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EP2760480A1 - Nanoemulsions et leur utilisation comme agents de contraste - Google Patents

Nanoemulsions et leur utilisation comme agents de contraste

Info

Publication number
EP2760480A1
EP2760480A1 EP12759749.0A EP12759749A EP2760480A1 EP 2760480 A1 EP2760480 A1 EP 2760480A1 EP 12759749 A EP12759749 A EP 12759749A EP 2760480 A1 EP2760480 A1 EP 2760480A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amphiphilic
fluorinated
compounds
mol
surfactant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP12759749.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marc Port
Caroline ROBIC
Jean-Michel FABICKI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guerbet SA
Original Assignee
Guerbet SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guerbet SA filed Critical Guerbet SA
Publication of EP2760480A1 publication Critical patent/EP2760480A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1806—Suspensions, emulsions, colloids, dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/126—Linear polymers, e.g. dextran, inulin, PEG
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins

Definitions

  • the present invention relates to new optimized nanoemulsion-type systems and their use as contrast agents, especially in MRI.
  • the emulsions used are in the form of vesicles prepared using lipid components (oil in particular) and surfactants (also called surfactants) serving as interface between the aqueous phase and the lipid core of the nanoparticle.
  • surfactants also called surfactants
  • the oil-in-water lipid emulsions incorporate a lipophilic oily phase, forming lipid droplets in aqueous solution.
  • a first category of emulsions described in particular in WO03 / 062198 or US 6,676,963 is that of fluorinated nanoemulsions comprising, integrated within the lipid vesicles, fluorinated compounds comprising fluorine atoms F19 used for magnetic resonance imaging.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • fluorine has the particular interest compared to the MRI of the proton to be virtually absent in biological systems in the free state which allows it to be recognized as an excellent quantitative probe in the fluorine F19 form.
  • the lipid core is formed of a fluorinated oil, and surrounded by a lipid layer formed by a surfactant (lecithin for example).
  • fluorinated emulsions may furthermore comprise a very large number of paramagnetic metal complexes, in particular lanthanides, to associate the MRI of fluorine 19F and proton H.
  • fluorine emulsions for MRI incorporating chelates capable of complexing are known.
  • lanthanides especially gadolinium.
  • the chelates used are in particular derivatives of DTPA, DOTA, D03A, HPD03A and other chelates widely described in the prior art.
  • These hydrophilic chelates are rendered lipophilic by grafting them with a lipophilic zone such as a phospholipid, which makes it possible to integrate them into the lipid membrane that forms the lipid surfactant of the composition.
  • the hydrophilic part (the hydrophilic part which represents the chelate to which a lipophilic group is attached so as to take the amphiphilic chelate) is located on the outer surface of the nanodroplets, in contact with the aqueous phase of the nanodroplet solution.
  • targeting molecules or targeting ligands, for example peptide having an affinity for the receptor
  • WO03 / 062198 particularly describes the use of peptidomimetic compounds to target integrins overexpressed in tumor areas.
  • targeting ligands for incorporation into the lipid membrane, targeting ligands (often hydrophilic) are rendered amphiphilic by associating them with lipophilic chains.
  • amphiphilic targeting ligands are often less good surfactants than the surfactants used to stabilize the interface.
  • the surface of the droplets is occupied mainly by the layer of surfactant amphiphilic lipids and the targeting ligands have difficulty integrating within this layer.
  • nanoemulsions for medical imaging exist, in particular nanoemulsions for fluorescence imaging, not comprising fluorinated compounds, and using nanocrystals of metal oxides.
  • WO2010 / 018222 discloses such nanoemulsions comprising: an aqueous solution
  • lipid nanodroplets in the aqueous solution, the nanodroplets incorporating nanocrystals of metal oxides having luminescence properties for fluorescence imaging
  • a surfactant phospholipids for example
  • co-surfactants for stabilizing nanodroplets.
  • Fluorescence imaging is, however, not well suited for several major diagnostic indications, in particular certain imaging of vascular and / or tumor territories.
  • fluorophylic dispersing agents referred to as fluorophile di- or triblock compounds
  • the invention relates, according to a first aspect, to an oil-in-water nanoemulsion composition, comprising:
  • a fluorinated phase comprising at least one fluorinated oil
  • the surfactant comprising:
  • At least one amphiphilic targeting ligand at least one amphiphilic targeting ligand
  • nanoemulsion means that the size of the droplets is between 1 and 1000 nm.
  • the size of the droplets is typically 50 to 400 nm, advantageously 100 to 350 nm, in particular 150 to 300 nm, in particular 200 to 250 nm.
  • Surfactant is typically 50 to 400 nm, advantageously 100 to 350 nm, in particular 150 to 300 nm, in particular 200 to 250 nm.
  • the nanoemulsion comprises a surfactant. It is clear to those skilled in the art that it is a surfactant forming a layer between the oily phase and the aqueous phase, and also referred to as "total surfactants" in the application. As detailed below, the surfactant (total surfactants) comprises, on the one hand, non-fluorinated amphiphilic compounds and, on the other hand, fluorinated amphiphilic compounds, in particular the di- or tri-block fluorophile compound.
  • the surfactant at the fluorinated oil / aqueous phase interface corresponds to all of the surfactants used, that is to say as explained in detail in the application: amphiphilic lipids, di-fluorophilic compounds or triblocks, amphiphilic targeting ligands, and optionally also amphiphilic paramagnetic metal chelates present or not according to the embodiments, and optionally other compounds such as pegylated lipids (lipids coupled to PEG). Because of their amphiphilic structure, the amphiphilic targeting ligands act as a surfactant, it being specified that their amount is generally small relative to the other amphiphilic compounds used.
  • total surfactant is meant the set of surfactants in the composition. ⁇ Fluorophile compound di- or tri-block
  • the fluorophile di- or tri-block is preferably written in the form F n H m described in detail below.
  • fluorophile di- or triblock compounds are known in particular from US 5,733,526, but they are used there to stabilize lipid systems of a certain type (micelles or oily droplets) incorporated in a non-aqueous system of another type (Fluorinated oil), and not as is the case in the present invention, for stabilizing lipid systems in an aqueous phase. More specifically, document US Pat. No. 5,733,526 describes in particular in its examples:
  • micelles with targeting ligands the micelles not delimiting an aqueous internal compartment
  • PFOB fluorinated oil
  • PFOB fluorinated oil
  • the diblock fluorophilic compounds are at the interface of a fluorinated oil and a non-fluorinated oil (hydrocarbon-based oil), while in the present application the diblock fluorophile compounds are located at the interface between the fluorinated oil and the aqueous phase.
  • the nanoemulsion according to the invention is free of hydrocarbon oil.
  • RF is a fluorinated or perfluorinated group (which may or may not include side chains and / or rings and / or heteroatoms, especially halogens)
  • Z is H or a group more polar or polarizable than the groups RH (for example an alcohol, a halogen, a group -O-R ' H where R' H is
  • the diblock fluorophile compound is of formula RFLRH, in which RF is a fluorinated alkyl of 2 to 12 carbon atoms, RH is a linear, branched, or cyclic, saturated or unsaturated hydrocarbon group of 2 to 16 carbon atoms. carbon, and L is a linking group comprising for example a single carbon-carbon bond or an oxygen atom or any other appropriate group, especially those mentioned above.
  • the di or triblock fluorophile compound is chosen from the following, where n, m and p are integers:
  • a halogen in particular an iodine
  • the fluorophilic diblock compound F4H8I has the formula CF 3 - (CF 2 ) 2 - CF 2 -CH 2 -CHI-CH 2 - (CH 2 ) 4 -CH 3
  • the fluorophilic diblock compound F4H14I has the formula CF 3 - (CF 2) 2 - CF 2 -CH 2 -CHI-CH 2 - (CH 2 ) 10 -CH 3.
  • the fluorophilic diblock compounds Cn F 2n + 1C m H 2m + 1 are particularly advantageous for the present invention.
  • hydrocarbon group and / or the fluorinated group of the fluorophile compound di- or triblock can also:
  • phosphorus eg (perfluoroalkyl) alkylene mono- or dimorpholinophosphate and fluorinated phospholipids
  • Diblock (perfluoroalkyl) alkylene phosphate RF I -OP (O) [N (CH 2 CH 2 ) 2 O] 2 or [RF R 1 O] 2 P (O) [N (CH 2 CH 2 ) 2 O], where RF is CF 3 (CF 2 ) t , with t an integer between 1 and 1 1, and R 1 is a saturated or unsaturated hydrocarbon chain, linear or branched, and RF and R 1 may comprise at least one atom O and / or S.
  • the amphiphilic lipids comprise a hydrophilic part and a lipophilic part. They are generally chosen from compounds whose lipophilic part comprises a saturated or unsaturated, linear or branched chain having from 8 to 30 carbon atoms. They may be chosen from phospholipids, cholesterols, lysolipids, sphingomyelins, tocopherols, glucolipids, stearylamines, cardiolipins of natural or synthetic origin; molecules composed of a fatty acid coupled to a hydrophilic group by an ether or ester function such as sorbitan esters such as, for example, sorbitan monooleate and monolaurate; polymerized lipids; sugar esters such as mono- and di-laurate, mono- and di-palmitate, mono- and distearate sucrose; said amphiphilic lipids may be used alone or in mixtures.
  • the amphiphilic lipid is a phospholipid, preferably chosen from: phosphatidylcholine dioleoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, phosphatidylserine, phosphatidylinositol.
  • Egg yolk phosphatidylcholine is a preferred amphiphilic lipid.
  • amphiphilic lipid may have a reactive function, such as a maleimide, thiol, amine, ester, oxyamine or aldehyde or alkyne or azide group.
  • a reactive function such as a maleimide, thiol, amine, ester, oxyamine or aldehyde or alkyne or azide group.
  • the surfactant may comprise pegylated lipids, that is to say carriers of polyethylene oxide groups.
  • PEG polyethylene glycol / phosphatidyl ethanolamine
  • polyethylene glycol PEG generally denotes compounds comprising a chain -CH 2 - (CH 2 -O-CH 2 ) k -CH 2 OR 3 in which k is an integer ranging from 2 to 100 (for example 2, 4, 6, 10, 50), and R 3 is chosen from H, alkyl or - (CO) Alk, the term “alkyl” or “alk” denoting an aliphatic hydrocarbon group, linear or branched, having about 1 to 6 carbon atoms in the chain.
  • polyethylene glycol as used herein includes especially aminopolyethylene glycol compounds.
  • PEGs 350, 750, 2000, 3000, 5000, modified by the addition of lipophilic groups to be inserted into the surfactant layer of the nanodroplet, are used, in particular:
  • pegylated lipid will be used:
  • fluorochrome amphiphilic compounds to combine F19 MRI and optical flurorescence imaging, such as DSPE-rhodamine.
  • optical flurorescence imaging such as DSPE-rhodamine.
  • the applicant's nanoemulsions are vectorized using at least one amphiphilic targeting ligand, a part of biological recognition located at the outer surface of the nanodroplets, capable of recognizing the biological target whose expression is modified in a pathological zone (tumor for example), compared to the healthy zone.
  • the nanoemulsion comprises at least one targeting ligand of a pathological zone anchored to the nanodroplet, typically using a targeting ligand anchoring group.
  • the number of nanodroplet targeting ligands is at least 1000 and typically of the order of 1000, 2000, 5000, 10,000.
  • the nanoemulsions obtained have the important advantage of having increased stability and affinity.
  • the applicant explains this advantageous technical effect by increasing the incorporation of the targeting ligands in the interface formed by the surfactants, between the fluorinated oil and the aqueous phase.
  • the fluorophile compounds di- or triblock prove to have the property of co-surfactant, locating in the fluorinated oil / aqueous phase of the droplets interface.
  • the fluorinated chain of the di- or tri-block fluorophile compounds is oriented towards the fluorinated core (PFOB oil, for example) of the droplet, and the alkylated chain of the di- or tri-block fluorophilic compounds is positioned on the side of the lipid chains of the amphiphilic lipids.
  • the alkyl chain of the di- or tri-blocks is chosen to have a strong interaction with the lipid chains of the amphiphilic lipids, advantageously using chains of lengths that are close to or identical, for example C12, C14 or C16.
  • Amphiphilic targeting ligands include a targeting ligand and a lipophilic group, all having an amphiphilic character.
  • the targeting ligands (targeting ligand portion of the amphiphilic targeting ligand) for targeting the target in a biological medium are grafted with chemical groups on a lipophilic portion allowing anchoring of the targeting ligand in the surfactant layer. . This allows the targeting ligands to be essentially on the outer surface side of the nanodroplets.
  • the targeting ligand of the amphiphilic targeting ligand (namely the part of biological recognition of the amphiphilic targeting ligand, located on the outer surface of the nanodroplets) is chosen from: the pharmacophores, the peptides (advantageously less than 20 amino acids, more preferably 5 to 10 amino acids), pseudopeptides, peptidomimetics, amino acids, targeting agents of integrins (peptides and pseudopeptides, peptidomimetics in particular), glycoproteins, lectins, biotin, pteroic derivatives or aminopteroids , folic acid and antifolate derivatives, antibodies or antibody fragments, avidin, steroids, oligonucleotides, ribonucleic acid sequences, deoxyribonucleic acid sequences, hormones, possibly recombinant proteins or mutated, mono- or polysaccharides, benzothiazole backbone compounds, benzofuran, styrylene nzoxazole
  • Peptides, folic acid and antifolate derivatives, targeting agents of integrins (peptides and pseudopeptides, peptidomimetics in particular), targeting agents of cellular or enzymes (especially targeting of kinases, especially tyrosine kinase, metalloproteases, caspases %) are particularly preferred.
  • pharmacophore molecules known for their ability to have a pharmacological effect, in particular by their ability to target at least one biological target (cellular receptor for example).
  • the targeting ligand of the amphiphilic targeting ligand is chosen from the following list (the documents and references in parentheses are examples and not a limiting list):
  • Targeting ligands targeting VEGF and angiopoietin receptors (described in WO 01/97850), polymers such as polyhystidine (US 6,372,194), fibrin targeting polypeptides (WO 2001/9188), integrin targeting peptides (WO 01/77145, WO 02 26776 for alphav beta3, WO 02/081497, for example RGDWXE), the pseudopeptides and targeting peptides of MMP metalloproteases (WO 03/062198, WO 01/60416), the peptides targeting, for example, the KDR / Flk-I receptor including RXKXH and R-XKXH, or Tie-1 and 2 receptors (WO 99/40947 for example), Lewis sialyl glycosides (WO 02062810 and Muller et al, Eur J.
  • polymers such as polyhystidine (US 6,372,194), fibrin targeting polypeptides (WO 2001/9188), integr
  • antioxidants such as ascorbic acid (WO 02/40060), tuftsin targeting ligands (e.g. US 6,524,554), GPCR protein G receptor targeting particularly cholecystokinin (WO 02/094873), associations between integrin antagonist and guanidine mime (US 6,489,333), quinolones targeted nt alphav beta3 or 5 (US 6,51 1, 648), benzodiazepines and analogs targeting integrins (US A 2002/0106325, WO01 / 97861), imidazoles and the like (WO 01/98294), RGD peptides (WO 01/10450), antibodies or antibody fragments (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inducible by TNF or IL (US Pat.
  • antioxidants such as ascorbic acid (WO 02/40060), tuftsin targeting ligands (e.g. US 6,524,554), GPCR protein G receptor targeting particularly cholecy
  • Angiogenesis inhibitors including those tested in clinical trials or already marketed, including: inhibitors of angiogenesis involving FGFR or VEGFR receptors such as SU101, SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, azacycle compounds (WO 00244156, WO 020591 10);
  • inhibitors of angiogenesis involving MMPs such as BB25-16 (marimastat), AG3340 (prinomastat), solimastat, BAY12-9566, BMS275291, metastat, neovastat;
  • angiogenesis inhibitors involving integrins such as SM256, SG545, adhesion molecules blocking EC-ECM (such as EMD 121 -974, or vitaxine);
  • drugs with a more indirect antiangiogenesis mechanism of action such as carboxiamidotriazole, TNP470, squalamine, ZD0101;
  • Targeting ligands capable of targeting receptors CD36, EPAS-1, ARNT, NHE3, Tie-1, 1 / KDR, Flt-1, Tek, neuropilin-1, endoglin, pleientropin, endosialin, Axl. , a2ssl, a4P1, a5pl, eph B4 (ephrin), laminin A receptor, neutrophilin 65 receptor, leptin OB-RP receptor, chemokine receptor CXCR-4 (and other receptors cited in WO99 / 40947), LHRH, bombesin / GRP , gastrin receptors, VIP, CCK.
  • GPIIb / IIIa receptor inhibitors selected from: (1) the Fab fragment of a GPIIb / IIIa receptor monoclonal antibody, Abciximab, (2) intravenous small peptidic and peptidomimetic molecules injected such as eptifibatide and tirofiban.
  • fibrinogen receptor antagonist peptides EP 425 212
  • 11b / 111a receptor ligand peptides fibrinogen ligands
  • thrombin ligands peptides capable of targeting atheroma plaque, platelets, fibrin, hirudin-based peptides, guanine derivatives targeting the llb / IIIa receptor.
  • targeting ligands or biologically active fragments of targeting ligands known to those skilled in the art as drugs, anti-thrombotic action, anti platelet aggregation, anti-atherosclerotic, antirestenotic, anticoagulant.
  • 6,537,520 selected from the following: mitomycin, tretinoin, ribomustine, gemcitabine, vincristine, andoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicin, carboquone, pentostatin, nitracrin, zinostatin, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicin, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acetate, ketanserin, doxifluridine, andretinate, isotretinoin, streptozocin, nimustine, vindesin, flutamide, d
  • certain targeting ligands targeting particular types of cancers for example, ST receptors for colorectal cancer, or the tachykinin receptor.
  • P-selectin targeting ligands for example, the 8 amino acid peptide described by Morikawa et al, 1996, 951, as well as various sugars.
  • any peptide obtained by targeting technologies such as phage display, optionally modified by non-natural amino acids (http // chemlibrary.bri.nrc.ca), for example peptides derived from phage display RGD libraries
  • Hormonal receptor ligands including hormones and steroids.
  • peptide targeting targeting ligands overexpressed in tumors LHRH, bombesin / GRP receptors
  • VIP receivers CCK receivers
  • receivers tachykinin for example
  • the somatostatin or bombesin analogs peptides derived from possibly glycosylated octreotide peptides, VIP peptides, alpha-MSH, CCK-B peptides
  • peptides selected from: cyclic peptides RGD, fibrin-alpha chain, CSVTCR, tuftsin, fMLF, YIGSR (receptor: laminin).
  • oligosaccharides oligosaccharides, polysaccharides and derivatives of oste, derivatives targeting Glut receptors (oste receptors).
  • markers of myocardial viability (tetrofosmin and hexakis2methoxy-2-methylpropylisonitrile).
  • neurotransmitter receptor ligands D, 5HT, Ach, GABA, NA receptors.
  • fibrin-binding peptides especially the peptide sequences described in WO 03/1 1 1 15.
  • integrin targeting compounds in particular having an affinity greater than 10,000, 100,000 or more, especially non-peptide mimetic compounds of RGD peptides, and in particular compounds comprising a tetrahydro naphthyridine group described for example in: J Med . Chem., 2003, 46, 4790-4798, Bioorg. Med. Chem. Letters, 2004, 14, 4515-4518, Bioorg. Med. Chem. Letters, 2005, 15, 1647- 1650.
  • naphthyridine compounds the applicant uses any naphthyridine compound known from the prior art (in particular those of WO2009 / 1 14776), the use of the naphthyridine compounds as targeting ligand for medical imaging being described in WO2007 / 042506 page 13 lines 30-34.
  • amphiphilic targeting ligands are advantageously written in the form:
  • Bio is a targeting ligand, in particular chosen from those mentioned above (that is to say the part of biological recognition, which is located on the outer surface of nanodroplets)
  • Lipo is a lipophilic group allowing insertion of the targeting ligand within the surfactant layer
  • L 2 is a linking group, advantageously chosen from:
  • NH2 with n integer from 0 to 20; NH2- (CH2) n-CO2H; NH2-CH2 - (CH2-O-CH2) n-CO2H with n integer from 1 to 10, squarate
  • P1 and P2 identical or different, being selected from O, S, NH, nothing (single bond), CO2, NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH-, NHSO2-, squarate
  • I alkylene, alkoxyalkylene, polyalkoxyalkylene (especially PEG), alkylene interrupted by one or more squarates or by one or more aryls, advantageously phenyl, alkenylene, alkynylene, alkylene interrupted by one or more groups selected from -NH-, -O- , -CO-, -NH (CO) -, - (CO) NH-, -O (CO) -, or - (OC) O-,
  • peptidic targeting ligands or amphiphilic rendered pharmacophores for anchoring to the outer surface of the nanodroplet are presented.
  • the nanoemulsion comprises an amphiphilic, preferably macrocyclic, paramagnetic metal chelate comprising a hydrophilic nucleus chosen from: DOTA, OD3A, HPD03, BTDO3A, PCTA, DOTAM, DOTMA, DOTA-GA and their derivatives.
  • the hydrophilic part of the amphiphilic chelate is a macrocyclic chelate chosen from: DOTA, D03A, HPD03, BTDO3A, PCTA and any known derivative of these chelates, especially described for example in Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 2003, Vol 3, No. 8.
  • the chelate is made amphiphilic by modifying it chemically, typically by coupling with one or more fatty chains, so as to present a lipophilicity (a sufficiently high lipophilicity, or conversely a sufficiently weak hydrophilicity), such that it can anchor within the surfactant layer of the nanodroplet and to form a lipid composition sufficiently stable for satisfactory diagnostic use.
  • a lipophilicity a sufficiently high lipophilicity, or conversely a sufficiently weak hydrophilicity
  • the HLB value the hydrophilic balance / lipophilicity
  • the number of lanthanide chelates per nanodroplet is at least 1000 and typically at least 5000, 10,000, 20,000, 50,000 to 100,000.
  • fluorinated oil and / or mixture of fluorinated oils
  • suitable fluorinated oil including linear or branched, cyclic or polycyclic, saturated or unsaturated perfluorocarbons, perfluorinated cyclic tertiary amines, perfluoro esters or thioesters, haloperfluorocarbons and compounds. known analogues or derivatives.
  • at least 60% of the hydrogen atoms of the corresponding hydrocarbon oil are replaced by a fluorine atom.
  • the lipid nanodroplet includes perfluorocarbons as described in US Pat. No.
  • the liquid emulsion containing nanodroplets comprising a perfluorocarbon with a relatively high boiling point (for example between 30 and 90 ° C., preferably between 50 and 150 ° C, for example 142 ⁇ ⁇ for PFOB) surrounded by a coating composed of a lipid and / or a surfactant.
  • a perfluorocarbon with a relatively high boiling point for example between 30 and 90 ° C., preferably between 50 and 150 ° C, for example 142 ⁇ ⁇ for PFOB
  • oils for perfluorocarbon emulsions for MRI imaging are recalled in particular in the documents US 6,676,963, US 4,927,623, US 5,077,036, US5,1 14,703, US5,171, 755, US5,304,325, US5,350,571, US5,393,524, US5,403,575; in particular the oils: perfluorooctylbromide PFOB, C8F17Br (PFOB or perfluorobron), perfluorooctylethane (C-sF ⁇ C ⁇ Hs PFOE), perfluorodecalin FDC, perfluorooctane C 8 Fi 8 , perfluorodichlorooctane, perfluoro-n-octyl bromide, perfluoroheptane, perfluorodecane Ci 0 F 22 , perfluorododecyl bromide Ci 0 F 22 Br PFDB, perfluorocycl
  • oils of formula C n F 2n + 1 X, XCn 2n X, where n is an integer ranging from 2 to 10, X Br, Cl or I
  • 1-bromo-F-butane (nC 4 F 9 Br), 1-bromo-F-hexane (nC 6 F 13 Br), 1-bromo-F-heptane (nC 7 Fi 5 Br), 1, 4- dibromo-F-butane and 1,6-dibromo-F-hexane.
  • Fluorinated compounds are also included with chlorinated substituents, for example: perfluorooctyl chloride (nC 8 Fi 7 Cl), 1,8-dichloro-F-octane (n-Cl 8 Cl 6 Cl), 1, 6-dichloro-F hexane (n-CIC 6 F 12 Cl), and 1,4-dichloro-F-butane (n-Cl C 4 F 8 Cl).
  • perfluorooctyl chloride nC 8 Fi 7 Cl
  • 1,8-dichloro-F-octane n-Cl 8 Cl 6 Cl
  • 1, 6-dichloro-F hexane n-CIC 6 F 12 Cl
  • 1,4-dichloro-F-butane n-Cl C 4 F 8 Cl
  • polycyclic or cyclic compounds such as: d 0 Fi 8 (F-decalin or perfluorodecalin), and mixtures of perfluoroperhydrophenanthrene and perfluoro n-butyldecalin.
  • Perfluorinated amines such as: F-tripropylamine (“FTPA”), F-tributylamine (“FTBA”), F-4-methyloctahydroquinolizine (“FMOQ”), FN-methyl-decahydroisoquinoline (“FMIQ”), are also included.
  • FHQ F-tripropylamine
  • FBA F-tributylamine
  • FMOQ F-4-methyloctahydroquinolizine
  • FMIQ FN-methyl-decahydroisoquinoline
  • FHQ FN-methyldecahydroquinoline
  • FCHP FN-cyclohexylpyrrolidine
  • FC-75 F-2-butyltetrahydrofuran
  • FC-77 F-2-butyltetrahydrofuran
  • mixtures of fluorinated oils mention may be made of mixtures of 10 to 70% of a first oil, of PFOB type for example, and 30 to 70% of a second fluorinated oil.
  • the aqueous phase is advantageously water or a pharmaceutically acceptable aqueous solution such as a saline solution or a buffer solution.
  • oil-in-water nanoemulsion composition comprises, according to advantageous embodiments:
  • an aqueous phase preferably representing 29.4 to 80% by weight of the composition, advantageously 55 to 65%, more advantageously 58 to 62%
  • a fluorinated phase comprising at least one fluorinated oil, representing 19.4 to 70% by weight of the composition, advantageously 35 to 45%, more preferably 37 to 42%
  • the surfactant comprising at least one di- or tri-block fluorophile compound, at least one amphiphilic lipid and at least one amphiphilic targeting ligand,
  • the total content of surfactant by weight relative to the fluorinated oil being between 3 and 15%, especially between 3 and 12%, advantageously between 4 and 8%;
  • the total content of surfactant by weight relative to the composition being between 0.6 and 7%, advantageously between 1 and 3%.
  • amphiphilic targeting ligand represents 0.1 to 10% by mole of the total surfactant, advantageously 0.5 to 5%, especially 1 to 2%.
  • the surfactant comprises:
  • the 50% of other surfactants comprise:
  • amphiphilic targeting ligand 0.1 to 10 mol% of amphiphilic targeting ligand.
  • amphiphilic compounds comprising a fluorophore (for example rhodamine).
  • the mass content of total surfactant relative to the fluorinated phase is greater than 3%, preferably 3 to 8%, more preferably preferably 4 to 6%.
  • the surfactant of the composition according to the invention comprises:
  • non-fluorinated amphiphilic compounds of which 80 to 95 mol% of amphiphilic lipid, 0 to 5 mol% of pegylated lipids and 0.1 to 10 mol% of amphiphilic targeting ligand.
  • fluorophile compounds di- or tri-blocks the non-fluorinated amphiphilic compounds representing 30 to 60 mol% of the total surfactants, and the fluorophilic di- or tri-block compounds represent 30 to 60 mol% of the total surfactants;
  • non-fluorinated amphiphilic compounds representing 50 mol% of the total surfactants
  • fluorophilic di- or tri-block compounds represent 50 mol% of the total surfactants
  • the nanoemulsion according to the invention has as composition by weight:
  • fluorinated phase comprising a fluorinated oil, advantageously 35 to 45%, more preferably 37 to 42%
  • the surfactant comprising:
  • non-fluorinated amphiphilic compounds of which 80 to 95 mol% of amphiphilic lipid, 0 to 5 mol% of pegylated lipids and 0.1 to 10 mol% of amphiphilic targeting ligand, and
  • fluorophile compounds di- or tri-blocks.
  • the non-fluorinated amphiphilic compounds represent 30 to 60 mol% of the total surfactants
  • the fluorophilic di- or tri-block compounds represent 30 to 60 mol% of the total surfactants (the total of the non-fluorinated amphiphilic compounds and the compounds fluorophiles di- or tri-blocks being 100%).
  • the non-fluorinated amphiphilic compounds represent 50 mol% of the total surfactants
  • the di- or triblock fluorophile compounds represent 50 mol% of the total surfactants.
  • nanodroplet size between 150 and 350 nm, and in particular around 200 to 250 nm.
  • the size and the stability of the nanodroplets are very satisfactory, as well as the viscosity (of the order of 2 to 3 mPa.s). Their behavior is Newtonian, which is an important advantage for injectable pharmaceutical solutions.
  • Aqueous phase of 29.4 to 80, 29.4 to 80, 29.4 to 80, composition preferably preferably preferably
  • Fluorinated phase 19.4 to 70, 19.4 to 70, 19.4 to 70, as a% of the composition, preferably preferably
  • % Molar content 40 to 60%, 40 to 60%, 40 to 60%, amphiphilic compounds preferably not preferably preferably fluorinated 50% 50% 50%
  • % Molar content 0.1 to 10 0.1 to 10 0.1 to 10 in targeting ligands preferably preferably preferably 0.5 to 3% amphiphilic 0.5 to 3% 0.5 to 3% non-amphiphilic compounds
  • the emulsions are heterogeneous lipid mixtures obtained in an appropriate manner, in particular by mechanical stirring and / or addition of emulsifiers.
  • the [amphiphilic targeting ligands / amphiphilic lipid / optional amphiphilic paramagnetic metal chelate / optionally pegylated lipids / optional amphiphilic compounds comprising a fluorophore] are dispersed in the aqueous phase with magnetic stirring and using ultrasound.
  • the fluorophilic compound di- or tri-block is then added to this aqueous phase and the fluorinated oil is introduced dropwise by pre-emulsifier with Ultraturax for example.
  • the pre-emulsion is then finalized microfluidizer and filtered on 0.45 ⁇ . ⁇
  • the invention also relates to a contrast agent comprising a composition as described above.
  • amphiphilic targeting ligands mentioned are essentially diagnostic.
  • the composition according to the invention is therefore useful for diagnosis, in particular by magnetic resonance imaging (MRI).
  • MRI magnetic resonance imaging
  • nanoemulsions can be prepared for the therapeutic treatment.
  • the nanodroplets will then comprise on the one hand an amphiphilic targeting ligand anchored in the surfactant layer making it possible to reach the biological target (the pathological zone), in particular as defined above, and on the other hand an active ingredient used as medicament for the therapeutic treatment and encapsulated in the droplets of fluorinated oil in the case of active principles soluble in the fluorinated oil.
  • the fluorinated oil is generally used at a sufficiently high level, at least 20% relative to the total weight of the composition, in order to have a sufficiently concentrated solution and a sufficient MRI signal. It is important to have a suitable concentration for the duration of injection, the moment of the acquisition of the signal and the associated processing of the data by the practitioner. An overly diluted solution would generally render it unusable for medical imaging examinations.
  • compositions have a droplet size sufficiently small to allow them to circulate in biological media without degradation of the product, up to the target of the targeting ligand attached to the droplets.
  • the size is typically 50 to 400 nm, advantageously 100 to 350 nm, especially 150 to 300 nm, in particular 200 to 250 nm.
  • the nanodroplets each comprise a number of targeting ligands of the order of 100 to 5000, in particular 500 to 2000, which allows the targeting according to the affinity and the multivalence of the targeting ligand to be effective.
  • the biological results obtained with the applicant's new nanoemulsions further show that the targeting ligands are advantageously distributed over the entire external surface of the nanodroplets, which results in optimized multivalence of the targeting ligands.
  • the amphiphilic targeting ligands advantageously represent 0.1 to 10 mol% of the total surfactants, advantageously 0.5 to 5%, especially 0.5 to 3%.
  • the injected contrast product having the described nanoemulsion compositions has an affinity of advantageously of the order of 1 ⁇ M to 100 nM, in particular 1 ⁇ M at 10 nM, advantageously 1 ⁇ M at 1 nM (the affinity by amphiphilic targeting ligand is multiplied by the number of nanodroplet targeting ligands).
  • the composition comprises 0.001 to 0.1% by weight of amphiphilic targeting ligand, in particular 0.01 to 0.1%.
  • the nanoemulsions of the applicant also have the advantage of being able to control the type and amount of targeting ligands, and in particular to be able to incorporate different targeting ligands.
  • a nanodroplet will include:
  • an amphiphilic targeting ligand which allows access to a pathological physiological zone, for example a targeting ligand passing through the BBB (blood-brain barrier),
  • Another target targeting amphiphilic targeting ligand which then allows the targeting of a target biological marker overexpressed by certain cells of this pathological zone.
  • Molecular interactions between the targeting ligand and the target biological marker allow the capture of nanodroplets at the pathological area, and the resulting MRI imaging can pinpoint the pathological area.
  • the contrast agent-forming composition is preferably administered intravascularly, depending on the patient being examined.
  • the lipid compositions obtained are optionally formulated using known additives recalled for example in US 6 010 682, in particular for administration by intravenous injection. They include thickeners, saccharides or polysaccharides, glycerol, dextrose, sodium chloride, antimicrobials.
  • compositions according to the invention the following characteristics can typically be obtained, which can vary according to the precise compositions of the emulsions and their preparation process:
  • targeting ligands 50 to 1000, especially 100 to 3000
  • the invention also relates to:
  • a contrast product preferably for MRI, comprising the nanoemulsion compositions of the application
  • the applicant's nanoemulsions for their use in the diagnosis, and in particular in the diagnosis of diseases, in particular cancerous, inflammatory, neurodegenerative, cardiovascular.
  • Tint 1 1 g is dissolved in 5 ml of CH 2 Cl 2 . 5ml of TFA are added to the medium. Leave for 3 hours at RT and then evaporate to dryness. Take up in 2 * 40 ml of iso ether, recover an oil which is dried by evaporation.
  • the product is purified with silica, eluting with CH 2 Cl 2 (fine fractionation). After collecting and evaporating the fractions according to: obtaining crystals.
  • DTPA bis anhydride is suspended in DMF.
  • the suspension is heated to 50 ° C. and there is a passage in solution.
  • Octadecylamine is added at one time.
  • the reaction is maintained overnight at 50 ° C. During the reaction, slow dissolution of the amine in DMF followed by precipitation of the desired product.
  • the reaction medium is cooled and then filtered on sinter.
  • the precipitate is washed once with DMF and then abundantly with methanol.
  • the mass spectrometry analysis is done by infusion of the sample
  • the product can be dissolved in methanol or toluene by adding TFA.
  • Ligand complexation in organic medium
  • the ligand (Int3) is suspended in methanol.
  • the GdCl 3 , 6H 2 O is added. There is solubilization instantly.
  • the pH of the solution is adjusted to 7 using a solution of sodium methanolate in methanol.
  • the solution is refluxed for 45 minutes.
  • the methanol is evaporated and the residue taken up in water.
  • the powder is washed with plenty of water. 15 g of crude product are obtained with a yield of 96%.
  • the mass spectrometry analysis is done by infusion of the sample into ES +.
  • the product can be dissolved in methanol with dichloromethane.
  • the product is purified by flash chromatography on silica gel. 15 g are purified with an eluent phase consisting of 90/10 methanol-dichloromethane.
  • EPC egg yolk phosphatidylcholine
  • DSPE-PEG 2000 Lipoid
  • 1.1 mg of the compound of Example 3 are dispersed with magnetic stirring in 30 ml of water at 2.5% w / w glycerol for 2 hours after being passed through an ultrasonic bath for 20 minutes.
  • This composition corresponds to a 40% (m / m) emulsion of PFOB.
  • the surfactant composition is 11% (m / m) of surfactants relative to PFOB or 16 mmol of surfactant per 100 g of PFOB.
  • the molar proportions in the surfactants are as follows: 50% F6H10 and 50% non-fluorinated surfactants.
  • the molar composition of non-fluorinated surfactants is 93% EPC, 5% DSPE-PEG 2000 and 2% of the compound of Example 3.
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 196 nm measured with Nanosizer ZS from Malvern.
  • PFOB and diblock F6H10 were previously purified according to the procedure described in M. Le Blanc et al., Pharmaceutical Research, 246-248 (1985).
  • This composition corresponds to a 40% (m / m) emulsion of PFOB.
  • the surfactant composition is 5.5% (m / m) of surfactants relative to PFOB or 8 mmol of surfactant per 100 g of PFOB.
  • the molar proportions in the surfactants are as follows: 50% F6H10 and 50% non-fluorinated surfactants.
  • the molar composition of non-fluorinated surfactants is: 94% EPC, 5% DSPE-PEG 2000 and 1% of the compound of Example 3.
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 225 nm measured with Nanosizer ZS from Malvern.
  • This composition corresponds to a 20% (m / m) emulsion of PFOB.
  • the surfactant composition is 5.5% (m / m) of surfactants relative to PFOB or 8 mmol of surfactant per 100 g of PFOB.
  • the molar proportions in the surfactants are as follows: 50% F6H10 and 50% non-fluorinated surfactants.
  • the molar composition of non-fluorinated surfactants is: 93% EPC, 5% DSPE-PEG
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 178 nm measured with Nanosizer ZS from Malvern.
  • Example 8 Synthesis of a PFOB emulsion with the F6H10 diblock fluorophile compound and the amphiphilic targeting ligand of Example 1 with a low% of surfactants
  • the surfactant composition corresponds to a 20% (m / m) emulsion of PFOB.
  • the surfactant composition is 2.75% (m / m) of surfactants relative to PFOB or 4 mmol of surfactant per 100 g of PFOB. This composition is not in the range [3% -15% by mass].
  • the molar proportions in the surfactants are as follows: 50% F6H10 and 50% non-fluorinated surfactants.
  • the molar composition of non-fluorinated surfactants is: 93% EPC, 5% DSPE-PEG 2000 and 2% of the compound of Example 3.
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 260 nm measured with Nanosizer ZS from Malvern
  • Example 9 Synthesis of a PFOB emulsion with the fluorophilic diblock F6H10 and the amphiphilic targeting ligand of Example 1 with a solvent step.
  • composition is identical to that of Example 7 but the procedure includes an organic solvent:
  • the EPC, the DSPE-PEG 2000, the compound of Example 1 and the F6H10 diblock are dissolved in a chloroform / methanol (7/3) mixture.
  • the organic phase is evaporated in a rotavapor.
  • the film obtained is taken up in the aqueous phase and the PFOB is added to the solution. This solution is passed to the Ultraturax then the microfluidizer and finally filtered on 0.45 ⁇ .
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 336 nm.
  • This composition corresponds to a 40% (m / m) emulsion of PFOB.
  • the surfactant composition is 5.5% (m / m) of surfactants relative to PFOB or 8 mmol of surfactant per 100 g of PFOB.
  • the molar proportions in the surfactants are as follows: 50% F6H10 and 50% non-fluorinated surfactants.
  • the molar composition of non-fluorinated surfactants is: 92.8% EPC, 5% DSPE-PEG 2000, 2% of the compound of Example 3 and 0.2% of DSPE-rhodamine.
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 198 nm measured with Nanosizer ZS from Malvern
  • This composition corresponds to a 40% (m / m) emulsion of PFOB.
  • the surfactant composition is 5.5% (m / m) of surfactants relative to PFOB or 8 mmol of surfactant per 100 g of PFOB.
  • the molar proportions in the surfactants are as follows: 50% F6H10 and 50% non-fluorinated surfactants.
  • the composition of non-fluorinated surfactants is: 74.8% EPC, 5% DSPE-PEG 2000, 0.2% DSPE-rhodamine and 20% Gd complex.
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 210 nm measured with Nanosizer ZS from Malvern
  • aqueous phase 20 ml of aqueous phase
  • This composition corresponds to a 20% (m / m) emulsion of PFOB.
  • the surfactant composition is 6% (m / m) of surfactants relative to PFOB or 7 mmol of surfactant per 100 g of PFOB.
  • the molar proportions in the surfactants are as follows: 98% EPC, 1.5% DSPE-PEG 2000 and 0.5% of the compound of Example 1.
  • the emulsion obtained is characterized by a hydrodynamic diameter of 134 nm measured with Nanosizer ZS from Malvern.
  • Example 5 The protocol and the composition are identical to Example 5, replacing PFOB with perfluoro 15-crown-5 ether.
  • Example 14 Stability Monitoring of the Emulsions of Examples 5, 7, 8, 9, 12
  • Example 14 IC50 measurement of the emulsions of Examples 5, 7, 8, 9 and 12.
  • the measure IC50 emulsions is performed by 3 competitions measurements ⁇ 3 on HUVEC overexpressing the Echistatin 25 l.
  • the suspension of the HUVECs is distributed in a 96-well plate with a conical bottom, in the proportion of 2.10 5 cells in 50 ⁇ l in binding buffer.
  • Fifty ⁇ l - solutions of increasing concentration of echistatin or RGD products are added by well.
  • the positive control is achieved by adding a binding buffer without a competitor. All points of concentration are made in duplicate.
  • the plate is incubated for 2 h at room temperature with stirring.
  • Fifty ⁇ ⁇ - of the solution échistatine- 25 l-SIB to 3 nM are then dispensed into each well and the plate is again incubated for 2 h at room temperature under stirring.
  • reaction mixtures are transferred into ampoules containing 200 ⁇ l of a density cushion composed of paraffin and dibutyl phthalate (10/90).
  • the microtubes are then centrifuged at 12,000 rpm for 3 min.
  • the tubes are finally frozen in liquid nitrogen and then cut to count the cell pellet and the gamma counter supernatant.
  • a competition curve is then drawn where the relative fastening echistatin 25 l-SIB is determined by the following equation:
  • the data is analyzed using the GraphPad Prism ® 5.0 software which determines the IC 50 values for each product from the competition curve.

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Abstract

L'invention concerne une composition de nanoémulsion huile dans eau pour IRM, comprenant : - une phase aqueuse, - une phase fluorée comprenant au moins une huile fluorée, - un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et fluorée, le tensioactif comprenant : - au moins un ligand de ciblage amphiphile, - au moins un lipide amphiphile, et - au moins un composé fluorophile di- ou tri-bloc, et son utilisation comme agent de contraste.

Description

Nanoémulsions et leur utilisation comme agents de contraste
La présente invention concerne de nouveaux systèmes optimisés de type nanoémulsions et leur utilisation comme agents de contraste notamment en IRM.
Dans le domaine de l'imagerie diagnostique, un grand nombre de recherches a concerné des nanosystèmes lipidiques de type émulsion. Typiquement les émulsions utilisées sont sous forme de vésicules préparées à l'aide de constituants lipidiques (huile en particulier) et de tensioactifs (également désignés surfactants) servant d'interface entre la phase aqueuse et le noyau lipidique de la nanoparticule. Les émulsions lipidiques huile dans eau incorporent une phase huileuse lipophile, formant des gouttelettes lipidiques en solution aqueuse.
Une première catégorie d'émulsions décrite notamment dans WO03/062198 ou US 6 676 963 est celle de nanoémulsions fluorées comprenant, intégrés à l'intérieur des vésicules lipidiques, des composés fluorés comportant des atomes de fluor F19 utilisés pour l'imagerie de résonance magnétique IRM. En effet le fluor a notamment l'intérêt par rapport à l'IRM du proton d'être quasiment absent dans les systèmes biologiques à l'état libre ce qui lui permet d'être reconnu comme une excellente sonde quantitative sous la forme fluor F19. Le cœur lipidique est formé d'une huile fluorée, et entouré d'une couche lipidique formée par un tensioactif (lécithine par exemple).
Ces émulsions fluorées peuvent comprendre en outre un nombre très élevé de complexes de métaux paramagnétiques, en particulier de lanthanides, pour associer l'IRM du fluor 19F et du proton 1 H. On connaît ainsi des émulsions fluorées pour IRM incorporant des chélates capables de complexer des lanthanides en particulier le gadolinium. Les chélates utilisés sont notamment des dérivés du DTPA, DOTA, D03A, HPD03A et autres chélates largement décrits dans l'art antérieur. Ces chélates hydrophiles sont rendus lipophiles en leur greffant une zone lipophile telle qu'un phospholipide, ce qui permet de les intégrer dans la membrane lipidique que forme le tensioactif lipidique de la composition. Plusieurs milliers (5000 à 100 000 environ) de ces complexes sont intégrés dans la membrane lipidique de ces vésicules, ce qui permet d'obtenir une relaxivité (signal IRM) élevée pour une détection de la zone physiologique étudiée et mofifier le temsp de relaxation du 19F. La partie hydrophile (la partie hydrophile que représente le chélate auquel est attaché un groupe lipophile de manière à prendre le chélate amphiphile) est localisée à la surface externe des nanogouttelettes, en contact avec la phase aqueuse de la solution de nanogouttelettes.
On connaît aussi des émulsions huile dans eau et non fluorées, comprenant des chélates de lanthanides pour l'IRM uniquement du proton. En outre, afin d'obtenir un signal spécifique de zones pathologiques, par exemple associés à une surexpression d'un marqueur de ces zones (récepteurs par exemple), des molécules de ciblage (ou ligands de ciblage, peptide par exemple ayant une affinité pour le récepteur) ont été greffés sur les nanogouttelettes des ces émulsions fluorées. WO03/062198 décrit en particulier l'utilisation de composés peptidomimétiques pour cibler des intégrines surexprimmées dans des zones tumorales. Pour l'incorporation à la membrane lipidique, les ligands de ciblage (souvent hydrophiles) sont rendus amphiphiles en les associant à des chaînes lipophiles.
Toutefois, malgré des avancées prometteuses, les agents de contraste fluorés et vectorisés décrits n'ont pas encore démontré totalement leur efficacité clinique, et posent des difficultés en matière de stabilité dans la durée.
Par rapport aux émulsions fluorées connues, on cherche :
- à améliorer la stabilité des ligands de ciblage dans ces émulsions, d'autant que le prix de revient industriel des nanoémulsions est pour environ au moins 80 à 90% représenté par les ligands de ciblage qui sont très onéreux
- à augmenter le taux et le rendement d'incorporation des ligands de ciblage, et l'affinité des émulsions pour la cible biologique
- à atteindre une stabilité dans le temps d'au moins un an, et de préférence de 2 à 3 ans.
II est rappelé que l'optimisation des constituants est complexe : nature et teneur de l'huile, des tensioactifs, des ligands de ciblage. Par exemple un taux de tensioactifs trop élevé se traduit par :
- la formation dans la composition, en plus des nanogoutelettes, de micelles dont le retrait nécessiterait pour une production à l'échelle industrielle de centaines de tonnes de produit, des étapes de séparation et de purification complexes et coûteuses d'où une chute du rendement industriel
- la difficulté voire l'impossibilité d'incorporer aux nanoparticules une quantité appropriée de ligands de ciblage biologique dont le coût est très élevé. En effet, les ligands de ciblage amphiphiles sont souvent moins bon tensioactifs que les tensioactifs utilisés pour stabiliser l'interface. De ce fait, la surface des gouttelettes est occupée principalement par la couche de lipides amphiphiles tensioactifs et les ligands de ciblage ont du mal à s'intégrer au sein de cette couche.
D'autres catégories d'émulsions pour l'imagerie médicale existent, en particulier des nanoémulsions pour l'imagerie de fluorescence, ne comprenant pas de composés fluorés, et utilisant des nanocristaux d'oxydes métalliques. Le document WO2010/018222 décrit de telles nanoémulsions comprenant : une solution aqueuse
- une phase dispersée (huile) formant des nanogouttelettes lipidiques dans la solution aqueuse, les nanogouttelettes incorporant des nanocristaux d'oxydes métalliques ayant des propriétés de luminescence pour une imagerie de fluorescence
- un surfactant (phospholipides par exemple) et des co-surfactants pour stabiliser les nanogouttelettes.
L'imagerie de fluorescence n'est cependant pas bien adaptée pour plusieurs indications diagnostiques majeures, en particulier certaines imageries de territoires vasculaires et/ou tumoraux.
Au vu de cet art antérieur complexe, on voit la difficulté d'obtenir des nanoémulsions très efficaces, en particulier des nanoémulsisons fluorées vectorisées pour IRM du fluor, répondant aux contraintes d'industrialisation et cliniquement performantes dans un large spectre d'indications.
Le demandeur a réussi à obtenir des nanoémulsions fluorées sous forme de nanogouttelettes vectorisées :
- suffisamment stables colloïdalement pour être produites et conservées pendant une longue durée, en particulier sans problème de coalescence entre elles des gouttelettes lipidiques
- suffisamment stables in vivo pour ne pas être dégradées
- adaptées sur le plan de la pharmacocinétique
- suffisamment efficaces en terme de signal pour l'imagerie clinique chez le patient
- capables d'incorporer des ligands de ciblage de zones pathologiques à la surface des nanogouttelettes, en quantité appropriée et sans perte d'affinité gênante avec leur cible biologique.
Le demandeur a pour cela incorporé aux nanoémulsions antérieures des agents dispersants fluorophiles, désignés composés fluorophiles di- ou tri-blocs.
A cet effet l'invention concerne selon un premier aspect une composition de nanoémulsion huile dans eau, comprenant :
- une phase aqueuse,
- une phase fluorée comprenant au moins une huile fluorée,
- un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et fluorée, le tensioactif comprenant :
- au moins un ligand de ciblage amphiphile,
- au moins un lipide amphiphile, et
- au moins un composé fluorophile di- ou tri-bloc. Par nanoémulsion, on entend que la taille des gouttelettes est comprise entre 1 et 1000 nm. La taille des gouttelettes est typiquement de 50 à 400 nm, avantageusement 100 à 350 nm, notamment 150 à 300 nm, en particulier 200 à 250 nm. · tensioactif
Par souci de simplification, il est indiqué que la nanoémulsion comprend un tensioactif. Il est clair pour l'homme du métier qu'il s'agit d'un tensioactif formant une couche entre la phase huileuse et la phase aqueuse, et désigné également « tensioactifs totaux » dans la demande. Comme détaillé plus loin, le tensioactif (tensioactifs totaux) comprend d'une part des composés amphiphiles non fluorés, et d'autre part des composés amphiphiles fluorés, notamment le composé fluorophile di- ou tri-bloc.
L'homme du métier comprend que le tensioactif à l'interface huile fluorée/phase aqueuse correspond à l'ensemble des tensioactifs utilisés, c'est à dire comme expliqué en détail dans la demande : des lipides amphiphiles, des composés fluorophiles di- ou tri- blocs, des ligands de ciblage amphiphiles, et éventuellement en outre des chélates de métal paramagnétique amphiphiles présents ou non selon les réalisations, et le cas échéant d'autres composés tels que des lipides pégylés (lipides couplés à des PEG). De par leur structure amphiphile, les ligands de ciblage amphiphiles jouent un rôle de tensioactif étant précisé que leur quantité est généralement faible par rapport aux autres composés amphiphiles utilisés.
On entend par l'expression « tensioactif total », l'ensemble des tensioactifs dans la composition. · composé fluorophile di- ou tri-bloc
Le composé fluorophile di- ou tri-bloc s'écrit de préférence sous la forme FnHm décrite en détail plus loin.
De tels composés fluorophiles di- ou tri-blocs sont connus notamment du document US 5,733,526, mais ils y sont utilisés pour stabiliser des systèmes lipidiques d'un certain type (micelles ou gouttelettes huileuses) incorporés dans un système non aqueux d'un autre type (huile fluorée), et non comme c'est le cas dans la présente invention, pour stabiliser des systèmes lipidiques dans une phase aqueuse. Plus précisément le document US 5,733,526 décrit notamment dans ses exemples:
- des micelles avec ligands de ciblage (les micelles ne délimitant pas un compartiment interne aqueux), incorporés dans une huile fluorée (PFOB), les di- ou tri-blocs étant directement les constituants des micelles.
- une huile carbonée, incorporée dans une huile fluorée (PFOB), des di- ou tri-blocs étant utilisés pour stabiliser cette interface.
Ainsi, dans US 5,733,526, les composés fluorophiles diblocs se situent à l'interface d'une huile fluorée et d'une huile non fluorée (huile à base d'hydrocarbure), alors que dans la présente demande, les composés fluorophiles diblocs se situent à l'interface entre l'huile fluorée et la phase aqueuse. De préférence, la nanoémulsion selon l'invention est exempte d'huile à base d'hydrocarbure.
De manière inattendue, le demandeur a réussi à démontrer que ses nouveaux systèmes permettent non seulement d'obtenir des nanoémulsions stables, mais aussi que l'affinité des nanoémulsions huile dans eau synthétisées pour la cible biologique est significativement améliorée.
Les composés fluorophiles diblocs utilisés pour les nanoémulsions selon l'invention ont avantageusement pour formule générale :
RF -L-RH (-Z)Z
dans laquelle :
1 ) RF est un groupe fluoré ou perfluoré (qui comprend ou non des chaînes latérales et/ou des cycles et/ou des hétéroatomes notamment des halogènes)
2) RH est un groupe hydrocarboné (qui comprend ou non des chaînes latérales et/ou des cycles et/ou des hétéroatomes notamment des halogènes et/ou des liaisons multiples (exemple -(CH2)n -, -C6H4 (CH2)4-, -(CH2)P 0(CH2)q -, -(CH2)2 CH=CH(CH2)5 -; n, p et q étant des nombres entiers variant de 1 à 50, notamment de 1 à 20, de préférence de 2 à 10) ;
3) L est un groupe de liaison et peut comprendre notamment un des groupes suivants : liaison simple, -CH2-, -CH=CH-, -O-, -S-, -P04 -, CONH
4) Z est H ou un groupe plus polaire ou polarisable que les groupes RH (par exemple un alcool, un halogène, un groupe -0-R'H où R'H est
- un groupe hydrocarboné, notamment un alkyle ou un groupe-(CH2)mCH=CH2 avec m nombre entier variant de 1 à 16), ou
- un groupe -P(0)[N(CH2 CH2)2 0]2)
5) z représente 0 ou 1 .
Avantageusement le composé fluorophile dibloc est de formule RFLRH, dans lequel RF est un alkyle fluoré de 2 à 12 atomes de carbone, RH est un groupe hydrocarboné linéaire, ramifié, ou cyclique, saturé ou insaturé de 2 à 16 atomes de carbone, et L est un groupe de liaison comprenant par exemple une simple liaison carbone-carbone ou un atome d'oxygène ou tout autre groupement approprié, notamment ceux cité ci-dessus.
Avantageusement le composé fluorophile di- ou tri-bloc est choisi parmi les suivants, où n, m et p sont des nombres entiers :
- composés de formule C n F 2n+1 C m H 2m+1 (saturé), ou de formule C n F 2n+1 C m H 2m-1 (insaturé), ou leurs combinaisons, n étant un nombre entier de 2 à 12 et m étant un entier de 2 à 16,
- composés de formule Cp H 2p+1 -C n F2n - C m H 2m+1 > avec p=1 -12, m=1 -12 et n=2-12
- composés de formule Cn F 2n+1 - CH = CH - C m H 2m+1 , avec n et m identiques ou différents comprise entre 2 et 12
- composés éthers ou polyéthers substitués (i.e : XC n F2n OCm H2m X, XCF20Cn H2n OCF2 X, avec n et m=1 -4, X=Br, Cl ou I)
- composés diblocs ou triblocs éthers notamment :
• a) C n F 2n+1 -O-C m H 2m+1 , avec n=2-10; m=2-16
• b) Cp H 2p+1 -O-Cn F2n -O-C m H 2m+1 , avec p=2-12, m=1 -12 et n=2-12.
Il est rappelé que la nomenclature des composés fluorophiles di- ou tri-blocs est connue de l'homme du métier. Par exemple les diblocs FnHm représentent l'écriture simplifiée des diblocs Cn F 2n+1 C m H 2m+1 (avec m=8,12,14 pour 1 -octène, 1 - dodécène, 1 -tétradécène), étant entendu que un ou plusieurs des atomes d'hydrogène peut être remplacé par un halogène, notamment un iode. Par exemple :
- le composé fluorophile dibloc F4H8I a pour formule CF3-(CF2)2- CF2-CH2-CHI-CH2- (CH2)4-CH3
- le composé fluorophile dibloc F4H14I a pour formule CF3-(CF2)2- CF2-CH2-CHI-CH2- (CH2)10-CH3.
Les composés fluorophiles diblocs Cn F 2n+1 C m H 2m+1 sont particulièrement avantageux pour la présente invention.
Le groupe hydrocarboné et/ou le groupe fluoré du composé fluorophile di- ou tri- bloc peut aussi :
- comprendre du phosphore (par exemple le (perfluoroalkyl)alkylene mono- ou dimorpholinophosphate et des phospholipides fluorés)
- être substituée par un alcool, comprendre un polyol, ou comprendre un groupeun polyhydroxylé ou aminé, être substitué par un groupe aminé oxydes ou amino acides. On citera aussi le dibloc (perfluoroalkyle)alkylène phosphate : RF I -OP(0)[N(CH2 CH2)2 0]2 ou [RF R1 0]2 P(0)[N(CH2 CH2)2 O], OÙ RF est CF3 (CF2)t, avec t un nombre entier entre 1 et 1 1 , et R1 est une chaîne hydrocarbonée saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, et RF et Ri peuvent comprendre au moins un atome O et/ou S.
• lipides amphiphiles
Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides, stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléate et monolaurate de sorbitan ; les lipides polymérisés ; les esters de sucre tels que les mono-et di-laurate, mono- et di-palmitate, mono- et distéarate de saccharose ; lesdits lipides amphiphiles pouvant être utilisés seuls ou en mélanges.
Avantageusement le lipide amphiphile est un phospholipide, de préférence choisi parmi : phosphatidylcholine dioléoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distéaroylphosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine, sphingomyéline, phosphatidylsérine, phosphatidylinositol. La phosphatidylcholine de jaune d'œuf est un lipide amphiphile préféré.
Selon un mode de réalisation particulier, tout ou partie du lipide amphiphile peut posséder une fonction réactive, telle qu'un groupe maléimide, thiol, aminé, ester, oxyamine ou aldéhyde ou alcyne ou azide. La présence de fonctions réactives permet le greffage de composés fonctionnels au niveau de l'interface entre la phase aqueuse et la phase fluorée. · lipide pégylé
En plus du lipide amphiphile, du ligand de ciblage amphiphile, du composé fluorophile di- ou tri-bloc et de l'éventuel chélate de métal paramagnétique amphiphile, le tensioactif peut comprendre des lipides pégylés c'est à dire porteurs de groupes oxyde de polyéthylène (PEG), tels que le polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE). Ces lipides pégylés permettent d'agir sur le caractère furtif de la composition selon l'invention dans l'organisme. Par « polyéthylèneglycol » PEG, au sens de la présente demande, on désigne de façon générale, des composés comprenant une chaîne -CH2- (CH2-0-CH2)k-CH2OR3 dans laquelle k est un nombre entier variant de 2 à 100 (par exemple 2, 4, 6, 10, 50), et R3 est choisi parmi H, alkyle ou -(CO)Alk, le terme "alkyle" ou "alk" désignant un groupe aliphatique hydrocarboné, linéaire ou ramifié, ayant environ de 1 à 6 atomes de carbone dans la chaîne. Le terme « polyéthylèneglycol » tel qu'employé ici englobe notamment les composés aminopolyéthylèneglycols. On utilise notamment les PEG 350, 750, 2000, 3000, 5000, modifiés par ajout de groupements lipophiles pour s'insérer au sein de la couche de tensioactif de la nanogouttelette, notamment :
1 ,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-
750]
1 ,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)- 2000],
1 ,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)- 5000]
On utilisera notamment le lipide pégylé :
• composés amphiphiles fluorochromes
Selon des variantes on peut intégrer des composés amphiphiles fluorochromes pour combiner l'IRM du F19 et l'imagerie optique de flurorescence, tels que le DSPE- rhodamine. · Ligand de ciblage amphiphile
Les nanoémulsions du demandeur sont vectorisées à l'aide d'au moins un ligand de ciblage amphiphile, partie de reconnaissance biologique localisée à la surface externe des nanogouttelettes, capable de reconnaître la cible biologique dont l'expression est modifiée dans une zone pathologique (tumeur par exemple), par rapport à la zone saine. La nanoémulsion comprend au moins un ligand de ciblage d'une zone pathologique ancré à la nanogouttelette, typiquement à l'aide d'un groupe d'ancrage du ligand de ciblage. Avantageusement le nombre de ligands de ciblage par nanogouttelette est d'au moins 1000 et typiquement de l'ordre de 1000, 2000, 5000, 10 000.
Comme indiqué précédemment, les nanoémulsions obtenues ont l'avantage important d'avoir une stabilité et une affinité augmentées. Le demandeur explique cet effet technique avantageux par l'augmentation de l'incorporation des ligands de ciblage dans l'interface formée par les tensioactifs, entre l'huile fluorée et la phase aqueuse. Les composés fluorophiles di- ou tri-blocs s'avèrent avoir la propriété de co-surfactant, en se localisant dans l'interface huile fluorée / phase aqueuse des gouttelettes. La chaîne fluorée des composés fluorophiles di- ou tri-blocs s'oriente vers le cœur fluoré (huile PFOB par exemple) de la gouttelette, et la chaîne alkylée des composés fluorophiles di- ou tri-blocs se positionne du côté des chaînes lipidiques des lipides amphiphiles. Selon des réalisations avantageuses, la chaîne alkylée des di- ou tri-blocs est choisie pour avoir une forte interaction avec les chaînes lipidiques des lipides amphiphiles, avantageusement en utilisant des chaînes de longueurs proches ou identiques, par exemple en C12, C14 ou C16.
Les ligands de ciblage amphiphile comprennent un ligand de ciblage et un groupe lipophile, l'ensemble ayant un caractère amphiphile. Les ligands de ciblage (partie ligand de ciblage du ligand de ciblage amphiphile) pour la reconnaissance de la cible en milieu biologique sont greffés à l'aide de groupes chimiques sur une partie lipophile permettant l'ancrage du ligand de ciblage dans la couche de tensioactifs. Cela permet aux ligands de ciblage de se trouver essentiellement du côté de la surface externe des nanogouttelettes.
Avantageusement le ligand de ciblage du ligand de ciblage amphiphile(à savoir la partie de reconnaissance biologique du ligand de ciblage amphiphile, localisée à la surface externe des nanogouttelettes) est choisi parmi : les pharmacophores, les peptides (avantageusement de moins de 20 acides aminés, plus avantageusement de 5 à 10 acides aminés), les pseudopeptides, les peptidomimétiques, les acides aminés, les agents de ciblage d'intégrines (peptides et pseudopeptides, peptidomimétiques notamment), les glycoprotéines, les lectines, la biotine, les dérivés ptéroïques ou aminoptéroïques, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les anticorps ou fragments d'anticorps, l'avidine, les stéroïdes, les oligonucléotides, les séquences d'acide ribonucléique, les séquences d'acide désoxyribonucléique, les hormones, les protéines éventuellement recombinantes ou mutées, les mono- ou polysaccharides, les composés à squelette benzothiazole, benzofurane, styrylbenzoxazole/thiazole/imidazole/quinoline, styrylpiridine et composés dérivés, et leurs mélanges. Les peptides, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les agents de ciblage d'intégrines (peptides et pseudopeptides, peptidomimétiques notamment), les agents de ciblage de récepteurs cellulaires ou d'enzymes (notamment de ciblage de kinases, notamment tyrosine kinase ; de métalloprotéases ; de caspases ...) sont particulièrement préférés.
On entend par pharmacophore les molécules connues pour leur capacité à avoir un effet pharmacologique, notamment de par leur capacité à cibler au moins une cible biologique (récepteur cellulaire par exemple).
Plus globalement, selon des réalisations avantageuses, le ligand de ciblage du ligand de ciblage amphiphile est choisi parmi la liste suivante (les documents et références entre parenthèses sont des exemples et non une liste limitative) :
1 ) Les ligands de ciblage ciblant des récepteurs VEGF et angiopoiétine (décrits dans WO 01/97850), les polymères tels que polyhystidine (US 6,372,194), les polypeptides ciblant la fibrine (WO 2001/9188), les peptides de ciblage d'intégrines (WO 01/77145, WO 02 26776 pour alphav beta3, WO 02/081497, par exemple RGDWXE), les pseudopeptides et peptides de ciblage de métalloprotéases MMP (WO 03/062198, WO 01/60416), les peptides ciblant par exemple le récepteur KDR/Flk-I dont R-X-K-X-H et R- X-K-X-H, ou les récepteurs Tie-1 et 2 (WO 99/40947 par exemple), les glycosides de sialyl Lewis (WO 02062810 et « Muller et al, Eur. J. Org. Chem, 2002,3966-3973), les antioxydants tels que l'acide ascorbique (WO 02/40060), les ligands de ciblage de la tuftsine (par exemple US 6,524,554), de ciblage de récepteurs à protéine G GPCR en particulier la cholécystokinine (WO 02/094873), les associations entre antagoniste d'intégrine et mime de la guanidine (US 6 489 333), les quinolones ciblant alphav beta3 ou 5 (US 6,51 1 ,648), les benzodiazépines et analogues ciblant des intégrines (US A 2002/0106325, WO01 /97861 ), les imidazoles et analogues (WO 01/98294), les peptides RGD (WO 01/10450), les anticorps ou fragments d'anticorps (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inductible par TNF ou IL (US 6,261 ,535), les molécule de ciblage modifiées par interaction avec la cible (US 5,707,605), les agents de ciblage de dépôts amyloïdes (WO 02/28441 par exemple), les peptides clivés cathepsines (WO 02/056670), les mitoxantrone ou quinone (US 6,410,695), les polypeptides ciblant des cellules épithéliales (US 6,391 ,280), les inhibiteurs de cystéines protéases (WO 99/54317), les ligands de ciblage décrits dans : US 6,491 ,893 (GCSF), US 2002/0128553, WO 02/054088, WO 02/32292, WO 02/38546, WO20036059, US 6,534,038, WO 0177102, EP 1 121 377, Pharmacological Reviews (52, n °2, 179 ; facteurs de croissance PDGF, EGF, FGF...), Topics in Current Chemistry (222, W.Krause, Springer), Bioorganic & Médicinal Chemistry (1 1 , 2003, 1319-1341 ; dérivés tétrahydrobenzazépinones ciblant alpha v beta3).
2) Les inhibiteurs d'angiogenèse, notamment ceux testés en essais cliniques ou déjà commercialisés, notamment : - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des récepteurs FGFR ou VEGFR tels que SU101 , SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, des composés azacycles (WO 00244156, WO 020591 10) ;
- les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des MMP tels que le BB25-16 (marimastat), le AG3340 (prinomastat), le solimastat, le BAY12-9566, le BMS275291 , le metastat, le neovastat ;
- les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des intégrines tels que le SM256, le SG545, des molécules d'adhésion bloquant le EC-ECM (tels que le EMD 121 -974, ou la vitaxine) ;
- des médicaments à mécanisme d'action antiangiogenèse plus indirect tels que le carboxiamidotriazole, le TNP470, la squalamine, le ZD0101 ;
- les inhibiteurs décrits dans le document WO 99/40947, les anticorps monoclonaux très sélectifs pour la liaison au récepteur KDR, les analogues de la somatostatine (WO 94/00489), les peptides de liaison à la sélectine (WO 94/05269), des facteurs de croissance (VEGF, EGF, PDGF, TNF, MCSF, interleukines); des ligands de ciblage de VEGF décrits dans Nuclear Medicine Communications, 1999, 20 ;
- les peptides inhibiteurs du document WO 02/066512.
3) Des ligands de ciblage capables de cibler des récepteurs : CD36, EPAS-1 , ARNT, NHE3, Tie-1 , 1/KDR, Flt-1 , Tek, neuropiline-1 , endogline, pléientropine, endosialine, Axl., aIPi, a2ssl, a4P1 , a5pl, eph B4 (éphrine), récepteur laminine A, récepteur neutrophiline 65, récepteur leptine OB-RP, récepteur chimiokine CXCR-4 (et autres récepteurs cités dans le document WO99/40947), LHRH, bombésine/GRP, récepteurs gastrine, VIP, CCK.
4) Des ligands de ciblage de type inhibiteurs de tyrosine kinase.
5) Les inhibiteurs du récepteur GPIIb/llla connus choisis parmi : (1 ) le fragment fab d'un anticorps monoclonal du récepteur GPIIb/llla, Abciximab, (2) les petites molécules peptidiques et peptidomimétiques injectées en intraveineuse telles que l'eptifibatide et le tirofiban.
6) Des peptides antagonistes de récepteurs au fibrinogène (EP 425 212), des peptides ligands de récepteurs llb/llla, des ligands du fibrinogène, des ligands de la thrombine, des peptides capables de cibler la plaque d'athérome, les plaquettes, la fibrine, des peptides à base d'hirudine, des dérivés à base de guanine ciblant le récepteur llb/llla.
7) D'autres ligands de ciblage ou fragments biologiquement actifs de ligands de ciblage connus de l'homme du métier comme médicaments, à action anti-thrombotique, anti agrégation plaquettaire, antiathérosclérotique, antiresténotique, anticoagulante. 8) D'autres ligands de ciblage ou fragments biologiquement actifs de ligands de ciblage ciblant alpha v beta3, décrits en association avec des DOTA dans le brevet US 6 537 520, choisis parmi les suivants : mitomycine, tretinoine, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicine, carboquone, pentostatine, nitracrine, zinostatine, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicine, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acétate, ketanserin, doxifluridine, etretinate, isotretinoine, streptozocine, nimustine, vindesine, flutamide, drogenil, butocin, carmofur, razoxane, sizofilan, carboplatine, mitolactol, tegafur, ifosfamide, prednimustine, picibanil, levamisole, teniposide, improsulfan, enocitabine, lisuride, oxymetholone, tamoxifen, progestérone, mepitiostane, epitiostanol, formestane, interferon-alpha, interferon-2 alpha, interferon-beta, interferon-gamma, colony stimulating factor-1 , colony stimulating factor-2, denileukin diftitox, interleukin-2, leutinizing hormone releasing factor.
9) certains ligands de ciblage ciblant des types particuliers de cancers, par exemple des peptides ciblant le récepteur ST associé au cancer colorectal, ou le récepteur tachykinine.
10) des ligands de ciblage utilisant des composés de type phosphines.
1 1 ) des ligands de ciblage de P-sélectine, E-sélectine ; par exemple, le peptide de 8 acides aminés décrit par Morikawa et al, 1996, 951 , ainsi que différents sucres.
12) l'annexine V ou des ligands de ciblage ciblant les processus apoptotiques.
13) tout peptide obtenu par des technologies de ciblage telles que le phage display, modifié éventuellement par des acides aminés non naturels (http//chemlibrary.bri.nrc.ca), par exemple des peptides issus de banques phage display RGD
14) d'autres ligands de ciblage peptidiques connus de ciblage de plaques d'athérome, cités notamment dans le document WO 2003/014145.
15) des vitamines.
16) des ligands de récepteurs hormonaux dont les hormones et les stéroïdes.
17) des ligands de ciblage ciblant des récepteurs opioïdes.
18) des ligands de ciblage ciblant des récepteurs TKI.
19) des antagonistes LB4 et VnR.
20) des composés nitriimidazoles et benzylguanidines.
21 ) des ligands de ciblage rappelés dans Topics in Current Chemistry, vol.222, 260- 274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals, notamment : - des ligands de ciblage de récepteurs peptidiques surexprimés dans les tumeurs (récepteurs LHRH, bombésine/GRP, récepteurs VIP, récepteurs CCK, récepteurs tachykinine par exemple), notamment les analogues de somatostatine ou de bombésine, des peptides dérivés octréotide éventuellement glycosylés, les peptides VIP, les alpha- MSH, les peptides CCK-B
des peptides choisis parmi : des peptides cycliques RGD, fibrine-chaîne alpha, CSVTCR, tuftsine, fMLF, YIGSR (récepteur : laminine).
22) des oligosaccharides, des polysaccharides et des dérivés d'osés, des dérivés ciblant les récepteurs Glut (récepteurs d'osés).
23) des ligands de ciblage utilisés pour des produits de type smart.
24) des marqueurs de la viabilité myocardique (tétrofosmine et hexakis2méthoxy- 2méthylpropylisonitrile).
25) des traceurs du métabolisme des sucres et des graisses.
26) des ligands de récepteurs de neurotransmetteurs (récepteurs D, 5HT, Ach, GABA, NA).
27) des oligonucléotides.
28) le facteur tissulaire
29) des ligands de ciblage décrits dans WO 03/20701 , en particulier le PK1 1 195 ligand du récepteur périphérique aux benzodiazépines.
30) des peptides liant la fibrine, notamment les séquences peptidiques décrites dans WO 03/1 1 1 15.
31 ) des inhibiteurs d'agrégation de plaques amyloïdes (décrits par exemple dans
WO 02/085903).
32) des pharmacophores composés de ciblage de la maladie d'Alzheimer, en particulier les composés comprenant les squelettes de type benzothiazole, benzofuranes, styrylbenzoxazoles/thiazoles/imidazoles/quinoline, styrylpiridines.
33) des composés de ciblage d'intégrines notamment ayant une affinité supérieure à 10 000, 100 000 ou plus, notamment des composés non peptidiques mimétiques de peptides RGD, et en particulier des composés comprenant un groupe tetrahydro naphtyridine décrits par exemple dans : J Med. Chem., 2003, 46, 4790-4798, Bioorg. Med. Chem. Letters, 2004, 14, 4515-4518, Bioorg. Med. Chem. Letters, 2005, 15, 1647- 1650.
En particulier pour ces composés naphtyridine, le demandeur utilise tout composé de naphtyridine connu de l'art antérieur (notamment ceux de WO2009/1 14776), l'utilisation des composés naphtyridine comme ligand de ciblage pour imagerie médicale étant décrite dans WO2007/042506 page 13 lignes 30-34.
Alternativement ou cumulativement, les ligands de ciblage amphiphiles s'écrivent avantageusement sous la forme :
dans laquelle :
- Bio est un ligand de ciblage, notamment choisi parmi ceux susmentionnés (c'est-à- dire la partie de reconnaissance biologique, qui est localisée à la surface externe des nanogouttelettes)
- Lipo est un groupe lipophile permettant l'insertion du ligand de ciblage au sein de la couche de tensioactif
L2 est un groupe de liaison, avantageusement choisi parmi :
- d-6 alkylène, PEG par exemple CH2-(CH2-0-CH2)k-CH2 avec k=2 à 10, (CH2)3- NH, NH-(CH2)2-NH, NH-(CH2)3-NH, rien ou une simple liaison, (CH2)n, (CH2)n-CO-
, -(CH2)nNH-CO- avec n nombre entier de 2 à 10 , (CH2CH20)q(CH2)r-CO- , (CH2CH20)q(CH2)r-NH-CO- avec q nombre entier de 1 à 10 et r nombre entier de 2 à 10, (CH2)n-CONH - , (CH2)n-CONH - PEG, (CH2)n-NH- HOOC-CH2-0- (CH2)2-0-(CH2)2-0-CH2-COOH ; HOOC-(CH2)2-∞2-(CH2)2-OCO-(CH2)2- COOH ; HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH; HOOC-(CH2)n-COOH; NH2-(CH2)n-
NH2, avec n nombre entier de 0 à 20; NH2-(CH2)n-C02H ; NH2-CH2 - (CH2-O- CH2)n-C02H avec n nombre entier de 1 à 10, squarate
- P1 -I-P2, P1 et P2 identiques ou différents, étant choisis parmi O, S, NH, rien (liaison simple), CO2, NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH-, NHSO2-, squarate
avec I = alkylène, alkoxyalkylène, polyalkoxyalkylène (notamment PEG), alkylène interrompu par un ou plusieurs squarates ou par un ou plusieurs aryles, avantageusement phényle, alcénylène, alcynylène, alkylène interrompu par un ou plusieurs groupes choisis parmi -NH-, -O-, -CO-, -NH(CO)-, -(CO)NH-, - O(CO)-, ou -(OC)O- ,
- L1 est choisi parmi une liaison simple, -CONH-, -COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS- NH-, -C-S-, -N-NH-CO-, -CO- NH-N-, -CH2-NH-, -N-CH2-, -N-CS-N-, -CO-CH2-S-, -N-CO-CH2-S-, -N-CO-CH2-CH2-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-0-, -O- N=CH- ou répondant aux formules suivantes :
On présente quelques exemples de ligands de ciblage peptidiques ou pharmacophores rendus amphiphiles pour l'ancrage à la surface externe de la nanogouttelette (ci après, ligands de ciblage peptides, dérivés de l'acide folique, dérivés naphtyridine).
La demande présente des exemples illustratifs et non limitatifs de leur synthèse.
• chélate de métal paramagnétique amphiphile
Selon des réalisations la nanoémulsion comprend un chélate de métal paramagnétique amphiphile, de préférence macrocyclique, comportant un noyau hydrophile choisi parmi : DOTA, D03A, HPD03, BTD03A, PCTA, DOTAM, DOTMA, DOTA-GA et leurs dérivés. Avantageusement la partie hydrophile du chélate amphiphile est un chélate macrocyclique choisi parmi : DOTA, D03A, HPD03, BTD03A, PCTA et tout dérivé connu de ces chélates, notamment décrit par exemple dans Mini Reviews in Médicinal Chemistry,2003,vol 3,n °8. Le chélate est rendu amphiphile en le modifiant chimiquement, typiquement par couplage à une ou plusieurs chaînes grasses, de manière à présenter une lipophilie (une lipophilie suffisamment élevée, ou à l'inverse une hydrophilie suffisamment faible), telle qu'il puisse s'ancrer au sein de la couche de tensioactifs de la nanogouttelette et de manière à former une composition lipidique suffisamment stable pour une utilisation diagnostique satisfaisante. On aura par exemple, de manière non limitative, un choix des groupements amphiphiles greffés au chélate tel que la valeur HLB (la balance hydrophile / lipophilie) du chélate soit de l'ordre de 13 à 20 pour les chélates ancrés aux nanoémulsions. Avantageusement le nombre de chélates de lanthanide par nanogouttelette est d'au moins 1000 et typiquement au moins 5000, 10 000, 20 000, 50 000 à 100 000.
• Huile fluorée
Toute huile fluorée appropriée (et/ou mélange d'huiles fluorées) peut être utilisée, incluant des perfluorocarbones linéaires ou ramifiés, ou cycliques ou polycycliques, saturés ou insaturés, des aminés tertiaires cycliques perfluorées, des perfluoro esters ou thioesters, des haloperfluorocarbones et composés connus analogues ou dérivés. Avantageusement au moins 60% des atomes d'hydrogène de l'huile hydrocarbonée correspondante sont remplacés par un atome de fluor. Typiquement ces huiles fluorées sont des chaînes de 2 à 16 atomes, perfluoroalkanes, bis(perfluoroalkyle)alcènes, perfluoréthers, perfluoroamines, perfluoroalkyle bromures, perfluoroalkyle chlorures. Selon des réalisations avantageuses, la nanogouttelette lipidique inclut des perfluorocarbones tels que décrits dans US 5,958,371 , l'émulsion liquide contenant des nanogouttelettes comportant un perfluorocarbone à point d'ébullition assez élevé (par exemple entre 30 et 90 °C, de préférence entre 50 et 150°C, par exemple 142 <Ό pour le PFOB) entouré d'un revêtement composé d'un lipide et/ou d'un surfactant.
Les huiles perfluorées pour émulsions de perfluorocarbone pour imagerie IRM sont rappelées notamment dans les documents US 6 676 963, US 4,927,623, US 5,077,036, US5,1 14,703, US5,171 ,755, US5,304,325, US5,350,571 , US5,393,524, US5,403,575 ; notamment les huiles : perfluorooctylbromide PFOB, C8F17Br (PFOB ou perfluorobron), perfluorooctyléthane (C-sF^C^Hs PFOE), perfluorodecalin FDC, perfluorooctane C8Fi8, perfluorodichlorooctane, bromure de perfluoro-n-octyl, perfluoroheptane, perfluorodécane Ci0F22, perfluorododécyle bromide Ci0F22Br PFDB, perfluorocyclohexane, perfluoromorpholine, perfluorotripropylamine, perfluorotributylamine, perfluorodiméthylcyclohexane, perfluorotriméthylcyclohexane, ester de perfluorodicyclohexyl, perfluoro-n- butyltétrahydrofurane.
On inclut dans la définition des huiles fluorées les huiles de formule Cn F 2n+1 X, XCn ^2n X, où n est un nombre entier variant de 2 à 10, X = Br, Cl ou I
notamment : 1 bromo-F-butane (n-C4 F9 Br), 1 -bromo-F-hexane (n-C6 F13 Br), 1 -bromo-F- heptane (n-C7 Fi5 Br), 1 ,4-dibromo-F-butane et 1 ,6-dibromo-F-hexane.
On inclut aussi des composés fluorés avec des substituants chlorés par exemple: perfluorooctyl chloride (n-C8 Fi7 Cl), 1 ,8-dichloro-F-octane (n-CI C8 Fi6 Cl), 1 ,6-dichloro-F- hexane (n-CIC6 F12 Cl), et 1 ,4-dichloro-F-butane (n-CI C4 F8 Cl).
On inclut aussi les huiles fluorées de formule Cn F 2n+1 OCm F 2m+1 . Cn F 2n+1
CH=CHCm F 2m+1 , par exemple : C4 F9 CH=CHC4 F9 (F-44E), i-C3 F9 CH=CHC6 F13 (F- i36E), C6 F13 CH=CHC6 Fi3 (F-66E)) où n et m sont identiques ou différentes, et sont des entiers compris entre 2 et 12.
On inclut aussi des composés polycycliques ou cycliques tels que : d0 Fi8 (F- decalin ou perfluorodecalin), et des mélanges de perfluoroperhydrophenanthrene et de perfluoro n-butyldecalin.
On inclut aussi des aminés perfluorées, telles que : F-tripropylamine ("FTPA"), F- tributylamine ("FTBA"), F-4-methyloctahydroquinolizine ("FMOQ"), F-N-methyl- decahydroisoquinoline ("FMIQ"), F-N-methyldecahydroquinoline ("FHQ"), F-N- cyclohexylpyrrolidine ("FCHP"), F-2- butyltetrahydrofuran ("FC-75" or "FC-77").
Parmi les mélanges d'huiles fluorés, on citera les mélanges de 10 à 70% d'une première huile, de type PFOB par exemple, et de 30 à 70% d'une seconde huile fluorée.
• Phase aqueuse
La phase aqueuse est avantageusement de l'eau ou une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable telle qu'une solution saline, une solution tampon.
• Proportions des constituants de la composition
Plus spécifiquement la composition de nanoémulsion huile dans eau comprend selon des réalisations avantageuses :
- une phase aqueuse, représentant de préférence 29.4 à 80 % en poids de la composition, avantageusement 55 à 65%, plus avantageusement de 58 à 62%, - une phase fluorée comprenant au moins une huile fluorée, représentant 19.4 à 70% en poids de la composition, avantageusement 35 à 45%, plus avantageusement 37 à 42%,
- un tensioactif (formant la couche de tensioactif) à l'interface entre les phases aqueuse et fluorée, le tensioactif comprenant au moins un composé fluorophile di- ou tri-bloc, au moins un lipide amphiphile et au moins un ligand de ciblage amphiphile,
- la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à l'huile fluorée étant comprise entre 3 et 15%, notamment entre 3 et 12%, avantageusement entre 4 et 8 % ;
- la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à la composition étant comprise entre 0.6 et 7%, avantageusement entre 1 et 3 %.
Avantageusement le ligand de ciblage amphiphile représente 0,1 à 10% en mole du total de tensioactif, avantageusement 0.5 à 5%, notamment 1 à 2 %.
Avantageusement le tensioactif comprend :
- 50% en moles de composés fluorophiles di- ou tri-blocs
- 50% en mol de tensioactifs autres (c'est-à-dire des composés amphiphiles non fluorés).
Avantageusement, les 50% de tensioactifs autres (composés amphiphiles non fluorés) comprennent :
- 50 à 95% en moles de lipide amphiphile,
- 0 à 25% en moles de chélate de métal paramagnétique amphiphile,
- 0.1 à 10% en moles de ligand de ciblage amphiphile.
- 0 à 10% en moles de lipides pegylés
- 0.1 à 0.5% en moles de composés amphiphiles comprenant un fluorophore (par exemple la rhodamine).
Avantageusement, pour une phase fluorée représentant 19.4 à 70%, et notamment 30 à 50% de la composition, le taux massique de tensioactif total par rapport à la phase fluorée est supérieur à 3%, de préférence de 3 à 8 %, encore de préférence de 4 à 6 %.
De préférence, le tensioactif de la composition selon l'invention comprend :
- des composés amphiphiles non fluorés dont 80 à 95% en moles de lipide amphiphile, 0 à 5% en moles de lipides pegylés et 0.1 à 10% en moles de ligand de ciblage amphiphile.
- des composés fluorophiles di- ou tri-blocs ; les composés amphiphiles non fluorés représentant 30 à 60% en moles des tensioactifs totaux, et les composés fluorophiles di- ou tri-blocs représentent 30 à 60% en moles des tensioactifs totaux ;
avantageusement les composés amphiphiles non fluorés représentant 50 % en moles des tensioactifs totaux, et les composés fluorophiles di- ou tri-blocs représentent 50 % en moles des tensioactifs totaux.
Selon des réalisations préférées, la nanoémulsion selon l'invention a pour composition en poids :
1 ) 29.4 à 80% en poids de phase aqueuse, avantageusement 55 à 65%, plus avantageusement de 58 à 62%
2) 19.4 à 70% en poids de phase fluorée comprenant une huile fluorée, avantageusement 35 à 45%, plus avantageusement 37 à 42 %
3) 0.6 à 7% de tensioactif total ou bien 3 à 10% par rapport à la phase fluorée, le tensioactif comprenant :
- des composés amphiphiles non fluorés dont 80 à 95% en moles de lipide amphiphile, 0 à 5% en moles de lipides pegylés et 0.1 à 10% en moles de ligand de ciblage amphiphile, et
- des composés fluorophiles di- ou tri-blocs.
De préférence, les composés amphiphiles non fluorés représentent 30 à 60% en moles des tensioactifs totaux, et les composés fluorophiles di- ou tri-blocs représentent 30 à 60% en moles des tensioactifs totaux (le total des composés amphiphiles non fluorés et des composés fluorophiles di- ou tri-blocs étant de 100%).
De manière préférée les composés amphiphiles non fluorés représentent 50 % en moles des tensioactifs totaux, et les composés fluorophiles di- ou tri-blocs représentent 50 % en moles des tensioactifs totaux.
En particulier, parmi les réalisations ci- dessous les réalisations suivantes sont avantageuses :
% en poids de % en poids % en poids de tensioactif % en poids de tensioactif phase aqueuse d'huile par rapport à l'huile par rapport à la (1 ) (2) (3) composition totale
(4)
3 à 10% de (2)
50-70 29.1 -50 0.9-5 % (*)
3 à 10% de (2)
55-65 33.95-45 1 .05-4.5 %
3 à 10% de (2)
57-61 37-41 1 .1 1 -4.1 %
4 à 8% de (2)
55-65 33.6-45 1 .4-3.6 %
57-61 37-41 4 à 8% de (2) 1 .48-3.28 %
Etant précisé que le total (1 ) + (2) + (4) = 100%
(*) la gamme [0.9 - 5] correspond à 0.03*30 = 0.9 % et 0.1 *50= 5
Ces gammes sont préférées notamment dans la mesure où elles permettent d'obtenir une taille des nanogouttelettes comprise entre 150 et 350 nm, et en particulier autour de 200 à 250 nm.
La taille et la stabilité des nanogouttelettes sont très satisfaisantes, ainsi que la viscosité (de l'ordre de 2 à 3 mPa.s). Leur comportement est newtonien, ce qui constitue un avantage important pour des solutions pharmaceutiques injectables.
On a par exemple les gammes de proportions suivantes des constituants.
Mode de Mode de Mode de réalisation A réalisation B réalisation C
Phase aqueuse de la 29.4 à 80, 29.4 à 80, 29.4 à 80, composition de préférence de préférence de préférence
55 à 65, 55 à 65, 55 à 65, de préférence de préférence de préférence 59 59 59
Phase fluorée 19.4 à 70, 19.4 à 70, 19.4 à 70, en % de la composition de préférence de préférence de préférence
35 à 45, 35 à 45, 35 à 45, de préférence de préférence de préférence 39 39 39 Teneur (% molaire) 3 à 10, 3 à 10, 3 à 10, en tensioactifs de préférence de préférence de préférence par rapport à la phase fluorée 4 à 8 4 à 8 4 à 8
Teneur (% molaire) 40 à 60 %, 40 à 60 %, 40 à 60 %, en composés fluorophiles di- ou de préférence de préférence de préférence tri-blocs 50% 50% 50%
des tensioactifs
Teneur % molaire 40 à 60 %, 40 à 60 %, 40 à 60 %, des composés amphiphiles non de préférence de préférence de préférence fluorés 50% 50% 50%
des tensioactifs
Teneur % molaire 60 à 95 50 à 95 0
en lipides amphiphiles
des composés amphiphiles non
fluorés (a)
Teneur % molaire 0 à 25 0 à 25 0 à 99.95 en chélates de métal
paramagnétique amphiphiles
des composés amphiphiles
non fluorés (b)
Teneur % molaire 0 5 à 15 0 à 5 en lipides pégylés
des composés amphiphiles non
fluorés
(c)
Teneur % molaire 0.1 à 0.5% 0.1 à 0.5% 0.1 à 0.5% en composé amphiphile
comprenant un fluorophore
des composés amphiphiles non
fluorés (d)
Teneur % molaire 0.1 à 10 0.1 à 10 0.1 à 10 en ligands de ciblage de préférence de de préférence de préférence amphiphiles 0.5 à 3% de 0.5 à 3% de 0.5 à 3% des composés amphiphiles non
fluorés (e) Dans les modes de réalisation du tableau ci-dessus, l'ensemble [lipides amphiphiles, chélates de métal paramagnétique amphiphiles, lipides pégylés, ligands de ciblage amphiphiles] correspondant aux composés amphiphiles non fluorés, le total (a) + (b) + (c) + (d) + (e) est de 100%.
• Procédé de préparation
On rappelle que les émulsions sont des mélanges lipidiques hétérogènes obtenues de manière appropriée notamment par agitation mécanique et/ou addition d'agents émulsifïants.
Par exemple, les [ligand de ciblage amphiphile / lipide amphiphile / éventuel chélate de métal paramagnétique amphiphile / éventuel lipides pegylés / éventuel composés amphiphiles comprenant un fluorophore] sont dispersés dans la phase aqueuse sous agitation magnétique et à l'aide d'ultrasons. Le composé fluorophile di- ou tri-bloc est ensuite ajouté à cette phase aqueuse puis l'huile fluorée est introduite goutte à goutte en pré-émulsifiant à l'Ultraturax par exemple. La pré-émulsion est alors finalisée au microfluidiseur et filtrée sur 0.45 μηι. · Utilisation de la composition selon l'invention
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne aussi un agent de contraste comprenant une composition telle que décrite précédemment.
Les ligands de ciblage amphiphiles cités sont essentiellement à vocation diagnostique. La composition selon l'invention est donc utile pour le diagnostic, notamment par imagerie par résonance magnétique (IRM). On peut toutefois préparer des nanoémulsions pour le traitement thérapeutique. Les nanogouttelettes comprendront alors d'une part un ligand de ciblage amphiphile ancré dans la couche de tensioactif permettant d'atteindre la cible biologique (la zone pathologique), notamment tel que défini ci-dessus, et d'autre part un principe actif utilisé comme médicament pour le traitement thérapeutique et encapsulé dans les gouttelettes d'huile fluorée dans le cas de principes actifs solubles dans l'huile fluorée.
Il est précisé que comme compte tenu notamment du volume injectable aux patients, de l'ordre de 10 à 50 ml, l'huile fluorée est généralement utilisée à un taux suffisamment élevé, d'au moins 20% par rapport au poids total de la composition, afin d'avoir une solution suffisamment concentrée et un signal en IRM suffisant. Il est important d'avoir une concentration adaptée pour la durée d'injection, le moment de l'acquisition du signal et le traitement associé des données par le praticien. Une solution trop diluée la rendrait généralement inutilisable pour les examens d'imagerie médicale.
Les compositions (nanoémulsions) du demandeur ont une taille de gouttelettes suffisamment petite pour leur permettre de circuler dans les milieux biologiques sans dégradation du produit, jusqu'à la cible du ligand de ciblage fixé aux gouttellettes. La taille est typiquement de 50 à 400 nm, avantageusement 100 à 350 nm, notamment 150 à 300 nm, en particulier 200 à 250 nm.
Les nanogouttelettes comprennent chacune un nombre de ligands de ciblage de l'ordre de 100 à 5000, notamment 500 à 2000, ce qui permet le ciblage efficace selon l'affinité et la multivalence du ligand de ciblage. Les résultats biologiques obtenus grâce aux nouvelles nanoémulsions du demandeur montrent de plus que les ligands de ciblage sont avantageusement répartis sur l'ensemble de la surface externe des nanogouttelettes, ce qui se traduit par une multivalence optimisée des ligands de ciblage.
Les ligands de ciblage amphiphiles représentent avantageusement 0.1 à 10% en moles du total des tensioactifs, avantageusement 0.5 à 5%, notamment 0.5 à 3 %. Le produit de contraste injecté ayant les compositions de nanoémulsions décrites ont une affinité avantageusement de l'ordre de 1 pM à 100 nM, notamment 1 pM à 10 nM, avantageusement 1 pM à 1 nM (l'affinité par ligand de ciblage amphiphile, est multipliée par le nombre de ligands de ciblage par nanogouttelette).
Avantageusement la composition comprend 0,001 à 0.1 % en poids de ligand de ciblage amphiphile, notamment 0,01 à 0,1 %. Les nanoémulsions du demandeur ont en outre l'avantage de pouvoir contrôler le type et la quantité de ligands de ciblage, et notamment de pouvoir incorporer des ligands de ciblage différents. Par exemple une nanogouttelette comprendra :
- un ligand de ciblage amphiphile qui permet l'accès à une zone physiologique pathologique, par exemple un ligand de ciblage de passage à travers la BHE (barrière hémato encéphalique),
- un autre ligand de ciblage amphiphile de ciblage qui permet ensuite le ciblage d'un marqueur biologique cible surexprimmé par certaines cellules de cette zone pathologique.
Les interactions moléculaires entre le ligand de ciblage et le marqueur biologique cible permettent la captation des nanogouttelettes au niveau de la zone pathologique, et l'imagerie IRM qui en résulte permet de localiser précisément la zone pathologique.
La composition formant l'agent de contraste est administrée de préférence en intravasculaire, selon le patient examiné. Les compositions lipidiques obtenues sont le cas échéant formulées à l'aide d'additifs connus rappelés par exemple dans US 6 010 682, notamment pour une administration par injection intraveineuse. On citera notamment des agents épaississants, des saccharides ou polysaccharides, le glycérol, le dextrose, le chlorure de sodium, des antimicrobiens.
Avantageusement grâce aux compositions selon l'invention on peut obtenir typiquement les caractéristiques suivantes, pouvant varier selon les compositions précises des émulsions et leur procédé de préparation :
- viscosité cinématique (cSt) : 1 à 4
- osmomalité (miliosmol) : 250 à 350
- nombre de ligands de ciblage : 50 à 1000, notamment 100 à 3000
- diamètre : 10 à 300 nm
L'invention concerne aussi :
- un produit de contraste, de préférence pour IRM, comprenant les compositions de nanoémulsions de la demande
- les nanoémulsions de demandeur pour leur utilisation dans le diagnostique, et notamment dans le diagnostique de maladies, notamment cancéreuses, inflammatoires, neurodégénératives, cardiovasculaires.
L'invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent.
Exemple 1 : Synthèse d'un lipophile RGD linéaire (ligand de ciblage amphiphile)
Etape 1
100mg (0,15mmol) de peptide H-Gly-(D)-Phe-(L)-Val-(L)-Arg-Gly-(L)Asp-NH2 (H- GfVRGD-NH2) acheté chez Bachem sont dissous sous argon dans 3ml de DMSO séché sur tamis. 23μΙ de 3,4-Diethoxy-3-cyclobutene-1 ,2-dione (0.15mmol ; l équiv) et 25μΙ de triéthylamine sont ajoutés. Le milieu réactionnel est laissé une nuit à 40^ avant d'être précipité dans 40ml d'éther diéthylique. Après filtration, on obtient 98mg d'une poudre blanche (Rendement : 84%)
C34H48N1o011 ; m/z = 773 (ES+)
Eta e 2
95mg de l'intermédiaire obtenu en a) (0,12mmol ; l équiv) et 430mg (0,15mmol, 1 ,25 eq) de 1 ,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium sait) sont dissous dans 3 ml_ de DMSO séché sur tamis en présence de 25μΙ de triéthylamine. Le milieu réactionnel est agité 48h à température ambiante avant d'être précipité dans 40ml d'éther diéthylique. Après filtration, on obtient 400mg d'une poudre blanche. Le produit ainsi obtenu est ensuite purifié par flash sur cartouche C4 avec un gradient formiate d'ammonium 10mM pH6 / Methanol. On obtient 260mg d'une poudre blanche (Rendement : 62%).
C164H305N12O64P ; MALDI-TOF: Mode positif m/z = 3501
Exem le 2 : Synthèse d'un lipophile RGD cyclique (ligand de ciblage amphiphile)
Même mode opératoire que pour l'exemple 4 en partant de 90mg de peptide cyclique RGDfK acheté chez Bachem. C163H302N11 O63P ; MALDI-TOF: Mode positif m/z = 3456
Exemple 3 : Synthèse d'un lipophile avec un peptidomimétique du RGD comprenant un groupe naphtyridine (ligand de ciblage amphiphile)
Schéma de synthèse :
Première étape :
1 g de Tint 1 est dissout dans 5 ml de CH2CI2. 5ml de TFA sont ajoutés au milieu. Laisser 3h à TA puis évaporer à sec. Reprendre dans 2*40 ml d'éther iso, récupérer une huile que l'on sèche par évaporation.
Mobt = 0,8 g ; Rdt = 90% ; MALDI-TOF: Mode positif m/z = 564
Deuxième étape :
Dissoudre l'acide dans le DMF puis introduire HOBT et EDCI et laisser 1 h sous argon. Rajouter Tint 2 et la DIPEA ; laisser 18h à TA sous argon. Après évaporation l'huile est reprise dans CH2CI2 et lavée par une solution diluée de Na2C03 ; après évaporation obtention d'une huile.
Mobt = 0,600 g; Rdt =77%; M/Z = 780 Troisième étape :
Dissoudre Tint 3 dans le méthanol et introduire la solution dans l'autoclave de 125 ml ; rajouter le catalyseur et laisser 3h sous pression d'hydrogène (P= 5 bars)
Après filtration du catalyseur et évaporation, obtention d'une huile que l'on lave par 50 ml d'éther iso.
Attention à l'absorption possible de l'aminé sur le catalyseur (travailler avec le mini de catalyseur).
Mobt = 0,300 g ; Rdt =60% ; HPLC = 90% ; M/Z = 646 Quatrième étape
à TA sous argon. Verser dans de l'ether : obtention d'une pate blanche.
Mobt = 0,330 g ; Rdt =97%; M/Z = 770
Cinquième étape :
Dissoudre Tint 5 dans le DMSO, rajouter 3 gouttes de solution saturée en Na2C03 => solution A.
La DSPE est introduite dans 5ml de DMSO (solution partielle) : ajouter 1 ml d'eau => toujours trouble blanc.
Introduire la solution DSPE à la solution A : obtention d'un milieu trouble qui est agité 24h. Rajouter 1 ,5ml d'eau et laisser encore 24h à TA : le milieu devient homogène.
Après évaporation de l'eau, le résidu est lavé par 3*50 ml d'éther (permet d'éliminer le DMSO) : la pate obtenue est solubilisée dans 50 ml de CH2CI2 et le trouble est éliminé par filtration.
Le produit est purifié par une silice, éluant CH2CI2 (faire un fractionnement fin). Après avoir rassemblé et évaporé les fractions conformes : obtention de cristaux.
REMARQUE : Le produit obtenu est sous la forme acide par coupure de l'ester de methyl par la présence de Na2C03 => Confirmation en MALDI
Mobt = 0,170 g ;Rdt =17% ; M/Z = 3484 (ester de METHYL PM=3498) Exemple 4 : synthèse d'un complexe de Gd amphlphlle (chélate de métal
paramagnétoqie amphiphile)
Schéma de synthèse :
Octadécylamine
Molecular Weight =269.52
Int 1 Molecular Formula =C18H39N
9N308
In N5O8
Ouverture du DTPA bis anhydride par l'octadécylamine :
Molecular Weight =269.52
Int 1 Molecular Formula =C18H39N
Molecular Weight =896.36 Molecular Formula =C50H97N5O8
Le DTPA bis anhydride est mis en suspension dans le DMF. La suspension est chauffée à 50 'Ό et il y a passage en solution. L'octadécylamine est ajouté en une seule fois. La réaction est maintenue 1 nuit à 50°C. Durant la réaction, on voit la dissolution lente de l'aminé dans le DMF puis la précipitation du produit désiré.
Le milieu réactionnel est refroidi puis filtré sur fritté. Le précipité est lavé une fois au DMF puis abondamment au méthanol.
13.5 g de poudre jaune-blanche sont obtenus avec un rendement de 90%.
L'analyse de spectrométrie de masse se fait par infusion de l'échantillon
Le produit peut être dissout dans le méthanol ou le toluène en rajoutant du TFA. Complexation du ligand en milieu organique
Molecular Weight =896.36
Molecular Formula =C50H97N5O8
Le ligand (Int3) est mis en suspension dans le méthanol. Le GdCI3,6H20 est ajouté. Il y a solubilisation instantanément. Le pH de la solution est ajusté à 7 à l'aide d'une solution de méthanolate de sodium dans le méthanol. La solution est portée au reflux pendant 45 min. Le méthanol est évaporé et le résidu repris à l'eau. La poudre est lavée abondamment à l'eau. 15 g de produit brut sont obtenus avec un rendement de 96%.
L'analyse de spectrométrie de masse se fait par infusion de l'échantillon en ES+.
Le produit peut être dissout dans le méthanol avec du dichlorométhane.
Purification : Le produit est purifié par chromatographie flash sur gel de silice. On purifie 15 g avec une phase éluante composée de 90/10 en méthanol-dichlorométhane.
Après purification, 10 g de produit pur sont obtenus (poudre blanche grasse) Rendement de purification = 67% Exemple 5 : synthèse d'une émulsion de PFOB avec le composé fluorophile dibloc F6H10 et le ligand de ciblage amphiphile de l'exemple 3
1 .18 g g de phosphatidylcholine de jaune d'œuf (EPC) (Lipoïd), 220 mg de DSPE-PEG 2000 (Lipoïd) et 1 10 mg du composé de l'exemple 3, sont dispersés sous agitation magnétique dans 30 ml d'eau à 2,5 % m/m de glycérol pendant 2 heures après avoir été passé dans un bain à ultrasons 20 minutes.
Après ajustage au pH physiologique, 740 mg de dibloc F6H10 sont ajoutés. Enfin 20 g de PFOB sont introduits lentement goutte à goutte en pré-émulsionnant à l'ultraturax. La pré-émulsion est finalisée au microfluidiseur puis filtrée sur 0,45μηι.
Cette composition correspond à une émulsion 40 % (m/m) de PFOB. La composition en tensioactifs est de 1 1 % (m/m) de tensioactifs par rapport au PFOB ou bien 16 mmol de tensioactif pour 100 g de PFOB. Les proportions molaires dans les tensioactifs sont les suivantes : 50% de F6H10 et 50% de tensioactifs non fluorés. La composition molaire en tensioactifs non fluorés est de 93% d'EPC, 5% de DSPE-PEG 2000 et 2% du composé de l'exemple 3.
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 196 nm mesurée au Nanosizer ZS de chez Malvern.
Exemple 6 : synthèse d'une émulsion de PFOB avec le composé fluorophile dibloc F6H10 et le ligand de ciblage amphiphile de l'exemple 3 avec une composition différente de celle de l'exemple 5
Le protocole de synthèse est identique à l'exemple 5 mais en utilisant la composition suivante:
20 g de PFOB
590 mg d'EPC
1 10 mg de DSPE-PEG 2000
28 mg de composé de l'exemple 3
370 mg de dibloc F6H10
30 ml de phase aqueuse
Le PFOB et le dibloc F6H10 ont été préalablement purifiés suivant la procédure décrit dans M. Le Blanc et al., Pharmaceutical research, 246-248 (1985)
Cette composition correspond à une émulsion 40 % (m/m) de PFOB. La composition en tensioactifs est de 5.5 % (m/m) de tensioactifs par rapport au PFOB ou bien 8 mmol de tensioactif pour 100 g de PFOB. Les proportions molaires dans les tensioactifs sont les suivantes : 50% de F6H10 et 50% de tensioactifs non fluorés. La composition molaire en tensioactifs non fluorés est de : 94 % d'EPC, 5% de DSPE-PEG 2000 et 1 % du composé de l'exemple 3.
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 225 nm mesurée au Nanosizer ZS de chez Malvern.
Exemple 7 : synthèse d'une émulsion de PFOB avec le composé fluorophile dibloc F6H10 et le ligand de ciblage amphiphile de l'exemple 1
Protocole de synthèse identique à l'exemple 5 mais en utilisant le composé de l'exemple 1 à la place de celui de l'exemple 3.
5 g de PFOB
145 mg d'EPC
30 mg de DSPE-PEG 2000
15 mg de composé de l'exemple 1
92 mg de dibloc F6H10
20 ml de phase aqueuse
Cette composition correspond à une émulsion 20 % (m/m) de PFOB. La composition en tensioactifs est de 5.5 % (m/m) de tensioactifs par rapport au PFOB ou bien 8 mmol de tensioactif pour 100 g de PFOB. Les proportions molaires dans les tensioactifs sont les suivantes : 50% de F6H10 et 50% de tensioactifs non fluorés. La composition molaire en tensioactifs non fluorés est de : 93% d'EPC, 5% de DSPE-PEG
2000 et 2% du composé de l'exemple 1 .
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 178 nm mesurée au Nanosizer ZS de chez Malvern.
Exemple 8 : Synthèse d'une émulsion de PFOB avec le composé fluorophile dibloc F6H10 et le ligand de ciblage amphiphile de l'exemple 1 avec un faible % de tensioactifs
Protocole identique à l'exemple 5 mais en incorporant les quantités suivantes de tensioactifs :
5 g de PFOB
75 mg d'EPC
15 mg de DSPE-PEG 2000
7 mg de composé de l'exemple 1
46 mg de dibloc F6H10
20 ml de phase aqueuse Cette composition correspond à une émulsion 20 % (m/m) de PFOB. La composition en tensioactifs est de 2.75 % (m/m) de tensioactifs par rapport au PFOB ou bien 4 mmol de tensioactif pour 100 g de PFOB. Cette composition n'est pas dans la gamme [3%-15% massique]. Les proportions molaires dans les tensioactifs sont les suivantes : 50% de F6H10 et 50% de tensioactifs non fluorés. La composition molaire en tensioactifs non fluorés est de : 93% d'EPC, 5% de DSPE-PEG 2000 et 2% du composé de l'exemple 3.
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 260 nm mesurée au Nanosizer ZS de chez Malvern
Exemple 9 : Synthèse d'une émulsion de PFOB avec le composé fluorophile dibloc F6H10 et le ligand de ciblage amphiphile de l'exemple 1 avec une étape solvant.
La composition est identique à celle de l'exemple 7 mais le mode opératoire inclus un solvant organique :
L'EPC, le DSPE-PEG 2000, le composé de l'exemple 1 et le dibloc F6H10 sont dissous dans un mélange chloroforme / méthanol (7/3). La phase organique est évaporée dans un rotavapor . Le film obtenu est repris dans la phase aqueuse puis le PFOB est ajouté à la solution. Cette solution est passée à l'Ultraturax puis au microfluidiseur et enfin filtrée sur 0.45 μηι.
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 336 nm.
Exemple 10 : synthèse d'une émulsion PFOB avec ajout de rhodamine.
Le protocole est identique à celui de l'exemple 5 avec les quantités suivantes de tensioactifs :
20 g de PFOB
580 mg d'EPC
1 10 mg de DSPE-PEG 2000
55 mg de composé de l'exemple 3
370 mg de dibloc F6H 10
2 mg de DSPE - rhodamine (Lipoïd)
30 ml de phase aqueuse
Cette composition correspond à une émulsion 40 % (m/m) de PFOB. La composition en tensioactifs est de 5.5 % (m/m) de tensioactifs par rapport au PFOB ou bien 8 mmol de tensioactif pour 100 g de PFOB. Les proportions molaires dans les tensioactifs sont les suivantes : 50% de F6H10 et 50% de tensioactifs non fluorés. La composition molaire en tensioactifs non fluorés est de : 92.8% d'EPC, 5% de DSPE-PEG 2000, 2% du composé de l'exemple 3 et 0.2% de DSPE-rhodamine.
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 198 nm mesurée au Nanosizer ZS de chez Malvern
Exemple 11 : synthèse d'une émulsion PFOB avec rhodamine et complexe de Gd :
Le protocole est identique à celui de l'exemple 5 avec les quantités suivantes de tensioactifs : 20 g de PFOB
460 mg d'EPC
1 10 mg de DSPE-PEG 2000
370 mg de dibloc F6H10
2 mg de DSPE - rhodamine (Lipoïd)
168 mg du composé de l'exemple 4
30 ml de phase aqueuse
Cette composition correspond à une émulsion 40 % (m/m) de PFOB. La composition en tensioactifs est de 5.5 % (m/m) de tensioactifs par rapport au PFOB ou bien 8 mmol de tensioactif pour 100 g de PFOB. Les proportions molaires dans les tensioactifs sont les suivantes : 50% de F6H10 et 50% de tensioactifs non fluorés. La composition en tensioactifs non fluorés est de : 74.8% d'EPC, 5% de DSPE-PEG 2000, 0.2% de DSPE- rhodamine et 20% de complexe de Gd.
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 210 nm mesurée au Nanosizer ZS de chez Malvern
Exemple 12 : synthèse d'une émulsion de PFOB sans dibloc avec le ligand spécifique de l'exemple 1 (exemple comparatif)
Le protocole est identique à celui de l'exemple 5 cependant le dibloc F6H10 n'est pas ajouté. Les différents composés sont introduits dans les quantités suivantes :
5 g de PFOB
285 mg d'EPC
15 mg de DSPE-PEG 2000
7 mg de composé de l'exemple 1
20 ml de phase aqueuse Cette composition correspond à une émulsion 20 % (m/m) de PFOB. La composition en tensioactifs est de 6 % (m/m) de tensioactifs par rapport au PFOB ou bien 7 mmol de tensioactif pour 100 g de PFOB. Les proportions molaires dans les tensioactifs sont les suivantes : 98 % d'EPC, 1 .5 % de DSPE-PEG 2000 et 0.5 % du composé de l'exemple 1 .
L'émulsion obtenue est caractérisée par un diamètre hydrodynamique de 134 nm mesurée au Nanosizer ZS de chez Malvern.
Exemple 13 : synthèse d'une émulsion de crown ether
Le protocole et la composition sont identiques à l'exemple 5 en remplaçant le PFOB par le perfluoro 15- crown-5 ether.
Exemple 14 : suivi en stabilité des émulsions des exemples 5, 7, 8, 9, 12
Le tableau suivant rapporte les mesures de diamètre hydrodynamique mesuré au Nanosizer ZS de chez Malvern à t = 0, 3, 9 et 12 mois.
Les émulsions des exemples 5, 7 et 8 présentent une bonne stabilité à 12 mois malgré une légère augmentation de taille.
Exemple 14 : mesure d'IC50 des émulsions des exemples 5, 7, 8, 9 et 12.
La mesure d'IC50 des émulsions est réalisée 3 par des mesures de compétitions avec νβ3 sur des cellules HUVEC surexprimant de l'Echistatine 25l.
La suspension des HUVEC est distribuée dans une plaque 96 puits à fond conique, à raison de 2.105 cellules dans 50 μ\- en tampon de binding. Cinquante μ\- des solutions de concentration croissante d'échistatine ou des produits RGD sont ajoutés par puits. Le contrôle positif est réalisé par l'ajout de tampon de binding sans compétiteur. L'ensemble des points de concentration est réalisé en duplicat. La plaque est incubée 2 h à température ambiante sous agitation. Cinquante μ\- de la solution d'échistatine- 25l-SIB à 3 nM sont alors distribués dans chaque puits et la plaque est de nouveau incubée 2 h à température ambiante sous agitation. Les mélanges réactionnels sont transférés dans des ampoules contenant 200 μ\- d'un coussin de densité composé de paraffine et de dibutylphtalate (10/90). Les microtubes sont ensuite centrifugés à 12 000 rpm pendant 3 min. Les tubes sont finalement congelés dans l'azote liquide, puis sectionnés afin de compter le culot cellulaire et le surnageant au compteur gamma. Une courbe de compétition est alors tracée où la fixation relative de l'échistatine 25l-SIB est déterminée par l'équation suivante :
Radioactivité fixée en présence de compétiteur (cpm)
Fixation relative de l'échistatine-l 25-SIB = Radioactivité de rértantiien contrôle (cpm) X 100
Les données sont analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism® 5.0 qui détermine les valeurs IC50 pour chaque produit à partir de la courbe de compétition.
Composé IC50 (nM d'émulsion)
Exemple 5 0.002
Exemple 7 4
Exemple 8 6
Exemple 9 0.7
Exemple 12 75

Claims

REVENDICATIONS
1 . Composition de nanoémulsion huile dans eau, comprenant :
- une phase aqueuse,
- une phase fluorée comprenant au moins une huile fluorée,
- un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et fluorée, le tensioactif comprenant :
- au moins un ligand de ciblage amphiphile dont le ligand de ciblage est choisi parmi les pharmacophores, les peptides, les pseudopeptides, les peptidomimétiques, les acides aminés, les peptides et pseudopeptides, peptidomimétiques de ciblage d'intégrines, les glycoprotéines, les lectines, la biotine, les dérivés ptéroïques ou aminoptéroïques, l'acide folique, les dérivés de l'acide folique et antifolique, les anticorps ou fragments d'anticorps, l'avidine, les stéroïdes, les oligonucléotides, les séquences d'acide ribonucléique, les séquences d'acide désoxyribonucléique, les hormones, les protéines éventuellement recombinantes ou mutées, les mono- ou polysaccharides, les agents de ciblage de récepteurs cellulaires ou d'enzymes,
- au moins un lipide amphiphile, et
au moins un composé fluorophile di- ou tri-bloc de formule RF -L-RH (-Z)Z dans laquelle :
1 ) RF est un groupe fluoré ou perfluoré (qui comprend ou non des chaînes latérales et/ou des cycles et/ou des hétéroatomes notamment des halogènes),
2) RH est un groupe hydrocarboné qui comprend ou non des chaînes latérales et/ou des cycles et/ou des hétéroatomes notamment des halogènes et/ou des liaisons multiples,
3) L est un groupe de liaison et peut comprendre notamment un des groupes suivants : liaison simple, -CH2-, -CH=CH-, -O-, -S-, -P04 -, CONH,
4) Z est H ou un groupe plus polaire ou polarisable que les groupes RH ,
5) z représente 0 ou 1 .
2. Composition selon la revendication 1 dans laquelle le composé fluorophile di- ou tri-bloc est choisi parmi :
les composés de formule C n F 2n+1 C m H 2m+1 (saturé), ou de formule C n F 2n+1 C m H 2m-1 (insaturé), ou leurs combinaisons, n étant un nombre entier de 2 à 12 et m étant un entier de 2 à 16, les composés de formule Cp H 2p+1 -C n F2n - C m H 2m+1 > avec p=1 -12, m=1 -12 et n=2-12,
les composés de formule Cn F 2n+1 - CH = CH - C m H 2m+1 , avec n et m identiques ou différents comprise entre 2 et 1 2,
- les composés éthers ou polyéthers substitués de formule XC n ^2r\ OCm H2m X, XCF20Cn H2n OCF2 X, avec n et m=1 -4, X=Br, Cl ou I,
les composés diblocs ou triblocs éthers de formule :
• a) C n F 2n+1 -O-C m H 2m+1 , avec n=2-10; m=2-16 ou
• b) Cp H 2p+1 -O-Cn F2n -O-C m H 2m+1 > avec p=2-12, m=1 -1 2 et n=2-12,
où, dans chaque formule, n, m et p sont des nombres entiers.
3. Composition selon l'une des revendications 1 à 2 comprenant :
- une phase aqueuse, représentant de préférence 29.4 à 80 % en poids de la composition, avantageusement 55 à 65%, plus avantageusement de 58 à 62%,
- une phase fluorée comprenant au moins une huile fluorée, représentant 19.4 à 70% en poids de la composition, avantageusement 35 à 45%, plus avantageusement 37 à 42%,
- un tensioactif à l'interface entre les phases aqueuse et fluorée, le tensioactif comprenant un composé fluorophile di- ou tri-bloc, au moins au moins un lipide amphiphile et au moins un ligand de ciblage amphiphile,
- la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à l'huile fluorée étant comprise entre 3 et 1 0%, avantageusement entre 4 et 8 %,
- la teneur totale en tensioactif en poids par rapport à la composition étant comprise entre 0.6 et 7%, avantageusement entre 1 et 3 %.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 dans laquelle le tensioactif comprend:
- des composés amphiphiles non fluorés dont 80 à 95% en moles de lipide amphiphile, 0 à 5% en moles de lipides pegylés et 0.1 à 10% en moles de ligand de ciblage amphiphile.
- des composés fluorophiles di- ou tri-blocs ;
les composés amphiphiles non fluorés représentant 30 à 60% en moles des tensioactifs totaux, et les composés fluorophiles di- ou tri-blocs représentent 30 à 60% en moles des tensioactifs totaux ; avantageusement les composés amphiphiles non fluorés représentant 50 % en moles des tensioactifs totaux, et les composés fluorophiles di- ou tri-blocs représentent 50 % en moles des tensioactifs totaux. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4 dans laquelle :
1 ) le tensioactif comprend :
- 50% en moles de composés fluorophiles di- ou tri-blocs,
- 50% en mol de composés amphiphiles non fluorés,
2) les 50% de composés amphiphiles non fluorés comprennent :
- 50 à 95% en moles de lipide amphiphile,
- 0 à 25% en moles de chélate de métal paramagnétique amphiphile,
- 0.1 à 10% en moles de ligand de ciblage amphiphile,
- 0 à 10% en moles de lipides pegylés,
- 0.1 à 0.
5% en moles de composés amphiphiles comprenant un fluorophore.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5 dans laquelle l'huile fluorée est choisie parmi les perfluorocarbones linéaires ou ramifiés, ou cycliques ou polycycliques, saturés ou insaturés, des aminés tertiaires cycliques perfluorées, des perfluoro esters ou thioesters, des haloperfluorocarbones ; et avantageusement : perfluorooctylbromide PFOB, C8Fi7Br (PFOB ou perfluorobron), perfluorooctyléthane (C8F17C2H5 PFOE), perfluorodecalin FDC, perfluorooctane C8Fi8, perfluorodichlorooctane, bromure de perfluoro-n-octyl, perfluoroheptane, perfluorodécane Ci0F22, perfluorododécyle bromide Ci0F22Br PFDB, perfluorocyclohexane, perfluoromorpholine, perfluorotripropylamine, perfluorotributylamine, perfluorodiméthylcyclohexane, perfluorotriméthylcyclohexane, ester de perfluorodicyclohexyl, perfluoro-n- butyltétrahydrofuran.
7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6 dans laquelle le ligand de ciblage du ligand de ciblage amphiphile est un composé naphtyridine.
8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7 dans laquelle le ligand de ciblage amphiphile s'écrit sous la forme :
Bio - !_! - l_2 - Lipo
dans laquelle :
- Bio est un ligand de ciblage,
- Lipo est un groupe lipophile permettant l'insertion du ligand de ciblage au sein de la couche de tensioactif,
- L2 est un groupe de liaison, avantageusement choisi parmi :
- Ci-6 alkylène, PEG par exemple CH2-(CH2-0-CH2)k-CH2 avec k=2 à 10, (CH2)3- NH, NH-(CH2)2-NH, NH-(CH2)3-NH, rien ou une simple liaison, (CH2)n, (CH2)n-CO- , -(CH2)nNH-CO- avec n nombre entier de 2 à 10 , (CH2CH20)q(CH2)r-CO- , (CH2CH20)q(CH2)r-NH-CO- avec q nombre entier de 1 à 10 et r nombre entier de 2 à 10, (CH2)n-CONH - , (CH2)n-CONH - PEG, (CH2)n-NH- HOOC-CH2-0- (CH2)2-0-(CH2)2-0-CH2-COOH ; HOOC-(CH2)2-C02-(CH2)2-OCO-(CH2)2- COOH ; HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH; HOOC-(CH2)n-COOH; NH2-(CH2)n- NH2, avec n nombre entier de 0 à 20; NH2-(CH2)n-C02H ; NH2-CH2 - (CH2-O- CH2)n-C02H avec n nombre entier de 1 à 10, squarate,
- P1 -I-P2, P1 et P2 identiques ou différents, étant choisis parmi O, S, NH, rien (liaison simple), ∞2, NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH-, NHSO2-, squarate,
avec I = alkylène, alkoxyalkylène, polyalkoxyalkylène (notamment PEG), alkylène interrompu par un ou plusieurs squarates ou par un ou plusieurs aryles, avantageusement phényle, alcénylène, alcynylène, alkylène interrompu par un ou plusieurs groupes choisis parmi -NH-, -O-, -CO-, -NH(CO)-, -(CO)NH-, -
O(CO)-, ou -(OC)O-,
- I_! est choisi parmi une liaison simple, -CONH-, -COO-, -NHCO-, -OCO-, -NH-CS-NH-, -C-S-, -N-NH-CO-, -CO- NH-N-, -CH2-NH-, -N-CH2-, -N-CS-N-, -CO-CH2-S-, -N-CO- CH2-S-, -N-CO-CH2-CH2-S-, -CH=NH-NH-, -NH-NH=CH-, -CH=N-0-, -0-N=CH- ou répondant aux formules suivantes :
9.- Agent de contraste comprenant une composition selon l'une quelconq revendications 1 à 8.
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