[go: up one dir, main page]

WO2007105529A1 - 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤 - Google Patents

化学発光性化合物及びそれから成る標識剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2007105529A1
WO2007105529A1 PCT/JP2007/054254 JP2007054254W WO2007105529A1 WO 2007105529 A1 WO2007105529 A1 WO 2007105529A1 JP 2007054254 W JP2007054254 W JP 2007054254W WO 2007105529 A1 WO2007105529 A1 WO 2007105529A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
chemiluminescent
derivative
compound
hydrogen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/054254
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Koji Suzuki
Koji Yamada
Akemi Sato
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanagawa Academy of Science and Technology
Original Assignee
Kanagawa Academy of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kanagawa Academy of Science and Technology filed Critical Kanagawa Academy of Science and Technology
Publication of WO2007105529A1 publication Critical patent/WO2007105529A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/022—Boron compounds without C-boron linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C09K11/07—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials having chemically interreactive components, e.g. reactive chemiluminescent compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1011—Condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1096—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing other heteroatoms

Definitions

  • the present invention relates to a chemiluminescent compound and a labeling agent comprising the same.
  • Chemiluminescent compounds are widely used as labeling agents in various fields including immunoassay. Many of them are obtained by connecting a chemiluminescent substance having good performance such as a lucigenin derivative and a fluorescent dye such as rhodamine through a spacer (Patent Documents 1 to 13).
  • chemiluminescent materials have problems such as unsatisfactory luminous efficiency, low stability, and difficulty in synthesis.
  • labeling agents it is difficult to change the fluorescence emission wavelength greatly only by changing the substituent.
  • a fluorescent dye having a polonedipyrromethene skeleton is known (Patent Document 14).
  • no chemiluminescent compound in which boron dipyrromethene fluorescent dye is bound to other chemiluminescent groups is known.
  • Patent Document 1 International Publication No. W098 / 54574
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 9-5238
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 10-81659
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-51490
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-26665
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-183641
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-137824
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-302483
  • Patent Document 9 JP 2001-281257 A
  • Patent Document 10 JP 2001-115155 A
  • Patent Document 11 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-81455
  • Patent Document 12 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-245499
  • Patent Document 13 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-178550
  • Patent Document 14 US Patent No. 5,723,218
  • Patent Document 15 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-379505
  • Patent Document 16 US Pat. No. 5,869,689
  • Non-Patent Document 1 A. Burghart, H. Kim, M. B. Welch, L. H. Thoresen, J. Reibenspies, K
  • Non-Patent Document 2 M. A. T. Rogers, Journal of the Chemical Society, 1943, page 596
  • An object of the present invention is to provide a novel chemiluminescent compound capable of greatly changing the fluorescence emission wavelength only by changing a substituent having high luminous efficiency, and a labeling agent comprising the same. It is.
  • the present invention provides a chemiluminescent compound having a structure represented by the following general formula [I].
  • R 2 , R 4 and R 6 is a chemiluminescent group, and the others are hydrogen or any group which does not inhibit the light emission of the compound, R 5 and R 7 Is Independently of each other, hydrogen or any group that does not inhibit the light emission of the compound, R 8 and R 9 are independently of each other fluorine, an alkoxy group, or a chemiluminescent group (however, both are not chemiluminescent groups at the same time) ).
  • the present invention also provides a labeling agent comprising the chemiluminescent compound of the present invention. Furthermore, the present invention provides a combination of labeling agents comprising a plurality of types of the chemiluminescent compounds of the present invention having different emission wavelength adjusting groups from each other and thereby different emission wavelengths. Furthermore, the present invention provides a method for measuring a labeled substance, which comprises subjecting the substance labeled with the labeling agent of the present invention to a reaction, and after the reaction, causing the labeling agent to emit light and measuring the substance.
  • the present invention uses a plurality of types of the chemiluminescent compounds of the present invention having different emission wavelength adjusting groups from each other and thereby different emission wavelengths as labeling agents, and each labeling with the plurality of labeling agents.
  • the present invention provides a method for simultaneously measuring a plurality of labeled substances, comprising: subjecting the plurality of kinds of substances to a reaction, and after the reaction, causing each of the labeling agents to emit light and simultaneously measuring the plurality of types of the substances.
  • a novel chemiluminescent compound capable of greatly changing the fluorescence emission wavelength only by changing a substituent having high emission efficiency and a labeling agent comprising the same are provided.
  • the boron dipyrromethene skeleton employed in the chemiluminescent compound of the present invention has high luminous efficiency.
  • the chemiluminescent group is not bonded to the boron dipyrromethene skeleton via a spacer. Since it is directly coupled, the luminous efficiency can be further increased.
  • the fluorescence emission wave The length can be changed greatly. Since introduction of an arbitrary substituent on the boron dipyrromethene skeleton can be easily performed by a conventional method, a plurality of chemiluminescent compounds having different fluorescence emission wavelengths can be easily synthesized according to the present invention. be able to. Since these structures may have the same structure other than the modified substituent, in particular, the chemiluminescent group that chemiluminescents by the reaction, these multiple chemiluminescent substances emit light optimally under the same conditions.
  • the plurality of types of substances are respectively the same.
  • it becomes possible to measure This makes it possible to measure a plurality of different types of test substances at the same time, for example, in an immunoassay, and thus provides a new measurement technique according to the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing a spectrum of chemiluminescence wavelength of a compound of the present invention produced in an example of the present invention in comparison with a known dye.
  • the chemiluminescent compound of the present invention has a structure represented by the above general formula [I].
  • at least one of R 2 and R 6 is a chemiluminescent group, and other than that, hydrogen or any group that does not inhibit the light emission of the compound
  • R 5 and R 7 are each independently hydrogen or any group that does not inhibit the light emission of the compound
  • R 8 and R 9 are each independently fluorine, an alkoxy group or a chemiluminescent group (provided that both are simultaneously Not a chemiluminescent group).
  • the chemiluminescent group is preferably R 2 and / or R 6 .
  • the chemiluminescent group is a group having a structure that emits light by a chemical reaction.
  • the boron dipyrromethene moiety emits fluorescence by the light emitted from the chemiluminescent group, and this fluorescence is measured. Therefore, any chemiluminescent group that emits light that can excite the boron dipyrromethene moiety and emit fluorescence can be used as long as it does not necessarily emit visible light. Can do.
  • a luminescent group if it is used in this field as a labeling agent, it is! Any of these can be used, and various ones are known or well known.
  • Preferred examples include phthalcarbazide derivatives, dioxetane derivatives, oral fin derivatives, atalidine derivatives, indole derivatives, oxalic acid derivatives, diphenol derivatives or luciferin derivatives, all of which are well known in the art.
  • Each of these chemical luminescent groups is represented by the following general formula.
  • R is independently of each other hydrogen, an alkyl group, an aryl group, halogen, alkoxy, aryl alkyl, cycloalkyl, acyl, formyl, sialalkyl, heteroaryl, It is a substituent such as mono- or di-alkylamino, and one R in each general formula is bonded to the boron dipyrromethene skeleton directly or via a spacer.
  • the carbon number of the alkyl group in the group containing an alkyl group or an alkyl group part is usually about 1 to 10.
  • the term “alkyl group” includes both a linear alkyl group and a branched alkyl group.
  • any of the four Rs is -NR a R b (wherein R a R b is independently hydrogen or an alkyl group) is a luminol derivative.
  • a phthalhydrazide derivative capable of easily synthesizing a raw material phthalic acid capable of coupling synthesis to a boron dipyrromethene skeleton having a high emission quantum yield is preferable.
  • chemiluminescent groups are usually used in each compound, but a plurality of types may be combined.
  • the chemiluminescent group can be bonded to the boron dipyrromethene skeleton through a spacer such as an alkylene group, but by bringing the chemiluminescent group as close as possible to the boron dipyrromethene skeleton, a fluorescence that can generate partial dipyrromethene partial force is also generated.
  • the chemiluminescent group is directly bonded to the boron dipyrromethene skeleton without using a spacer. By selecting the boron dipyrromethene skeleton as the fluorescent dye, the chemiluminescent group can be easily coupled directly.
  • the boron dipyrromethene skeleton emits fluorescence
  • the boron dipyrromethene skeleton emits fluorescence.
  • groups other than the chemiluminescent group are not particularly limited. It may be any group that does not inhibit the light emission of the compound. Examples of the optional group include a light emission wavelength adjusting group, a binding group, and a polar group described later. As mentioned above, any group that does not fall under any of these may be hydrogen or any group that does not inhibit light emission of the compound, but preferred examples include a hydrogen atom and an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. be able to.
  • the fluorescence emission wavelength can be changed without changing other parts by changing the substituent bonded to the boron dipyrromethene skeleton. Can be greatly changed. It is preferable to have a light emission wavelength adjusting group as at least one of R 1 to R 7 utilizing this feature.
  • the “emission wavelength adjusting group” means a group in which the emission wavelength of fluorescence changes when this group is bonded as compared to the case where this group is not bonded.
  • the emission wavelength adjusting group is a group that can be combined with a boron dipyrromethene skeleton, and the wavelength of the fluorescence emitted by the boron dipyrromethene moiety.
  • the emission wavelength adjusting group may be any group.
  • the fluorescence wavelength changes relatively large by changing a single group.
  • the fluorescence wavelength may change on the longer wavelength side compared to the case where no emission wavelength adjusting group is provided. Therefore, preferred examples of the emission wavelength adjusting group include an alkyl group, an alkoxyl group, an aryl group, a heteroaryl group, and derivatives thereof.
  • carbon number of the alkyl part in an alkyl group or an alkoxyl group 1-10 are preferable.
  • a aryl group a phenol group and a naphthalene group are preferable.
  • a heteroaryl group one or more carbon atoms in the phenol group and the naphthalene group are nitrogen, oxygen, and Z or Groups substituted with iow are preferred.
  • a hydrogen atom bonded to one or a plurality of carbon atoms constituting these groups is a halogen, a cyano group, an alkoxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a mono- or dialkyl.
  • a group such as an amino group, a carbo group, a carboxyl group, a thiol group, or a disulfide group are preferred, and the carbon number of the alkyl moiety in these substituents is preferably 1 to 10 forces, and 1 to 6 is preferred. Further preferred.
  • the above alkyl group or alkoxyl group is constituted. A group in which one or a plurality of carbon atoms formed is replaced with at least one of oxygen, nitrogen and nitrogen is also preferable as the derivative of the alkyl group or alkoxyl group.
  • the hydrogen atom bonded to one or more carbon atoms constituting these groups is halogen, cyano group, alkoxyl group, amino group, hydroxyl group, mono- Alternatively, those substituted with a group such as a di-alkylamino group, a carbonyl group, a carboxyl group, a thiol group, or a disulfide group are preferred.
  • the carbon number of the alkyl moiety in these substituents is preferably 1 to 10 1 ⁇ 6 is more preferred.
  • the emission wavelength adjusting group a substituent such as benzocrown, N-arylazacrown, amide group, etc., whose electronic structure is changed by molecular recognition or chemical reaction and whose emission wavelength is changed is used. .
  • the fluorescence wavelength of the boron dipyrromethene fluorescent dye is greatly influenced by the type of substituents bonded to R 1 and R 7 in the general formula [I]
  • the above-described emission wavelength adjusting group is represented by R 1 And Z or R 7 is preferred.
  • a plurality of emission wavelength adjusting groups can be bonded, and different types of emission wavelength adjusting groups can be bonded to one boron dipyrromethene skeleton.
  • each labeling agent must be subjected to the chemiluminescence reaction under the same conditions. Therefore, it is preferable that the chemiluminescent group of each labeling agent is the same.
  • At least one of R 1 to R 7 in the general formula [I] has a binding group.
  • the binding group means a group that can be used for binding to another compound. Since chemiluminescent labeling agents are often bound to biologically related substances such as proteins, polypeptides, and sugars, the binding groups include amino groups, hydroxyl groups, and carboxyls that are convenient for binding to these biologically related substances. Preferred examples include groups, sulfonic acid groups, thiol groups, disulfide groups, isocyanate groups, thioisocyanate groups, succinimidyl ester groups, pentafluorophenyl ester groups, maleimide groups, and the like.
  • these groups need only be used for bonding with other compounds, at least any group including these groups (for example, an aminoalkyl group, etc.) is also a bonding group. It can be used as One binding group is sufficient, and one binding site is specified. It is usually preferred to have one, but it may contain two or more linking groups.
  • At least one of R 1 to R 7 may contain a group for adjusting solubility. Since the chemiluminescent labeling agent is often used in an aqueous system, when it is desired to improve the solubility in the aqueous system by increasing the hydrophilicity of the chemiluminescent compound, R 1 to R 7 At least one of them may contain a hydrophilic group. Examples of such a hydrophilic group include a sulfonic acid group or a salt thereof, a hydroxyl group, an amino group, a carboxylic group, a carboxyl group, or an alkyl group containing at least one of these groups or one or more ether bonds.
  • Examples thereof include (but preferably have 1 to 4 carbon atoms) or alkoxyl groups (preferably 1 to 4 carbon atoms), but are not limited thereto. Further, such a hydrophilic group may be used in combination with the above-described binding group, emission wavelength adjusting group, and the like.
  • R 8 and R 9 are each independently a fluorine, alkoxyl group or the above-described luminescent group, and are preferably independently a fluorine or an alkoxyl group, and an alkoxy group.
  • the number of carbon atoms is preferably 1-6.
  • chemiluminescent compound of the present invention include a compound having a structure represented by the following general formula [la].
  • R la and R 7a are independently of each other hydrogen, an alkyl group, an alkoxyl group, a halogen, a phenol group, or a substituted phenol group (the substituent is 1 to 5 alkyl groups, alkoxyl group or a mono - or di - alkylamino group) (wherein, R la and both R 7a is not simultaneously hydrogen) or hetero aromatic group, R 2a is hydrogen, halogen, terminus binding functional group Substituted carbonyl group or aryl group having the above, emission wavelength adjusting group, hydrophilic R 3a and R 5a are each independently hydrogen or an alkyl group, R 1 ⁇ 2 is hydrogen, an alkyl group, a phenyl group, or a substituted alkyl group or aryl having a binding functional group at the terminal.
  • the phthalcarbazide derivative portion is a chemiluminescent group
  • R la and R 7a are emission wavelength adjusting groups (except for hydrogen)
  • R 3a and R 5a are hydrogen or an arbitrary substituent
  • R 1 ⁇ 2 Corresponds to hydrogen or any substituent or linking group.
  • R lb and R 7b are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a phenol group or an alkoxy phenol group (the alkyl moiety has 1 to 10 carbon atoms),
  • R 2b is hydrogen or a sulfonic acid group or a salt thereof,
  • R 3b and R 5b are independently of each other hydrogen or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms,
  • R 4b is hydrogen or
  • R 1Q and R 11 are each independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, Represents an integer of 1 to 4).
  • the chemiluminescent compound of the present invention can be produced by bonding a chemiluminescent group to a boron dipyrromethene skeleton to which the above-described substituent is bonded, if necessary. Since the boron dipyrromethene skeleton and the chemiluminescent group are known and the production method thereof is also known, the chemiluminescent compound of the present invention can be easily produced by ordinary chemical synthesis. Some specific examples are described in detail in the examples below.
  • R 2 corresponds to R 1Q and R 11 in the substituent of R 4b in the general formula [lb], and R represents R 3b and R 11b in the general formula [lb].
  • Ar corresponds to R lb and R 7b in the general formula [lb].
  • dipyrromethene derivative VII When cyano-1,4-benzoquinone (DDQ) is sequentially added, the dipyrromethene derivative VII is produced.
  • Boron dipyrromethene derivative VIII is produced by adding trifluoroborane jetyl ether complex to toluene in the presence of triethylamine and refluxing. When this VIII is reacted with N-bromosuccinimide in black mouth form in the same manner as in Patent Document 16, bromine adduct IX is produced. In this reaction, bromine diadducts can be easily controlled by controlling the equivalent amount of NBS. Can be synthesized.
  • H, R2 CH3
  • chlorosulfonic acid in a methylene chloride solution.
  • the 8-position unsubstituted boron dipyrromethene XVII synthesized by the method described in Non-Patent Document 2 is treated in the same manner as in the synthesis route of II above, so that the 8-position unsubstituted chemistry of the present invention can be obtained in 4 steps.
  • the luminescent dye XV could also be synthesized.
  • the chemiluminescent compound of the present invention can be used as a chemiluminescent labeling agent.
  • the chemiluminescent labeling agent itself is well known, and the chemiluminescent compound of the present invention can also be used in the same manner as conventional chemiluminescent labeling agents.
  • the labeling substance is labeled by binding the chemiluminescent compound of the present invention to the labeling substance to be labeled.
  • the chemiluminescent compound of the present invention has the above-described binding group
  • the chemiluminescent compound of the present invention is bound to the labeling substance via the binding group by a conventional method.
  • a conventional method Do not have a linking group!
  • an intermediate having a binding group introduced can be prepared by a conventional method and bound to a labeling substance.
  • the mode of use of the chemiluminescent labeling agent is exactly the same as in the prior art.
  • the labeling substance (referred to herein as "labeling substance") ) Is subjected to a reaction, and a washing step or the like is performed as necessary. Then, the label is chemiluminescent and the luminescence is measured.
  • the labeling agent can be used as follows.
  • a primary antibody against the target antigen is bound to a solid phase and reacted with the test sample, so that the target antigen in the test sample is immobilized on the solid phase. Conjugated to the primary antibody. After washing, a second antibody labeled with a chemiluminescent labeling agent is reacted. After washing, the chemiluminescent labeling agent of the second antibody bound to the target antigen is chemiluminescent by a chemical reaction according to a conventional method, and luminescence is measured.
  • “measurement” includes any of detection, quantification, and semi-quantification.
  • the chemiluminescence of the labeling agent can be performed by conducting a chemical reaction according to the chemiluminescent group in each chemiluminescent labeling agent by a conventional method.
  • a chemiluminescent group is preferred, and an example phthalcarbazide derivative is used as a chemiluminescent group, as well known, in the presence of the catalyst hexocyano potassium (III) potassium (ferricyani potassium), hydrogen peroxide and By making it react, a chemiluminescent group can be light-emitted.
  • the boron dipyrromethene skeleton is excited by light from the chemiluminescent group, and fluorescence is emitted from the boron dipyrromethene skeleton. The fluorescence emission is measured.
  • the fluorescence wavelength can be greatly changed to be discernable by changing the above-described emission wavelength adjusting group. Bonding a substituent on the boron dipyrromethene skeleton is easily accomplished by conventional chemical synthesis. be able to. Therefore, a plurality of types of chemiluminescent compounds of the present invention having different fluorescence emission wavelengths can be easily produced. By using a plurality of types of chemiluminescent compounds of the present invention having different wavelengths of fluorescence emission so that they can be distinguished as chemiluminescent labeling agents, it becomes possible to label a plurality of types of substances with different chemiluminescent labeling agents.
  • a plurality of different test substances can be measured simultaneously.
  • different types of secondary antibodies can be labeled with different labeling agents so that the fluorescence wavelength can be distinguished.
  • the multiple types of labeling agents used need only differ so that the respective fluorescence emission wavelengths can be distinguished (that is, the emission wavelength ranges do not overlap or hardly overlap), and one of them is the emission wavelength adjustment. It may have no group. That is, the present invention has the emission wavelength adjusting groups different from each other.
  • the chemiluminescent labeling agent of the present invention can use a plurality of types of chemiluminescent labeling agents in which the chemiluminescent group and the skeleton of the fluorescent dye are identical to each other, and only the substituents on the boron dipyrromethene skeleton are different.
  • the chemiluminescent labeling agent of the present invention can be preferably used as a labeling agent in the dideoxy method when used for determining the base sequence of DNA.
  • V and 4 kinds of dideoxynucleotides are labeled with fluorescent dyes of different fluorescence wavelengths.
  • fluorescent dyes of different fluorescence wavelengths instead of these four types of fluorescent dyes, four types of labeling agents of the present invention having different emission wavelengths can be used.
  • the labeling agent of the present invention is used instead of the fluorescent dye. (1) Since a light source such as a laser is not required for detection, the structure of the measuring device is simplified and can be supplied at low cost.
  • the sensitivity is improved at least several times, so the amount of primer and dye-labeled dideoxynucleotide can be reduced, and the amplification time is shortened, so that measurement can be performed quickly.
  • Methylene chloride 100 mL was placed in a 300 mL three-necked flask and N-published for 30 minutes at room temperature.
  • ops was added and stirred at room temperature for 1 hour. The color changed from yellow to magenta.
  • DDQ (383 mg, 1.69 mmol, 1 eq) was added and stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction mixture was allowed to cool, and black mouth form and water were added to extract the organic phase.
  • the organic phase was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was concentrated under reduced pressure.
  • H 0 130 mL
  • KOH 33.6 g
  • M 110Z / ⁇ I , ⁇ 600] ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 0 os ⁇ nc ⁇ SZ) ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ 9 S) N3 ⁇ 4 ⁇ ° ⁇ Y ⁇
  • the mixture was degassed again and stirred at 80 ° C for 1 day under Ar.
  • the mixture was degassed again and stirred at 80 ° C. for 24 hours under Ar.
  • the mixture was degassed again and stirred at 80 ° C for 24 hours under Ar.
  • Luminescence experiments were performed on newly synthesized KCB-lime2, orange2 and apple2.
  • ABEI aminobutylethylisoluminol

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

明 細 書
化学発光性ィ匕合物及びそれから成る標識剤
技術分野
[0001] 本発明は、化学発光性化合物及びそれから成る標識剤に関する。
背景技術
[0002] 化学発光性化合物は、免疫測定をはじめ種々の分野において標識剤として広く用 いられている。その多くは、ルシゲニン誘導体等の性能のよい化学発光物質とローダ ミン等の蛍光色素をスぺーサーを介して連結しているものである（特許文献 1〜13)。 しかしながら、これらの公知の化学発光性物質では、発光効率が満足できない、安定 性が低い又は合成が容易ではない等の問題がある。また、公知の標識剤では、置換 基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることは困難である。一方、ポロ ンジピロメテン骨格を有する蛍光色素が知られている（特許文献 14)。しかしながら、 ボロンジピロメテン蛍光色素を他の化学発光基と結合したィ匕学発光性ィ匕合物は知ら れていない。
[0003] 特許文献 1：国際公開公報 W098/54574
特許文献 2：特開平 9-5238号公報
特許文献 3：特開平 10-81659号公報
特許文献 4：特開 2004-51490号公報
特許文献 5：特開 2004-26665号公報
特許文献 6：特開 2003-183641号公報
特許文献 7：特開 2003-137824号公報
特許文献 8：特開 2002-302483号公報
特許文献 9：特開 2001-281257号公報
特許文献 10：特開 2001-115155号公報
特許文献 11：特開 2001-81455号公報
特許文献 12：特開 2000-245499号公報
特許文献 13：特開 2000-178550号公報 特許文献 14:米国特許第 5,723,218号公報
特許文献 15：特開 2003-379505号公報
特許文献 16：米国特許第 5,869,689号公報
非特許文献 1 :A. Burghart, H. Kim, M. B. Welch, L. H. Thoresen, J. Reibenspies, K
. Burgess, Journal of Organic Chemistry, 64卷 7813ページ（1999年）
非特許文献 2 : M. A. T. Rogers, Journal of the Chemical Society, 1943年， 596ぺー ジ
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、発光効率が高ぐ置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大き く変化させることができる新規な化学発光性ィ匕合物及びそれから成る標識剤を提供 することである。
課題を解決するための手段
[0005] 本願発明者らは、鋭意研究の結果、ボロンジピロメテン骨格を有する蛍光色素に化 学発光基を結合させることにより、発光効率が高ぐボロンジピロメテン骨格に結合し ている置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができることを 見出し、本発明を完成した。
[0006] すなわち、本発明は、下記一般式 [I]で示される構造を有する化学発光性化合物を 提供する。
[0007] [化 1]
Figure imgf000004_0001
[ I ]
ただし、式中、 R2、 R4及び R6は、これらのうち少なくとも 1つが化学発光基であり、それ 以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、 R5及び R7は 、互いに独立に水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、 R8及び R9は 互いに独立にフッ素、アルコキシ基又は化学発光基である（ただし、両者が同時に化 学発光基ではない)。
[0008] また、本発明は、上記本発明の化学発光性化合物から成る標識剤を提供する。さ らに本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し、それによつて発光波長が 異なる複数種類の上記本発明の化学発光性化合物から成る標識剤の組合せを提供 する。さらに、本発明は、上記本発明の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応 後、該標識剤を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法を提供 する。さらに、本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し、それによつて発 光波長が異なる複数種類の上記本発明の化学発光性化合物を標識剤として用い、 該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応後、それ ぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の該物質を同時に測定することを含む 複数の標識物質の同時測定方法を提供する。
発明の効果
[0009] 本発明により、発光効率が高ぐ置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変 ィ匕させることができる新規な化学発光性ィ匕合物及びそれから成る標識剤が提供され た。本発明の化学発光性ィ匕合物で採用したボロンジピロメテン骨格は、発光効率が 高ぐ特に、本発明の好ましい態様では、化学発光基をボロンジピロメテン骨格にス ぺーサ一を介することなく直接結合させるのでより一層発光効率を高めることができ る。また、本発明の化学発光性ィ匕合物では、ボロンジピロメテン骨格上の置換基、好 ましくは単一の置換基を変更することにより、他の構造が同一であっても蛍光発光波 長を大きく変化させることができる。ボロンジピロメテン骨格上に任意の置換基を導入 することは常法により容易に行うことができるので、本発明により、蛍光発光波長の異 なる複数の化学発光性ィ匕合物を容易に合成することができる。そして、これらは、変 更された置換基以外の構造、特に反応により化学発光する化学発光基が同一であ つてよいので、これらの複数の化学発光性物質は、同一条件下で最適に発光させる ことができる。このため、単一の反応系に関わる複数種類の物質をそれぞれ異なる本 発明の化学発光性化合物で標識することにより、該複数種類の物質のそれぞれを同 時に測定することが可能になる。これにより、例えば、免疫測定等において、複数種 類の異なる被検物質を同時に測定することが可能となり、したがって、本発明により 新たな測定手法が提供される。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明の実施例で作製した本発明の化合物の化学発光波長のスペクトルを公 知の色素と比較して示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 上記の通り、本発明の化学発光性ィ匕合物は、上記一般式 [I]で示される構造を有す る。一般式 [I]中、 R2及び R6は、これらのうち少なくとも 1つが化学発光基であり、それ 以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、
Figure imgf000006_0001
R5及び R7 は、互いに独立に水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、 R8及び R9 は互いに独立にフッ素、アルコキシ基又は化学発光基である（ただし、両者が同時に 化学発光基ではな 、)。前記化学発光基は R2及び/又は R6であるものが好まし 、。
[0012] 化学発光基は、化学反応により発光する構造を有する基である。本発明の化学発 光性ィ匕合物では、該化学発光基が発する光によりボロンジピロメテン部分が蛍光を 発し、この蛍光が測定される。したがって、化学発光基は、必ずしも可視光を発光す るものである必要はなぐボロンジピロメテン部分を励起して蛍光を発せさせることが できる光を発するものであればいずれのものをも採用することができる。このようなィ匕 学発光基としては、この分野にぉ 、て標識剤として用いられて 、るものであれば！/、ず れのものをも用いることができ、種々のものが公知ないしは周知である。好ましい例と して、フタルカルバジド誘導体、ジォキセタン誘導体、口フィン誘導体、アタリジン誘導 体、インドール誘導体、シユウ酸誘導体、ジフヱノィル誘導体又はルシフヱリン誘導体 を挙げることができ、これらはいずれもこの分野において周知である。これらの化学発 光基は、それぞれ以下の一般式で示されるものである。
[0013] [化 2]
Figure imgf000007_0001
フタルヒドラジド誘導体 [0014] [化 3]
Figure imgf000007_0002
ジォキセタン誘導体
[0015] [ィ匕 4]
Figure imgf000007_0003
ロフィン誘導体
[0016] [化 5]
Figure imgf000007_0004
ァクリジン誘導体
[0017] [化 6]
〇 〇
R-O 11 11 O-R ジォキセタン誘導体
[0018] [化 7]
Figure imgf000007_0005
ジフ Iノィル誘導体 (X = -0-, —0—0—) [0019] [化 8]
Figure imgf000008_0001
ルシフ Iリン誘導体
[0020] なお、上記各一般式において、 Rは、互いに独立して水素、アルキル基、ァリール 基、ハロゲン、アルコキシ、ァリールアルキル、シクロアルキル、ァシル、ホルミル、シ ァ入ァルケ-ル、ヘテロァリール、モノ—又はジ—アルキルァミノなどの置換基であ り、各一般式における 1つの Rは、ボロンジピロメテン骨格に直接又はスぺーサーを 介して結合される。なお、アルキル基又はアルキル基部分を含む基の中のアルキル 基の炭素数は通常 1〜10程度である。また、本明細書及び請求の範囲において単 に「アルキル基」と 、う場合には直鎖状アルキル基及び分枝状アルキル基の両者が 包含される。アルコキシル基についても同様である。なお、上記したフタルカルバジド 誘導体において、 4つの Rのうちのいずれ力が- NRaRb (式中、 RaRbは互いに独立して 水素又はアルキル基）がルミノール誘導体である。
[0021] 上記した各種化学発光基のうち、発光量子収率が高ぐボロンジピロメテン骨格へ のカップリング合成が可能な原料フタル酸が容易に合成できるフタルヒドラジド誘導 体が好ましい。
[0022] なお、上記した化学発光基は、各化合物において通常 1種類のものを 1個又は複 数個用いることが好ましいが、複数種類のものを結合してもよい。また、化学発光基 は、アルキレン基等のスぺーサーを介してボロンジピロメテン骨格に結合させることも できるが、化学発光基をできるだけボロンジピロメテン骨格に近づけることにより、ポロ ンジピロメテン部分力も発せられる蛍光の強度を大きくするために、化学発光基はス ぺーサ一を介することなく直接ボロンジピロメテン骨格に結合させることが好ましい。 ボロンジピロメテン骨格を蛍光色素として選択したことにより、化学発光基を容易に直 結させることができる。
[0023] ボロンジピロメテン部分は、そのボロンジピロメテン骨格が蛍光を発するので、 R1な いし R7のうち、上記化学発光基以外の基は特に限定されるものではなぐ水素又は化 合物の発光を阻害しない任意の基であってよい。任意の基としては、後述する発光 波長調整基、結合性基及び極性基を挙げることができる。これらのいずれにも該当し ないものとしては、上記のとおり、水素又は化合物の発光を阻害しない任意の基であ ればよいが、水素原子及び炭素数 1〜4のアルキル基を好ましい例として挙げること ができる。
本発明の化学発光性ィ匕合物の重要な特徴の 1つとして、ボロンジピロメテン骨格に 結合している置換基を変更することにより、他の部分を変更しなくても蛍光発光の波 長を大きく変化させることができるということがある。この特徴を利用すベぐ R1ないし R 7の少なくとも 1つとして発光波長調整基を有することが好ましい。ここで、「発光波長 調整基」は、この基を結合させることにより、この基を結合していない場合と比較して 蛍光の発光波長が変化する基を意味する。発光波長調整基としては、それをボロン ジピロメテン骨格に結合させることによりボロンジピロメテン部分が発する蛍光の波長 力 発光波長調整基を有さない化合物の蛍光波長と比べて変化する基であれば特 に限定されず、また、ボロンジピロメテン骨格は、その置換基により影響を受けて多か れ少なかれ蛍光波長が変化するので、発光波長調整基は任意の基であってよい。も つとも、単一の基を変更することによって比較的大きく蛍光波長が変化することが好ま しぐ特に発光波長調整基を有さない場合と比べて長波長側に蛍光波長が変化する ことが好ましいので、発光波長調整基の好ましい例としてアルキル基、アルコキシル 基、ァリール基、ヘテロァリール基及びこれらの誘導体を挙げることができる。ここで、 アルキル基又はアルコキシル基中のアルキル部分の炭素数は 1〜10が好ましい。ま た、ァリール基としては、フエ-ル基及びナフタレン基が好ましぐヘテロァリール基と しては、フエ-ル基及びナフタレン基中の 1個又は複数の炭素原子が窒素、酸素及 び Z又はィォゥで置換された基が好ましい。また、アルキル基又はアルコキシル基の 誘導体としては、これらの基を構成する 1又は複数の炭素原子に結合している水素 原子が、ハロゲン、シァノ基、アルコキシル基、アミノ基、水酸基、モノー若しくはジー アルキルアミノ基、カルボ-ル基、カルボキシル基、チオール基、ジスルフイド基等の 基で置換されたものが好ましく、これらの置換基中のアルキル部分の炭素数は 1〜 1 0力好ましく、 1〜6がさらに好ましい。また、上記アルキル基又はアルコキシル基を構 成する 1個又は複数の炭素原子が、酸素、ィォゥ及び窒素の少なくともいずれかで置 換された基も上記アルキル基又はアルコキシル基の誘導体として好ましい。また、前 記ァリール基又はへテロアリール基の誘導体としては、これらの基を構成する 1又は 複数の炭素原子に結合している水素原子が、ハロゲン、シァノ基、アルコキシル基、 アミノ基、水酸基、モノー若しくはジ—アルキルアミノ基、カルボニル基、カルボキシル 基、チオール基、ジスルフイド基等の基で置換されたものが好ましぐこれらの置換基 中のアルキル部分の炭素数は 1〜10が好ましぐ 1〜6がさらに好ましい。
[0025] 発光波長調整基としては、ベンゾクラウン、 N-ァリールァザクラウン、アミド基等の、 分子認識やィ匕学反応によって電子構造が変わり発光波長の変わる置換基を用いる ことちでさる。
[0026] ボロンジピロメテン蛍光色素の蛍光波長は、一般式 [I]中の R1及び R7に結合する置 換基の種類により大きく影響されるので、上記した発光波長調整基は、 R1及び Z又 は R7であることが好ましい。また、発光波長調整基は複数個結合させることができ、異 なる種類の発光波長調整基を 1つのボロンジピロメテン骨格に結合させることもできる 。もっとも、後で詳しく説明する、複数種類の被検物質を同時測定するために複数種 類の化学発光標識剤を用いる場合には、各標識剤は同じ条件下でィ匕学発光反応に 供することが好都合であるので、各標識剤の化学発光基を同一のものにすることが 好ましい。
[0027] 一般式 [I]中の R1ないし R7の少なくとも 1つとして、結合性基を有することが好ましい。
ここで、結合性基は、他の化合物に結合させるために利用できる基を意味する。化学 発光標識剤は、タンパク質、ポリペプチド、糖等の生体関連物質に結合されることが 多いため、結合性基としては、これらの生体関連物質との結合に好都合な、アミノ基 、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフイド基、イソシァネ ート基、チォイソシァネート基、スクシンィミジルエステル基、ペンタフルオロフェ-ル エステル基、マレイミド基等を好ましい例としてあげることができる。なお、これらの基 は、他の化合物との結合のために用いることができればよいので、これらの基の少な くとも 、ずれかを含む任意の基 (例えば、アミノアルキル基等)も結合性基として利用 することができる。なお、結合性基は、 1つあれば足り、また、結合部位を 1つに特定 するためにも 1つであることが通常好ま 、が、 2個以上の結合性基を含んで 、てもよ い。
[0028] さらに、必要に応じ、 R1ないし R7の少なくとも 1つとして、溶解性を調整する基を含ま せてもよい。化学発光標識剤は、水系で用いられることが多いので、化学発光性ィ匕 合物の親水性を高めて水系中での溶解性を向上させることが望まれる場合には、 R1 ないし R7の少なくとも 1つとして親水性基を含ませてもよい。このような親水性基として は、スルホン酸基若しくはその塩、水酸基、アミノ基、カルボ-ル基、カルボキシル基 、又はこれらの基の少なくとも 、ずれか若しくはエーテル結合を 1個又は複数含むァ ルキル基 (炭素数は 1〜4が好まし 、）若しくはアルコキシル基 (炭素数は 1〜4が好ま しい）等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。また、このような 親水性の基は上記した結合性基、発光波長調整基等と兼用させてもよい。
[0029] 一般式 [I]中、 R8及び R9は互いに独立にフッ素、アルコキシル基又は上記したィ匕学 発光性基であり、好ましくは互いに独立にフッ素又はアルコキシル基であり、アルコキ シル基の炭素数は 1〜6が好ましい。
[0030] 本発明の化学発光性化合物の好ま ヽ例として、下記一般式 [la]で示される構造を 有する化合物を挙げることができる。
[0031] [化 9]
Figure imgf000011_0001
[ la ]
[0032] ただし、式中、 Rla及び R7aは互いに独立に水素、アルキル基、アルコキシル基、ハロゲ ン、フエ-ル基若しくは置換フエ-ル基（置換基は 1ないし 5個のアルキル基、アルコ キシル基又はモノ—若しくはジ—アルキルアミノ基）（ただし、 Rla及び R7aの両方が同 時に水素ではない)又はへテロ芳香族基、 R2aは水素、ハロゲン、末端に結合性官能 基を有する置換カルボニル基若しくはァリール基、上記発光波長調整基、上記親水 性基又は上記化学発光性基、 R3a及び R5aは、互いに独立に水素又はアルキル基、 R½ は、水素、アルキル基、フ ニル基又は末端に結合性官能基を有する置換アルキル 基若しくはァリール基である。なお、これらの置換基中のアルキル基又はアルキル基 部分の炭素数は 1〜10が好ましい。また、 Rla及び R7aの定義中の「ヘテロ芳香族基」と しては、フラン、チォフェン等を好ましい例として挙げることができる。一般式 Da]中、フ タルカルバジド誘導体部分が化学発光基、 Rla及び R7aが発光波長調整基 (ただし、水 素以外の場合)、 R3a及び R5aが水素又は任意の置換基、 R½が水素若しくは任意の置 換基又は結合性基に該当する。
[0033] 上記一般式 [la]で示される構造を有する化合物の中でも、さら〖こ、下記一般式 [lb] で示される構造を有する化合物が好ま ヽ。
[0034] [化 10]
Figure imgf000012_0001
[ lb ]
[0035] ただし、式中、 Rlb及び R7bは、互いに独立に炭素数 1〜4のアルキル基、フエ-ル基又 はアルコキシフエ-ル基（アルキル部分の炭素数は 1〜10)、 R2bは水素又はスルホン 酸基若しくはその塩、 R3b及び R5bは互いに独立に水素又は炭素数 1〜4のアルキル 基、 R4bは水素又は
[0036] [化 11]
Figure imgf000012_0002
(ただし、式中、 R1Q及び R11は互いに独立に水素又は炭素数 1〜4のアルキル基、 ま 1〜4の整数を示す）。
[0037] なお、本願出願人は先に、本発明と類似した化学発光性化合物に係る発明を特許 出願している（特願 2005-129094)。この先願発明と比較した場合、本発明では、化学 発光性基の結合位置が、先願発明に具体的な開示のない特定の位置に限定されて おり、それに起因して、（1)発光波長が幅広い範囲に亘る種々の化合物を提供できる 、（2)特許文献 15などに記載された公知のボロンジピロメテンィ匕合物を公知の方法で 合成した後、上記化学発光性基を結合することにより本発明の化合物を容易に合成 することができる、（3)合成に際し、分枝アルコキシル基のような嵩高な基がなくても凝 集が起きず、合成が可能であるので、伸盛衰が高ぐ極性溶媒でも均一に分散して 自己消光しにくい、標識剤として用いた場合に定量製の高い化合物を容易に合成で きる、（4)結合性基を容易に R4 (必要ならば R2にも)等に導入できる、といった利点を有 する。
[0038] 本発明の化学発光性ィ匕合物は、必要に応じて上記した置換基を結合させたボロン ジピロメテン骨格に化学発光基を結合させることにより製造することができる。ボロン ジピロメテン骨格及びィ匕学発光基はそれぞれ公知であり、その製造方法も公知であ るので、本発明の化学発光性ィ匕合物は、通常の化学合成により容易に製造すること ができ、そのいくつかの具体例が下記実施例に詳細に記載されている。
[0039] 例えば、上記一般式 [lb]に示される本発明の好ましい化合物は、次のような合成ル ートにより合成することができる。なお、下記の合成ルートに示すィ匕学式において、 R
2 は一般式 [lb]中の R4bの置換基中の R1Q及び R11に対応し、 Rは一般式 [lb]中の R3b及び
1
R5bに対応し、 Arは一般式 [lb]中の Rlb及び R7bに対応する。
[0040] [化 12]
Figure imgf000014_0001
市販されている 4-ヒドロキシベンズアルデヒド（III: R = H)若しくは 2,6-ジメチル- 4-
2
ヒドロキシベンズアルデヒド（III: R = CH )を、市販されている N- (2-ブロモェチル)フ
2 3
タルイミド (VI)と塩基存在下 DMF中で反応させるとべンズアルデヒド誘導体 Vが生成 する。この Vと、市販されている 2,4-ジメチルビロール (VI: Ar = CH , R = CH )若しく
3 1 3 は Burgessらの手法（非特許文献 1)で合成した 2-ァリールピロール（VI: Ar = Ph or 4 -MeO-Ph, R = H)の塩化メチレン溶液に、トリフルォロ酢酸 · 2, 3-ジクロロ- 5,6-ジシ
1
ァノ- 1,4-ベンゾキノン（DDQ)を順次カ卩えると、ジピロメテン誘導体 VIIが生成する。こ の VIIにトリェチルァミン存在下トルエン中でトリフルォロボランジェチルエーテル錯体 を加え還流すると、ボロンジピロメテン誘導体 VIIIが生成する。この VIIIを、特許文献 1 6と同様の手法で、クロ口ホルム中 N-ブロモスクシンイミドと反応させると、臭素付加物 IXが生成する。なおこの反応で NBSの等量を制御することにより臭素二付加体も容易 に合成することが出来る。さらに、市販されている 4-ブロモ無水フタル酸 (XII)とビス（ ネオペンチルダリコラート)ジボロン (XIII)力 2段階で合成されるフタルイミドボロン酸 エステル Xと、 IXとを鈴木カップリング反応で直結することで、ボロンジピロメテン-フタ ルイミド誘導体 XIが生成する。最後に、 XIをヒドラジンで処理することで、フタルイミド カもフタルヒドラジドへの変換とァミノ基の保護基の脱保護が同時に起こり、ラベルイ匕 (結合性基の導入)が可能な本発明の化学発光色素 Πが生成する。なお臭素二付加 体には、 R2aの位置に別途置換基をカップリングすることにより、ラベルイ匕部位の導入' 発光波長の調整 ·溶解性の調整が可能である。
[0042] [化 13]
Figure imgf000015_0001
[0043] 上記の方法で合成されたボロンジピロメテン-フタルイミド誘導体 (XI: Ar = Ph, Rl =
H, R2 = CH3)を塩化メチレン溶液中クロロスルホン酸と反応させることで、スルホン 酸付加体 XVIが合成できる。この XVIを XIと同様にヒドラジンで処理することで、水溶 性の向上したオレンジ色化学発光色素 KCB-orange2-wが生成する。
[0044] [化 14]
Figure imgf000015_0002
非特許文献 2記載の方法により合成された 8位無置換ボロンジピロメテン XVIIを、上 記の IIの合成ルートと同様の手法で処理することで、 4段階で 8位無置換の本発明の 化学発光色素 XVを合成することもできた。 [0046] 本発明の化学発光性ィ匕合物は、化学発光標識剤として用いることができる。化学 発光標識剤自体は周知であり、本発明の化学発光性化合物も従来の化学発光標識 剤と同様にして用いることができる。すなわち、本発明の化学発光性化合物を、標識 すべき被標識物質に結合させることにより被標識物質を標識する。本発明の化学発 光性ィ匕合物が上記した結合性基を有する場合には、常法により上記結合性基を介し て本発明の化学発光性化合物を被標識物質に結合する。結合性基を有さな！/ヽ場合 には、常法により結合性基を導入した中間体を調製し、これを被標識物質と結合する ことができる。
[0047] 化学発光標識剤の使用の態様は従来と全く同様であり、上記のように被標識物質 を標識した後、標識した物質 (本明細書にお!、て「標識物質」と 、う）を反応に供し、 必要に応じて洗浄工程等を行なった後、標識を化学発光させ、該発光を測定する。 例えば、化学発光標識剤が広く用いられている免疫測定の場合、次のようにして標 識剤を利用することができる。例えば、サンドイッチ法により被検試料中の標的抗原 を免疫測定する場合、標的抗原に対する一次抗体を固相に結合し、これを被検試料 と反応させて、被検試料中の標的抗原を固相化一次抗体に結合させる。洗浄後、化 学発光標識剤で標識した第二抗体を反応させる。洗浄後、標的抗原に結合した第 二抗体の化学発光標識剤を、常法に従い化学反応により化学発光させ、発光を測 定する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において「測定」には検出、定量、半 定量のいずれもが包含される。標識剤の化学発光は、常法により各化学発光標識剤 中の化学発光基に応じた化学反応を行なうことにより行うことができる。例えば、化学 発光基の好ま 、例であるフタルカルバジド誘導体を化学発光基として用いる場合 には、周知の通り、触媒であるへキサシァノ鉄 (III)カリウム（フェリシアンィ匕カリウム）の 存在下、過酸化水素と反応させることにより化学発光基を発光させることができる。化 学発光基からの光でボロンジピロメテン骨格が励起され、ボロンジピロメテン骨格から 蛍光が発せられ、この蛍光発光を測定する。
[0048] 本発明の有利な特徴の 1つとして、上記した発光波長調整基を変更することにより、 蛍光波長を識別可能な程度に大きく変化させることができるということがある。ボロン ジピロメテン骨格上に置換基を結合させることは、通常の化学合成により容易に行う ことができる。したがって、蛍光発光の波長が異なる複数種類の本発明の化学発光 性ィ匕合物を容易に製造することができる。蛍光発光の波長が識別可能な程度に異な る複数種類の本発明の化学発光性化合物を化学発光標識剤として用いることにより 、複数種類の物質をそれぞれ異なる化学発光標識剤で標識することが可能となり、 ひいては、異なる複数の被検物質を同時に測定することが可能となる。例えば、上記 したサンドイッチ法による免疫測定に複数種類の化学発光標識剤を用いる場合、異 なる複数種類の二次抗体を蛍光波長が識別可能な程度に異なる標識剤で標識する ことができ、各標識剤力もの発光を識別して測定することにより、複数種類の抗原を 同時に免疫測定することができる。なお、用いる複数種類の標識剤は、それぞれの 蛍光発光の波長が識別可能な程度に異なっていればよい (すなわち、発光波長域が 全くあるいはほとんど重複しない）ので、そのうちの 1つは発光波長調整基を有さない ものであってもよい。すなわち、本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し
(ただし、 1種類の化学発光性ィ匕合物のみは、前記発光波長調整基を有さなくてもよ い）、それによつて発光波長が異なる複数種類の本発明の化学発光性化合物を標識 剤として用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、 反応後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の該物質を同時に測定す ることを含む複数の標識物質の同時測定方法をも提供するものであり、また、この同 時測定方法に用いられる複数の標識剤の組合せをも提供するものである。
従来、蛍光発光波長が互いに異なる種々の化学発光標識剤が知られているが、そ れらを組み合わせて用いて複数種類の被検物質を同時に測定しょうとしても、各化 学発光標識剤を化学発光させる反応自体や最適な反応条件が異なるため、いずれ 力の標識剤の測定感度が低下したり測定が煩雑になったりする問題がある。これに 対し、本発明の化学発光標識剤では、化学発光基や蛍光色素の骨格部分が互いに 同一で、ボロンジピロメテン骨格上の置換基のみが異なる複数種類の化学発光標識 剤が利用可能であるので、化学発光基の発光反応やその最適な条件が同一である 複数種類の標識剤で複数種類の物質をそれぞれ標識することが可能であるから、同 一の反応により、いずれの標識剤も高感度に同時に測定することが可能である。これ により、例えば、免疫測定等において、複数種類の異なる被検物質を同時に測定す ることが可能となり、したがって、本発明により新たな測定手法が提供される。
[0050] 例えば、本発明の化学発光標識剤を、 DNAの塩基配列決定に用いられて 、るジデ ォキシ法における標識剤として好ましく用いることができる。現在、ジデォキシ法にお V、ては、 4種類のジデォキシヌクレオチドをそれぞれ異なる蛍光波長の蛍光色素で 標識している。この 4種類の蛍光色素に代えて、発光波長のそれぞれ異なる 4種類の 本発明の標識剤を用いることができる。ジデォキシ法において、蛍光色素に代えて、 本発明の標識剤を用いることには、 (1)検出にレーザーなどの光源が必要なくなるの で、測定装置の構造が簡単になり安価に供給できる、（2)蛍光検出に比べ、感度が少 なくとも数倍は向上するので、プライマーおよび色素標識されたジデォキシヌクレオ チドの量が少なくて済む上、増幅時間が短くなるので迅速に測定が行える、という利 点がある。
[0051] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実 施例に限定されるものではない。
実施例 1
[0052] 本発明の化学発光性化合物 KCB-lime2の合成
[0053] [化 15]
Figure imgf000018_0001
1 2
[0054] Ar気流下で（1) (3.2 g, 26 mmol, 1 eq)を DMF (20 mL)に溶解し、 300 mL三ロフラ スコに加えて攪拌した。そこにブロモェチルフタルイミド（6.5 g, 26 mmol, 1 eq)、 K C
2
Ο (9.0 g, 65 mmol, 2.5 eq)を加え、 65 °Cで 24時間攪拌した。反応終了後、放冷し、
3
酢酸ェチルを加え、有機相を 3回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫 酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカ ゲルクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム）で分離精製し、 目的化合物（2) (1.9 g, 収率; 25.0 %)を黄褐色オイルとして得た。
[0055] TLC ;R=0.15 (溶離液；クロ口ホルム）
f
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 9.86 (s, CHO), 7.87 (d, J = 4 Hz, 2 H), 7.80 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.74 (d, J = 4 Hz , 2 H), 7.00 (d, J = 9 Hz, 2 H), 4.30 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ).
[0056] [化 16]
Figure imgf000019_0001
[0057] 300 mL三口フラスコに塩化メチレン（100 mL)を入れ、室温で 30分 Nパブリングした
2
。 (2) (500 mg, 1.69 mmol, 1 eq)、 2,4-ジメチルピロール (322 mg, 3.38 mmol, 2 eq) を塩化メチレン（50 mL)溶解して加え、再び室温で 30分 Nパブリング後、 TFA (10 dr
2
ops)を加え、室温で 1時間攪拌した。黄色から赤紫色に変化した。 DDQ (383 mg, 1.6 9 mmol, 1 eq)を加え、室温で 30分攪拌した。
[0058] 反応終了後、塩化メチレンと NaHCO aq.を加え、有機相を抽出した。 DDQをよく取
3
り除くため、有機相を NaHCO aq.で 4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。無水
3
硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をァ ルミナクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム I酢酸ェチル = 4 / 1 )で分離精製し 、 目的化合物（3) (91.3 mg,収率； 11.9 %)を褐色固体として得た。
[0059] TLC ;R=0.21 (溶離液；クロ口ホルム I酢酸ェチル = 4 / 1 )
f
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.88 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.74 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.93 (d, J = 8 Hz, 2 H), 5.87 (s, 2 H), 4.27 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.33 (s, 6 H), 2.05 (s, 6 H).
[0060] [化 17]
Figure imgf000020_0001
[0061] 20 mLナスフラスコに（3) (91.3 mg, 0.20 mmol, 1 eq)をトルエン（10 mL)に溶かし て入れた。次いで Et N (0.5 mL), BF -Et O (0.75 mL)を加え、室温で 1時間撹拌し
3 3 2
た。
[0062] 反応終了後、 sat.NaHCO aqを加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で
3
洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得ら れた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム）で分離精製し、 目的 化合物（4) (65.8 mg,収率; 65.3 %)を赤色固体として得た。
[0063] TLC ;R=0.20 (溶離液；クロ口ホルム）
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.88 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.74 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.14 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.98 (d, J = 8 Hz, 2 H), 5.96 (s, 2 H), 4.28 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.53 (s, 6 H), 1.39 (s, 6 H).
[0064] [化 18]
Figure imgf000021_0001
[0065] 30 mLナスフラスコに（4) (37.1 mg, 0.07 mmol, 1 eq)をクロ口ホルム（10 mL)に溶 かて入れた。次いで NBS (13.0 mg, 0.07 mmol, 1 eq)を加え、室温で 1時間撹拌した 。赤色溶液になった。
[0066] 反応終了後、水を加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水 硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリ 力ゲルクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム Iへキサン = 3 / 1)で分離精製し、さ らに分取用薄層クロマトグラフィー (溶離液;クロ口ホルム)で分離精製し、 目的化合物 (5) (28.9 mg,収率; 67.8 %)を赤色固体として得た。
[0067] TLC ;R=0.15 (溶離液；クロ口ホルム
f Iへキサン = 3 / 1)
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.89 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.75 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.13 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.99 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.01 (s, 2 H), 4.30 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.16 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.57 (s, 3 H), 2.55 (s, 3 H), 1.40 (s, 3 H), 1.37 (s, 3 H).
[0068] [化 19]
Figure imgf000022_0001
[0069] 50 mL二口フラスコに (5) (28.9 mg, 0.05 mmol, 1 eq)を 1,4-ジォキサン (15 ml)に 溶解し、化合物 (5') (20.2 mg, 0.07 mmol, 1.5 eq), K CO (54.2 mg, 0.4 mmol, 8 eq)
2 3
を入れ、真空脱気した。次いで Pd(pph ) (5.8 mg, 0.005 mmol, 0.1 eq)をすばやく加
3 4
え、再び真空脱気し、 Ar下 80 °Cで 1日攪拌した。
[0070] 反応終了後、放冷し、クロ口ホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和 食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮し た。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム Iへキサン = 3 / 1 )で分離精製し、 目的化合物（6) (14.2 mg,収率; 43.0 %)を赤色固体として得た。
[0071] TLC ;R=0.15 (溶離液；クロ口ホルム Iへキサン = 3 / 1 )
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.88 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.85 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.74 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.62 (d, J = 1 Hz, 1 H), 7.47 (dd, J = 1, 8 Hz, 1 H), ), 7.18 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.00 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.04 (s, 1 H), 4.29 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3 .18 (s, 3 H), 2.59 (s, 3 H), 2.51 (s, 3 H), 1.43 (s, 3 H), 1.31 (s, 3 H).
[0072] [化 20]
Figure imgf000023_0001
[0073] 30 mLナスフラスコに（6) (7.2 mg, 0.01 mmol, 1 eq)をエタノール（10 ml)に溶解し 、ヒドラジン（100 μ 1,大過剰)を加えて 1時間還流した。反応終了後、放冷し、氷浴中 でジェチルエーテル (20 ml)をカ卩え、さらにへキサン (10 ml)を加え、 30分放置した。赤 色沈殿が析出した。沈殿をろ別し、ろ物をメタノールに溶力して減圧濃縮した。 目的 化合物（KCB-lime2) (5.7 mg,収率； 100 %)を赤色固体として得た。
[0074] TLC ;R=0.10 (溶離液；クロ口ホルム Iメタノーノレ = 9 / 1 )
f
ESI-MS(positive) m/z: calcd for C H BF N O (M+H+), 544.23; found, 543.36.
29 29 2 5 3
実施例 2
[0075] 本発明の化学発光性化合物 KCB-orange2の合成
[0076] [化 21]
Figure imgf000023_0002
6'
[0077] 500 mL三口フラスコに H 0 (130 mL)、 KOH (33.6 g)を入れ、氷冷しながら溶かした
2
。次いで (6') (40 g, 0.33 mmol, 1 eq)を加え、 60 °Cに昇温した。クロ口ホルム (52 mL )を 3時間かけて滴下し、その後 24時間還流した。茶色から赤茶色に変化した。
[0078] 反応終了後、放冷し、氷冷しながら dil.H SO (200mL)を除々に加え、酸性にした。 白色固体が生成し、黄色になった。生成した固体をろ別し、得られたろ物をクロロホ ルムで洗浄して黄色の不純物を取り除いた。真空ポンプで乾燥後、 目的化合物 (7) ( 3.0 g,収率; 6.0 %)を白色固体として得た。
[0079] TLC ;R=0.80 (溶離液；へキサン I酢酸ェチル = 1 / 1 = v / v )
f
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 10.36 (s, CHO), 10.32 (s, OH), 6.53 (s, 2 H), 3.36 (s, 6 H).
[0080] [化 22]
Figure imgf000024_0001
8
[0081] Ar気流下で（7) (1.5 g, 10 mmol, 1 eq)を DMF (20 mL)に溶解し、 100 mL三ロフラ スコに加えて攪拌した。そこにブロモェチルフタルイミド（3.8 g, 15 mmol, 1.5 eq)、 K
2
CO (3.5 g, 25 mmol, 2.5 eq)を加え、 65 °Cで 24時間攪拌した。うすい黄色から黄土
3
色に変色した。反応終了後、放冷し、酢酸ェチルを加え、有機相を 3回抽出した。有 機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を 減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム） で分離精製し、 目的化合物（8) (1.65 g,収率; 51.6 %)を黄色オイルとして得た。
[0082] TLC ;R=0.20 (溶離液；クロ口ホルム）
f
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 10.39 (s, CHO), 7.83 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.72 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 6.55 (s, 2 H), 4.27 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.11 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.53 (s, 6 H).
[0083] [化 23]
Figure imgf000025_0001
[0084] 300 mL三口フラスコに (9) (4.5 g , 18.3 mmol, 1 eq)、フエ-ルボロン酸 (2.2 g, 18.3 mmol, 1 eq)、 Pd(PPh ) (208 mg, 0.18 mmol, 0.01 eq)を入れ、次いで超音波脱気し
3 4
た 2 N Na CO aq. (10 mL, 21.9 mmol, 1.2 eq)を入れた。そこにトルエン (100 mL)
2 3
メタノール (10 ml)を加え、真空脱気し、 Ar気流下 80°Cで 72時間攪拌した。黄色透 明から赤褐色に変化した。
[0085] 反応終了後、水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水 硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシ リカゲルクロマトグラフィー（溶離液;へキサン I酢酸ェチル = 50 / 1 )で分離精製し 、目的化合物（10) (2.69 g ,収率; 60.4 %)を黄色透明のオイルとして得た。
[0086] TLC ;Rf = 0.15 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 50 / 1 , v / v )
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.35 (m, 5 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.23 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 6.20 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.13 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 1.34 (s, 9 H).
[0087] [化 24]
Figure imgf000025_0002
[0088] 30 mLナスフラスコに化合物（10) (1.16 g, 4.77 mmol, 1 eq)を入れ、 THF (15 mL) に溶解した。次いで 28% NaOMeメタノール溶液 (2.5 mL)を加え、室温で 1時間攪拌 した。
[0089] 反応終了後、トルエンと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄 し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。 目的化合 物（11) (509 mg,収率； 74.6 %)を茶白色固体として得た。
[0090] TLC ;Rf = 0.15 (溶離液；へキサン I酢酸ェチル = 20 / 1, v / v )
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 8.43 (s, NH), 7.38 (m, 5 H), 6.88 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 6.54 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.32 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ).
[0091] [化 25]
Figure imgf000026_0001
[0092] 300 mL三口フラスコに塩化メチレン（100 mL)を入れ、室温で 30分 Nパブリングした
2
。 (10) (472 mg, 1.46 mmol, 1 eq)、 (11) (418 mg, 2.92 mmol, 2 eq)を塩化メチレン (5 0 mL)溶解して加え、再び室温で 30分 Nパブリング後、 TFA (10 drops)を加え、室温
2
で 1時間攪拌した。黄色力 紫色に変化した。 DDQ (331 mg, 1.46 mmol, 1 eq)をカロ え、室温で 30分攪拌した。濃い紫色になった。
[0093] 反応終了後、塩化メチレンと NaHCO aq.を加え、有機相を抽出した。 DDQをよく取
3
り除くため、有機相を NaHCO aq.で 4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。無水
3
硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をァ ルミナクロマトグラフィー（溶離液;へキサン I塩化メチレン = 1 / 1 )で分離精製し、 目的化合物（12) (447.5 mg,収率; 52.0 %)を赤色固体として得た。
[0094] TLC ;R=0.21 (溶離液；へキサン I塩化メチレン = 1 / 1 )
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 8.42 (s, NH), 7.92 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.88 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.74 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.47 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.36 (m, 2 H), 6.75 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.66 (s, [6600]
•(H 9 <s)
ZVZ '( H 2 'ZH 9 = f LVf '( H S 'ZH 9 = f 6Z'f '(H Z '2H = i 'P) SS"9 '(Η Z
'ZH = f 'P) 6S"9 '(H Z 's) 69·9 '(H '^Η 6 = ί 'Ρ) LVL '(Η Z 'ω) ·Ζ '(Η Ζ 'ΖΗ £
'ε = f 'ρρ) e " '(Η Ζ 'ΖΗ ε'ε = f 'ρρ) 68· '(Η 'ΖΗ 6 = f 'ρ) 06- '(ΗΝ zvs 9
('口 'SRL ήつ αつ 'ΖΗ兩 οε) Η顺- Ητ
( Λ / Λ = χ / 02 = I ^ ' ) OS'O=J : 丄 [8600] o-M ^ m^ ^ (% 0 6·*¾ί ' 9ε （ει) 目、つ攝慰鑭
M 110Z = / ェ邈 I
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
、 丄 600] α ί^οε ο0 os ^nc^ SZ ) ο¾· Η9 S ) N¾^^^ °^Y ^
權 (， 02)ベエ ί¾ ( τ 画 9Ζ (Z\)コ )c OS [9600]
Figure imgf000027_0003
[92^ ] [S600] •(H 9 <s)
ZVZ '( H 2 'ZH 9 = f ' ) LVf '( H S 'ZH 9 = f 6Ζ'Ϋ(Η S 'ΖΗ = f 'P) W9 '(Η Z
93 6ZSS0T/.00Z OAV
[sz^ [εοτο]
•(H 9 's) SVZ '( H 2 'ZH 9 = f LVf '( H S 'ZH 9 = f l£' '(H Z '2H = i
'Ρ) 09·9 '(Η ΐ 'ZH = f 'Ρ) Ζ9·9 '(H Z <S) 0Γ9 ' (H 9 'ω) '(H S 'ZH 6 = f 'P) 99 •Z '(H 2 'ZH 6 = f 'Ρ) 9ΓΖ '(H Z 'ZH S'S = f 'PP) S8"Z '(H Z 'ZH S'S = f 'PP) 06· 9
('口 'SRL ήつ αつ 'ZH兩 οε) Η顺- Ητ ( Λ / Λ = χ / 02 = Iベエ β · ) 02 =Η · n丄 βθΐθ]
。 ェつ; : #圑^绻¾ (% 00Ϊ: ¾ί π ε) (w)呦^ 目 m 鷇 ϊί教 瀚缀ェっ
Figure imgf000028_0001
。 _n#if¾s— ¾累 ο)¾· 'つ止縱ェ 翻 ΐェっ
^ ^ m 03) ^ΰΰ^¾ ( τ '\o ffo 'Sin 0"8Ζ) SHN^ ^ °^Y ^
コ） (ΐω OSS) ^ΓΛ^ ^ (be '\o fQ 'Sin fz^Z) (ST) ui OS [0010]
Figure imgf000028_0002
Wひ SO/ OOZdf/ェ:) d 93 6ZSS0T/.00Z OAV
Figure imgf000029_0001
[0104] 200 mL三口フラスコに（14) (314 mg, 0.44 mmol, 1 eq)を 1,4-ジォキサン（50 ml)に 溶解し、化合物 (5') (240 mg, 0.88 mmol, 2 eq)、 K CO (486 mg, 3.52 mmol, 8 eq)を
2 3
入れ、真空脱気した。次いで Pd(pph ) (46 mg, 0.04 mmol, 0.1 eq)をすばやく加え、
3 4
再び真空脱気し、 Ar下 80 °Cで 1日攪拌した。
[0105] 反応終了後、放冷し、クロ口ホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和 食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮し た。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー（溶離液；トルエン I酢酸ェチル = 9 / 1 )で分離精製し、目的化合物（15) (274.3 mg,収率; 78.3 %)を赤紫色粉末として得た
[0106] TLC ;R=0.38 (溶離液；トルエン I酢酸ェチル = 9 / 1 = v / v )
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.90 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.89 (s, 1 H), 7.88 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.76 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.51 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.49 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7.41 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.37 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7.17 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.14 (m, 6 H) , 6.77 (s, 1 H), 6.74 (s, 2 H), 6.72 (d, J = 4 Hz, 1 H), 6.63 (d, J = 4 Hz, 1 H), 4.31 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4. 19 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.11 (s, 3 H), 2.23 (s, 6 H).
[0107] [化 29]
Figure imgf000030_0001
[0108] 50mLナスフラスコに（15) (26.3 mg, 0.03 mmol, 1 eq)をエタノール（30 ml)に溶解 し、ヒドラジン（100 μ 1,大過剰)を加えて 2時間還流した。反応終了後、放冷し、酢酸 ェチル Iジェチルエーテル = 1 / 1 = V / Vと水を加え、有機相を抽出した。有機相 を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧 濃縮した。 目的化合物（KCB-orange2) (20 mg,収率; 90.9 %)を赤紫色固体として得 た。
[0109] TLC ;R =0.10 (溶離液；クロ口ホルム Iメタノーノレ = 9 / 1 )
f
実施例 3
[0110] 本発明の化学発光性化合物 KCB-orange2-wの合成
[0111] [化 30]
Figure imgf000030_0002
[0112] 30mL二口フラスコに（15) (19.0 mg, 0.44 mmol, 1 eq)を塩化メチレン（3ml)に溶解 して- 78 °Cで撹拌し、 C1SO H (1 drop)をカ卩えてそのまま 3時間撹拌した。蛍光ピンク
3
力も紫色になり、沈殿が生じた。反応終了後、 NaHCO aq.を加えてタエンチした。赤
3
色沈殿が生じた。
[0113] 沈殿をろ別し、ろ物をメタノールに溶力して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣を 分取用逆相薄層クロマトグラフィー (溶離液;メタノール）で分離精製し、 目的化合物（ 15') (13.3 mg,収率； 58.8 %)を赤色固体として得た。
[0114] TLC ;R=0.10 (溶離液；クロ口ホルム/メタノール = 9 / 1 = v / v )
f
ESI-MS(negative) m/z: calcd for C H BF N O S (M- Na+), 875.22; found, 875.2.
39 31 2 5 6
[0115] [化 31]
Figure imgf000031_0001
[0116] 30mLナスフラスコに（15，） (4.7 mg, 0.005 mmol, 1 eq)をエタノール（6 ml)に溶解し 、ヒドラジン（50 1、大過剰)を加えて 30分還流した。蛍光オレンジ力 濃いピンクに 変化した。反応終了後、放冷し、ジェチルエーテルを加え、氷冷しながら沈殿を析出 させた。吸引ろ過で沈殿 (赤色固体)を回収し、メタノールに溶解させて溶媒を減圧 濃縮した。 目的化合物（KCB-orange2-w) (4.0 mg,収率； 100 %)を赤色固体として得 た。
[0117] TLC ;R =0.05 (溶離液；クロ口ホルム
f Iメタノーノレ = 6 / 1 )
ESI-MS(negative) m/z: calcd for C H BF N O S (M- Na+), 746.21; found, 745.8.
39 31 2 5 6
実施例 4
[0118] 本発明の化学発光性ィ匕合物 KCB-apple2の合成
[0119] [化 32]
Figure imgf000032_0001
9
[0120] 300mL三口フラスコに (9) (4.5 g , 18.3 mmol, 1 eq)、 4-メトキシフエ-ルボロン酸（2.
7 g, 18.3 mmol, 1 eq)、 Pd(PPh ) (208 mg, 0.18 mmol, 0.01 eq)を入れ、次いで超音
3 4
波脱気した 2 N Na CO aq. (10 mL, 21.9 mmol, 1.2 eq)を入れた。そこにトルエン（1
2 3
00 mL)、メタノール (10 ml)を加え、真空脱気し、 Ar気流下 80°Cで 48時間攪拌した。
[0121] 反応終了後、水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水 硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシ リカゲルクロマトグラフィー（溶離液;へキサン I酢酸ェチル = 29 / 1 )で分離精製し 、 目的化合物（16) (2.4 g ,収率; 48.1%)を無色透明のオイルとして得た。
[0122] TLC ;Rf = 0.15 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 29 / 1 , v / v )
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.32 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 7.27 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.20 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.13 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 3.83 (s, 3 H), 1.39 (s, 9 H).
[0123] [化 33]
Figure imgf000032_0002
[0124] 50mLナスフラスコに化合物 (16) (780 mg, 2.85 mmol, 1 eq)を入れ、 THF (15 mL) に溶解した。次いで 28% NaOMeメタノール溶液 (2.5 mL)を加え、室温で 1時間攪拌 した。うすい緑色から濃い茶色に変化した。
[0125] 反応終了後、トルエンと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄 し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。 目的化合 物（17) (469 mg,収率； 94.9 %)を茶白色固体として得た。
[0126] TLC ;Rf = 0.1 (溶離液；へキサン/酢酸ェチル = 29 / 1, v / v ) Ή-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 8.30 (s, NH), 7.38 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.80 (d, J = 2 Hz 1 H), 6.40 (s, 1 H), 6.28 (d, J = 3 Hz, 1 H ), 3.81 (s, 3 H).
[0127] [化 34]
Figure imgf000033_0001
[0128] 300 mL三口フラスコに塩化メチレン（100 mL)を入れ、室温で 30分 Nパブリングした
2
。 (8) (436.5 mg, 1.35 mmol, 1 eq)、 (17) (469 mg, 2.7 mmol, 2 eq)を塩化メチレン (5 0 mL)に溶解して加え、再び室温で 30分 Nパブリング後、 TFA (10 drops)を加え、室
2
温で 42時間攪拌した。茶色から青色に変化した。 DDQ (306.4 mg, 1.35 mmol, 1 eq) を加え、室温で 30分攪拌した。濃い青色に変化した。
[0129] 反応終了後、塩化メチレンと NaHCO aq.を加え、有機相を抽出した。 DDQをよく取
3
り除くため、有機相を NaHCO aq.で 4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。無水
3
硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をァ ルミナクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム）で分離精製し、 目的化合物（18) (484 .4 mg,収率; 55.2 %)を赤紫色固体として得た。
[0130] TLC ;R=0.80 (溶離液；クロ口ホルム）
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 10.43 (s, NH), 7.87 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.85 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.73 (dd, J = 3 ,3 Hz, 2 H), 7.00 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.67 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.65 (s, 2 H), 6.37 (d, J = 4 Hz, 2 H),4.28 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.11 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.89 (s, 6 H), 2.12 ( s, 6 H).
[0131] [化 35]
Figure imgf000034_0001
[0132] 50mLナスフラスコに (18X484.4 mg, 0.75 mmol, 1 eq)をトルエン（10 mL)に溶かし て入れた。次いで Et N (0.5mL), BF -Et O (0.75 mL)を加え、 60 °Cで 15分撹拌した
3 3 2
[0133] 反応終了後、 sat.NaHCO aqをカ卩えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で
3
洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得ら れた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液;クロ口ホルム)で分離精製し、 目的 化合物（19) (497.3 mg,収率； 95.6 %)を青色固体として得た。
[0134] TLC ;R=0.20 (溶離液；クロ口ホルム）
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.87 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.85 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.73 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 6. 95 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.68 (s, 2 H), 6.53 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.51 (d, J = 4 Hz, 2 H), 4.28 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.16 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.85 (s, 6 H), 2.56 (s, 6 H).
[0135] [化 36]
Figure imgf000035_0001
[0136] 30mLナスフラスコに（19) (209 mg, 0.30 mmol, 1 eq)をクロ口ホルム（20 mL)に溶か て入れた。次いで NBS (53.4 mg, 0.30 mmol, 1 eq)をクロ口ホルム (20 mL)に溶かして 30分かけて滴下し、そのまま室温で 3時間撹拌した。
[0137] 反応終了後、水を加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水 硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物（20) (2 38.1 mg,収率； 100 %)を青色固体として得た。（Br2個つきもできたが、 1個つきと Rf値 がほとんど同じで分離できないため、そのまま次の反応を進めた）
[0138] TLC ;R=0.15 (溶離液；トルエン I酢酸ェチル = 20 / 1 = v / v )
f
[0139] [化 37]
Figure imgf000036_0001
[0140] lOOmL三口フラスコに（20) (238.1 mg, 0.31 mmol, 1 eq)を 1,4-ジォキサン（50mL) に溶解し、化合物 (5') (167 mg, 0.62 mmol, 2 eq)、 K CO (342 mg, 2.5 mmol, 8 eq)
2 3
を入れ、真空脱気した。次いで Pd(pph ) (35.8 mg, 0.03 mmol, 0.1 eq)をすばやく加
3 4
え、再び真空脱気し、 Ar下 80 °Cで 24時間攪拌した。
[0141] 反応終了後、放冷し、クロ口ホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和 食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮し た。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー（溶離液；トルエン I酢酸ェチル = 9 / 1 )で分離精製し、その後 GPCでさらに精製し、目的化合物（21) (108.2 mg,収率; 40.7 %)を青色固体として得た。
[0142] TLC ;R=0.10 (溶離液；トルエン I酢酸ェチル = 9 / 1 = v / v )
f
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.90 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.88 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 4 Hz, 2 H), 7 .44(d, J = 9 Hz, 2 H), 7.18 (d, J = 8 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.89 (d, J = 9
Hz, 3 H), 6.73 (s, 2 H), 6.69 (s, 1 H), 6.66 (d, J = 9 Hz, 3 H), 4.30 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.18 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.84 (s, 3 H), 3.83 (s, 3 H), 3.12 (s, 3 H), 2.21 (s, 6 H ).
[0143] [化 38]
Figure imgf000037_0001
[0144] 50mLナスフラスコに (21) (17.5 mg, 0.02 mmol, 1 eq)をエタノール (40 ml)に溶解 し、ヒドラジン（100 μ 1,大過剰)を加えて 2時間還流した。反応終了後、放冷し、酢酸 ェチル Iジェチノレエーテノレ = 1 / 1 = V / Vと水をカ卩え、有機相を抽出した。水相の 色がなくなるまで 7回程抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウ ムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣を HPLC (溶離液; メタノール）にて分離精製し、 目的化合物（KCB-apple2) (14.9 mg,収率； 100 %)を青 色固体として得た。
[0145] TLC ; R=0.10 (溶離液；クロ口ホルム Iメタノーノレ = 9 / 1 )
f
ESI-MS(positive) m/z: calcd for C H BF N O (M+H+), 728.29; found, 727.56.
41 37 2 5 5
実施例 5
[0146] 本発明の化学発光性ィ匕合物 KCB-apple3の合成
[0147] [化 39]
Figure imgf000037_0002
[0148] 200mL三口フラスコに (9) (931 mg , 3.79 mmol, 1 eq)、 4- (1-ブチル -ペンチ口キシ) -フエ-ノレボロン酸 (1.0 g, 3.79 mmol, 1 eq)、 Pd(PPh ) (44 mg, 0.04 mmol, 0.01 eq) を入れ、次いで超音波脱気した 2 N Na CO aq. (10 mL, 9.46 mmol, 2.5 eq)を入れ
2 3
た。そこにトルエン（50 mL)、メタノール (10 ml)を加え、真空脱気し、 Ar気流下 80°C で 22時間攪拌した。
[0149] 反応終了後、水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水 硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシ リカゲルクロマトグラフィー（溶離液;へキサン I酢酸ェチル = 80 / 1 )で分離精製し 、 目的化合物（22) (1.1 g ,収率; 75.3 %)を茶色のオイルとして得た。
[0150] TLC ;Rf = 0.13 (溶離液；へキサン I酢酸ェチル = 80 / 1 , v / v )
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.31 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 7.23 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.85 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.20 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.13 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 4.23 (m, 1 H), 1.60 (m, 4H), 1. 36 (s, 9 H), 1.32 (m, 8H), 0.89 (t, J = 7 Hz, 6H).
[0151] [化 40]
Figure imgf000038_0001
[0152] lOOmLナスフラスコに化合物（22) (1.1 g, 2.85 mmol, 1 eq)を入れ、 THF (20 mL) に溶解した。次いで 28% NaOMeメタノール溶液 (2.5 mL)を加え、室温で 3時間攪拌 した。うすい茶色から濃い茶色に変化した。
[0153] 反応終了後、酢酸ェチルと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で 洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得ら れた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；へキサン I酢酸ェチル I TEA = 4 0 / 1 / 0.1 )で分離精製し、 目的化合物（23) (192 mg,収率; 23.6 %)を肌色固体と して得た。
[0154] TLC ;Rf = 0.15 (溶離液；へキサン I酢酸ェチル / TEA = 40 / 1 / 0.1 , v / v / v ) JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 8.27(s, NH), 7.33 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.87 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.73 (d, J = 2, 3 Hz , 1 H), 6.39 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.25 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 4.20 (m, 1 H), 1.63 (m, 4H), 1.33 (m, 8 H), 0.89 (t, J = 7 Hz, 6H).
[0155] [化 41]
Figure imgf000039_0001
[0156] 200 mL三口フラスコに Ar下（23) (192 mg, 0.67 mmol, 2 eq)を塩化メチレン（10 mL) に溶かして入れ、（EtO) CH (3 ml, 10.1 mmol, 30 eq)、 TFA(10 drops)をカ卩え、室温
3
で 1時間撹拌した。無色力 真っ青に色が変化した。
[0157] 反応終了後、塩化メチレンと NaHCO aq.を加え、有機相を抽出した。中和した途端
3
真っ赤になった。有機相を NaHCO aq.で 4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。
3
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣 をアルミナクロマトグラフィー（溶離液;へキサン I塩化メチレン = 8 / 1→ 1 / 1 )で 分離精製し、目的化合物（24) (151.8mg,収率; 77.8 %)を赤色固体として得た。
[0158] TLC ;R=0.10 (溶離液；へキサン I塩化メチレン = 8 / 1)
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.81 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.98 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.96 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.82 (s, 1 H), 6.78 (d, J = 4 Hz, 2 H ), 4.32 (m, 2 H), 1.68 (m, 8H), 1.36 (m, 16 H), 0.92 (t, J = 7 Hz, 12 H).
[0159] [化 42]
Figure imgf000039_0002
[0160] 50 mLナスフラスコに（24) (150 mg, 0.26 mmol, 1 eq)をトルエン（15 mL)に溶力し て入れた。次いで Et N (0.5 mL), BF -Et O (0.75 mL)を加え， 100 °Cで 30分撹拌し た。
[0161] 反応終了後、 sat.NaHCO aqをカ卩えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で
3
洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得ら れた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液；トルエン Iへキサン = 1 / 1 )で分 離精製し、 目的化合物（25) (162 mg,収率； 100 %)を青色固体として得た。
[0162] TLC ;R=0.25 (溶離液；トルエン/へキサン = 1 / 1 = v / v )
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.88 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.18 (s, 1 H), 7.06 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.91 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.63 (d, J = 4 Hz, 2 H ), 4.27 (m, 2 H), 1.67 (m, 8H), 1.35 (m, 16 H), 0.90 (t, J = 7 Hz, 12 H).
[0163] [化 43]
Figure imgf000040_0001
[0164] 30 mLナスフラスコに（25) (45.6 mg, 0.07 mmol, 1 eq)をクロ口ホルム（10 mL)に溶 かして入れた。次いで NBS (13 mg, 0.07 mmol, 1 eq)を加え，室温で 1時間撹拌した
[0165] 反応終了後、水を加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水 硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリ 力ゲルクロマトグラフィー（溶離液;へキサン Iトルエン = 2 / 1 )で分離精製し、 目的 化合物（26) (12.5 mg,収率; 24.2 %)を青色固体として得た。
[0166] TLC ;R=0.15 (溶離液；へキサン/トルエン = 2 / 1 = v / v )
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.87 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.60 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.15 (s, 1 H), 7.14 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7.09 (s, 1 H), 6.92 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.88 (d, J = 9 Hz, 2 H ), 6.71 (d, J = 4 Hz, 1 H ), 4.26 (m, 2 H), 1.65 (m, 8H), 1.33 (m, 16 H), 0.90 (t, J = 7 Hz, 12 H). [0167] [化 44]
Figure imgf000041_0001
[0168] 50 mL二口フラスコに（26) (12.7 mg, 0.02 mmol, 1 eq)を 1,4-ジォキサン（10 mL) に溶解し、化合物 (5') (7.37 mg, 0.03 mmol, 1.5 eq)、 K CO (20 mg, 0.14 mmol, 8 e
2 3
q)を入れ、真空脱気した.次いで Pd(pph ) (2.3 mg, 0.002 mmol, 0.1 eq)をすばやく
3 4
加え、再び真空脱気し、 Ar下 80 °Cで 24時間攪拌した。
[0169] 反応終了後、放冷し、クロ口ホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和 食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮し た。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー（溶離液；トルエン I酢酸ェチル = 8 / 1 )で分離精製し、その後 GPCでさらに精製し、目的化合物（27) (5.0 mg,収率; 35.2 % )を青色光沢固体として得た。
[0170] TLC ;R=0.15 (溶離液；トルエン I酢酸ェチル = 8 / 1 = v / v )
f
1H-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.67 (s, 1 H), 7.59 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7.37 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.28 (s, 1 H), 7.24 (m, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 7.14 (d, J = 7 Hz, 1 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.84 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.75 (d, J = 4 Hz, 2 H), 4.25 (m, 2 H), 3.15 ( s, 3 H), 1.65 (m, 8 H), 1.34 (m, 16 H), 0.90 (t, J = 7 Hz, 12 H).
[0171] [化 45]
Figure imgf000041_0002
[0172] 50 mLナスフラスコに（27) (4.6 mg, 0.006 mmol, 1 eq)をエタノール（10 ml)に溶解 し、ヒドラジン（100 μ ΐ,大過剰)を加えて 1時間還流した。 [0173] 反応終了後、放冷し、 IN HC1 aq.とジェチルエーテルを加え、有機相を抽出した。 有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶 媒を減圧濃縮した。 目的化合物（KCB-apple3) (3.3 mg,収率; 71.7 %)を青色固体と して得た。
[0174] TLC ;R=0.10 (溶離液；クロ口ホルム Iメタノーノレ = 9 / 1 )
f
実施例 6
[0175] 本発明の化学発光性化合物 KCB-lime3の合成
[0176] [化 46]
Figure imgf000042_0001
[0177] 50 mL二口フラスコに (28) (40 mg, 0.12 mmol, 1 eq)を 1,4-ジォキサン (30 mし)に 溶解し、化合物 (5') (49.2 mg, 0.18 mmol, 1.5 eq)、 K CO (132.7 mg, 0.96 mmol, 8 e
2 3
q)を入れ、真空脱気した。次いで Pd(pph ) (11.6 mg, 0.01 mmol, 0.1 eq)をすばやく
3 4
加え、再び真空脱気し、 Ar下 80 °Cで 20時間攪拌した。
[0178] 反応終了後、放冷し、クロ口ホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和 食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮し た。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー（溶離液;へキサン Iクロ口ホルム = 1 / 1
)で分離精製し、その後 GPCでさらに精製し、 目的化合物（29) (28.5 mg,収率; 58.3
%)を赤色固体として得た。
[0179] TLC ;R=0.15 (溶離液；へキサン/クロ口ホルム = 1 / 1 = v / v )
f
JH-NMR (300MHz, CDC1 , TMS, r.t.)
3
δ 7.90 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.73 (d, J = 1 Hz, 1 H), 7.57 (dd, J = 8, 1 Hz, 1 H), 7.1 7 (s, 1 H), 6.14 (s, 1 H), 3.21 (s, 3 H), 2.58 (s, 3 H), 2.54 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 2. 25 (s, 3 H).
[0180] [化 47]
Figure imgf000043_0001
[0181] 50 mLナスフラスコに (29) (9.2 mg, 0.02 mmol, 1 eq)をエタノール (15 mL)に溶解 し、ヒドラジン（100 μ L,大過剰)をカ卩えて 3時間還流した。
[0182] 反応終了後、放冷し、 IN HC1 aq.とジェチルエーテルを加え、有機相を 3回抽出し た。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して 溶媒を減圧濃縮した。 目的化合物（KCB-lime3) (4.0 mg,収率; 43.5 %)を赤色固体 として得た。
[0183] TLC ; R=0.10 (溶離液；クロ口ホルム
f Iメタノーノレ = 9 / 1 )
実施例 7
[0184] 化学発光実験
新規に合成された KCB-lime2、 orange2、 apple2について発光実験を行った。発光 色およびスペクトルの比較として、巿販されて 、る ABEI (アミノブチルェチルイソルミノ ール)も同様の反応条件で測定した。発光色は、 KCB約 10— 4 M (ABEIは約 10— 2 M)の エタノール溶液約 3 mLに 30%過酸化水素水： 10%水酸化ナトリウム水溶液 =20: 1の溶 液 0.3mLと 1 mMのフェリシアンカリウム水溶液 0.3mLを順次カロえ、激しく攪拌し、 OLY MPUS CAMEDIA C-760を用いて 2秒のシャッタースピードで撮影した。化学発光ス ベクトルは、 1cm角の石英製蛍光セルに KCB約 10— 5 M (ABEIは約 10— 3 M)のエタノー ル溶液約 2.5 mLを入れ、 30%過酸化水素水： 10%水酸化ナトリウム水溶液 =20: 1の溶 液 0.5mLと 1 mMのフェリシアンカリウム水溶液 0.3mLを勢い良く注ぎ込み、 日立蛍光 分光器 F-4500を用いて毎分 1200nmのスキャンレートで測定した。
[0185] 結果を図 1に示す。図 1に示すように、本発明の化合物である KCBシリーズの 3種の 化合物は、公知の色素 ABEIと比較してピークが鋭ぐノイズが少なぐかつ、 3種類の 化合物の発光波長のピークが明瞭に分離していた。なお、 目視観察の結果、 lime2は 黄緑、 orangeは橙色、 apple2は赤色であり、肉眼でも色は明瞭に区別できた。

Claims

請求の範囲
下記一般式 [I]で示される構造を有する化学発光性化合物。
Figure imgf000044_0001
ただし、式中、 R2、 R4及び R6は、これらのうち少なくとも 1つが化学発光基であり、それ 以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、
Figure imgf000044_0002
R5及び R7は 、互いに独立に水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、 R8及び R9は 互いに独立にフッ素、アルコキシ基又は化学発光基である（ただし、両者が同時に化 学発光基ではない)。
[2] 前記一般式 [I]において、 R8及び R9は互いに独立にフッ素又はアルコキシ基である 請求項 1記載の化合物。
[3] 前記化学発光基は R2及び/又は R6である請求項 1又は 2記載の化合物。
[4] 前記一般式 [I]中の R1ないし R7の少なくとも 1つとして、発光波長調整基を有する請 求項 1な!、し 3の!、ずれか 1項に記載の化合物。
[5] 前記発光波長調整基がアルキル基、アルコキシル基、ァリール基、ヘテロァリール 基及びこれらの誘導体から成る群より選ばれる基である請求項 4記載の化合物。
[6] R1及び/又は R7が前記発光波長調整基である請求項 4又は 5記載の化合物。
[7] 前記一般式 [I]中の R1ないし R7であって前記化学発光性基、前記発光波長調整基 又は水素以外の基として、結合性基を有する請求項 4ないし 6のいずれか 1項に記載 の化合物。
[8] 前記結合性基がアミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、 ジスルフイド基、イソシァネート基、チォイソシァネート基、スクシンィミジルエステル基 、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基、ハロゲン並びにこれらの少なくと もいずれかを含む基から成る群より選ばれる請求項 7記載の化合物。
[9] 前記化学発光基がフタルカルバジド誘導体、ジォキセタン誘導体、口フィン誘導体
、アタリジン誘導体、インドール誘導体、シユウ酸誘導体、ジフヱノィル誘導体又はル シフェリン誘導体である請求項 1ないし 8のいずれ力 1項に記載の化合物。
[10] 前記化学発光基が前記一般式 [I]に示されるボロンジピロメテン骨格にスぺーサー を介することなく直結されている請求項 1ないし 9のいずれか 1項に記載の化合物。
[11] 下記一般式 Da]で示される構造を有する請求項 1記載の化合物。
[化 2]
Figure imgf000045_0001
[ la ]
ただし、式中、 Rla及び R7aは互いに独立に水素、アルキル基、アルコキシル基、ハロゲ ン、フエ-ル基若しくは置換フエ-ル基（置換基は 1ないし 5個のアルキル基、アルコ キシル基又はモノ—若しくはジ—アルキルアミノ基）（ただし、 Rla及び R7aの両方が同 時に水素ではない)又はへテロ芳香族基、 R2aは水素、ハロゲン、末端に結合性官能 基を有する置換カルボニル基若しくはァリール基、発光波長調整基、親水性基又は 化学発光性基、 R3a及び R5aは、互いに独立に水素又はアルキル基、 R½は、水素、ァ ルキル基、フ -ル基又は末端に結合性官能基を有する置換アルキル基若しくはァ リール基である。
前記 R2a並びに R3a及び R5aの定義中の結合性官能基が、アミノ基、水酸基、カルボキ シル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフイド基、イソシァネート基、チォイソシァ ネート基、スクシンィミジルエステル基、ペンタフルオロフェ-ルエステル基、マレイミ ド基又はハロゲンであり、前記発光波長調整基がアルキル基、アルコキシル基、ァリ ール基、ヘテロァリール基及びこれらの誘導体から成る群より選ばれる基であり、前 記化学発光性基がフタルカルバジド誘導体、ジォキセタン誘導体、口フィン誘導体、 アタリジン誘導体、インドール誘導体、シユウ酸誘導体、ジフヱノィル誘導体又はルシ フェリン誘導体である請求項 11記載の化合物。
[13] 前記親水性基が、スルホン酸基若しくはその塩、水酸基、アミノ基、カルボ-ル基、 カルボキシル基、又はこれらの基の少なくともいずれか若しくはエーテル結合を 1個 又は複数含むアルキル基若しくはアルコキシル基である請求項 11又は 12記載の化 合物。
[14] 下記一般式 [lb]で示される構造を有する請求項 11記載の化合物。
[化 3]
Figure imgf000046_0001
ただし、式中、 Rlb及び R7bは、互いに独立に炭素数 1〜4のアルキル基、フエ-ル基又 はアルコキシフエ-ル基（アルキル部分の炭素数は 1〜10)、 R2bは水素又はスルホン 酸基若しくはその塩、 R3b及び R5bは互いに独立に水素又は炭素数 1〜4のアルキル 基、 R4bは水素又は
[化 4]
Figure imgf000046_0002
(ただし、式中、 R1Q及び R11は互いに独立に水素又は炭素数 1〜4のアルキル基、 ま
1〜4の整数を示す）。
[15] 請求項 1な!、し 14の 、ずれか 1項に記載の化合物から成る標識剤。
[16] 互いに異なる前記発光波長調整基を有し (ただし、 1種類の化学発光性化合物の みは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによつて発光波長が異なる複 数種類の請求項 4な 、し 14の 、ずれか 1項記載の化学発光性化合物から成る標識 剤の組合せ。
[17] 前記複数の標識剤が、同一の化学発光基を有する請求項 16記載の標識剤の組 合せ。
[18] 請求項 15記載の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光 させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法。
[19] 互いに異なる前記発光波長調整基を有し (ただし、 1種類の化学発光性化合物の みは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによつて発光波長が異なる複 数種類の請求項 4ないし 14のいずれか 1項に記載の化学発光性ィ匕合物を標識剤と して用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応 後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の物質を同時に測定することを 含む複数の標識物質の同時測定方法。
[20] 前記複数の標識剤が、同一の化学発光基を有する請求項 19記載の測定方法。
PCT/JP2007/054254 2006-03-07 2007-03-06 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤 Ceased WO2007105529A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-061786 2006-03-07
JP2006061786A JP2007238489A (ja) 2006-03-07 2006-03-07 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007105529A1 true WO2007105529A1 (ja) 2007-09-20

Family

ID=38509364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/054254 Ceased WO2007105529A1 (ja) 2006-03-07 2007-03-06 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2007238489A (ja)
WO (1) WO2007105529A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009056782A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Ucl Business Plc Luminescence
WO2010098119A1 (ja) * 2009-02-27 2010-09-02 三井化学株式会社 錯体化合物、および該錯体化合物を含有する有機電界発光素子
WO2010098098A1 (ja) * 2009-02-27 2010-09-02 出光興産株式会社 ピロメテンホウ素錯体化合物及びそれを用いた有機電界発光素子
CN111139066A (zh) * 2019-12-24 2020-05-12 山东大学 一种广谱型低电位电化学发光体系及其构建方法
CN115298286A (zh) * 2020-03-20 2022-11-04 日东电工株式会社 含硼环状发光化合物和包含该含硼环状发光化合物的色彩转换膜

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2601950A1 (en) * 2011-12-06 2013-06-12 Sanofi Cycloalkane carboxylic acid derivatives as CXCR3 receptor antagonists
CN110114701B (zh) 2016-12-19 2021-05-25 富士胶片株式会社 波长转换用发光性树脂组合物及其制造方法、以及波长转换部件及发光元件
JP2019172826A (ja) * 2018-03-28 2019-10-10 富士フイルム株式会社 蛍光性化合物及びこれを用いた蛍光標識生体物質

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003137824A (ja) * 2001-10-22 2003-05-14 Park Kun-Ha アントラセン化合物およびこれを含む化学発光組成物
WO2004076466A1 (ja) * 2003-02-28 2004-09-10 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 蛍光プローブ
JP2006306752A (ja) * 2005-04-27 2006-11-09 Kanagawa Acad Of Sci & Technol 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003137824A (ja) * 2001-10-22 2003-05-14 Park Kun-Ha アントラセン化合物およびこれを含む化学発光組成物
WO2004076466A1 (ja) * 2003-02-28 2004-09-10 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 蛍光プローブ
JP2006306752A (ja) * 2005-04-27 2006-11-09 Kanagawa Acad Of Sci & Technol 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOLLMANNSBERGER M. ET AL.: "Electrogenerated chemiluminescence and proton-dependent switching of fluorescence: functionalized difluoroboradiaza-s-indacenes", ANGEWANDTE CHEMIE, INTERNATIONAL EDITION IN ENGLISH, vol. 36, no. 12, 1997, pages 1333 - 1335, XP003017096 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009056782A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Ucl Business Plc Luminescence
WO2010098119A1 (ja) * 2009-02-27 2010-09-02 三井化学株式会社 錯体化合物、および該錯体化合物を含有する有機電界発光素子
WO2010098098A1 (ja) * 2009-02-27 2010-09-02 出光興産株式会社 ピロメテンホウ素錯体化合物及びそれを用いた有機電界発光素子
CN102333783A (zh) * 2009-02-27 2012-01-25 出光兴产株式会社 亚甲基吡咯硼配位化合物及使用了其的有机电致发光元件
US8778510B2 (en) 2009-02-27 2014-07-15 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Pyrromethene-boron complex compounds and organic electroluminescent elements using same
CN111139066A (zh) * 2019-12-24 2020-05-12 山东大学 一种广谱型低电位电化学发光体系及其构建方法
CN111139066B (zh) * 2019-12-24 2021-05-07 山东大学 一种广谱型低电位电化学发光体系及其构建方法
CN115298286A (zh) * 2020-03-20 2022-11-04 日东电工株式会社 含硼环状发光化合物和包含该含硼环状发光化合物的色彩转换膜

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007238489A (ja) 2007-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108440475B (zh) 一种区分不同极性脂滴的比率型荧光探针及其制备方法和应用
CN101983202B (zh) 检测活性种类的发光猝灭剂和荧光探针
EP2022794B1 (en) Fluorescent compound and labeling agent comprising the same
JP6351511B2 (ja) 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成
WO2007105529A1 (ja) 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤
US8389741B2 (en) Difluoroboradiazaindacene dyes
JP2016050296A (ja) 蛍光色素結合セレンテラジン
CN108504130B (zh) 一种花菁类荧光染料及其合成方法
US10144722B2 (en) Carbazole end capped bipyridine compounds and process for preparation thereof
CN115703771B (zh) 一种荧光染料及其制备方法和用途
CN108516979B (zh) 一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物及其应用
CN102040617A (zh) 有机二氟化硼配合物及其制备方法
CN103443101A (zh) 具有荧光发色团的化合物、含有化合物的离子浓度传感器、含有化合物的试剂、具备试剂的试剂盒、化合物的前体、以及化合物的合成方法
JP4030382B2 (ja) 高効率な有機発光性化合物
CN111849196B (zh) 一种近红外二区染料及其合成方法
Khatua et al. A dual state emission luminogen based on the 1, 3, 3-trimethylindoline and chroman-2, 4-dione conjugate for highly selective dual channel detection of cyanide ions
CN108727277A (zh) 一种单线态氧高度选择性聚集诱导化学发光探针及其制备方法和应用
KR102131302B1 (ko) 화합물, 상기 화합물을 포함하는 형광 프로브 조성물, 상기 형광 프로브 조성물을 이용한 수은 이온 검출방법
CN111621289B (zh) 一种光控双通道荧光染料及其制备方法和应用
JP5437615B2 (ja) ケイ光ソルバトクロミック色素
CN105461755B (zh) 一种具有聚集诱导红光发射的铂配合物及其制备方法和应用
JP5636644B2 (ja) 亜鉛発光プローブ及び発光体
JP2006306752A (ja) 化学発光性化合物及びそれから成る標識剤
CN117088881B (zh) 氮杂双环戊萘类荧光分子探针及制备和应用
Tang et al. An emission-tunable fluorescent organic molecule for specific cellular imaging

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07715222

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07715222

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1