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CN118126032A - 荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118126032A
CN118126032A CN202410195066.4A CN202410195066A CN118126032A CN 118126032 A CN118126032 A CN 118126032A CN 202410195066 A CN202410195066 A CN 202410195066A CN 118126032 A CN118126032 A CN 118126032A
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CN
China
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compound
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btd
hydroxy
hydrogen
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CN202410195066.4A
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颜金武
郭欲惠
张雷
莫君勇
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Guangzhou Pusai Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Pusai Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本申请公开了一种荧光探针及其制备方法和应用。本发明合成了一种新型D‑A‑π‑A构型荧光探针，以苯并噻二唑作为化合物母体，其可应用于酪胺信号放大技术；本发明中提供的荧光探针BTD‑SZ‑COOH，其发射波长较长，相比较于传统的商业染料Cy3，具有更高斯托克斯位移和荧光量子产率，相比较于商业染料Cy3.5，具有更高的光稳定性和荧光量子产率。

Description

荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光检测领域，特别涉及荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
酪胺信号放大(TSA)是一种基于辣根过氧化酶(HRP)的催化活性对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法，具有更高的检测灵敏度。TSA基于HRP在低浓度过氧化氢存在下将含有标记酪胺的底物转化为氧化的高反应性自由基的能力，该自由基可与HRP处或附近的酪氨酸残基共价结合。为了实现大免疫组织化学染色法(IHC)检测，酪胺用荧光团预标记。每个过氧化物酶标记物的多个酪胺底物转换所赋予的信号放大转化了对低丰度靶标的超灵敏检测以及使用较少量的抗体和杂交探针。TSA技术具有适用广，多重标记可避免抗体种属交叉问题，染色特异性好，信号强度高，适合低丰度靶标等优势。花菁荧光团广泛应用于各种科学和技术领域，目前已经设计了Cy3酪胺和Cy5酪胺用于TSA技术。根据花菁染料的电子结构和分子排列的特殊性，决定了其独特的光物理和光化学性质。但是常规的花菁染料的离子型D-π-A结构易受亲核试剂的进攻，破坏共轭结构，因此化学稳定性较差。Cy3是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料，最大激发波长和发射波长分别在550nm和570nm左右，Cy3.5是一种发红色荧光的花青素类荧光染料。花菁类染料一般都具有较高摩尔吸光系数，但较小的斯托克斯(stocks)位移、较差的稳定性和低荧光量子产率限制了花菁染料在生物检测中的应用。本领域亟需开发新的稳定性好，荧光量子产率高且斯托克斯位移大的荧光染料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种式I所示化合物或其盐。
本发明的另一目的在于提供一种式I所示化合物或其盐的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种式I所示化合物作为荧光探针应用。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了一种式I所示化合物或其盐，
式中，L为
X为S或-C(CH3)2；
R1为-(CH2)n-C(O)R3或C1-4烷基，R3为羟基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、或-NH-(CH2)n-R31，R31取代的烷基取代的氨基，R31为氢、苯或R32取代的苯，R32为羟基或氨基，各n独立地为1-6之间的整数；和
R2为氢、卤素或
Ra和Rb分别独立地为C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在一些优选的方案中，Ra和Rb相同。
在一些优选的方案中，R2为氢、氯、溴或
在一些优选的方案中，Ra和Rb均为甲基，通式I所示具有如通式I’所示的结构或其盐，
在一些优选的方案中，L为
在一些优选的方案中，n为2、3、4、5或6。
在一些优选的方案中，R3为给电子基。
在一些优选的方案中，R3为羟基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲胺基、二甲胺基、乙胺基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基。
在一些优选的方案中，R3为羟基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基。
在一些优选的方案中，所述化合物选自下组：
式中，X为S或-C(CH3)2；
R3为羟基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；
R2为氢、氯、溴或
在一些优选的方案中，R3为羟基或4-羟基苯乙胺基。
在一些优选的方案中，式I或式II所示的化合物的盐为氯盐或溴盐。
在一些优选的方案中，R2为式I或式II所示的化合物为磺酸内盐。
在一些优选的方案中，R2为氢，式I或式II所示的化合物与氯离子或溴离子形成盐。
在一些优选的方案中，X为S，R2为氢，R3为羟基，式II所示的结构与氯离子或溴离子形成盐。
在一些优选的方案中，X为S，R2为氢，R3为4-羟基苯乙胺基，式II所示的化合物与氯离子或溴离子形成盐。
在一些优选的方案中，X为-C(CH3)2，R2为氢，R3为羟基，式II所示的化合物与氯离子或溴离子形成盐。
在一些优选的方案中，X为-C(CH3)2，R2为氢，R3为4-羟基苯乙胺基，式II所示的化合物与氯离子或溴离子形成盐。
在一些优选的方案中，X为S，R2为R3为羟基，式II所示的化合物为磺酸内盐。
在一些优选的方案中，X为S，R2为R3为4-羟基苯乙胺基，式II所示的化合物为磺酸内盐。
在一些优选的方案中，所述化合物选自下组：
本发明的第二方面，提供了一种式I所示化合物的制备方法，所述方法包括步骤：
使式I-1所示化合物和式I-2所示化合物反应，即得；
其中，X为S或-C(CH3)2；
R1为-(CH2)n-C(O)R3，R3为羟基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、或-NH-(CH2)n-R31，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基或氨基，各n独立地为1-6之间的整数；。
R2为氢或
在一些优选的方案中，所述方法包括步骤：
使式I-1’所示化合物和式I-2所示化合物反应，即得；
在一些优选的方案中，所述方法包括步骤：使式I-1所示化合物和式I-3所示化合物反应，即得；
其中，X为S或-C(CH3)2；
R3为羟基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；
R2为氢或
在一些优选的方案中，所述反应为缩合反应，所述反应在含有乙酸的醇溶液中进行，所述反应的温度为75-90℃。
在一些优选的方案中，所述方法包括步骤：使式I-1’所示化合物和式I-3所示化合物反应，即得；
在一些优选的方案中，I-3所示化合物的制备包括步骤：
使I-4所示化合物与I-5所示化合物反应，即得；
其中，X为S或-C(CH3)2；
R3为羟基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；和
R2为氢或
在一些优选的方案中，所述I-4所示化合物与I-5所示化合物的反应在醇溶液中进行，所述反应的温度为100-130℃。
在一些优选的方案中，式I-1所示化合物的制备包括步骤：
使7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛与二甲胺发生反应，即得；
在一些优选的方案中，使所述7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛(7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛，市售可得)溶解于二甲胺的水溶液(更优选为质量分数为20-50％的二甲胺水溶液)，在45-65℃下进行反应。
本发明的第三方面，提供了通式I所示化合物作为荧光探针的应用。
在一些优选的方案中，所述荧光探针为D-A-π-A构型荧光探针。
在一些优选的方案中，所述荧光探针为酪胺信号放大用荧光探针。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优势：
(1)本发明合成了一种新型D-A-π-A构型荧光探针，以苯并噻二唑作为化合物母体，其可应用于酪胺信号放大技术；
(2)本发明中提供的荧光探针BTD-SZ-COOH，其发射波长较长，相比较于传统的商业染料Cy3，具有更高斯托克斯位移和荧光量子产率，相比较于商业染料Cy3.5，具有更高的光稳定性和荧光量子产率。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1为本发明中合成的荧光探针的紫外吸收归一化光谱；其中，A为BTD-SZ-COOH；B为BTD-YD-COOH；C为BTD-SZ-550；D为BTD-YD-594；
图2为本发明中合成的荧光探针的荧光发射归一化光谱；其中，A为BTD-SZ-COOH；B为BTD-YD-COOH；C为BTD-SZ-550；D为BTD-YD-594；
图3为本发明中合成的荧光探针的光稳定性对比；其中，A为BTD-SZ-COOH；B为Cy3；C为BTD-YD-594；D为Cy3.5；
图4为本发明中合成的荧光探针的pH稳定性；其中，A为BTD-SZ-COOH；B为BTD-YD-COOH。
图5为本发明中合成的荧光探针的紫外吸收归一化光谱；
图6为本发明中合成的荧光探针的荧光吸收归一化光谱；
图7为本发明中合成的荧光探针BTD-SZ(DMSO)的1H-NMR谱图；
图8为本发明中合成的荧光探针BTD-YD(CD3OD)的1H-NMR谱图；
图9为本发明中合成的荧光探针BTD-SZCl(DMSO)的1H-NMR谱图。
具体实施方式
现有的花菁类荧光染料为D-π-A结构，斯托克斯位移(stocks位移)小背景干扰大，稳定性差在荧光发光时容易被降解，且荧光量子产率低。本发明人经过广泛而深入的研究，开发出一系列荧光量子产率高的如本发明通式I所示化合物的D-A-π-A构型化合物作为荧光染料，不仅荧光团发光时没有发现降解表现出良好的光稳定性和热稳定性，还能够显示较大的斯托克斯位移，从而避免不希望的背景干扰和激发光被有效地阻挡到达探测器。
化合物
本发明提供了具有D-A-π-A构型的式I所示化合物或其盐，其结构如下：
在式I中，L为π-共轭片段，作为L，其可以是在本发明优选的实施方式中，L为
在式I中，L右边连接的单元为吸电子单元(A)，其中X为S或-C(CH3)2；R1为-(CH2)n-C(O)R3或C1-4烷基，R2为氢、卤素或
R1中，R3为给电子基，优选地R3为羟基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、或-NH-(CH2)n-R31，R31为氢、苯或R32取代的苯，R32为羟基或胺基；更优选地，R3为羟基、氨基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲胺基、二甲胺基、乙胺基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；最优选地，R3为羟基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；最优选地，R3为羟基或4-羟基苯乙胺基。作为R1，在本发明优选的实施方式中，R1为-(CH2)n-C(O)R3，n为2、3、4、5或6；最优选地，n为5。
在本发明的一些实施方式中，式I所示化合物可与阴离子形成盐的形式，优选地与氯离子和溴离子形成盐。
在本发明的一些实施方式中，R2为式I所示化合物为磺酸内盐。
在本发明的一些实施方式中，R2为氢，式I所示化合物与氢离子结合。
在式I中，L右边连接的单元为给电子单元(D)-吸电子单元(A)(D-A单元)，包括给电子单元(D)和吸电子单元(A)，其中，给电子单元为-N(RaRb),吸电子单元为苯并噻二唑(BTD)基，其中Ra和Rb分别独立地为C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
在本发明优选的实施方式中，Ra和Rb相同。例如Ra和Rb均为甲基，给电子单元为二甲胺基，此时式I所示具有如式I’所示的结构或其盐，
在本发明的一些更优选的实施方式中，L为n为5，荧光探针为式II所示的结构或其盐，
式中，X为S或-C(CH3)2；R3为羟基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；R2为氢或式II所示的结构或其盐提供更优越的稳定性和荧光量子产率。
在本发明的一些实施方式中，式II所示化合物可与阴离子形成盐的形式，优选地与氯离子和溴离子形成盐。
在本发明的一些实施方式中，R2为式II所示化合物为磺酸内盐。
在本发明的一些实施方式中，R2为氢，式II所示化合物与氢离子结合。
在本发明的一些实施方式中，X为S，且R2为氢。
在本发明的一些实施方式中，X为-C(CH3)2，且R2为
在本发明的一些实施方式中，R1为C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基或正丁基。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述化合物选自下组：
制备方法
本发明还涉及通式I所示化合物的制备方法，包括步骤：
使式I-1所示化合物和式I-2所示化合物反应，得到荧光探针；具体地，式I-1所示化合物和式I-2所示化合物发生如下反应式1所示反应
式I-1和I-2所示化合物中，X、Ra、Rb、R1和R2的定义同本文其他部分。
优选地，Ra、Rb均为甲基，式I-1’所示化合物和式I-2所示化合物发生如下反应
式I-1所示化合物和式I-2所示化合物发生的反应为缩合反应。作为反应介质，该缩合反应在有机溶剂中进行，有机溶剂优选极性有机溶剂，更优选为醇，例如乙醇。
在本发明优选的实施方式中，缩合反应在含有乙酸的有机溶剂中进行。乙酸作为催化剂，其在反应体系中浓度优选为7.5μL/mL，或者按照反应体系的为体积百分比0.75％添加乙酸。
作为反应温度，该缩合反应的反应温度为75-90℃例如80℃。该缩合反应的反应时间不作限制，能够得到目标产物的任意反应时间均在本发明的范围内，优选的实施方式中，该缩合反应的反应时间不少于1小时，更优选地为2-12小时，更优选地为6-12小时，例如10小时。作为投料比，该缩合反应中式I-1所示化合物和式I-2所示化合物优选以摩尔比为1:(1-1.2)投料。
缩合反应的反应物I-1’所示化合物可通过使7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛与二甲胺发生反应得到，具体地如下反应式4所示：
反应式4。
在本发明优选的实施方式中，I-1’所示化合物的制备包步骤：使7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛溶解于二甲胺的水溶液(更优选为质量分数为20-50％的二甲胺水溶液)，在45-65℃下(例如55℃)进行反应。该反应优选地在搅拌条件下进行，反应的时间优选为1-12小时。
反应结束后，可通过常规的分离纯化方式从反应液中分离得到I-1’所示化合物，例如萃取、层析等。在本发明优选的实施方式中，将反应结束后的反应液经二氯甲烷萃取，再取萃取液通过硅胶柱层析纯化，得到I-1’所示化合物。在本发明优选的实施方式中，硅胶柱层析步骤中，选用石油醚与乙酸乙酯的体积比为10:1作为层析液，层析柱中所填硅胶优选为200～300目。
当I-2所示化合物中，R1为-(CH2)n-C(O)R3，n为5时，式I-2化合物即为式I-3化合物，式I-1’所示化合物和式I-3所示化合物发生如下反应式2所示反应。
反应式2。
式I-3所示化合物中，X、R2和R3的定义同本文其他部分。
上述反应物I-3所示化合物可通过使I-4所示化合物与I-5所示化合物发生反应得到，具体地如下反应式3所示：
反应式3。
式I-4和式I-5所示化合物中，X、R2和R3的定义同本文其他部分。
在本发明优选的实施方式中，I-3所示化合物的制备包括步骤:使I-4所示化合物与I-5所示化合物溶解于醇溶液，于100-130℃(例如120℃)下进行反应得到。I-4所示化合物与I-5所示化合物优选以摩尔比为1:(1-1.2)投料反应。反应时间优选为1-12小时(优选为10小时)。反应结束后可通过常规手段分离纯化反应液得到纯净的I-3所示化合物。在本发明优选的实施方式中，可通过将反应液减压抽滤，去滤渣反复用二氯甲烷清洗得到纯净的I-3所示化合物。
在本发明的一些实施例中，I-5所示化合物为6-溴己酸，使式I-4所示化合物与6-溴己酸反应得到下式I-6所示化合物，式I-6中，X和R2的定义同本文其他部分。
在本发明的一些实施例中，可通过式I-6所示化合物与4-羟基苯乙胺反应得到I-7化合物，式I-7中，X和R2的定义同本文其他部分。
上述式I-6所示化合物与4-羟基苯乙胺的反应优选在催化剂HATU存在下和保护性气体存在下进行。在本发明的一些实施方式中，使式I-6所示化合物溶解于有机溶剂(有机溶剂优选为DMF)，然后依次加入催化剂HATU和4-羟基苯乙胺，保护性气体(优选为氮气、氩气或其组合气体)存在下加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下进行反应，得到式I-7所示化合物。式I-6所示化合物和4-羟基苯乙胺优选以摩尔比1:(2-5)投料。在更优选的实施方式中，反应体系中HATU的质量分数为5-10mg/mL，例如8mg/mL；DIPEA的体积分数为6-9μl/mL，例如34μl/5mL。反应结束后，常规手段分离纯化反应液得到纯净的I-7所示化合物。在本发明的优选实施方式中，采用薄层色谱分离纯化反应液得到I-7所示化合物，薄层色谱洗脱液为二氯甲烷与甲醇混合液(二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1)。
用途
本发明还涉及式I化合物作为荧光探针的应用。优选地，该荧光探针为酪胺信号放大用荧光探针。
术语
除非另行指明，此处所用的术语“D-A-π-A构型”指的是分子结构由给电子单元(D)-吸电子单元(A)-π-共轭片段-吸电子单元(A)构成的荧光探针。
除非另行指明，此处所用的术语“烷基”指线性或带支链的饱和单价烃基，其中该烷基可任选地被一个或多个取代基取代。在特定的实施方式中，烷基是具有1至20(C1-20)、1至15(C1-15)、1至12(C1-12)、1至10(C1-10)或1至6(C1-6)个碳原子的线性饱和单价烃基，或者具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至12(C3-12)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的带支链饱和单价烃基。此处所用的线性C1-6和带支链C3-6烷基基团也称为“低级烷基”。烷基基团的范例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基(包括所有同分异构形式)、正丙基、异丙基、丁基(包括所有同分异构形式)、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基(包括所有同分异构形式)以及己基(包括所有同分异构形式)。例如，C1-6烷基指具有1至6个碳原子的线性饱和单价烃基或者具有3至6个碳原子的带支链饱和单价烃基。在一个实施方式中，该烷基是本文别处描述的任选地取代的烷基。
除非另行指明，此处所用的术语“烷氧基”指稳定的直链或支链，或者环状的烃基，或其组合，其由所示数量的碳原子和一个或多个O原子组成。烷氧基的范例包括，但不限于-O-CH3、-O-CH2-CH3、-O-CH2-CH2-CH3、-O-CH-(CH3)2和-O-CH2-CH2-O-CH3。在一个实施方式中，该烷氧基是本文别处描述的任选地取代的烷氧基。
除非另行指明，此处所用的术语“胺基”指稳定的直链或支链，或者环状的烃基，或其组合，其由所示数量的碳原予以及一个或多个(在一个实施方式中为一至三个)N原子组成。胺基的范例包括，但不限于，-NH-CH3、-N(CH3)2、-NH-CH2-CH3、-N(CH3)-CH2-CH3、-NH-CH-(CH3)2、-CH2-CH2-NH-CH3和-CH2-CH2-N(CH3)2。在一个实施方式中，该胺基是本文别处描述的任选地取代的胺基。
除非另行指明，此处所用的术语“卤素”指氟、氯、溴和/或碘。
除非另行指明，此处所用的术语“氢”包括质子(1H)、氘(2H)、氚(3H)和/或其混合物。在此处所述的化合物中，一个或多个被氢占据的位置可被氘和/或氚富集。该种同位素富集类似物可通过由商业来源获得的合适的同位素标记起始原料制备得到或者由已知的文献步骤制备得到。
如本文中所使用的，术语“羟基”指-OH。
如本文中所使用的，术语“氨基”指-NH2。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
除非另有指明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
如本文使用的，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则例如“一个”、“一种”和“所述”在内的词语的单数形式包括它们相应的复数指代物。
实施例1
本实施例中，制备得到了化合物BTD-SZ-COOH。
(1)化合物1的合成步骤：
称取7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛(0.2g，0.82mmol)，充分搅拌溶解在质量分数为40％的二甲胺水溶液(9mL)中，在55℃的温度下进行回流反应，每隔1h监测反应的进程。
反应结束后经二氯甲烷萃取，采用硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10:1，v/v；硅胶200～
300目)纯化得到橙色固体化合物1，产率为64.1％。
核磁氢谱表征：
7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazole-4-carbaldehyde：Orangesolid；Yield:64.1％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.25(s,1H),8.06(d,J＝8.5Hz,1H),6.63(d,J＝8.6Hz,1H),3.55(s,6H).
(2)化合物2的合成步骤：
称取2-甲基苯并噻唑(2.0g，13.40mmol)，充分溶解在溴己酸(2.61g，13.38mmol)中，在110℃条件下反应10h。反应结束后进行抽滤，二氯甲烷反复清洗产物，得到白色固体化合物2，产率为73.06％。
3-(5-carboxypentyl)-2-methylbenzo[d]thiazol-3-ium:White solid；Yield:73.06％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.48(d,J＝9.4Hz,1H),8.35(d,J＝8.5Hz,1H),7.93(t,1H),7.80(t,J＝7.7Hz,1H),4.73(d,J＝7.9Hz,2H),3.23(s,3H),2.22(t,J＝7.2Hz,2H),1.92–1.78(m,2H),1.55(q,J＝7.4Hz,2H),1.45(t,J＝6.2Hz,2H).
(3)BTD-SZ-COOH的合成步骤：
称取化合物1(0.1g，0.48mmol)溶解在乙醇中，加入化合物2(0.2g，0.58mmol)，再滴加适量乙酸(150μL，终浓度为7.5μL/mL)，在80℃的温度下回流5h，反应结束后进行抽滤，乙醇反复清洗产物，得到紫黑色固体化合物BTD-SZ-COOH，产率为53.06％。
(E)-3-(5-carboxypentyl)-2-(2-(7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazol-4-yl)vinyl)benzo[d]thiaz ol-3-ium:Purple black solid；Yield:53.06％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.03(s,1H),8.35(d,J＝3.2Hz,2H),8.31(d,J＝6.9Hz,1H),8.24–8.15(m,2H),7.78(t,J＝7.2Hz,1H),7.68(t,J＝7.6Hz,1H),6.77(d,J＝8.8Hz,1H),4.72(t,J＝7.6Hz,2H),3.64(s,5H),2.24(t,J＝7.2Hz,2H),1.92(p,J＝7.6Hz,2H),1.65(p,J＝7.1Hz,2H),1.54(q,J＝7.9Hz,2H).
实施例2
本实施例中，制备得到了化合物BTD-SZ-550。
取实施例1制备得到的BTD-SZ-COOH(20.0mg，0.037mmol)加入到DMF中，依次加入催化剂HATU(40mg)和DIPEA(34μL)，最后加入对羟基苯乙胺(12.9mg，0.094mmol)，在保护性气体氛围下，室温中进行反应，待反应结束后，以涂布于支持板上的1mm层析硅胶作为固定相，以及二氯甲烷：甲醇(10：1，v/v)混合溶液作为展开剂，在室温下得到黑紫色的固体BTD-SZ-550，产率为43.06％。
(E)-2-(2-(7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazol-4-yl)vinyl)-3-(6-((4-hydroxyphenethyl)amin o)-6-oxohexyl)benzo[d]thiazol-3-ium:Purple blacksolid；Yield:43.06％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.24(s,1H),8.32(d,J＝3.3Hz,1H),8.29(d,J＝7.9Hz,1H),8.17(t,J＝8.9Hz,2H),7.79(dd,J＝11.7,6.5Hz,2H),7.67(t,J＝7.7Hz,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),6.72(d,J＝8.8Hz,1H),6.63(s,2H),4.70(t,J＝7.5Hz,2H),3.61(s,6H),3.10(dt,J＝8.2,6.1Hz,2H),2.45(t,J＝7.6Hz,2H),2.06(t,J＝7.1Hz,2H),1.90(t,J＝7.6Hz,2H),1.62(t,J＝7.6Hz,2H),1.49–1.41(m,2H).
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.10,156.04,155.63,147.71,146.20,129.86,129.77,129.45,127.80,124.37,116.16,115.48,107.13,49.07,48.48,43.58,40.93,35.57,34.95,28.29,26.05,25.18.
实施例3
本实施例中，制备得到了化合物BTD-YD-COOH。
称取实施例1中制备得到的化合物1(0.1g，0.48mmol)溶解在乙醇中，加入1-(5-羧基己基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-磺酸内盐(0.17g，0.48mmol)，再滴加适量乙酸(150μL，终浓度为7.5μL/mL)，在80℃的温度下回流5h，反应结束后进行抽滤，乙醇反复清洗产物，得到紫黑色固体化合物BTD-YD-COOH，产率为58.05％。
(E)-1-(5-carboxypentyl)-2-(2-(7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazol-4-yl)vinyl)-3,3-dimethyl-3H-indol-1-ium-5-sulfonate:Blue blacksolid；Yield:58.05％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.58(d,J＝15.1Hz,1H),8.42(d,J＝8.8Hz,1H),8.22(d,J＝15.1Hz,1H),7.97(s,1H),7.77(d,J＝8.2Hz,1H),7.69(d,J＝8.4Hz,1H),6.86(d,J＝8.9Hz,1H),4.39(t,J＝7.6Hz,2H),3.72(s,6H),2.13(s,2H),1.82(s,6H),1.63(s,2H),1.51(s,2H),1.24(s,2H).HRMS-ESI(m/z):C31H34N5O2S2测定值：572.2153。
实施例4
本实施例中，制备得到了化合物BTD-YD-594。
将BTD-YD-COOH(20.0mg，0.037mmol)加入到DMF中，依次加入催化剂HATU(40mg)和DIPEA(34μL)，最后加入对羟基苯乙胺(12.9mg，0.094mmol)，在保护性气体氛围下，室温中进行反应，待反应结束后，以涂布于支持板上的1mm层析硅胶作为固定相，以及二氯甲烷：甲醇(10：1，v/v)混合溶液作为展开剂，在室温下得到黑蓝色的固体BTD-YD-550，产率为43.06％。
(E)-2-(2-(7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazol-4-yl)vinyl)-1-(6-((4-hydroxyphenethyl)amin o)-6-oxohexyl)-3,3-dimethyl-3H-indol-1-ium-5-sulfonate:Blue black solid；Yield:43.06％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.16(s,1H),8.58(d,J＝15.2Hz,1H),8.41(d,J＝8.9Hz,1H),8.21(d,J＝14.7Hz,1H),7.99(s,1H),7.78(d,J＝9.6Hz,2H),7.69(d,J＝8.4Hz,1H),7.05(d,J＝8.1Hz,1H),6.85(dd,J＝16.9,8.6Hz,3H),6.62(d,J＝8.2Hz,2H),4.40(s,2H),3.70(s,6H),3.18(d,J＝4.8Hz,2H),3.10(q,J＝6.7Hz,2H),2.82–2.73(m,3H),2.05(t,J＝7.2Hz,2H),1.83(s,6H),1.61(t,J＝7.5Hz,2H),1.44(d,J＝7.4Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ179.93,172.09,161.32,156.42,156.01,149.04,148.05,147.38,142.48,141.62,130.06,129.86,129.75,128.53,126.85,120.61,115.72,115.45,114.68,113.06,108.03,106.55,51.03,45.75,44.05,35.57,34.96,34.68,27.52,27.18,26.19,25.27.HRMS-ESI(m/z):C34H39N5O5S2测定值：684.2294[M+Na]+。
实施例5
本实施例中，制备得到了化合物BTD-SZ。
称取化合物1(0.10g，0.48mmol)溶解在乙醇中，加入2,3-二甲基苯并噻唑碘化物(0.17g，0.58mmol)，再滴加适量乙酸(150μL，终浓度为7.5μL/mL)，在80℃的温度下回流5h，反应结束后进行抽滤，乙醇反复清洗产物，得到紫黑色固体化合物BTD-SZ，产率为64.21％。
E)-2-(2-(7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazol-4-yl)vinyl)-3-methylbenzo[d]thiazol-3-iu m(BTD-SZ):Purple solid；Yield:64.21％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(m,J＝8.2Hz,3H),8.22(d,J＝8.6Hz,1H),8.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(t,J＝7.9Hz,1H),7.68(t,J＝7.7Hz,1H),6.76(d,J＝8.8Hz,1H),4.21(s,3H),3.63(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ171.68,155.65,147.62,147.38,145.78,142.34,140.62,129.35,127.81,127.16,124.24,116.26,113.57,108.05,107.17,43.58,35.87.Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):calcd.for[C18H17N4S2]+353.0889；found 353.0895.图7为其核磁共振氢谱。
实施例5
本实施例中，制备得到了化合物BTD-SZCl。
称取化合物1(0.10g，0.48mmol)溶解在乙醇中，加入6-氯-2,3-二甲基苯并[d]噻唑-3-鎓(0.18g，0.55mmol)，再滴加适量乙酸(150μL，终浓度为7.5μL/mL)，在80℃的温度下回流5h，反应结束后进行抽滤，乙醇反复清洗产物，得到紫黑色固体化合物BTD-SZCl，产率为30.06％。
(E)-6-chloro-2-(2-(7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazol-4-yl)vinyl)-3-methylbenzo[d]thi azol-3-ium(BTD-SZBr):Purple solid；Yield:30.06％；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(s,1H),8.32(d,J＝12.1Hz,1H),8.23(d,J＝8.6Hz,2H),7.85(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(s,1H),4.18(s,3H),3.66(s,6H).图8为其核磁共振氢谱。
实施例6
本实施例中，制备得到了化合物BTD-YD。
称取化合物1(0.10g，0.48mmol)溶解在乙醇中，加入1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物(0.17g，0.56mmol)，再滴加适量乙酸(150μL，终浓度为7.5μL/mL)，在80℃的温度下回流5h，反应结束后进行抽滤，乙醇反复清洗产物，得到紫黑色固体化合物BTD-YD，产率为62.26％。
(E)-2-(2-(7-(dimethylamino)benzo[c][1,2,5]thiadiazol-4-yl)vinyl)-1,3,3-trimethyl-3H-indol-1-iu m(BTD-YD):Purple solid；Yield:62.26％；1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.56(d,J＝15.3Hz,1H),8.32(d,J＝15.4Hz,1H),8.23(d,J＝8.8Hz,1H),7.69(dd,J＝7.3,1.2Hz,1H),7.64(d,J＝7.9Hz,1H),7.58(td,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.50(td,J＝7.4,1.2Hz,1H),6.83(d,J＝8.8Hz,1H),4.01(s,3H),3.78(s,6H),1.88(s,6H).图9为其核磁共振氢谱。
测试例
(1)荧光探针的光谱学性质测试
将化合物精确称量(约1mg)并配制成储存液(10mM)，在-7℃的冰箱中低温避光保存。首先对四个系列光敏剂进行紫外光谱测试，分别取储存液(2μL)用不同极性的溶剂稀释成待测液(10μM)，溶剂的极性由小到大分别为DCM、THF、EA、Acetone、ACN、DMF、MeOH、DMSO和H2O，用紫外分光光度计分别测试化合物在300-700nm区间内的紫外光谱。再取上述所得待测液，进一步测试在不同极性溶剂中的荧光光谱。以化合物在紫外光谱中的最大吸收波长作为激发波长，发射开始波长设置为比激发波长大15nm，通过荧光分光光度计得到化合物在不同溶剂中的荧光性质。将数据整理后用OriginPro 2021绘制曲线图。
(2)荧光量子产率的计算
荧光量子产率的计算公式如下：
上述公式中的缩写含义列表如下，Φ代表荧光量子产率，OD代表荧光曲线下的面积；A代表光敏剂的最大吸光度；η代表溶剂的折射率。标准品是指罗丹明6G，在乙醇中的量子产率为0.95。
(3)荧光探针的稳定性研究
配制化合物的DMSO溶液(10μM)，在520nm激光(20mW)下照射200min，取各个时间点，测试溶液在最大吸收波长处的吸光度，以及最大发射波长处的荧光强度。采用不同NaOH和HCl的混合溶液配制不同的pH溶液，通过酶标仪测试化合物在不同pH溶液中的荧光强度。
测试结果如图1～4和表1所示。BTD-SZ-COOH和BTD-SZ-550探针分子都是溶剂极性敏感性的(图1A和C)，主要表现在紫外吸收波长随着溶剂极性的变化呈现规律性的变化，随着溶剂极性增加面向短波方向移动，在水溶液中，BTD-SZ-COOH激发波长为蓝移至545nm。BTD-YD-COOH和BTD-YD-594探针分子对极性并不敏感(图1B和D)，激发波长主要在594nm左右。再比较荧光分子的发射波长(图2A-D)，BTD-SZ-COOH和BTD-SZ-550也表现出极性敏感，在水中的发射波长分别为637nm和612nm，相比较于Cy3，具有更长的stock’s位移。BTD-YD-COOH和BTD-YD-594的发射波长在616nm左右。通过计算得到BTD-SZ-COOH和BTD-YD-COOH在乙醇中的荧光量子产率分别为3.95％和4.41％，相比较于Cy3(1.23％)和Cy3.5(3.63％)，具有更大的荧光量子产率(表1)。
图5和图6展示了化合物BTS-SZ和BTD-YD的紫外吸收光谱和荧光吸收光谱，可见其相较于Cy3，也具有更长的stock’s位移。
表1
进一步研究BTD-SZ-COOH、BTD-YD-COOH和传统商业染料Cy3和Cy3.5的稳定性，Cy3相比较于其他花菁类探针，具有更高的光稳定性，而BTD-SZ-COOH在激光(520nm，20mw)照射下，光稳定性较好(图3A和B)。如图3C和D所示，在同样的激光照射下，BTD-YD-COOH相比较于Cy3.5具有更高的光稳定性，这符合苯并噻二唑类荧光探针的特性。最后，选择BTD-SZ-COOH和BTD-YD-COOH进一步测试其pH稳定性(图4)，在pH 3-12的范围内，探针的吸光度没有明显变化，而荧光强度在偏酸性条件下较强，但变化不大。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.式I所示化合物或其盐，
式I中，L为
X为S或-C(CH3)2-；
R1为-(CH2)n-C(O)R3、或C1-4烷基；R3为羟基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、或-NH-(CH2)n-R31，R31为氢、苯或R32取代的苯，R32为羟基或氨基，各n独立地为1-6之间的整数；和
R2为氢、卤素或
Ra和Rb分别独立地为C1-4烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于，所述化合物的结构如式II所示，
式中，X为S或-C(CH3)2；
R3为羟基、或-NH-(CH2)n-R31，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；
R2为氢或
3.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于，R31为4-羟基苯基。
4.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其特征在于，R2为氢，式I所示的化合物与氯离子或溴离子形成盐；
或者，R2为式I所示的化合物为磺酸内盐。
5.根据权利要求1中所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自下组：
6.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
使式I-1所示化合物和式I-2所示化合物反应，即得；
其中，X为S或C(CH3)2-；
R1为-(CH2)n-C(O)R3，R3为羟基、氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、或-NH-(CH2)n-R31，R31为氢、苯或R32取代的苯，R32为羟基或氨基，各n独立地为1-6之间的整数；
R2为氢或
Ra和Rb分别独立地为C1-4烷基。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，式I-2化合物中，R1为-(CH2)n-C(O)R3，n为5，所述制备方法包括步骤：在惰性溶剂中，使式I-1’所示化合物和式I-3所示化合物反应，即得；
其中，X为S或-C(CH3)2；
R3为羟基、R31取代的乙胺基，R31为苯或R32取代的苯，R32为羟基；和
R2为氢或
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，I-3所示化合物的制备包括步骤：使I-4所示化合物与I-5所示化合物反应，即得；
9.如权利要求6所述方法，其特征在于，I-1所示化合物的制备包括步骤：
使7-溴-2,1,3-苯并噻二唑-4-甲醛与二甲胺发生反应，即得；
10.通式I所示化合物作为荧光探针的应用。
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