WO2007026922A1

WO2007026922A1 - プロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法

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Publication number: WO2007026922A1
Application number: PCT/JP2006/317415
Authority: WO
Inventors: Rikiya Ishida; Hiroyuki Nakagoshi
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-08-30
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2008-02-29
Also published as: EP1921135A4; JP4905351B2; EP1921135A1; CN101248176B; CN101248176A; JPWO2007026922A1

Abstract

トランスグルタミナーゼ含有物に夾雑するプロテアーゼを、トランスグルタミナーゼ活性を低下させることなく低減することができる処理方法、プロテアーゼを含有するトランスグルタミナーゼ含有物を温度０℃以上５０℃未満、ｐＨ９．０より高くｐＨ１３．０未満、１０分以上６０時間以下保持して処理することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法、該処理方法に従って得られるトランスグルタミナーゼ含有物、該トランスグルタミナーゼ含有物を配合したトランスグルタミナーゼ製剤、および該トランスグルタミナーゼ製剤を添加した食品の製造方法を提供する。

Description

プロテア一ゼ活性が低減されているトランスダル夕ミナーゼ含有物の製造方法

技術分野

本発明は、プロテア一ゼ活性が低減されている卜ランスダル夕ミナ一ゼ含有物とその製造方法に関する。特に本発明明は、トランスダル夕ミナーゼ含有物に夾雑するプロテア一ゼ活性の低減方法に関する。ま田た、プロテア一ゼ活性が低減されている書

トランスダル夕ミナ一ゼ含有物と副剤からなるトランスグル夕ミナーゼ製剤、およびトランスダル夕ミナ一ゼ製剤を用いた食品の製造方法に関する。

背景技術

トランスグルタミナ一ゼは、夕ンパク質含有素材の物性を改質する酵素物質として知られており、タンパク含有素材に直接添加してその物性を改質したり、トランスダル夕ミナ一ゼをタンパク質含有素材、特にゼラチンゃ乳夕ンパク質の溶液と混合し、接着剤組成物として各種素材に使用されている。ところが、入手可能なトランスグル夕ミナーゼ含有物、特に微生物由来のトランスダルタミナ一ゼ含有物を用いて製造したトランスグル夕ミナ一ゼ製剤は、他の酵素製剤同様、そのロット間で品質にばらつきがあった。

トランスグル夕ミナ一ゼ製剤のタンパク質含有素材に対する効果がロット間でばらつきがある主な理由は、トランスグルタミナーゼ含有物のトランスダル夕ミナ一ゼ活性のばらつきに起因するものと考えられてきたが、トランスグル夕ミナーゼ活性を制御してもなお品質にばらつきが残り、事業上の大きな課題であった。

トランスダル夕ミナーゼはタンパク質分子を架橋重合する機能を有するのに対し、プロテアーゼはタンパク質を分解する機能を有している。プロテアーゼは、トランスグル夕ミナーゼのタンパク質に対する機能とは逆の機能を有しているため、トランスグル夕ミナーゼ含有物中にプロテア一ゼが夾雑することは、トランスグルタミナ一ゼ含有物及びそれを原料として配合したトランスグルタミナーゼ製剤として好ましくないと考えられる。しかしながら、トランスダル夕ミナーゼ活性を損なうことなく、含まれているプロテア一ゼ活性のみを選択的に失活又は除去する効率的な方法は知られていない。

そのためトランスダル夕ミナーゼ製剤の品質を確保するためには、試作試験によつてプロテアーゼ活性の低いトランスダル夕ミナ一ゼ含有物を選定することや、混在しているプロテアーゼ活性に応じて、トランスグル夕ミナ一ゼ含有物の配合率を高くするなどの対策が必要であつた。これらの対策は、人的および原材料のコスト上昇を招き、トランスグル夕ミナーゼ製剤の製造コストを大きく押し上げていた。このためトランスグル夕ミナ一ゼ活性を損なうことなく、トランスダル夕ミナ一ゼ含有物に含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活させる技術が切望されていた。

一般に、トランスグル夕ミナーゼ含有物中のプロテア一ゼ活性を制御する方法としては、トランスダル夕ミナ一ゼ含有物中のプロテア一ゼの活性を選択的に失活させるか、トランスダル夕ミナ一ゼ含有物から選択的に除去する処理を施すことが考えられる。特に、インヒビ夕一やその他の化学的処理により、プロテア一ゼを働かないようにするのが基本的な回避策である。

特定の酵素である耐塩性ダル夕ミナーゼに関して、プロテアーゼ活性を選択的に失活させる方法として、 p H 9 . 8、 3 7 °C , 1 6時間処理することによりプロテァ一ゼ、 α—アミラーゼ等の夾雜酵素活性を除く方法が知られている（特許文献 1 ) 。

しかしながら、当該酵素は、アルカリ性で極めて安定であることが知られていたのに対し、トランスダルタミナーゼにおいて同様のアル力リ処理をすることによつて、トランスグル夕ミナーゼ活性を損なうことなく、含まれるプロテア一ゼ活性のみを選択的に失活できるかどうかは知られていなかった。

また、プロテアーゼ活性の低減方法に関連するものとしては、ラクタ一ゼ中のプ口テア一ゼをァ線照射によって失活させる方法が知られている（特許文献 2 ) 。しかし、この放射線処理がトランスダル夕ミナ一ゼ含有物中のプロテアーゼ活性の選択的な失活手段として適用できるかどうか、また、この処理によるトランスグル夕ミナーゼのプロテアーゼ活性低下程度がタンパク質含有素材への効果と密接に相関するかどうかは不明であるし、放射線を使用する処理手段である点でも商業的な価値は低い。

特許文献 1

特開平 1 1一 4 2 0 8 6号公報

特許文献 2

特開昭 5 1— 7 6 4 5 9号公報発明の開示

本発明は、トランスダル夕ミナーゼ含有物に混在するプロテアーゼを、トランスグル夕ミナ一ゼ活性を低下させることなく低減することができる処理方法を提供することを目的とするものである。

本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテア一ゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法を提供することを目的とするものである。また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテア一ゼ活性が低減された卜ランスダル夕ミナ一ゼ含有物を提供することを目的とするものである。

また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテア一ゼ活性が低減されたトランスグル夕ミナーゼ含有物を配合した、トランスダルタミナ一ゼ製剤を提供することを目的とするものである。

また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテア一ゼ活性が低減されたトランスダル夕ミナーゼ含有物を配合した、トランスダルタミナーゼ製剤を用いた食品の製造方法を提供することを目的とするものである。

なお、本発明において特に限定のない限り、 T Gはトランスダル夕ミナーゼの略語を意味する。本発明は、以下の各発明を包含する。

(1) プロテア一ゼが夾雑するトランスグル夕ミナ一ゼ含有物を温度 0°C以上 50 °C未満、 ρΗ9'. 0より高く ρΗ 1 3. 0未満で、 1 0分以上 60時間以下保持して処理することからなるプロテアーゼ活性が低減きれているトランスグル夕ミナ一ゼ含有物の製造方法。

(2) 前記保持が、トランスダルタミナーゼ含有物におけるプロテア一ゼ活性ノ '卜ランスダルタミナーゼ活性を 0. 00024以下となるまで保持することからなる

( 1 ) 項記載のトランスダルタミナーゼ含有物の製造方法。

(3) 前記保持が、発酵法によるトランスダル夕ミナーゼ含有物の製造工程において、発酵液からトランスグル夕ミナ一ゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる（1) 項又は（2)項に記載のトランスグル夕ミナーゼ含有物の製造方法。

(4) (1) 項〜（3) 項のいずれか 1項に記載の製造方法によって製造されたプ口テアーゼ活性が低減されているトランスグル夕ミナーゼ含有物。

(5) (4) 項に記載のトランスダル夕ミナーゼ含有物と副剤からなるトランスグル夕ミナーゼ製剤。

(6) (4) 項に記載のトランスグル夕ミナーゼ含有物とタンパク質含有素材からなる接着用トランスグル夕ミナーゼ製剤。

(7) (4) 項に記載のトランスダル夕ミナ一ゼ含有物とコラーゲン及びノ又は乳蛋白からなる接着用トランスダルタミナーゼ製剤。

(8) (4) 項に記載のトランスダル夕ミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩類、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤からなる水産練製品用トランスグル夕ミナ一ゼ製剤。

(9) (4) 項〜（7) 項のいずれか 1項に記載のトランスグル夕ミナ一ゼ含有物を用いた、接着成型食品の製造方法。

(10) (4) 項に記載のトランスグル夕ミナ一ゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び/又は乳蛋白とを混合した溶液を、食品原材料に添加することからなる接着成型食品の製造方法。

(1 1) (4) 項、（5) 項、（8) 項のいずれか 1項に記載のトランスダルタミナーゼ含有物を魚肉すり身に添加することからなる水産練製品の製造方法。

(1 2) プロテア一ゼが夾雑するトランスグル夕ミナ一ゼ含有物を温度 5〜 50°C 、 pH 9. 5〜1 3. 0で 10分〜 60時間保持して処理することからなるプロテァーゼ活性が低減されているトランスダル夕ミナーゼ含有物の製造方法。

(1 3) 前記保持が、トランスダル夕ミナーゼ含有物におけるプロテア一ゼ活性/ トランスグル夕ミナ一ゼ活性を 0. 00024以下となるまで保持することからなる（12) 項記載のトランスグル夕ミナーゼ含有物の製造方法。

(14) 前記保持が、発酵法によるトランスグル夕ミナ一ゼ含有物の製造工程にお：いて、発酵液からトランスグルタミナ一ゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる（1 2) 項又は（1 3) 項に記載のトランスグルタミナ一ゼ含有物の製造方法。

(1 5) (12) 項〜（14) 項のいずれか 1項に記載の製造方法によって製造されたプロテア一ゼ活性が低減されているトランスグル夕ミナーゼ含有物。

(16) (1 5.) 項に記載のトランスグル夕ミナ一ゼ含有物からなるトランスダル夕ミナーゼ製剤。

(1 7) (1 5) 項に記載のトランスグル夕ミナ一ゼ含有物とコラーゲン及び. z又は乳蛋白からなる接着用トランスグル夕ミナ一ゼ製剤。

(18) ( 16) 項又は（ 17) 項に記載のトランスダルタミナーゼ製剤を魚肉すり身に添加することからなる魚肉すり身製品の製造方法。

(19) (16) 項又は（17) 項に記載のトランスグル夕ミナ一ゼ製剤を畜肉及び/又は家禽肉のひき肉に添加することからなるひき肉製品の製造方法。

(20) (16) 項又は（17) 項に記載のトランスグル夕ミナ一ゼ製剤を植物蛋白に添加することからなる植物蛋白含有食品の製造方法。

(21) (16) 項又は（17) 項に記載のトランスグル夕ミナ一ゼ製剤を魚卵蛋白に添加することからなる魚卵製品の製造方法。 (22) (16) 項又は（1 7) 項に記載のトランスダル夕ミナ一ゼ製剤を鶏卵製品に添加することからなる鶏卵食品の製造方法。

(23) (16) 項又は（1 7) 項に記載のトランスダル夕ミナ一ゼ製剤を、タンパク質含有素材の接着剤として用いることからなる接着成型食品の製造方法。 (24) ( 1 5) 項に記載のトランスダル夕ミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び. Z又は乳蛋白とを混合した溶液を、タンパク質含有素材に添加することからなる接着成型食品の製造方法。

(25) (15) 項に記載のトランスグル夕ミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と異種蛋白を混合してなるピックル液を食肉単身品に添加することからなる食肉単身品の製造方法。本発明の処理方法を適用することによって得られるトランスグル夕ミナ一ゼ含有物は、そのプロテア一ゼ活性が極めて低い水準に低減されており、製剤の品質を確保するための、試作試験によるトランスグル夕ミナーゼ含有物の選別や、配合率を高めに設定するなどの対策を行う必要がなく、高品質のトランスダル夕ミナ一ゼ含有物及びトランスグルタミナ一ゼ製剤を低コス卜で製造することが可能となる。図面の簡単な説明

図 1は、試料液の処理 pHを変化させた場合の試料液のトランスグル夕ミナーゼ活性とプロテアーゼ活性の相対活性を示す図である。

図 2は、特定処理 p Hにおいて処理時間を変化させた場合の試料液のトランスグル夕ミナ一ゼ活性とプロテア一ゼ活性の相対活性を示す図である。

図 3は、特定処理 pHにおいて処理温度を変化させた場合の試料液のトランスグル夕ミナーゼ活性とプロテアーゼ活性の相対活性を示す図である。

図 4は、特定処理 pHにおいて高いプロテア一ゼ活性を有するトランスグルタミナーゼ含有物を処理したときと、処理しないときの接着力比蛟を示す図である。図 5は、特定処理 pHにおいて高いプロテアーゼ活性を有する卜ランスグルタミナ一ゼ含有物を P H I 1で保持したときと、保持しないときの蒲鋅物性値の比較を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明の実施の形態について説明する。

トランスグルタミナーゼ含有物中にプロテア一ゼが夾雑することは知られていた力トランスダル夕ミナ一ゼ活性を損なうことなく、含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活させることは困難であつた。

本発明者らは、トランスグルタミナ一ゼ含有物中に夾雑するプロテア一ゼ活性の低減方法について鋭意検討した結果、前記処理方法を開発し、この処理方法で製造したプロテア一ゼ活性の低減されたトランスダルタミナーゼ含有物を使用することにより、高品質なトランスグル夕ミナ一ゼ製剤を低コストで製造することを可能ならしめたものである。

本発明におけるプロテア一ゼとは、タンパク質を分解する酵素であり、その由来は、卜ランスダル夕ミナーゼ含有物を製造する際に、原料から移行するプロテア一ゼか、もしくは微生物が分泌するプロテアーゼである。

本発明におけるトランスダル夕ミナーゼとは、ァシル基転移反応を触媒するトランスフェラーゼの一種である。

本発明に用いるトランスダルタミナーゼとしては、組織由来、微生物由来の双方ともに利用できるが、微生物由来トランスダル夕ミナーゼは安価に入手できる点で好ましい。また、本発明に用いる卜ランスダル夕ミナ一ゼは C a依存性及び C a非依存性のどちらでも使用できるが、 C a非依存性トランスダル夕ミナ一ゼの方が、その効果が添加対象における C a濃度に依存しないで好ましい。

本発明におけるトランスダル夕ミナーゼ含有物とは、トランスダル夕ミナ一ゼを含む生体組織もしくは微生物の培養液から得られ、必要に応じて濾過や精製工程を経た液体、またはそれらを乾燥させた粉末を指す。トランスダル夕ミナーゼ活性を一定に揃えたり、その酵素活性を安定化させるために、賦形剤や安定化剤が混合さ 31ることある。

また、本発明におけるトランスダル夕ミナーゼ製剤とは、トランスグルタミナ一ゼ含有物と、目的に応じて選択された副剤とを混合したものを指す。

ここで、副剤としては、タンパク質含有素材、塩類、糖類、賦形剤等が用いられるトランスグル夕ミナーゼ含有物又はトランスダル夕ミナーゼ製剤の添加対象である、本発明におけるタンパク質含有素材とは、トランスダル夕ミナ一ゼの基質となるグルタミン残基を含むタンパク質を含む素材であり、可食、不可食を問わない。可食性のタンパク質含有素材としては、その由来は植物性タンパク質、動物性タンパク質、微生物タンパク質、藻類タンパク質、などが挙げられ、植物性タンパク質としては、大豆たん白、小麦たん白、えんどう豆たん白などが、動物性タンパク質としては、畜肉、家禽肉、魚肉、鶏卵、乳及びこれらの単離精製物、魚卵、血漿たん白、ゼラチン、コラーゲンなどが挙げられる。

塩類としては、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、焼成カルシウム、リン酸 3ナトリウム、炭酸ナトリウム等が使いやすい。糖類としては、糖類、澱粉、デキストリン、糖アルコール類などを使用することができる。賦形剤としては、前記の糖類が使用され、特に味への影響が小さいデキス卜リン、澱粉、乳糖などを使用するのが好ましい。

本発明において、トランスダル夕ミナ一ゼ含有物の処理条件は、 pH9. 0より高く pH 1 3. 0未満の領域が好ましく、 pH9. 5以上 pH 12. 5以下がより好ましく、さらに好ましくは pH 1 0. 5以上 pH 12. 5以下である。また、 p H9. 5〜1 3の領域であってもよい。処理時の温度条件及び処理時間は、トランスグル夕ミナーゼが失活しない温度及び処理時間であれば特に制限はなく、一般的には 0°C以上 50°C未満、好ましくは 10°C以上 40°C以下の温度、， 10分以上 6 0時間以下、好ましくは 10分以上 18時間以下の処理時間が採用される。また、 0°C〜 50°C、好ましくは 1 5°C〜40°Cの温度であってもよい。

本発明において、前記トランスグル夕ミナ一ゼ含有物の処理は、プロテア一ゼ活性， /トランスグル夕ミナ一ゼ活性の比を 0 . 0 0 0 2 4以下とする処理が好ましく、さらに好ましくは 0 . 0 0 0 1 7以下とする処理である。経験的にみて、実用的な最低限の接着強度が 5 0 g、更に好ましくは 1 0 0 gとされており、上記活性比は、上記接着強度に対応する。

また、前記処理は、発酵法によるトランスグル夕ミナ一ゼ含有物の製造工程における、発酵液からトランスダルタミナ一ゼを単離する工程における処理として行うことができる。また、一度粉末化したトランスグル夕ミナーゼ含有物を再度溶媒に溶解した溶液を処理しても、同様の効果が得られる。さらには、トランスダルタミナーゼ含有物と目的に応じて選択された副剤（タンパク質含有素材、塩類、糖類、賦形剤等）とが混合された溶液を処理しても同様の効果が得られる。

本発明でいう接着用トランスダル夕ミナ一ゼ製剤とは、トランスダルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材を粉粉混合したもの、もしくは両者を別々に包装してセットとして供給できるようにしたものを指す。前者は粉末のまま、もしくは水を加えて水溶液として被接着物にまぶすか、塗布するか、被接着物と混合して用いられ、後者は両者を直前に粉粉混合して前者と同様に用いるか、水にトランスグルタミナ一ゼ含有物とタンパク質含有素材を投入して溶解し、これを被接着物に塗布するか、被接着物と混合して用いられる。また、流通に耐え得る十分な保存安定性が得られるのであれば、製剤の形態は粉末に限らず、液体製剤として供給することもできる。

接着製剤において配合されるタンパク質含有素材の由来としては、前述のタンパク質含有素材から選択することができる。特にカゼインを主体とする乳たん白、水溶性が高いゼラチン、フィプリンを主体とする血漿たん白は接着製剤の副剤として優れている。ゼラチンの中では、魚ゼラチンが特に望ましい。ゼラチンを副剤とする接着用トランスダル夕ミナ一ゼ製剤は、接着力が非常に高い反面、プロテアーゼの影響を比較的受けやすいため、本発明の適用によりその品質は格段に向上する。本発明でいう水産練製品用トランスグル夕ミナ一ゼ製剤とは、トランスダルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩、アルカリ性塩類、陚形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤とを使用することを特徴とする製剤をさす。カルシウム塩としては、カルシウムを含む塩であればよく、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、焼成カルシウム、卵殻カルシウム、貝カルシゥムなどが挙げられる。アルカリ性塩類としては、魚肉すり身の pHを上昇させうるものであればよく、リン酸 3ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、焼成カルシウムなどが使いやすい。水産練製品用トランスグル夕ミナ一ゼ製剤に配合されるタンパク質含有素材としては、カゼインナトリウム、カゼイン力リウム、大豆蛋白、小麦蛋白などが挙げられる。賦形剤としては、糖類、澱粉、デキストリン、糖アルコール類などを使用することができ、特に味への影響が小さいデキストリン、澱粉、乳糖などを使用するのが好ましい。

本発明のトランスダル夕ミナーゼ含有物またはトランスダル夕ミナーゼ製剤は、接着成型食品や水産練製品に使用することができ、魚肉すり身、畜肉ゃ家禽肉のひき肉、ゼラチン、植物蛋白、魚卵、鶏卵製品等に添加することができる。また、トランスダル夕ミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と異種蛋白を混合してなるピックル液を食肉単身品に添加することによって食肉単身品の製造に使用することができる。

本発明でいう接着成型食品とは、食品原材料を接着してなる食品を指す。ここでいう食品原材料とは、牛肉、豚肉、馬肉、羊肉、山羊肉、家禽肉、鶏肉などいわゆる食肉ばかりでなく、各種魚肉、貝類、ェピ、力二などの甲殻類、イカ、夕コなどの軟体動物、いくら、スジコ、タラコ、カズノコなどの魚卵類なども利用できる。また、野菜、果実などもこの食品原材料に含まれる。もちろん、これ以外の原料も使用可能であり、また 2種類以上の原材料を組み合わせて使用してもかまわない。本発明においては、プロテアーゼ活性の単位を以下のとおり定義する。

「1分間に l m gのゥシ血清アルブミン（B S A ) に相当する非たん白性の L o w r y試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を 1ユニット（ 1 U) とする。」なお、プロテア一ゼ活性は、測定条件によって変化するため、同一の測定条件によつて測定された値のみ直接比較することができる。本発明における卜ランスダル夕ミナ一ゼの活性単位は、次のように測定され、かつ、定義される。すなわち「温度 3 7°Cで pH6. 0のトリス緩衝液中、ベンジルォキシカルボ二ルー Lーグルタミルダリシン及びヒドロキシルアミンを基質とする反応系で TG a s eを作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をトリクロ口酢酸存在下で鉄錯体を形成させた後、 5 2 5 nmにおける吸光度を測定し、ヒドロキサム酸量を検量線により求め、 1分間に 1 モルのヒドロキサム酸を生成せしめる酵素量を 1ユニット（ 1 U) とする。」（日本特許公開公報一昭 64— 2 747 1号参照 ) 。実施例

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

実施例 1 ·

(トランスグル夕ミナ一ゼの処理方法）

試料トランスグル夕ミナーゼ〔商品名「ァクティバ TG」、味の素（株）社製〕 1 gを蒸留水 2 0 gに溶解した水溶液 0. 4 gを、 pH3， 4, 5, 6, 7, 8, 9， 1 0， 1 1， 1 2に調製した 0.· 1 M GTA b u f f e r 1. 6 gに混合した。各水溶液を 2 0 °C、 3 0分保持したものを試料液とした。 .

(トランスダル夕ミナ一ゼ活性測定）

上述の条件にて調製した試料液に pH6. O T r i s—HC l b u f f e rを加えて、試料トランスダル夕ミナ一ゼ〔商品名「ァクティバ TG」、味の素（株）社製〕として 0. 2 ?。になるように希釈した。その後、 3 7°Cでベンジルォキシカルポニル— Lーグルタミルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質とする反応系で、トランスグル夕ミナ一ゼ含有物を作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体にする。次に、反応系の 5 2 5 nmにおける吸光度を測定し、生成したヒドロキサム酸量を検量線により求める。そして、 1分間に 1 / /モルのヒドロキサム酸を生成せしめる酵素量をトランスグル夕ミナーゼの活性単位、即ち 1ュニッ卜（ 1 u) とする。

(プロテアーゼ活性測定）

上述の条件にて調製した試料液に、 2%KC 1、 1 ?έ T r i t on X— 100 、 5 OmM りん酸緩衝液（pH6. 0) を加え、試料トランスダル夕ミナーゼ〔商品名「ァクティバ TG」、味の素（株）社製〕として 0. 5%になるように希釈した。スターラーで 60分間攪拌した後、遠心分離（3000 r pm， 1 0分間、 20°C) し.、その上澄を孔径 0. 45 .mのシリンジフィル夕一でろ過する（用時調製）。 .

ジメチルカゼィン〔S I GMA C 9801、 C a s e i n, N, N— d i me t h y l a t e d f r om b o v i n e m i l k] 2. 5 gを正確に量りとり 50 mMリン酸緩衝液（ p H 6. 0 ) 100 m 1を加え、常温で約 30分以上攪拌して溶解する（用時調製）。

アル力リ性銅試液 29。N.a₂C0₃ i n 0. 1 MN aOH： 2。。'酒石酸ナトリゥム溶液： 1 ¾硫酸銅 5水和物を 50 ： 1 ： 1で混合する。（用時調製） 2倍希釈フエノール試液（和光純薬製フエノール試薬）と蒸留水を体積比 1 ： 1 で混合する。（用時調製）

サンプル：ジメチルカゼイン溶液を 5°C±0. 5°Cに設定した恒温槽中（温度を標準温度計で確認する）で冷却しておく。試験管に試料溶液 0. 4mLを量り取り、恒温槽中で約 10分間以上静置した後、ジメチルカゼイン溶液 2 mLを加え、直ちに振り混ぜ、 5°C± 0. 5°Cで正確に 24時間静置する。反応停止時間に、順次 5 。トリクロ口酢酸を 2m 1加えて直ちに攪拌し、室温中に出す。 37°C±0. 5 • °Cに設定した恒温槽中に入れて 30〜45分間静置し、遠心分離（3000 r pm , 1 0分間 20°C) し、孔径 0. 45 tmのシリンジフィル夕一でろ過し、ろ液を回収する。

ブランク：ジメチルカゼイン溶液 2 mLを試験管に加えて 5 °C± 0. 5でで24 時間静置する。 5%トリクロ口酢酸を 2m l加えて直ちに攪拌し、室温中に出す。各試料溶液 0. 4mLを加えて、直ちに攪拌する。 37°C±0. 5°Cに設定した恒温槽中に入れて 30〜45分間静置し、遠心分離（3000 r pm、 10分間、 2 0°C) し、孔径 0. 45 xmのシリンジフィルターでろ過し、ろ液を回収する。試験管にろ液 0. 4 mLを量り取り、アルカリ性銅試液 2 mLを加えて振り混ぜ、室温で 1 0分間放置する。次に、水で 2倍に希釈したフエノール試薬（和光純薬製） 0, 2mLを加えて直ちに攪拌する。続いて、 37°C±0. 5°Cに設定した恒温槽中に入れて 30分間静置後、室温中で放冷する。この液につき、水を対照とし、波長 700 nmにおける吸光度（サンプルの吸光度を A 1、ブランクの吸光度を A 2とする）を測定する。

市販の標準用精製ゥシ血清アルブミン（B S A) 溶液（B i o— R a d P r o t e i n As s ay S t and a r d I I 濃度既知）に対し、蒸留水による 2倍希釈（1→2) を繰り返し、 2倍、 4倍、 8倍希釈溶液を調製する（例： B S A溶液の濃度が 1. Smg m 1の場合、希釈溶液の濃度はそれぞれ 0. 6，

0. 3, 0. 1 5mg.Zm 1となる）。試験管に希釈した B S A溶液 0. 4m Lを量り取り、アルカリ性銅試液 2 mLを加えて振り混ぜ、室温で 1 0分間放置する。次に、水で 2倍に希釈したフエノール試薬 0. 2mLを加えて直ちに攪拌する。続いて、 37°C±0. 5°Cに設定した恒温槽中に入れて 30分間静置後、室温中で放冷する。この液につき、水を対照とし、波長 700 nmにおける吸光度（S 1 ) を測定する。別に、 B S A溶液の代わりに蒸留水を用い、同様に操作して、吸光度（S O) を測定する。各標準蛋白質溶液の濃度、及び各 S 1から S 0を差し引いた吸光度差を用い、 M i c r o s o f t社製ソフト「E X c e 1」により散布図を作成し、多項式近似 '次数 2として近似曲線を作成し、数式を求める。 A 1及び A 2の吸光度から S 0を差し引いた値を数式に代入して、それぞれの蛋白質濃度（P A 1， P A 2) を算出する。

1分間に lmgのゥシ血清アルブミン（BSA) に相当する非たん白性の L ow r y試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を 1単位（1 U) とし、次式により算出する。プロテア一ゼ活性（U/'g) = (PA 1 -PA 2) X 4. 4 ÷ 0. 4÷TXV÷

W

酵素反応溶液の蛋白質濃度（mgBSAノ m l )

ブランクの蛋白質濃度（mgBSA,''m l ) 反応停止後の総液量への換算係数

反応時間（分）

粉末試料溶解体積（m 1 )

粉末試料採取量（g) 各条件で処理した試料液のトランスダル夕ミナ一ゼ活性とプロテア一ゼ活性について、 pH処理を行わなかった活性値を 100 %としたときの相対活性を図 1にまとめた。

pH 3〜9までは、トランスダル夕ミナ一ゼ相対活性値とプロテアーゼ相対活性値（pH処理する前のトランスグル夕ミナ一ゼ活性を 100 %としたときの相対活性）は、ほぼ同等であり、すなわち当該 p H領域で保持してもトランスダルタミナーゼ活性を低下させずに、プロテァ一ゼ活性を低減させることはできないことが明らかとなつた（図 1) 。一方 pH9より高い条件にて保持した場合、トランスダル夕ミナーゼ相対活性値よりプロテアーゼ相対活性値の方が、低くなることが明らかとなった。さらには、 pH 1 3以上になるとトランスグル夕ミナ一ゼ活性は急激に低下することも確認された。以上より、 PH9. 0より高く pH 1 3. 0未満の条件で、トランスグル夕ミナ一ゼ溶液を保持することにより、トランスグル夕ミナ一ゼ活性を低減させずに、プロテアーゼ活性を低減することができ、より高品質の卜ランスダル夕ミナ一ゼを製造可能であることが確認された。

実施例 2 試料トランスグル夕ミナーゼ〔商品名「ァクティバ TG」、味の素（株）社製〕 1 gを蒸留水 20 gに溶解した水溶液 0. 4 gを、 pH9, 1 0, 1 1, 1 2に調製した 0. 1M GTA b u f f e 1- 1. 6 gに混合した。各水溶液を 20°C、 3 0分〜 6時間保持したものを試料液とした。

(トランスグル夕ミナーゼ活性測定方法）

実施例 1記載の方法に準じ、測定した。

(プロテアーゼ活性測定方法）

実施例 1記載の方法に準じ、測定した。

実施例 1の結果と同様に、 pH 9で 6 11時 5間保持してもトランスグル夕ミナ一ゼ相対活性値とプロテア一ゼ相対活性値に差は認められなかったのに対し、 p H 9より高い条件で保持した場合では、トランスグル夕ミナーゼ相対活性値よりプロテア一ゼ相対活性値の方が低いことが確認された（図 2) 。さらには、 pH 1 1以上で 3 0分以上処理することにより、トランスダル夕ミナ一ゼ相対活性を 80%以上に保つたまま、プロテアーゼ相対活性を 20 %以下に低減することが可能であることが確認された。さらに、 pH 12以上 30分以上処理することにより、トランスグル夕ミナ一ゼ相対活性を 80 %以上に保ったまま、プロテアーゼ相対活性を 1 0%以下に低減することが可能であることが認められた。

実施例 3

(トランスダル夕ミナ一ゼの処理方法）

試料トランスダル夕ミナ一ゼ〔商品名「ァクティバ TG」、味の素（株）社製〕 1 gを蒸留水 20 gに溶解した水溶液 0. 4 gを、？^1 1に調製した0. 1M GTA b u f f e r 1. 6 gに混合した。調製した水溶液を 1 0、 20、 30、 40、 50°Cで 30分保持したものを試料液とした。

(トランスダルタミナ一ゼ活性測定方法）

実施例 1記載の方法に準じ、測定した。

(プロテアーゼ活性測定方法）

実施例 1記載の方法に準じ、測定した。各温度帯でトランスダル夕ミナーゼ水溶液を保持することにより、プロテアーゼ活性を低下させることができることが確認された（図 3) 。ただし、 50°Cで保持した場合には、トランスグル夕ミナ一ゼ活性の低下も顕著であることから、 50°C 未満で保持条件により、トランスグル夕ミナ一ゼ活性を維持したまま、プロテア一ゼ活性を低減させることができることが確認された。

実施例 4

プロテア一ゼ活性.ノトランスダル夕ミナ一ゼ活性が 0. 00024より大きい試料トランスグルタミナ一ゼ〔商品名「ァクティバ TG」、味の素（株）社製〕 0. 18 g、魚コラーゲン〔Kemiy&Ross Ltd.製〕 1. 2 gを、水 1 2 gに溶解し、トランスグル夕ミナーゼ魚コラーゲン水溶液とした。

調製した卜ランスダル夕ミナーゼ魚コラーゲン水溶液を豚もも肉の小片（約 2 c m角） 300 gを添加し混合後、無水リン酸 3ナトリウム 0. 3 g添加し、さらに混合し折り幅 75 m mのケ一シングチューブに詰めた。

別試験区として、上述のとおり調製したトランスグル夕ミナーゼ魚コラーゲン溶液に無水リン酸 3ナトリウム 0. 3 gを添加混合し、 pH 1 1の水溶液を調製した。この pH 1 1水溶液にて 25°Cで、 30分および 2時間保持した後、それぞれの水溶液を豚もも肉の小片（約 2 cm角） 300 gへ添加し、混合後折り幅 75 mm のケ一シングチューブに詰めた。

上述のとおりケーシングチューブに詰めたトランスグル夕ミナ一ゼ魚コラーゲン水溶液と豚もも肉混合物を 5 °C 2時間放置し、トランスダル夕ミナーゼ反応を進行させた。放置後、一 40^DCの冷凍庫に入れ、評価するまで冷凍保存した。冷凍したトランスグルタミナ一ゼ魚コラーゲン水溶液と豚もも肉混合物を厚さ 9 mm、幅 2 . 5 cmにスライスし、解凍後、 Stable Micro Systems社製テクスチャ一アナライザ一で引つ張り試験により接着強度を測定した。

実用的な最低限の接着強度は経験的に 50 g/' cm²とされている。結果より、 pH 1 1で処理を行わなかつたトランスグルタミナ一ゼ魚コラ一ゲン水溶液を使用した場合の接着強度は実用的な最低限の接着強度 50 g/ cm²以下であった（図 4) 。一方、同じ試料トランスグルタミナ一ゼを用い pH 1 1水溶液で 30分、 2 時間処理した場合、実用強度 50 gパ cm²以上の接着強度が得られることが確認された。実用強度が得られなかつた試料トランスグル夕ミナーゼ中のプロテア一ゼ活性が、 pHl 1水溶液で保持することで、トランスダル夕ミナーゼ活性を低下させることなく低減され、実用強度が得られたと考えられる。

実施例 5

プロテア—ゼ活性ノトランスグル夕ミナ—ゼ活性が 0. 00024より大きい試料トランスグル夕ミナ一ゼ（高プロテアーゼ TG) と、 0. 00024以下の試料トランスグル夕ミナ一ゼ（低プロテアーゼ TG) 〔商品名「ァクティバ TG」、味の素（株）社製〕それぞれ 0. 336 gを 1 ? 食塩水 40m 1に添加溶解させた。トランスグル夕ミナ一ゼ水溶液に、 1？リン酸三ナトリゥム水溶液 5 m 1を添加し pHl lに調製し、 25°C 30分、保持した。その後 0. 4%フマル酸水溶液 5m 1を添加し p H 7に中和したものを p H 1 1処理卜ランスグル夕ミナ一ゼ含有物とした。一方、 1 %リン酸三ナトリゥム水溶液 5 m 1と 0. 4 %フマル酸水溶液 5 m 1をあらかじめ混合した水溶液をトランスダル夕ミナ一ゼ水溶液に添加混合したものをコントロールとし、以上処理を行ったトランスグル夕ミナーゼ含有物を用いて、下記に示す手順に従い蒲鋅を試作した。

フレークにした冷凍すり身（すけそうだら、 FA級） l O O O gをステフアンカッターで、温度が一 2〜0°Cになるまでカッティングする。食塩 30 gを添加し、氷水 350 gを加え、ステフ.アンカッターで温度が 7〜8°Ciこなるまでカッテイングする。グラニュー糖 20 g、馬鈴薯澱粉 40 g、氷水 350 g、水産練製品用製剤 2 gを加え、温度が 7〜8°Cになるまでカッティングする。得られた生地を、直径 30 mmの筒状の塩化ビニリデン製ケ一シングに詰め、 40°Cの蒸気中で 30分、続いて 85°Cの蒸気中で 20分加熱し、氷水に浸して冷却する。 ' テクスチャ一アナライザ一を用い、破断試験を行う。円柱形の蒲鋅を高さ 30m mに切断し、直径 5 mmの球形のプランジャーを蒲鋅の断面中央に対して 1 mmZ 秒の速さで突刺し、破断した時点の応力（破断応力）を測定する。蒲鋅の破断応力と、試料トランスグル夕ミナーゼ原末の各条件のプロテアーゼ活性について、 M i c 1- o s o f t社製ソフト「E X c e 1」を用いて相関係数を求める。

経験的に蒲鋅の破断強度を比較する場合、強度の差が 5 %以上あれば食感上の差異が認められる。結果を図 5に示す。図 5より低プロテアーゼ TGの蒲鋅破断応力を 1 00 % (5 1 1. 0 g) としたときの高プロテア一ゼ TG蒲鋅破断応力は 90 . 8 % (464. 2 g) であり、食感上の差異が認められる。

一方、高プロテアーゼ TGを pH 1 1で 30分保持した場合には、蒲鋅破断応力は 99. 6 % (509. 1 g) となり、食感上差異が認められない強度になることが確認された。高プロテア一ゼ活性の卜ランスグル夕ミナ一ゼ含有物を、 pH l l 水溶液で保持することで、トランスダルタミナーゼ活性を低下させることなくプロテアーゼ活性が低減され、低プロテアーゼ活性のトランスグル夕ミナ一ゼ含有物と同等の効果が得られたと考えられる。産業上の利用可能性

以上に詳述したとおり、本発明の方法によれば、卜ランスダル夕ミナ一ゼ活性を低減させずに、選択的にプロテア一ゼ活性を低減することができるので、より高品質のトランスダル夕ミナ一ゼ製剤を製造することが可能である。トランスダルタミナ一ゼの基質となるグルタミン残基を有するタンパク質を含む各種素材の品質改善のための添加剤、特に接着製剤用、水産練製品製剤用の成分として有用な高品質の卜ランスグル夕ミナーゼ含有物を安価に提供することができるので、上記タンパク質含有素材の利用分野を食品分野以外の分野にも拡大せしめるものである。本出願は日本国で出願された特許出願番号 2005-248771を基礎としており、その内容は本明細書中に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1 . プロテア一ゼが夾雑するトランスグル夕ミナーゼ含有物を温度 0 °C以上 5 0 °C 未満、 p H 9 . 0より高く p H 1 3 . 0未満で、 1 0分以上 6 0時間以下保持することからなるプロテァ一ゼ活性が低減されているトランスグル夕ミナ一ゼ含有物の製造方法。

2 . 前記保持が、トランスグル夕ミナーゼ含有物におけるプロテア一ゼ活性トランスグル夕ミナ一ゼ活性を 0 . 0 0 0 2 4以下となるまで保持することからなる請求項 1記載のトランスダルタミナーゼ含有物の製造方法。

3 . 前記保持が、発酵法によるトランスグル夕ミナ一ゼ含有物の製造工程において、発酵液から卜ランスダル夕ミナーゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる請求項 1又は.2に記載のトランスダル夕ミナ一ゼ含有物の製造方法。

4 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の製造方法によって製造されたプロテア一ゼ活性が低減されているトランスグル夕ミナ一ゼ含有物。

5 . 請求項 4に記載のトランスグル夕ミナーゼ含有物と副剤からなるトランスグル夕ミナーゼ製剤。

6 . 請求項 4に記載のトランスダルタミナーゼ含有物と夕ンパク質含有素材からなる接着用トランスグル夕ミナーゼ製剤。

7 . 請求項 4に記載のトランスダルタミナ一ゼ含有物とコラーゲン及び又は乳蛋白からなる接着用トランスダル夕ミナ一ゼ製剤。

8 . 請求項 4に記載のトランスダル夕ミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、力ルシゥム塩類、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤からなる水産練製品用トランスダル夕ミナーゼ製剤。

9 . 請求項 4 ~ 7のいずれか 1項に記載のトランスグル夕ミナーゼ含有物を用いた、接着成型食品の製造方法。

1 0 . 請求項 4に記載のトランスダル夕ミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び./又は乳蛋白とを混合した溶液を、食品原材料に添加することからなる接着成型食品の製造方法。

1 1. 請求項 4、 5、 8のいずれか 1項に記載のトランスダル夕ミナーゼ含有物を魚肉すり身に添加することからなる水産練製品の製造方法。