[go: up one dir, main page]

WO2010116020A1 - Cepas de s.cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa - Google Patents

Cepas de s.cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa Download PDF

Info

Publication number
WO2010116020A1
WO2010116020A1 PCT/ES2010/070219 ES2010070219W WO2010116020A1 WO 2010116020 A1 WO2010116020 A1 WO 2010116020A1 ES 2010070219 W ES2010070219 W ES 2010070219W WO 2010116020 A1 WO2010116020 A1 WO 2010116020A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
galactosidase
signal sequence
protein
yeast
microorganism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2010/070219
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Manuel BECERRA FERNÁNDEZ
María Esperanza CERDÁN VILLANUEVA
Rafael FERNÁNDEZ LEIRO
María Isabel GONZÁLEZ SISO
Ángel PEREIRA RODRÍGUEZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidade da Coruna
Original Assignee
Universidade da Coruna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidade da Coruna filed Critical Universidade da Coruna
Priority to BRPI1012587A priority Critical patent/BRPI1012587A2/pt
Priority to US13/263,292 priority patent/US20130273602A1/en
Priority to CN2010800233001A priority patent/CN102449145A/zh
Priority to EP10761222A priority patent/EP2418275A4/en
Publication of WO2010116020A1 publication Critical patent/WO2010116020A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)

Definitions

  • the invention relates to strains of S. cerevisiae that are capable of producing ⁇ -galactosidase.
  • the ⁇ -galactosidase gene has a fused signal sequence.
  • Said strains are useful in methods for the production of ⁇ -galactosidase, biomass and ethanol, from a medium rich in rafmosa, melibiosa and / or staquiosa and, in the case that the strains contain a second construction that expresses a protein of therapeutic interest, for the production of said therapeutic proteins.
  • the ⁇ -galactosidases (EC 3.2.1.22) catalyze the hydrolysis of galactose residues linked by ⁇ (l, 6) bonds of galacto-oligosaccharides and polymeric galacto-mannans (polymers of mannoses with galactose branches), as well as oligosaccharides like the stachy, raffinose and melibious present in beans, soybeans and other legumes. These enzymes are widely distributed in animals, plants and microorganisms.
  • ⁇ -galactosidase concentrates of different origins such as manufactured tablets by Promefarm (Sinaire).
  • ⁇ -galactosidase is a lysosomal exoglycosidase that acts on terminal residues of the ⁇ -galactosyl type of glycolipids and glycoproteins. Mutations in this gene cause deficiencies in these degradations that result in Fabry's disease (X-linked sphingolipodysis). This disease has an incidence of 1 / 40,000.
  • treatments such as the one developed by Genzyme Corp. (Fabrazyme), based on the enzyme replacement technique to treat this disease through the use of human ⁇ -galactosidase expressed in CHO mice.
  • Fabrazyme the enzyme replacement technique to treat this disease through the use of human ⁇ -galactosidase expressed in CHO mice.
  • the use of recombinant human ⁇ -galactosidase in yeast has been studied.
  • the glycoprotein calyx of the cell surface of red blood cells determines, among many other functions, the blood type of each individual.
  • Type 0 blood can be used to perform transfusions to any individual, making it the most necessary.
  • ⁇ -galactosidases capable of processing ⁇ -type galactose bonds (1-3) blood type 0 can be mimicked from type B blood.
  • ⁇ -galactosidase is also used to eliminate the presence of raffinose that prevents the correct crystallization of caramel and thus improve production.
  • the waste product of this industry molasses, has a high content of raffinose and stachy, which means that it cannot be directly discharged due to its high biodegradability (BOD).
  • BOD biodegradability
  • This enzyme or organisms producing it are used to degrade these sugars and couple this degradation to another function such as the production of ethanol or biomass.
  • Molasses in addition, are the most widely used substrate for the production of the nearly 430000 tons of S. cerevisiae for baking (dry weight) produced annually.
  • Baking yeast strains lack ⁇ -galactosidase and Saccharomyces strains have been developed of baking with the gene encoding the S. cerevisiae var. ⁇ -galactosidase. uvarum in order to improve the production of this biomass (LiIj estróm-Suominen et al; Appl Environ Microbiol. 1988 Jan; 54 (l): 245-249).
  • ⁇ -galactosidase releases non-reducing residues in the terminal position of galactose located at terminal ends of the substrates but not internal residues ().
  • ⁇ -galactosidases possess the ability to synthesize oligosaccharides by transglycosylation and by reverse hydrolysis in the presence of high concentrations of monosaccharides (). Saccharomyces cerevisiae is one of the most studied sources of ⁇ -galactosidase and its use in logical biotech applications is widespread ().
  • uvarum (LiIj estróm-Suominen et ai, 1988). Mediated human ⁇ -galactosidase has also been produced from other yeasts, such as Pichia Pastoris (Chen, Y. et al, Protein Expr Purif. 2000 Dec; 20 (3): 472-84).
  • the present invention contributes to providing S. cerevisiae strains transformed with the constructs of the invention, producing an ⁇ -galactosidase generated from yeasts, with multiple applications in the food industry and biotechnology companies.
  • the use of the catalytic activity of ⁇ -galactosidase is of interest, for example, in the hydrolysis of rafmosa in the production of beet sugar and in the processing of soybeans; in the use of molasses by yeast strains, in the development of treatments for Fabry's disease and as a dietary supplement to maximize energy use in animal diets and to treat gastrointestinal disorders in humans.
  • the invention relates to a DNA construct comprising a heterologous promoter regulated by glucose repression, a sequence encoding a functional signal sequence in yeast, and the region of the MEL1 gene encoding the mature form of ⁇ -galactosidase or a functionally variant equivalent; where sequences (b) and (c) must be under the same reading frame.
  • the invention in another aspect, relates to a DNA construct comprising the ADH2 promoter or a functionally equivalent variant thereof, a sequence encoding a functional signal sequence in yeast and the region of a gene encoding a mature form of ⁇ - galactosidase or a functionally equivalent variant; wherein the signal sequence and the gene encoding a mature form of ⁇ -galactosidase must be under the same reading frame.
  • the invention relates to a protein encoded by any of the DNA constructs of the invention.
  • the invention relates to an expression vector containing the construction of the invention.
  • the invention relates to a microorganism that contains the constructs of the invention, the protein encoded by any of the DNA constructs of the invention, the expression vector with any of the constructs of the invention.
  • the invention relates to a method of producing ⁇ -galactosidase comprising the steps of culturing a microorganism and recovering the secreted ⁇ -galactosidase from the culture medium.
  • the invention relates to a method for obtaining cellular biomass comprising the steps of culturing a microorganism that contains the expression vector with the construction of the invention in a substrate containing non- ⁇ -D-galactose residues. reducers, in terminal position and recover cell biomass.
  • the invention in another aspect, relates to a method for obtaining ethanol comprising the steps of culturing a microorganism that contains the expression vector with the construction of the invention in a substrate containing non-reducing ⁇ -D-galactose residues. , in terminal position and recover the ethanol produced.
  • the invention relates to a microorganism containing the expression vector with the construction of the invention and also a second construction with a gene encoding a protein of interest.
  • the invention relates to a method for obtaining a protein comprising the steps of culturing a microorganism containing the expression vector with the construction of the invention and also a second construction with a gene encoding a protein of interest, in a substrate containing non-reducing ⁇ -D-galactose residues, in terminal position and recovering the protein of interest.
  • Figure 1 shows the absorbance measurements at 600 nm and the extracellular, intracellular and total ⁇ -galactosidase activity curves of the S. cerevisiae strain transformed with the secretion plasmid containing the entire gene encoding the S.-galactosidase of S. cerevisiae
  • the measures of extracellular and intracellular ⁇ -galactosidase activity are the result of four independent measures.
  • Figure 2 shows the comparison measures of the extracellular and total ⁇ -galactosidase activity of the S. cerevisiae strain transformed with the secretion plasmid containing the whole gene encoding the S. cerevisiae ⁇ -galactosidase (black symbols and lines continuous) with the S. cerevisiae strain transformed with the gene encoding the S. cerevisiae ⁇ -galactosidase under the ADHl promoter (used in US 5055401) (blank symbols and dashed lines).
  • Figure 3 shows the absorbance measurements at 600 nm and the total ⁇ -galactosidase activity curves of the S.
  • cerevisiae strain transformed with the secretion plasmid containing the entire gene encoding the S. cerevisiae ⁇ -galactosidase growing in a synthetic medium with 2% raffinose. Absorbance values at 600 nm are compared with those of the same untransformed strain with the MELl gene.
  • the invention relates to a DNA construct comprising:
  • Component (a) of the first construction of the invention is a heterologous promoter regulated by glucose repression.
  • heterologous promoter regulated by glucose repression refers to the fact that the gene of interest is regulated by a promoter of a gene other than the one of interest and, on the other hand, refers to promoters whose expression is subject to repression by glucose, of so that the expression of ⁇ -galactosidase will be repressed when it begins to increase the concentration of glucose in the medium.
  • Promoters useful for carrying out the present invention include promoters such as the S.
  • the promoter is the ADH2 gene promoter, whose sequence is SEQ ID NO: 1.
  • Component (b) of the first construct of the invention is a sequence encoding a functional signal sequence in yeast.
  • functional signal sequence in yeast refers to a peptide that is capable of promoting the secretion of any protein to the extracellular medium, in a particular embodiment, the protein is ⁇ -galactosidase.
  • signal sequences that can be used in the context of the present invention include the signal sequence of factor ⁇ of
  • S.cerevisiae and other species of the genera Kluyveromyces, Pichia, and Hansenula the killer toxin signal sequence of K. lactis, the glucoamylase II signal sequence of S. diastaticus, the glucoamylase signal sequence of C. albicans, the phosphatase signal sequence of S.cerevisiae, the signal sequence of the 128 kDa killer toxin of S.cerevisiae, the signal sequence of the S. cerevisiae invertase, as well as random sequences that are known for their ability to functionally replace signal sequences native to E.coli, as described by Kaiser ,C. et al.
  • the signal sequence and the ⁇ -galactosidase may be directly linked or, alternatively, may be separated by a spacer peptide that is bound to the ⁇ -galactosidase after the processing of the signal sequence and that may serve to identify the ⁇ -galactosidase or for purification of the culture medium.
  • any peptide or peptide sequence that allows recognition of the fusion peptide or protein can be used, for example, a peptide sequence recognized by a monoclonal antibody and which can be used to recognize the resulting fusion protein by immunoaffinity chromatography, for example, tag peptides such as c-myc, HA, E, FLAG and, in general, any other sequence recognized by an antibody.
  • any peptide or peptide sequence that allows isolation or purification of the fusion peptide or protein can be used, for example, a polyhistidine sequence, a peptide sequence recognized by a monoclonal antibody and which can serve to purify the resulting fusion protein by immunoaffinity chromatography, for example, tag peptides such as c-myc, HA, E, FLAG, etc. [Using Antibodies: A laboratory manual. Ed Harlow and David La ⁇ e (1999). CoId Spring Harbor Laboratory Press. New Cork Chapter: Tagging proteins. pp. 347-377] and, in general, any other sequence recognized by an antibody.
  • the tag peptide is the FLAG epitope (SEQ ID NO: 2), and is connected to the C-terminal end of the signal sequence and the N-terminal end of the ⁇ -galactosidase, so that after removal of the signal sequence, the FLAG epitope forms the N-terminal end of ⁇ -galactosidase.
  • the DNA construct may comprise a sequence encoding the S. cerevisiae factor ⁇ sequence (SEQ ID NO: 3) or the endogenous signal sequence of the S. cerevisiae MELl gene, fused through its 3 'end and in the same reading frame with the sequence encoding the ⁇ -galactosidase.
  • the third element (c) of the first DNA construct of the invention is the region of the MEL1 gene that encodes the mature form of the ⁇ -galactosidase protein (SEQ ID NO: 4) or a functionally equivalent variant.
  • Functionally equivalent variant of the sequence identified by SEQ ID NO: 4 means any other sequence resulting from the insertion, deletion or substitution of one or more amino acids that maintains the ⁇ -galactosidase activity.
  • Methods for the determination of ⁇ -galactosidase activity are sufficiently known in the state of the art. These methods are based on determining the ability of the enzyme to hydrolyze a chromogenic, fluorogenic or chemiluminescent conjugate, which consists of galactose conjugated to a chromophore / fluoride / chemiluminescent compound by means of an ⁇ -glycosidic bond where the release of said compound can be detected. by measuring the fluorescence released, the optical density at a given wavelength or the chemiluminescence.
  • Chromogenic compounds that can be used as ⁇ -galactosidase substrates to determine their activity include p-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (PNPG), following the method described by Kew and Douglas (Kew, OM and Douglas, H. C, 1976) which, when hydrolyzed, produces an intense yellow compound generated due to the change in pH produced by stopping the enzymatic reaction and proportional to the amount of substrate released.
  • PNPG p-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside
  • Kew and Douglas Kerw, OM and Douglas, H. C, 1976
  • Other known ⁇ -galactosidase activity assays are those described by Dey and
  • the ADH2 promoter is the alcohol dehydrogenase II gene promoter and is subject to catabolic repression.
  • the term "functional signal sequence in yeast” is defined in the first aspect and applies in the same way in this case.
  • the signal sequence is the endogenous signal sequence of the MEL1 gene or the signal sequence of yeast factor ⁇ .
  • a mature form of ⁇ -galactosidase can correspond to any ⁇ -galactosidase present in animals, plants and microorganisms.
  • a preferred embodiment would be one in which the gene encoding the ⁇ -galactosidase protein is the MELl gene.
  • the invention relates to a protein encoded by the constructs defined above and to an expression vector containing said constructs.
  • the protein generated from one of the DNA constructs of the invention comprises a functional signal sequence in yeast and an ⁇ -galactosidase fused so that the C-terminal end of the signal sequence is fused to the N-terminal end of ⁇ -galactosidase.
  • expression vector refers to a replicative DNA construct used to express DNA that encodes the polypeptide of the invention or the fusion protein of the invention and that includes a transcriptional unit comprising the assembly of (1) gene element / s that have a regulatory role in gene expression, for example, promoters, operators or enhancers, operably linked to (2) a DNA sequence encoding the polypeptide or the fusion protein of the invention that is transcribed to messenger RNA and translated into protein and (3) appropriate sequences for initiation and termination of transcription and translation.
  • Vectors that can be used in the context of the present invention typically include a genetic marker, an origin of replication in bacteria or yeast, multiple cloning sites, and a genetic marker.
  • the genetic marker is usually a gene that confers resistance to an antibiotic or, alternatively, an auxotrophic marker, in the case of yeasts.
  • Yeast vectors suitable for the present invention may be based on the following types of plasmids
  • These plasmids contain sequences that allow the generation of multiple copies of said vectors. These sequences can be called 2 ⁇ , such as the one that appears in episomal plasmids (YEp or "yeast episomal plasmids") or ARS-like sequences, such as those that appear in replication plasmids (YRps or "yeast replication plasmids").
  • yeast episomal plasmids such as the one that appears in episomal plasmids
  • ARS-like sequences such as those that appear in replication plasmids (YRps or "yeast replication plasmids”).
  • yeast replication plasmids examples of vectors based on this type of plasmids are p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD or p426GAL, YEp24 and YEplac.
  • Plasmids containing the autonomous ARSl replication sequence and a centromeric sequence (CEN4). This type of plasmids includes centromeric plasmids (YCps or "yeast centromere plasmids").
  • Plasmids that are capable of integrating into the genome of the cell that hosts them. These types of plasmids include integration plasmids (YIPs or "yeast integrating plasmids"). Examples of vectors based on this type of plasmids are pRS303, pRS304, pRS305 or pRS306 and the like.
  • the invention relates to a microorganism containing the DNA construct according to the invention, the expression vector containing the construct of the invention or the fusion protein according to the invention.
  • the microorganism is a yeast.
  • yeast is meant any eukaryotic organism belonging to the type of ascomycetes, which includes organisms generally known as yeasts as well as those generally known as filamentous fungi.
  • Yeasts and filamentous fungi include Pichia sp (for example, P. pastoris, P. finlandica, P. trehalophila, P. koclamae, P. membraneefaciens, P. minuta, P. opuntiae, P. thertnotolerans, P.
  • Trichoderma reesia Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus (eg, A. nidulans, A. niger, A. oryzae ), Hansenula polymorpha, Candida, Kloeckera, Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces sp.
  • Aspergillus eg, A. nidulans, A. niger, A. oryzae
  • Hansenula polymorpha Candida, Kloeckera, Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces sp.
  • Aspergillus sp for example, Aspergillus nidulans, Aspergillum niger, Aspergillus oryzae
  • Trichoderma reesei Trichoderma reesei
  • Chrysosporium luchiowense Fusarium sp. (for example, Fusarium gramineum, Fusarium venenatum), Physcomitrella patens.
  • yeast any yeast can be used for the implementation of the process of the invention; however, in a particular embodiment, said yeast is a yeast of the genus Saccharomyces, such as S. cerevisiae.
  • Suitable methods for introducing a DNA molecule into a yeast cell include:
  • - Transformation of spheroplasts which involves removing the cell wall of the yeast and contacting the spheroplasts with the plasmid in the presence of PEG.
  • - Transformation with Li + which involves the treatment of yeast cells with monovalent alkali cations (Na + , K + , Rb + , Cs + and Li + ) in combination with PEG to stimulate the uptake of DNA by intact cells.
  • Electroporation which implies the administration of electrical pulses to yeasts, resulting in the opening of pores in the spheroplast membrane and intact yeast cells.
  • the microorganisms of the invention are capable of producing and secreting the ⁇ -galactosidase medium.
  • the invention relates to a method for producing ⁇ -galactosidase comprising culturing a microorganism according to the invention and recovering the secreted ⁇ -galactosidase from the culture medium.
  • the ⁇ -galactosidase protein can be conveniently purified in a single affinity chromatography step by using substrate analogs, such as, for example, p-aminophenyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (Steers, E. et al, 1970, J. Biol.Chem. 246: 196-200).
  • substrate analogs such as, for example, p-aminophenyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the determination of the degree of purity of ⁇ -galactosidase can be estimated by the value of the specific enzyme activity that is calculated by dividing the number of units of enzyme activity by the amount of mg. of protein in a given volume.
  • the enzymatic activity is determined by the method of Guarente, L. (Methods Enzymol. 1983, 101: 181-191).
  • the microorganisms of the invention are capable of growing in media containing a substrate rich in non-reducing ⁇ -D-galactose residues in the terminal position as the sole source of carbon.
  • the invention relates to a method for obtaining cellular biomass from a non-reducing composition rich in non-reducing ⁇ -D-galactose residues comprising (a) culturing a microorganism comprising one of the constructs of the invention and (b) recover the biomass from the culture medium.
  • Preferred terminal-rich non-reducing ⁇ -D-galactose residues are media rich in stachyose, raffinose, melibious, sugarcane and / or beet molasses, soy protein permeate and a combination of any of the above.
  • the biomass can be recovered from the culture medium by any technique known to the person skilled in the art including, without being limited, centrifugation, deposition or filtration. Preferably, the technique employed should minimize damage to the cells. In case the same culture is used for the preparation of biomass and the production of ⁇ -galactosidase, the separation of the biomass from cells should minimize the loss of ⁇ -galactosidase.
  • the microorganism recovered from the culture medium is washed with an aqueous solution to remove unwanted materials that could be associated therewith.
  • the protein content in yeast is between 35 and 65%.
  • the recovered yeast biomass can be used as an ingredient in food products without the need for additional processing.
  • the recovered biomass can also be lysed and, optionally, separate intact cells.
  • the yeast cells used can be used in culture media as a yeast extract or can be further processed to separate their different components, such as peptides, nucleotides, amino acids or specific cell wall components such as chitin, glucans, mannans and oligosaccharides .
  • Susceptible substrates are digested by the yeast of the invention, generating galactose that would be a suitable substrate for fermentation alcoholic producing ethanol or other compounds.
  • the invention relates to a method for obtaining a fermentation product comprising the steps of culturing a microorganism in a medium rich in non-reducing ⁇ -D-galactose residues in terminal position, wherein said yeast comprises a DNA construct that encodes a fusion protein with the mature form of a fused ⁇ -galactosidase in the same reading frame with a signal sequence, wherein said signal sequence is capable of promoting the secretion of the ⁇ -galactosidase from a cell of yeast and (b) recover the fermentation product from the culture medium.
  • fermentation product a product that can be obtained from a yeast from a sugar under anaerobic conditions.
  • Fermentation products that can be obtained using the strains and methods of the present invention include alcohols (ethanol, methane 1, butane 1), organic acids (for example, citric acid, acetic acid, itaconic acid), ketones (for example, acetone), amino acids (for example, glutamic acid), gases (H 2 and CO 2 ), antibiotics (penicillin, tetracycline), etc.
  • the fermentation product is ethanol, which can be used as fuel, in beverages or industrially.
  • alcoholic fermentation to give rise to ethanol is carried out for 30-60 h at a temperature of around 32 0 C.
  • the culture conditions for the production of fermentation products are essentially the same as those used in the production of ⁇ -galactosidase, in regard to the culture media that can be used as a carbon source. However, in order to improve the reaction yield, it is important that the culture conditions are those that favor the fermentation of the monosaccharides. Once the appropriate concentration of fermentation product in the medium has been reached, it is necessary to recover said product from the medium. The way to recover the product will depend on the chemical nature of the product. In the event that the fermentation product is ethanol, it is recovered using conventional techniques, including, for example, distillation.
  • microorganisms of the present invention can also be transformed with a second expression vector containing a gene encoding a protein of interest and thus be used for the production of proteins of interest by culturing said doubly transformed strains in a culture medium. rich in non-reducing ⁇ -D-galactose residues in the terminal position, as the only carbon source.
  • the invention relates to a microorganism comprising, in addition to the first construction of the invention, a second construction with a gene encoding a protein of interest.
  • Expression vectors that can be used for the expression of heterologous proteins are essentially the same as those that can be used for expression of the fusion protein with ⁇ -galactosidase. However, it is convenient that the two vectors have different selection markers to ensure that both remain stably in yeasts. Additionally, the promoters that regulate the expression of the heterologous protein may be the same as those used to regulate the expression of fusion proteins.
  • Promoters useful for the realization of the present construction include: - Constitutive promoters such as, for example, the alcohol dehydrogenase (ADHl) promoter, the elongation factor 1 alpha (TEF) promoter and the gene promoter that encodes the triose phosphate isomerase (TPI), the glyceraldehyde promoter 3- phosphate dehydrogenase (GPD) and the 3-phosphoglycerate kinase promoter (GPK), the MRP7 promoter and the alcohol oxidase (AOXl) promoter.
  • ADHl alcohol dehydrogenase
  • TEZ elongation factor 1 alpha
  • TPI triose phosphate isomerase
  • GPD glyceraldehyde promoter 3- phosphate dehydrogenase
  • GPK 3-phosphoglycerate kinase promoter
  • MRP7 promoter the alcohol oxidase
  • - Inducible promoters such as the metallothionein promoter (CUPl) whose expression is regulated by adding copper to the culture medium, the promoter of the gene encoding the FUSl gene or the FUS2 gene, whose expression is activated in the presence of pheromones ( factor ⁇ ) as described in US5063154, the TET promoter whose expression is regulated in the presence of tetracyclines, the GALl-IO, GALL, GALS promoters that are activated in the presence of galactose, the estrogen inducible VP 16-ER promoter, and the phosphatase promoter (PH05) whose expression is activated in the presence of phosphate and the HSP150 thermal shock protein promoter, whose expression is activated at elevated temperature.
  • CUPl metallothionein promoter
  • PH05 phosphatase promoter
  • - Suppressive promoters such as the promoter of the enolasa (ENO-I) gene of S.cerevisiae whose expression can be repressed when the microorganism is grown in a non-fermentable carbon source as well as promoters whose expression is subject to repression by glucose, so that the expression will be repressed when part of the lactose has been hydrolyzed and begins to increase the concentration of glucose in the medium, the promoter of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH2 / GAP) of S. cerevisiae and the galactokinase promoter (GALl).
  • ENO-I enolasa
  • ADH2 / GAP glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • GALl galactokinase promoter
  • the two constructs so that the expression of the ⁇ -galactosidase and the heterologous protein can be regulated independently.
  • the promoter used to regulate its expression is conveniently an adjustable promoter, so that the expression of the protein of interest can be delayed until Sufficient levels of biomass have been reached.
  • the invention contemplates the use of stachy, raffinose, melibious, sugar cane and / or beet molasses, soy protein permeate and a combination of any of the above.
  • the proteins of interest may lack a signal sequence or, alternatively, they may be synthesized with a signal sequence in order to cause their release to the culture medium and thus facilitate their recovery.
  • Signal sequences that can be used in the context of the present invention essentially include the same ones that can be used to promote the secretion of ⁇ -galactosidase.
  • the doubly transformed strains can be conveniently used for the production of proteins of interest using non-reducing ⁇ -D-galactose residues in the terminal position as the main carbon source.
  • the invention relates to a method for obtaining a protein of interest comprising the steps of (a) cultivating a doubly transformed yeast strain according to the invention in a medium rich in residues of ⁇ - Non-reducing D-galactose in the terminal position and (b) recover the protein of interest from the medium.
  • the medium rich in non-reducing ⁇ -D-galactose residues in the terminal position is stachy, melibious, raffinose, sugar cane and / or beet molasses, soy protein permeate and a combination of any of the above.
  • the protein of interest that can be expressed using the strains and methods of the present invention. These include both human and mammalian proteins of therapeutic interest and enzymes of different origins that allow reconstituting metabolic pathways in yeast and the consequent production of compounds of interest.
  • proteins of therapeutic interest that can be produced by the cells object of the invention are erythropoietin (EPO), adrenocorticotropic hormone releasing hormone (CRH), somatotropic hormone releasing hormone (GHRH), gonadotro fine releasing hormone (GnRH), Thyrotropin-releasing hormone (TRH), prolactin-releasing hormone (PRH), melatonin-releasing hormone (MRH), prolactin-inhibiting hormone (PIH), somato statine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), somatotropic or growth hormone (GH), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), thyrotropin (TSH or hormone Thyroid stimulant), prolactin, oxytocin, antidiuretic hormone (ADH or vasopressin), melatonin, Müllerian inhibitory factor, calcitonin, paratyphoid hormone, gastrin, cholecystokin
  • yeast cells are lysed by hypotonic lysis of spheroplasts previously formed by glucanase treatment, by sonication or by agitation in the presence of glass balls.
  • Two pairs of primers were designed in order to amplify by PCR (Polymerase Chain Reaction) the MEL1 gene encoding Saccharomyces cerevisiae ⁇ galactosidase.
  • Two fragments were amplified, one of them corresponding to the complete ⁇ galactosidase gene (SEQ ID NO: 4), amplified with the following primers, with SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and the other fragment corresponding to the gene of the ⁇ galactosidase to which the 54 nucleotides that encode the secretion signal (SEQ ID NO: 7) and amplified by the following primers were removed, with sequences SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • the complete gene galactosidase ⁇ was inserted into the YEpFLAGl vector for expression in yeast under the ADH2 (Alcohol dehydrogenase 2) (SEQ ID NO: 1) (Eastman Kodak Company Cat N 0 IB 13,400.) And the transcriptional terminator of CYCl gene (SEQ ID NO: 10).
  • the second amplification product with the ⁇ galactosidase gene without the secretion signal was inserted into a vector like the previous one, which also presents the secretion signal of the yeast ⁇ factor (83 amino acids) and the FLAG peptide for subsequent detection immunological (SEQ ID NO: 2).
  • the resulting constructions were transformed into a strain of Saccharomyces cerevisiae (pep4 :: HIS3 prb-A1.6R HIS3 lys2-208 trpl-AWl ura3-52 gal2 canl) by the method of Lithium Acetate (Ito et al, J Bacteriol. 1983 Jan; 153 (l): 163-8).
  • the strains transformed with the two constructs were grown in CM medium (Zitomer et al, J Biol Chem. 1976 Oct 25; 251 (20): 6320-6), using tryptophan as an auxotrophic marker. When they reached the stationary growth phase they were used to inoculate 100 ml of YPHSM medium (1% glucose, 3% glycerol, 1% yeast extract and 8% peptone) or the same culture medium but containing raffinose at 2% instead of 1% glucose.
  • YPHSM medium 1% glucose, 3% glycerol, 1% yeast extract and 8% peptone
  • cultures were carried out in 2 liters of medium in Biostat-MD (Braun-Biotech) fermenters, monitoring the aeration (2 1 / min), temperature (3O 0 C), pH, agitation (250 rpm). Samples were collected at different time intervals and the parameters mentioned above were also analyzed.
  • PNPG chromogenic substrate p-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside
  • Figure 1 shows the cell growth obtained by absorbance measurements at 600 nm and the extracellular and intracellular ⁇ -galactosidase activity of the S. cerevisiae strain transformed with the expression plasmid containing the whole MEL gene encoding the ⁇ - S. cerevisiae galactosidase growing in a synthetic medium with 1% glucose. Enzymatic activity data shown in the
  • UE / ml on average of ⁇ -galactosidase to the culture medium, between 90 and 140 hours, the total average activity being for that same time interval of 32000 UE / ml, which means that extracellular activity is 58.4 % of the total.
  • the absorbance measurements at 600 nm and total ⁇ -galactosidase activity of the strain growing in a synthetic medium with 2% raffinose are shown growing in 2% raffinose. It can be seen that while the untransformed strain reaches absorbance values around 12 at the end of the culture, in the transformed strain they practically double reaching values around 22.
  • the untransformed strain can use only the raffinose fructose, but it is not able to metabolize the melibiosa.
  • the transformed strain in addition to using the raffinose fructose, is able to use the melibiosa.
  • HPLC determination of raffinose, melibious, fructose, glucose and galactose sugars confirmed the presence of melibiosa in the culture in the untransformed strain while the melibiosa practically disappears at 48 in the transformed strain.
  • Example 1 Cloning details and measures of ⁇ -galactosidase activity are described in Example 1. Cultivation of the recombinant strain [A] was carried out in a synthetic medium with 1% glucose.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La invención se relaciona con cepas de S. cerevisae que son capaces de producir @-galactosidasa bajo el control de un promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa, en concreto ADH2. Para su mejor secreción, el gen de la @-galactosidasa tiene fusionada una secuencia señal, en concreto el factor α de levadura. Dichas cepas son útiles para la producción de @-galactosidasa, de biomasa y de etanol, a partir de un medio rico en rafinosa, melibiosa y/o estaquinosa.

Description

CEPAS DE S.CEREVISIAE CAPACES DE CRECER EN MEDIOS CON MELIBIOSA, ESTAQUIOSA Y RAFINOSA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con cepas de S. cerevisiae que son capaces de producir α-galactosidasa. Para su mejor secreción, el gen de la α-galactosidasa tiene fusionada una secuencia señal. Dichas cepas son útiles en métodos para la producción de α- galactosidasa, de biomasa y de etanol, a partir de un medio rico en rafmosa, melibiosa y/o estaquiosa y, en el caso de que las cepas contengan una segunda construcción que exprese una proteína de interés terapéutica, para la producción de dichas proteínas terapéuticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las α-galactosidasas (EC 3.2.1.22) catalizan la hidrólisis de residuos de galactosa unidos por enlaces α(l,6) de galacto-oligosacáridos y galacto-mananos poliméricos (polímeros de mañosas con ramificaciones de galactosa), así como la de oligosacáridos como la estaquiosa, rafinosa y melibiosa presentes en habas, soja y otras legumbres. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en animales, plantas y microorganismos. Sin embargo, la mayoría de los mamíferos monogástricos, incluidos los humanos, carecen de α-galactosidasa pancreática, de manera que este tipo de oligosacáridos no pueden ser digeridos en el sistema digestivo y son fermentados por la microflora intestinal produciendo gases que generan flatulencia y otro tipo de desórdenes gastrointestinales que pueden causar problemas de diferente consideración en individuos sensibles. El caso de la soja y los productos derivados de ésta tiene especial importancia pues son un componente importante en la dieta de muchas personas, puesto que constituye una buena fuente de proteínas y se utiliza en algunos casos como sustituto de productos lácteos, por ejemplo en personas con intolerancia a la lactosa. Para el tratamiento de estos desórdenes existen suplementos alimentarios consistentes en concentrados de α-galactosidasa de diferentes orígenes (Lactococus, Aspergillus niger, Saccharomyces, etc.) como por ejemplo los comprimidos fabricados por Promefarm (Sinaire). El pretratamiento con α-galactosidasa de estos productos de la soja, así como de otros preparados para nutrición humana y animal con contenido elevado en oligosacáridos no digeribles como la rafinosa y la estaquiosa, constituye una buena alternativa para evitar estos problemas gastrointestinales. Además contribuye al aumento del valor nutricional de los mismos; este punto tiene gran importancia en nutrición animal puesto que se aumenta el aprovechamiento energético de los piensos.
En humanos, la α-galactosidasa es una exoglicosidasa lisosómica que actúa sobre residuos terminales de tipo α-galactosil de glicolípidos y glicoproteínas. Mutaciones en este gen provocan deficiencias en estas degradaciones que resultan en la enfermedad de Fabry (esfingolipodisis ligada al cromosoma X). Esta enfermedad presenta una incidencia de 1/40.000. En la actualidad existen tratamientos, como el desarrollado por la empresa Genzyme Corp. (Fabrazyme), basado en la técnica de reemplazamiento enzimático para tratar esta enfermedad mediante la utilización de α-galactosidasa de humanos expresada en ratones CHO. Como alternativa más rentable a la utilización de células de mamíferos para la producción heteróloga de la proteína, se ha estudiado la utilización de α-galactosidasa humana expresada de forma recombinante en levaduras.
Por otro lado, el cáliz glicoproteico de la superficie celular de glóbulos rojos determina, entre otras muchas funciones, el tipo sanguíneo de cada individuo. La sangre de tipo 0 puede ser empleada para realizar transfusiones a cualquier individuo por lo que es la más necesaria. Empleando α-galactosidasas capaces de procesar enlaces de galactosa de tipo α (1-3) se puede imitar el tipo sanguíneo 0 a partir de sangre de tipo B.
En la producción de caramelo y de azúcar a nivel industrial también se utiliza la α-galactosidasa para eliminar la presencia de rafinosa que impide la correcta cristalización del caramelo y mejorar así la producción. Además, el producto de desecho de esta industria, las melazas, tiene un elevado contenido en rafinosa y estaquiosa, que hace que no pueda ser vertido de forma directa al tener una elevada biodegradabilidad (DBO). Esta enzima u organismos productores de la misma son empleados para degradar estos azúcares y acoplar esta degradación a otra función como puede ser la producción de etanol o de biomasa. Las melazas, además, son el sustrato más utilizado para la producción de las cerca de 430000 toneladas de S. cerevisiae para panificación (peso seco) que se producen anualmente. Las cepas de levaduras empleadas en panificación carecen de α-galactosidasa y se han desarrollado cepas de Saccharomyces de panificación con el gen que codifica para la α-galactosidasa de S. cerevisiae var. uvarum con el fin de mejorar la producción de esta biomasa (LiIj estróm-Suominen et al; Appl Environ Microbiol. 1988 Jan;54(l):245-249).
En el caso de levaduras, se ha descrito que la α-galactosidasa libera los residuos no reductores en posición terminal de galactosa situados en extremos terminales de los sustratos pero no los residuos internos (). Además de la actividad hidrolítica, las α- galactosidasas poseen la capacidad de sintetizar oligosacáridos por transglicosilación y por hidrólisis inversa en presencia de concentraciones elevadas de monosacáridos (). Saccharomyces cerevisiae es una de las fuentes de α-galactosidasa más estudiada y su utilización en aplicaciones biotecno lógicas está ampliamente extendida ().
Dada la importancia y las amplias aplicaciones biotecnológicas de esta enzima, existen datos acerca de la producción de α-galactosidasa a partir de bacterias como Bacillus stearothermophilus (patente US n° 3846239), Thermus sp. cepa T2 (patente ES n° 2172380), Streptomyces griseoloalbus (Anisha et al.; Appl Biochem Biotechnol. 2008 Sep 4), sin embargo, y dado que muchas de las aplicaciones que va a tener esta enzima van a estar relacionados con el procesamiento o la preparación de materiales relacionados con la alimentación bien animal o bien humana, es esencial que el microorganismo que se vaya a utilizar sea GRAS (General Recognised As Safe), como es el caso de S. cerevisiae. También existen datos de la producción de α-galactosidasa a partir de cepas de hongos de los géneros Neurospora y Rhizopus (Worthington y Beuchat, J Agrie Food Chem. 1974; 22(6): 1063-6), Aspergillus oryzae, A. foetidus (Liu et al, Lett Appl Microbiol. 2007 Aug;45(2):206-12), A. ficuum (Zapater et al, Prep Biochem. 1990;20(3-4):263-96) y A. niger entre otros (patentes US n° 6197566 y n° 5919690) aunque uno de los principales inconvenientes de la producción en hongos es la producción de productos secundarios no deseados. En el caso de la producción de α- galactosidasa en A. niger se producen cantidades importantes de ácido oxálico. Asimismo, existen datos de producción de α-galactosidasa no humana, como la de la planta guar (Cyamopsis tetragonoloba) fusionada a diferentes secuencias señal (Harmsen, M. et al, Gene. 1993 Mar 30; 125(2): 115-23). En cuanto a la producción en levaduras, la patente US 4431737 describe una cepa mutada de S. cerevisiae productora de α-galactosidasa obtenida por mutagénesis mediante radiaciones ultravioleta. El inconveniente de las cepas mutadas mediante un tratamiento mutagénico con radiación ultravioleta, es que este tratamiento altera fundamentalmente el ADN por la formación de dímeros de pirimidinas provocando una distorsión local de la configuración de la doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento y la respiración. Por lo tanto, las cepas así mutadas además de poder presentar otras mutaciones no deseadas suelen presentar lentos crecimientos. Existe también otra patente (US n° 5055401) en la cual se han construido cepas de Saccharomyces transformadas con el gen que codifica para la α-galactosidasa de S. cerevisiae var. uvarum (LiIj estróm-Suominen et ai, 1988). Se ha producido también α-galactosidasa humana secretada al medio a partir de otras levaduras, como Pichia Pastoris (Chen, Y. et al, Protein Expr Purif. 2000 Dec;20(3):472-84).
Por tanto, es un objetivo de especial interés en biotecnología la producción y obtención de la α-galactosidasa a partir de levaduras, de una manera eficiente y mejorada.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención contribuye a proporcionar cepas de S. cerevisiae transformadas con las construcciones de la invención, produciéndose una α- galactosidasa generada a partir de levaduras, con múltiples aplicaciones en la industria de la alimentación y empresas biotecnológicas. El aprovechamiento de la actividad catalítica de la α-galactosidasa es de interés, por ejemplo, en la hidrólisis de rafmosa en la producción de azúcar de remolacha y en el procesamiento de la soja; en la utilización de melazas por las cepas de levadura, en el desarrollo de tratamientos para la enfermedad de Fabry y como suplemento dietético para maximizar el aprovechamiento energético en dietas animales y para tratar desórdenes gastrointestinales en humanos.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende un promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa, una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura, y la región del gen MELl que codifica la forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente; en donde las secuencias (b) y (c) han de estar bajo el mismo marco de lectura.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende el promotor ADH2 o una variante funcionalmente equivalente del mismo, una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura y la región de un gen que codifica una forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente; en donde la secuencia señal y el gen que codifica una forma madura de α- galactosidasa han de estar bajo el mismo marco de lectura.
En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína codificada por alguna de las construcciones de ADN de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector de expresión que contiene la construcción de la invención.
Aún en otro aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo que contiene las construcciones de la invención, la proteína codificada por alguna de las construcciones de ADN de la invención, el vector de expresión con alguna de las construcciones de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir α- galactosidasa que comprende las etapas de cultivar un microorganismo y recuperar la α- galactosidasa secretada del medio de cultivo. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de biomasa celular que comprende las etapas de cultivar un microorganismo que contiene el vector de expresión con la construcción de la invención en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores, en posición terminal y recuperar la biomasa celular. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de etanol que comprende las etapas de cultivar un microorganismo que contiene el vector de expresión con la construcción de la invención en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores, en posición terminal y recuperar el etanol producido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo que contiene el vector de expresión con la construcción de la invención y además una segunda construcción con un gen que codifica una proteína de interés. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de una proteína que comprende las etapas de cultivar un microorganismo que contiene el vector de expresión con la construcción de la invención y además una segunda construcción con un gen que codifica una proteína de interés, en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores, en posición terminal y recuperar la proteína de interés.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra las medidas de absorbancia a 600 nm y las curvas de actividad α-galactosidasa extracelular, intracelular y total de la cepa de S. cerevisiae transformada con el plásmido de secreción conteniendo el gen íntegro que codifica la α- galactosidasa de S. cerevisiae. Las medidas de actividad α-galactosidasa extracelular e intracelular son el resultado de cuatro medidas independientes.
La Figura 2 muestra las medidas de comparación de la actividad α-galactosidasa extracelular y total de la cepa de S. cerevisiae transformada con el plásmido de secreción conteniendo el gen íntegro que codifica la α-galactosidasa de S. cerevisiae (símbolos en negro y líneas continuas) con la cepa de S. cerevisiae transformada con el gen que codifica la α-galactosidasa de S. cerevisiae bajo el promotor ADHl (utilizada en US 5055401) (símbolos en blanco y líneas discontinuas). La Figura 3 muestra las medidas de absorbancia a 600 nm y las curvas de actividad α-galactosidasa total de la cepa de S. cerevisiae transformada con el plásmido de secreción conteniendo el gen íntegro que codifica la α-galactosidasa de S. cerevisiae creciendo en un medio sintético con rafinosa al 2%. Se comparan los valores de absorbancia a 600 nm con los de la misma cepa sin transformar con el gen MELl .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado una construcción de ADN que está compuesta por un promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa, una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura fusionada en el mismo marco de lectura con un gen que codifica la forma madura de la α-galactosidasa de S. cerevisiae. Han puesto de manifiesto que las cepas de levadura que contienen dicha construcción secretan α-galactosidasa al medio en su forma activa, lo que permite el uso de las cepas para múltiples aplicaciones en la industria de la alimentación y empresas biotecnológicas. Gracias a estas características, las cepas proporcionan una solución a los problemas existentes en el estado de la técnica. Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende:
(a) un promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa,
(b) una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura, y
(c) la región del gen MEL 1 que codifica la forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente, en donde las secuencias (b) y (c) han de estar bajo el mismo marco de lectura. En adelante, se denominará primera construcción de la invención.
El componente (a) de la primera construcción de la invención es un promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa. El término "promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa" se refiere a que el gen de interés está regulado por un promotor de un gen distinto al de interés y por otro lado, se refiere a promotores cuya expresión está sujeta a represión por glucosa, de forma que la expresión de la α- galactosidasa se verá reprimida cuando comience a aumentar la concentración de glucosa en el medio. Promotores útiles para la realización de la presente invención incluyen promotores tales como el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) de S. cerevisiae, el promotor de la galactoquinasa (GALl y GAL7) y el del gen de 3- fosfoglicerato quinasa (PGK). En una forma de realización preferida, el promotor es el promotor del gen ADH2, cuya secuencia es SEQ ID NO: 1. El componente (b) de la primera construcción de la invención es una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura.
Por "secuencia señal funcional en levadura" se refiere a un péptido que es capaz de promover la secreción de cualquier proteína al medio extracelular, en una realización particular, la proteína es la α-galactosidasa. Ejemplos ilustrativos pero no limitativos de secuencias señal que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen la secuencia señal del factor α de
S.cerevisiae y de otras especies de los géneros Kluyveromyces, Pichia, y Hansenula, la secuencia señal de la toxina killer de K. lactis, la secuencia señal de la glucoamilasa II de S. diastaticus, la secuencia señal de la glucoamilasa de C. albicans, la secuencia señal de la fosfatasa de S.cerevisiae, la secuencia señal de la toxina killer de 128 kDa de S.cerevisiae, la secuencia señal de la invertasa de S. cerevisiae, así como secuencias aleatorias que son conocidas por su capacidad por reemplazar funcionalmente secuencias señales nativas de E .coli, tal y como han sido descritas por Kaiser,C. et al. (Science, 1987, 235:312-317) y secuencias señal que pueden ser identificadas usando los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo por Gallicioti,G. et al. J. Membrane Biology, 183:175-182). La secuencia señal y la α-galactosidasa pueden estar directamente unidas o, alternativamente, pueden estar separadas por un péptido espaciador que queda unido a la α-galactosidasa tras el procesamiento de la secuencia señal y que puede servir para la identificación de la α-galactosidasa o para su purificación del medio de cultivo. En el primero de los casos, prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el reconocimiento del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para reconocer la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo. En el segundo de los casos, prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia de polihistidina, una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG, etc. [Using Antibodies: A laboratory manual. Ed Harlow and David Lañe (1999). CoId Spring Harbor Laboratory Press. New Cork. Capítulo: Tagging proteins. pp. 347-377] y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo. Preferiblemente, el péptido etiqueta es el epítopo FLAG (SEQ ID NO :2), y se encuentra conectado al extremo C-terminal de la secuencia señal y al extremo N-terminal de la α-galactosidasa, de forma que tras la eliminación de la secuencia señal, el epítopo FLAG forma el extremo N-terminal de la α-galactosidasa. En una forma de realización preferida, la construcción de ADN puede comprender una secuencia que codifica la secuencia del factor α de S. cerevisiae (SEQ ID NO:3) o la secuencia señal endógena del gen MELl de S. cerevisiae, fusionado a través de su extremo 3 ' y en el mismo marco de lectura con la secuencia que codifica la α- galactosidasa.
El tercer elemento (c) de la primera construcción de ADN de la invención es la región del gen MELl que codifica la forma madura de la proteína α-galactosidasa (SEQ ID NO: 4) o una variante funcionalmente equivalente.
Por variante funcionalmente equivalente de la secuencia identificada por SEQ ID NO :4, se entiende cualquier otra secuencia resultante de la inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos que mantiene la actividad α-galactosidasa.
Métodos para la determinación de la actividad α-galactosidasa son suficientemente conocidos en el estado de la técnica. Dichos métodos se basan en determinar la capacidad de la enzima de hidrolizar un conjugado cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente, que consta de galactosa conjugado a un compuesto cromóforo/fluoruro/qumioluminiscente mediante un enlace α-glicosídico en donde la liberación de dicho compuesto se puede detectar mediante medición de la fluorescencia liberada, de la densidad óptica a una longitud de onda determinada o de la quimioluminscencia. Compuestos cromogénicos que pueden usarse como sustratos de la α-galactosidasa para determinar su actividad incluyen el p-nitrofenil-α-D- galactopiranósido (PNPG), siguiendo el método descrito por Kew y Douglas (Kew, O. M. y Douglas, H. C, 1976) que, al ser hidrolizado, produce un compuesto de color amarillo intenso generado a causa del cambio de pH producido al parar la reacción enzimática y proporcional a la cantidad de sustrato liberado. Otros ensayos de actividad α-galactosidasa conocidos son los descritos por Dey y
Pridham, 1969 (Dey, P.M., Pridham, J.B., 1969. Biochem. J. 113, 49-55); Lazo et al., 1977 (Lazo, P. S., Ochoa, A. G., Gascón, S., 1977. Eur. J. Biochem. 77(2): 375-382); Ryan et al, 1998 (Ryan, M.P., Jones, R., Morse, R.H., 1998. Mol CeIl Biol 18(4): 1774- 82); Garroa et al, 2004 (Garroa MS, Valdeza GF, Gioria GS., 2004. Food Microbiol 21 :511-8.); Liu et al, 2007 (Liu, C, Rúan, H., Shen, H., Chen, Q., Zhou, B., Li, Y., He, G., 2007. J Food Sci 72(4): M120-M125). Condiciones adecuadas para la realización del ensayo α-galactosidasa son ampliamente conocidos en la materia. Por ejemplo, en Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1982)). En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende:
(a) el promotor ADH2 o una variante funcionalmente equivalente del mismo,
(b) una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura, y
(c) la región de un gen que codifica una forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente, en donde las secuencias (b) y (c) han de estar bajo el mismo marco de lectura.
El promotor ADH2 es el promotor del gen alcohol deshidrogenasa II y está sujeto a represión catabólica.
El término "secuencia señal funcional en levadura" se encuentra definido en el primer aspecto y aplica de la misma manera en este caso. En una forma de realización preferida, la secuencia señal es la secuencia señal endógena del gen MELl o la secuencia señal del factor α de levadura.
Una forma madura de α-galactosidasa puede corresponder a cualquier α- galactosidasa presente en animales, plantas y microorganismos. Para el término "variante funcionalmente equivalente" se aplican los mismos criterios que para el primer aspecto. Una forma de realización preferida sería aquella en la que el gen que codifica la proteína α-galactosidasa es el gen MELl.
Por otro lado, en otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína codificada por las construcciones definidas anteriormente y con un vector de expresión que contiene dichas construcciones.
La proteína generada a partir de una de las construcciones de ADN de la invención comprende una secuencia señal funcional en levadura y una α-galactosidasa fusionadas de forma que el extremo C-terminal de la secuencia señal se encuentra fusionado con el extremo N-terminal de la α-galactosidasa. El término "vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN replicativo utilizado para expresar ADN que codifica el polipéptido de la invención o la proteína de fusión de la invención y que incluye una unidad transcripcional que comprende el ensamblaje de (1) elemento/s génico/s que tienen un papel regulatorio en la expresión génica, por ejemplo, promotores, operadores o "enhancers" ( aumentadores), operativamente unidos a (2) una secuencia de ADN que codifica el polipéptido o la proteína de fusión de la invención que es transcrito a ARN mensajero y traducido a proteína y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y traducción.
Los vectores que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen, típicamente, un marcador genético, un origen de replicación en bacterias o en levaduras, sitios múltiples de clonaje, y un marcador genético. El marcador genético es, habitualmente, un gen que confiere resistencia a un antibiótico o, alternativamente, un marcador auxotrófico, en el caso de levaduras.
Los vectores de levaduras adecuados para la presente invención pueden estar basados en los siguientes tipos de plásmidos
- Plásmidos autónomos multicopia: Estos plásmidos contienen secuencias que permiten la generación de múltiples copias de dichos vectores. Estas secuencias pueden ser las denominadas 2μ, como la que aparece en los plásmidos episomales (YEp o "yeast episomal plasmids") o secuencias tipo ARS, como las que aparecen en los plásmidos de replicación (YRps o "yeast replication plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD o p426GAL, YEp24 y YEplac.
- Plásmidos autónomos de una única copia: Plásmidos que contienen la secuencia autónoma de replicación ARSl y una secuencia centromérica (CEN4). Este tipo de plásmidos incluye los plásmidos centroméricos (YCps o "yeast centromere plasmids").
- Plásmidos de integración: Plásmidos que son capaces de integrarse en el genoma de la célula que los hospeda. Este tipo de plásmidos incluyen plásmidos de integración (YIPs o "yeast integrating plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son pRS303, pRS304, pRS305 o pRS306 y similares.
En general, todos los vectores mencionados en Sikorski ("Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae" , in Plasmid, A Practical Approach, Ed. K. G. Hardy, IRL Press, 1993) y en Ausubel et al. ("Yeast Cloning Vectors and Genes" Current Protocols in Molecular Biology, Section II, Unit 13.4, 1994) son útiles en el contexto de la presente invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo que contiene la construcción de ADN según la invención, el vector de expresión que contiene la construcción de la invención o la proteína de fusión según la invención. En una realización particular, el microorganismo es una levadura. Por levadura se entiende cualquier organismo eucariota perteneciente al tipo de los ascomicetos, que incluye los organismos conocidos de forma general como levaduras así como los conocidos de forma general como hongos filamentosos. Las levaduras y los hongos filamentosos incluyen Pichia sp (por ejemplo, P. pastoris, P. finlandica, P. trehalophila, P. koclamae, P. membranaefaciens, P. minuta, P. opuntiae, P. thertnotolerans, P. salictaria, P. guercuum, P. pijperi, P. stiptis, P. methanolicá), Saccharomyces (S. cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo, K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramü, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans, and K. marxianus, K. yarrowia), Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus (por ejemplo, A. nidulans, A. niger, A. oryzae), Hansenula polymorpha, Candida, Kloeckera, Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces sp. (por ejemplo, Kluyveromyces lactis), Candida albicans, Aspergillus sp (por ejemplo, Aspergillus nidulans, Aspergillum niger, Aspergillus oryzae), Trichoderma reesei, Chrysosporium luchiowense, Fusarium sp. (por ejemplo, Fusarium gramineum, Fusarium venenatum), Physcomitrella patens.
Prácticamente cualquier levadura puede ser utilizada para la puesta en práctica del procedimiento de la invención; no obstante, en una realización particular, dicha levadura es una levadura del género Saccharomyces, como S. cerevisiae.
Para la obtención de la levadura de la invención, es necesario introducir el vector que contiene la construcción en la célula de levadura. Métodos adecuados para introducir una molécula de ADN en una célula de levadura incluyen:
- Transformación de esferoplastos, lo que implica eliminar la pared celular de la levadura y poner en contacto las esferoplastos con el plásmido en presencia de PEG. - Transformación con Li+, que implica el tratamiento de células de levadura con cationes alcalinos monovalentes (Na+, K+, Rb+, Cs+ y Li+) en combinación con PEG para estimular la captación del ADN por las células intactas.
- Electroporación, que implica la administración de pulsos eléctricos a las levaduras lo que resulta en la apertura de poros en la membrana de esferoplastos y de células de levadura intactas.
Los microorganismos de la invención son capaces de producir y secretar al medio α-galactosidasa. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir α-galactosidasa que comprende cultivar un microorganismo de acuerdo a la invención y recuperar la α-galactosidasa secretada del medio de cultivo.
La proteína α-galactosidasa puede purificarse convenientemente en un único paso de cromatografía de afinidad mediante el uso de análogos de sustrato, como por ejemplo, el p-aminofenil-β-D-tiogalactopiranosido (Steers, E. et al, 1970, J.Biol.Chem. 246:196-200). La determinación del grado de pureza de la α-galactosidasa se puede estimar mediante el valor de la actividad enzimática específica que se calcula dividiendo el número de unidades de actividad enzimática entre la cantidad de mg. de proteína en un volumen determinado. Preferiblemente, la actividad enzimática se determina mediante el método de Guarente, L. (Methods Enzymol. 1983, 101 :181-191). Los microorganismos de la invención son capaces de crecer en medios que contienen un sustrato rico en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal como única fuente de carbono. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener biomasa celular a partir de una composición rica en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal que comprende (a) cultivar un microorganismo que comprende una de las construcciones de la invención y (b) recuperar la biomasa del medio de cultivo.
Los medios ricos en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal preferidos son medios ricos en estaquiosa, rafinosa, melibiosa, melazas de caña de azúcar y/o remolacha, permeados de proteína de soja y una combinación de cualquiera de los anteriores. La biomasa se puede recuperar del medio de cultivo mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia incluyendo, sin estar limitado, centrifugación, depósito o filtración. Preferiblemente, la técnica empleada debe minimizar al máximo el daño a las células. En caso de que el mismo cultivo se use para la preparación de biomasa y la producción de α-galactosidasa, la separación de la biomasa de células debe minimizar al máximo la pérdida de α-galactosidasa.
Típicamente, el microorganismo recuperado del medio de cultivo es lavado con una solución acuosa para eliminar materiales indeseados que pudiesen estar asociados al mismo. Preferiblemente, el contenido de proteína en la levadura es de entre 35 y 65%. La biomasa de levadura recuperada se puede utilizar como ingrediente en productos alimenticios sin necesidad de procesamiento adicional. La biomasa recuperada también se puede lisar y, opcionalmente, separar las células intactas. Las células de levadura usadas pueden ser usadas en medios de cultivo como extracto de levadura o puede ser procesado adicionalmente para separar sus distintos componentes, tales como péptidos, nucleótidos, aminoácidos o componentes específicos de la pared celular tales como quitina, glucanos, mananos y oligosacáridos.
Los sustratos susceptibles de ser utilizados (estaquiosa, rafinosa, melibiosa, melazas de caña de azúcar y/o remolacha y/o permeados de proteína de soja) son digeridos por la levadura de la invención, generando galactosa que sería un sustrato adecuado para la fermentación alcohólica produciéndose etanol u otros compuestos. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener un producto de fermentación que comprende las etapas de cultivar un microorganismo en un medio rico en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal, en donde dicha levadura comprende una construcción de ADN que codifica una proteína de fusión con la forma madura de una α-galactosidasa fusionada en el mismo marco de lectura con una secuencia señal, en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la α-galactosidasa de una célula de levadura y (b) recuperar el producto de fermentación del medio de cultivo.
Por producto de fermentación se entiende en el contexto de la presente invención un producto que puede ser obtenido a partir de una levadura a partir de un azúcar en condiciones anaerobias. Productos de fermentación que pueden ser obtenidos usando las cepas y métodos de la presente invención incluyen alcoholes (etanol, metano 1, butano 1), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico), cetonas (por ejemplo, acetona), amino ácidos (por ejemplo, ácido glutámico), gases (H2 y CO2), antibióticos (penicilina, tetraciclina), etc. En una forma de realización preferida, el producto de fermentación es etanol, que puede ser usado como combustible, en bebidas o a nivel industrial. Típicamente, la fermentación alcohólica para dar lugar a etanol se lleva a cabo durante 30-60 h a una temperatura de en torno a 32 0C.
Las condiciones de cultivo para la producción de productos de fermentación son esencialmente las mismas que las usadas en la producción de α-galactosidasa, en lo que se refiere a los medios de cultivo que pueden ser usados como fuente de carbono. Sin embargo, con objeto de mejorar el rendimiento de la reacción, es importante que las condiciones de cultivo sean aquellas que favorecen la fermentación de los monosacáridos. Una vez se haya alcanzado la concentración adecuada de producto de fermentación en el medio, es necesario recuperar dicho producto del medio. La forma de recuperar el producto dependerá de la naturaleza química del producto. En el caso de que el producto de fermentación sea etanol, éste se recupera usando técnicas convencionales entre las que se incluyen, por ejemplo, la destilación.
Los microorganismos de la presente invención también pueden ser transformados con un segundo vector de expresión que contiene un gen que codifica una proteína de interés y así ser utilizadas para la producción de proteínas de interés mediante el cultivo de dichas cepas doblemente transformadas en un medio de cultivo rico en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal, como única fuente de carbono.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un microorganismo que comprende además de la primera construcción de la invención, una segunda construcción con un gen que codifica una proteína de interés. Los vectores de expresión que pueden ser usados para la expresión de las proteínas heterólogas son esencialmente los mismos que se pueden usar para la expresión de la proteína de fusión con la α-galactosidasa. Sin embargo, es conveniente que los dos vectores tengan marcadores de selección diferentes para asegurarse que ambos permanecen de forma estable en las levaduras. Adicionalmente, los promotores que regulan la expresión de la proteína heteróloga pueden ser los mismos que se usan para regular la expresión de las proteínas de fusión. Promotores útiles para la realización de la presente construcción incluyen: - Promotores constitutivos como por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADHl), el promotor del factor de elongación 1 alfa (TEF) y el promotor del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa (TPI), el promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y el promotor de la 3- fosfoglicerato quinasa (GPK), el promotor MRP7 y el promotor de la alcohol oxidasa (AOXl).
- Promotores inducibles como por ejemplo el promotor de la metalotioneina (CUPl) cuya expresión se regula mediante adición de cobre al medio de cultivo, el promotor del gen que codifica el gen FUSl o el gen FUS2, cuya expresión se activa en presencia de feromonas (el factor α) según se describen en US5063154, el promotor TET cuya expresión se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GALl-IO, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP 16-ER, inducible por estrógenos, y el promotor de la fosfatasa (PH05) cuya expresión se activa en presencia de fosfato y el promotor de la proteína de choque térmico HSP150, cuya expresión se activa a elevada temperatura.
- Promotores reprimibles como por ejemplo el promotor del gen de la enolasa (ENO-I) de S.cerevisiae cuya expresión se puede reprimir cuando se hace crecer el microorganismo en una fuente de carbono no fermentable así como promotores cuya expresión está sujeta a represión por glucosa, de forma que la expresión se verá reprimida cuando parte de la lactosa se ha hidrolizado y comienza a aumentar la concentración de glucosa en el medio, el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de S. cerevisiae y el promotor de la galactoquinasa (GALl).
Preferiblemente, se usan promotores distintos en las dos construcciones de forma que se pueda regular independientemente la expresión de la α-galactosidasa y de la proteína heteróloga. Preferiblemente, en aquellos casos en los que se sospeche que la proteína heteróloga pudiese ser tóxica para la célula hospedadora, el promotor usado para regular su expresión es convenientemente un promotor regulable, de forma que se pueda retrasar la expresión de la proteína de interés hasta que se han alcanzado niveles suficientes de biomasa. Como medio de cultivo rico en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal, la invención contempla el uso de estaquiosa, rafinosa, melibiosa, melazas de caña de azúcar y/o remolacha, permeados de proteína de soja y una combinación de cualquiera de los anteriores.
Las proteínas de interés pueden carecer de secuencia señal o, alternativamente, pueden sintetizarse con una secuencia señal con el fin de provocar su liberación al medio de cultivo y así facilitar su recuperación. Secuencias señales que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen esencialmente las mismas que se pueden usar para promover la secreción de la α-galactosidasa.
Las cepas doblemente transformadas pueden ser utilizadas convenientemente para la producción de proteínas de interés usando residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal como fuente principal de carbono. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la obtención de una proteína de interés que comprende las etapas de (a) cultivar una cepa de levadura doblemente transformada de acuerdo a la invención en un medio rico en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal y (b) recuperar la proteína de interés del medio.
En una forma de realización preferida, el medio rico en residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal es estaquiosa, melibiosa, rafinosa, melazas de caña de azúcar y/o remolacha, permeados de proteínas de soja y una combinación de cualquiera de los anteriores. Prácticamente no existe limitación con respecto a la proteína de interés que puede ser expresada usando las cepas y métodos de la presente invención. Estas incluyen tanto proteínas humanas y de mamíferos de interés terapéutico como enzimas de distintos orígenes que permitan reconstituir vías metabólicas en levadura y la consiguiente producción de compuestos de interés. Ejemplos de proteínas de interés terapéutico que pueden ser producidas por las células objeto de la invención son eritropoietina (EPO), hormona liberadora de hormona adrenocorticotropa (CRH), hormona liberadora de hormona somatotropa (GHRH), hormona liberadora de gonadotro finas (GnRH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona liberadora de prolactina (PRH), hormona liberadora de melatonina (MRH), hormona inhibidora de prolactina (PIH), somato statina, hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona somatotropa o del crecimiento (GH), hormona luteinizante (LH), hormona folículo estimulante (FSH), tirotropina (TSH u hormona estimulante del tiroides), prolactina, oxitocina, hormona antidiurética (ADH o vasopresina), melatonina, factor inhibidor Mülleriano, calcitonina, hormona paratifoidea, gastrina, colecistoquinina (CCK), secretina, factor de crecimiento de tipo insulina tipo I (IGF-I), factor de crecimiento de tipo insulina tipo II (IGF-II), péptido natriurético atrial (PNA), gonadotrofina coriónica humana (GCH), insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático (PP), leptina, neuropéptido Y, renina, angiotensina I, angiotensina II, factor VIII, factor IX, factor tisular, factor VII, factor X, trombina, factor V, factor XI, factor XIII, interleuquina 1 (IL-I), factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF-α), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8 (IL-8 y quemoquinas), interleuquina 12 (IL-12), interleuquina 16 (IL-16), interferones α, β, gamma, factor de crecimento neuronal (NGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante β (TGF-β), proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF y relacionados), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento glial, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento endotelial, antitripsina 1 alfa, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulo cito y macrófagos (GM-CSF), ciclosporina, fibrinógeno, lactoferrina, activador de plasminógeno tipo tisular (tPA), quimotripsina, inmunoglobinas, hirudina, superóxido dismutasa y imiglucerasa.
Prácticamente cualquier método conocido en la técnica puede ser utilizado para la recuperación de la proteína de interés del interior celular o del medio de cultivo. Si la proteína se produce en el interior de la célula de levadura, es necesario lisar las células para liberar las proteínas de interés. Convencionalmente, las células de levaduras, se lisan mediante lisis hipotónica de esferoplastos formados previamente mediante tratamiento con glucanasas, mediante sonicación o mediante agitación en presencia de bolas de vidrio. Una vez que la proteína de interés se encuentra en el medio, bien mediante liberación del interior celular bien porque la proteína es secretada por la propia maquinaria de secreción de la levadura, se emplean métodos convencionales para la purificación de dicha proteína, incluyendo, sin estar limitado, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, de interacción hidrofóbica, de filtración en gel, HPLC), métodos electroforéticos (isoelectroenfoque preparativo, electroforesis preparativa en geles de poliacrilamida-SDS), solubilidad diferencial (precipitación con sulfato amónico), ultracentrifugación preparativa en gradiente de sacarosa. Una vez que se ha alcanzado el grado deseado de pureza, lo que puede requerir más de un paso cromato gráfico, es frecuente que sea necesario concentrar la proteína o eliminar sales e iones que puedan ser perjudiciales para su posterior uso. En ese caso, se recurre a técnicas conocidas, tales como liofilización o ultrafiltración.
La invención se describe a continuación mediante unos ejemplos que no son limitativos de la invención, sino ilustrativos.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
Obtención de la cepa de levadura modificada para producir α galactosidasa
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Clonación de la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la α galactosidasa
Se diseñaron dos pares de cebadores con el fin de amplificar por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) el gen MEL l que codifica la α galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae. S e amplificaron dos fragmentos, uno de ellos correspondiente al gen completo de la α galactosidasa (SEQ ID NO :4), amplificado con los siguientes cebadores, con SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 y el otro fragmento correspondiente al gen de la α galactosidasa al que se le eliminaron los 54 nucleótidos que codifican la señal de secreción (SEQ ID NO :7) y amplificado por los siguientes cebadores, con secuencias SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9. El gen completo de la α galactosidasa se insertó en el vector YEpFLAGl (Eastman Kodak Company Cat. N0 IB 13400) para expresión en levaduras, bajo el promotor ADH2 (Alcohol Deshidrogenasa 2) (SEQ ID NO: 1) y el terminador transcripcional del gen CYCl (SEQ ID NO: 10). El segundo producto de amplificación con el gen de la α galactosidasa sin la señal de secreción fue insertado en un vector como el anterior, que presenta además la señal de secreción del factor α de levadura (83 aminoácidos) y el péptido FLAG para su posterior detección inmunológica (SEQ ID NO :2). Las construcciones resultantes fueron transformadas en una cepa de Saccharomyces cerevisiae (pep4::HIS3 prb-A1.6R HIS3 lys2-208 trpl-AWl ura3-52 gal2 canl) mediante el método de Acetato de Litio (Ito et al, J Bacteriol. 1983 Jan;153(l):163-8).
2. Cultivo de las cepas recombinantes
Las cepas transformadas con las dos construcciones se cultivaron en medio CM (Zitomer et al, J Biol Chem. 1976 Oct 25;251(20):6320-6), utilizando como marcador auxótrofo el triptófano. Cuando alcanzaron la fase de crecimiento estacionaria se utilizaron para inocular 100 mi de medio YPHSM (1% de glucosa, 3 % de glicerol, 1% de extracto de levadura y 8% de peptona) o bien el mismo medio de cultivo pero conteniendo rafinosa al 2% en vez de glucosa al 1%.
Todos los cultivos ensayados se hicieron crecer a 3O0C, con una agitación orbital de 250 r.p.m y partiendo de una absorbancia a 600 nm inicial de 0,05. Se determinaron los valores de absorbancia a 600 nm, actividad α-galactosidasa extracelular e intracelular y dependiendo del caso consumo de rafinosa, melibiosa, fructosa, glucosa y galactosa a diferentes intervalos de tiempo.
En algunos casos se realizaron cultivos en 2 litros de medio en fermentadores de tipo Biostat-MD (Braun-Biotech) monitorizando la aireación (2 1/min), temperatura (3O0C), pH, agitación (250 r.p.m). Se recogieron muestras a diferentes intervalos de tiempo y se analizaron igualmente los parámetros mencionados anteriormente.
3. Determinación de la actividad α galactosidasa
Las medidas de la actividad α galactosidasa in vitro se llevaron a cabo utilizando el sustrato cromogénico p-nitrofenil-α-D-galactopiranósido (PNPG) (Sigma-Aldrich) siguiendo el método descrito por Kew y Douglas (Kew, O. M. et al, J Bacteriol. 1976 Jan;125(l):33-41). El compuesto incoloro PNPG da lugar a un producto tras la hidrólisis que, a causa del cambio de pH producido al parar la reacción enzimática, adquiere un color amarillo cuantificable utilizando un espectrofotómetro y proporcional a la cantidad de sustrato liberado. La actividad α-galactosidasa se expresa en unidades enzimáticas; definiendo la unidad enzimática (U. E.) como la cantidad de enzima que libera un nanomol de p- nitrofenil por minuto en las condiciones del ensayo (U.E.= nanomol x min"1 x mi"1). Las unidades se expresan como U.E./ml de medio de cultivo.
4. Determinación de la presencia de rafinosa, melibiosa, fructosa, glucosa y galactosa
Para la determinación de rafínosa, melibiosa, fructosa, glucosa y galactosa se utilizó un HPLC (High Performance Liquid Chromatography) de Waters con bomba isocrática de la serie Breeze modelo 1515 con detector de índice de refracción modelo 2414 y una columna de separación Sugar Pak I de 6.5 mm x 300 mm.
RESULTADOS
En la Figura 1 se muestra el crecimiento celular obtenido mediante medidas de absorbancia a 600 nm y la actividad α-galactosidasa extracelular e intracelular de la cepa de S. cerevisiae transformada con el plásmido de expresión que contiene el gen MELl íntegro que codifica para la α-galactosidasa de S. cerevisiae creciendo en un medio sintético con glucosa al 1%. Los datos de actividad enzimática mostrados en la
Figura 1 fueron el resultado de 4 medidas independientes. La actividad total es la suma de la actividad intracelular y extracelular. Esta cepa recombinante secreta unas 18700
U.E./ml de media de α-galactosidasa al medio de cultivo, entre las 90 y 140 horas, siendo la actividad total media para ese mismo intervalo de tiempo de 32000 U.E./ml, lo que supone que la actividad extracelular es un 58,4% de la total.
Con el fin de verificar el crecimiento de la cepa recombinante con el gen MELl íntegro en medios con rafinosa, en la Figura 3 se muestran las medidas de absorbancia a 600 nm y de actividad α-galactosidasa total de la cepa creciendo en un medio sintético con rafinosa al 2%. A modo comparativo se muestran las medidas de absorbancia a 600 nm de la misma cepa sin transformar creciendo en rafinosa al 2%. Se puede observar que mientras que la cepa sin transformar alcanza valores de absorbancia en torno a 12 al final del cultivo, en la cepa transformada prácticamente se duplican alcanzando valores en torno a 22. La cepa sin transformar puede utilizar sólo la fructosa de la rafinosa, pero no es capaz de metabolizar la melibiosa. Sin embargo la cepa transformada, además de utilizar la fructosa de la rafinosa, es capaz de utilizar la melibiosa. La determinación mediante HPLC de los azúcares rafinosa, melibiosa, fructosa, glucosa y galactosa confirmaron la presencia de melibiosa en el cultivo en la cepa sin transformar mientras que prácticamente desaparece la melibiosa a las 48 de cultivo en la cepa transformada.
EJEMPLO 2 Comparación de la actividad α-galactosidasa de la cepa con MELl bajo el promotor ADH2 [A] y de una cepa con MELl bajo el promotor ADHl [B].
Los detalles de clonación y las medidas de la actividad α-galactosidasa están descritos en el Ejemplo 1. El cultivo de la cepa recombinante [A] se llevó a cabo en un medio sintético con glucosa al 1%.
En la Figura 2 se han comparando los datos obtenidos por la cepa [B] descrita en US 5055401 con la cepa recombinante [A] de la invención. Para ello se han extraído los datos de las figuras 7A y 7B de US 5055401 y se han comparado. Se puede observar que, mientras que en la cepa descrita en US 5055401 se alcanzó a las 36-54 horas una actividad total de α-galactosidasa de 8000 UE/ml, con la cepa [A] de la invención se obtuvieron para ese mismo intervalo de tiempo una actividad total que va de 10000 U.E./ml a 20000 UE/ml, alcanzando, como se ha comentado anteriormente, valores en torno a 32000 U.E./ml en fases posteriores del cultivo. Dicho aumento supone un incremento en actividad α-galactosidasa total del 25% al 300% en la cepa recombinante [A] de la invención con respecto a la cepa [B] descrita en US 5055401. Asimismo, en lo que respecta a la actividad α-galactosidasa extracelular de la cepa [B] descrita en US 5055401, comparada con la cepa recombinante [A] de la invención, se puede observar que en la primera se obtiene una actividad en torno a 2600 U.E./ml, a las 36-54 horas, lo que supone el 32,5 % de la actividad total, mientras que en la cepa [A] de la invención, se obtuvieron valores de 3400 a 7800 U.E./ml (aproximadamente un 37,25% de la actividad total) aumentando a 18700 U.E./ml (un 58,4% de la actividad total) en fases posteriores del cultivo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Construcción de ADN que comprende:
(a) un promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa, (b) una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura, y
(c) la región del gen MELl que codifica la forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente en donde las secuencias (b) y (c) han de estar bajo el mismo marco de lectura.
2. Construcción según la reivindicación 1 , en la que el promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa es el promotor ADH2.
3. Construcción según la reivindicaciones 1 ó 2, en donde la secuencia señal es la secuencia señal endógena del gen MELl.
4. Construcción según la reivindicaciones 1 ó 2, en donde la secuencia señal es la secuencia señal del factor α de levadura.
5. Construcción de ADN que comprende: (a) el promotor ADH2 o una variante funcionalmente equivalente del mismo,
(b) una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura, y
(c) la región de un gen que codifica una forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente, en donde las secuencias (b) y (c) han de estar bajo el mismo marco de lectura.
6. Construcción según la reivindicación 5, en la que el gen que codifica la proteína α-galactosidasa es el gen MELl.
7. Construcción según la reivindicación 5 ó 6, en la que la secuencia señal es la secuencia señal endógena del gen MELl .
8. Construcción según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la secuencia señal es la secuencia señal del factor α de levadura.
9. Proteína codificada por una construcción s e gún cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Vector de expresión que contiene una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Un microorganismo que contiene un vector según la reivindicación 10, una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una proteína según la reivindicación 9.
12. Microorganismo según la reivindicación 11 en donde el microorganismo es una levadura.
13. Microorganismo según la reivindicación 12 en donde el microorganismo es Saccharomyces cerevisiae.
14. Un método para producir α-galactosidasa que comprende
(a) cultivar un microorganismo según culquiera de las reivindicaciones 11 , 12 ó 13 en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal y
(b) recuperar la α-galactosidasa secretada del medio de cultivo.
15. Un método para la obtención de biomasa celular que comprende
(a) cultivar un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 11 , 12 ó 13 en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal y (b) recuperar la biomasa celular.
16. Un método para la obtención de etanol que comprende (a) cultivar un microorganismo, según cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13 en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal y
(b) recuperar el etanol producido.
17. Un microorganismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 1, 12 ó 13, que comprende una segunda construcción con un gen que codifica una proteína de interés.
18. Un método para la obtención de una proteína que comprende
(a) cultivar un microorganismo según la reivindicación 17 en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal y
(b) recuperar la proteína de interés.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el sustrato que contiene residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal se selecciona del grupo de rafinosa, melibiosa, estaquiosa, melazas de caña de azúcar y/o remolacha, permeados de proteína de soja y una combinación de cualquiera de los anteriores.
PCT/ES2010/070219 2009-04-08 2010-04-08 Cepas de s.cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa Ceased WO2010116020A1 (es)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BRPI1012587A BRPI1012587A2 (pt) 2009-04-08 2010-04-08 cepas de s. cerevisiae capazes de crescer em meio com melibiose, estaquiose e rafinose
US13/263,292 US20130273602A1 (en) 2009-04-08 2010-04-08 Strains of s.cerevisiae capable of growing in media with melibiose, stachyose and raffinose
CN2010800233001A CN102449145A (zh) 2009-04-08 2010-04-08 能够在具有蜜二糖、水苏四糖和棉子糖的培养基中生长的酿酒酵母菌株
EP10761222A EP2418275A4 (en) 2009-04-08 2010-04-08 STRAINS OF S. CEREVISIAE WHICH CAN DEVELOP IN MEDIUM-RICH MEDIUM, STACHYOSE AND RAFFINOSE MEDIA &xA;

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200900961A ES2351296B8 (es) 2009-04-08 2009-04-08 Cepas de s. cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa.
ESP200900961 2009-08-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010116020A1 true WO2010116020A1 (es) 2010-10-14

Family

ID=42935678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2010/070219 Ceased WO2010116020A1 (es) 2009-04-08 2010-04-08 Cepas de s.cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20130273602A1 (es)
EP (1) EP2418275A4 (es)
CN (1) CN102449145A (es)
BR (1) BRPI1012587A2 (es)
ES (1) ES2351296B8 (es)
WO (1) WO2010116020A1 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103695326A (zh) * 2014-01-03 2014-04-02 湖南大学 一种处理分散式高浓度有机废水的酵母及其制备方法与应用
CN103966196A (zh) * 2014-05-12 2014-08-06 江南大学 一种利用酿酒酵母二酪氨酸层疏松型孢子固定化酶的方法
CN103981171A (zh) * 2014-05-12 2014-08-13 江南大学 一种基于酿酒酵母孢子的微胶囊固定化酶的制备方法
JP7565087B2 (ja) * 2019-04-02 2024-10-10 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 組換えタンパク質の製造方法
CN110331115A (zh) * 2019-08-08 2019-10-15 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用
CN119351239B (zh) * 2024-12-26 2025-03-21 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一株重组毕赤酵母及其在合成水苏糖、毛蕊花糖中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3846239A (en) 1972-07-24 1974-11-05 Monsanto Co Process for the preparation of heat-resistant alpha-galactosidase enzyme
US4431737A (en) 1981-12-03 1984-02-14 Anic, S.P.A. Process for the production of alpha-galactosidase and uses of the enzyme thus obtained
WO1986003777A1 (en) * 1984-12-24 1986-07-03 Allelix, Inc. Dna sequence useful for the production and secretion from yeast of peptides and proteins
US5055401A (en) 1987-04-10 1991-10-08 Alko Ltd. Construction of new α-galactosidase producing yeast strains and the industrial application of these strains
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5919690A (en) 1993-03-31 1999-07-06 Novo Nordisk A/S α-galactosidase enzyme
ES2172380A1 (es) 2000-03-03 2002-09-16 Consejo Superior Investigacion Un procedimiento para producir alfa-galactosidasa recombinante de thermus sp. t2 en celulas hospedantes.

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7198919B1 (en) * 1983-04-25 2007-04-03 Genentech, Inc. Use of alpha factor sequences in yeast expression systems
CA1339101C (en) * 1986-06-03 1997-07-29 Nicolaas Overbeeke Production of guar alpha-galactosidase and immunologically related alpha-galactosidases by host organisms transformed with recombinant dna methods

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3846239A (en) 1972-07-24 1974-11-05 Monsanto Co Process for the preparation of heat-resistant alpha-galactosidase enzyme
US4431737A (en) 1981-12-03 1984-02-14 Anic, S.P.A. Process for the production of alpha-galactosidase and uses of the enzyme thus obtained
WO1986003777A1 (en) * 1984-12-24 1986-07-03 Allelix, Inc. Dna sequence useful for the production and secretion from yeast of peptides and proteins
US5055401A (en) 1987-04-10 1991-10-08 Alko Ltd. Construction of new α-galactosidase producing yeast strains and the industrial application of these strains
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5919690A (en) 1993-03-31 1999-07-06 Novo Nordisk A/S α-galactosidase enzyme
US6197566B1 (en) 1993-03-31 2001-03-06 Novo Nordisk A/S α-galactosidase enzyme
ES2172380A1 (es) 2000-03-03 2002-09-16 Consejo Superior Investigacion Un procedimiento para producir alfa-galactosidasa recombinante de thermus sp. t2 en celulas hospedantes.

Non-Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Plasmid, A Practical Approach", 1993, IRL PRESS, article "Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae"
"Using Antibodies: A laboratory manual", 1999, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, pages: 347 - 377
ANISHA ET AL., APPL BIOCHEM BIOTECHNOL., 4 September 2008 (2008-09-04)
AUSUBEL ET AL.: "Yeast Cloning Vectors and Genes", CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1994
BRUNELLI JOSEPH P.: "A Series of Yeast Shuttle Vectors for Expression of cDNAs and Other DNA Sequences", YEAST., vol. 9, no. 12, 1993, pages 1299 - 130, XP002606432 *
CHEN, Y. ET AL., PROTEIN EXPR PURIF., vol. 20, no. 3, December 2000 (2000-12-01), pages 472 - 84
DEY, P.M., PRIDHAM, J.B., BIOCHEM. J., vol. 113, 1969, pages 49 - 55
GALLICIOTI,G. ET AL., J. MEMBRANE BIOLOGY, vol. 183, pages 175 - 182
GARROA MS, VALDEZA GF, GIORIA GS., FOOD MICROBIOL, vol. 21, 2004, pages 511 - 8
HARMSEN, M. ET AL., GENE, vol. 125, no. 2, 30 March 1993 (1993-03-30), pages 115 - 23
ITO ET AL., J BACTERIOL., vol. 153, no. 1, January 1983 (1983-01-01), pages 163 - 8
KAISER,C. ET AL., SCIENCE, vol. 235, 1987, pages 312 - 317
KEW, O. M. ET AL., J BACTERIOL., vol. 125, no. 1, January 1976 (1976-01-01), pages 33 - 41
LAZO, P. S., OCHOA, A. G., GASCON, S., EUR. J. BIOCHEM., vol. 77, no. 2, 1977, pages 375 - 382
LEE K M. ET AL.: "Evaluation of the Saccharomyces cerevisiae ADH2 promoter for protein synthesis", YEAST., vol. 22, no. 6, 2005, pages 431 - 440, XP008153281 *
LILJESTROM-SUOMINEN ET AL., APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 54, no. 1, January 1988 (1988-01-01), pages 245 - 249
LIU ET AL., LETT APPL MICROBIOL., vol. 45, no. 2, August 2007 (2007-08-01), pages 206 - 12
LIU, C., RUAN, HOURS., SHEN, HOURS., CHEN, Q, ZHOU, B., LI, Y., HE, G., J FOOD SCI, vol. 72, no. 4, 2007, pages M120 - M125
MANIATIS ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1982, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
MAYA DOUGLAS ET AL.: "Systems for applied gene control in Saccharomyces cerevisiae.", BIOTECHNOLOGY LETTERS., vol. 30, no. 6, June 2008 (2008-06-01), pages 979 - 987, XP019599915 *
METHODS ENZYMOL., vol. 101, 1983, pages 181 - 191
RYAN, M.P., JONES, R., MORSE, R.H., MOL CELL BIOL, vol. 18, no. 4, 1998, pages 1774 - 82
See also references of EP2418275A4 *
STEERS, E. ET AL., J.BIOL.CHEM., vol. 246, 1970, pages 196 - 200
WORTHINGTON, BEUCHAT, J AGRIC FOOD CHEM., vol. 22, no. 6, 1974, pages 1063 - 6
ZAPATER ET AL., PREP BIOCHEM., vol. 20, no. 3-4, 1990, pages 263 - 96
ZITOMER ET AL., J BIOL CHEM., vol. 251, no. 20, 25 October 1976 (1976-10-25), pages 6320 - 6

Also Published As

Publication number Publication date
CN102449145A (zh) 2012-05-09
BRPI1012587A2 (pt) 2015-09-22
ES2351296B1 (es) 2012-01-02
ES2351296B8 (es) 2012-07-03
EP2418275A4 (en) 2012-09-12
ES2351296A1 (es) 2011-02-02
US20130273602A1 (en) 2013-10-17
EP2418275A1 (en) 2012-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220127564A1 (en) Recombinant yeast host cells expressing cell-associated heterologous proteins
ES2351296B1 (es) Cepas de s. cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa.
WO2012168495A1 (es) Obtención de oligosacaridos mediante un procedimiento biotecnológico
Lin et al. High-level expression and characterization of the thermostable leucine aminopeptidase Thelap from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus in Aspergillus niger and its application in soy protein hydrolysis
US12391935B2 (en) Compositions comprising digestive enzymes
US12365890B2 (en) Optimization of yeast host cells for the production of heterologous proteins
US9279135B2 (en) Kluyveromyces lactis yeast strain and methods for the production of sugars, ethanol, beta-galactosidase and biomass
US10323247B2 (en) Methods for improving expression levels of foreign proteins by means of phospholipase fusion expression
JPS60256388A (ja) エタノ−ルおよびタン白質の製造法
CN109563504B (zh) 核苷酶
CN115141763B (zh) 一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用
ES2319489B1 (es) Cepas de levadura capaces de secretar beta-galactosidasa al medio y su uso para la produccion de biomasa, etanol, beta-galactosidasa y proteinas de interes.
KR101350955B1 (ko) 신규 엑소글루카나제 및 그의 용도
CN117925430A (zh) 一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN110616228B (zh) 一种高活力乳糖酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用
US9382555B2 (en) Polypetide with enhanced beta-glucosidase activity at low temperature
CN119464353B (zh) 生产α-葡萄糖苷酶的菌株及其构建方法和应用
CN116731144B (zh) 一种重组大米抗氧化肽及其制备方法和应用
JP7194112B2 (ja) 細胞結合型異種タンパク質を発現する組換え酵母宿主細胞
Thomsen Production of α-amylase by yeast
ES2347398B1 (es) Esterasa termofila de thermus thermophilus.
CN119709439A (zh) 一种高效表达重组人胃蛋白酶原rhPGA5的工程菌株及其构建方法和应用
KR19980067477A (ko) 효모 변이주를 이용한 글루코스 옥시다제의 대량생산방법

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080023300.1

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10761222

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 8370/DELNP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010761222

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13263292

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: PI1012587

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI1012587

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20111007