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WO2008155393A1 - Utilisation d'hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pour la préparation d'une composition destinée à agir comme agent anti-coccidien - Google Patents

Utilisation d'hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pour la préparation d'une composition destinée à agir comme agent anti-coccidien Download PDF

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WO2008155393A1
WO2008155393A1 PCT/EP2008/057808 EP2008057808W WO2008155393A1 WO 2008155393 A1 WO2008155393 A1 WO 2008155393A1 EP 2008057808 W EP2008057808 W EP 2008057808W WO 2008155393 A1 WO2008155393 A1 WO 2008155393A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
radical
use according
hydrogen atom
composition
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2008/057808
Other languages
English (en)
Inventor
Michèle MEYER
Christian Vivares
Augustin Ephrem Nkengfack
Anatole Guy Blaise Azebaze
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Museum National dHistoire Naturelle
Universite Clermont Auvergne
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Museum National dHistoire Naturelle
Universite Clermont Auvergne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Museum National dHistoire Naturelle, Universite Clermont Auvergne filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2008155393A1 publication Critical patent/WO2008155393A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C07D311/82—Xanthenes
    • C07D311/84—Xanthenes with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 9
    • C07D311/86—Oxygen atoms, e.g. xanthones

Definitions

  • the present invention relates to the use of oxygenated heterocycles chosen from xanthones and biflavonoids for the preparation of a composition intended to act as an anti-coccidial agent, the coccidia being advantageously chosen from the group consisting of Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia and Neospora.
  • the composition is intended for the prevention or treatment of coccidiosis in humans or animals.
  • such a composition is intended to be administered orally.
  • the present invention also relates to a novel compound of formula (Ia), laurentinone A.
  • Animal coccidiosis in particular is a serious problem in animal pathology, whether for poultry, cattle or rabbit. They are due to protozoa of the Phylum Apicomplexa, class Sporozoa. In the poultry industry, coccidiosis causes considerable economic losses (US $ 800 million per year in 2002). A dozen species parasitize the chicken. The most common are: Eimeria tenella (bloody diarrhea), Eimeria necatrix (intestinal bloody diarrhea) and Eimeria acervulina, as well as Eimeria maxima (chronic intestinal coccidiosis). The number of species for the turkey is seven, the most important of which are: Eimeria meleagrimitis (located in the jejunum) and Eimeria adenoeides (located in the lower ileum, caeca and rectum).
  • Coccidiosis in rabbit are also important.
  • the species responsible are at the intestinal level: Eimeria intestinalis and Eimeria flavescens, and at the hepatic level: Eimeria sitesdai. Diarrhea causes weight loss and mortality.
  • Coccidiosis remains an important problem in poultry farming, despite the effective molecules present on the market (chemoresistance problem) and the launch on the market of an attenuated vaccine (Paracox). The problem is increasing due to the evolution of EU legislation on the use of additives and consumer pressure.
  • Toxoplasma is an obligate intracellular parasite responsible for abortion in ewes and women, as well as very serious problems for the fetus or the immunocompromised patient such as AIDS (deadly cerebral toxoplasmosis).
  • the infestation is carried out by ingestion of oocysts produced by the cat or that of the meat (sheep, beef).
  • oocysts produced by the cat or that of the meat (sheep, beef).
  • 50 to 60% of humans are parasitized by toxoplasm in the form of microcysts in the muscles and brain.
  • behavioral disorders have been shown both in rodents (experimentally) and in humans (analysis of psychological and psychiatric records, Nature).
  • oxygenated heterocycles selected from xanthones and biflavonoids can be used as anti-coccidial agents, particularly in the prevention or treatment of coccidiosis-like parasitic diseases, such as eimeriosis. or toxoplasmosis, in humans or animals.
  • These oxygenated heterocycles are natural compounds that can be extracted from plants, and which have the advantage of being non-cytotoxic.
  • xanthones are secondary metabolites found in higher plants, lichens and fungi.
  • Xanthones C and O glycosides have been demonstrated (Hostettmann et al., Phytochemistry, 1977, 481). Plants belonging to the family Guttiferaceae are known to develop oxygenated xanthones, and more particularly isoprenylated xanthones (Banerjii 1994). A series of isoprenyl xanthones isolated from Moraceae have been characterized and their activities highlighted (hypotensive, antirhinoviral, and antitumor effect (Hano et al 1990, Planta Medica, 478).
  • Xanthones have been studied from a chemotaxonomic point of view, but also for their biological and pharmacological properties (Cardona et al, 1990, Phytochemistry, 3003). It has been shown that some of these xanthones have antiviral, cardiotonic, antimicrobial, or anti-hepatotoxic properties (Banerji et al 1994). In addition, xanthones and their derivatives are bronchodilators in the treatment of asthma (Balasubramanian 1988).
  • xanthones have never been described to date as anti-coccidial agents, to prevent or treat coccidiosis, especially caused by the parasitic microorganisms Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia and Neospora, especially in the field veterinary.
  • the subject of the present invention is therefore the use of oxygenated heterocycles chosen from xanthones and biflavonoids for the preparation of a composition intended to act as an anti-coccidial agent in humans or animals, the coccidia being chosen from the group consisting of Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia and Neospora.
  • the oxygenated heterocycles chosen from xanthones and biflavonoids are used as anti-coccidial agents in animals, in the veterinary field, in particular in cattle.
  • the oxygenated heterocycles are xanthones corresponding to the general formula (I)
  • each of the radicals R 1 to R 6 independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl (OH) radical, a C 1 -C 6 alkoxy radical, a linear or branched, advantageously C 1 to C 6 , alkyl radical, or a linear or branched alkene radical, advantageously C 1 to C 6 , or R 1 and R 2 together form a ring, such as a pyranic or furan derivative, optionally substituted with at least one C 1 to C 6 alkyl group.
  • each of the radicals R 1 to R 6 independently represents a hydrogen atom, a hydroxyl radical, a C 1 -C 6 alkoxy radical, such as a methoxy, or a linear alkene radical or branched, advantageously C 1 -C 6 , typically C 1 -C 5 .
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 5 represent a hydrogen atom; R 4 represents a hydroxy radical; and R 6 represents an alkoxy radical, advantageously a methoxy radical.
  • R 1 and R 6 represent a branched, preferably C 1 -C 5 , alkene radical, such as a prenyl group;
  • R 2 represents a hydroxy radical;
  • R 3 and R 4 represent a hydrogen atom; and
  • R 5 represents an alkoxy radical, advantageously a methoxy radical.
  • R 1 , R 4 and R 6 represent a branched, preferably C 1 -C 5 , alkene radical, such as a prenyl group; R3 represents a hydrogen atom; and R 2 and R 5 represent a hydroxy radical.
  • R 1 and R 2 together form a ring such as a pyranic or furan derivative, advantageously substituted by at least one alkyl group, typically C 1 to C 6 .
  • R 3 advantageously represents a linear or branched alkene radical, advantageously C 1 to C 6 , typically C 1 to C 5 ; and R 4 , R 5 and R 6 each advantageously represent independently a hydrogen atom or a hydroxy radical.
  • R 1 and R 2 together form a pyran ring, advantageously substituted by at least one methyl group, in particular substituted with a dimethyl gem group, typically at the 2-position;
  • R 3 represents a branched alkene radical, such as a 1,1-dimethyl-2-propene group;
  • R 4 represents a hydroxy radical;
  • R 5 and R 6 represent a hydrogen atom.
  • the compound (I) has the following formula:
  • the oxygenated heterocycles are biflavonoids corresponding to the general formula (II)
  • the xanthones and biflavonoids according to the present invention are advantageously natural compounds, extracted from plants, typically plants of African origin.
  • the oxygenated heterocycles of the xanthones and biflavonoids type are extracted from plants selected from the group consisting of Vismia laurentii, Pentadesma grandifolia, Allanblackia monticola, Allanblackia floribunda, and Allanblackia gabonensis.
  • the xanthones and biflavonoids used according to the present invention may also have been chemically synthesized.
  • the composition according to the present invention is intended for the prevention or treatment of coccidiosis, such as eimeriosis or toxoplasmosis, in humans or animals.
  • the composition according to the invention is used for the prevention or treatment of coccidiosis in animals, in the veterinary field, in particular in cattle.
  • this composition can be used to prevent or treat parasitic diseases of livestock, for example cattle, rabbits, pigs, or birds, for example poultry such as chickens or turkeys.
  • composition of the present invention is intended to be administered orally.
  • composition according to the present invention may in particular be in the form of a tablet, capsule, powder, granule, solution or oral suspension.
  • the composition of the present invention is a pharmaceutical composition, a food composition such as a food, a food or drink, a food supplement or a food additive.
  • composition according to the present invention may contain acceptable excipients as well as conventional additives.
  • the subject of the present invention is also a novel compound corresponding to the following formula (Ia), laurentinone A:
  • Figure 1 represents the in vitro human cell line cytotoxicity study of the products EVL9 (concentration: 0.01 mg / mL and 0.005 mg / mL) and PG2 (concentration: 0.01 mg / mL and 0.005 mg / mL ).
  • Figure 2 represents the study of the in vitro cytotoxicity on human cell line of AM5 products (concentration: 5 ⁇ g / mL), AFR6 (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), AFR 7 (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), AFR8 (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), EAFR (concentration: 10 ⁇ g / mL), EFAM (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), and ERAM (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL).
  • Figure 3 shows the antiparasitic activity of the ERPG products (concentration: 0.02 mg / mL and 0.01 mg / mL), and ETVL (concentration: 0.02 mg / mL, 0.01 mg / mL and 0.002 mg / mL), on infested cells.
  • Figure 4 represents the antiparasitic activity of PG2 (concentration: 0.005 mg / mL, 0.01 mg / mL) on infested cells.
  • Figure 5 shows the antiparasitic activity of EVL9 (concentration: 0.005 mg / mL and 0.01 mg / mL) in infested cells.
  • Figure 6 represents the antiparasitic activity of AM5 (concentration: 5 ⁇ g / mL), AFR6 (concentration: 5 ⁇ g / mL), AFR7 (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), AFR8 (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), EAFR (concentration: 10 ⁇ g / mL), EFAM (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), and ERAM (concentration: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL), on infested cells.
  • coccidiostatic products such as EFAM, ERAM, ERPG, and ETVL
  • Figure 9 shows the mortality rate in coccidiostatic trials.
  • Vismia laurentii is a 1.5 to 3 m shrub up to 15 m tall, found in the African forest, in general and more specifically in Senegal, Liberia, Ghana, Nigeria, Ivory Coast, Sierra Leone and in Cameroon.
  • This ETVL extract was subjected to flash chromatography on silica gel (Merck 60, 70-230 Mesh) and eluted with a hexane-AcOEt mixture of increasing polarity. 50 fractions of 250 ml each were collected and pooled on the basis of C. C. M., thus leading to 5 series called S1-S5.
  • the S2 series (9 g), obtained from flash chromatography by elution with hex-AcOEt (3/1), was in turn subjected to silica gel column chromatography (70-230 mesh ) using the Hexane-AcOEt mixture as the elution gradient. A total of 105 fractions, each of 150 ml capacity, were collected and pooled on the basis of C.CM.
  • Fractions F53-63 obtained from fraction S2 by elution with Hexane-AcOEt (4/1), were pooled and subjected again to column chromatography on silica gel, eluted with a Hexane-HCl mixture. AcOEt of increasing polarity. 40 fractions of 15 ml each were collected. From fraction F28-33, eluted with Hexane-AcOEt (85/15), compound EVL9 precipitated at room temperature as a yellow powder (18 mg).
  • the empirical formula C M H 10 O O 6 was deduced from its positive resolution high resolution mass spectrum ESI-TOF, on which the peak of pseudomolecular ion [M + H] + at m / z 275 was observed, 0586, corresponding to the formula C 14 H 11 O 6 and containing 10 degrees of unsaturation.
  • the NOESY spectrum of EVL9 clearly shows that the ABM system is located on cycle A of the xanthonic ring.
  • the methoxyl group is located at the 8-position in the peri-position relative to the carbonyl ( ⁇ H 3,90 / ⁇ x 55,9) (Terreaux et al, 1995). This is confirmed by the HMBC spectrum.
  • Garcinone E was extracted from the plant Pentadesma grandifolia.
  • Pentadesma grandifolia is a tree up to 20 meters in height and 80 centimeters in diameter, with straight bole, cylindrical, without buttresses at the base, found in Africa, and particularly in Cameroon at altitudes between 800 and 1600 m.
  • the PG2 compound was obtained as yellow-orange crystals and melted at 134-136 ° C. It gives a positive reaction to the ferric chloride test, characteristic of phenolic hydroxyls.
  • the infrared spectrum (IR) of this compound exhibits, among other things, vibration bands of valencies characteristic of a free hydroxyl ( ⁇ 3460 cm -1 ), a chelated hydroxyl ( ⁇ 3250 cm -1 ) and a conjugated carbonyl ( ⁇ 1647 cm -1 )
  • vibration bands of valencies characteristic of a free hydroxyl ⁇ 3460 cm -1
  • a chelated hydroxyl ⁇ 3250 cm -1
  • a conjugated carbonyl ⁇ 1647 cm -1
  • cm “1 ) as well as those due to the CO bonds of the ethers ( ⁇ 1245, 1118 cm -1 ).
  • the first prenyl group occupies the C-8 position, and is in the peri position, because of the removal of these allylic protons HI "from the cone of paramagnetic anisotropy of the carbonyl, since it resonates at ⁇ 4.20 instead of ⁇ 3.2-3.40
  • the second group ⁇ , ⁇ -dimethylallyl is in position C-2 on the basis of the long-distance correlations C, H, observed on its HMBC spectrum.
  • the protons of the allyl CH 2 in position - 1 '( ⁇ 3,46) give, inter alia, 3 J correlation tasks with the carbon resonant at ⁇ l61,5 and the carbon C-2 resonant at This position is further confirmed by the correlations observed on the NOESY spectrum between the H-1 'allyl protons and the proton of the chelated hydroxyl at position 1.
  • the aromatic resonant proton at ⁇ 6.38 is therefore localized in position C-4 and has both the correlation tasks 2 J, 3 J with the carbons C-4a (155,2) and C-3 (163,0).
  • the third prenyl group is in position 5.
  • Compound (II), in which R H, was extracted from the plant Allanblackia floribunda. This is volkensiflavone (AFR7).
  • Allanblackia monticola is a tree about 20m tall and 60 cm in diameter.
  • the barks are brown with yellow internal indentations and red outer indentations.
  • the flowers are yellow and give off a characteristic odor around 11 o'clock in the morning.
  • the fruits, more or less ovoid or elongated by about 12 cm, contain in addition many seeds (about 10 to 12 seeds per fruit).
  • Allanblackia floribunda is a tree up to 30 m tall and 80 cm in diameter with a base wheelbase, a straight, cylindrical bole, short, horizontal branches, very numerous forming a plume of dense foliage.
  • the bark is brown, thin, scaly; the brittle slice, reddish on the outside, yellow on the inside, exudes a yellow latex.
  • the evergreen leaves are opposite, simple, entire (12-25 x 5-8 cm) leathery, shiny above with very many parallel lateral veins, with petioles 1 to 1.5 cm long.
  • the flowers are large (5 cm in diameter) arranged in clusters. They are white, pink or red type 5 unisexual pedicels 2.5 to 8 cm long.
  • the fruits are elongated berries (20 to 50 x 8 to 15 cm), light brown speckled with chestnuts with 5 ribs more or less marked, hanging at the end of a peduncle leaving exuding an abundant yellow latex. Seeds (2.5 x 2 cm) numerous (40 to 100 per fruit) and brown are surrounded by a gelatinous pulp and pinkish. It contains an edible fat (boandjo butter by Yokadouma) (Vivien and Faure, 1995).
  • Allanblackia gabonensis is one of the Allanblackia species found in tropical Africa (Cameroon, Zaire) between 500 and 1750 m altitude.
  • 150 g of the 250 g of raw extract of the Allanblackia monticola trunk bark are fractionated on a flash column containing 200 g of 70-230 mesh size silica.
  • the elution is made by means of a hexane-ethyl acetate mixture of increasing polarity.
  • the 300 ml fractions are collected and pooled on the basis of TLC. This allowed to obtain 4 indexed series A, B, C and D.
  • AFR6, AFR7 and AFR8 compounds 150 g of the 182 g of the total extract (EAFR) of Allanblackia floribunda were subjected to flash chromatography containing 500 g of silica with a particle size of 70-230 mesh in order to and fractionated with methylene chloride, hexane-ethyl acetate 50%, pure ethyl acetate and finally 10% ethyl acetate-methanol. 20 fractions of 400 ml each were collected and pooled on the basis of TLC.
  • Fractions 50-62 also crystallize in methylene chloride as yellow crystals which, after washing and filtration, provide an AFR 8 indexed compound.
  • Morelloflavone AFR 8
  • Example 4.1 Evaluation of the sulforhodamine B cytotoxicity of compounds (I) or (II) and extracts containing such compounds according to the present invention
  • SRB Sulforhodamine B
  • SRB is a protein-binding dye whose adsorption can be measured spectrophotometrically at 550 nm (pink color).
  • human fibroblast MRC5 cells (Biomérieux) were cultured at 37 ° C. in a 96-well plate (Costar), at 2.10 4 cells per well, in 200 ⁇ l of MEM medium (Gibco), to which 5% of fetal calf serum were added. After 24h culture, the medium is changed and the extracts, which we want to test the toxicity, are added after being taken up in the appropriate volume of appropriate solvent (dimethylsulfoxide or water). The concentrations indicated in the figures of the present application are the final concentrations in the wells. We leave 48h in culture. The cells are then fixed by adding 50 ⁇ l of cold TCA (trichloroacetic acid) per well to the surface of the culture medium, and the plate is allowed to stand for 5 minutes at room temperature and then for 2 hours at 4 ° C.
  • TCA trichloroacetic acid
  • the supernatant is then removed, and the wells are washed 5 times with 100 ⁇ l of water (the plate being emptied by turning). The plate is then allowed to dry. It can be kept dry until staining. 100 ⁇ l of sulforhodamine B (0.4% in 1% acetic acid) are added to each well. The coloration lasts 20 minutes. Sulforhodamine is then removed, and the wells rinsed 5 times with 1% acetic acid. The cell-bound staining is then solubilized for 5 minutes by adding 100 ⁇ l of 10 mM Tris Base (pH 10.5).
  • the optical density is read at 550 nm on a microplate reader (Bio-Rad model 550).
  • FIG. 1 The result of the analysis of the cytotoxicity of the compounds EVL 9 and PG 2 appears in FIG. 1.
  • This figure thus shows that the products EVL9 (laurentinone A) and PG2 (garcinone E), at the concentrations 0.01 mg / ml and 0.005 mg / mL, are not cytotoxic.
  • the 20% DMSO used as a control is toxic, since more than 60% of cells are killed.
  • Example 4.2 Evaluation of the antiparasitic (anticoccidial) activity of compounds (I) or (II) and extracts containing such compounds
  • the ELISA test was used on the coccidia Toxoplasma gondii (virulent strain RH) by measurement of the ⁇ -galactosidase activity.
  • the test is carried out on the specific recognition of an antibody of the surface parasitic proteins of Toxoplasma gondii (T gondii), which makes it possible to evaluate the multiplication of the parasite.
  • the T. gondii strain used corresponds to the recombinant RH strain, a gene encoding ⁇ -galactosidase having been introduced into the genome of the parasite.
  • MRC5 cells human fibroblasts
  • tachyzoites 200 ⁇ L
  • Two controls are made: healthy cells on the one hand, and untreated infected cells on the other hand.
  • the plate After lysis of the cells (48 to 72 hours), the plate is centrifuged at 200 g for 5 minutes at room temperature. Lysis is carried out with 50 ⁇ l of lysis buffer for 1 hour at 50 ° C.
  • the lysis buffer contains: - 100 mM HEPES pH 8
  • reaction buffer 160 ⁇ L are added and the mixture is left for 5 minutes at 37 ° C.
  • the substrate of the enzyme is added to the wells: 40 ⁇ l of 6.25 mM chlorophenolred- ⁇ -D-galactopyranoside in solution in phosphate buffer pH 7.3.
  • the 0.1 M phosphate buffer pH 7.3 contains:
  • the reaction buffer contains:
  • Optical Density (OD) at 540 nm (greater sensitivity at 570 nm) / 420 nm is measured. This reflects the amount of ⁇ -galactosidase present in the well, which reveals the amount of parasites present in the well.
  • the effect of the ERPG extract at 0.02 mg / mL is as follows: 96% +/- 0%; 0.01 mg / mL: 74% +/- 1%; and 0.002 mg / mL: 56% +/- 3%.
  • the effect of the ETVL extract at 0.02 mg / mL is as follows: 95% +/- 0%; 0.01 mg / mL: 95% +/- 0%; and 0.002 mg / mL: 68% +/- 4%.
  • Figure 3 shows that the products are effective at the highest used concentrations.
  • PG2 and EVL9 products are solubilized in DMSO.
  • the effect of DMSO solutions has been analyzed beforehand. It appears that the antiparasitic effects of plant products observed are due to the action of molecules, and not to the action of DMSO.
  • the concentrations used for EVL9 and PG2 are: 0.01 mg / mL and 0.005 mg / mL.
  • the effect of the PG2 molecule at 0.005 mg / mL is as follows: 86% +/- 2%; at 0.01 mg / mL: 91% +/- 7%.
  • the two compounds have a strong anti-parasitic (anticoccidial) activity against T.gondii: on average 85% of development inhibition for the two concentrations tested (3 trials).
  • ERPG and ETVL extracts also have high antiparasitic (anticoccidial) activity against T. gondii.
  • the results of the anticoccidial activities of the AM5, AFR6, AFR7, AFR8, and EAFR, EFAM, and ERAM extracts are shown in Figure 6.
  • the concentrations used are: AM5: 5 ⁇ g / mL, AFR6: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL, AFR7: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL, AFR8: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL, EAFR: 10 ⁇ g / mL, EFAM: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL, ERAM: 5 ⁇ g / mL and 10 ⁇ g / mL.
  • Figure 6 shows that the products are effective at the concentrations used.
  • Example 5 Study of the biological activity of the products in vivo.
  • ERPG 0.02 mg / mL and 0.04 mg / mL
  • ETVL 0.02 mg / mL and 0.04 mg / mL
  • EFAM 0.02 mg / mL
  • ERAM 0.02 mg / mL and 0.04 mg / mL
  • EAGC 0.02 mg / mL and 0.03 mg / mL
  • AFR8 0.005 mg / mL
  • PG2 0.005 mg / mL
  • D12 banding, weighing, histogram of weights, rejection of extremes.
  • 252 chickens weighing an average of 275 grams were so retained. These chickens were distributed by batch of 6 chickens in 42 cages, 18 chickens per batch (3 repetitions per batch). Each batch received the solutions prepared according to the concentrations recommended above on the basis of 200 ml / day / chicken for 9 days. The 2 control lots received only water.
  • J19 The chickens were weighed, and 13 lots out of 14 were infested by oocysts of sporulated coccidia. A control lot was not infested.
  • zootechnical criteria were also studied, namely the weight gain, the GMQ and the consumption index.
  • the growth percentages of the chickens are calculated relative to the uninoculated and untreated control (100% chicken growth) over a period of 48 days. For the untreated inoculated control, there was 55% mortality.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pour la préparation d'une composition destinée à agir comme agent anti-coccidien, les coccidies étant choisies dans le groupe constitué parEimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia et Neospora. En particulier, la composition est destinée à la prévention ou au traitement de coccidioses chez l'homme ou l'animal. Avantageusement, une telle composition est destinée à être administrée par voie orale. La présente invention a également pour objet un nouveau composé de formule (Ia), la laurentinone A.

Description

« Utilisation d'hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pour la préparation d'une composition destinée à agir comme agent anti-coccidien »
La présente invention concerne l'utilisation d'hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pour la préparation d'une composition destinée à agir comme agent anti-coccidien, les coccidies étant avantageusement choisies dans le groupe constitué par Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia et Neospora. En particulier, la composition est destinée à la prévention ou au traitement de coccidioses chez l'homme ou l'animal. Avantageusement, une telle composition est destinée à être administrée par voie orale. La présente invention a également pour objet un nouveau composé de formule (Ia), la laurentinone A.
L'extrême variété des microorganismes, la variété de leurs cycles, et la nécessité, dans la majorité des cas, d'avoir recours à l'hôte spécifique pour leur étude, font de la microbiologie un monde complexe, qui explique partiellement la faiblesse de nos connaissances actuelles et la nécessité de nouvelles stratégies pour la thérapeutique. Ajouté aux nombreuses maladies humaines, le coût des pertes dues aux maladies infectieuses dans le domaine vétérinaire est considérable. En plus d'une mortalité élevée dans les élevages, les agents infectieux en question induisent un retard de croissance des animaux infectés. Il faut ajouter à ces coûts, la nécessaire et coûteuse mise en place de stratégies de prévention. D'après des données récentes, les additifs alimentaires à action préventive, les produits anti-infectieux et les antiparasitaires représentent respectivement 14,3%, 17% et 27,5% du marché de la médecine vétérinaire.
Si nos moyens de traitement ont permis d'éradiquer certaines maladies infectieuses, les principales n'ont pas disparu et l'apparition de chimiorésistances incite à la recherche de nouvelles molécules. Ceci est d'autant plus vrai que les molécules principales doivent être retirées du marché en accord avec les nouvelles législations européenne et internationale en termes de toxicité humaine.
Les coccidioses animales en particulier sont un grave problème en pathologie animale, que ce soit pour la volaille, le bétail ou la cuniculture. Elles sont dues à des protozoaires du Phylum des Apicomplexa, de la classe des Sporozoa. Dans l'industrie aviaire, les coccidioses causent des pertes économiques considérables (800 millions US$ aux USA par an en 2002). Une douzaine d'espèces parasitent le poulet. Les plus communes sont : Eimeria tenella (diarrhée sanguinolente caecale), Eimeria necatrix (diarrhée sanguinolente intestinale) et Eimeria acervulina, ainsi que Eimeria maxima (coccidiose chronique intestinale). Le nombre d'espèces pour la dinde est de sept, dont les plus importantes sont : Eimeria meleagrimitis (localisée dans le jéjunum) et Eimeria adenoeides (localisée dans l'iléon inférieur, les caeca et le rectum).
Pour ces volailles, les animaux plus sensibles sont ceux qui sont en croissance et les jeunes adultes. Les animaux infectés, consommant moins d'aliments et d'eau, sont diarrhéiques, et peuvent devenir émaciés et déshydratés. Le taux de production d'oeufs est réduit chez les pondeuses. La coccidiose caecale peut produire des déjections sanglantes et l'anémie, souvent suivie de la mort. La coccidiose intestinale peut être confondue avec le syndrome hémorragique d'anémie et d'autres maladies entériques.
Dans le bétail, les eimerioses sont provoquées par une quinzaine d'espèces, dont les plus fortement pathogènes sont Eimeria bovis et Eimeria zuernii, et plus occasionnellement Eimeria auburnensis. Ce sont des parasites intestinaux (intestin grêle, caecum, côlon), causant de graves diarrhées qui sont hémorragiques quand l'espèce E. zuernii est impliquée. Ce sont les jeunes veaux âgés de 1 à 6 mois qui sont les animaux les plus sensibles ; cependant, les individus plus âgés (1 à 2 ans) peuvent être affectés. Les pertes annuelles sont de l'ordre de 100 millions US$ aux USA.
Les coccidioses en cuniculture (lapin) sont également importantes. Les espèces responsables sont au niveau intestinal : Eimeria intestinalis et Eimeria flavescens, et au niveau hépatique : Eimeria stiedai. Les diarrhées entraînent chute de poids et mortalité.
Il est difficile, sinon impossible, d'empêcher la coccidiose par la seule hygiène. Il est nécessaire d'ajouter une drogue coccidio statique à l'alimentation qui prévient la croissance des coccidies dans la région digestive et leur multiplication. Les coccidioses demeurent un problème important en aviculture, malgré les molécules efficaces présentes sur le marché (problème de chimiorésistance) et le lancement sur le marché d'un vaccin atténué (Paracox). Le problème augmente en raison de l'évolution de la législation européenne au sujet de l'utilisation des additifs et de la pression des consommateurs. Le toxoplasme, quant à lui, est un parasite intracellulaire obligatoire responsable d'avortement chez la brebis et la femme, ainsi que de problèmes très graves pour le fœtus ou chez l'immunodéprimé tel le sidéen (toxoplasmose cérébrale mortelle). L'infestation est réalisée par ingestion d'ookystes produits par le chat ou par celle de la viande (mouton, bœuf). Il est à noter que, dans les pays occidentaux développés, 50 à 60% des humains sont parasités par le toxoplasme sous forme de micro-kystes dans les muscles et le cerveau. Or, il a été montré des troubles du comportement aussi bien chez les rongeurs (expérimentalement) que chez les humains (analyse de dossiers psychologiques et psychiatriques ; Nature).
De nombreuses molécules ont été étudiées, mais elles ne traitent le plus souvent que les symptômes dus à la forme de multiplication ou sont relativement cytotoxiques. Il convient donc de rechercher des molécules à effet anti-kystique étant non cytotoxiques.
Il est important de noter que la physiologie et le métabolisme des coccidies appartenant aux genres Toxoplasma et Eimeria sont similaires.
Au-delà de la préservation de la santé des animaux, l'enjeu majeur de la médecine vétérinaire est la garantie de la sécurité des hommes. Il s'agit d'éviter toute transmission de microbes ou de résidus médicamenteux par des aliments d'origine animale, tout en empêchant la propagation de zoonoses préjudiciables à la santé humaine.
Grâce aux médicaments vétérinaires, l'homme a réussi à enrayer, voire à éradiquer des maladies graves comme la tuberculose et la fièvre aphteuse. De nouveaux produits permettent aussi de mieux protéger le bétail contre les infections de toutes sortes. Cependant, en dépit de nombreux succès engrangés, le besoin de nouveaux médicaments innovateurs ou de nouveaux additifs alimentaires dans le cadre de la médecine vétérinaire reste important.
La demanderesse a découvert de manière surprenante que des hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pouvaient être utilisés en tant qu'agents anti-coccidiens, en particulier dans la prévention ou le traitement de maladies parasitaires du type coccidioses, telles que l'eimeriose ou encore la toxoplasmose, chez l'homme ou l'animal. Ces hétérocycles oxygénés sont des composés naturels qui peuvent être extraits de plantes, et qui présentent l'avantage d'être non cytotoxiques.
En particulier, les xanthones sont des métabolites secondaires que l'on retrouve dans les plantes supérieures, les lichens et les champignons.
Des xanthones C et O glycosides ont été mises en évidence (Hostettmann et al, Phytochemistry, 1977, 481). Les plantes appartenant à la famille des Guttiféracées sont connues pour élaborer des xanthones oxygénées, et plus particulièrement des xanthones isoprénylées (Banerjii 1994). Une série de xanthones isoprénylées isolées de Moracées ont été caractérisées et leurs activités mises en évidence (effet hypotensif, antirhinoviral, et antitumoral ( Hano et al 1990, Planta Medica, 478).
Les xanthones ont été étudiées d'un point de vue chimiotaxonomique, mais aussi pour leurs propriétés biologiques et pharmacologiques (Cardona et al, 1990, Phytochemistry, 3003). Il a ainsi été montré que certaines de ces xanthones ont des propriétés antivirale, cardiotonique, antimicrobienne, ou antihépatotoxique (Banerji et al 1994). En outre, les xanthones et leurs dérivés sont bronchodilatateurs dans le traitement de l'asthme (Balasubramanian 1988).
Cependant, les xanthones n'ont jamais été décrites jusqu'à présent comme agents anti-coccidiens, pour prévenir ou traiter les coccidioses, en particulier provoquées par les micro-organismes parasitaires Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia et Neospora, notamment dans le domaine vétérinaire.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pour la préparation d'une composition destinée à agir comme agent anti-coccidien chez l'homme ou l'animal, les coccidies étant choisies dans le groupe constitué par Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia et Neospora. De manière particulièrement avantageuse selon l'invention, les hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes sont utilisés en tant qu'agents anti-coccidiens chez l'animal, dans le domaine vétérinaire, en particulier chez le bétail.
Par le terme de "xanthone", on entend au sens de la présente invention, les composés de formule :
Figure imgf000006_0001
Par le terme de "biflavonoïde", on entend au sens de la présente invention, les composés de formule :
Figure imgf000006_0002
ou
Figure imgf000006_0003
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, les hétérocycles oxygénés sont des xanthones répondant à la formule générale (I)
Figure imgf000006_0004
(I) dans laquelle chacun des radicaux Ri à R6 représente indépendamment un atome d'hydrogène, un radical hydroxy (OH), un radical alcoxy avantageusement en Ci à C6, un radical alkyle, linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C6, ou un radical alcène linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C6, ou bien Ri et R2 forment ensemble un cycle, tel qu'un dérivé pyranique ou furanique, éventuellement substitué par au moins un groupe alkyle avantageusement en Ci à C6.
Selon un exemple de réalisation de la présente invention, chacun des radicaux Ri à R6 représente indépendamment un atome d'hydrogène, un radical hydroxy, un radical alcoxy en Ci à C6, tel qu'un méthoxy, ou un radical alcène linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C6, typiquement en Ci à C5.
Parmi les composés de formule (I) de la présente invention, on peut citer les composés préférés suivants :
R1, R2, R3 et R5 représentent un atome d'hydrogène ; R4 représente un radical hydroxy ; et R6 représente un radical alcoxy, avantageusement un radical méthoxy.
Ri et R6 représentent un radical alcène ramifié, avantageusement en Ci à C5, tel qu'un groupe prényle ; R2 représente un radical hydroxy ; R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène ; et R5 représente un radical alcoxy, avantageusement un radical méthoxy.
R1, R4 et R6 représentent un radical alcène ramifié, avantageusement en Ci à C5, tel qu'un groupe prényle ; R3 représente un atome d'hydrogène ; et R2 et R5 représentent un radical hydroxy.
Selon un autre exemple de réalisation de la présente invention, Ri et R2 forment ensemble un cycle tel qu'un dérivé pyranique ou furanique, avantageusement substitué par au moins un groupe alkyle, typiquement en Ci à C6.
Dans cet exemple de réalisation, R3 représente avantageusement un radical alcène linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C6, typiquement en Ci à C5 ; et R4, R5 et R6 représentent avantageusement chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy.
Parmi les composés de formule (I) de la présente invention, on peut citer le composé préféré suivant : Ri et R2 forment ensemble un cycle pyranique, avantageusement substitué par au moins un groupe méthyle, en particulier substitué par un groupe gem diméthyle, typiquement en position 2 ; R3 représente un radical alcène ramifié, tel qu'un groupe l,l-diméthyl-2-propène ; R4 représente un radical hydroxy ; et R5 et R6 représentent un atome d'hydrogène.
Avantageusement, le composé (I) a la formule suivante :
Figure imgf000008_0001
Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, les hétérocycles oxygénés sont des biflavonoïdes répondant à la formule générale (II)
Figure imgf000008_0002
(H) dans laquelle le radical R représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy.
Les xanthones et biflavonoïdes selon la présente invention sont avantageusement des composés naturels, extraits à partir de plantes, typiquement des végétaux d'origine africaine. De manière particulièrement avantageuse selon la présente invention, les hétérocycles oxygénés du type xanthones et biflavonoïdes sont extraits de plantes choisies dans le groupe constitué par Vismia laurentii, Pentadesma grandifolia, Allanblackia monticola, Allanblackia floribunda, et Allanblackia gabonensis .
Dans le cadre de la présente invention, on peut utiliser avantageusement comme agents anti-coccidiens les xanthones ou biflavonoïdes tels que définis ci-dessus, ou bien des extraits contenant de tels composés.
Les xanthones et biflavonoïdes utilisés selon la présente invention peuvent également avoir été synthétisés chimiquement.
Avantageusement, la composition selon la présente invention est destinée à la prévention ou au traitement de coccidioses, telles que les eimerioses ou toxoplasmoses, chez l'homme ou l'animal. De manière particulièrement avantageuse, la composition selon l'invention est utilisée pour la prévention ou le traitement de coccidioses chez l'animal, dans le domaine vétérinaire, en particulier chez le bétail. En particulier, cette composition peut être utilisée pour prévenir ou traiter les maladies parasitaires du bétail, par exemple des bovins, des lapins, des porcs, ou des oiseaux, par exemple de la volaille telle que les poulets ou les dindes.
Avantageusement, la composition de la présente invention est destinée à être administrée par voie orale.
La composition selon la présente invention peut en particulier se présenter sous forme de comprimé, gélule, poudre, granule, solution ou suspension orale.
Avantageusement, la composition de la présente invention est une composition pharmaceutique, une composition alimentaire telle qu'un aliment, une nourriture ou une boisson, un complément alimentaire ou un additif alimentaire.
La composition selon la présente invention peut contenir des excipients acceptables, ainsi que des additifs conventionnels.
La présente invention a également pour objet un nouveau composé répondant à la formule suivante (Ia), la laurentinone A :
Figure imgf000010_0001
Les figures et exemples suivants sont donnés à titre non limitatif et illustrent la présente invention.
La Figure 1 représente l'étude de la cytotoxicité in vitro sur lignée cellulaire humaine des produits EVL9 (concentration : 0,01 mg/mL et 0,005 mg/mL) et PG2 (concentration : 0,01 mg/mL et 0,005 mg/mL).
La Figure 2 représente l'étude de la cytotoxicité in vitro sur lignée cellulaire humaine des produits AM5 (concentration : 5 μg/mL), AFR6 (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), AFR 7 (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), AFR8 (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), EAFR (concentration : 10 μg/mL), EFAM (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), et ERAM (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL).
La Figure 3 représente l'activité antiparasitaire des produits ERPG (concentration : 0,02 mg/mL et 0,01 mg/mL), et ETVL (concentration : 0,02 mg/mL, 0,01 mg/mL et 0,002 mg/mL), sur cellules infestées.
La Figure 4 représente l'activité antiparasitaire de PG2 (concentration : 0,005 mg/mL, 0,01 mg/mL) sur cellules infestées.
La Figure 5 représente l'activité antiparasitaire de EVL9 (concentration : 0,005 mg/mL et 0,01 mg/mL) sur cellules infestées.
La Figure 6 représente l'activité antiparasitaire de AM5 (concentration : 5 μg/mL), AFR6 (concentration : 5 μg/mL), AFR7 (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), AFR8 (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), EAFR (concentration : 10 μg/mL), EFAM (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), et ERAM (concentration : 5 μg/mL et 10 μg/mL), sur cellules infestées. La Figure 7 représente les pourcentages de croissance des poulets pour les produits ayant un effet coccidiostatique, tels EFAM, EAGC, AM5, AFR8, et PG2, sur une période de 26 jours. Les pourcentages sont calculés par rapport au témoin non inoculé et non traité (ce témoin = 100% de croissance des poulets). Pour le témoin inoculé non traité, il y a eu 55% de mortalité.
La Figure 8 représente les pourcentages de croissance des poulets pour les produits ayant un effet coccidiostatique, tels EFAM, ERAM, ERPG, et ETVL, sur une période de 48 jours. Les pourcentages sont calculés par rapport au témoin non inoculé et non traité (ce témoin = 100% de croissance des poulets). Pour le témoin inoculé non traité, il y a eu 55% de mortalité.
La Figure 9 représente le taux de mortalité lors des essais coccidiostatiques.
Exemples :
Exemple 1 : Préparation de composés de formule (I) : l,5,6-trihydroxy-8- méthoxyxanthone : laurentinone A (EVL9) Ri, R2, R3 et R5 = H ; R4 = OH, et R6 = OCH3
La laurentinone A a été extraite de la plante Vismia laurentii.
Vismia laurentii est un arbuste de 1,5 à 3 m pouvant atteindre 15 m de hauteur, qu'on retrouve dans la forêt africaine, en général et plus précisément au Sénégal, Libéria, Ghana, Nigeria, Côte d'Ivoire, Sierra Leone et au Cameroun.
Extraction :
Des tiges de Vismia laurentii, récoltées au Cameroun, ont été découpées, séchées, puis broyées. La poudre obtenue, 3 kg, a été extraite par macération à température ambiante pendant 48 heures dans le méthanol (10 L). Après fîltration, la solution résultante a été concentrée par évaporation sous pression réduite pour donner 150 g d'un résidu visqueux de couleur marron qui constitue l'extrait ETVL. Ce dernier est caractérisé sur la base de la chromatographie sur couche mince de gel de silice dans l'hexane-acétate d'éthyle 75 : 25, et révélé à l'UV et à l'acide sulfurique. Isolement :
Cet extrait ETVL a été soumis à une chromatographie flash sur gel de silice (Merck 60, 70-230 Mesh) et élue avec un mélange hexane- AcOEt de polarité croissante. 50 fractions de 250 ml chacune ont été collectées et réunies sur la base de la C. C. M., conduisant ainsi à 5 séries dénommées S1-S5.
Traitement de la série :
La série S2 (9 g), obtenue de la chromatographie flash par élution à l'aide du mélange hex-AcOEt (3/1), a été à son tour soumise à une chromatographie sur colonne de gel de silice (70-230 mesh) en utilisant le mélange Hexane- AcOEt comme gradient d'élution. Un total de 105 fractions, d'une capacité de 150 ml chacune, a été collecté et rassemblé sur la base de la C. CM.
Les fractions F53-63, obtenues à partir de la fraction S2 par élution avec le mélange Hexane-AcOEt (4/1), ont été rassemblées et soumises de nouveau à une chromatographie sur colonne de gel de silice, éluées avec un mélange Hexane- AcOEt de polarité croissante. 40 fractions de 15 ml chacune ont été collectées. De la fraction F28-33, éluée avec le mélange Hexane- AcOEt (85/15), le composé EVL9 précipite à température ambiante sous forme de poudre jaune (18 mg).
Structure de EVL9 ou laurentinone A :
La laurentinone A a été obtenue sous forme d'une poudre jaune orangée. Il fond dans le mélange hexane-acétate d'éthyle, et donne en solution dans le méthanol une réaction positive au chlorure ferrique, indiquant la présence en son sein d'hydroxyles phénoliques.
La formule brute CMHIOOÔ a été déduite de son spectre de masse à haute résolution ESI-TOF en mode positif, sur lequel on observe le pic de l'ion pseudomoléculaire [M+H]+ à m/z 275,0586, correspondant à la formule C14H11O6 et renfermant 10 degrés d'insaturation.
Le spectre UV de ce composé pris dans le méthanol présente cinq maxima d'absorption à λmax 204, 237, 266, 331 et 410, caractéristiques des xanthones tétraoxygénées (Terreaux et al., 1995 ; Imuna et al, 1996). La présence au sein de la laurentinone A d'hydroxyles phénoliques, d'un carbonyle et d'un grand nombre de carbones sp2, est corroborée par l'existence sur son spectre IR des bandes de vibration de valences caractéristiques à υ3453 cm"1 (OH libre), υ3115 cm"1 (OH chélaté), υl664 cm"1 (carbonyle conjugué et chélaté), υl617, 1584 cm"1 (C=C aromatiques).
Son spectre de RMN 13C Jmodulé (75,45 MHz, DMSO-d6, Cf. tableau 1) présente 14 signaux dus aux 14 atomes de carbone présents dans la molécule. L'analyse de ces signaux au moyen des techniques APT et HSQC permet de mettre en évidence : 9 signaux de phase négative, correspondant tous à des carbones quaternaires, parmi lesquels un signal de carbonyle à δ 180,7, et six carbones oxygénés hybrides sp2 résonant entre δ 142,6 et 160,9 ; 5 signaux de phase positive correspondant aux carbones primaires et tertiaires, dont quatre autres signaux, tous hybrides sp2, et résonant à δ95,3 ; 106,9 ; 109,5 et 136,3 étant dus aux carbones tertiaires, et un hybride sp du au groupement méthoxyle et résonant à δ55,9.
Le spectre de RMN1H (300 MHz, DMSO-d6, Cf. tableau 1), complété par le spectre COSY 45 de ce composé, révèle la présence : d'un hydroxyle phénolique chélaté à δl2,95 (IH, s), attribuable à l'hydroxyle en position 1 ; deux signaux échangeables tous à l'eau lourde à δ 10,25 et 9,75, attribuables aux hydroxyles phénoliques ; un système ABM de trois protons aromatiques constitués d'un triplet d'un proton à δ 7,65 ayant une constante de couplage J = 8,4 Hz et deux doublets dédoublés d'un proton chacun respectivement à δ 7,00 et 6,85, avec pour constantes de couplage J= 8,4 et 1,9 Hz ; un singulet d'un proton aromatique à δ 7,10 ; et un singulet de trois protons à δ 3,90, attribuables aux protons d'un groupement méthoxyle. Tableau 1 : Données spectrales de RMN 13C et RMN 1H de la laurentinone A
Attribution °C Multiplicité 1H[Hi, J (Hz)]
1 160,9 s -
2 109,5 s 6,85 (dd, 8.4, 1.9)
3 136,30 s 7,65 (t, 8.4)
4 106,9 d 7,00 (dd, 8.4, 1.9)
4a 155,6 s -
5a 142,6 s -
5 133,3 d -
6 142,8 s -
7 95,3 s 7,10 (s)
8 146,2 s -
8a 111,3 s -
9 180,7 s -
9a 107,6 s -
1-OH 12,95 (s)
5-OH - - 9,75 (s)
6-OH 10,25 (s)
Le spectre NOESY de EVL9 montre clairement que le système ABM est localisé sur le cycle A du cycle xanthonique . Le groupement méthoxyle est localisé en position 8 soit en position péri par rapport au carbonyle (ÔH 3,90/ δx 55,9) (Terreaux et al, 1995). Ceci est confirmé par le spectre HMBC.
Sur le spectre NOESY de la laurentinone A, on observe que l'unique proton du cycle B est en position 7 et les deux hydroxyles phénoliques en position 5 et 6.
Sur le base de toutes ces données, la structure de EVL9 ou l,5,6-trihydroxy-8- méthoxyxanthone a été attribuée à la laurentinone A. Cette structure est décrite pour la première fois du règne végétal et dans la littérature.
Figure imgf000015_0001
laurentinone A
Exemple 2 : Préparation de composés de formule (I) : 1,3,6,7-tétrahydroxy- 2,5,8-tri(3-méthylbut-2-ènyl)xanthone : garcinone E (PG2) R1, R4, et Re = groupe prényle ; R3 = H ; et R2 et R5 = OH
La garcinone E a été extraite de la plante Pentadesma grandifolia.
Pentadesma grandifolia est un arbre pouvant atteindre 20 mètres de hauteur et 80 centimètres de diamètre, à fût droit, cylindrique, sans contrefort à la base, qu'on retrouve en Afrique, et particulièrement au Cameroun en altitude entre 800 et 1600 m.
Extraction et purification :
Des écorces de Pentadesma grandifolia, récoltées au Cameroun, ont été découpées en petits morceaux, séchées, et broyées. La poudre obtenue, 4 kg, est macérée dans 8L de mélange chlorure de méthylène-méthanol (1 :1) à froid pendant 48H.
L'évaporation du solvant sous pression réduite a permis d'obtenir 156 g d'un résidu visqueux de couleur jaunâtre qui constitue l'extrait ERPG, caractérisé par sa C. CM dans l'acétate d'éthyle-méthanol 75 : 25, et révélé à l'UV et à l'acide sulfurique.
Isolement :
Une partie de cet extrait ERPG, 90g, a été chromatographiée dans une colonne de gel de silice en utilisant comme éluant le mélange hexane-acétate d'éthyle de polarité croissante. Les fractions de 100 mL sont collectées et réunies sur la base de la C. C. M. Ceci a permis d'obtenir neuf séries indexées de Bl à B9. La série B5, constituée des fractions 85-106 éluées avec le système hexane- acétate d'éthyle (7 :3), a été rechromatographiée dans une colonne de gel de silice, éluée avec le système hexane-acétate d'éthyle (7,5 : 2,5). Les fractions de 100 mL sont collectées. Des fractions 34-65, PG2 cristallise sous forme de cristaux jaune-orangés et est soluble dans l'acétone.
Caractérisation du composé PG2 :
Le composé PG2 a été obtenu sous forme de cristaux jaune-orangés et fond à 134-136°C. Il donne une réaction positive au test au chlorure ferrique, caractéristique des hydroxyles phénoliques.
Son spectre de masse ESI-TOF, à haute résolution et en mode positif, donne un ion quasi-moléculaire à m/z 465,2244 (C28H33O6), correspondant à la molécule protonée [M+H]+, ainsi que deux ions à m/z 488 et 504 correspondant respectivement aux adduits [M+Na]+ et [M+K]+. On en déduit que le composé PG2 a une masse molaire de 464, correspondant à la formule brute C2SH32OO (13 degrés d'insaturation).
Le spectre infra-rouge (IR) de ce composé, enregistré sur pastille de KBr, exhibe entre autres, des bandes de vibration de valences caractéristiques d'un hydroxyle libre (υ 3460 cm"1), d'un hydroxyle chélaté (υ 3250 cm"1) et d'un carbonyle conjugué (υ 1647 cm"1). On observe également sur ce spectre des bandes d'absorption correspondant aux fréquences de vibration de valence des doubles liaisons C=C des aromatiques et des oléfmes (υ 1650 cm"1), ainsi que celles dues aux liaisons C-O des éthers (υ 1245, 1118 cm"1).
Son spectre de RMN 13C Jmodulé (75,45 MHz, acétone-d6, Cf. Tableau 2) présente 28 signaux dus aux 28 atomes de carbone présents dans la molécule. L'analyse du spectre permet de mettre en évidence 18 signaux de phase négative, correspondant aux carbones secondaires et quaternaires, parmi lesquels un signal de carbonyle à δ 183,2, et au moins six carbones oxygénés hybrides sp2 résonant entre δ 144,1 et 162,9 ; 10 signaux de phase positive correspondant aux carbones primaires et tertiaires, dont six méthyles résonnant à δl7,5 ;17,7 ; 18,1 ; 25,7 ; 25,8 ; 25,9 ; les quatre autres signaux, tous hybrides sp2 et résonant à δ93,2 ; 123,8 ; 124,9 et 125,2, étant dus aux carbones tertiaires. Toutes ces informations, combinées avec la présence sur le spectre de RMN 1H (300,1 MHz, acétone-dβ, Cf. tableau 2) d'un signal d'un proton à δl3,90, correspondant à un hydroxyle chélaté, montre que le composé PG2 est une xanthone.
Sur le spectre de RMN 1H, on observe, en outre : un signal intégrant deux protons échangeables à l'eau lourde à δ9,43 et un troisième à 2,80 attribuable à trois groupements hydroxyles, un singulet d'un proton à 6,38, attribuable à un proton aromatique, enfin, trois ensembles de signaux attribuables aux groupements caractéristiques γ,γ- diméthylallyle et constitués de trois protons oléfmiques à δ5,28 (m, H-2') ; 5,26 (m, H- 2") et 5,25 (m, H-2'") ; trois paires de protons allyliques à δ3,46 (d, J=7,12 Hz, CH2- 1 ') ; 3,56 (d, J=7,19 Hz, CH2-I ") et 4,20 (d, J=7,35 Hz, CH2-I '") et six groupements méthyle à δl,68 (s, CH3-5', 5", 5'") ;l,80 (s, CH3-4'") ; 1,82 (s, CH3-4') et 1,86 (s, CH3-4").
Sur le squelette xanthonique, le premier groupement prényle occupe la position C-8, et se trouve en position péri, en raison du déblindage que subissent ces protons allyliques H-I " de la part du cône d'anisotropie paramagnétique du carbonyle, puisqu'il résone à δ4,20 au lieu de δ3,2-3,40. Le deuxième groupement γ,γ-diméthylallyle, se trouve en position C-2 sur la base des corrélations à longue distance C, H, observées sur son spectre HMBC. En effet, sur ce spectre, les protons du CH2 allylique en position - 1 ' (δ3,46) donnent, entre autres, des tâches de corrélations 3J avec le carbone C-I résonant à δl61,5 et le carbone C-2 résonant à δl 11,0. Cette position est confirmée en plus par les corrélations observées sur le spectre NOESY entre les protons allyliques H- 1 ' et le proton de l'hydroxyle chélaté en position 1.
Le proton aromatique résonant à δ6,38 est donc localisé en position C-4 et présente à la fois les tâches de corrélations 2J, 3J avec les carbones C-4a (155,2) et C-3 (163,0), le troisième groupement prényle occupe la position 5.
Sur la base de toutes ces données physiques et spectrales, la structure de la l,3,6,7-tétrahydroxy-2,5,8-tri (3-méthylbut-2-ényl)xanthone, encore appelée garcinone E, a été attribuée à PG2. Ce composé a été décrit pour la première fois par Sakai et Coll. en 1993. Tableau 2 : Données spectrales de RMN 13/ C et RMN H de la garcinone E
Figure imgf000018_0001
Exemple 3 : Préparation de composés de formule (I) ou (II) extraits, isolés et purifiés à partir des plantes à'Allanblackia monticola et à'Allanblackia floribunda, et préparation d'extraits à partir de la plante à'Allanblackia gabonensis
Le composé (I), dans lequel Ri et R6 = groupe prényle ; R2 = OH ; R3 et R4 = H ; et R5 = OCH3, a été extrait de la plante Allanblackia monticola. Il s'agit de l'α- mangostine (AM5). Le composé (I), dans lequel Ri et R2 forment ensemble un cycle pyranique, substitué par un groupe gem diméthyle ; R3 représente le groupe l,l-diméthyl-2- propène ; R4 = OH ; et R5 et R6 = H, a été extrait de la plante Allanblackia floribunda. Il s'agit de la macluraxanthone (AFR6).
Le composé (II), dans lequel R = H, a été extrait de la plante Allanblackia floribunda. Il s'agit de la volkensiflavone (AFR7).
Le composé (II), dans lequel R = OH, a été extrait de la plante Allanblackia floribunda. Il s'agit de la morelloflavone (AFR8).
Allanblackia monticola est un arbre d'environ 20m de hauteur et de 60 cm de diamètre. Les écorces sont marrons avec des entailles internes jaunes et des entailles externes rouges. Les fleurs sont jaunes et dégagent une odeur caractéristique vers 11 heures de la matinée. Les fruits, plus ou moins ovoïdes ou allongés d'environ 12 cm, renferment en outre de nombreuses graines (10 à 12 graines environ par fruit).
Allanblackia floribunda est un arbre atteignant 30 m de hauteur et 80 cm de diamètre avec un empattement à la base, un fût droit et cylindrique, des branches courtes, horizontales, très nombreuses formant un panache de feuillage dense. L'écorce est brune, mince, écailleuse ; la tranche cassante, rougeâtre à l'extérieur, jaune à l'intérieur, exsude un latex jaune. Les feuilles persistantes, sont opposées, simples, entières (12-25 x 5-8 cm) coriaces, luisantes en dessus à très nombreuses nervures latérales parallèles, à pétioles long de 1 à 1,5 cm. Les fleurs sont grosses (5 cm de diamètre) disposées en grappes. Elles sont de couleurs blanche, rosé ou rouge de type 5 unisexuées à pédicelles long de 2,5 à 8 cm. Les fruits sont des baies allongées (20 à 50 x 8 à 15 cm), brunes claires piquetées de châtains à 5 côtes plus ou moins marquées, pendantes à l'extrémité d'un pédoncule laissant exsuder un latex jaune abondant. Les graines (2,5 x 2 cm) nombreuses (40 à 100 par fruit) et brunes sont entourées d'une pulpe gélatineuse et rosâtre. Elle renferme une matière grasse comestible (beurre de boandjo par Yokadouma) (Vivien et Faure, 1995).
Allanblackia gabonensis est l'une des espèces du genre Allanblackia qui se retrouve en Afrique tropicale (Cameroun, Zaïre) entre 500 et 1750 m d'altitude.
Ce sont des arbres à base à peine évasée, mais parfois avec contreforts a fût droit. Ses branches sont horizontales et retombantes. L'écorce est rougeâtre et écailleuse. La tranche rougeâtre exsude un latex jaune. Cette espèce a de petites feuilles (6 à 12 cm de long et 2,5 à 5 cm de large) obovales, cuspidées, opposées et rouges pendantes. Elle a des pédicelles épais de 2 à 6 cm de long, de grosses fleurs blanches, rouges ou rosés et unisexuées. Ses fruits, globuleux ou ovoïdes, bruns clairs piquetés de châtain contiennent de 10 à 12 graines par fruit.
Des écorces du tronc, racines, feuilles et fruits de AHanblackia monticola, ainsi que des racines de AHanblackia floribunda, et des fruits de AHanblackia gabonensis, ont été récoltés au Cameroun.
Extraction : Obtention des extraits EAFR, EAM, EFAM, ERAM, et EAGC
Les écorces du tronc, racines et feuilles de AHanblackia monticola ont été découpées séparément en petits morceaux, séchées, puis broyées. Ceci a permis d'obtenir respectivement 3 kg d'écorce du tronc, 2,5 kg de feuilles, et 2 kg de racines. L'extraction par macération dans le mélange chlorure de méthylène-méthanol (1/1) des différentes poudres a permis d'obtenir, après évaporation sous pression réduite, 250 g d'extrait des écorces du tronc (EAM), 225 g d'extrait des feuilles (EFAM), et 115g d'extrait des racines (ERAM).
Les racines de Allanblackia floribunda ont été découpées en petits morceaux, séchées, puis broyées. La poudre résultante, 5 kg, est extraite par macération successivement au mélange CH2Cl2-MeOH (1 :1) pendant 24 heures et au MeOH pur pendant 4 heures. Chacun des extraits est concentré à sec sous pression réduite au moyen d'un évaporateur rotatif, et donne respectivement 137 g au CH2Cl2-MeOH et 45 g au MeOH pur, qui sont réunis sur la base de la CCM. analytique pour conduire à un extrait total (EAFR).
Les fruits de Allanblackia gabonensis ont été débarrassés de leurs graines, et les coques ont été découpées, séchées puis broyées. La poudre (250g) ainsi obtenue a été extraite par macération à froid dans le mélange CH2Cl2-MeOH (1 :1) pendant 48 heures. Après concentration à sec du solvant sous pression réduite, 18g d'extrait EAGC au CH2Cl2-MeOH ont été obtenus. Isolement et purification du composé AM 5
150 g des 250 g d'extrait brut des écorces du tronc d'Allanblackia monticola sont fractionnés sur une colonne flash contenant 200 g de silice de granulométrie 70-230 mesh. L'élution est faite au moyen d'un mélange hexane-acétate d'éthyle de polarité croissante. Les fractions de 300 ml sont collectées et réunies sur la base de la CCM. Ceci a permis d'obtenir 4 séries indexées A, B, C et D.
La série B, issue des fractions 18-39 qui ont été éluées avec le système hexane- acétate d'éthyle 7,5/2,5, est constituée d'une masse visqueuse de 25 g.
Elle est chromatographiée sur une colonne de silice (granulométrie 70-230 mesh) et éluée avec le mélange hexane-acétate d'éthyle de polarité croissante. 95 fractions de 150 ml chacune ont été recueillies et réunies sur la base de la CCM. Les fractions 71-80, rassemblées sur la base de la chromatographie sur couche mince, renferment 4 produits, après plusieurs chromatographies sur colonne utilisant comme éluant le système hexane-acétate 9/1. Ainsi, deux composés ont pu être isolés à l'état pur, parmi lesquels 15 mg d'une poudre jaune so lubie dans l'acétone, indexée AM2, et 300 mg de cristaux jaunes, indexés AM5.
Composé AM5 (α-mangostine) : Ce composé cristallise sous forme de poudre jaune ; PF = 178 - 1800C ; Masse moléculaire 410 g/mol ; Formule brute : C24H26O6.
Isolement et purification des composés AFR6, AFR7 et AFR8 150 g des 182 g de l'extrait total (EAFR) à'Allanblackia floribunda ont été soumis à une chromatographie "flash" contenant 500 g de silice de granulométrie 70- 230 mesh en vue d'un fractionnement, et ont été élues respectivement au chlorure de méthylène, au mélange hexane-acétate d'éthyle 50 %, à l'acétate d'éthyle pur, et enfin au mélange acétate d'éthyle-méthanol 10 %. 20 fractions de 400 ml chacune ont été collectées et réunies sur la base de la CCM.
Les fractions 50 à 53, éluées avec le système hexane-acétate d'éthyle (9/1), précipitent sous forme d'une poudre jaune qui, après lavage et fîltration, fournit un composé pur indexé AFR6.
La série B, constituée des fractions 6 à 13 qui ont été éluées avec les systèmes Hexane- AcOEt 50 % et AcOEt pur 100 %, est constituée d'une masse visqueuse de 40 g. Cette série est rechromatographiée dans une colonne de gel de silice, et éluée avec le système Hexane AcOEt de polarité croissante. Les fractions de 150 ml sont collectées et regroupées sous la base de la CCM.
Les fractions 37 à 45 cristallisent après 3 jours dans le chlorure de méthylène sous forme de cristaux jaunes qui, après lavage et fïltration, donnent un composé soluble à l'acétone indexé AFR7.
Les fractions 50-62 cristallisent également dans le chlorure de méthylène sous forme de cristaux jaunes qui, après lavage et fïltration, fournissent un composé indexé AFR8.
Macluraxanthone (AFRβ)
" Cristallise sous forme de cristaux jaunes " Test au chlorure ferrique positif
- P.F. 17FC
" Formule brute C23H22O6
Volkensiflavone (AFR7)
• Cristallise sous forme de cristaux jaunes dans le chlorure de méthylène " Test au chlorure ferrique positif
- P.F 201,6-202,80C
• Formule brute C30H20O10
Morelloflavone (AFR8)
• Cristallise sous forme de poudre jaune dans le chlorure de méthylène " Test au chlorure ferrique positif
- P.F 244,6-245,8°C
• Formule brute C30H20O11
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AFR7 (R=H) AFR8 (R=OH)
Exemple 4 : Etude de l'activité biologique des produits in vitro
Exemple 4.1. Evaluation de la cytotoxicité à la sulforhodamine B des composés (I) ou (II) et des extraits contenant de tels composés selon la présente invention
La sulforhodamine B (SRB) est un colorant qui se lie aux protéines, et dont l'adsorption peut être mesurée au spectrophotomètre à 550 nm (coloration rosé).
Pour ce test, des cellules MRC5 fïbroblastes humains (Biomérieux) ont été cultivés à 37°C dans une plaque 96 puits (Costar), à raison de 2.104 cellules par puits, dans 200 μl de milieu MEM (Gibco), auquel 5% de sérum de veau fœtal ont été ajoutés. Après 24h de culture, le milieu est changé et les extraits, dont on veut tester la toxicité, sont ajoutés après avoir été repris dans le volume de solvant approprié indiqué (diméthylsulfoxyde ou eau). Les concentrations indiquées dans les figures de la présente demande sont les concentrations finales dans les puits. On laisse 48h en culture. On fixe ensuite les cellules en ajoutant 50 μl de TCA (acide trichloroacétique) froid par puits, à la surface du milieu de culture, et on laisse reposer la plaque 5 minutes à température ambiante, puis 2 heures à 4°C.
Le surnageant est ensuite éliminé, et les puits sont lavés 5 fois avec 100 μl d'eau (la plaque étant vidée par retournement). On laisse alors sécher la plaque. Elle peut être conservée sèche jusqu'à coloration. 100 μl de sulforhodamine B (à 0,4% dans de l'acide acétique 1%) sont ajoutés dans chaque puits. La coloration dure 20 minutes. La sulforhodamine est ensuite enlevée, et les puits rincés 5 fois à l'acide acétique 1%. On solubilise alors la coloration liée aux cellules pendant 5 minutes en ajoutant lOOμl de Tris Base 1OmM (pH 10,5).
La densité optique est lue à 550 nm sur un lecteur de microplaques (Bio-Rad model 550).
Le résultat de l'analyse de la cytotoxicité des composés EVL 9 et PG2 apparaît sur la Figure 1. Cette figure montre ainsi que les produits EVL9 (laurentinone A) et PG2 (garcinone E), aux concentrations 0,01 mg/mL et 0,005 mg/mL, ne sont pas cytotoxiques. Le DMSO à 20% utilisé comme contrôle est quant à lui toxique, puisque plus de 60% de cellules sont tuées.
Le résultat de l'analyse de la cytotoxicité des produits AM5 (α-mangostine), AFR6 (macluraxanthone), AFR7 (volkensiflavone), et AFR8 (morelloflavone), ainsi que des extraits contenant de tels composés : EAFR, EFAM, ERAM, apparaît sur la Figure 2.
Il apparaît ainsi que les différents produits testés, à savoir les composés AM5, AFR6, AFR7, AFR8, et les extraits contenant de tels composés ne présentent pas de cytotoxicité significative aux concentrations utilisées.
Exemple 4.2. Evaluation de l'activité antiparasitaire (anticoccidienne) des composés (I) ou (II) et des extraits contenant de tels composés
Afin d'évaluer l'activité antiparasitaire (anticoccidienne) des composés et/ou des extraits selon la présente invention, le test ELISA a été utilisé sur la coccidie Toxoplasma gondii (souche virulente RH) par mesure de l'activité β-galactosidase.
Le test est réalisé sur la reconnaissance spécifique d'un anticorps des protéines parasitaires de surface de Toxoplasma gondii (T gondii), ce qui permet d'évaluer la multiplication du parasite.
La souche de T. gondii utilisée correspond à la souche RH recombinante, un gène codant la β-galactosidase ayant été introduit dans le génome du parasite. Des cellules MRC5 (fïbroblastes humains), confluentes dans des plaques 96 puits, sont infestées par 2.104 tachyzoites (200 μL) pendant 1 heure. Après lavage des puits (une fois avec du MEM supplémenté), les extraits à tester sont ensuite ajoutés à la bonne concentration dans un volume de 200 μL.
Deux témoins sont réalisés : des cellules saines d'une part, et des cellules infestées non traitées d'autre part.
Après lyse des cellules (48 à 72 heures), on centrifuge la plaque 200 g pendant 5 minutes à température ambiante. La lyse est effectuée avec 50 μL de tampon de lyse 1 heure à 500C.
Le tampon de lyse contient : - HEPES 100 mM pH 8
- MgSO4 1 mM - Triton X 100 1 %
- DTT 5 mM
La lyse est vérifiée au microscope photonique. On ajoute 160 μL de tampon de réaction, et on laisse 5 minutes à 37°C.
Le substrat de l'enzyme est ajouté dans les puits : 40 μL de chlorophénolred-β- D-galactopyranoside 6,25 mM en solution dans du tampon phosphate pH 7,3.
Le tampon phosphate 0,1 M pH 7,3 contient:
- Na2HPO4 1 M
- NaH2PO4 1 M le pH est ajusté à 7,3.
Le tampon de réaction contient :
- Tampon phosphate 100 mM pH 7,3
- β mercaptoéthanol 102 mM
- MgCl2 9 Mm.
La réaction se fait à 37°C jusqu'à obtenir une coloration rouge. La Densité Optique (DO) à 540 nm (plus grande sensibilité à 570 nm) / 420 nm est mesurée. Celle- ci traduit la quantité de β-galactosidase présente dans le puits, ce qui révèle donc la quantité de parasites présents dans le puits.
Le résultat de l'analyse de l'activité anticoccidienne des extraits ERPG et ETVL apparaît sur la Figure 3. Les concentrations utilisées sont : 0,02 mg/mL, 0,01 mg/mL et 0,002 mg/mL. Elles ont été déterminées sur la base des résultats de l'étude de la cytotoxicité. Il s'agit bien de concentrations non cytotoxiques.
Ainsi, l'effet de l'extrait ERPG à 0,02 mg/mL est le suivant : 96% + /- 0% ; à 0,01 mg/mL : 74%+/- 1% ; et à 0,002 mg/mL : 56%+/-3%.
L'effet de l'extrait ETVL à 0,02 mg/mL est le suivant : 95% + /- 0% ; à 0,01 mg/mL : 95%+/-0% ; et à 0,002 mg/mL : 68%+/-4%.
La Figure 3 montre ainsi que les produits sont efficaces aux concentrations utilisées les plus élevées.
Les résultats des activités anticoccidiennes des produits PG2 (garcinone E) et EVL9 (laurentinone A) apparaissent respectivement sur les Figures 4 et 5.
Pour cette étude, les produits PG2 et EVL9 sont solubilisés dans le DMSO. L'effet des solutions de DMSO a été analysé au préalable. Il en ressort que les effets antiparasitaires des produits d'origine végétale observés sont dus à l'action des molécules, et non à l'action du DMSO. Les concentrations utilisées pour EVL9 et PG2 sont : 0,01 mg/mL et 0,005 mg/mL.
Il apparaît sur ces figures que l'effet de la molécule EVL9 à 0,005 mg/mL est le suivant : 73% + /- 4% ; à 0,01 mg/mL : 86%+/-8%.
Et, l'effet de la molécule PG2 à 0,005 mg/mL est le suivant : 86% + /-2%; à 0,01 mg/mL : 91% + /- 7% .
Les Figures 4 et 5 montrent ainsi que les produits sont efficaces aux concentrations utilisées.
Ainsi, les deux composés ont une activité antiparasitaire (anticoccidienne) forte contre T.gondii : en moyenne 85 % d'inhibition de développement pour les deux concentrations testées (3 essais). Les extraits ERPG et ETVL ont également une activité antiparasitaire (anticoccidienne) élevée contre T. gondii.
Le résultat des activités anticoccidiennes des produits AM5, AFR6, AFR7, AFR8, et des extraits EAFR, EFAM, et ERAM apparaît sur la Figure 6. Les concentrations utilisées sont : AM5 : 5 μg/mL, AFR6 : 5 μg/mL et 10 μg/mL, AFR7 : 5 μg/mL et 10 μg/mL, AFR8 : 5 μg/mL et 10 μg/mL, EAFR : 10 μg/mL, EFAM : 5 μg/mL et 10 μg/mL, ERAM : 5 μg/mL et 10 μg/mL.
La Figure 6 montre que les produits sont efficaces aux concentrations utilisées.
Il apparaît ainsi que les différents produits et extraits présentent en moyenne une activité anticoccidienne comprise entre 80 et 92%.
Exemple 5 : Etude de l'activité biologique des produits in vivo.
L'étude de l'activité biologique des produits in vivo a été réalisée sur des lots de poussins auxquels ont été administrées des solutions préparées avec les produits suivants (200mL/jour/poulet pendant 9 jours) :
Extraits testés :
ERPG : 0,02 mg/mL et 0,04 mg/mL
ETVL : 0,02 mg/mL et 0,04 mg/mL EFAM : 0.02 mg/mL
ERAM : 0,02 mg/mL et 0,04 mg/mL EAGC : 0,02 mg/mL et 0,03 mg/mL
Molécules testées :
AM5 : 0,005 mg/mL
AFR8: 0,005 mg/mL PG2: 0,005 mg/mL
Déroulement de l'expérimentation
JO : arrivée des poussins
J12 : baguage, pesée, histogramme des poids, rejet des extrêmes.
252 poulets pesant en moyenne 275 grammes ont été ainsi retenus. Ces poulets ont été répartis par lot de 6 poulets dans 42 cages, soit 18 poulets par lot (3 répétitions par lot). Chaque lot a reçu les solutions préparées selon les concentrations préconisées ci-dessus sur la base de 200 ml / jour / poulet pendant 9 jours. Les 2 lots témoins n'ont reçu que de l'eau.
J19 : Les poulets ont été pesés, et 13 lots sur 14 on été infestés par des oocystes de coccidies sporulés. Un lot témoin n'a pas été infesté.
J25 : Contrôle de l'excrétion d'oocystes de coccidies.
J26 : Après le contrôle de l'excrétion oocystes, les poulets ont été pesés, et 3 poulets ont été sacrifiés par cage et autopsiés. Les scores lésionnels ont été notés.
J27 : Contrôle de l'excrétion d'oocystes.
En plus des critères parasito logiques (excrétion ookystale, scores lésionnels), des critères zootechniques ont été également étudiés, à savoir le gain de poids, le GMQ et l'indice de consommation.
Remarque : Tous les poulets morts pendant l'essai après l'infestation, ont été autopsiés. Pour tous ces poulets, la cause de la mort est la coccidiose. Ils présentaient tous des diarrhées sanguinolentes avec des scores lésionnels de +4 au niveau des intestins.
L'expérimentation a été menée sur deux périodes : 26 et 48 jours.
Les résultats des effets coccidio statiques des extraits et des molécules selon l'invention apparaissent sur les Figures 7 et 8.
Pour la Figure 7, les pourcentages de croissance des poulets sont calculés par rapport au témoin non inoculé et non traité (100% de croissance des poulets), sur une période de 26 Jours. Pour le témoin inoculé non traité, il y a eu 55% de mortalité.
Pour la Figure 8, les pourcentages de croissance des poulets sont calculés par rapport au témoin non inoculé et non traité (100% de croissance des poulets), sur une période de 48 Jours. Pour le témoin inoculé non traité, il y a eu 55% de mortalité.
Ces essais ont montré que les différents produits biologiques testés ont donné des résultats satisfaisants.
Ainsi, pour les différents extraits testés, malgré une excrétion d'oocystes plus ou moins importante, les animaux ont gardé un appétit normal et croissant, ce qui s'est de facto répercuté sur leur poids corporel, donc leur croissance. Leurs performances ne sont pas très éloignées de celles des témoins non inoculés et non traités (Cf. Figures 7 et 8).
Par contre, les témoins inoculés et non traités sont morts de coccidiose (diarrhées sanguinolentes, lésion des intestins), ou ont eu une baisse considérable de leur consommation alimentaire (Cf. Figures 7 et 8).
Le taux de mortalité des poulets lors des essais coccidiostatiques apparaît sur la Figure 9. Aucune mortalité n'a été attribuée aux produits testés, ce qui confirme leur caractère non toxique.
Cet essai permet de conclure que les produits testés sont non toxiques pour les poulets et présentent une activité coccidiostatique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'hétérocycles oxygénés choisis parmi les xanthones et les biflavonoïdes pour la préparation d'une composition destinée à agir comme agent anti- coccidien, les coccidies étant choisies dans le groupe constitué par Eimeria, Isospora, Toxoplasma, Besnoitia et Neospora.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est destinée à agir comme agent anti-coccidien chez l'animal, en particulier le bétail.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les hétérocycles oxygénés sont des xanthones répondant à la formule générale (I)
Figure imgf000030_0001
(I) dans laquelle chacun des radicaux Ri à R6 représente indépendamment un atome d'hydrogène, un radical hydroxy, un radical alcoxy avantageusement en Ci à C6, un radical alkyle, linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C6, ou un radical alcène linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C6, ou bien Ri et R2 forment ensemble un cycle, tel qu'un dérivé pyranique ou furanique, éventuellement substitué par au moins un groupe alkyle avantageusement en Ci à C6.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que chacun des radicaux Ri à R6 représente indépendamment un atome d'hydrogène, un radical hydroxy, un radical alcoxy tel qu'un méthoxy, ou un radical alcène linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C5.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que R1, R2, R3 et R5 représentent un atome d'hydrogène ;
R4 représente un radical hydroxy ; et R6 représente un radical méthoxy.
6. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que Ri et R6 représentent un radical alcène ramifié, avantageusement un groupe prényle ; R2 représente un radical hydroxy ;
R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène ; et
R5 représente un radical méthoxy.
7. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que R1, R4 et R6 représentent un radical alcène ramifié, avantageusement un groupe prényle ;
R3 représente un atome d'hydrogène ; et R2 et R5 représentent un radical hydroxy.
8. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que Ri et R2 forment ensemble un cycle tel qu'un dérivé pyranique ou furanique, avantageusement substitué par au moins un groupe alkyle, typiquement en Ci à C6 ;
R3 représente un radical alcène linéaire ou ramifié, avantageusement en Ci à C5, et
R4, R5 et R6 représentent chacun indépendamment un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que Ri et R2 forment ensemble un cycle pyranique, avantageusement substitué par au moins un groupe méthyle, en particulier substitué par un groupe diméthyle ;
R3 représente un radical alcène ramifié, tel qu'un groupe l,l-diméthyl-2-propène ;
R4 représente un radical hydroxy ; et
R5 et R6 représentent un atome d'hydrogène.
10. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les hétérocycles oxygénés sont des biflavonoïdes répondant à la formule générale (II)
Figure imgf000031_0001
(H) dans laquelle le radical R représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxy.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les hétérocycles oxygénés sont extraits de plantes choisies dans le groupe constitué par Vismia laurentii, Pentadesma grandifolia, Allanblackia monticola, Allanblackia floribunda, et Allanblackia gabonensis .
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition est destinée à la prévention ou au traitement de coccidioses chez l'homme ou l'animal, en particulier de maladies parasitaires du bétail, par exemple des bovins, des lapins, des porcs, ou des oiseaux, par exemple de la volaille telle que les poulets ou les dindes.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition est destinée à être administrée par voie orale.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition est une composition pharmaceutique, une composition alimentaire telle qu'un aliment ou une boisson, ou un complément alimentaire.
15. Composé répondant à la formule suivante (Ia) :
Figure imgf000032_0001
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