ES2347398B1 - Esterasa termofila de thermus thermophilus. - Google Patents
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Abstract
Esterasa termófila de Thermus
thermophilus.
La invención se relaciona con una proteína
termófila con actividad esterasa. Dicha proteína, del organismo
Thermus thermophilus, se expresa en bacterias y levaduras
recombinantes, en particular en E.coli, K.lactis y
S.cere- visae. Dicha esterasa se expresa en forma de
proteína de fusión con una secuencia señal que permite la secreción
al medio de cultivo y, además, se encuentran operativamente ligadas
a un promotor inducible. Las cepas recombinantes tienen las ventajas
de que (i) su cultivo es mucho más fácil que el del organismo
termófilo del que procede la enzima y (ii) permiten obtener un mayor
número de unidades enzimáticas por litro de cultivo que las cepas
termófilas originales.
Description
Esterasa termófila de Thermus
thermophilus.
La presente invención se refiere a enzimas
termófilas, en particular a esterasas termófilas, de Thermus
thermophilus que pueden expresarse en organismos mesófilos.
Las enzimas son catalizadores muy potentes,
selectivos y muy específicos. El término esterasa es un término
general para denotar una enzima de tipo hidrolasa que hidroliza
enlaces de tipo éster para producir alcoholes y ácidos
carboxílicos.
Las aplicaciones que tienen las hidrolasas, y en
particular las esterasas, en la industria actual son múltiples, por
ejemplo, el ibuprofeno, un agente antiinflamatorio no esteroideo se
ha sintetizado mediante una hidrólisis
estereo-selectiva de su metil-éster mediante el
empleo de una carboxiesterasa. La mayor aplicación industrial de las
hidrolasas, en particular las esterasas, incluyen la industria de
detergentes donde se emplean para descomponer materia grasa en
sustancias hidrofílicas fácilmente eliminables.
El mayor requisito para una enzima comercial es
su estabilidad térmica porque la desnaturalización térmica es una
causa común de la inactivación enzimática. Adicionalmente, mediante
el incremento en la termoestabilidad enzimática se podrían llevar a
cabo reacciones enzimáticas a mayor temperatura, lo que podría
ayudar para aumentar los ratios de conversión, la solubilidad del
sustrato y reducir la posibilidad de crecimiento microbiano y la
viscosidad en el medio de reacción. En el procesado de los
alimentos, desde un punto de vista de higiene, las reacciones
enzimáticas a altas temperaturas son menos peligrosas para la
contaminación por bacterias. En la descomposición de grasas y
aceites, actualmente se emplean métodos en los que las grasas y
aceites se ponen en contacto con vapor a temperaturas de
aproximadamente 250°C y a presiones de aproximadamente 50
atmósferas, lo que implica la necesidad de disponer de instalaciones
adecuadas para llevar a cabo tales reacciones. Grasas como el ácido
palmítico o el ácido esteárico son sólidas a temperatura ambiente y
tienen puntos de fusión de aproximadamente 65°C. Por ello, las
reacciones de hidrólisis deben llevarse a cabo a temperaturas por
encima de dicho punto de fusión.
La disponibilidad de esterasas termofílicas
permitiría operar a altas temperaturas, con el lógico incremento de
la velocidad de reacción y una más fácil solubilización de los
sustratos, aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante
en algunas aplicaciones de este tipo de enzimas (p.ej. reacciones de
síntesis en medios con bajo contenido en agua).
Los microorganismos extremófilos han despertado
un gran interés durante los últimos años, debido a la elevada
estabilidad térmica, resistencia a desnaturalizantes químicos y pHs
extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente adecuadas para
su uso en procesos de biotransformación en condiciones extremas de
pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termófilos crecen a
temperaturas superiores a 45°C, y en algunos casos (hipertermófilos)
incluso por encima de 90°C.
Aunque los organismos termófilos pueden ser
buenos candidatos en producir enzimas termoestables, muchas veces no
resulta práctico debido al bajo rendimiento y al equipo de
fermentación de alta temperatura que sería necesario emplear.
La producción de enzimas de interés
biotecnológico procedentes de microorganismos termófilos extremos
suele efectuarse mediante su clonado y expresión a alto nivel en una
bacteria o levadura modelo fácilmente manipulable, tal como
Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Sin
embargo, existen una gran cantidad de enzimas termófilas cuya
complejidad de síntesis hace imposible su obtención en forma activa
en estos organismos modelo (Hidalgo, A. y cols., 2004. Appl.
Environ. Microbiol. Vol. 70 (7): 3839-3844). Este es
el caso frecuente de enzimas hetero-oligoméricas o
el de aquellas enzimas que requieren la incorporación de un cofactor
en el proceso de síntesis, que suele requerir la ayuda de chaperonas
específicas que mantienen la estructura de la enzima en posición
abierta para la entrada del mencionado cofactor. En tales casos, que
pueden llegar a constituir hasta el 50% de las enzimas codificadas
en cualquier termófilo, la alternativa evidente es la de utilizar en
la producción un microorganismo termófilo relacionado evolutivamente
con aquel del que procede la enzima de interés.
Las bacterias del género Thermus spp. se
caracterizan por su capacidad para crecer a altas temperaturas y por
su facilidad de manipulación genética, única entre organismos
termófilos extremos. Las bacterias del género Thermus spp.
tienen gran potencial de utilización como sistemas de obtención de
enzimas termoestables mediante selección funcional a elevadas
temperaturas, existiendo algunos ejemplos de ello en la literatura
científica (Fridjonsson y cols., 2002. J Bacteriol. Vol.
184:3385-3391; Brouns y cols., 2005. J Biol Chem.
Vol. 280:11422-31). No obstante, la aplicación de
estos métodos depende de la generación de una cepa de Thermus
spp. mutante que requiera de la actividad funcional de la enzima a
termoestabilizar para su crecimiento, siendo muy limitadas en la
actualidad las metodologías existentes para la obtención de dichos
mutantes.
La solicitud de patente internacional WO9725058
describe el aislamiento, caracterización y purificación de esterasas
de Thermus sp. T351 (ATCC 31674). Dichas enzimas pueden
expresarse en organismos mesófilos tales como Escherichia
coli a partir de la infección de dichas células con vector de
expresión que codifica para dicha enzima, tal como el fago lambda.
Por otro lado, el documento WO2006082059 describe la expresión de
una enzima con actividad esterasa de Alicyclobacillus
acidocaldarius en vectores de expresión que comprenden la
secuencia de nucleótidos que codifican dicha enzima en forma de
proteína de fusión. Dicha esterasa es particularmente útil como
marcador de actividad proteica en sistemas de síntesis de proteínas
libres de células (cell-free translation system) o
en sistemas in vivo, tales como E. coli o células de
levadura.
Por otra parte, Fuciños P., et al (J
Biotechnology, (2005) 117; 233-241) describen la
identificación de enzimas extracelulares con actividad
lipasa/esterasa producidas en cultivos de Thermus
thermophilus HB27. Dichos autores describen la purificación
parcial y caracterización bioquímica preliminar de las mismas a
nivel de actividad y estabilidad a altas temperaturas
(80-90°C). Sin embargo, el grado de purificación de
dichas enzimas es muy bajo (factor de purificación de 4 con respecto
al homogeneizado celular) y por otra parte, dichos autores no
describen la secuencia aminoacídica de dichas proteínas.
Por tanto, existe la necesidad de encontrar
nuevas enzimas termófilas con actividad esterasa que presenten
estabilidad a elevadas temperaturas y que puedan expresarse en
organismos mesófilos.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto, la invención se refiere a
un polipéptido aislado con actividad esterasa que comprende la
secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una
variante funcionalmente equivalente del mismo.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
una proteína de fusión que comprende
- i)
- un polipéptido según la invención; y
- ii)
- un péptido heterólogo.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona
con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una
proteína de fusión según la invención.
En otro aspecto, la invención también se
relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de
nucleótidos según la invención.
En un aspecto adicional, la invención se
relaciona con un vector de expresión que comprende una secuencia de
nucleótidos o una construcción génica según la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
célula que comprende una secuencia de nucleótidos, una construcción
génica o un vector de expresión según la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición que comprende un polipéptido según la invención o una
proteína de fusión según la invención.
En otro aspecto, la invención también se refiere
a un procedimiento para la obtención de un polipéptido con actividad
esterasa que comprende cultivar una célula según la invención bajo
condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido y, si se
desea, recuperar dicho polipéptido.
En un aspecto adicional, la invención se
relaciona con el uso de un polipéptido según la invención o una
proteína de fusión según la invención en la elaboración de una
composición detergente.
Finalmente, la invención se refiere a un método
para la modificación de grasas o aceites que comprende poner en
contacto un polipéptido o una proteína de fusión según la invención
con una grasa o aceite en condiciones donde dicho polipéptido o
proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 muestra unas curvas de actividad
esterasa y biomasa en el medio de cultivo para el fragmento del
polipéptido de la invención que carece de los aminoácidos
1-16 del extremo N-terminal (Figura
1 A) y del fragmento del polipéptido de la invención que carece de
los aminoácidos 1-26 del extremo
N-terminal (Figura IB), ambos expresados en la
levadura Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140
junto con la señal de secreción alfa-mating factor
de K. lactis.
La Figura 2 muestra unas curvas de actividad
esterasa y biomasa en el medio de cultivo para el fragmento del
polipéptido de la invención que carece de los aminoácidos
1-16 del extremo N-terminal
expresado en la levadura Saccharomyces cerevisiae BJ3505
junto con la secuencia de la señal de secreción del
alfa-mating factor de S. cerevisiae.
En la Figura 3 se muestra una electroforesis en
gel SDS-PAGE del medio de cultivo postincubado
(carril 2), concentrado por ultrafiltración (carril 3) y el eluído
de la cromatografía de afinidad (carril 4). El carril 1 es el
marcador de Pm (Da). El tratamiento con la glicosidasa EndoH resulta
en una única banda (carril 5).
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con un polipéptido aislado, de aquí en adelante polipéptido de la
invención, con actividad esterasa que comprende la secuencia de
aminoácidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante
funcionalmente equivalente del mismo.
El término "esterasa", tal como aquí se
emplea se refiere a una enzima de tipo hidrolasa que hidroliza
enlaces de tipo éster.
Tal como aquí se utiliza, la expresión
"variante funcionalmente equivalente" de una secuencia de
aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos que (i) es
sustancialmente homologa a dicha secuencia de aminoácidos y (ii)
ejerce la misma función (e.g. que tiene actividad esterasa).
Una secuencia de aminoácidos es sustancialmente
homologa a una secuencia de aminoácidos determinada cuando presenta
un grado de identidad de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al
menos, un 75%, típicamente de, al menos, un 80%, preferentemente de,
al menos, un 85%, más preferentemente de, al menos, un 90%, aún más
preferentemente de, al menos, un 95%, 97%, 98% ó 99%, respecto a
dicha secuencia de aminoácidos determinada. El grado de identidad
entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de
alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica,
tales como, por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic
local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;
215(3):403-10). El experto en la materia
entenderá que las secuencias de aminoácidos a las que se hace
referencia en esta descripción pueden estar modificadas
químicamente, por ejemplo, mediante modificaciones químicas que son
fisiológicamente relevantes, tales como, fosforilaciones,
acetilaciones, etc. Así, la expresión "variante funcionalmente
equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el
polipéptido o proteína en cuestión mantiene, al menos, una de las
funciones del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEQ ID NO: 1, preferentemente, al menos, una función
relacionada con la hidrólisis, en particular, que mantiene la
actividad esterasa. La actividad esterasa del polipéptido de la
invención puede ser determinada mediante el empleo de métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia, por
ejemplo, a modo simplemente ilustrativo, la actividad esterasa de
dicho polipéptido se puede determinar mediante métodos tales como
los ensayos descritos en los Ejemplos 1-3 donde se
describe que para la medida de actividad lipolítica, se emplea el
método descrito por Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
En una realización particular, el polipéptido de
la invención es una variante que presenta una o más inserciones,
deleciones y/o modificaciones de uno o más aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y mantiene la
capacidad esterasa.
En otra realización particular, dicha variante
es un fragmento del polipéptido de la invención. El término
"fragmento" tal como se utiliza en la presente descripción se
refiere a un polipéptido que comprende una porción de dicho
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ ID NO: 1, es decir, una secuencia de aminoácidos contiguos
comprendida dentro de dicha SEQ ID NO: 1. Para su empleo en la
presente invención dicho fragmento debe ser funcionalmente
equivalente a dicho polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, es decir, debe tener
actividad esterasa. En una realización particular de la invención,
dicha esterasa es una esterasa termófila. En una realización
concreta, dicho fragmento comprende las secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEQ ID NO: 1 en la que se han eliminado los 16 ó 26
aminoácidos del extremo N-terminal, es decir, las
putativas señal de secreción (aminoácidos 1-16) y
hélice transmembrana (aminoácidos 6-26), respecto a
la secuencia aminoacídica previamente mencionada.
El término "termófilo" tal como aquí se
emplea se refiere a una enzima, en particular, una esterasa que
puede soportar condiciones de temperatura relativamente altas, es
decir, que es estable y es capaz de realizar su actividad en
condiciones de temperatura elevadas, en particular a una temperatura
igual o superior a 50°C, más preferiblemente a una temperatura
comprendida entre 60 y 90°C. En una realización particular, dicha
enzima proviene de un organismo termófilo, en particular de
Thermus thermophilus HB27.
Adicionalmente, el polipéptido de la invención
puede formar parte de una proteína de fusión. En este sentido, a
modo ilustrativo, no limitativo, dicha proteína de fusión puede
contener una región A constituida por un primer polipéptido que
comprende el polipéptido de la invención unido a una región B que
comprende un segundo péptido. Dicho segundo péptido puede ser
cualquier péptido apropiado, por ejemplo, un péptido señal de
secreción extracelular.
Dicha región B puede estar unida a la región
amino-terminal de dicha región A, o bien,
alternativamente, dicha región B puede estar unida a la región
carboxilo-terminal de dicha región A. Ambas regiones
A y B pueden estar unidas directamente o a través de un péptido
espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. La proteína de
fusión puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por los
expertos en la materia, por ejemplo, mediante la expresión génica de
la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de
fusión en células hospedadoras
apropiadas.
apropiadas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
refiere a una proteína de fusión que comprende
- i)
- un polipéptido según la invención; y
- ii)
- un péptido heterólogo.
En una realización particular de la invención,
dicho péptido heterólogo es un péptido señal de secreción
extracelular, es decir, una secuencia que permita la secreción de
dicha proteína de fusión al medio extracelular. Por péptido señal de
secreción extracelular, según se usa en el contexto de la presente
invención, se entiende todo péptido que comprende o que consiste en
una secuencia señal que se encuentra de forma natural asociada a una
proteína distinta al polipéptido según la invención que se desea
expresar. Así, la presente invención contempla el uso de secuencias
señal derivadas de cualquier péptido secretado, incluyendo tanto
aquellas secuencias señal pertenecientes al mismo organismo cuyo
polipéptido queremos expresar pero cuya función es promover la
secreción al medio de proteínas distintas al polipéptido de la
invención, así como de secuencias señal que derivan de otros
microorganismos y que se encargan de promover la secreción al medio
de cualquier enzima. Así, ejemplos ilustrativos pero no limitativos
de secuencias señal que pueden usarse en el contexto de la presente
invención incluyen polipéptidos que contienen o que consisten en la
secuencia señal del preprofactor \alpha de S. cerevisiae y
de otras especies de los géneros Kluyveromyces, Pichia, y
Hansenula, la secuencia señal de la toxina killer de
K. lactis, la secuencia señal de la glucoamilasa II de S.
diastaticus, la secuencia señal de la glucoamilasa de C.
albicans, la secuencia señal de la fosfatasa de S.
cerevisiae, la secuencia señal de la toxina killer de 128
kDa de S. cerevisiae, la secuencia señal de la invertasa de
S. cerevisiae, así como secuencias aleatorias que son
conocidas por su capacidad por reemplazar funcionalmente secuencias
señales nativas de E. coli, tal y como han sido descritas por
Kaiser, C. et al. (Science, 1987,
235:312-317). Así, ejemplos ilustrativos, no
limitativos de secuencias señal de E. coli, incluyen la
proteína MBP (maltose-binding protein), la proteína
de unión a ribosa RBP (ribose-binding protein), la
fosfatasa alcalina y el péptido señal OmpA así como otras secuencias
señal que pueden ser identificadas usando los métodos conocidos en
la técnica (por ejemplo por Gallicioti, G. et al. J. Membrane
Biology, 183:175-182). En una forma de realización
preferida, cuando la célula a transformar es S. cerevisiae,
la proteína de fusión de la invención comprende una secuencia que
codifica para la secuencia señal alfa-mating factor
de S. cerevisiae fusionado a través de su extremo 3' y en el
mismo marco de lectura con la secuencia que codifica para el
polipéptido de la invención. En otra realización preferida, cuando
la célula a transformar es K. lactis, la proteína de fusión
de la invención comprende una secuencia que codifica para la
secuencia señal alfa-mating factor domain de K.
lactis fusionado a través de su extremo 3' y en el mismo marco
de lectura con la secuencia que codifica para el polipéptido de la
invención.
El polipéptido de la invención o la proteína de
fusión de la invención puede incluir, además, una secuencia
aminoacídica útil para el aislamiento o purificación de la proteína
de fusión de la invención. Dicha secuencia estará situada en una
región de la proteína de fusión de la invención que no afecte
adversamente a la funcionalidad del polipéptido de la invención.
Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser
utilizada para aislar o purificar una proteína de fusión
(denominadas genéricamente péptidos etiqueta o "tag") puede
estar presente en dicha proteína de fusión de la invención. A modo
ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia aminoacídica útil para
aislar o purificar una pro teína de fusión puede ser, por ejemplo,
una cola de argininas (Arg-tag), una cola de
histidinas (His-tag), FLAG-tag,
Strep-tag, un epítopo susceptible de ser reconocido
por un anticuerpo, tal como
c-myc-tag, SBP-tag,
S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de
unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión
S-transferasa-tag, proteína de unión
a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe
K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003),
60:523-525), \beta-galactosidasa,
VSV-glicoproteína, etc. En una realización preferida
de la invención, dicho péptido de purificación se selecciona entre
un péptido Flag o una cola de polihistidinas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una secuencia de nucleótidos, de aquí en adelante secuencia de
nucleótidos de la invención, que codifica un polipéptido o una
proteína de fusión según la invención. Por razones de simplicidad,
bajo la denominación "secuencia de nucleótidos de la invención"
se incluyen la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido
de la invención, es decir, el polipéptido que comprende la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, así como una secuencia
de nucleótidos que codifica una variante o un fragmento
funcionalmente equivalente de dicho polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según
la invención. En otro aspecto adicional, la invención se refiere a
un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o
una construcción génica según la reivindicación.
El término "vector de expresión" se refiere
a una construcción de ADN replicativo utilizado para expresar ADN
que codifica el polipéptido de la invención o la proteína de fusión
de la invención y que incluye una unidad transcripcional que
comprende un ensamblaje de (1) elemento/s genético/s que tienen un
papel regulatorio en la expresión génica, por ejemplo, promotores,
operadores o "enhancers" (aumentadores), operativamente
unidos a (2) una secuencia de ADN que codifica el polipéptido o la
proteína de fusión de la invención que es transcrito a ARN mensajero
y traducido a proteína y (3) secuencias apropiadas de iniciación y
terminación de latranscripción y traducción.
Preferentemente, la invención contempla el uso
de vectores que puedan ser propagados tanto en bacteria como en
levadura.
En una realización particular de la invención,
cuando la célula es una célula procariota, tal como una bacteria,
vectores adecuados según la invención son, por ejemplo, los vectores
pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (Messing, 1983. Meth. in Enzymology
101:20-77; Vieira y Messing, 1982. Gene
19:259-268), Bluescript (Stratagene, La Jolla,
California) y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl,
RP4, pNH8A, pNH16a, pNH18a. En una realización particular de la
invención, cuando dicha bacteria es E. coli, dicho vector es
el plásmido pET, en particular, el plásmido pET21d. Los genes
clonados en dicho plásmido se transcriben bajo el control del
promotor del bacteriófago T7, cuando se activa la T7 RNA polimerasa
en la célula huésped. La expresión se induce con IPTG, el cual
remueve al represor del operador para que se lleve a cabo la
transcripción y se promueva la expresión de la proteína de
interés.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Adicionalmente, ejemplos ilustrativos de
vectores adecuados para la presente invención cuando dicha célula a
transformar es una célula de levadura son los siguientes:
- -
- Plásmidos autónomos multicopia: Estos plásmidos contienen secuencias que permiten la generación de múltiples copias de dichos vectores. Estas secuencias pueden ser las denominadas 2 \mu, como la que aparece en los plásmidos episomales (YEp o "yeast episomal plasmids") o secuencias tipo ARS, como las que aparecen en los plásmidos de replicación (YRps o "yeast replication plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son p426GPD, p416GPD, p426TEF, p423GPD, p425GPD, p424GPD o p426GAL, YEp24 y YEplac.
- -
- Plásmidos autónomos de una única copia: Plásmidos que contienen la secuencia autónoma de replicación ARS1 y una secuencia centromérica (CEN4). Este tipo de plásmidos incluye los plásmidos centroméricos (YCps o "yeast centromere plasmids").
- -
- Plásmidos de integración: Plásmidos que son capaces de integrarse en el genoma de la célula que los hospeda. Este tipo de plásmidos incluye plásmidos de integración (YIPs o "yeast integrating plasmids"). Ejemplos de vectores basados en este tipo de plásmidos son pRS303, pRS304, pRS305 o pRS306 y similares.
En una realización particular de la invención,
cuando la célula transformada es una célula de levadura, en
particular Kluyveromyces lactis, el vector de expresión es el
plásmido pKLACl.
La elección de un promotor y otro/s elemento/s
regulatorios generalmente varía en función de la célula huésped
utilizada. Promotores adecuados en el contexto de la presente
invención incluyen promotores constitutivos que promueven la
expresión de las secuencias asociadas a ellas de forma constante y
promotores inducibles, que requieren de un estímulo externo para
promover la transcripción de las secuencias asociadas a ellos.
Promotores útiles para la realización de la
presente invención incluyen:
- -
- Promotores constitutivos como por ejemplo, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH1), el promotor del factor de elongación 1 alfa (TEF) y el promotor del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa (TPI), el promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) y el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa (GPK), el promotor MRP7 y el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1).
- -
- Promotores inducibles como por ejemplo el promotor de la metalotioneina (CUP1) cuya expresión se regula mediante adición de cobre al medio de cultivo, el promotor del gen que codifica el gen FUS1 o el gen FUS2, cuya expresión se activa en presencia de feromonas (el factor \alpha) según se describen en US5063154, el promotor TET cuya expresión se regula en presencia de tetraciclinas, los promotores GAL1- 10, GALL, GALS que se activan en presencia de galactosa, el promotor VP16-ER, inducible por estrógenos, y el promotor de la fosfatasa (PH05) cuya expresión se activa en presencia de fosfato y el promotor de la proteína de choque térmico HSP150, cuya expresión se activa a elevada temperatura.
- -
- Promotores reprimibles como por ejemplo el promotor del gen de la enolasa (ENO-1) de S.cerevisiae cuya expresión se puede reprimir cuando se hace crecer el microorganismo en una fuente de carbono no fermentable así como promotores cuya expresión está sujeta a represión por glucosa, de forma que la expresión se verá reprimida cuando parte de la lactosa se ha hidrolizado y comienza a aumentar la concentración de glucosa en el medio, el promotor de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de S. cerevisiae y el promotor de la galactoquinasa (GAL1). Preferiblemente, el promotor que es reprimible por glucosa es el promotor del gen ADH2.
En una realización particular, cuando la célula
a transformar con dicho vector o construcción de la invención es una
bacteria, dicho promotor es el sistema promotor
beta-lactamasa y lactosa (Chang et al.,
Nature 275:615, 1978), el promotor T7 RNA polimerasa (Studier et
al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990), el
promotor lambda (Elvin et al., Gene
87:123-126, 1990), el promotor trp (Nichols and
Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983) y el promotor tac
(Russell et al., Gene 20:231, 1982).
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización más particular de la
invención, dicho promotor es un promotor inducible. En una
realización más particular, dicho promotor es un promotor inducible
por galactosa, lactosa o por IPTG. En una realización preferida,
dicho promotor es el promotor de la
beta-galactosidasa de forma que las enzimas se
secretan al medio de cultivo cuando las células transformadas crecen
en presencia de un inductor como galactosa o lactosa. En otra
realización particular de la invención, dicho promotor es un
promotor que se reprime en presencia de glucosa.
La invención también contempla el uso de
aumentadores de la expresión. En una realización particular, dichos
aumentadores de la expresión son aumentadores específicos de
levaduras (los denominados UAS o "upstream activating
sequences") con el fin de regular la expresión del polipéptido o
proteína de fusión de la invención. Alternativamente, se pueden
utilizar promotores sintéticos híbridos que resultan de la unión de
un UAS con la región de activación de la transcripción de otro
promotor. Ejemplos de promotores híbridos incluyen la región
reguladora del gen ADH unido a la región de activación del promotor
del gen GAP, así como promotores que comprenden las secuencias
reguladoras de los promotores de los genes ADH2, GAL4, GAL10, y PHO5
combinadas con las regiones de activación de la transcripción de
genes que codifican enzimas glicolíticos, tales como GAP o piruvato
quinasa. Adicionalmente, cuando la célula a transformar es una
célula de levadura, los promotores de levadura pueden contener
promotores de otros orígenes que tienen la habilidad de unirse al
RNA de levadura y de iniciar la transcripción.
En otra forma de realización, el vector de
expresión de la invención incorpora un terminador transcripcional en
dirección 3' de la secuencia que codifica para el polipéptido o la
proteína de fusión de la invención. Terminadores transcripcionales
preferidos que pueden ser incorporados incluyen los terminadores que
se encuentran en el gen de la enolasa de S.cerevisiae, en el
gen CYC1 de S.cerevisiae y en el gen
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenase.
En general, todos los vectores mencionados en
Sikorski ("Extrachromsomoal cloning vectors of Saccharomyces
cerevisiae", in Plasmid, A Practical Approach, Ed. K. G.
Hardy, IRL Press, 1993) y en Ausubel et al. ("Yeast Cloning
Vectors and Genes" Current Protocols in Molecular Biology,
Section II, Unit 13.4, 1994) son útiles en el contexto de la
presente invención.
Los vectores que se pueden usar en el contexto
de la presente invención incluyen, típicamente, un origen de
replicación, un gen de resistencia a antibióticos, un origen de
replicación en bacterias (necesario para la propagación en
bacterias), sitios múltiples de clonaje, y un marcador genético. El
marcador genético es, habitualmente, un gen que confiere resistencia
a un antibiótico o, alternativamente, un marcador autotrófico. Así,
genes marcadores útiles en el contexto de la presente invención
incluyen por ejemplo el gen de resistencia a la neomicina, que
confiere resistencia al aminoglucósido G418, el gen de la
higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina,
el gen ODC, que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina
descarboxilasa
(2-(difluorometil)-DL-ornitina
(DFMO), el gen de la dihidrofolato reducíase que confiere
resistencia a metrotexato, el gen de la
puromicina-N-acetil transferasa, que
confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere
resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que confiere
resistencia a 9-beta-D-
xilofuranosil adenina, el gen de la citosina deaminasa, que permite
a las células crecer en presencia de
N-(fosfonacetil)-L-aspartato,
timidina kinasa, que permite a las células crecer en presencia de
aminopterina o el gen de Xantina-guanina
fosforibosiltransferasa, que permite a las células crecer en
presencia de xantina y ausencia de guanina. Otros marcadores
autotróficos que se pueden usar según la presente invención, son los
genes TRP1, URA3, LEU2, HIS3 o LYS2, que complementan defectos
genéticos en las células que los portan, lo que permite a dichas
células crecer en ausencia de triptófano, uracilo, leucina,
histidina y lisina, respectivamente.
El vector de la invención puede ser utilizado
para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser
transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas
células pueden ser procariotas o eucariotas. Por tanto, en otro
aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende un
vector de la invención, para lo cual dicha célula ha podido ser
transformada, transfectada o infectada con un vector proporcionado
por esta invención. Células huéspedes adecuadas incluyen: células
procariotas o células eucariotas. Las células huésped preferidas son
células de procariotas, en particular, de bacteria, o células
eucariotas, en particular, de levadura.
Así, ejemplos ilustrativos, no limitativos de
bacterias según la presente invención, incluyen bacterias Gram
negativas, por ejemplo, una cepa de Escherichia spp. (e.g.,
E. coli, etc.), una cepa de Salmonella spp. (e.g.,
S. tiphymurium, etc.), una cepa de Pseudomonas spp.
(e.g., P. aeruginosa, P. putida, etc.), etc., que puede ser
transformada con una construcción génica de la invención o con un
vector de la invención, tal como un vector de expresión
proporcionado por esta invención. En una realización preferida,
dicha bacteria es Escherichia coli. Ejemplos ilustrativos de
cepas de E. coli que pueden ser empleadas según la invención
son las cepas BL21 (DE3), DH10B y DH5\alpha.
Por levadura se entiende cualquier organismo
eucariota perteneciente al tipo de los ascomicetes que incluye los
organismos conocidos de forma general como levaduras así como los
conocidos de forma general como hongos filamentosos. Las levaduras y
los hongos filamentosos incluyen Pichia sp (P. pastoris, P.
finlandica, P. trehalophila, P. koclamae, P. membranaefaciens, P.
minuta, P. opuntiae, P. thermotolerans, P. salictaria, P. guercuum,
P. pijperi, P. stiptis, P. methanolica), Saccharomyces (S.
cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces
(K. lactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii,
K. drosophilarum, K. thernotolerans, and K. marxianus; K.
yarrowia), Trichoderma reesia, Neurospora crassa,
Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Penicillium,
Totypocladium, Aspergillus (A.nidulans, A.niger,
A.oryzae), Hansenula polymorpha, Candida, Kloeckera,
Torulopsis, and Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces sp.
(for example, Kluyveromyces lactis), Candida albicans,
Aspergillus sp (for example, Aspergillus nidulans,
Aspergillum niger, Aspergillus oryzae), Trichoderma reesei,
Chrysosporium luchiowense, Fusarium sp. (por ejemplo,
Fusarium gramineum, Fusarium venenatum), Physcomitrella
patens. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a
una célula que comprende una secuencia de nucleótidos o una
construcción génica o un vector de expresión según la invención. En
otra realización preferida de la invención, dicha levadura se
selecciona entre Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces
lactis.
El polipéptido o la proteína de fusión de la
invención se puede obtener mediante diversos métodos conocidos por
el experto en la materia, por ejemplo, mediante el empleo de
técnicas de ADN recombinante. De hecho, la secuencia de nucleótidos
o vector de la invención puede ser utilizado para producir el
polipéptido o la proteína de fusión de la invención. Por tanto, a
modo ilustrativo, no limitativo, un método para producir dicho
polipéptido o dicha proteína de fusión de la invención comprende
crecer una célula proporcionada por esta invención bajo condiciones
que permiten la producción de dicho polipéptido o proteína de
fusión. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula
dependerán de la célula utilizada. Si se desea, el polipéptido o la
proteína de fusión de la invención puede ser aislado y,
opcionalmente, purificada, por métodos convencionales.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un procedimiento para la obtención de un polipéptido
con actividad esterasa que comprende cultivar una célula según la
invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho
polipéptido y, si se desea, recuperar dicho polipéptido. Así, el
polipéptido de la invención, si se desea, es aislado y,
opcionalmente, purificado.
Prácticamente cualquier método conocido en la
técnica puede ser utilizado para la recuperación de la proteína de
interés del interior celular o del medio de cultivo. Si la proteína
se produce en el interior de la célula, es necesario lisar las
células para liberar las proteínas de interés.
Así, en el caso de que dicha célula sea una
bacteria, dichas células se pueden lisar por diferentes métodos que
incluyen tratamiento con álcalis o calor, detergentes iónicos o no
iónicos y disolventes orgánicos. La elección del método de
extracción dependerá de la especie bacteriana de que se trate de
forma que el tratamiento debe modificarse según la cepa hospedadora
(especie bacteriana o estirpe, debido a la diferente composición de
la pared celular de distintos microorganismos).
Convencionalmente, cuando la célula es una
célula de levadura, éstas se lisan mediante lisis hipotónica de
esferoplastos formados previamente mediante tratamiento con
glucanasas, mediante sonicación o mediante agitación en presencia de
bolas de vidrio.
Una vez que la proteína de interés se encuentra
en el medio, bien mediante liberación del interior celular bien
porque la proteína es secretada por la propia maquinaria de
secreción de la célula, se emplean métodos convencionales para la
purificación de dicha proteína, incluyendo, sin estar limitado,
cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, de
interacción hidrofóbica, de filtración en gel, HPLC), métodos
electroforéticos (isoelectroenfoque preparativo, electroforesis
preparativa en geles de poliacrilamida-SDS),
solubilidad diferencial (precipitación con sulfato amónico),
ultracentrifugación preparativa en gradiente de sacarosa. Una vez
que se ha alcanzado el grado deseado de pureza, lo que puede
requerir más de un paso cromatográfico, es frecuente que sea
necesario concentrar la proteína o eliminar sales e iones que puedan
ser peijudiciales para su posterior uso. En ese caso, se recurre a
técnicas conocidas, tales como liofilización o ultrafiltración.
La determinación del grado de pureza de dicho
polipéptido se puede estimar mediante el valor de la actividad
enzimática específica que se calcula dividiendo el número de
unidades de actividad enzimática entre la cantidad de mg de proteína
en un volumen determinado. Preferiblemente, la actividad enzimática
se determina mediante el método de medida de actividad lipolítica
descrito según Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición que comprende un polipéptido o una proteína de fusión
según la invención.
Las esterasas son enzimas capaces de hidrolizar
enlaces tipo éster de las grasas. Por tanto, en otro aspecto, la
invención se relaciona con el uso de un polipéptido o una proteína
de fusión según la invención en la elaboración de una composición
detergente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para la modificación de grasas o aceites que comprende poner
en contacto un polipéptido o una proteína de fusión según la
invención con una grasa o aceite en condiciones donde dicho
polipéptido o proteína de fusión pueda hidrolizar dicha grasa o
aceite.
La invención se describe a continuación mediante
los siguientes ejemplos que deben ser considerados como meramente
ilustrativos y no limitativos de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica
la enzima heteróloga con actividad esterasa (secuencia completa que
codifica una proteína de 329 aminoácidos) de T. thermophilus
HB27 (DE3) se amplificó por PCR a partir de DNA genómico de T.
thermophilus con los siguientes primers que comprenden sitios
BamHI (F) y HindIII (R):
\newpage
| PUREST-F: | CGGGATCCGAatgaagcggcttatcgcgct | (SEQ ID NO: 2) |
| PUREST-R: | CCCAAGCTTaggccgcacccgggggggcg | (SEQ ID NO: 3) |
El producto de amplificación se clonó en los
correspondientes sitios de restricción del vector pET21d
(NOVAGEN).
La bacteria Escherichia coli BL21 (DE3)
(NOVAGEN) se transformó con la secuencia clonada en el plásmido
pET21d de forma que la proteína se sintetiza fusionada a una cola
C-terminal de 6 histidinas tras inducción con IPTG
(Isopropil
\beta-D-tiogalactopiranósido).
Las bacterias transformadas con el plásmido
recombinante, se cultivaron en medio líquido LBA (1%
Bacto-Triptona, 0,5%
Bacto-Yeast-Extract, 0,5% Cloruro
Sódico, 0,1% Glucosa, Ampicilina 40 mg/mL) a 37°C en agitación
orbital y al alcanzar una DO a 600 nm de 0,6 se llevó a cabo la
inducción con IPTG.
La medida de actividad lipolítica y definición
de unidad enzimática de la enzima recombinante se realizó según
Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
Por otro lado, se transformaron cepas de la
levadura Kluyveromyces lactis NRRL-Y1140 con
variantes de la secuencia integradas en multicopia en el genoma
fusionadas a una señal de secreción y expresándose bajo el promotor
de la beta-galactosidasa. De esta forma, las enzimas
se secretan al medio de cultivo cuando las levaduras crecen en
presencia de un inductor como galactosa o lactosa.
Las variantes de la secuencia utilizadas
consisten en eliminar 16 ó 26 aminoácidos del extremo
N-terminal, es decir, las putativas señales de
secreción (aminoácidos 1-16) y hélice transmembrana
(aminoácidos 6-26) de la proteína nativa y se
corresponden con las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 4 y
SEQ ID NO: 5, respectivamente.
Las secuencias se amplificaron por PCR a partir
de DNA genómico de T. thermophilus HB27 con los siguientes
primers para clonarlas entre los sitios XhoI y KpnI del plásmido
pKLAC1 (New England Biolabs) en pauta de lectura con la señal de
secreción (K. lactis alfa-mating factor
domain).
Empezando en el aminoácido 27
| EST1KF (XhoI) | TTTCTCGAGAAAAGAgaggtgcccggtggggtctgc | (SEQ ID NO: 6) |
| EST1KR (KpnI) | TTTGGTACCtcaaggccgcacccgggggggcgt | (SEQ ID NO: 7) |
\vskip1.000000\baselineskip
Empezando en el aminoácido 17
| EST1KF2 (XhoI) | TTTCTCGAGAAAAGAcagggcctcgaggccttctgg | (SEQ ID NO: 8) |
| EST1KR (KpnI) | TTTGGTACCtcaaggccgcacccgggggggcgt | (SEQ ID NO: 7) |
Con los plásmidos linearizados por digestión
enzimática con SacII se transformó la levadura K. lactis
NRRL-Y1140 y se seleccionaron los transformantes por
crecimiento en medio sólido con 5 mM de acetamida como fuente de
nitrógeno, y se comprobó que la construcción se había integrado en
multicopia en el genoma. Las levaduras se transformaron según el
método del acetato de litio descrito en Ito et al. (1983) (J.
Bacteriol, 153: 163-168.).
Las cepas transformadas se cultivaron en
matraces de 1L con 200 mL de medio YPgal (Extracto de levadura: 10
g/L, Bacto-peptona: 20 g/L, Lactosa: 20 g/L) a 30°C
en agitación orbital (100 rpm), obteniendo una actividad esterasa
aproximada en el medio de cultivo a las 49 horas de 500 U/L en el
caso de la variante más larga y de 200 U/L en el caso de la variante
más corta, como puede verse en las gráficas de la Figura 1. La
actividad especifica (U/mg prot) en los postincubados libres de
células fue de 0,09 y 0,04 U/mg proteína, respectivamente. El método
de medida de actividad lipolítica empleado es el descrito según
Fuciños et al (2005) (J. Biotechnol.
117:233-241).
Se transformó la levadura Saccharomyces
cerevisiae BJ3505 (Eastman Kodak Company) con la variante de la
secuencia de nucleótidos de la proteína heteróloga sin la región
correspondiente a los 16 aminoácidos N-terminales
clonada en yEpFlagl (Eastman Kodak Company) en pauta de lectura con
la secuencia de la señal de secreción (del
alfa-mating factor de S. cerevisiae) y del
péptido Flag.
El plásmido lleva un promotor que se reprime por
glucosa. Las enzimas se secretan al medio de cultivo, cuando se ha
agotado la glucosa, fusionadas al péptido Flag por el extremo
N-terminal.
La secuencia se amplificó por PCR a partir de
DNA genómico de T. thermophilus HB27 con los siguientes
primers que tienen colas homologas al vector MCS (del inglés,
múltiple cloning site).
PFLAG-EST
| F: | AAAAGAGACTACAAGGATGACGATGACAAGcagggcctcgaggccttctgg | (SEQ ID NO: 9) |
| R: | TGGGACGCTCGACGGATCAGCGGCCGCTTAaggccgcacccgggggggcgt | (SEQ ID NO: 10) |
Con el producto de PCR y el vector linearizado
por digestión en el sitio de clonación múltiple con EcoRI y SalI, se
transformó la levadura S. cerevisiae BJ3505 seleccionando los
transformantes (que contienen el plásmido recombinante que se ha 1
recircularizado por recombinación) por crecimiento en medio
CM-trp. El medio CM sin el correspondiente
aminoácido (triptófano) empleado como marcador auxotrófico se
preparó según (Zitomer y Hall, 1976, J. Biol. Chem., 251:
6320-6326). Las levaduras se transformaron según el
método del acetato de litio de Ito et al. (1983) (J.
Bacteriol., 153: 163-168).
Las cepas transformadas se cultivaron en un
medio que contiene 1% glucosa, 3% glicerol, 1% extracto de levadura
y 8% de peptona. Se realiza un cultivo de 100 ml en un matraz de
500 ml, se pone en marcha el cultivo con un inoculo inicial a 0,1 de
DO_{600} y se incuba a 30° con agitación orbital continua (250
rpm), obteniendo una actividad lipasa aproximada a las 72 horas en
el medio de cultivo de 1000 UE/L como puede verse en la gráfica a
modo de ejemplo. La actividad específica en ese momento fue de de
3,79 U mg^{-1}. El método de medida de actividad lipolítica y
definición de unidad enzimática según Fuciños et al (2005) J.
Biotechnol. 117:233-241.
Se purificó la proteína producida
extracelularmente por la levadura Saccharomyces cerevisiae
BJ3505 transformada con la variante de la secuencia sin la región
correspondiente a los 16 aminoácidos N-terminales
clonada en yEpFlagl en pauta de lectura con la secuencia de la señal
de secreción (del alfa-mating factor de S.
cerevisiae) y del péptido Flag.
El medio postincubado libre de células (72 horas
de cultivo) se concentró por ultrafiltración tangencial (corte
10.000 Da) y a partir del concentrado se purificó la esterasa por
cromatografía de afinidad con AntiFlag M2 agarosa (Sigma) siguiendo
las instrucciones del proveedor. La actividad específica (media de
tres experimentos) aumentó desde 7,30 U/mg en el postincubado
concentrado hasta 220,6 U/mg en el eluído de la cromatografía de
afinidad (Factor Purificación= 30,2).
En la Figura 2 se muestra una electroforesis en
gel SDS-PAGE del medio de cultivo postincubado
(carril 2), concentrado por ultrafiltración (carril 3) y el eluído
de la cromatografía de afinidad (carril 4). El carril 1 es el
marcador de Pm (Da). Tras la cromatografía de afinidad se obtienen
tres bandas mayoritarias que corresponden a la esterasa (las tres se
revelan en el western blot con anticuerpos antiFlag) pero en
diferentes formas de glicosilación pues el tratamiento con la
glicosidasa EndoH resulta en una única banda (carril 5).
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> UNIVERSIDAD DA CORUÑA
\vskip0.400000\baselineskip
<110> UNIVERSIDAD DE VIGO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ESTERASA TERMÓFILA DE Thermus
thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P3837ES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
PUREST-F para amplificar por PCR la secuencia de
nucleótidos de la esterasa de T. thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
PUREST-R para amplificar por PCR la secuencia de
nucleótidos de la esterasa de T. thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido EST1KF para
amplificación por PCR de la variante 1 de la esterasa de T.
thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido EST1KR para
amplificar por PCR la secuencia de la variante 1 y 2 de T.
thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido EST1KF2 para
amplificar por PCR la secuencia de la variante 2 de la esterasa de
T. thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
PFLAG-EST-F para amplificar por PCR
la secuencia de nucleótidos de la esterasa de T.
thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
PFLAG-EST-R para amplificar por PCR
la secuencia de nucleótidos de la esterasa de T.
thermophilus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
Claims (24)
1. Un polipéptido aislado con actividad esterasa
que comprende la secuencia de aminoácidos identificada en la SEQ ID
NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, donde
dicha esterasa es una esterasa termófila.
3. Polipéptido según la reivindicación 2, donde
dicha esterasa termófila es estable a una temperatura comprendida
entre 60 y 90°C.
4. Una pro teína de fusión que comprende
- i)
- un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
- ii)
- un péptido heterólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Proteína de fusión según la reivindicación 4,
donde dicho péptido heterólogo es un péptido señal de secreción
extracelular.
6. Polipéptido o proteína de fusión según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha proteína de
fusión comprende, además, un péptido de purificación.
7. Polipéptido o proteína de fusión según la
reivindicación 6, donde dicho péptido de purificación se selecciona
entre un péptido Flag o una cola de polihistidinas.
8. Una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una
proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a
7.
9. Una construcción génica que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8.
10. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8 o una
construcción génica según la reivindicación 9.
11. Vector de expresión según la reivindicación
10, que comprende, además, la secuencia de nucleótidos de un
promotor.
12. Vector de expresión según la reivindicación
11, donde dicho promotor es un promotor inducible o reprimible.
13. Vector de expresión según la reivindicación
12, donde dicho promotor es un promotor inducible por galactosa o
lactosa.
14. Vector de expresión según la reivindicación
12, donde dicho promotor es un promotor inducible por IPTG.
15. Vector de expresión según la reivindicación
12, donde dicho promotor es un promotor que se reprime en presencia
de glucosa.
16. Una célula que comprende una secuencia de
nucleótidos según la reivindicación 8 o una construcción génica
según la reivindicación 9 o un vector de expresión según cualquiera
de las reivindicaciones 10 a 15.
17. Célula según la reivindicación 16, donde
dicha célula se selecciona entre una bacteria y una levadura.
18. Célula según la reivindicación 17, donde
dicha bacteria es Escherichia coli.
19. Célula según la reivindicación 17, donde
dicha levadura se selecciona entre Saccharomyces cerevisiae y
Kluyveromyces lactis.
20. Una composición que comprende un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.
21. Un procedimiento para la obtención de un
polipéptido con actividad esterasa o una variante funcionalmente
equivalente del mismo que comprende cultivar una célula según
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 bajo condiciones que
permiten la producción de dicho polipéptido y, si se desea,
recuperar dicho polipéptido.
22. Procedimiento según la reivindicación 21,
donde cuando dicho polipéptido con actividad esterasa comprende la
secuencia de aminoácidos de un péptido de secreción extracelular, la
recuperación de dicho polipéptido se realiza a partir del medio de
cultivo.
23. Uso de un polipéptido según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión según una
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 en la elaboración de una
composición detergente.
24. Método para la modificación de grasas o
aceites que comprende poner en contacto un polipéptido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una proteína de fusión
según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 con una grasa o
aceite en condiciones donde dicho polipéptido o proteína de fusión
pueda hidrolizar dicha grasa o aceite.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801767A ES2347398B1 (es) | 2008-06-11 | 2008-06-11 | Esterasa termofila de thermus thermophilus. |
| PCT/ES2009/070215 WO2009156532A1 (es) | 2008-06-11 | 2009-06-10 | Esterasa termófila de thermus thermophilus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801767A ES2347398B1 (es) | 2008-06-11 | 2008-06-11 | Esterasa termofila de thermus thermophilus. |
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|---|---|
| ES2347398A1 ES2347398A1 (es) | 2010-10-28 |
| ES2347398B1 true ES2347398B1 (es) | 2011-09-15 |
Family
ID=41444060
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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