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WO2004076466A1 - 蛍光プローブ - Google Patents

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WO2004076466A1
WO2004076466A1 PCT/JP2004/002407 JP2004002407W WO2004076466A1 WO 2004076466 A1 WO2004076466 A1 WO 2004076466A1 JP 2004002407 W JP2004002407 W JP 2004002407W WO 2004076466 A1 WO2004076466 A1 WO 2004076466A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
alkyl
substituent
substituted
alkyl group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/002407
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuo Nagano
Yu Gabe
Yasuteru Urano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sekisui Medical Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Pure Chemicals Co Ltd filed Critical Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority to US10/547,305 priority Critical patent/US20060275912A1/en
Priority to JP2005502965A priority patent/JP4522365B2/ja
Priority to EP04715541A priority patent/EP1604994A4/en
Publication of WO2004076466A1 publication Critical patent/WO2004076466A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US12/688,625 priority patent/US20100120160A1/en
Priority to US13/425,802 priority patent/US8673957B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/022—Boron compounds without C-boron linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
    • C09K2211/1055—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms with other heteroatoms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y10T436/177692—Oxides of nitrogen

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent probe. More specifically, the present invention relates to a fluorescent probe that emits fluorescence by capturing nitric oxide. Background technique
  • indacene derivatives having an ion uptake useful for measuring alkali metal ions or cations are known (JP-A-10-338695 and JP-A-11-5796).
  • JP-A-10-338695 and JP-A-11-5796 there is no report on any attempt to measure nitric oxide using the fluorochrome of this indacene derivative. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to provide a fluorescent probe that emits fluorescence by specifically and efficiently capturing nitric oxide, and as a result, by using a fluorescent chromophore of an indacene derivative, We succeeded in providing a reagent for measuring nitric oxide, which can efficiently react with nitric oxide under the conditions and gives a fluorescent substance with excellent fluorescence intensity (Japanese Patent Application No. 2002-80230).
  • the present inventors have further studied and found that by introducing a substituent such as a carboxy-substituted alkyl group into the fluorescent chromophore of an indacene derivative, it is possible to provide a more water-soluble reagent for measuring nitric oxide.
  • a substituent such as a carboxy-substituted alkyl group
  • they have found that the fluorescence intensity of a fluorescent triazole derivative generated by trapping nitric oxide with the reagent is hardly affected by pH fluctuation.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • R 1 and R 2 each represent an amino group to be substituted at an adjacent position on the fuel ring, and one of the amino groups is an alkyl group which may have a substituent. may have pieces;
  • R 3 ⁇ Pi R 4 each independently represent a hydrogen atom, (6 represent an alkyl group, or _ 6 alkoxy group may have a R 5 and are independently a substituent _ 6 represents an alkyl group,
  • R 6 and R g are each independently a carboxy-substituted _ 6 alkyl group, alkoxycarbonyl-substituted d-6 alkyl group, a sulfonic acid-substituted (6 alkyl group, or an alkyl sulfonate-substituted alkyl group
  • R 7 and R 1G each independently may have a substituent ⁇ 6 alkyl group, aryl which may have a substituent Group, an optionally substituted c 6 alkoxycarbonyl group, an optionally substituted but
  • the above compound or a salt thereof wherein R 6 and R 9 are 2-carboxy-1-ethyl groups, and R 5 , R 7 , R and R 1D are methyl groups. Is done. Further, according to the present invention, there is provided a reagent for measuring nitrogen monoxide containing the above compound or a salt thereof.
  • the present invention provides a compound represented by the following general formula (II):
  • R 13 and R 14 are a hydrogen atom, each independent, _ 6 alkyl group, or (6 An alkoxy group; R 15 and R 18 each independently may have a substituent (a 6 alkyl group; R 16 and R 19 each independently represent a carboxy-substituted 6 alkyl group; , alkoxycarbonyl-substituted (6 alkyl group, a sulfonic acid-substituted C M alkyl group, or an alkyl sulfonate-substituted C M Al kill group And, R 17 and R 2 ° is optionally independently have a substituent (6 alkyl group, which may have a substituent Ariru group which may have a substituent (6 Alkoxycarbonyl group, vinyl group which may have a substituent, Or a pyrrolyl group which may have a substituent], or a salt
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring changes in excitation and fluorescence spectra when NOC13 was added to compound (7).
  • (A) shows the excitation spectrum (Em: 535 nm)
  • (B) shows the fluorescence spectrum (Ex: 520 nm).
  • the results when the N0C13 concentration is 5.0 ⁇ , 2.0 ⁇ ⁇ , 1.0 ⁇ , 0.5 ⁇ , and 0 ⁇ are shown in order from the curve with the highest fluorescence intensity.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of HPLC of the reaction product after addition of NOC 13 to compound (7).
  • FIG. 3 shows the results of measuring the fluorescence intensities of compounds (7) and (8) in various conditions.
  • FIG. 4 is a diagram showing a change in fluorescence intensity when a NO-form form solution of NO was added to a compound-form solution of compound (9).
  • the alkyl group may be linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • a functional group is said to have "substituents", the type, number, The substitution position is not particularly limited, and examples thereof include a halogen atom (which may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom), a hydroxyl group, an amino group, a carbonyl group, a sulfonic acid group and an alkylsulfonate group. You may have it.
  • the term "aryl group” may be either a monocyclic or polycyclic aryl group, but preferably a phenyl group. The same applies to the reel ring.
  • R 3 and / or represents a ( 6 alkyl group or a ( 6 alkoxy group) those groups are preferably bonded to the 2-position and the 6-position on the benzene ring. In the presence of these groups, the quantum yield and the reaction rate may be improved, and the detection sensitivity may be increased
  • the alkyl group represented by R 3 and R 4 is preferably a methyl group, and is preferably an alkoxy group. Is preferably a methoxy group, and it is also preferred that both R 3 and R 4 are hydrogen atoms The same applies to R 13 and R 14 in the general formula (II).
  • R 6 ⁇ Pi R 9 represents (6 alkyl groups are to be preferred. Carboxy-substituted (6 carbon atoms in the alkyl portion content of the alkyl group is not 1 it is monocarboxy substituted _ 6 Al Kill group 4 It is more preferably 2 or 3, and particularly preferably has 2 carbon atoms.It is most preferred that R 6 and R 9 are 2-hydroxyl-1-ethyl groups.R 6 and R 9 the alkoxycarbonyl-substituted (6 Aruki Le group represented, can be exemplified (6 alkyl ester of a carboxy-substituted (6 alkyl groups mentioned preferably ethoxycarbonyl substituted -.., etc.
  • R 6 alkyl R 6 and the, the alkyl sulfonate substituted (6 alkyl group monosulfonic acid substituted _ 6 alkyl groups are preferred.
  • R 6 and R 9 represents a sulfonic acid-substituted C 6 alkyl group shown, motor Roh alkylsulfonates substituted (6 alkyl group Shi-liked, alkyl sulfonates and alkyl sulfonate group in the substituted alkyl group C 6 alkyl sulfonate (( ⁇ 6 alkyl -.
  • R 6 and R 9 when a duck Nokarubokishi substituted C M alkyl group, in particular R 6 ⁇ Pi is 2-force Rupokishi - 1 - when it is Echiru groups, water solubility increases markedly compounds, and by reaction with nitric oxide the fluorescence intensity of the general formula (II) compounds represented by occurring obtained an excellent effect that is not affected by P H variations.
  • the aryl group represented by R 7 and R 1Q is preferably a phenyl group. When the phenyl group has a substituent, the substituent is preferably a sulfonic acid group or a sulfonate group, and particularly preferably a sulfonic acid group.
  • R 7 and R 1D (6 alkoxy force Ruponiru group Shi preferred ethoxycarbonyl group les.
  • substituent groups present in Bulle group represented by R 7 and R 1Q phenyl group, Monoaminofue group, or Jiaminofu Examples of the phenyl group and the pyrrolyl group represented by R 7 and R 1Q are a 2-phenyl group and a 2-pyrrol group, respectively.
  • R 7 and R 1Q are groups other than the alkyl group, the fluorescence wavelength of the compound may shift to the longer wavelength side.
  • R 6 and R 9 are more preferably a 2-carboxy-1-ethyl group.
  • R 5, preferably R 7, R ⁇ Pi ° is also be _ 6 alkyl group optionally having a substituent, e.g., R 5, R ⁇ Pi R 1Q
  • R 15, R 16 in the general formula (II), R 17, R 18, R 19, and the above R 5 also R 2 °, R 6, R 7, R 8, R 9, and the same as R M Ah
  • R 1 and R 2 each represent an amino group substituted at an adjacent position on the phenyl ring.
  • R 1 ⁇ Pi R 2 may be both unsubstituted Amino groups, any of the R 1 ⁇ Pi may be substituted with one alkyl group, the Al kill group 1 Or it may have two or more substituents.
  • the alkyl group substituted on the amino group for example, _ 18 alkyl group linear or branched (preferably there may be mentioned (6 alkyl group), specifically, for example, a methyl group, Echiru group , N-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, etc.
  • alkyl group has a substituent
  • substituents include, for example, a substituted or unsubstituted group.
  • examples include an aryl group-substituted ( ⁇ 6 alkyl group (aralkyl group).
  • aryl-substituted alkyl group include a benzyl group, a phenethyl group, a normethoxybenzyl group, and a no. Laethoxycarbonyl benzyl group. And a paracarboxybenzyl group.
  • R 11 and R 12 are bonded to each other and are adjacent to each other on the phenyl ring.
  • -N N-NR 3fl -group forming a ring at the indicated position.
  • R 3e represents a hydrogen atom or an alkyl group which may have a substituent.
  • the alkyl group include a linear or branched C W8 alkyl group (preferably ( 6 alkyl group)).
  • the alkyl group having a substituent include substituted or unsubstituted alkyl groups.
  • aralkyl group examples include a benzyl group, a phenethyl group, a paramethoxybenzyl group, a paraethoxycarbonylbenzyl group, and a norroxyloxybenzyl group.
  • R 11 and R 12 represents a combination of adjacent (which may have one substituent) Amino substituted on position and nitro group on the phenyl ring, but the R 11 ⁇ Pi R 12 One of them represents an amino group, and the other represents a nitro group.
  • One of R 11 and R 12 - towards the amino group represented by is may be unsubstituted, alkyl group, for example - 18 alkyl group, preferably may have one of C M alkyl group.
  • the alkyl group may have a substituent.
  • a substituted or unsubstituted aralkyl group may be substituted with an amino group.
  • the amino group may have a protecting group for the amino group, for example, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryl group such as a benzoyl group, and an alkylsilyl group such as a trimethylsilyl group.
  • a protecting group for the amino group for example, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryl group such as a benzoyl group, and an alkylsilyl group such as a trimethylsilyl group.
  • An aralkyl group such as a benzyl group may be used as a protecting group.
  • the compound of the present invention represented by the general formula (I) or (II) may form a salt in some cases.
  • the type of salt is not particularly limited, and may be either an acid addition salt or a base addition salt.
  • the acid addition salt include mineral salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, citrate, p-toluenesulfonate, and oxalate.
  • the base addition salts include metal salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, ammonium salts, and organic amine salts such as methylamine salts and triethylamine salts.
  • they may form salts of amino acids such as glycine.
  • the salt of the compound of the present invention is not limited to these specific examples.
  • the compound of the present invention represented by the above general formula (I) or ( ⁇ ) may have one or more asymmetric carbon atoms. Therefore, one or more asymmetric carbons Any optical isomer in optically pure form, any mixture of optical isomers, racemate, diastereoisomers in pure form, mixtures of diastereoisomers, etc., are all within the scope of the present invention. You. Further, the compound of the present invention may exist as a hydrate or a solvate, but it goes without saying that these substances are also included in the scope of the present invention.
  • a compound represented by the above general formula (I) or a compound represented by the above general formula (II) (provided that R 11 and R 12 are substituted at adjacent positions on the phenol ring, R 3 and R 4 are hydrogen atoms, R 6 and R 9 are 2-carboxy-1-ethyl groups, and R 5 and R 7 , a compound in which R and R lfl are all methyl groups, and R 13 and R 14 are hydrogen atoms, R 16 and R 19 are 2-carboxy-1-ethyl groups, and R 15 , Production examples of compounds in which R 17 , R 18 , and R 2 ° are all methyl groups are specifically shown in Examples of the present specification.
  • the compound represented by the general formula (II) is useful as an intermediate for producing the compound represented by the general formula (I).
  • the compound represented by the general formula (I) is taken into a living tissue or a cell and reacted with nitric oxide to generate a fluorescent compound of the general formula (II), thereby reducing the fluorescence of the compound.
  • the compound of the general formula (I) of the present invention has excellent reactivity with nitrogen monoxide, and has an excellent characteristic that it can measure nitrogen monoxide with high sensitivity and accuracy. ing.
  • the method for measuring nitric oxide comprises reacting a compound represented by the general formula (I) with nitric oxide to produce a compound represented by the general formula ( ⁇ ), )) (Where R 11 and R 12 are bonded to each other to form a ring at an adjacent position on the phenyl ring, ie, a compound showing a —N NN—NR 3Q — group). Included.
  • the term “measurement” should be interpreted in the broadest sense, including measurement for various purposes such as detection, quantification, and qualitative analysis.
  • the above reaction can be carried out preferably under neutral conditions, for example, in the range of pH 6.0 to 8.0, preferably in the range of pH 6.5 to 7.8, more preferably in the range of pH 6.8 to pH 7.8. 7.
  • neutral conditions for example, in the range of pH 6.0 to 8.0, preferably in the range of pH 6.5 to 7.8, more preferably in the range of pH 6.8 to pH 7.8. 7.
  • the measurement of nitrogen monoxide using the compounds of the present invention is not limited to the neutral region or the weakly acidic region, and can be performed under strongly acidic conditions such as gastric mucosal cells. is there.
  • the compound represented by the general formula ( ⁇ ) of the present invention has an extremely excellent property that the fluorescence intensity does not change over a wide range of pH, and enables accurate measurement without being affected by pH fluctuation. It is.
  • the fluorescence can be measured according to a conventionally known fluorescence measurement method (for example, Wiersma, JH, Anal. Lett., 3, pp. 123-132, 1970; Sawicki, CR, Anal. Lett., 4). , pp. 761-775, 1971; Damiani, P. and Burini, G., Talanta, 8, pp. 649-652, 1986; Damiani, P. and Burini, G., Talanta, 8, pp. 649-652. , 1986; Misko, TP, Anal. Biochem. 214, pp. 11-16, 1993, etc.).
  • a conventionally known fluorescence measurement method for example, Wiersma, JH, Anal. Lett., 3, pp. 123-132, 1970; Sawicki, CR, Anal. Lett., 4). , pp. 761-775, 1971; Damiani, P. and Burini, G., Talanta, 8, pp. 649-6
  • nitric oxide measurement of the present invention for example, light of about 520 nm is irradiated as excitation light and about 535 nm is irradiated. It is preferred to measure the degree of fluorescence.
  • the compound represented by the general formula (II) of the present invention has an excellent property of giving a sufficient fluorescence intensity even by long-wavelength excitation light, and can reduce damage to organisms, tissues, cells, and the like. It is possible.
  • spectroscopy can be efficiently performed even with a fluorescent filter provided in a general-purpose fluorescent microscope, and high-sensitivity measurement can be performed without using a special filter.
  • the measurement of nitric oxide may be performed in the presence of an oxygen source.
  • an oxygen source for example, oxygen, ozone, or an oxide compound can be used.
  • dissolved oxygen can be used as oxygen.
  • oxygen gas may be introduced into the reaction system, or a reagent for generating oxygen (for example, hydrogen peroxide) may be added.
  • the oxide compound is not particularly limited as long as it is a compound having an oxide bond in which an oxygen atom is easily cleaved, such as N-0, S-0, P-0, and, for example, PTI0 (2-phenyl-4,4,5,5) , 5-Tetramethylimidazoline-1-oxinole-3-oxoxide: Maeda, H., et al., J. Leuk. Biol., 56, pp. 588-592, 1994; Akaike, T., et al. , Biochemistry, 32, pp.
  • PTI0 and its derivatives are particularly preferable compounds and compounds that can be easily obtained by those skilled in the art (Tokyo Kasei Co., Ltd., Organic Chemicals Catalog, 32, 1 "). 4 etc.)
  • the oxoxide compound itself may be used as a reaction reagent, but it is also possible to use the oxoxide compound encapsulated in ribosomes, etc.
  • the amount of oxygen source is not particularly limited, but is small. It is preferable that the amount is at least ⁇ , preferably 10 to 30 ⁇ , more preferably about 10 to 203 ⁇ 41 with respect to the nitric oxide to be measured.
  • the required amount of oxygen source is supplied by the dissolved oxygen. May decrease Ri, the oxygen source amounts which may cause inconvenience to the extremely large light-emitting by fluorescence. Therefore, the amount of monoacid I arsenide nitrogen to be measured pretest or known It is preferable to add an oxygen source in an appropriate concentration range as predicted by the method.
  • the reaction can be performed in a temperature range of 10 to 25 ° C.
  • the method of measuring nitrogen monoxide using a fluorescent probe is described in detail in Tetsuo Nagano et al., Chemistry and Education, 47, pp. 665-669, 1999. With reference to the above, nitric oxide can be measured with high sensitivity using the compound of the present invention.
  • Methyl 5- (benzyloxycarbonyl) -2,4-dimethyl-3-pyrrolepropionate (3.1 g, 9.8 mmol) was dissolved in 100 mL of acetone. To this solution was added 10% Pd-C, and the mixture was stirred at room temperature under hydrogen gas. When the raw materials disappeared, the reaction solution was filtered, and the mother liquor was distilled under reduced pressure. To the residue was added 10 mL of trifluoroacetic acid, and the mixture was heated at 40 ° C for 10 minutes under an argon stream. Chloroform was added to the reaction mixture, and the mixture was washed once with water, and the aqueous layer was extracted twice with chloroform.
  • 6- (4-Amino-3-ditrophenyl) -4,4, _bis- (2-methoxycarbonylyl) -3,3,3,5,5-tetramethylpyrromethene (213 mg, 0.42 t) was dissolved in 20 raL of dichloromethane. Under an argon stream, disopropylethylamine (DIEA, 1 mL, 5.7 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. Further, boron trifluoride-ethyl etherate (1 mL, 7.9 mL) was added, and the mixture was stirred for 40 minutes. Shortly after addition, fluorescence appeared.
  • DIEA disopropylethylamine
  • reaction mixture was washed once with water and twice with a 2NNa0H aqueous solution, and the aqueous layer and the NaOH layer were combined and extracted three times with dichloromethane.
  • the fluorescence characteristics of compound (7) and compound (8) were measured.
  • the quantum yield is F-4500 (Hitachi), Other spectra were measured with LS50B (Perkin Elmer). Less than 0.2% of dimethyl sulfoxide was dissolved in 0.1 M sodium-phosphate buffer (pH 7.4) as a cosolvent, and the measurement was performed at 20 ° C.
  • the quantum yield was calculated based on the assumption that fluorescein in an aqueous solution of 0.1 mM NaOH was 0.85. Table 1 shows the results.
  • NOC13 which is a nitric oxide generating reagent was added, and changes in excitation and fluorescence spectra were measured.
  • Excitation and fluorescence after incubating compound (7) 5 ju M (0.1% DMS0 co-solvent) and N0C 13 in 0.1 M sodium-phosphate buffer ( PH 7.4) for 1 hour at 37 The spectrum was measured. The measurement was performed with a slit width of Ex / Em 2.5 / 2.5 nm, an excitation wavelength of 520 nm, and a fluorescence wavelength of 535 nm. The results are shown in Figure 1. An increase in fluorescence was observed depending on the concentration of N0C13 added.

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Description

明細書 蛍光プローブ 技術分野
本発明は蛍光プローブに関する。 より具体的には一酸化窒素を捕捉して蛍光を 発する蛍光プローブに関する。 背景技 丁
最近、 それ自体はほとんど蛍光性を有しない特定のフルォレセイン誘導体が、 中性条件下で一酸ィヒ窒素と容易に反応して高い蛍光強度を有するトリァゾール化 合物を与え、該トリアゾール誘導体が 495 nm程度の長波長の励起光により 515 nm 程度の強い蛍光を発することができることが報告された （米国特許第 5， 874， 590 号明細書)。このフルォレセィン誘導体を一酸化窒素測定試薬として用いると、汎 用の蛍光顕微鏡に備えられた蛍光フィルターで励起光を容易に分光することがで き、 個々の細胞内の蛍光を測定することにより簡便に細胞内の一酸化窒素濃度を 測定できる。
また、 中性条件下において一酸化窒素と効率よく反応でき、 蛍光強度に優れた トリァゾール誘導体を与えるジァミノローダミン誘導体が提案されている (米国 特許第 6， 201, 134号明細書)。このジァミノローダミン誘導体は上記フルォレセィ ン誘導体に比べて長波長側にシフトしており、 細胞の自家蛍光領域とほとんどォ 一バーラップしないこと、並びに酸性領域においても蛍光の減弱がないことから、 生体組織や細胞に対してダメージを与えず、 細胞の自家蛍光領域よりも長波長の 蛍光領域で一酸化窒素を測定することができる。
一方、 アルカリ金属イオン又はカチオン測定のために有用なイオン取り込み部 を有するインダセン誘導体が知られている（特開平 10 - 338695号公報及び特開平 11- 5796号公報)。 しかしながら、 このインダセン誘導体の蛍光発色団を用いて一 酸化窒素測定を測定する試みについては全く報告がない。 発明の開示
本発明者らは、 一酸化窒素を特異的かつ効率的に捕捉して蛍光を発する蛍光プ ローブを提供すべく鋭意研究を行った結果、 ィンダセン誘導体の蛍光発色団を用 いることにより、 中性条件下において一酸化窒素と効率よく反応でき、 蛍光強度 に優れた蛍光性物質を与える一酸化窒素測定試薬を提供することに成功した （特 願 2002-80230号明細書）。
本発明.者らはさらに研究を進めた結果、 インダセン誘導体の蛍光発色団にカル ポキシ置換アルキル基などの置換基を導入することにより、 さらに水溶性に優れ た一酸化窒素測定用試薬を提供できること、 及ぴ該試薬が一酸化窒素をトラップ して生成する蛍光性トリァゾール誘導体の蛍光強度が pH変動によりほとんど影 響を受けないことを見出した。 本発明はこれらの知見を基にして完成されたもの である。
すなわち、 本発明は、 下記の一般式（I ) ：
Figure imgf000004_0001
(式中、 R1及び R2はそれぞれフエ-ル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を 示し、 該ァミノ基のいずれか 1つは置換基を有していてもよいアルキル基を 1個 有していてもよく ； R3及ぴ R4はそれぞれ独立に水素原子、 （ 6アルキル基、 又は _6アルコキシ基を示し、 R5及び はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい _6アルキル基を示し、 R6及び Rgはそれぞれ独立にカルボキシ置換 _6アルキル基、 アルコキシカルボニル置換 d—6アルキル基、 スルホン酸置換（ 6アルキル基、 又 はアルキルスルホネート置換 アルキル基を示し、 R7及ぴ R1Gはそれぞれ独立に 置換基を有していてもよい < 6アルキル基、 置換基を有していてもよいァリール 基、 置換基を有していてもよい c 6アルコキシカルボ二ル基、 置換基を有してい てもよいビュル基、 置換基を有していてもよいチェニル基、 又は置換基を有して いてもよいピロリル基を示す） で表される化合物又はその塩を提供するものであ る。
この発明の好ましい態様によれば、 R6及び R9が 2-カルボキシ- 1-ェチル基であ り、 R5、 R7、 R 及ぴ R1Dがメチル基である上記化合物又はその塩が提供される。 また、 本発明により、 上記の化合物又はその塩を含む一酸ィ匕窒素測定用試薬が提 供される。
別の観点からは、 本発明により、 下記の一般式 (II) :
Figure imgf000005_0001
[式中、 R11及び R12は互いに結合してフヱ-ル環上の隣接した位置に環を形成す る - N=N-NR3°- (式中、 R3°は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を 示す）で表される基を示す力 \又は R11及ぴ R12はフエニル環上の隣接した位置に置 換するアミノ基 （置換基を有していてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を 有していてもよい） 及ぴニトロ基の組み合わせを示し； R13及び R14はそれぞれ独 立に水素原子、 _6アルキル基、 又は（ 6アルコキシ基を示し、 R15及ぴ R18はそれ ぞれ独立に置換基を有していてもよい ( 6アルキル基を示し、 R16及び R19はそれぞ れ独立にカルボキシ置換 _6アルキル基、 アルコキシカルボニル置換（ 6アルキ ル基、 スルホン酸置換 CMアルキル基、 又はアルキルスルホネート置換 CMアル キル基を示し、 R17及び R2°はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい（ 6アルキ ル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 置換基を有していてもよい（ 6ァ ルコキシカルボニル基、 置換基を有していてもよいビニル基、 置換基を有してい てもよいチェニル基、 又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す] で表さ れる化合物又はその塩が提供される。 この発明の好ましい態様によれば、 R16及ぴ R19が 2-カルボキシ -1-ェチル基であり、 R15、 R17、 R18、 及ぴ R2Qがメチル基である 上記化合物又はその塩が提供される。
さらに別の観点からは、一酸化窒素の測定方法であって、 （a)上記の一般式（ I ) で示される化合物を一酸化窒素と反応させる工程；及び、 （b)上記工程 (a)におい て生成する一般式 (II)の化合物 [ただし、 R11及ぴ R12は互いに結合してフエニル 環上の隣接した位置に環を形成する - N=N- NR3°- (式中、 R3flは水素原子又は置換基 を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示す]を検出する工程を含 む方法が本発明により提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は、 化合物（7)に N0C 13を添加して励起及び蛍光スぺクトルの変化を測定 した結果を示した図である。 図中、 （A)は励起スペク トル （Em: 535 nm)、 （B)は蛍 光スぺクトル (Ex : 520 nm)を示す。 蛍光強度の高い曲線から順に N0C 13濃度が 5. 0 μ Μ、 2· 0 μ Μ、 1. 0 μ Μ, 0. 5 μ Μ、 及び 0 μ Μの場合の結果を示す。
第 2図は、化合物（7)に N0C 13を添加して反応生成物を HPLCで測定した結果を示 した図である。
第 3図は、種々の Ηにおける化合物（7)及び (8)の蛍光強度を測定した結果を示し た図である。
第 4図は、化合物（ 9 )のクロ口ホルム溶液に NOのクロ口ホルム溶液を添加した時 の蛍光強度の変化を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
本明細書において、 特に言及しない場合にはアルキル基は直鎖状、 分枝鎖状、 環状、 又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。 アルキル部分を有する他の置 換基 （アルコキシ基） のアルキル部分についても同様である。 また、 ある官能基 について 「置換基を有していてもよい」 と言う場合には、 置換基の種類、 個数、 置換位置は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子のいずれでもよい）、 水酸基、 アミノ基、 力ルポキシル基、 スルホン酸基、 アルキルスルホネート基などを置換基として有していてもよレ、。 また、 本明細書においてァリール基という場合には、 単環性又は多環性のァリー ル基のいずれであってもよいが、 好ましくはフエ二ル基を用いることができる。 ァリール環についても同様である。
一般式（ I )において、 R3及び/又は が（ 6アルキル基又は（ 6アルコキシ基 を示す場合には、それらの基はベンゼン環上の 2-位及び 6 -位に結合することが好 ましい。 これらの基が存在すると量子収率や反応速度が向上し検出感度を高める ことができる場合がある。 R3及ぴ R4が示すアルキル基としてはメチル基が好まし く、 アルコキシ基としてはメ トキシ基が好ましい。 R3及び R4がともに水素原子で あることも好ましい。 一般式（II)における R13及び R14についても同様である。
R6及ぴ R9が示すカルボキシ置換 ( 6アルキル基はモノカルボキシ置換 _6アル キル基であることが好ましい。 カルボキシ置換（ 6アルキル基の アルキル部 分の炭素数は 1ないし 4であることが好ましく、 さらに好ましくは 2又は 3であ り、 特に好ましいのは炭素数 2である。 R6及ぴ R9が 2 -力ルポキシ- 1-ェチル基で あることが最も好ましい。 R6及び R9が示すアルコキシカルボニル置換（ 6ァルキ ル基としては、 上記のカルボキシ置換（ 6アルキル基の（ 6アルキルエステルを 例示することができる。 好ましくはエトキシカルボニル置換 — 6アルキル基など である。 R6及び が示すスルホン酸置換 C 6アルキル基としては、 モノスルホン 酸置換 _6アルキル基が好ましい。 R6及び R9が示すアルキルスルホネート置換 ( 6 アルキル基としては、モノアルキルスルホネート置換 ( 6アルキル基が好ましレ、。 アルキルスルホネート置換 アルキル基におけるアルキルスルホネート基とし ては C 6アルキルスルホネート（(^6アルキル- 0- S02- )が好ましい。 R6及び R9がモ ノカルボキシ置換 CMアルキル基である場合、 特に R6及ぴ が 2-力ルポキシ- 1 - ェチル基である場合には、 化合物の水溶性が著しく高まり、 かつ一酸化窒素との 反応により生じる一般式 (II)で表される化合物の蛍光強度が PH変動により影響 を受けないという優れた効果が得られる。 R7及ぴ R1Qが示すァリール基としてはフエニル基が好ましい。フエニル基が置換 基を有する場合、 該置換基としてはスルホン酸基又はスルホネート基などが好ま しく、 特に好ましいのはスルホン酸基である。 R7及び R1Dが示す ( 6アルコキシ力 ルポニル基としてはエトキシカルボニル基が好ましレ、。 R7及び R1Qが示すビュル基 に存在する置換基としてはフエニル基、 モノアミノフエ二ル基、 又はジァミノフ ェニル基 （例えば 3， 4 -ジアミノフヱニル基） などを挙げることができる。 R7及び R1Qが示すチェ-ノレ基又はピロリル基としては、 それぞれ 2-チェニル基又は 2 -ピ 口リル基が好ましい。 R7及び R1Qがアルキル基以外の基である場合には、化合物の 蛍光波長が長波長側にシフトする場合がある。
一般式（I)において、 R6及び R9が 2-カルボキシ- 1 -ェチル基であることがより好 ましい。 また、 一般式 (I)において、 R5、 R7、 R\ 及ぴ °が置換基を有していても よい _6アルキル基であることが好ましく、 例えば、 R5、 R 及ぴ R1Qがいず れもメチル基である化合物は本発明の好適な態様である。一般式 (II)における R15、 R16、 R17、 R18、 R19、 及び R2°についても上記の R5、 R6、 R7、 R8、 R9、 及び RMと同様で あ
上記一般式（I ) において、 R1及び R2はそれぞれフエニル環上の隣接した位置 に置換するァミノ基を示す。 R1及ぴ R2が共に無置換のァミノ基であってもよいが、 R1及ぴ のうちのいずれかは 1個のアルキル基で置換されていてもよく、 該アル キル基は 1個又は 2個以上の置換基を有していてもよい。 アミノ基上に置換する アルキル基としては、 例えば、 直鎖又は分枝鎖の _18 アルキル基 （好ましくは ( 6アルキル基） を挙げることができ、 具体的には、 例えば、 メチル基、 ェチル 基、 n-プロピル基、 イソプロピル基、 n-ブチル基、 sec-ブチル基、 tert- ブチル 基などを用いることができる。 アルキル基が置換基を有する場合の例としては、 例えば、 置換若しくは無置換のァリール基が置換した（^6アルキル基 （ァラルキ ル基） などを挙げることができる。 ァリール置換アルキル基としては、 例えば、 ベンジル基、 フエネチル基、 ノ ラメ トキシベンジル基、 ノヽ。ラエトキシカルポニル ベンジル基、 パラカルボキシべンジル基などを用いることができる。
上記の一般式（II)において、 R11及び R12は互いに結合してフエニル環上の隣接 した位置に環を形成する- N=N- NR3fl -基を示す。 ここで、 R3eは水素原子又は置換基 を有していてもよいアルキル基を示す。 該アルキル基としては、 直鎖又は分枝鎖 の CW8アルキル基 （好ましくは（ 6アルキル基） を挙げることができ、 該アルキ ル基が置換基を有する場合の例として、 例えば、 置換若しくは無置換のァラルキ ル基を挙げることができる。 該ァラルキル基としては、 例えば、 ベンジル基、 フ エネチル基、 パラメ トキシベンジル基、 パラエトキシカルポニルベンジル基、 ノ ラ力ルポキシべンジル基などを用いることができる。
また、 R11及び R12はフエニル環上の隣接した位置に置換するァミノ基 （1個の 置換基を有していてもよい） 及びニトロ基の組み合わせを示すが、 R11及ぴ R12の いずれか一方はアミノ基を示し、 他方はニトロ基を示す。 R11及び R12のいずれか —方が示すアミノ基は無置換であってもよいが、 アルキル基、 例えば — 18アルキ ル基、 好ましくは CMアルキル基を 1個有していてもよい。 該アルキル基は置換 基を有していてもよく、 例えば、 置換若しくは無置換のァラルキル基などがアミ ノ基に置換していてもよい。 また、 該ァミノ基はァミノ基の保護基、 例えば、 ァ セチル基、 トリフルォロアセチル基、 ベンゾィル基などのァシル基； トリメチル シリル基などのアルキルシリル基などを有していてもよい。 ベンジル基などのァ ラルキル基を保護基として利用してもよい。
上記一般式（ I )又は一般式 (II)で表される本発明の化合物は塩を形成する場合 もある。 塩の種類は特に限定されず、 酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであって もよい。 酸付加塩としては、 例えば、 塩酸塩、 硫酸塩、 硝酸塩などの鉱酸塩、 又 はメタンスルホン酸塩、 クェン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩、 シユウ酸塩など の有機酸塩を挙げることができる。 また、 塩基付加塩としては、 ナトリウム塩、 力リゥム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモェゥム塩、又はメチルァミン塩、 トリェチルァミン塩などの有機アミン塩を挙げることができる。 さらに、 グリシ ンなどのアミノ酸の塩を形成する場合もある。 もっとも、 本発明の化合物の塩は これらの具体例に限定されることはない。
上記一般式（ I )又は一般式 (Π)で表される本発明の化合物は 1個または 2個以 上の不斉炭素を有している場合がある。 従って、 1個または 2個以上の不斉炭素 に基づく光学的に純粋な形態の任意の光学異性体、 光学異性体の任意の混合物、 ラセミ体、 純粋な形態のジァステレオ異性体、 ジァステレオ異性体の混合物など はいずれも本発明の範囲に包含される。 また、 本発明の化合物は水和物や溶媒和 物として存在する場合もあるが、 これらの物質も本発明の範囲に包含されること はいうまでもない。
上記の一般式（ I )で表される化合物及び一般式 (Π)で表される化合物（ただし、 R11及ぴ R12がフエ-ル環上の隣接した位置に置換するァミノ基及ぴニト口基の組 み合わせを示す化合物）のうち、代表的化合物として R3及び R4が水素原子であり、 R6及ぴ R9が 2-カルボキシ -1-ェチル基であり、 R5、 R7、 R 及ぴ Rlflがいずれもメ チル基である化合物、 並びに R13及び R14が水素原子であり、 R16及び R19が 2-カル ボキシ - 1-ェチル基であり、 R15、 R17、 R18、 及び R2°がいずれもメチル基である化合 物の製造例が本明細書の実施例に具体的に示されている。 従って、 上記の一般式 (II)で表される化合物が一般式（ I )で表される化合物の製造中間体として有用で あることが理解されよう。 また、 一般式 (II)で示される化合物のうち、 R11及び R12が互いに結合してフエニル環上の隣接した位置に環を形成する - N=N - NR3fl-基を 示す化合物については、 上記一般式（ I )で表される化合物と一酸化窒素とを反応 させることにより製造可能である。 この化合物は、 後述のように強い蛍光性を有 しており、 一酸化窒素の測定に有用である。 .
本明細書の実施例の具体的説明を参照することにより、 一般式（ I )及び一般式 (II)に包含される化合物を容易に製造できることが当業者には理解されよう。 ま た、 インダセン骨格については、 例えば、 特開平 10-338695 号公報及ぴ特開平 11- 5796号公報のほ力、、 New J. Chem. , 25， pp. 289- 292， 2001； Tetrahedron Letters, 42, pp. 6711 - 6713， 2001； Angew. Chem. Int. Ed. , 40， pp. 385-387, 2001；及び 特願 2002-80230号明細書などに合成方法が示されているので、これらの刊行物を 参照することにより当業者は本発明の化合物をさらに容易に製造可能である。 本発明の一般式（ I )で表される化合物は、 中性条件下において一酸化窒素と効 率的に反応して、 収率よく一般式 (II)の化合物 （ただし、 R11及び R12は互いに結 合してフエニル環上の隣接した位置に環を形成する -N=N- NR3°-基を示す化合物） を生成する性質を有している。 一般式（I )で表される化合物自体は、 中性条件下 において 485 nm程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上 記一般式 (II)の化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光を発する性質を有し ている。 従って、 一般式（I )で表される化合物を生体組織中や細胞内に取り込ま せて一酸化窒素と反応させ、 蛍光性の上記一般式 (II)の化合物を生成させてこの 化合物の蛍光を測定することにより、 生体,袓織中や細胞内の一酸化窒素を測定す ることができる。 特に、 本努明の一般式（I )の化合物は一酸ィヒ窒素との反応性に 優れており、 高感度かつ正確に一酸ィ匕窒素の測定を行なえるという優れた特徴を 有している。
従って、 本発明により提供される一酸化窒素の測定方法は、 一般式（I )で表さ れる化合物と一酸化窒素とを反応させて一般式 (Π)の化合物を生成させ、 一般式 (Π)の化合物 （ただし、 R11及ぴ R12は互いに結合してフエニル環上の隣接した位 置に環を形成する- N=N-NR3Q-基を示す化合物） の蛍光を測定する工程を含んでい る。 本明細書において 「測定」 という用語は、 検出、 定量、 定性など種々の目的 の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。 上記反応は好ましくは中性条 件下に行うことができ、 例えば、 pH 6. 0〜8. 0の範囲、 好ましくは pH 6. 5〜7. 8の 範囲、 より好ましくは pH 6. 8〜7. 6の範囲で行うことができる。 もっとも、 本発 明の化合物を用いた一酸ィヒ窒素の測定は中性領域ないし弱酸性領域に限定される ことはなく、 例えば、 胃の粘膜細胞など強酸性の条件においても測定が可能であ る。特に、本発明の一般式 (Π)で表される化合物は広範囲な pHにおいて蛍光強度 が変化しないという極めて優れた性質を有しており、 pH変動の影響を受けずに正 確な測定が可能である。
蛍光の測定は、 従来公知の蛍光測定方法に準じて行うことができる （例えば、 Wiersma, J. H. , Anal. Lett. , 3, pp. 123 - 132， 1970； Sawicki, C. R. , Anal. Lett. , 4, pp. 761-775, 1971； Damiani, P. and Burini, G. , Talanta, 8, pp. 649-652, 1986； Damiani, P. and Burini, G.， Talanta, 8， pp. 649-652, 1986； Misko, T. P.， Anal. Biochem. 214, pp. 11- 16， 1993 などの刊行物を参照）。 本発明の一酸化窒 素測定においては、 例えば、 励起光として 520 nm程度の光を照射し、 535 nm程 度の蛍光を測定することが好ましい。 本発明の一般式 (II)で表される化合物は、 長波長の励起光によっても充分な蛍光強度を与えるという優れた性質があり、 生 体や組織、 細胞などへの障害を軽減することが可能である。 また、 このような波 長の光を用いると、 汎用の蛍光顕微鏡に備えられた蛍光フィルターでも効率的に 分光することができ、 特殊なフィルターを用いずに高感度な測定が可能になる。 特に高感度な測定が必要な場合には、 上記の一酸化窒素の測定を酸素源の存在 下に行ってもよい。 酸素源としては、 例えば、 酸素、 オゾン、 又はォキシド化合 物などを用いることが可能である。 酸素としては、 一般的には溶存酸素を用いる ことができるが、 必要に応じて、 反応系内に酸素ガスを導入するか、 酸素発生用 試薬（例えば、過酸化水素など）を添加してもよレ、。ォキシド化合物としては N - 0， S - 0, P-0など容易に酸素原子が開裂されるォキシド結合を有する化合物であれば 特に限定されないが、 例えば、 PTI0 (2- フヱニル- 4, 4, 5, 5-テトラメチルイミダ ゾリン— 1— ォキシノレ— 3— ォキシド： Maeda, H. , et al. , J. Leuk. Biol.， 56, pp. 588-592, 1994； Akaike, T. , et al. , Biochemistry, 32, pp. 827-832, 1993) またはその誘導体 (PTIOのフエニル基の P-位にカルボキシル基が導入されたカル ポキシ PTI0など）、 トリフエ-ルホスフィンオキサイド、 トリェチルアミンォキ サイドなどを用いることができる。
上記のォキシド化合物のうち、 PTI0及びその誘導体 （例えばカルポキシ PTI0 など）は特に好ましい化合物であり、当業者に容易に入手可能な化合物である（東 京化成株式会社、 Organic Chemicals Catalog, 32, 1"4などに記載されている）。 なお、 ォキシド化合物はそれ自体を反応試薬として用いてもよいが、 リボソーム 等に封入したものを用いることもできる。 酸素源の量は特に限定されないが、 少 なくとも測定すべき一酸化窒素に対して Ι μ Μ以上、 好ましくは 10〜30 μ Μ、 よ り好ましくは 10〜20 ¾1程度の量であることが好ましい。 生体試料などの測定で は、 試料中に 10〜20 /ί Μ程度の量を添加することが好ましいが、 一般的には、 溶 存酸素により必要量の酸素源が供給される。 酸素源の量が極端に少ないと測定感 度が低下する場合があり、 酸素源の量が極端に多いと蛍光による発光に不都合を 生じる場合がある。 従って、 測定すべき一酸ィヒ窒素の量を予試験若しくは公知の 方法で予測して適宜の濃度範囲の酸素源を添加することが好ましい。反応は 10〜 25°Cの温度範囲で行うことが可能である。 なお、 蛍光プローブを用いた一酸化窒 素の測定方法に関しては長野哲雄ら、 化学と教育、 47、 pp. 665-669, 1999などに 詳細に記載されているので、 当業者は上記刊行物を参照しつつ、 本発明の化合物 を用いて高感度に一酸化窒素を測定することができる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。
例 1
(1) 4-ァセトアミ ド- 3 -二トロべンズアルデヒ ド
氷冷下、 濃硫酸 6 mLに発煙硝酸 1 mLを 3回に分けて加えて混酸を調製し、 4 -ァ セトアミドゼンズアルデヒド（1. 91 g， 11. 7讓 ol)を少量ずつ加えた。 添加後、 直 ちに反応液を氷に注ぎ、 固形物を濾取した。 冷水でよく洗浄して乾燥し、 シリカ ゲルカラムクロマトグラフィー (展開溶媒; CH2C12)で精製した後、 水から再結晶 して目的化合物を淡黄色の針状固体として得た（1. 57 g， y. 64%)。
¾-NMR (300 MHz, CDC13)
2. 36 (3H, s) , 8. 16 (1H, dd, J = 8. 79, 1. 65 Hz) , 8. 74 (1H， d, J = 1. 65 Hz) , 9. 04 (1H, d, J = 8. 79 Hz) , 9. 99 (1H， s) , 10. 63 (1H, s)
MS (El) 208 (M+)
m. p. 156°C
(2) 4-ァミノ- 3-二ト口べンズアルデヒド
4 -ァセトアミド- 3 -二ト口べンズアルデヒド（2. 08 g, 10 mmol)をメタノール 200 mLに溶解した。 その溶液に 2N HC1水溶液 50 mLを加え、 アルゴン気流下で 80 °C で 8時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮してメタノールを除き、残渣を 2N NaOH 水溶液で塩基性にしてジクロルメタンで 5 回抽出した。 有機相を合わせて無水 N¾S04で乾燥して減圧濃縮し、目的化合物を黄色固体として得た （1. 62 g， y. 98%)。 ¾-NMR (300 MHz, CDC13) 6. 91 (1H， d, J = 8. 58 Hz) , 7. 92 (1H, dd， J = 8. 58, 2. 01 Hz) , 8. 63 (1H， d, J = 2. 01 Hz) , 9. 82 (1H， s)
MS (El) 166 (^)
(3) 3- (2 -メ トキシカルポニルェチル) - 2， 4-ジメチルビロール
メチル 5 -（ベンジルォキシカルボニル） - 2， 4 -ジメチル -3-ピロールプロピオネー ト（3. 1 g, 9. 8 mmol)をアセトン 100 mLに溶解した。 この溶液に 10% Pd- Cを加え て水素ガス下で室温にて攪拌した。 原料が消失したところで反応液をろ過し、 母 液を減圧蒸留した。 残渣にトリフルォロ酢酸 10 mL を加え、 アルゴン気流下で 40 °Cにて 10分間加熱した。反応混合物にクロロホルムを加えて水で 1回洗浄し、 水層をクロ口ホルムで 2回抽出した。 有機相を合わせて Na2C03水溶液で 1回、 水 で 1回洗浄し、 無水 Na2S04で乾燥して減圧濃縮した。 残渣をシリカゲル力ラムク 口マトグラフィー （展開溶媒； CH2C12)で精製して目的化合物を褐色液体として得 た（1. 6 g， y. 90%)。
¾-NMR (300 MHz, CDC13)
2. 03 (3H, d, J = 0. 90 Hz) , 2. 18 (3H， s)， 2. 45 (2H， ra) , 2. 72 (2H, m) , 3. 67 (3H, s) , 6. 38 (1H, d, J = 0. 90 Hz) , 7. 53 (1H, s)
MS (El) 181 (M+)
(4) 6- (4 -ァミノ- 3-ニトロフエニル） - 4, 4，-ビス-（2 -メ トキシカルボ二ルェチ ル） - 3， 3，，5， 5' -テトラメチノレビロメテン
4-ァミノ- 3-ニトロべンズアルデヒド（760 mg, 4. 58 mmol)と 3- (2-メ トキシカル ポニルェチル）-2， 4-ジメチルピロール（1. 6 g, 9. 16 mmol)を 250 mLのジクロルメ タンに溶解した。 アルゴン気流下でこの溶液に数滴のトリフルォロ酢酸を加え、 室温で一晩遮光して攪拌した。 薄層クロマトグラフィー （展開溶媒； ジクロルメ タン， シリカゲル）で原料消失を確認してジクロロジシァノパラべンゾキノン (DDQ, 1. 07 g, 4. 58 mmol)のジクロルメタン溶液 120 mLを加えた。 反応混合物を 15分攪拌した後に水で 1回洗い、 無水 MgS04で乾燥して減圧濃縮した。 残渣をァ ルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒； メタノール/ジクロルメタン = 1 I 20)で精製して目的化合物を得た （y. 76%)。 - NMR (300 MHz, CDC13)
1.37 (6H， s)， 2.33 (6H, s), 2.36 (4H, dd, J = 8.43, 7.14 Hz), 2.63 (4H， dd， 】= 8.43， 7.14 Hz), 3.65 (6H， s)， 6.32 (2H, s), 6.92 (1H, d, J = 8.61 Hz)， 7.26 (1H, dd, J 8.61， 2.01 Hz), 8.06 (1H， d, J = 2.01 Hz)
MS (El) 508 (M+)
(5) 8- (4-ァミノ- 3-ニトロフエニル） - 4， 4 -ジフルォロ- 2，6-ビス -（2 -メ トキシカ ルボニルェチル)- 1， 3, 5, 7-テトラメチル- 4-ボラ- 3a， 4a-ジァザ- s-ィンダセン
6 - (4-ァミノ -3-二トロフエ二ル）- 4， 4， _ビス-（2 -メ トキシカルボ二ルェチ ル)- 3， 3， ， 5, 5，-テトラメチルピロメテン（213 mg, 0.42腿 ol)を 20 raLのジクロル メタンに溶解した。 アルゴン気流下でジィソプロピルェチルァミン（DIEA, 1 mL, 5.7 mmol)を加え、室温で 10分間攪拌した。 さらにボロントリフルオラィド ·ジ ェチルエーテラート （1 mL， 7.9讓 ol)を加えて 40分間攪拌した。 添加して少し すると蛍光が出現した。 反応終了後、 反応混合物を水で 1回、 2NNa0H水溶液で 2 回洗浄し、水層と NaOH層を合わせてジクロルメタンで 3回抽出した。有機相を合 わせて無水 N S04で乾燥して減圧濃縮し、 残渣をアルミナカラムクロマトグラフ ィ一 （展開溶媒； メタノール /ジクロルメタン = 1 / 20)で精製して目的化合物を 橙色固体として得た （72 mg, y. 31%)。
¾-NMR (300 MHz, CDC13)
1.46 (6H, s)， 2.37 (4H, dd, J = 8.25, 7.32 Hz), 2.54 (6H， s), 2.65 (4H， dd, J = 8.25, 7.32 Hz) , 3.66 (6H, s), 6.32 (2H, s)， 6.99 (1H， d, J = 8.40 Hz)， 7.24 (1H, dd, J = 8.40, 1.83 Hz), 8.06 (1H, d, J = 1.83 Hz)
MS (El) 556 (M+)
(6) 8- (4 -ァミノ- 3-二ト口フエニル） - 2, 6-ビス-（2-カルポキシェチル）-4， 4-ジ フルォロ- 1, 3, 5, 7-テトラメチル- 4-ボラ- 3a， 4a -ジァザ- s -ィンダセン
8_ (4 -ァミノ- 3 -二トロフエ二ル）- 4， 4-ジフルォロ- 2, 6 -ビス-（2-メ トキシカルポ 二ルェチル）- 1， 3， 5, 7-テトラメチル- 4-ポラ- 3a, 4a-ジァザ- s-ィンダセン（182.5 mg, 0.33 mmol)をメタノール 100 mLに溶解し、 この溶液に 0.2N NaOH水溶液 10 mL を加えて 80でで 1時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮してメタノールを除き、 2Nの HCl水溶液で酸性にして酢酸ェチルで 3回抽出した。有機相を合わせて無水 Na2S04で乾燥して減圧濃縮し、 残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー （展 開溶媒；メタノール/ジクロルメタン =1/10)で精製して目的化合物を得た (87.1 mg, y. 50%) o
-雇 R (300 MHz, CD30D)
1.44 (6H, s)， 2.26 (4H, dd, J = 7.86, 7.32 Hz), 2. 0 (6H, s), 2.57 (4H， dd, J = 7.86, 7.32 Hz)， 7.07 (1H， d, J = 8.61 Hz)， 7.17 (1H, dd, J = 8.61, 2.01 Hz), 7.88 (1H， d， J = 2.01 Hz)
MS (FAB) 528 (M+)
(7) 8- (3,4 ジァミノフエニル) - 2， 6-ビス -（2 -カルボキシェチル) - 4， 4-ジフルォ 口 - 1， 3, 5, 7-テトラメチル- 4 -ポラ- 3a, 4a-ジァザ - s -ィンダセン rDAMBO - PH)
8- (4-ァミノ- 3-二ト口フエ二ル）- 2, 6-ビス-（2-力ルポキシェチル） -4， 4-ジフルォ ロ- 1， 3, 5， 7-テトラメチル- 4 -ポラ- 3a, 4a -ジァザ - s -ィンダセン （87.1 mg, 0.16 mmol)をメタノール 100 mLに溶解し、 この溶液に 10% Pd-Cを加えて水素ガス下 で室温にて攪拌した。 原料消失を確認した後、 反応混合物をろ過して母液を減圧 蒸留し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （展開溶媒； ¾0/ァセトニ トリル =1 0)で精製して目的化合物を茶褐色固体として得た（31.5mg， y. 38%) 0 ¾-NMR (300 MHz, CD30D)
1.51 (6H, s)， 2.28 (4H, dd, J = 8.40, 7.14 Hz)， 2.47 (6H， s), 2.64 (4H, dd, J = 8.40, 7.14 Hz), 6.46 (1H, dd, J = 7.86, 2.01 Hz)， 6.59 (1H, d， J = 2.01 Hz), 6.83 (1H, d, J = 7.86 Hz)
MS (FAB) 498 (M+)
(8) 8-(5-ベンゾトリアゾリル） -2， 6-ビス-（2 -カルボキシェチル） -4, 4-ジフルォ ロ- 1， 3， 5, 7-テトラメチル- 4-ポラ- 3a， 4a -ジァザ - ィンダセン H)AMB0-PH - T) p-DAMBO-P" (17.4 mg, 0.035 mmol)に INの HCl水溶液を 20 mL加え、 この溶液を 氷冷下で攪拌しながら NaN02 (2.5 mg, 0.036讓 ol)の水溶液を少量ずつ加えた。 添加終了後に反応液を室温に戻し、 15分間攪拌した。 溶液を酢酸ェチルで 3回抽 出し、 有機相を合わせて無水 N S04で乾燥して減圧濃縮し、 残渣をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー （展開溶媒； ¾0 /ァセトニトリル = 1 / 10)で精製して 目的化合物を赤褐色固体として得た（14.6 mg， y. 82%)。
¾-NMR (300 MHz, CD30D)
1.24 (6H， s)， 2.30 (4H, dd, J = 8.25, 7.14 Hz) , 2.51 (6H, s), 2.63 (4H, dd， J = 8.25, 7.14 Hz), 7. 3 (1H， d, J = 8.43 Hz)， 7.89 (1H, s)， 8.08 (1H， d， J = 8.43 Hz)
MS (FAB) 509 (M+)
(9) 8 -（3， 4 -ジァミノフエニル） - 4， 4 -ジフルォロ- 2, 6-ビス -（2-メ トキシカルボ二 ルェチル）- 1,3， 5, 7 -テ トラメチル- 4 -ボラ- 3a， 4a -ジァザ - S-ィンダセン ( DAMBO- PMe)
8- (4-ァミノ- 3-二トロフヱニル） - 4， 4-ジフルォロ- 2， 6 -ビス -（2 -メ トキシカルボ ニルェチル) - 1， 3, 5， 7-テトラメチル -4-ポラ- 3a， 4a -ジァザ- s-ィンダセン（131 mg, 0.24 mmol)を 50 mLのジクロルメタンに溶解し，さらにメタノール 100 mlを加え た。 この溶液に 10% Pd-Cを加えて水素ガス下で室温にてー晚攪拌した。 アルミナ TLC (展開溶媒； ジクロルメタン）で原料消失を確認した後、 反応混合物をろ過し て母液を減圧濃縮し、 残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー （展開溶媒； ジ クロルメタン）で精製した（85 mg， y. 68%)。 へキサン/クロ口ホルムより再結晶を 打った。
¾-NMR (300 MHz, CDC13)
1.44 (6H， s)， 2.35 (4H, dd, J = 8.61, 7.32 Hz), 2.53 (6H, s), 2.64 (4H, dd, J = 8.61， 7.32 Hz), 3.46 (2H， s)， 3.54 (2H, s)， 3.66 (6H， s)， 6.55 (1H, d， J = 6.39 Hz), 6.56 (s, 1H)， 6.79 (1H， d， J = 6.39 Hz)
MS (ESI) 549 ([M+Na]+)
例 2 ：試験例
(a)蛍光スぺクトル
化合物 (7)及び化合物 (8)の蛍光特性を測定した。 量子収率は F- 4500 (日立)、 そ れ以外のスぺクトルは LS50B (Perkin Elmer)で測定した。 0. 2%未満のジメチルス ルホキシドを共溶媒として 0. 1 Mナトリウム-リン酸バッファー （pH 7. 4)に溶解 して 20°Cで測定した。量子収率は 0· lM NaOH水溶液中でのフルォレセィンを 0. 85 として算出した。 結果を表 1に示す。 対照として一般式 (I)において R6及び R9が 水素原子である化合物 (P- DAMB0)及ぴ一般式（Π)において R16及ぴ R19が水素原子 である化合物 (P- DAMB0 - T)について同様に量子収率の測定を行ったところ、それぞ れ 0. 001及ぴ 0. 40であり、本発明の化合物では大きな量子収率が得られることが 分かった。 また、本発明の化合物ではストークスシフトが 16nmであり、対照とし て用いた p- DAMB0及ぴ p- DAMB0- Tよりも大きく、 フノレォレセインとほぼ同程度の 大きなストークスシフトが得られた （p - DAMB0及ぴ p- DAMB0 - Tのストークスシフ トはともに 9nmである）。
Figure imgf000018_0001
(b)—酸化窒素との反応
化合物 (7)に一酸化窒素発生試薬である N0C 13を添加して励起及び蛍光スぺクト ルの変化を測定した。 0. 1 Mナトリウム-リン酸バッファー （PH 7. 4)中で化合物 (7) 5 ju M (0. 1% DMS0共溶媒）と N0C 13を 37 で 1時間ィンキュベートしてか ら励起及び蛍光スぺク トルを測定した。 測定はスリット幅を Ex/Em = 2. 5/2. 5 nm とし、励起波長を 520 nm、 蛍光波長を 535 nmとして行った。 結果を図 1に示す。 N0C 13の添加濃度に依存して蛍光の増加が認められた。 また、 0. 1 Mナトリウム -リン酸パッファー (pH 7. 4)中で化合物 (7) 5 μ Μ (0. 1% DMS0共溶媒）と N0C 13 (20 μ Μ)を 37でで 1時間ィンキュベートしてから、 反応物を HPLCで分析した結果を 図 2に示す。 HPLC条件は力ラム： Inertsil 0DS-3 4. 6 X 250 mm、溶出液： 0. 1% Η3Ρ0Λ 水溶液/ァセトニトリル =55/45 (v/v)、検出： UV-vis (520nm) /蛍光（520/535nm)、流 速： lmL/min、 試料容量： 5 μ ίとした。 化合物（7)と一酸化窒素との反応が極めて 速やかに起こることが確認できた。
(c)蛍光強度の ρΗによる変動
化合物（7)及び (8)を種々の ΡΗ に調整した 0. 1 Μナトリウム-リン酸バッファー (0. 1% DMS0共溶媒）に溶解して、 上記 (b)と同様にして蛍光を測定した。 結果を図 3に示す。 化合物（8)は pH 3から 13に至る極めて広範囲な pHにおいて蛍光強度 がほとんど変化していないことが確認できた。 従って、 本発明の化合物を用いた —酸化窒素の測定では、 PH変動を伴う生体試料においても極めて精度の高い測定 が可能である。
( d )化合物 （9 ) ( DAMB0-PMe)の 有機溶媒中における NOとの反応による蛍光 の変化を測定した。 1 μ M DAMB0-PMeクロ口ホルム溶液に、 NOのクロ口ホルム溶液 (クロロホルムにアルゴンガスを 10分バブル後、 NOガスを 3分バブルして作成 した)を 1分に 5 μ Ι添カロして、 10分測定した。スリット幅は、 Ex/Em = 5. 0/0 nm、 励起波長 520 nm、 蛍光波長 535 nmで測定した。 結果を図 4に示す。 DAMBO- PMe を用いることにより、有機溶媒中での NOの測定が可能であることが図 4に示され ている。 これより、 本発明の化合物は細胞膜透過性を有し、 生体膜などの脂溶性 環境でも N0を効率よく検出することが可能であることが分かる。

Claims

1 . 下記の一般式（I ) ：
一一
Figure imgf000020_0001
の
(式中、 R1及び R2はそれぞれフエニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を 示し、 該ァミノ基のいずれか 1つは置換基を有し囲ていてもよいアルキル基を 1個 有していてもよく ； R3及び R4はそれぞれ独立に水素原子、 _6アルキル基、 又は CMアルコキシ基を示し、 R5及び R8はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい アルキル基を示し、 R6及び R9はそれぞれ独立にカルボキシ置換 ( 6アルキル基、 アルコキシカルボニル置換 d_6アルキル基、 スルホン酸置換 _6アルキル基、 又 はアルキルスルホネート置換 _6アルキル基を示し、 R7及び R1Qはそれぞれ独立に 置換基を有していてもよい（ 6アルキル基、 置換基を有していてもよいァリール 基、 置換基を有していてもよい C 6アルコキシカルポニル基、 置換基を有してい てもよいビュル基、 置換基を有していてもよいチェニル基、 又は置換基を有して いてもよいピロリル基を示す） で表される化合物又はその塩。
2 . R6及び R9が 2-力ルポキシ-卜ェチル基であり、 R5、 R7、 R 及ぴ R1Qがメチ ル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその塩。
3 . R6及ぴ R9が 2-メトキシカルポニル- 1-ェチル基であり、 R5、 R7、 R8、及ぴ R1D がメチル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物又はその塩。
4. 請求の範囲第 1項から第 3項のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を 含む一酸化窒素測定用試薬。
5 . 下記の一般式 (II) :
Figure imgf000021_0001
[式中、 R11及び R12は互いに結合してフヱニル環上の隣接した位置に環を形成す る - N=N- NR - (式中、 R3Qは水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を 示す）で表される基を示すか、又は R11及ぴ R12はフヱニル環上の隣接した位置に置 換するアミノ基 （置換基を有していてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を 有していてもよい） 及びニトロ基の組み合わせを示し； R13及ぴ R14はそれぞれ独 立に水素原子、 _6アルキル基、 又は _6アルコキシ基を示し、 R15及ぴ R18はそれ ぞれ独立に置換基を有していてもよい ( 6アルキル基を示し、 R18及ぴ R19はそれぞ れ独立にカルポキシ置換 _6アルキル基、 アルコキシカルボニル置換（ 6アルキ ル基、 スルホン酸置換 _6アルキル基、 又はアルキルスルホネート置換 CMアル キル基を示し、 R17及ぴ R2Qはそれぞれ独立に置換基を有していてもよい アルキ ル基、 置換基を有していてもよいァリール基、 置換基を有していてもよい _6ァ ルコキシカルボニル基、 置換基を有していてもよいビニル基、 置換基を有してい て よいチェニル基、 又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す] で表さ れる化合物又はその塩。
6 . R16及び R19が 2-カルボキシ- 1-ェチル基であり、 R15、 R17、 R18、 及ぴ R2Qがメ チル基である請求の範囲第 5項に記載の化合物又はその塩。
7 . R16及ぴ R19が 2-メトキシカルポニル- 1-ェチル基であり、 R15、 R17、 R18、 及 び R2Dがメチル基である請求の範囲第 5項に記載の化合物又はその塩。
8 . 一酸化窒素の測定方法であって、（a)請求の範囲第 1項に記載の一般式（I ) で示される化合物を一酸化窒素と反応させる工程；及ぴ、 （b)上記工程 (a)におい て生成する請求の範囲第 5項に記載の一般式 (II)の化合物 [ただし、 R11及び R12 は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する- N=N- NR3。- （式中、 R30は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を 示す] を検出する工程を含む方法。
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