが好適である。
　また、前記（１）の生菌数の測定工程は、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞～＜４．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞の生菌数の測定方法を適宜２つ以上組み合わせて行ってもよい。
　本技術の組成物の製造方法における前記（１）の生菌数測定工程は、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞～＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞と共通する構成について、その説明を省略する。
　本技術の組成物の製造方法において、被検体となる組成物は、１種類又は複数種類であり、複数の場合には、同一ロット、製造時期が同時期、製造原材料が同一であるものが好ましい。
　目的生菌数とは、１種類又は複数種類でもよい。また、目的生菌数とは、特に限定されず、製造者の任意によって設定することができ、製造時に組成物に配合する生菌数である。例えば、目的生菌数として、製造時に基準として設定された生菌数；製造直後の生菌数マイナス製造保管時の生菌数に基づき生菌数の減少分を補充するように補正された生菌数等が挙げられる。
　本技術の被検菌は特に限定されないが、好ましくはビフィズス菌であり、より好ましくはビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムであり、よりさらに好ましくはビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムから選択される２種類又は３種類である。
　組成物に１種類又は複数種類の細菌が含まれているが、経時的変化によって、この組成物中の１種類の細菌又は複数種類の各細菌の生残率等が変化してくる。このため、細菌を含む組成物の品質管理では、長期間保存したときにこの変化を想定して各細菌の配合量及び細菌割合を調整する対策も必要となっている。本技術では、このような細菌の配合量及び配合割合の調整をより正確に行うことができる。
　また、細菌を通常長期間保存すると細菌の生育力も低下しやすいので、特殊な成分を使用して生菌数を測定する方法ではその特殊な成分の影響によって真の生残率よりもより低い生残率を算出しやすく、正確さに欠けるリスクがある。しかしながら、本技術の培地組成物はそのリスクを低減することができる。
　また、本技術では、保管による組成物中の各細菌の生菌数及び細菌割合の変化をモニタリングし正確に把握することもできる。そして、本技術では、このモニタリング結果を製造プロセスにフィードバックし、製造プロセスにおける組成物中の各細菌の生菌数及び細菌割合を調整（増量又は減量）することによって、一定期間保存後の組成物中における目的とする生菌数及び細菌割合にすることができる。
　本技術であれば、後記実施例（特に実施例４）に示すように、長期間保存した場合でも、本技術の培地組成物及び本技術の生菌数の測定方法を用いれば目的とする生菌数を簡便でありながら精度よく測定できる。
　また、本技術であれば、２５℃２年間又はこれに相当する保管期間であれば、目的とする生菌数を簡便でありながら精度良く測定できる。
　本技術において、製造時の生菌数と一定期間保存時の生菌数との対比が好ましい。この対比結果より、保存時の生菌数が目的の生菌数になるように細菌の配合を製造時に調整（増減）することが好ましい。これにより、想定される保存期間において一定の生菌数になるように製造時点で制御することができる。
　なお、上述した本技術の方法とその結果及び／又は当該結果と組成物の製造方法を、装置のＣＰＵ等を含む制御部、及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、制御部によって実現させることも可能である。
　また、本技術は、本技術の方法及び／又は当該結果と組成物の製造方法として、コンピュータを機能させるためのプログラムとすることも可能である。
　以下、実施例等に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例等は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
［使用菌］
　本実施例で使用されるB. longum subsp. longum BB536（以下、「ロンガムＢＢ５３６」ともいう）、B. breve M-16V（以下、「ブレーベＭ－１６Ｖ」ともいう）、B. longum subsp. infantis M-63（以下、「インファンティスＭ－６３」ともいう）は、森永乳業株式会社から市販されている製品から採取することができる。
　また、［１］ロンガムＢＢ５３６として同一細菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２１を、［２］ブレーベＭ－１６Ｖとして同一細菌であるビフィドバクテリウム・ブレーベ　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２２を、［３］インファンティスＭ－６３として同一細菌であるビフィドバクテリウム・インファンティス　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２３を、それぞれ使用してもよい。
［浸透圧の測定］
　各培地組成物の浸透圧は、寒天末を溶解する前の〔培地組成物／水１Ｌ〕をアドバンス　オズモメータ３２５０（氷点降下法浸透圧計：アドバンス社）で測定した値である。「寒天末溶解前の〔培地組成物／水１Ｌ〕」とは、加熱殺菌（オートクレーブ殺菌１００℃以上１５分間）前の寒天末を含む培地組成物を、水１Ｌで混合したものである。
　なお、浸透圧測定を行った後に「寒天末溶解前の〔培地組成物／水１Ｌ〕」をオートクレーブにて加熱殺菌する。オートクレーブにて加熱溶解した培地を混釈法又は平板塗抹法に従ってシャーレ容器（１シャーレ；直径９ｃｍ）に流し入れ冷却固形化する。固形化後に培養を行い、シャーレの中に形成されたコロニー数を測定する。
　［実施例１：高浸透圧培地組成物及びその調整成分］
　［実施例１－１：ブレーベＭ－１６Ｖの生菌数の測定（高浸透圧成分：糖類）］
　被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ－１６Ｖを１．２×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ－６３を６．４×１０６ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
　スクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１０８４ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地組成物を含む培地（寒天末溶解前の液体１Ｌ）を調製した。
　前記スクロース１６０．０ｇ／Ｌ添加のＴＯＳ寒天培地を用いて、及び対照としてスクロースを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いて、プレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表１は、スクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表１に示すように、１６０．０ｇ／Ｌ　スクロースを添加した高浸透圧培地では、ブレーベＭ－１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ－６３は０．２％未満しか生残出来ず、コロニーは未検出であった。、同じプレート上で、ブレーベＭ－１６Ｖだけを検出することができた。
　また、本方法を使用すれば、ロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の菌数比率が、例えば１：１０００：１のように、ビフィズス菌の中でブレーベが多い割合の製品の場合でも、ブレーベだけ及びその生菌数を正確に検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
[実施例１－２：ブレーベＭ－１６Ｖの生菌数の測定（高浸透圧成分：ハロゲン化アルカリ金属塩）]
　被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．０×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ－１６Ｖを１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ－６３を９．２×１０６ｃｆｕ／ｇ　含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
　塩化カリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１０５８ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地、塩化ナトリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１２０８ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地組成物を含む培地（寒天末溶解前の液体１Ｌ）を調製した。
　前記塩化カリウム２０．０ｇ／Ｌ添加のＴＯＳ寒天培地、前記塩化ナトリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加のＴＯＳ寒天培地、及び対照として塩化カリウム及び塩化ナトリウムの何れも添加しないＴＯＳ寒天培地をそれぞれ用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表２は、塩化カリウム又は塩化ナトリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及び塩化カリウム及び塩化ナトリウムの何れも添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表１に示すように、２０．０ｇ　／Ｌ　塩化カリウム又は塩化ナトリウムを添加した培地では、ブレーベＭ－１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ－６３は０．５％未満しか生残出来ずコロニーは未検出であった。同じプレート上で、ブレーベＭ－１６Ｖだけを検出することができた。
　従って、高浸透圧培地組成物を用いる方法を使用すれば、ビフィズス菌中でブレーベが多くなった場合でも、ブレーベだけを正確に検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　実施例１－１及び実施例１－２の結果から、高浸透圧培地組成物を用いる方法を使用すれば、簡便にブレーベを選択的に同定し、ブレーベの生菌数を測定することができる。さらに、高浸透圧培地組成物を用いる方法を使用すれば、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを簡便に区別でき、さらにブレーベのみの生菌数を測定することができる。
　また、高含有させることで高浸透圧にしているので、資化される糖類であっても、資化による影響は少ない。すなわち、高浸透圧調整成分は、高浸透圧調整可能な物質であれば特に限定されず、糖類でも塩類でもよい。
　また、水溶性成分の場合、寒天培地中に含まれる水溶性の高浸透圧成分の含有量を適宜測定することで培地の浸透圧の状態も理解することができる。例えば、寒天培地／水１Ｌで粉砕撹拌した後に氷点降下法浸透圧計にて浸透圧を測定すること等が考えられる。
　［実施例２：浸透圧の調整］
　［実施例２－１：ブレーベＭ－１６Ｖの生菌数の測定（浸透圧の範囲）］
　被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ－１６Ｖを１．４×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ－６３を６．４×１０６ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
　スクロースを２２０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１３１０ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地を用いて、及び対照としてスクロースを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表３は、スクロースを２２０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表３に示すように、浸透圧を１３１０ｍＯｓｍに高めた高浸透圧培地では、ブレーベＭ－１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ－６３は０．２％未満しか生残出来ずコロニーは未検出であった。同じプレート上で、ブレーベＭ－１６Ｖだけを検出することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　［実施例２－２：　ブレーベＭ－１６Ｖ生菌数の測定（浸透圧の範囲）］
　被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．２×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ－１６Ｖを２．０×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ－６３を８．９×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
　スクロースを１５０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を８９５ｍＯｓｍに高めたＲＣＭ寒天培地、及び対照としてスクロースを添加しないＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表４は、スクロースを１５０．０ｇ／Ｌ添加したＲＣＭ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＲＣＭ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表４に示すように、浸透圧を８９５ｍＯｓｍに高めた高浸透圧培地では、ブレーベＭ－１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ－６３は１．２％未満しか生残出来ず、コロニーは未検出であった。同じプレート上で、ブレーベＭ－１６Ｖだけを検出することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例２－１及び実施例２－２の結果から、高浸透圧培地組成物を含む培地の浸透圧が少なくとも８９５ｍＯＳｍであれば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスをコロニーが未検出にすることができるので、ブレーベを選択的に同定し、ブレーベの生菌数を測定することができる。また、高浸透圧培地組成物を含む培地の浸透圧が１３１０ｍＯｓｍ以下までであれば、ブレーベの生残率を確保することができるので、簡便にブレーべを選択的に同定し、ブレーベの生菌数を測定することができる。
　すなわち、浸透圧が８９５～１３１０ｍＯsｍの範囲内であれば、簡便にブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを簡便に区別でき、さらにブレーベのみの生菌数を測定することができる。
　さらに、実施例１及び実施例２から、高浸透圧培地組成物に使用する基礎培地組成物がビフィズス菌生育可能な市販品であれば、簡便にブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを簡便に区別でき、さらにブレーベのみの生菌数を測定することができる。
［実施例３：ストレプトマイシン含有培地組成物及びその量］
［実施例３－１：インファンティスＭ－６３の生菌数の測定］
　被験試料としてロンガムＢＢ５３６を９．０×１０６ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ－１６Ｖを１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ－６３を７．３×１０６ｃｆｕ／ｇ　含有する粉末を調整し、それぞれ適宜希釈した。
　ストレプトマイシンを６０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地及び対照としてストレプトマイシンを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表５は、ストレプトマイシンを６０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の被験試料１ｇあたりの菌数及びストレプトマイシンを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表５に示すように、ストレプトマイシンを６０．０ｍｇ／Ｌ添加した培地では、インファンティスＭ－６３は１００％生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びブレーベＭ－１６Ｖは０．４％以下の生残率となり、同じプレート上でインファンティスＭ－６３だけを検出できることが分かった。
　また、本方法を使用すれば、ロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の菌数比率が例えば、１：１：１０００のように、ビフィズス菌中でインファンティスＭ－６３が多い割合の製品の場合でも、インファンティスＭ－６３だけ及びその生菌数を正確に検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　

 
　［実施例３－２：インファンティスＭ－６３の生菌数の測定］
　被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．２×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ－１６Ｖを２．５×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ－６３を１．２×１０１１ｃｆｕ／ｇ　含有する粉末を調整し、それぞれ適宜希釈した。
　ストレプトマイシンを１５００．０ｍｇ／Ｌ添加したＲＣＭ寒天培地及び対照としてストレプトマイシンを添加しないＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表６は、ストレプトマイシンを１５００．０ｍｇ／Ｌ添加したＲＣＭ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の被験試料１ｇあたりの菌数及びストレプトマイシンを添加していないＲＣＭ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表６に示すように、ストレプトマイシンを１５００．０ｍｇ／Ｌ添加した培地では、インファンティスＭ－６３は５１％生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びブレーベＭ－１６Ｖは１．０％未満の生残率となり、同じプレート上でインファンティスＭ－６３だけを検出できることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  

　実施例２－１及び実施例２－２の結果から、ストレプトマイシンを含む培地を使用すれば、簡便にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを選択的に同定し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。さらに、ストレプトマイシンを含む培地組成物を用いる方法を使用すれば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスと、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムとを簡便に区別でき、さらにビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのみの生菌数を測定することができる。
　さらに、培地組成物のストレプトマイシン濃度が少なくとも６０．０ｍｇ／Ｌであれば、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムをコロニー未検出にすることができるので、簡便にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを選択的に同定し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。また、培地組成物のストレプトマイシン濃度が１５００．０ｍｇ／Ｌ以下までであれば、インファンティスの生残率を確保することができるので、簡便にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを選択的に同定し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。
［実施例４：生菌数が測定可能な保存期間］
［実施例４－１：２５℃２年間保管したブレーベＭ－１６Ｖの生菌数の測定］
　被験試料として、２５℃２年間保管したブレーベＭ－１６Ｖを１．７×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
　スクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１０８４ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地、及び対照としてスクロースを添加しないＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表７はスクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたブレーベＭ－１６Ｖの被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＲＣＭ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表７に示すように、２５℃２年間保管したブレーベＭ－１６Ｖにおいても、Ｍ－１６Ｖを正確に検出することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
［実施例４－２：２５℃２年半保管したインファンティスＭ－６３の生菌数の測定］
　被験試料として、２５℃２年半保管したインファンティスＭ－６３を６．７×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。ストレプトマイシンを８０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地、及び対照としてストレプトマイシンを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
　嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
　表８は、ストレプトマイシンを８０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたインファンティスＭ－６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びストレプトマイシンを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
　表８に示すように、２５℃２年半保管したインファンティスＭ－６３においても、インファンティスＭ－６３を正確に検出することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　実施例４－１の結果から、ブレーベを含む製品の保管期間が数年に及ぶ場合において、本技術の高圧浸透培地を用いてもブレーベの生菌数を正確に測定することができる。
　実施例４－２の結果から、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを含む製品の保存期間が数年に及ぶ場合において、本技術のストレプトマイシンを含む培地を用いてもビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を正確に測定することができる。
　従って、ブレーベ及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを含む製品の保管期間が数年に及ぶ場合でも、高浸透圧培地組成物を含む培地及びストレプトマイシンを含む培地を用いても、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのそれぞれの生菌数を正確に測定することができる
　実施例１～４の結果より、高浸透圧培地及びストレプトマイシン含有培地をそれぞれ用いて固体培養を行うことで、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスをそれぞれ選択的に同定することができ、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのそれぞれの生菌数を測定することができる。
　また、ビフィズス菌生育用の基本培養培地を用いてブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムからなる総生菌数を計測することによって、（総生菌数－上述のブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数）に基づき、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの生菌数を計測することができる。
［実施例５：３菌を含む粉末中の個別の生菌数の測定］
　ロンガムＢＢ５３６、インファンティスＭ－６３、ブレーベＭ－１６Ｖ含有する粉末を被験試料として用い、適宜希釈した。
　表９は、以下の各培養法で求められた被験試料１ｇあたりのロンガムＢＢ５３６、インファンティスＭ－６３、ブレーベＭ－１６Ｖの菌数を示した。
　上記希釈物を、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成された菌種ごとのコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりのロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３、及びこれらの総菌数を計算した。その結果を表９に示す。
（１）総菌数の測定
　上記希釈物を、ＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりのロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ－１６Ｖ、インファンティスＭ－６３の総菌数を一般的なビフィズス菌生育用基礎培地を用いて計算した。その結果を表９に示す。
（２）ロンガムＢＢ５３６の生菌数の測定
　上記希釈物を、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地、及び対照として無菌脱繊血を添加しないＢＬ寒天培地を用いて、プレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニーの中からロンガムＢＢ５３６が特異的なコロニーのみを計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりの菌数を計算した。その結果を表９に示す。
　表９に示すように、無菌脱繊血を添加しないＢＬ寒天培地において、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地と同等の菌数が確認できた。この結果から、無菌脱繊血添加なしＢＬ寒天培地でもロンガムＢＢ５３６計測が可能であることが分かった。
（３）インファンティスＭ－６３の生菌数の測定
　上記希釈物を、ストレプトマイシンを８０ｍｇ／Ｌの濃度で添加したＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりの菌数を計算した。その結果を表９に示す。
　表９に示すように、ストレプトマイシンを含む培地を用いれば、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地と同等のインファンティスＭ－６３の菌数が確認できた。
（４）ブレーベＭ－１６Ｖの生菌数の測定
　上記希釈物を、スクロースを１６０ｇ／Ｌの濃度で添加したＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりの菌数を計算した。その結果を表９に示す。
　高浸透圧培地組成物を含む培地を用いれば、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地と同等のブレーベの菌数が確認できた。
　（５）ブレーベＭ－１６Ｖの生菌数の測定（引き算法）
　上記（１）一般的なビフィズス菌生育用基礎培地を用いて求められた総菌数から、上記（２）無菌脱繊血添加なしＢＬ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６菌数、及び上記（３）ストレプトマイシンを含む培地を用いて求められたインファンティスＭ－６３の菌数を差し引くことでブレーベＭ－１６Ｖの菌数を求めた。
　表９に示すように、一般的なビフィズス菌生育用基礎培地、無菌脱繊血添加なしＢＬ寒天培地及びストレプトマイシンを含む培地を組み合わせて用いて求められたブレーベの菌数は、無菌脱繊血を添加したＢＬ培地で検出された菌数と同等の菌数であることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　以上のことから、一般的なビフィズス菌生育用基礎培地、無菌脱繊血添加なしＢＬ培地、ストレプトマイシンを含む培地、高浸透圧培地組成物を含む培地から１種又は２種以上を選択して用いることによって、ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数を計測することができ、これら各生菌数は、無菌脱繊血を添加したＢＬ培地で検出された各菌数と同等であることが確認できた。
　上記（１）、（３）、（４）及び（５）を用いる方法では、培地に形成されたコロニー数をカウントできるので、熟練度が低くとも正確に各生菌数を測定することができる。また、培地に形成されたコロニー数をカウントできるので、個人差も生じにくいことから、測定結果の均質化を図ることができる。これにより、ヒトの能力に関係なく、製品中の各生菌数（特にブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの生菌数）の情報をより正確に表示又は報告することが可能である。
　また、上記（１）～（５）の培地を用いても、長期間保存した製品中の各生菌数を計測できるので、経時的各生菌数の変化をモニタリングすることができる。モニタリングすることによって目的保存時の各生菌数の割合になるように製造時の生菌数の割合を調整するように設計することも可能である。
　（１）ビフィドバクテリウム・ロンガム　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２１（受託番号：NITE BP-02621）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
　（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベ　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２２（受託番号：NITE BP-02622）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
　（３）ビフィドバクテリウム・インファンティス　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２６２３（受託番号：NITE BP-02623）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。

Claims (11)

  1. 　１種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、
    　前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、
    　当該培地に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程、を含む方法。
  2. 　前記高浸透圧培地の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記高浸透圧培地が、少なくとも塩類及び／又は糖類を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記判定工程は、さらに形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出することを含む、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
  5. 　前記被験体が、少なくともビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムの細菌を含むものである、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
  6. 　１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、以下の（Ａ）及び（Ｂ）によって、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定する方法であり、
    　（Ａ）前記請求項１～５の何れか１項に記載のビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法により、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する工程；
    　（Ｂ）１種類又は複数種類の細菌を含む被検体をストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出する判定工程、を含むことにより、前記インファンティスの生菌数を測定する工程；を含む方法。
  7. 　前記ストレプトマイシン含有培地が、ストレプトマイシン６０ｍｇ／Ｌ以上のものである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記被験体に含まれる１種類又は複数種類の細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　単数又は複数の細菌を含む組成物の製造方法であり、
    　請求項１～８の何れか１項に記載の組成物中の前記細菌の生菌数を測定する方法で、前記組成物中の各細菌の生菌数を測定する工程、
    　前記測定された組成物中の各細菌の生菌数に基づき、前記組成物に対して目的生菌数になるように各細菌の配合量の調整を行う工程を含み、
    　前記各細菌の配合量の設計に基づき、前記単数または複数種類の細菌を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
  10. 　ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定するための高浸透圧培地組成物。
  11. 　前記高浸透圧培地組成物の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、請求項１０に記載の培地組成物。
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