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WO2009053597A2 - Nouveau procede de preparation de nanoparticules recouvertes d'une couche stabilisatrice organique couplee a des ligands de ciblage - Google Patents

Nouveau procede de preparation de nanoparticules recouvertes d'une couche stabilisatrice organique couplee a des ligands de ciblage Download PDF

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WO2009053597A2
WO2009053597A2 PCT/FR2008/051803 FR2008051803W WO2009053597A2 WO 2009053597 A2 WO2009053597 A2 WO 2009053597A2 FR 2008051803 W FR2008051803 W FR 2008051803W WO 2009053597 A2 WO2009053597 A2 WO 2009053597A2
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WO
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targeting
ligand
group
ligands
acid
Prior art date
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PCT/FR2008/051803
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Inventor
Marc Port
Olivier Rousseaux
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Guerbet SA
Original Assignee
Guerbet SA
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Publication date
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Publication of WO2009053597A3 publication Critical patent/WO2009053597A3/fr
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    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the invention relates to a novel process for the preparation of nanoparticles for medical imaging comprising a metal core, an organic stabilizing layer and at least one targeting ligand of a pathological tissue.
  • Metallic nanoparticles used in diagnostic imaging, in particular MRI magnetic resonance imaging, comprising a metal core, coated with a stabilizing organic layer coupled, where appropriate, to biological targeting ligands, are known.
  • metal nanoparticles commonly known as USPIO which are very small particles of iron oxide, including magnetite (Fe 3 O 4 ), maghemite ( ⁇ -Fe 2 O 3 ) and other mineral compounds. magnetic transition elements, less than about 100-150 nm in size.
  • the particle is covered with a stabilizing organic layer consisting of macromolecules such as carbohydrates such as dextran, or small organic molecules such as carboxylic acids.
  • an appropriate targeting ligand In order to obtain relevant information for medical imaging diagnosis, it is very advantageous to couple them to an appropriate targeting ligand, so that the particles bind to and / or are specifically recognized by cells or tissues. targets.
  • This recognition is often provided by the formation of an affinity complex between an affinity ligand (or biovector) attached to the particle and a receptor on the surface of target cells, or using ligands involved in biodistribution. of the product for example by a mechanism of the phagocytosis type of the particle by cells of the immune system such as macrophages.
  • the ligands with specific affinity are typically peptides or other organic molecules (sugars, pharmacological ligands, etc.).
  • Bioders involved in biodistribution are, for example, hydrophilic groups such as aminoalcohol groups, or polyethylene glycol type compounds. .
  • the document WO 97/01760 describes magnetic particles coated with dimercaptosuccinic acid (ADMS), coupled to a specific targeting entity, annexin, via the thiol functions of ADMS.
  • the documents EP 888 545 and WO2004 / 034411 describe particles of diameters of the order of 5 nm, covered with aliphatic polycarboxylic acid groups, these groups being able to be linked to active pharmaceutical substances (targeting ligands), chosen in particular from proteins, enzymes, antibiotics, endotoxins, therapeutic substances in the fields including cardiovascular, cancerous.
  • active pharmaceutical substances targeting ligands
  • the core with the stabilizing layer, for example polycarboxylic acid; coupling of the particle obtained with the targeting ligand.
  • the stabilizing layer for example polycarboxylic acid
  • the nanoparticle before coupling with the ligands is not sufficiently stable for industrial production, or the degree of ligand grafting is not completely controlled: it is then possible to have a lack or an excess of grafted ligands or too much heterogeneity between the particles of the batch of product produced and if necessary to perform complex purification steps or inoperative.
  • the applicant has succeeded in obtaining a novel process for synthesizing metallic nanoparticles making it possible to overcome the drawbacks of the prior art for several stabilizing layers, and designated the reverse method.
  • elements consisting of one or more ligands chemically coupled with organic linking groups (also referred to as stabilizing groups or attachment groups) are prepared, and then these elements [together: linking group + ligand] are coupled to the nanoparticles. metal.
  • the organic linking groups will belong to or form the stabilizing layer (also referred to as the tie layer).
  • the metal nanoparticles are of varied diameter, in particular of the order of 3 to 300 nm, advantageously 5 to 100 nm, and especially 5 to 50 nm.
  • the method is effectively applied to very diverse and advantageous chemical and therapeutic and / or diagnostic pharmaceutical properties.
  • the invention thus relates, according to a first aspect, to a method for preparing metal nanoparticles, for medical imaging in particular, comprising an N metal core covered with an organic stabilizing layer coupled to at least one targeting ligand, said method comprising the steps of: a) preparing the metal N core of the metal nanoparticles; b) preparation of targeting elements of formula S - C, wherein:
  • S is an attachment group selected from the following groups and their derivatives: polycarboxylic acid, hydroxy polycarboxylic acid, phosphonate, sulfonate, hydroxamate, silane, siloxane catecholate;
  • C is a targeting ligand; c) then grafting on the N nucleus of targeting elements S-C.
  • Each group S comprises at least one N-ring binding part, and at least one X chemical function of coupling with a ligand C, more precisely of covalent binding to a reactive function of ligand C.
  • step c) for the covers allowing a stable coverage (citrate for example), it will be possible to partially cover the metal core N with a layer of stabilizer / attachment groups S, before grafting SC targeting elements therein. step c). Steps a) and b) can be performed in any order but before step c).
  • the ligand is a hydrophilic group with an effect on the biodistribution (distribution in the tissues, macrophage uptake, etc.), advantageously an aminoalcohol or polyethylene glycol group.
  • the ligand is an affinity ligand (biovector), with a binding affinity for a target overexpressed in a pathological cell or tissue, in particular a cellular receptor, an enzyme, and advantageously chosen from a linear peptide or cyclic, a pseudopeptide, a monosaccharide, a polysaccharide, a vitamin, an antibody, a nucleic acid, a pharmacologically active substance.
  • a portion of the ligands are affinity biovectors, and another portion of the ligands are biodistribution effect ligands.
  • the nucleus is covered, on the one hand, targeting elements with specific affinity targeting ligands and, on the other hand, stabilization / binding groups linked to stability ligands. / biodistribution.
  • nuclei are grafted on the one hand with targeting elements SC and on the other hand with stabilization groups S not carrying ligands. For example, there will be 5% to 100% of SC groups and the complement (95 to 0%) of groups S. The tables in the detailed description illustrate these possibilities.
  • the set of groups S grafted on the nucleus N constitutes the tie layer (stabilizer).
  • the degree of grafting (percentage by mol of compound SC and / or S per mol of iron, the degree of grafting is calculated from the known microanalysis methods) of the targeting elements SC on the core N is typically between 0.5 and 5%, or between 1 and 10%, especially between 1 and 3%, for example 1%, 2%, 3%, 5%, 10% for a crystal size of the core of the order of 7-8 nm.
  • the ligands may therefore be identical or different between the grafted targeting elements.
  • the metal nanoparticles obtained after grafting will thus have, for example, part of the targeting elements with an affinity ligand (biovector peptide for example, for example 0.1 to 50%: advantageously of the order of 0.1 , 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 50% of the X functions of the S groups are coupled to a biovector), and another part (typically 10 to 99% of the targeting elements) with a ligand different (another biovector of affinity or biodistribution ligand). It is thus possible to combine several affinity and / or biodistribution ligands. Generally, a coupling rate is achieved suitable for obtaining a satisfactory final particle hydrodynamic size, while allowing for effective specific targeting.
  • the polycarboxylic acid comprises at least two carboxylic functions and is chosen from the following acids: citric acid, tartaric acid (D, L), tartaric acid, glutaric acid, malic acid, cyclohexanetricarboxylic acid, cyclohexanehexacarboxylic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, 4-bromo-mandelic acid, cis, cis, cis, cis-1,2,3,4-cyclopentanetetracarboxylic, acid
  • DL-malic acid dibenzoyl-D-tartaric acid, chelidonic acid, tetrahydrofuran-1,3,4,5-tetracarboxylic acid, DL-isocitric acid, mucic acid, oxalic acid, glucuronic acid.
  • carboxylic acid derivatives it is possible to use aliphatic or aromatic acids, substituted compounds of polycarboxylic acids, the carboxyl groups of which are unchanged, but of which one or more hydrogen atoms are replaced by alkyl groups or carbon atoms. 'halogen.
  • the S-linking groups, particularly the carboxylic acids, used for binding to targeting ligands include at least one core coupling function and at least one ligand coupling function.
  • the polycarboxylic acid is a tricarboxylic acid, preferably citric acid which comprises:
  • a CO 2 H function allowing a chemical coupling to a biovector, for example by an amino function of the biovector by using peptide biocoupling techniques - a part interacting with the nucleus, comprising two CO 2 H functions.
  • the group S is chosen from the following groups, for which the direct grafting on the nucleus is not satisfactorily achievable under standard grafting conditions described in the literature: phosphonate, sulphonate, hydroxamate, siloxane, silane , catecholate.
  • R is for example a group X-L, where:
  • X is a function capable of coupling with a biovector (as described below);
  • L is a chemical linker linkage chosen from: a single bond, an aliphatic group (in particular an alkyl group such as the methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, isobutyl, pentyl and hexyl radicals); an alicyclic group, especially cycloalkyl; an aromatic group (mono- or polycyclic aromatic hydrocarbon group preferably comprising from 5 to 20 carbon atoms); aromatic-aliphatic, said aliphatic, alicyclic and aromatic groups being optionally substituted by methyl, hydroxy, methoxy, acetoxy, amido, or a chlorine, iodine or aliphatic group; alicyclic; alicyclic-aliphatic; bromine; a group -Li-NHCO-L 2 where Li and L 2 are either identical or different and represent an aliphatic group; alicyclic; aromatic; alicyclic-aliphatic or aromatic-
  • the silanes are typically of formula (Si n H 2n + 2 ), the siloxanes of formula [R 2 SiO] n (where R is as defined above - for example [SiO (CH 3 ) 2 ] n .
  • S groups are rendered fluorescent, the nanoparticles are then covered with non-fluorescent SC elements on the one hand, and fluorescent S or SC elements on the other hand (examples detailed below), the nanoparticles being interest in multimodal imaging (MRI and near infra-red optical imaging in particular) to refine the diagnosis.
  • multimodal imaging MRI and near infra-red optical imaging in particular
  • a second stabilizing compound as mentioned in paragraph [0040] of this document is used as in US Pat. No. 6,638,494.
  • one also grafts groups having an effect on the stability of the nanoparticle for example hydroxy-carboxylic acids, for example chosen from the following: gluconic acid, oxalic acid, mandelic acid 4-hydroxy-3-methoxy-mandelic acid, lactobionic acid, alpha-hydroxyhippuric acid, methyl 2-hydroxybutyric acid, glycolic acid, N-acetylneuraminic acid, phosphoenolpyruvic acid.
  • hydroxy-carboxylic acids for example chosen from the following: gluconic acid, oxalic acid, mandelic acid 4-hydroxy-3-methoxy-mandelic acid, lactobionic acid, alpha-hydroxyhippuric acid, methyl 2-hydroxybutyric acid, glycolic acid, N-acetylneuraminic acid, phosphoenolpyruvic acid.
  • the applicant's method makes it possible to perfectly control the degree of grafting of the nanoparticles into ligand-bearing compounds, which is very useful for the cost and the control of the physiological efficacy of the product.
  • the manufacture of SC targeting elements is by elsewhere completely controlled, especially their purity before grafting, which is major for industrial manufacturing.
  • the metal core of the prepared nanoparticles is typically composed in whole or in part of iron hydroxide; hydrated iron oxide; mixed iron oxides such as mixed iron oxides of cobalt, nickel, manganese, beryllium, magnesium, calcium, barium, strontium, copper, zinc or platinum; or a mixture of these.
  • the term "ferrite” denotes iron oxides of general formula [xF ⁇ 2 ⁇ 3, y MOz], where M denotes a magnetizable metal under the effect of a magnetic field such as Fe, Co, Ru, Mg, Mn, the magnetizable metal. possibly being radioactive.
  • the magnetic particles of the compositions of the invention comprise a ferrite, in particular maghemite ( ⁇ F ⁇ 2 ⁇ 3) and magnetite (F ⁇ 3 ⁇ 4), or mixed ferrites of cobalt (F ⁇ 2 CoO 4) or manganese (F ⁇ 2 MnO 4 ).
  • Non-superparamagnetic metals such as lanthanide oxides (especially gadolinium and europium), delayed luminescence particles (PNAS, 2007, 29,104,22,9266: particles of CaZnHgSiO doped with lanthanides Eu 3+ may also be used for the nucleus.
  • Dy 3+ , Mn 2+ mixed compounds based on elements selected from the group consisting of Ca, Mn, Mg, Si and O, said mixed compounds being doped with lanthanides, quantum dot type particles.
  • affinity ligands As preferred affinity ligands, mention may be made of glycoproteins, lectins, biotin, vitamins, pteroic or aminoptero derivatives, folic acid and antifolic acid derivatives, antibodies or antibody fragments, peptides and their derivatives, mono- or polysaccharides, avidin, inhibitors or substrates of receptors (membrane or nuclear), phospholipids, steroids and their analogues, oligonucleotides, ribonucleic acid sequences, deoxyribonucleic acid sequences hormones or hormone-like substances, amino acids, pharmacologically active organic molecules, pharmacophores, optionally recombinant or mutated proteins, antibodies or antibody fragments, aminoalcohols, phospholipid derivatives, saccharides; folic acid and antifolate derivatives, targeting agents of integrins or metalloproteases being particularly preferred.
  • the affinity ligand is chosen from the following list (the documents and references in parent
  • Biovectors targeting VEGF and angiopoietin receptors (described in WO 01/97850), polymers such as polyhystidine (US 6,372,194), fibrin targeting polypeptides (WO 2001/9188), integrin targeting peptides (WO 01/77145, WO 02 26776 for alphav beta3, WO 02/081497, for example RGDWXE), the pseudopeptides and targeting peptides of MMP metalloproteases (WO 03/062198, WO 01/60416), the peptides targeting for example the KDR receptor / Flk-I including RXKXH and RXKXH, or Tie-1 and 2 receptors (WO 99/40947 for example), Lewis sialyl glycosides (WO 02062810 and M ⁇ ller et al, Eur J.
  • polymers such as polyhystidine (US 6,372,194), fibrin targeting polypeptides (WO 2001/9188), integrin targeting
  • antioxidants such as ascorbic acid (WO 02/40060), targeting biovectors of tuftsin (for example US 6,524,554), targeting GPCR protein G receptors, in particular cholecystokinin (WO 02 / 094873), associations between integrin antagonist and guanidine mime (US 6,489,333), quinolones targeting alphav b eta3 or 5 (US 6,511,648), benzodiazepines and analogs targeting integrins (US A 2002/0106325, WO01 / 97861), imidazoles and the like (WO 01/98294), RGD peptides (WO 01/10450), antibodies or antibody fragments (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inducible with TNF or IL (US Pat.
  • antioxidants such ascorbic acid (WO 02/40060), targeting biovectors of tuftsin (for example US 6,524,554), targeting GPCR protein G receptors, in
  • target-modified targeting molecules US 5,707,605
  • targeting of amyloid deposits WO 02/28441 for example
  • cathepsin cleaved peptides WO 02/056670
  • mitoxantrone or quinone US 6,410,695
  • polypeptides targeting epithelial cells US 6,391,280
  • cysteine inhibitors proteases WO 99/54317
  • Angiogenesis inhibitors including those tested in clinical trials or already marketed, including:
  • inhibitors of angiogenesis involving FGFR or VEGFR receptors such as SU101, SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, azacycle compounds (WO 00244156, WO 02059110);
  • inhibitors of angiogenesis involving MMPs such as BB25-16 (marimastat), AG3340 (prinomastat), solimastat, BAY12-9566, BMS275291, metastat, neovastat;
  • angiogenesis inhibitors involving integrins such as SM256, SG545, adhesion molecules blocking EC-ECM (such as EMD 121-
  • drugs with a more indirect antiangiogenesis mechanism of action such as carboxiamidotriazole, TNP470, squalamine, ZD0101;
  • the inhibitors described in WO 99/40947 the highly selective monoclonal antibodies for binding to the KDR receptor, the somatostatin analogs (WO 94/00489), the selectin binding peptides (WO 94/05269), growth factors (VEGF, EGF, PDGF, TNF, MCSF, interleukins); VEGF targeting biovectors described in Nuclear Medicine Communications, 1999, 20; the inhibitory peptides of document WO 02/066512.
  • Biovectors capable of targeting receptors CD36, EPAS-1, ARNT, NHE3, Tie-1, 1 / KDR, Flt-1, Tek, neuropilin-1, endoglin, pleientropin, endosialin, AxI., AIP1, a2ssl , a4P1, a5pl, eph B4 (ephrin), laminin A receptor, neutrophilin 65 receptor, leptin OB-RP receptor, chemokine receptor CXCR-4 (and other receptors cited in WO99 / 40947), LHRH, bombesin / GRP, receptors gastrin, VIP, CCK.
  • GPIIb / IIIa receptor inhibitors selected from: (1) the Fab fragment of a GPIIb / IIIa receptor monoclonal antibody, Abciximab, (2) intravenous small peptidic and peptidomimetic molecules injected such as eptifibatide and tirofiban.
  • Fibrinogen receptor antagonist peptides (EP 425 212), 11b / 111a receptor ligand peptides, fibrinogen ligands, ligands thrombin, peptides capable of targeting atheroma plaque, platelets, fibrin, hirudin-based peptides, guanine derivatives targeting the llb / IIIa receptor.
  • biovectors or biologically active fragments of biovectors known to those skilled in the art as drugs, anti-thrombotic action, anti platelet aggregation, antiatherosclerotic, antirestenotic, anticoagulant.
  • biovectors or biologically active fragments of biovectors targeting ⁇ v ⁇ 3, described in association with DOTA in US Pat. No. 6,537,520 selected from the following: mitomycin, tretinoin, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicin, carboquone, pentostatin, nitracrine, zinostatin, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicin, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acetate, ketanserin, doxiflur
  • some biovectors targeting particular types of cancers for example ST-associated receptors for colorectal cancer, or the tachykinin receptor.
  • any peptide obtained by targeting technologies such as phage display, optionally modified by non-natural amino acids (http // chemlibrary.bri.nrc.ca), for example peptides derived from phage libraries display: RGD, NGR, CRRETAWAC, KGD, RGD-4C, XXXY * XXX, RPLPP, APPLPPR.
  • Hormonal receptor ligands including hormones and steroids.
  • biovectors recalled in Topics in Current Chemistry, vol.222, 260-274, Fundamentals of Receptor-based Metallopharmaceuticals Diagnostics including: - biovectors targeting peptide receptors overexpressed in tumors (LHRH receptors, bombesin / GRP, receptors VIP, CCK receptors, tachykinin receptors for example), in particular the somatostatin or bombesin analogues, peptides derived from possibly glycosylated octreotide, VIP peptides, alpha-MSH, CCK-B peptides
  • peptides chosen from: cyclic peptides RGD, fibrin-alpha chain, CSVTCR, tuftsin, fMLF, YIGSR (receptor: laminin).
  • markers of myocardial viability (tetrofosmin and hexakis2methoxy-2-methylpropylisonitrile).
  • neurotransmitter receptor ligands D, 5HT, Ach, GABA, NA receptors.
  • Tissue factor 29 biovectors described in WO 03/20701, in particular the PK11195 peripheral benzodiazepine receptor ligand.
  • fibrin-binding peptides in particular the peptide sequences described in WO 03/11115.
  • the ligands in particular the antibodies and the pharmacophores, may be optionally functionalized so as to be able to react with the X-coupling functions of the S-linking groups, and form a covalent bond preferably of -CONH-, -COO-, - type.
  • hydrophilic groups in particular aminoalcohols and polyethyleneglycol (also called PEG), are advantageously used.
  • aminoalcohol a ligand comprising an amine function carrying at least one chain aliphatic hydrocarbon-based hydrocarbon containing from 2 to 10 carbon atoms, said hydrocarbon chain being substituted by several hydroxyl groups, in particular by 4 to 10 hydroxyl groups.
  • aminoalcohol ligands are compounds of general formula (II):
  • R 1 and R 2 are identical or different and represent an aliphatic hydrocarbon chain containing from 2 to 6 carbon atoms, preferably substituted by 6 to 10 hydroxyl groups, or else from 4 to 8 hydroxyl groups in the case where R 1 and / or R 2 2 is interrupted by one or more oxygen atoms.
  • R 1 and R 2 each independently represent a - (CH 2 ) - (CHOH) 4 -CH 2 OH or - (CH 2 ) -CHOH group -CH 2 OH, especially those for which R 1 represents a group - (CH 2 ) - (CHOH) 4 -CH 2 OH or - (CH 2 ) -CHOH-CH 2 OH and R 2 a group -CH 2 - ( CHOH) 4 -CH 2 OH.
  • aminoalcohol ligands are compounds of formula (IV)
  • Z is a bond, CH 2 , CH 2 CONH or (CH 2 ) 2 NHCO
  • R 1, R 2, R 3, R 4 or R 5 each independently represent H, Br, Cl, I, CONQiQ 2 or NQiCOQ 2 , with Q 1 and Q 2 being identical or different chosen from H, a (C 1 -C) alkyl mono- or polyhydroxyl group and / or optionally interrupted by one or more oxygen atoms, such that Qi and Q 2 together comprise from 4 to 10 OH groups; it being understood that at least one and at most two of the groups R 1 to R 5 represent CONQ 1 O 2 or NQ 1 CO 2 ;
  • R 1 each independently represent H, Br, Cl, or I and
  • R 2 and R 4 represent
  • R'1, R'3 and R 5 identical or different, represent H, Br, Cl or I; Qi and Q 2 have the same meaning as before;
  • Z "' is a group selected from CONQ, CONQCH 2 CONQ, CONQCH 2 , NQCONQ, CONQ (CH 2 ) 2 NQCO, and
  • Q is H or (dC 4 ) alkyl, said alkyl groups being linear or branched and optionally hydroxylated.
  • Z is CH 2 .
  • Z " is CONH
  • R 2 and R 4 are CONQiQ 2 .
  • R 1, R 3, R 5 represent Br.
  • Q 1 and Q 2 each independently represent a group - (CH 2 HCHOH) 4 -CH 2 OH or - (CH 2 ) -CHOH-CH 2 OH, in particular a group - (CH 2 ) - (CHOH) 4 -CH 2 OH.
  • the aminoalcohol ligand of formula (IV) is the compound:
  • the aminoalcohol ligands according to the invention are coupled via their amino function -NH- or -NH 2 to the function X of the attachment groups S of formula XL-CH (PO 3 H 2 ) 2 , so that the Hydroxyl functions remain free, thus preserving their hydrophilic character.
  • polyethylene glycol generally denotes compounds comprising a chain -CH 2 - (CH 2 -O-CH 2 ) k -CH 2 OR 3 in which k varies from 2 to 100 (for example 2, 4, 6, 10, 50), and R 3 is chosen from H, alkyl or - (CO) Alk, the term “alkyl” or “alk” denoting a linear or branched hydrocarbon aliphatic group having about 1 to 6 carbon atoms in the chain.
  • polyethylene glycol as used herein includes, in particular, aminopolyethylene glycol compounds of formula (III):
  • R 1 and R 2 which are identical or different, represent H, an alkyl group or a polyethylene glycol chain of formula -CH 2 - (CH 2 -O-CH 2 ) K -CH 2 OR 3 , it being understood that at least one of the groups R 1, R 2 represents a polyethylene glycol chain, in which k ranges from 2 to 100 (for example 2, 4, 6, 10, 50), and
  • R 3 is chosen from H, alkyl or - (CO) Alk, the term “alkyl” or “alk” denoting a linear or branched hydrocarbon aliphatic group having from 1 to 6 carbon atoms in the chain.
  • aminopolyethylene glycols are the compounds O- (2-aminoethyl) -O'-methylpolyethyleneglycol 1100, O- (2-aminoethyl) -O'-methylpolyethyleneglycol 2000, O- (2-aminoethyl) -O'- methylpolyethylene glycol 750, compounds PEG 340, PEG 750, PEG 2000 for example.
  • two different biovectors targeting the same pathology can be coupled to each magnetic particle (for example a peptide targeting a first type of receptor overexpressed in cells tumors and a second type of receptor overexpressed in tumor cells), or different pathologies.
  • a mixed coupling can for example be used with different biovectors but capable of specifically targeting the same pathology, such as peptides of different sequences capable of targeting different integrins or metalloproteases overexpressed in a cancerous or cardiovascular pathological zone.
  • a "mixed" coupling between a ligand associated with a recognition by cells of the immune system for example hydrophilic groups improving macrophage uptake, in particular in inflammatory or neurodegenerative zones
  • a ligand of different nature that is to say having either a specific affinity for a given target, or a pharmacological and / or cytotoxic activity, so as to modify the biodistribution of the final product.
  • the method according to the invention further comprises the grafting of elements S-C-T, where C is a polyethylene glycol ligand and T represents a chromophore group.
  • chromophore is meant a colored group, that is to say, capable of absorbing the energy of photons in a range of the visible spectrum while the other wavelengths are transmitted or diffused.
  • a chromophore useful according to the invention there may be mentioned in particular 4- (amino) fluorescein hydrochloride. It is thus possible to obtain a large variety of vectorized nanoparticles (carrying at least one ligand).
  • the invention thus also relates to the use of nanoparticles for the preparation of a diagnostic or therapeutic composition.
  • the nanoparticles are in particular used as a contrast agent of the nanoparticle composition type as described in detail in the document WO2004058275, for the MRI or scanner X-ray imaging.
  • the particles are carried in active substance delivery systems, such as liposome or solid lipid nanoparticle-type encapsulation systems which can also enclose, in addition to nanoparticles used as a diagnostic agent, therapeutic active principles. .
  • the Applicant has also studied this reverse method for non-metallic or metal particles comprising a core and at least one layer of organic monomers or polymers carrying targeting ligands useful in diagnostic or therapeutic terms.
  • the applicant has also studied this inverse method for particles comprising a nucleus (typically metal, but not necessarily), on which the targeting elements comprise a linker group connected to the biovector (drug for example), the group binding being biodegradable so as to release the drug in vivo.
  • a nucleus typically metal, but not necessarily
  • the targeting elements comprise a linker group connected to the biovector (drug for example)
  • the group binding being biodegradable so as to release the drug in vivo.
  • M or M / L molar concentration (mole / liter).
  • M / z mass on charge determined by mass spectrometry.
  • ES + positive mode electrospray.
  • TFA trifluoroacetic acid.
  • kD molecular weight unit (kiloDalton).
  • TLC Thin Layer Chromatography.
  • Z ave hydrodynamic diameter measured by PCS.
  • PoIy ⁇ polydispersity measured by PCS.
  • the iron is assayed by atomic absorption spectroscopy (VARIAN AA10 Spectrophotometer) after mineralization with concentrated HCl and dilution against a standard range of ferric ions (0, 5, 10, 15 and 20 ppm).
  • Example 3 Product with a sulfonate blanket, not stable by the process of the prior art (direct route)
  • Step 1
  • Examples 4 and 5 product with a sulfonate blanket with amino-alcohol biovector (biodistribution ligand: branch designated AAG1AA28Br), by the method of the invention by inverse route
  • step 1 of example 3 200 mg (1.3 ⁇ 10 -3 M) of step 1 of example 3 are solubilized in 10 ml of water 1.46 gr (1.3 ⁇ 10 -3 M) of AAGiAA 2 8 Br are introduced into this solution and the pH is adjusted to 6.2 with QSP of 0.1 N NaOH 250 mg (1.3 ⁇ 10 -3 M) of EDCI are added and the whole is stirred for 8 hours, 250 mg (1.3 ⁇ 10 -3 M) are again added and the whole is stirred 16 hours.
  • the reaction medium is partly concentrated in vacuo and the concentrate is poured into 200 ml of IPA, stirred for 2 hours, filtered and dried under vacuum. The precipitate is eluted on a 50 ml column of Amberlite H + 252 Na resin. The solution is concentrated to dryness under vacuum. The residue is stirred in NPA 2 hours and is filtered and dried. The mass spectrum is consistent.
  • Examples 6 and 7 product with citrate cover with amino-alcohol biovector, by the method of the invention by the inverse route
  • Example 9 According to the procedure of Example 9, using a mixture of the clamps (ligand-carrying groups) of Examples 6 and 8, with the fluorescent clamps 5, 6, 7 or 8 in variable proportions as summarized in FIG. following table:
  • the biovectors are coupled with citric acid according to the procedure described in Example 1.
  • the proportions of the cosolvent are adjusted according to the solubility of the products used.
  • Example 9 According to the procedure of Example 9 using a mixture of the forceps of Examples 6 and 8 with biovector clamps n ⁇ i or 22 in variable proportions as summarized in the following table:
  • Example 9 using a mixture of the clamps of Examples 6 and 8, with the biovector clamps 21 or 22 and fluorescent clamps 5, 6, 7 or 8 in variable proportions as summarized in the table. next :

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Abstract

L'invention concerne un nouveau procédé de préparation de nanoparticules pour l'imagerie médicale comprenant un noyau métallique, une couche stabilisatrice organique et au moins un ligand de ciblage d'un tissu pathologique.

Description

NOUVEAU PROCEDE DE PREPARATION DE NANOPARTICULES RECOUVERTES D'UNE COUCHE STABILISATRICE ORGANIQUE COUPLEE
A DES LIGANDS DE CIBLAGE
L'invention concerne un nouveau procédé de préparation de nanoparticules pour l'imagerie médicale comprenant un noyau métallique, une couche stabilisatrice organique et au moins un ligand de ciblage d'un tissu pathologique.
On connaît des nanoparticules métalliques utilisées en imagerie de diagnostique, notamment en imagerie par résonance magnétique IRM, comportant un noyau métallique, recouvert d'une couche organique stabilisatrice couplée le cas échéant à des ligands de ciblage biologique.
Parmi ces nanoparticules, on connaît notamment des nanoparticules métalliques couramment désignées USPIO qui sont de très petites particules d'oxyde de fer, dont notamment de magnétite (Fe3O4), de maghémite (γ-Fe2O3) et autres composés minéraux magnétiques d'éléments de transition, de taille inférieure à environ 100-150 nm.
Pour obtenir des solutions colloïdales de particules magnétiques, stables en milieu physiologique, il est nécessaire de conditionner la surface des particules magnétiques. Pour cela on recouvre la particule d'une couche organique stabilisatrice constituée de macromolécules telles que des carbohydrates comme le dextran, ou de petites molécules organiques telles que des acides carboxyliques.
Afin d'obtenir des informations pertinentes pour le diagnostique par imagerie médicale, il est très avantageux de coupler ces dernières à un ligand de ciblage approprié, de manière à ce que les particules se lient à et/ou soient reconnues spécifiquement par des cellules ou tissus cibles. Cette reconnaissance est souvent assurée par la formation d'un complexe d'affinité entre un ligand d'affinité (ou biovecteur) fixé à la particule et un récepteur à la surface de cellules cibles, ou à l'aide de ligands intervenant sur la biodistribution du produit par exemple par un mécanisme de type phagocytose de la particule par des cellules du système immunitaire telles que les macrophages. Les ligands à affinité spécifique sont typiquement des peptides ou d'autres molécules organiques (sucres, ligands pharmacologiques...)- Des ligands intervenant sur la biodistribution sont par exemple des groupements hydrophiles tels que des groupements aminoalcool, ou des composés de type polyéthylène glycol.
Le document WO 97/01760 décrit des particules magnétiques recouvertes d'acide dimercaptosuccinique (ADMS), couplées à une entité de ciblage spécifique, l'annexine, via les fonctions thiols de l'ADMS. Les documents EP 888 545 et WO2004/034411 décrivent des particules de diamètres de l'ordre de 5 nm, recouvertes de groupes aliphatiques polyacides carboxyliques, ces groupes pouvant être liés à des substances pharmaceutiques actives (ligands de ciblage) notamment choisies parmi des protéines, des enzymes, des antibiotiques, des endotoxines, des substances thérapeutiques dans les domaines notamment cardiovasculaires, cancéreux. Les procédés de l'art antérieur comprennent schématiquement les étapes suivantes :
- préparation du noyau métallique des nanoparticules métalliques ;
- enrobage du noyau avec la couche stabilisatrice, par exemple polyacide carboxylique ; - couplage de la particule obtenue avec le ligand de ciblage.
Toutefois, ces procédés de préparation antérieurs rencontrent des difficultés pour obtenir un contrôle totalement satisfaisant de la quantité de ligand greffée et de l'affinité. Par exemple, dans le cas de peptides biocouplés par des méthodes usuelles (carbodiimido), les fonctions latérales lysine, glutamique, aspartique, peuvent réagir, tout comme les fonctions N et C terminales. Or, ce contrôle est important pour optimiser l'affinité de l'agent de contraste injecté pour la zone pathologique, pour moduler la pharmacocinétique, la biodistribution et éventuellement le métabolisme, l'excrétion et l'innocuité de ces particules. Ce contrôle est de plus très utile pour une production à l'échelle industrielle de tels composés et qui respecte les impératifs de sécurité clinique du produit injecté aux patients. Pour certaines couches stabilisatrices telles que le citrate, la nanoparticule avant couplage avec les ligands n'est pas suffisamment stable pour la fabrication industrielle, ou le taux de greffage des ligands n'est pas maîtrisé de manière totalement satisfaisante : on risque alors d'avoir un manque ou au contraire un excès de ligands greffés ou une trop forte hétérogénéité entre les particules du lot de produit fabriqué et le cas échéant de devoir procéder à des étapes de purification complexes ou inopérantes.
Pour certaines couches stabilisatrices, il n'est tout simplement pas possible d'après les essais réalisés par le demandeur avec les procédés décrits dans la littérature d'obtenir une particule suffisamment stable avant le couplage avec les ligands : c'est le cas en particulier des couches suivantes : phosphonates, phosphinates, hydroxamates.
Le demandeur a réussi à obtenir un nouveau procédé de synthèse de nanoparticules métalliques permettant de pallier les inconvénients de l'art antérieur pour plusieurs couches stabilisatrices, et désigné procédé par voie inverse. Dans ce procédé, on prépare des éléments constitués par un ou plusieurs ligands couplés chimiquement avec des groupements organiques de liaison (également désignés groupes stabilisateurs ou groupes d'attache), puis ces éléments [ensemble : groupement de liaison + ligand] sont couplés aux nanoparticules métalliques. Les groupements organiques de liaison appartiendront à ou formeront la couche stabilisatrice (également désignée couche d'attache).
Les nanoparticules métalliques sont de diamètre varié, notamment de l'ordre de 3 à 300 nm, avantageusement de 5 à 100 nm, et notamment de 5 à 50 nm. Le procédé s'applique efficacement à des ligands de nature chimique et de propriété pharmaceutique thérapeutique et/ou diagnostique très variées et avantageuses.
De plus, pour les couches stabilisatrices instables avec les procédés antérieurs, il permet d'obtenir des particules stables et pouvant être greffées par des ligands, ces particules étant donc des composés nouveaux.
Il n'était de plus pas du tout évident pour l'homme du métier que cette voie inverse conduise à des performances améliorées, illustrées dans les exemples détaillés. L'invention concerne ainsi, selon un premier aspect, un procédé de préparation de nanoparticules métalliques, pour l'imagerie médicale notamment, comprenant un noyau métallique N recouvert d'une couche stabilisatrice organique couplée à au moins un ligand de ciblage, ledit procédé comprenant les étapes de : a) préparation du noyau métallique N des nanoparticules métalliques ; b) préparation d'éléments de ciblage de formule S - C, dans laquelle :
S est un groupe d'attache choisi parmi les groupes suivants et leurs dérivés : acide polycarboxylique, acide hydroxy polycarboxylique, phosphonate, sulfonate, hydroxamate, silane, siloxane catécholate;
C est un ligand de ciblage ; c) puis greffage sur le noyau N des éléments de ciblage S-C.
Chaque groupement S comprend au moins une partie de liaison au noyau N, et au moins une fonction chimique X de couplage avec un ligand C, plus précisément de liaison covalente à une fonction réactive du ligand C.
Selon des réalisations, pour les couvertures permettant une couverture stable (citrate par exemple), on pourra partiellement recouvrir le noyau métallique N avec une couche de groupes stabilisateurs/d'attache S, avant d'y greffer des éléments de ciblage S-C lors de l'étape c). Les étapes a) et b) peuvent être réalisés dans n'importe quel ordre mais avant l'étape c).
Selon un mode de réalisation, le ligand est un groupe hydrophile à effet sur la biodistribution (répartition dans les tissus, captation macrophagique...), avantageusement un groupe aminoalcool ou polyéthylène glycol. Selon un mode de réalisation, le ligand est un ligand d'affinité (biovecteur), à affinité de liaison pour une cible surexprimée dans une cellule ou un tissu pathologique, notamment un récepteur cellulaire, une enzyme, et avantageusement choisi parmi un peptide linéaire ou cyclique, un pseudopeptide, un monosaccharide, un polysaccharide, une vitamine, un anticorps, un acide nucléique, une substance pharmacologiquement active. Selon un mode de réalisation, une partie des ligands sont des biovecteurs d'affinité, et une autre partie des ligands sont des ligands à effet sur la biodistribution. Ainsi à l'étape c), on recouvre le noyau, d'une part, d'éléments de ciblage avec ligands de ciblage à affinité spécifique et, d'autre part, de groupes stabilisateurs/d'attache liés à des ligands de stabilité/biodistribution. Selon des réalisations, on greffe sur le noyau, d'une part, des éléments de ciblage S-C et, d'autre part, des groupes de stabilisation S non porteurs de ligands. On aura par exemple 5% à 100% de groupes S-C et le complément (95 à 0%) de groupes S. Les tableaux de la description détaillée illustrent ces possibilités. Ces taux correspondent au taux de couverture (au niveau des sites de fixation possible, typiquement les sites protonés localisés à la surface de la nanoparticule) sur le noyau des éléments S ou S-C. Les pourcentages sont ainsi exprimés en nombre de molécules S-C ou S par nombre de sites de fixation disponibles sur le noyau. Ainsi, pour un taux de 100%, la surface du noyau sera sensiblement totalement recouverte par des éléments S-C et/ou S. Ce taux de couverture est ainsi distinct du taux de greffage décrit ci-après.
L'ensemble des groupements S greffés sur le noyau N constitue la couche d'attache (stabilisatrice). Le taux de greffage (pourcentage en mol de composé S-C et/ou S par mol de fer ; le taux de greffage est calculé à partir des méthodes de microanalyse connues) des éléments de ciblage S-C sur le noyau N est typiquement compris entre 0,5 et 5%, ou entre 1 et 10%, notamment entre 1 et 3%, par exemple 1 %, 2%, 3%, 5%, 10% pour une taille cristalline du noyau de l'ordre de 7-8 nm.
Les ligands peuvent donc être identiques ou différents entre les éléments de ciblage greffés. Selon des réalisations, les nanoparticules métalliques obtenues après greffage auront ainsi par exemple une partie des éléments de ciblage avec un ligand d'affinité (biovecteur peptide par exemple ; par exemple 0,1 à 50% : avantageusement de l'ordre de 0,1 , 0,5, 1 , 5, 10, 15, 20, 30, 50% des fonctions X des groupes S sont couplés à un biovecteur), et une autre partie (typiquement 10 à 99 % des éléments de ciblage) avec un ligand différent (autre biovecteur d'affinité ou ligand de biodistribution). On peut ainsi combiner plusieurs ligands d'affinité et/ou de biodistribution. Généralement, on réalise un taux de couplage approprié pour obtenir une taille hydrodynamique de la particule finale satisfaisante, tout en permettant d'assurer un ciblage spécifique efficace.
Selon des réalisations, l'acide polycarboxylique comprend au moins deux fonctions carboxyliques et est choisi parmi les acides suivants : acide citrique, acide tartarique (D, L), acide tartrique, acide glutarique, acide malique, acide cyclo- hexanetricarboxylique, acide cyclohexanehexacarboxylique, acide éthylène- diaminetétraacétique, acide diéthylènetriaminepentaacétique, acide 4-bromo- mandélique, l'acide cis,cis,cis,cis-1 ,2,3,4-cyclopentanetétracarboxylique, acide
DL-malique, acide dibenzoyle-D-tartarique, acide chélidonique, acide tétra- hydrofurane-1 ,3,4,5-tétracarboxylique, acide DL-isocitrique, acide mucique, acide oxalique, acide glucuronique.
Parmi les dérivés d'acide carboxylique, on peut utiliser des acides aliphatiques ou aromatiques, des composés substitués des acides polycarboxyliques, dont les groupes carboxyle sont inchangés, mais dont un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont remplacés par des groupes alkyle ou des atomes d'halogène.
Les groupes de liaison S, en particulier les acides carboxyliques, utilisés pour une liaison à des ligands de ciblage comprennent au moins une fonction de couplage au noyau et au moins une fonction de couplage avec un ligand. Avantageusement, l'acide polycarboxylique est un acide tricarboxylique, de préférence l'acide citrique qui comprend :
- une fonction CO2H permettant un couplage chimique à un biovecteur, par exemple par une fonction aminé du biovecteur en utilisant des techniques de biocouplage peptidique - une partie en interaction avec le noyau, comprenant deux fonctions CO2H.
Selon des réalisations, le groupement S est choisi parmi les groupes suivants, pour lesquels le greffage direct sur le noyau n'est pas réalisable de manière satisfaisante dans des conditions de greffage standard décrites dans la littérature : phosphonate, sulfonate, hydroxamate, siloxane, silane, catécholate.
Figure imgf000008_0001
R est par exemple un groupe X-L, où :
- X est une fonction capable d'assurer le couplage avec un biovecteur (tel que décrit plus loin) ;
- L est un lien chimique linker choisi parmi : une simple liaison, un groupe aliphatique (notamment un groupe alkyle tel que les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, tert-butyle, isobutyle, pentyle et hexyle) ; un groupe alicyclique, notamment cycloalkyle ; un groupe aromatique (groupement hydrocarboné mono- ou polycyclique aromatique comprenant préférentiellement de 5 à 20 atomes de carbone) ; aromatique-aliphatique, lesdits groupes aliphatiques, alicycliques et aromatiques pouvant être éventuellement substitués par un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy, acétoxy, amido, ou un atome de chlore, d'iode ou un groupe aliphatique ; alicyclique ; alicyclique-aliphatique ; brome ; un groupement -Li-NHCO-L2 où Li et L2 sont soit identiques, soit différents et représentent un groupe aliphatique ; alicyclique ; aromatique ; alicyclique-aliphatique ou aromatique-aliphatique, lesdits groupes pouvant être éventuellement substitués par un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy, acétoxy, amido ou un atome de chlore, d'iode ou de brome. R' est typiquement un groupe aliphatique ou H.
L'homme du métier comprend que l'interaction des groupes S du tableau précédent avec le noyau est localisée sensiblement au niveau des groupes porteurs des atomes d'oxygène.
Les silanes sont typiquement de formule (SinH2n+2), les siloxanes de formule [R2SiO]n (où R est tel que défini ci-dessus - par exemple [SiO(CH3)2]n.
Selon des réalisations, des groupements S sont rendus fluorescents, on couvre alors les nanoparticules avec d'une part des éléments S-C non fluorescents, et d'autre part des éléments S ou S-C rendus fluorescents (exemples détaillés plus loin), les nanoparticules étant d'intérêt en imagerie multimodale (IRM et imagerie optique proche infra rouge notamment) pour affiner le diagnostic.
Selon des réalisations, on utilise comme dans le document US 6,638,494 un second composé stabilisateur tel que cité dans le paragraphe [0040] de ce document.
Selon des réalisations, en plus des éléments de ciblage S-C, on greffe aussi des groupes ayant un effet sur la stabilité de la nanoparticule, par exemple des acides hydroxy mono carboxyliques, par exemple choisi parmi les suivants : acide gluconique, acide oxalique, acide mandélique, acide 4-hydroxy-3-méthoxy- mandélique, acide lactobionique, acide alpha-hydroxyhippurique, acide méthyl 2- hydroxybutyrique, acide glycolique, acide N-acétylneuraminique, acide phosphoénolpyruvique.
De manière très avantageuse, le procédé du demandeur permet de parfaitement contrôler le taux de greffage des nanoparticules en composés porteurs de ligands, ce qui est très utile pour le coût et le contrôle de l'efficacité physiologique du produit. La fabrication des éléments de ciblage S-C est par ailleurs totalement maîtrisée, en particulier leur pureté avant le greffage, ce qui est majeur pour la fabrication industrielle.
Le noyau métallique des nanoparticules préparées est typiquement composé en tout ou partie d'hydroxyde de fer ; d'oxyde de fer hydraté ; d'oxydes de fer mixtes tels que des oxydes de fer mixtes de cobalt, de nickel, de manganèse, de béryllium, de magnésium, de calcium, de baryum, de strontium, de cuivre, de zinc ou de platine ; ou d'un mélange de ceux-ci. Le terme "ferrite" désigne les oxydes de fer de formule générale [xFβ2θ3,y MOz], où M désigne un métal magnétisable sous l'effet d'un champ magnétique tel que Fe, Co, Ru, Mg, Mn, le métal magnétisable pouvant être éventuellement radioactif. De façon préférentielle, les particules magnétiques des compositions de l'invention comprennent une ferrite, notamment la maghémite (γFβ2θ3) et la magnétite (Fβ3θ4), ou encore les ferrites mixtes de cobalt (Fβ2CoO4) ou de manganèse (Fβ2MnO4). On pourra aussi utiliser pour le noyau des métaux non superparamagnétiques tels que des oxydes de lanthanides (gadolinium et europium notamment), des particules à luminescence retardée (PNAS, 2007, 29,104,22,9266 : particules de CaZnHgSiO dopé avec des lanthanides Eu3+, Dy3+, Mn2+), des composés mixtes à base des éléments choisis dans le groupe consistant en Ca, Mn, Mg, Si et O, lesdits composés mixtes étant dopés par des lanthanides, des particules de type quantum dot.
A titre de ligands d'affinité préférés, on citera les glycoprotéines, les lectines, la biotine, les vitamines, les dérivés ptéroïques ou aminoptéroïques, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les anticorps ou fragments d'anticorps, les peptides et leurs dérivés, les mono- ou polysaccharides, l'avidine, les inhibiteurs ou substrats de récepteurs (membranaires ou nucléaires), les phospholipides, les stéroïdes et leurs analogues, les oligonucléotides, les séquences d'acide ribonucléique, les séquences d'acide désoxyribonucléique, les hormones ou substances analogues aux hormones, les acides aminés, les molécules organiques à activité pharmacologique, les pharmacophores, les protéines éventuellement recombinantes ou mutées, les anticorps ou fragments d'anticorps, les aminoalcools, les dérivés de phospholipide, les saccharides ; les dérivés de l'acide folique et antifolique, les agents de ciblage d'intégrines ou de métalloprotéases étant particulièrement préférés. Selon des réalisations avantageuses, le ligand à affinité est choisi parmi la liste suivante (les documents et références entre parenthèses sont des exemples et non une liste limitative) :
1 ) Les biovecteurs ciblant des récepteurs VEGF et angiopoiétine (décrits dans WO 01/97850), les polymères tels que polyhystidine (US 6,372,194), les polypeptides ciblant la fibrine (WO 2001/9188), les peptides de ciblage d'intégrines (WO 01/77145, WO 02 26776 pour alphav beta3, WO 02/081497, par exemple RGDWXE), les pseudopeptides et peptides de ciblage de métalloprotéases MMP (WO 03/062198, WO 01/60416), les peptides ciblant par exemple le récepteur KDR/Flk-I dont R-X-K-X-H et R-X-K-X-H, ou les récepteurs Tie-1 et 2 (WO 99/40947 par exemple), les glycosides de sialyl Lewis (WO 02062810 et « Mϋller et al, Eur. J. Org. Chem, 2002,3966-3973), les antioxydants tels que l'acide ascorbique (WO 02/40060), les biovecteurs de ciblage de la tuftsine (par exemple US 6,524,554), de ciblage de récepteurs à protéine G GPCR en particulier la cholécystokinine (WO 02/094873), les associations entre antagoniste d'intégrine et mime de la guanidine (US 6 489 333), les quinolones ciblant alphav beta3 ou 5 (US 6,511 ,648), les benzodiazépines et analogues ciblant des intégrines (US A 2002/0106325, WO01/97861 ), les imidazoles et analogues (WO 01/98294), les peptides RGD (WO 01/10450), les anticorps ou fragments d'anticorps (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inductible par TNF ou IL (US 6,261 ,535), les molécule de ciblage modifiées par interaction avec la cible (US 5,707,605), les agents de ciblage de dépôts amyloïdes (WO 02/28441 par exemple), les peptides clivés cathepsines (WO 02/056670), les mitoxantrone ou quinone (US 6,410,695), les polypeptides ciblant des cellules épithéliales (US 6,391 ,280), les inhibiteurs de cystéines protéases (WO 99/54317), les biovecteurs décrits dans : US 6,491 ,893 (GCSF), US 2002/0128553, WO 02/054088, WO 02/32292, WO 02/38546, WO20036059, US 6,534,038, WO 0177102, EP 1 121 377, Pharmacological Reviews (52, u°2, 179 ; facteurs de croissance PDGF, EGF, FGF...), Topics in Current Chemistry (222, W.Krause, Springer), Bioorganic & Médicinal Chemistry (11 , 2003, 1319-1341 ; dérivés tétrahydrobenzazépinones ciblant alphav beta3). 2) Les inhibiteurs d'angiogenèse, notamment ceux testés en essais cliniques ou déjà commercialisés, notamment :
- les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des récepteurs FGFR ou VEGFR tels que SU101 , SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, des composés azacycles (WO 00244156, WO 02059110) ;
- les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des MMP tels que le BB25-16 (marimastat), le AG3340 (prinomastat), le solimastat, le BAY12-9566, le BMS275291 , le metastat, le neovastat ;
- les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des intégrines tels que le SM256, le SG545, des molécules d'adhésion bloquant le EC-ECM (tels que le EMD 121-
974, ou la vitaxine) ;
- des médicaments à mécanisme d'action antiangiogenèse plus indirect tels que le carboxiamidotriazole, le TNP470, la squalamine, le ZD0101 ;
- les inhibiteurs décrits dans le document WO 99/40947, les anticorps monoclonaux très sélectifs pour la liaison au récepteur KDR, les analogues de la somatostatine (WO 94/00489), les peptides de liaison à la sélectine (WO 94/05269), des facteurs de croissance (VEGF, EGF, PDGF, TNF, MCSF, interleukines); des biovecteurs de ciblage de VEGF décrits dans Nuclear Medicine Communications, 1999, 20 ; - les peptides inhibiteurs du document WO 02/066512.
3) Des biovecteurs capables de cibler des récepteurs : CD36, EPAS-1 , ARNT, NHE3, Tie-1 , 1/KDR, Flt-1 , Tek, neuropiline-1 , endogline, pléientropine, endosialine, AxI., aIPi, a2ssl, a4P1 , a5pl, eph B4 (éphrine), récepteur laminine A, récepteur neutrophiline 65, récepteur leptine OB-RP, récepteur chimiokine CXCR-4 (et autres récepteurs cités dans le document WO99/40947), LHRH, bombésine/GRP, récepteurs gastrine, VIP, CCK.
4) Des biovecteurs de type inhibiteurs de tyrosine kinase.
5) Les inhibiteurs du récepteur GPIIb/llla connus choisis parmi : (1 ) le fragment fab d'un anticorps monoclonal du récepteur GPIIb/llla, Abciximab, (2) les petites molécules peptidiques et peptidomimétiques injectées en intraveineuse telles que l'eptifibatide et le tirofiban.
6) Des peptides antagonistes de récepteurs au fibrinogène (EP 425 212), des peptides ligands de récepteurs llb/llla, des ligands du fibrinogène, des ligands de la thrombine, des peptides capables de cibler la plaque d'athérome, les plaquettes, la fibrine, des peptides à base d'hirudine, des dérivés à base de guanine ciblant le récepteur llb/llla.
7) D'autres biovecteurs ou fragments biologiquement actifs de biovecteurs connus de l'homme du métier comme médicaments, à action anti-thrombotique, anti agrégation plaquettaire, antiathérosclérotique, antiresténotique, anticoagulante.
8) D'autres biovecteurs ou fragments biologiquement actifs de biovecteurs ciblant αvβ3, décrits en association avec des DOTA dans le brevet US 6 537 520, choisis parmi les suivants : mitomycine, tretinoine, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicine, carboquone, pentostatine, nitracrine, zinostatine, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicine, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acétate, ketanserin, doxifluridine, etretinate, isotretinoine, streptozocine, nimustine, vindesine, flutamide, drogenil, butocin, carmofur, razoxane, sizofilan, carboplatine, mitolactol, tegafur, ifosfamide, prednimustine, picibanil, levamisole, teniposide, improsulfan, enocitabine, lisuride, oxymetholone, tamoxifen, progestérone, mepitiostane, epitiostanol, formestane, interferon-alpha, interferon-2 alpha, interferon-beta, interferon-gamma, colony stimulating factor-1 , colony stimulating factor-2, denileukin diftitox, interleukin-2, leutinizing hormone releasing factor.
9) certains biovecteurs ciblant des types particuliers de cancers, par exemple des peptides ciblant le récepteur ST associé au cancer colorectal, ou le récepteur tachykinine.
10) des biovecteurs utilisant des composés de type phosphines.
11 ) des biovecteurs de ciblage de P-sélectine, E-sélectine ; par exemple, le peptide de 8 acides aminés décrit par Morikawa et al, 1996, 951 , ainsi que différents sucres. 12) l'annexine V ou des biovecteurs ciblant les processus apoptotiques.
13) tout peptide obtenu par des technologies de ciblage telles que le phage display, modifié éventuellement par des acides aminés non naturels (http//chemlibrary.bri.nrc.ca), par exemple des peptides issus de banques phage display : RGD, NGR, CRRETAWAC, KGD, RGD-4C, XXXY*XXX, RPLPP, APPLPPR.
14) d'autres biovecteurs peptidiques connus de ciblage de plaques d'athérome, cités notamment dans le document WO 2003/014145. 15) des vitamines.
16) des ligands de récepteurs hormonaux dont les hormones et les stéroïdes.
17) des biovecteurs ciblant des récepteurs opioïdes.
18) des biovecteurs ciblant des récepteurs TKI. 19) des antagonistes LB4 et VnR.
20) des composés nitriimidazoles et benzylguanidines.
21 ) des biovecteurs rappelés dans Topics in Current Chemistry, vol.222, 260-274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals, notamment : - des biovecteurs de ciblage de récepteurs peptidiques surexprimés dans les tumeurs (récepteurs LHRH, bombésine/GRP, récepteurs VIP, récepteurs CCK, récepteurs tachykinine par exemple), notamment les analogues de somatostatine ou de bombésine, des peptides dérivés octréotide éventuellement glycosylés, les peptides VIP, les alpha-MSH, les peptides CCK-B
- des peptides choisis parmi : des peptides cycliques RGD, fibrine- chaîne alpha, CSVTCR, tuftsine, fMLF, YIGSR (récepteur : laminine).
22) des oligosaccharides, des polysaccharides et des dérivés d'osés, des dérivés ciblant les récepteurs Glut (récepteurs d'osés). 23) des biovecteurs utilisés pour des produits de type smart.
24) des marqueurs de la viabilité myocardique (tétrofosmine et hexakis2méthoxy-2méthylpropylisonitrile).
25) des traceurs du métabolisme des sucres et des graisses.
26) des ligands de récepteurs de neurotransmetteurs (récepteurs D, 5HT, Ach, GABA, NA).
27) des oligonucléotides.
28) le facteur tissulaire 29) des biovecteurs décrits dans WO 03/20701 , en particulier le PK11195 ligand du récepteur périphérique aux benzodiazépines.
30) des peptides liant la fibrine, notamment les séquences peptidiques décrites dans WO 03/11115.
31 ) des inhibiteurs d'agrégation de plaques amyloïdes décrits dans WO 02/085903.
32) des composés de ciblage de la maladie d'Alzheimer, en particulier les composés comprenant les squelettes de type benzothiazole, benzofuranes, styrylbenzoxazoles/thiazoles/imidazoles/quinoline, styrylpiridines.
Les ligands, dont notamment les anticorps et les pharmacophores, peuvent être éventuellement fonctionnalisés de manière à pouvoir réagir avec les fonctions de couplage X des groupes de liaison S, et former une liaison covalente de préférence de type -CONH-, -COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS-NH-, -C-S-, -N-NH- CO-, -CO- NH-N-, -CH2-NH-, -N-CH2-, -N-CS-N-, -CO-CH2-S-, -N-CO-CH2-S-, -N- CO-CH2-CH2-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-O-, -0-N=CH- ou répondant aux formules suivantes :
Figure imgf000015_0001
A titre de ligands à effet sur la biodistribution du produit de contraste, on utilise avantageusement des groupes hydrophiles, notamment des aminoalcools et les polyéthylèneglycol (encore dénommé PEG).
Par le terme « aminoalcool » selon la présente demande, on entend un ligand comprenant une fonction aminé porteuse d'au moins une chaîne hydrocarbonée aliphatique comportant de 2 à 10 atomes de carbones, ladite chaîne hydrocarbonée étant substituée par plusieurs groupements hydroxyles, notamment par 4 à 10 groupements hydroxyles.
Selon un mode de réalisation préféré, les ligands aminoalcools sont des composés de formule générale (II) :
/ R1
dans laquelle :
Ri et R2 sont identiques ou différents et représentent une chaîne hydrocarbonée aliphatique comportant de 2 à 6 atomes de carbone, substituée de préférence par 6 à 10 groupements hydroxyles, ou bien par 4 à 8 groupements hydroxyles dans le cas où Ri et/ou R2 est interrompu par un ou plusieurs atomes d'oxygène.
Comme exemple de ligand aminoalcool de formule (II), on peut citer notamment les ligands pour lesquels Ri et R2 représentent chacun indépendamment un groupe -(CH2)-(CHOH)4-CH2OH ou -(CH2)-CHOH-CH2OH, en particulier ceux pour lesquels Ri représente un groupe -(CH2)-(CHOH)4-CH2OH ou -(CH2)-CHOH-CH2OH et R2 un groupe -CH2- (CHOH)4-CH2OH.
Selon un autre mode de réalisation préféré, les ligands aminoalcools sont des composés de formule (IV)
Figure imgf000016_0001
dans laquelle :
Z est une liaison, CH2, CH2CONH ou (CH2)2NHCO,
Z est une liaison, O, S, NQ, CH2, CO, CONQ, NQCO, NQ-CONQ ou CONQCH2CONQ, Z" est une liaison, CONQ, NQCO ou CONQCH2CONQ p et q sont des nombres entiers dont la somme vaut O à 3 (avec selon une variante avantageuse p=q=O) Ri, R2, R3, R4 ou R5 représentent chacun indépendamment H, Br, Cl, I, CONQiQ2 Ou NQiCOQ2, avec Qi et Q2 identiques ou différents choisis parmi H, un groupe (Cr Cδ)alkyle mono- ou polyhydroxylé et/ou éventuellement interrompu par un ou des atomes d'oxygène, de telle sorte que Qi et Q2 comportent à eux deux de 4 à 10 groupes OH ; étant entendu qu'au moins l'un et au plus deux des groupes Ri à R5 représente CONQiQ2 ou NQiCOQ2 ;
ou bien Ri, R3, R5 représentent chacun indépendamment H, Br, Cl, ou I et
R2 et R4 représentent
Figure imgf000017_0001
dans laquelle
R'1, R'3 et R5, identiques ou différents, représentent H, Br, Cl ou I ; Qi et Q2 ont la même signification que précédemment ;
Z"' est un groupe choisi parmi CONQ, CONQCH2CONQ, CONQCH2, NQCONQ, CONQ(CH2)2NQCO ; et
Q est H ou (d-C4)alkyle, lesdits groupes alkyles pouvant être linéaires ou ramifiés et étant éventuellement hydroxylés.
De préférence, Z est CH2.
De préférence, p=q=O.
De préférence, Z" est CONH. De préférence, R2 et R4 représentent CONQiQ2.
De préférence, Ri, R3, R5 représentent Br.
De préférence, Qi et Q2 représentent chacun indépendamment un groupe - (CH2HCHOH)4-CH2OH OU -(CH2)-CHOH-CH2OH, en particulier un groupe -(CH2)- (CHOH)4-CH2OH. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le ligand aminoalcool de formule (IV) est le composé :
Figure imgf000018_0001
De préférence, les ligands aminoalcools selon l'invention sont couplés via leur fonction aminé -NH- ou -NH2 à la fonction X des groupes d'attache S de formule X-L-CH(PO3H2)2, de sorte que les fonctions hydroxyles restent libres, préservant ainsi leur caractère hydrophile.
Par « polyéthylèneglycol », au sens de la présente demande, on désigne de façon générale, des composés comprenant une chaîne -CH2-(CH2-O- CH2)k-CH2OR3 dans laquelle k varie de 2 à 100 (par exemple 2, 4, 6, 10, 50), et R3 est choisi parmi H, alkyle ou -(CO)AIk, le terme "alkyle" ou "alk" désignant un groupe aliphatique hydrocarboné, linéaire ou ramifié, ayant environ de 1 à 6 atomes de carbone dans la chaîne. Le terme « polyéthylèneglycol » tel qu'employé ici englobe notamment les composés aminopolyéthylèneglycols de formule (III) :
/ R1
HN
dans laquelle :
Ri et R2, identiques ou différents, représentent H, un groupe alkyle ou une chaîne polyéthylèneglycol de formule -CH2-(CH2-O-CH2) K-CH2OR3, étant entendu qu'au moins un des groupes Ri, R2 représente une chaîne polyéthylèneglycol, dans laquelle k varie de 2 à 100 (par exemple 2, 4, 6, 10, 50), et
R3 est choisi parmi H, alkyle ou -(CO)AIk, le terme "alkyle" ou "alk" désignant un groupe aliphatique hydrocarboné, linéaire ou ramifié, ayant environ de 1 à 6 atomes de carbone dans la chaîne. Des exemples d'aminopolyéthylèneglycols sont notamment les composés O- (2-aminoéthyl)-O'-méthylpolyéthylèneglycol 1100, O-(2-aminoéthyl)-O'-méthylpoly- éthylèneglycol 2000, O-(2-aminoéthyl)-O'-méthylpolyéthylèneglycol 750, les composés PEG 340, PEG 750, PEG 2000 par exemple. Selon des variantes dans lesquelles des biovecteurs différents sont couplés via les fonctions X à la surface de particules magnétiques, on peut coupler sur chaque particule magnétique deux biovecteurs différents ciblant une même pathologie (par exemple un peptide ciblant un premier type de récepteur surexprimé dans des cellules tumorales et un second type de récepteur surexprimé dans des cellules tumorales), ou des pathologies différentes. Un couplage mixte peut par exemple être utilisé avec des biovecteurs différents mais capables de cibler spécifiquement une même pathologie, tels que des peptides de séquences différentes capables de cibler différentes intégrines ou métalloprotéases surexprimées dans une zone pathologique cancéreuse ou cardiovasculaire. On pourra aussi réaliser un couplage de molécules fluorescentes, phosphorescentes, radioactives (pour imagerie, PET, SPECT), pour une imagerie multimodale.
Selon un mode particulier, on réalise un couplage "mixte" entre un ligand associé à une reconnaissance par des cellules du système immunitaire (par exemple des groupes hydrophiles améliorant la captation macrophagique, en particulier dans des zones inflammatoires ou neurodégénératives), et un ligand de nature différente, c'est à dire présentant soit une affinité spécifique pour une cible donnée, soit une activité pharmacologique et/ou cytotoxique, de manière à modifier la biodistribution du produit final.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre le greffage d'éléments S-C-T, où C est un ligand polyéthylèneglycol et T représente un groupe chromophore.
Par « chromophore », on entend un groupement coloré, c'est-à-dire capable d'absorber l'énergie de photons dans une gamme du spectre visible tandis que les autres longueurs d'onde sont transmises ou diffusées.
Comme exemple de chromophore utile selon l'invention, on peut citer notamment le chlorhydrate de 4-(amino)fluorescéine. On peut ainsi obtenir une grande variété de nanoparticules vectorisées (portant au moins un ligand). L'invention concerne ainsi également l'utilisation des nanoparticules pour la préparation d'une composition diagnostique ou thérapeutique. Les nanoparticules sont en particulier utilisées comme agent de contraste de type composition de nanoparticules telles que décrites en détail dans le document WO2004058275, pour l'imagerie IRM ou scanner RX.
Selon des réalisations, les particules sont véhiculées dans des systèmes de libération de principes actifs, tels que des systèmes d'encapsulation de type liposomes ou nanoparticules lipidiques solides qui peuvent également enfermer, en plus des nanoparticules utilisées comme agent de diagnostique, des principes actifs thérapeutiques.
Le demandeur a par ailleurs étudié ce procédé voie inverse pour des particules non métalliques ou métalliques comprenant un noyau et au moins une couche de monomères ou de polymères organiques porteuse de ligands de ciblage utiles sur le plan diagnostique ou thérapeutique.
Le demandeur a par ailleurs étudié ce procédé voie inverse pour des particules comprenant un noyau (typiquement métallique, mais pas nécessairement), sur lequel les éléments de ciblage comprennent un groupe de liaison (linker) relié au biovecteur (médicament par exemple), le groupe de liaison étant biodégradable de manière à pouvoir libérer le médicament in vivo.
L'invention est illustrée à l'aide des exemples détaillés suivants.
Dans ce qui suit, les abréviations M, M/L, M théorique, N et M/z, ES+, ES, kD et CCM ont les mêmes significations que dans le document WO 2004/058275 (US 2004/253181 ).
M ou M/L : concentration molaire (mole/litre).
M théorique : masse moléculaire théorique.
N : normalité.
M/z : masse sur charge déterminée par spectrométrie de masse. ES+ : électrospray mode positif.
ES" : électrospray mode négatif.
TFA : acide trifluoroacétique. kD : unité de masse moléculaire (kiloDalton). CCM : Chromatographie sur Couche Mince. Z ave : diamètre hydrodynamique mesuré par PCS. PoIy σ : polydispersité mesurée par PCS.
La nomenclature chimique qui suit est issue du logiciel ACD/NAME (société Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Canada), selon les règles IUPAC.
Dosage du fer total :
Le fer est dosé par spectroscopie d'absorption atomique (Spectrophotomètre VARIAN AA10) après minéralisation par HCI concentré et dilution par rapport à une gamme étalon d'ions ferrique (0, 5, 10, 15 et 20 ppm).
Taille des particules :
- Diamètre hydrodynamique de la particule greffée (Z ave) = Taille PCS : Déterminé par PCS (appareil Malvern 4700, laser 488 nm à 90°) sur un échantillon dilué à ~ 1 millimolaire avec de l'eau PPI filtrée sur 0.22 μm.
PCS = Photon Corrélation Spectroscopy = Technique par Diffusion de Lumière Dynamique - Référence : R. Pecora dans J. of Nano. Res. (2000), 2, p. 123-131. - Diamètre de la particule magnétique (p) (avant greffage) :
Déterminé par déconvolution des courbes d'aimantation (mesures effectuées sur un magnétomètre SQUID) à différentes températures (Référence : R.W. Chantrell dans IEEE Transactions on Magnetics (1978), 14(5), p. 975-977).
Analyses structurales :
Par spectroscopie de masse (appareil MICROMASS VG Quattro II) avec une source Electrospray.
Exemples 1 et 2 : préparation d'un USPIO avec couverture phosphonate + amino-alcool (ligand de biodistribution : branche P792) Exemple 1 : Etape 1 :
Figure imgf000022_0001
600 mg (1.8 10~3 M) d'acide dibenzylphosphopropionique sont solubilisés dans 20 ml d'eau et 20 ml de dioxane. 3 gr (2.1 10~3 M) de la branche P792 sont ajoutés à cette solution. Le pH est ajusté à 6.2 et 36 mg (2.3 10"3M) de HOBT sont mis en réaction pendant % d'heure. 450 mg (2.3 10"3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 24 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré à sec sous vide. Le produit obtenu est utilisé tel quel sans purification, avec un rendement quantitatif et un spectre de masse conforme.
Etape 2 :
Figure imgf000022_0002
500 mg (2.9 10"4 M) du produit issu de l'étape 1 sont mis en agitation dans 5 ml de TFA pendant 4 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré à sec avec de l'azote. Le résidu huileux est repris avec de NPA et de l'éther éthylique et est agité 24 heures. Le précipité obtenu est filtré sous vide. Le produit obtenu est utilisé tel quel sans purification, avec un rendement quantitatif et un spectre de masse conforme. Exemple 2 :
Figure imgf000023_0001
125 mg (8 10"5M) du produit issu de l'étape 2 de l'exemple 1 (mis en solution dans 1 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 1 ml de Fe2θ3 à 2 M/L dilué avec 100 ml d'eau. L'ensemble est agité % heure, le pH est ajusté à 7 avec QSP de NaOH 0.1 N. La solution est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 μs dans le filtrat. 20 ml de solution sont obtenus avec une concentration en Fer de 0.087M/L. Micro analyse : N = 90%, C = 84 %, Br = 93 %. Taux de greffage à partir des dosages de Phosphore = 2.4 % (pourcentage en mol de composé de l'exemple 1 -étape 2, par mol de fer). Taille PCS = 25.9 nm. Polydispersité = 0.23.
Exemple 3 : produit à couverture sulfonate, non stable par le procédé de l'art antérieur (voie directe)
Etape 1 :
Figure imgf000023_0002
Le protocole décrit dans Takahashi Doi et coll., J. Org. Chem 1985, vol. 50, p. 5716-5719 est utilisé.
Une solution de 14 ml d'acide acétique et 14 ml de H2O2 à 25 % est chauffée à 50"C. 2 g (1.88 10 "2 M) d'acide mercaptopropanoique sont introduits lentement en maintenant une température de 50"C. L'agitation est maintenue 1 heure à 50"C et une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est concentré à sec sous vide. Le produit obtenu est utilisé tel quel sans purification (Spectre de masse ES" conforme). Etape 2 :
Figure imgf000024_0001
30 mg (1.95 10"4M) du produit issu de l'étape 1 de l'exemple 3 (mis en solution dans 1 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 1 ml de Fe2O3 à 2M/L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée % H à température ambiante et Y2 H à
90"C. Le pH est ajusté à 7 avec QSP de NaOH 0.1 N. L a solution obtenue n'est pas stable à ce pH.
Exemples 4 et 5 : produit à couverture sulfonate avec biovecteur aminoalcool (ligand de biodistribution : branche désignée AAG1AA28Br), par le procédé de l'invention par voie inverse
Exemple 4 :
Figure imgf000024_0002
200 mg (1.3 10"3M) de l'étape 1 de l'exemple 3 sont solubilisés dans 10 ml d'eau. 1.46 gr (1.3 10"3M) de AAGiAA28Br sont introduits dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec QSP de NaOH 0.1 N. 250 mg (1.3 10"3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 heures. 250 mg (1.3 10"3M) sont à nouveau ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est en partie concentré sous vide et le concentrât est versé dans 200 ml d' IPA, agité 2 heures, filtré et séché sous vide. Le précipité est élue sur une colonne de 50 ml de résine Amberlite H+ 252 Na. La solution est concentrée à sec sous vide. Le résidu est mis en agitation dans de NPA 2 heures puis est filtré et séché. Le spectre de masse est conforme.
Exemple 5
Figure imgf000025_0001
72 mg (5.67 10"5M) du produit issu de l'étape 1 de l'exemple 4 (mis en solution dans 1 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 1 ml de Fe2Os E 1.92 M/L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée Vz heure à 90"C. Le pH est ajusté à 11 avec QSP de NaOH 1 N puis à 7.2 avec QSP d'HCI 0.1 N. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 μs dans le filtrat. Taille PCS : 30 nm. La fixation au noyau Fe2O3 se fait au niveau des groupements SO3H.
Exemples 6 et 7 : produit à couverture citrate avec biovecteur aminoalcool, par le procédé de l'invention par voie inverse
Exemple 6
Figure imgf000026_0001
3.2 g (1.67 10"2M) d'acide citrique sont solubilisés dans 240 ml d'eau. 19.2 g (1.7 10"2M) de AAGiAA2S sont introduits dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec QSP de NaOH 5 N. 4 g (2 10"2M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 Heures. 4 g (2 10"2M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est en partie concentré sous vide. La solution est éluée sur une colonne de 200 ml de résine Amberlite H+ 252 Na. La solution est concentrée à sec sous vide. Le résidu est mis en agitation dans de l'éthanol 24 heures puis est filtré et séché.
Exemple 7
Figure imgf000026_0002
500 mg (3.84 10"4M) du produit issu de l'exemple 6 (mis en solution dans 2 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 14 ml de Fe2Os à 1.336 M/L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée % H à TA et Vz H à 900C. Le pH est ajusté à 7.2 avec QSP de NaOH 0.1 N. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 μs dans le filtrat. Volume final = 60 ml. [Fe] = 0.312 M/L. PCS (dans une formulation citrate) = 30.6 nm. Polydispersité = 0.263. Taux de AAGiAA28/Fe = 1.14 %. Exemples 8 et 9 : produit à couverture citrate avec biovecteur glucosamine, par le procédé de l'invention par voie inverse
Exemple 8
Figure imgf000027_0001
400 mg (2.08 10"3M) d'acide citrique, sont solubilisés dans 30 ml d'eau. 539 mg (2.5 10"3M) de (D) glucosamine chlorhydrate sont introduits dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec QSP de NaOH 1 N. 500 mg (2.6 10"3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 Heures. 500 mg (2.6 10"3M) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est en partie concentré sous vide. Le résidu est mis en agitation dans de I' IPA 24 heures puis est filtré et séché. Le rendement est quantitatif, le spectre de masse conforme. Le produit obtenu est utilisable tel quel sans purification.
Exemple 9
Figure imgf000027_0002
70 mg (2 10"4M) du produit issu de exemple 8 (mis en solution dans 5 ml d'eau) sont ajoutés à une solution de 2 ml de Fe2O3 à 1.92 M/L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée Y2 H à 90"C. Le pH est ajusté à 7.2 avec QSP de NaOH 1 N. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 μs dans le filtrat. Le volume final est de 25 ml. La taille PCS du composé formulé citrate (formulation citrate = 2.9 g de citrate de sodium pour 100 ml de solution) est de 36.7 nm, avec une polydispersité de 0.3. La taille PCS du composé non formulé citrate est de 32.7 nm avec une polydispersité de 0.256. Le taux de citrate-Glucamine /Fe est de 3.20 %.
Exemple 10 : produit à couverture citrate avec couverture mixte (biovecteur peptidique (ligand d'affinité), et ligand de biodistribution AAG1AA28), par le procédé de l'invention par voie inverse
Figure imgf000028_0001
16.5 mg (2 10"5M) du peptide (molécule ciblant l'intégrine αvβ3), mis en solution dans 1 ml d'eau, sont ajoutés à une solution de 2 ml de Fβ2θ3 à 1.92 M/L dans 100 ml d'eau. La solution est agitée % heure. 261 mg (2 10"4M) du composé de l'exemple 6 (mis en solution dans 2 ml d'eau) sont ajoutés au milieu réactionnel. La solution est agitée Vz H à 90"C. Le pH est ajusté à 7.2 avec QSP de NaOH 1 N à température ambiante. La solution obtenue est ultrafiltrée sur 30 KD jusqu'à une conductivité de 30 μs dans le filtrat. Volume final = 25 ml. PCS (non formulé citrate) = 36.7 nm - Polydispersité = 0.242. PCS (formulé citrate) = 32.7 nm. Polydispersité = 0.22.
Exemple 11 : préparation de composés désignés pinces fluorescentes
(groupements citrate porteurs de groupements fluorescents).
Liste des colorants fluorescents engagés dans la réaction de couplage avec l'acide citrique.
Figure imgf000029_0001
400 mg (2.08 mmol) d'acide citrique, sont dissous dans 30 ml d'eau et 2,5 mmol de colorant sont introduites dans cette solution et le pH est ajusté à 6.2 avec NaOH 1 N. 500 mg (2.6 mmol) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 8 Heures. 500 mg (2.6 mmol) de EDCI sont ajoutés et l'ensemble est agité 16 heures. Le milieu réactionnel est concentré sous vide. Le résidu est précipité dans l'éther puis filtré et séché. Le produit est ensuite purifié par chromatographie flash sur cartouche de silice C18.
Figure imgf000030_0001
Exemple 12 : synthèse des nanoparticules d'oxyde de fer fluorescentes ayant une couverture citrate porteuse, d'une part, de ligands hydrophiles (aminoalcool) et, d'autre part, de groupements fluorescents.
Selon le mode opératoire de l'exemple 9, en utilisant un mélange des pinces (groupements de liaison porteurs des ligands) des exemples 6 et 8, avec les pinces fluorescentes 5, 6, 7 ou 8 dans des proportions variables tel que résumé dans le tableau suivant :
Figure imgf000031_0001
Exemple 13 : synthèse des pinces vectorisées (groupements de liaison porteurs des ligands biovecteurs).
Figure imgf000032_0001
Les biovecteurs sont couplés avec l'acide citrique selon le mode opératoire décrit à l'exemple 1. Les proportions du cosolvant sont ajustées en fonction de la solubilité des produits mis en œuvre.
Exemple 14 : synthèse des nanoparticules d'oxyde de fer vectorisées
Selon le mode opératoire de l'exemple 9 en utilisant un mélange des pinces des exemples 6 et 8 avec les pinces biovecteur n^i ou 22 dans des proportions variables tel que résumé dans le tableau suivant :
Figure imgf000033_0001
Exemple 15 : synthèse des nanoparticules d'oxyde de fer vectorisées et fluorescentes
Selon le mode opératoire de l'exemple 9, en utilisant un mélange des pinces des exemples 6 et 8, avec les pinces biovecteur 21 ou 22 et des pinces fluorescentes 5,6,7 ou 8 dans des proportions variables tel que résumé dans le tableau suivant :
Figure imgf000033_0002

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de nanoparticules métalliques comprenant un noyau métallique N recouvert d'une couche stabilisatrice organique couplée à au moins un ligand de ciblage, comprenant les étapes de : a) préparation du noyau métallique N des nanoparticules métalliques ; b) préparation d'éléments de ciblage de formule : S - C dans laquelle :
- S est un groupe organique de liaison choisi parmi les groupes : acide polycarboxylique, phosphonate, sulfonate, hydroxamate, silane, siloxane, catécholate ;
- C est un ligand de ciblage ; c) greffage sur le noyau N des éléments de ciblage S-C.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le noyau métallique est choisi parmi les suivants : hydroxyde de fer, oxyde de fer hydraté, ferrite, oxyde de fer mixte, oxyde de lanthanides, composé mixte à base des éléments choisis dans le groupe consistant en Ca, Mn, Mg, Si et O, ledit composé mixte étant dopé par des lanthanides.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que S est un groupe acide polycarboxylique, avantageusement di ou tricarboxylique.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que S est un groupe phosphonate, sulfonate, hydroxamate, siloxane, catécholate.
5. Procédé selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est un groupe hydrophile à effet sur la biodistribution ou la captation macrophagique, avantageusement un groupe aminoalcool ou polyéthylène glycol.
6. Procédé selon la revendication 1 à 5, caractérisé en ce que le ligand est un ligand d'affinité, à affinité de liaison pour une cible surexprimée dans une cellule ou un tissu pathologique, notamment un récepteur cellulaire, une enzyme, et avantageusement choisi parmi : un peptide linéaire ou cyclique, un pseudopeptide, un monosaccharide, un polysaccharide, une vitamine, un anticorps, un acide nucléique, une substance pharmacologiquement active.
7. Procédé selon la revendication 1 à 6, caractérisé en ce qu'une partie des ligands sont des biovecteurs d'affinité, et une autre partie des ligands sont des ligands à effet sur la biodistribution.
8. Procédé selon la revendication 1 à 7, caractérisé en ce que l'on greffe sur le noyau, d'une part, des éléments de ciblage S-C et, d'autre part, des groupes de stabilisation S non porteurs de ligands.
9. Procédé selon la revendication 1 à 8, caractérisé en ce que le taux de greffage des éléments de ciblage sur le noyau est de 1 à 10%, avantageusement 1 , 2, 3, 5, 10 %.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant en outre le greffage d'éléments S-C-T, où C est un ligand polyéthylèneglycol et T représente un groupe chromophore.
11. Nanoparticule comprenant un noyau métallique recouverte d'une couche stabilisatrice de type phosphonate, sulfonate, hydroxamate, catécolate, sur laquelle sont greffés des ligands de ciblage, susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 1 ou 2.
12. Utilisation d'une particule selon la revendication 11 pour la préparation d'une composition de diagnostic pour imagerie médicale.
13. Nanoparticule selon la revendication 11 pour son utilisation à titre d'agent diagnostic en imagerie médicale.
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