WO2006016468A1

WO2006016468A1 - リポソーム含有製剤の製造方法

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Publication number: WO2006016468A1
Application number: PCT/JP2005/013309
Authority: WO
Inventors: Chiaki Nagaike; Yasuyuki Motokui
Original assignee: Konica Minolta Medical and Graphic Inc
Current assignee: Konica Minolta Medical and Graphic Inc
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2007-02-11
Also published as: EP1776948A4; EP1776948B1; EP1776948A1; NO20070764L; JPWO2006016468A1; US20060034907A1; JP5176320B2; US8480952B2

Abstract

　本発明は、生体内での安定性に優れ、さらに薬物の内包率が高いリポソームを含んでなるリポソーム含有製剤の製造方法、該方法により得られたリポソーム含有製剤を提供する。　本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法は、超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するリポソーム膜構成物質と、水溶性薬物とを、圧力容器内で混合した後に、該圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出することにより水溶性薬剤が内包されたリポソームの水性分散液を調製することを特徴とする。

Description

明細書

リボソーム含有製剤の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、生体内での安定性に優れ、かつ薬物の内包化率が高いリボソームを含んでなるリボソーム含有製剤の製造方法、および該方法により得られたリボソーム含有製剤に関する。

背景技術

[0002] リボソームは、主にリン脂質によって形成される二分子膜 (リボソーム膜)の閉鎖小胞体であり、生体膜と類似の構造や機能を有するため、従来から様々な製剤材料として用いられてきている。リボソームは、内部に有する水相には水溶性薬物を、二分子膜の内部には油溶性の薬物を保持するという、いわゆるカプセル構造を構築できることから、診断、治療、化粧などの様々な分野で用いられてきている。さらに、近年では、薬物送達システム（DDS)への応用が盛んに研究されている。

[0003] このような薬物が内包されたリボソームを調製するには、従来力 Bangham法や逆相蒸発法 (REV法)などが用いられている。これらの方法では、素材としての安全性が高ぐ生体内で適度な分解性を有するリボソームの中に薬物を内包させて、るにもかかわらず、製造過程においてリボソーム膜を構成するリン脂質の溶剤として、有機溶媒を使用する必要がある。そのため、上記方法で得られるリボソーム含有製剤においては、完全に除去できな力つた有機溶媒が製剤中に残留する問題があり、人体への副作用が生ずる問題があった。

[0004] さらに、従来の方法では、リボソーム内に薬物を充分に内包させることができず、リポソーム含有製剤を大量に投与する必要があるため患者に過度の負担となる問題があった。このように、治療用薬剤に比べて投与量が多くなる診断用造影剤への応用を考えた場合、造影物質の保持効率（内包率)が高いリボソーム含有製剤が求められていた。

[0005] 一方、特許文献 1には、超臨界二酸化炭素を用いて、水溶性電解質の薬物が内包されたリボソームを製造する方法が開示されている。この方法は、製造条件を種々設定することが可能であることから、従来のリボソームの懸濁液の製造方法に比べ、比較的容易に水溶性薬物の内包率を向上させることができる。し力しながら、特許文献

1に記載の超臨界二酸化炭素を用いた方法は、従来の方法に比べ水溶性薬物の内包率が向上したリボソームを調製することができるものの、その内包率に改良の余地かあつた。

[0006] また、診断及び治療用の薬物を包含する用途に用いられているリボソームは、生体内で不安定であると、リボソーム膜が破壊され内包されていた薬物が早期に流出してしまう。したがって、薬物を所望の部位に送達することができず、さらにリボソームの一つの機能である徐放性を制御するのが困難である問題があった。したがって、生体内での安定性に優れるリボソームが求められていた。

[0007] そのような問題を解決するものとして、 15°Cでの pHが 9. 5以下でありかつアンモ- ァまたは水溶性アミンを含む緩衝液を分散液に含有させることによってリボソームの安定性を向上させる方法が開示されている (特許文献 2参照)。しかしながら、このような方法によって得られるリボソームであっても、生体内での安定性には依然として問題があった。

[0008] 本発明は、従来技術の問題を解決するものであって、生体内での安定性に優れ、薬物の内包率が高いリボソームを含んでなるリボソーム含有製剤の製造方法、およびリボソーム含有製剤を提供することを目的とする。

特許文献 1：特開 2003— 119120号公報

特許文献 2：特表 2000 - 515487号公報

発明の開示

[0009] 本発明の上記目的は、下記の各々の構成によって達成される。

[0010] 本発明に係るリボソーム含有製剤の製造方法は、超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するリボソーム膜構成物質と、薬物とを混合することを特徴とする。

[0011] 前記リン脂質の転移温度が、 22〜60°Cの範囲にあることが好ましい。

[0012] 前記超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素と、前記リボソーム膜構成物質と、前記薬物とを強攪拌下で混合することにより、リボソームへの薬物の内包率を向上させることも好まし、。

[0013] 前記転移温度を有するリン脂質力ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素添カ卩大豆レシチン、水素添カ卩大豆ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンカもなる群より 1種以上選ばれることが好ましく、ジミリストイルホスファチジルコリンおよび Zまたはジパルミトイルホスファチジルコリンであることが特に好ましい。

[0014] 前記薬物が、造影化合物または抗がん性物質であることが好ま、。

[0015] 本発明に係るリボソーム含有製剤は、前記の方法によって製造されたことを特徴とする。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 本発明に係るリボソーム含有製剤の製造方法は、超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素 (以下、単に「超臨界二酸ィ匕炭素」ともいう）と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するリボソーム膜構成物質と、薬物とを混合してリボソームを調製する方法である。

[0017] (リボソーム膜構成成分）

本発明に用いられるリボソーム膜構成成分としては、通常リン脂質および Zまたは糖脂質が好ましく使用され、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有する。

[0018] リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリンなどに代表されるリン脂質が挙げられる。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品など、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなぐ飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。

[0019] 具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC)、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMP C)、ジォレイルホスファチジルコリン（DOPC)、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミンなどが挙げられる。

[0020] 上記中性リン脂質のほかに、ァ-オン性リン脂質、カチオン性リン脂質といった荷電リン脂質、さらには重合性リン脂質、ならびにカチオン性 (正荷電)脂質を含んでもよい。

[0021] 負に荷電したリン脂質として、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール (DPPG)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール (DSPG)、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS)、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS)、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI)、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI)、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA)、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA)、ジミリストイルホスファチジン酸などを挙げることができる。

[0022] カチオン性リン脂質として、ホスファチジン酸とァミノアルコールとのエステル、たとえばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA)もしくはジステアロイルホスファチジン酸（ DSPA)とヒドロキシエチレンジァミンとのエステルなどが挙げられる。

[0023] 本発明におヽて用いられるリン脂質には、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含む。リン脂質の「(相)転移温度」とは、リン脂質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度である。その測定は、示差走査熱量計 (DSC)を使用する示差熱分析による。リン脂質の転移温度は、 22〜60°C、好ましくは 30〜60°C、さらに好ましくは 40〜55°Cであることが望まし!/、。

[0024] 相転移温度を有するリン脂質としては、ジミリストイルホスファチジルコリン (相転移温度（以下同じ）： 23〜24°C)、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41. 0〜41. 5°C )、水素添カ卩大豆レシチン（53°C)、水素添カ卩大豆ホスファチジルコリン（54°C)、ジステアロイルホスファチジルコリン（54. 1-58. 0°C)などが挙げられ、好ましくはジミリストィルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、さらに好ましくはジパルミトイルホスファチジルコリンを用いることが望ましい。本発明においては、これら力選択される 1種または 2種以上組み合わせて用いられる。

[0025] これらの相転移温度を有するリン脂質は、脂質全質量に対して 40〜： LOO質量％、好ましくは 50〜80質量％となる量で用いることが望ましい。この相転移温度を有するリン脂質を上記の量で用いることにより、後述する混合温度において生体内での安定性に優れたリボソームを調製することができる。

[0026] 本発明で用いられるリン脂質は、通常、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するが、その他のリン脂質を 1種または 2種以上併用してもよい。ただし 2種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リボソームの凝集防止の観点から望ましい。

[0027] カチオン性脂質の例としては、 1、 2 ジォレオイルォキシ 3— (トリメチルアンモ- ゥム）プロパン（DOTAP)、 N、 N ジォクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS) 、ジメチルジォクタデシルアンモ-ゥムブロミド（DDAB)、 N— [1— (2、 3 ジォレイルォキシ）プロピル]— N、 N、 N トリメチルアンモ -ゥムクロリド（DOTMA)、 2、 3— ジォレイルォキシー N— [2 (スペルミンカルボキサミド）ェチル] N、 N ジメチル - 1 プロパンアミ-ゥムトリフルォロアセテート（DOSPA)および N— [1— (2、 3— ジミリスチルォキシ）プロピル] N、 N ジメチルー N— (2—ヒドロキシェチル）アンモ-ゥムブロミド（DMRIE)などが挙げられる。

[0028] 糖脂質としては、ジガラタトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセ口脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラタトシルセラミド、ガンダリオシド G7、ガングリオシド G6、ガンダリオシド G4などのスフインゴ糖脂質などを挙げることができる。

[0029] リボソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロ一ノレ、コレステロ一ノレエステノレ、フィトステロ一ノレ、シトステロ一ノレ、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロールなどが挙げられる。また 1 O—ステロールダルコシド， l—O—ステロールマルトシドまたは l— O—ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリボソームの安定ィ匕に効果があることが示されて、る（特開平 5— 245357号公報)。特にコレステロールが好ましい。

[0030] ステロール類の使用量として、リン脂質 1重量部に対して 0. 05〜： L 5重量部、好ましくは 0. 2〜1重量部、より好ましくは 0. 3〜0. 8重量部の割合が望ましい。 0. 05重量部未満であると混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定ィ匕が発揮されず、 1. 5重量部を超えるとリボソームの形成が阻害される力形成されても不安定となる。

[0031] リボソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンォキシド導入用のアンカーにもなり得る。特開平 09— 3093号公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、種々の機能性物質を共有結合により固定ィ匕することができ、リボソーム形成用の成分として利用することができる新規なコレステロール誘導体が開示されている。

[0032] 上記ステロール類の他にリボソーム膜の構成成分として、グリコール類をカ卩えてもよい。グリコール類として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコーノレ、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、 1, 4 ブタンジオールなどが挙げられる。グリコール類の使用量として、脂質全質量に対して 0. 01〜20質量％、好ましくは 0. 5〜10質量％の割合が望ましい。

[0033] 本発明では、リボソーム膜の一成分として、ポリエチレングリコール (PEG)基を有する化合物、好ましくはポリエチレングリコール基を有するリン脂質またはコレステロ一ルを用いることが望ましい。誘導体化されるリン脂質は、上記に例示されたリン脂質から適宜選択される。ポリエチレングリコール (PEG)基を有する化合物は、一（CH CH

2

O) Hであらわされる PEG基のォキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜

2 n

変えることにより、その機能を調節することができる。 PEG基として、ォキシエチレン単位（n)力 O〜3500、好ましくは 100〜2000のポリエチレングリコールが好適である。ポリエチレングリコールを使用する場合の使用量は、該リボソームを構成する脂質に対して 0. 1〜30質量⁰ /₀、好ましくは 1〜15質量％程度含むのがよい。ポリエチレングリコール基を有する化合物は、特開平 7— 165770号に記載の方法により製造することができる。

[0034] このようなポリエチレングリコール基を有する化合物を超臨界二酸ィ匕炭素への溶解助剤として用いてリボソームを調製すると、有機溶媒を使用することなく内包率の高!ヽリボソームを調製することができる。

[0035] (薬物）

本発明で用いられる薬物は、脂質膜内またはその内部水相に内包させる薬物類であり、具体的には、造影物質、杭がん性物質、抗真菌物質、抗酸化性物質、抗菌性物質、抗炎症性物質、血行促進性物質、美白物質、肌荒れ防止物質、老化防止物質、発毛促進性物質、保湿性物質、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などの薬物が挙げられる。

[0036] 本発明で用いられる薬物が水溶性である場合には、所定量の水性媒体に従来公知の方法で溶解させて水溶液として用いられる。水溶性薬物の濃度は、薬物の溶解度、製造条件に応じて適宜選択される。水性媒体には、蒸留水、局方注射用水、純水などの水のほか、生理食塩水、各種緩衝液、塩類などを含む水溶液などが用いられる。

[0037] 本発明のリボソーム含有製剤は、水溶性薬物として造影性物質、または抗がん性物質を用いることが好まし、。

[0038] 造影物質としては、水溶性ヨウドィ匕合物を用いることができる。水溶性ョウド化合物は、造影性があればイオン性、非イオン性を問わず、特に規定されない。一般的には非イオン性ヨウドィ匕合物の方が、イオン性ヨウドィ匕合物よりも浸透圧が低ぐ投与された人体に対する負荷が小さ!/、ためにより望ま U、。水溶性の非イオン性ヨウドィ匕合物としてヨウ化フエ-ルを含み、例えば 2, 4, 6 トリョードフエ-ル基を少なくとも 1個有する非イオン性ョウド化合物が好適である。

[0039] そのような非イオン性ョウド化合物として、具体的には、ィォパミドール (Iopamidol) 、ィオメプロ一ノレ (Iomeprol)、ィォへキソーノレ (Iohexol)、ィォペントーノレ (Iopentol )、ィォプ口ド (Iopromide、ィォシド (Iosimide)、ィォぺノレソーノレ (Ioversol)、 Λ オトロラン（Iotrolan)、ィオタズル（Iotasul)、ィォジキサノール（Iodixanol)、ィォデシノモール（Iodecimol)、 (1, 3 ビス一（N— 3, 5 ビス一 [2, 3 ジヒドロキシプロピルアミノカルボ-ル] 2, 4, 6 トリョードフエ-ル）一 N ヒドロキシァセチルァミノ )プロパンなどが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよぐあるいは 2種以上を組み合わせて用いてもょ、。

[0040] 本発明のリボソーム含有製剤を X線検査用造影剤として用いる場合、好適なョウド化合物としては、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならない非ィォン性のヨウド化合物として、ィォメプロール、ィォパミドール、ィオトロラン、ィォジキサノールが好ましい。このような非電解質物質も超臨界二酸ィ匕炭素法によると、リポソ一ム内に効率良く内包することができる。

[0041] 本発明のリボソーム含有製剤における水溶性ヨウドィ匕合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リボソーム内に封入されたヨウドィ匕合物の量は、典型的には X線造影剤における全ョウド化合物の 5〜40質量％、好ましくは 5〜35質量％、より好ましくは 10〜25質量％であることが望ましい。この内包化率はリボソーム粒子の細密充填の限界を下回るため、リボソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。

[0042] 抗がん化合物としては、具体的には、メトトレキサート、ドキソルビシン、ェビルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトボシド、エリブシチン、カプトデシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスブラチン、ブレドニゾンなどが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよぐあるいは 2種以上を組み合わせて用いてもょヽ

[0043] なお本明細書において、上記化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。

[0044] 以下に、このような成分を用いた本発明に係るリボソーム含有製剤の製造方法を詳細に説明する。

[0045] 本発明に係るリボソーム含有製剤の製造方法は、具体的には、

圧力容器内で、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するリボソーム膜構成成分と、液化二酸化炭素と、必要に応じて親油性の薬物とを攪拌混合し (工程 1)、次いで、圧力容器内を 32〜55°Cに加温するとともに加圧することにより液ィ匕ニ酸化炭素を超臨界もしくは亜臨界状態とし (工程 2)、

リボソーム膜構成成分と、超臨界二酸ィ匕炭素とを攪拌混合しながら水溶性薬物の水溶液を供給して、混合溶液を調製し (工程 3)、

前記混合溶液を得た後に、圧力容器内を減圧して混合溶液から二酸化炭素を排出し、薬物が内包されたリボソームの水性分散液を調製する（工程 4)ことにより行われる。 [0046] さらに、リボソームの水性分散液を、 0. 1〜0. 45 μ mの孔径を有する濾過膜で濾過する（第 5工程)ことも好ま、。

[0047] 以下、各工程に沿って説明する。

[0048] 工程 1

工程 1では、圧力容器内で、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するリポソーム膜構成成分と、液化二酸化炭素と、必要に応じて親油性の薬物とを攪拌混合する。これらの添加順序は特に限定されず、また攪拌条件は、これらを混合することができれば特に限定されな、。

[0049] 圧力容器としては、 500気圧まで耐圧可能であり、内部をガラス窓により目視観察することができるように構成されて、るステンレス製のオートクレープが好ましく用いられる。

[0050] リボソーム膜構成成分の添加量は、薬物の種類、製剤スケール等に応じて適宜決定され、一方、必要に応じて用いられる親油性薬物の添加量は、親油性薬物の活性や、リボソームの内包化率等に応じて適宜決定される。

[0051] 本発明にお、ては、各工程にぉ、て、圧力容器内や、圧力容器に投入される薬物、液化二酸化炭素、気体などは無菌状態に管理されていることが好ましぐさらに圧力容器内に投入する際には濾過手段などにより滅菌することが好ましい。

[0052] 工程 2

工程 2では、圧力容器内を 32〜55°Cに加温するとともに加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とする。本発明においては、亜臨界状態を含めて超臨界状態とする。

[0053] 本発明の製造方法で使用する超臨界状態の二酸化炭素の温度は、 32〜55°C、好ましくは 32〜50°C、さらに好ましくは 35〜50°Cであることが望ましい。また、超臨界状態の二酸化炭素の好適な圧力は、上記温度範囲から適宜選択されるが、 50〜 500kgZcm²、好ましくは 100〜400kg/cm²である。

[0054] 本発明にお、ては、このように体温に近、温度で二酸化炭素を超臨界状態としてリン脂質力リボソームを形成しているため、リボソームの形成温度と、製剤として投与された後にリボソームが生体内で受ける温度 (体温）とが略等しい。したがって、本発明のリボソーム製剤が生体内に投与された後に、生体内においてリボソームが体温で加温されても、力かる温度はリボソームが形成した際の温度と略等しいことから、リン脂質の配列が温度による影響をほとんど受けることがなぐリボソームの生体内での安定性が向上すると考えられる。

[0055] このような効果は、超臨界状態の二酸化炭素の温度を、上記温度範囲の転移温度を有するリン脂質に対し、「転移温度 + 10°C」以下、好ましくは「転移温度 + 5°C」以下、さらに好ましくは「転移温度」以下となるように設定することにより、さらに顕著となる。従来は、「リン脂質の転移温度 + 20°C程度」に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となって流動性が高まり、リン脂質が超臨界二酸ィ匕炭素と効率良く混合され、リボソームの調製が容易となるため好ましく行われていた。しかしながら、本発明者らは、超臨界状態の二酸化炭素の温度を、上記のようにリン脂質の転移温度付近またはそれ以下とすることにより、リン脂質に過度の熱が力からないため変性することがなぐさらにリン脂質が規則的に配列してリボソーム膜が生成されることを見出し、本発明を完成させたのである。このようにして得られるリボソームは膜構造が安定するためリボソームの徐放性を制御するのが容易となり、さらに生体内での安定性が向上するため所望の部位に薬物を選択的に送達することができる。

[0056] 工程 3

工程 3では、リボソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素とを所定の攪拌手段により攪拌混合しながら、薬物水溶液を供給して、混合溶液を調製する。上記攪拌条件は、強攪拌であることが好ましい。

[0057] 「強攪拌」とは、混合溶液の容量や攪拌手段によって好ましい範囲が異なるが、例えば、混合溶液の容量が 10〜： LOOml程度の場合において、長さ 15mm、直径 5mm の略円柱状の攪拌子を用い、マグネチックスターラーで回転数 400〜4000rpm、好ましくは 1000〜1500rpmで攪拌することを意味する。なお、混合溶液の容量ゃ攪拌手段が上記とは異なる場合であっても、前記攪拌条件で混合溶液に与えられるせん断カ等を考慮して、適宜攪拌条件を定めることが好ましい。具体的には、攪拌条件が以下の式を満たすことが特に好ま、。

[0058] 式： C = N X V"⁰· ¹⁵

C :回転数 (rpm) V:混合溶液の容量 (L)

N : 300〜3000

また、強攪拌の時間は、 1〜120分間、好ましくは 5〜60分間であることが望ましい。なお、上記強攪拌の時間には、薬物水溶液を供給する時間も含む。

[0059] このような条件を満たす強攪拌下で、リボソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素とを所定の時間混合することにより、リボソームの生成率がより高ぐ薬物の内包率がより高いリボソームを含有する製剤を得ることができる。すなわち、このような条件で強攪拌することにより、リボソームの生成が促進され、薬物の内包率も向上する。

[0060] したがって、本発明においては、上記の温度で二酸ィ匕炭素を超臨界もしくは亜臨界状態とし、さらに強攪拌下で超臨界二酸ィ匕炭素とリボソーム膜構成成分とを所定の時間混合することが特に好ましぐこれにより、生体内での安定性が向上し、さらに薬物の内包率がより高いリボソームを含んでなるリボソーム含有製剤を得ることができる。さらに、この範囲の中でも、より長時間超臨界状態を維持し強攪拌を継続することにより、リボソームへの薬物の内包率が高い傾向が認められる。

[0061] また、強攪拌下で超臨界二酸ィ匕炭素とリボソーム膜構成成分とを所定の時間混合する際に、超音波を印加することも好ましい。超音波を印加することにより、リボソーム膜構成成分 (脂質)を微細な粒子として超臨界二酸ィ匕炭素に分散させることができ、リボソームの生成率と薬物の内包率がより高いリボソーム含有製剤を調製することができる。

[0062] 本発明のリボソーム含有製剤の製造方法においては、（1)圧力容器内で、リポソ一ム膜構成成分と、液化二酸化炭素と、必要に応じて親油性の薬物とを攪拌混合し、 ( 2)次いで、圧力容器内を加温加圧して液ィ匕ニ酸ィ匕炭素を超臨界もしくは亜臨界状態とし、（3)リボソーム膜構成成分と、超臨界二酸ィ匕炭素とを攪拌混合しながら薬物水溶液を供給して、混合溶液を調製する、態様によって説明したが、

(1)圧力容器内で、リボソーム膜構成成分と、薬物水溶液と、必要に応じて親油性の薬物とを攪拌混合し、（2)次いで、液化二酸化炭素を該圧力容器内に供給し、該圧力容器内を加温加圧して液化二酸化炭素を超臨界状態とし、 (3)リボソーム膜構成成分と、薬物と、超臨界二酸化炭素とを所定の時間混合して混合溶液を調製する、ことも好ましい。このような態様の製造工程によれば、超臨界二酸化炭素を生成した後に水溶性薬物を添加する必要がないため、圧力容器内の温度および圧力の制御が容易であり、リボソームの生成率と薬物の内包率がより向上する。

[0063] 懸濁液は、リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とは、圧力容器内に投入された後に混合して調製してもよいが、工程 1の好ましい態様においては、予め混合して懸濁液とし、この懸濁液を圧力容器内に供給する。予め懸濁液とすることにより、リポソ一ム膜構成成分と薬剤水溶液を、圧力容器内に容易に供給することができるとともに、リボソームの生成率と薬剤の内包率を向上させることができる。

[0064] また、本発明における工程 1の別の好ましい態様においては、薬剤水溶液と溶解助剤とを混合し、次いで、さらにリボソーム膜構成成分を混合して懸濁液を調製する。薬剤水溶液に予め溶解助剤を分散させておくことにより、薬剤水溶液中にリボソーム膜構成成分を溶解させることができるため、上記効果に優れる。

[0065] また、本発明における工程 1の更に別の好ましい態様においては、リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混合する際に、または薬剤水溶液と溶解助剤とを混合し、次いで、さらにリボソーム膜構成成分を混合して懸濁液を調製する際に、超音波を照射して懸濁液を調製し、この懸濁液を圧力容器内に供給する。

[0066] 超音波の照射条件は、リボソームの懸濁液に含有されるリボソームの形態、粒子径分布、内包化率等により適宜選択される力 10〜： LOOkHz、好ましくは 15〜45kHz の超音波を、 l〜600wZmlZ分、好ましくは 5〜500wZmlZ分照射することが望ましい。照射量は、使用する超音波分散機の定格出力、照射する分散液の量、照射する時間力計算することができる。

[0067] このような照射条件で懸濁液を調製することにより、リボソーム膜構成成分 (脂質)を薬剤水溶液に微細な粒子として分散させることができ、実生産スケールの製造装置においても、リボソームの生成率と薬剤の内包率が高いリボソーム含有製剤を調製することができる。このような効果は、上記条件で超音波を照射して懸濁液を調製することにより懸濁液中でリン脂質の配列が開始されており、その後、懸濁液と超臨界二酸化炭素とを混合してリボソームを形成する際に、その形成を促進するためと考えられる。 [0068] さらに、リボソーム膜構成成分と薬剤水溶液とを混合する際に、上記の条件で超音波を照射するとともに、リン脂質の転移温度〜転移温度 + 50°C (ただし 100°Cを超えな、）に加温して懸濁液を調製することがさらに好ま、。

[0069] 工程 1にお、ては、上記のような懸濁液を収容して、る圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給する。

[0070] 液化二酸化炭素は、従来公知の方法により、気体の二酸化炭素を冷却、加圧することによって調製される。得られた液化二酸化炭素を、液体状態を維持しながら圧力容器内に供給する。圧力容器内への供給は、特に限定されず、一度に添加してもよぐ間欠的に添加してもよい。また、液ィ匕ニ酸ィ匕炭素の供給量は、リボソーム膜構成成分や水溶性薬剤の種類、製造スケールなどにより適宜選択される。

[0071] 工程 4

工程 4では、第 3工程において、リボソーム膜構成成分と、超臨界二酸化炭素と、薬物の水溶液とを混合した後に、圧力容器内を減圧して、この混合溶液から二酸化炭素を排出し、薬物が内包されたリボソームの水性分散液を調製する。

[0072] 工程 3において、リボソームは水相に転相していると推定されるため、系内を減圧して二酸化炭素を排出すると、薬物を内包するリボソームが分散している水性分散液が生成する。造影剤を製造する場合、該リボソームの内部以外の水相に薬物が含まれていてもよい。リボソーム内部にも上記水溶液が封入されているため、造影物質はリボソームの外部水相のほ力、主としてリボソーム内部の水相に存在し、いわゆる「内包」の状態にある。

[0073] 第 5工程

第 5工程では、第 4工程により得られたリボソームの水性分散液を、 0. 1〜1. 0 m の孔径を有する濾過膜で濾過する。

[0074] 具体的には、圧力容器内が負圧となっている場合には、圧力容器内にフィルター滅菌された気体を供給する。この気体としては、大気、二酸化炭素、窒素、ヘリウム、アルゴン等が挙げられる。

[0075] このように気体を供給して圧力容器内を大気圧に調整し、リボソームの水性分散液を 0. 1〜1. O /z mの孔径を有する濾過膜で濾過する。濾過操作により、リボソームの粒径を容易に調整することができ、均一な粒径のリボソームを含有する製剤が得られる。

[0076] 具体的には、 0. 1〜1. 0 mの孔径のフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより行われる。具体的には、各種の静圧式押出し装置、たとえば「エタストルーダー」（商品名、日油リボソーム製）、「リポナイザー」（商品名、野村マイクロサイエンス製)などを使用して、フィルターを強制的に通過させる。フィルタ一は、ポリカーボネート系、セルロース系などのタイプを適宜使用することができ、押出し濾過法については、たとえば Biochim. Biophys. Acta 557卷， 9ページ（1979)に記載されている。

[0077] このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。なお、上記孔径の濾過膜で濾過する前に、 1. 0〜2. 0 m程度の濾過膜で濾過し、サイジングゃ、望ましくない物質の除去を予備的に行ってもよい。

[0078] 本発明のリボソーム含有製剤は、リボソームの水性分散液を上記のように濾過膜で濾過し、必要に応じて遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などの方法により、リボソーム内に未保持の薬物を除去して精製してもよぐまた所定の濃度となるように濃縮し、さらに通常使用される希釈剤等の製剤補助剤を適宜混合して製造することもできる。

[0079] また、本発明のリボソーム含有製剤は、常法にしたがって、リボソームの水性分散液から、リボソームを凍結乾燥させて得ることもできる。リボソームを凍結乾燥した場合には、使用直前に水性媒体などで再懸濁させて用、る。

[0080] このような本発明のリボソーム含有製剤の製造方法によれば、有機溶剤を使用する必要がなぐ薬物をリボソームに効率よく内包させることができ、さらに生体内での安定性に優れたリボソームを含んでなるリボソーム含有製剤を得ることができる。

[0081] 上述のようにして製造される本発明のリボソーム含有製剤は、薬物を内包してなるリポソームを含み、そのリボソームの平均粒径は、通常 0. 05-2. O ^ m,好ましくは 0 . 05-1. O ^ m,より好ましくは 0. 05-0. 5 mであること力 ^望まし!/ヽ。平均粒径は、治療、診断、 X線撮像の目的に応じて適切に設定することが好ましぐたとえば腫瘍部分に選択的に送達させるには、リボソームの粒径を 0. 10-0. 20 /z m、より好ましくは 0. 11〜0. 13 mnmとすることが望ましい。これにより癌組織へ選択的に薬効物質または造影剤を集中させることが可能となる。つまり、固形癌組織にある新生血管壁の孔は、正常糸且織の毛細血管壁窓（fenestra)の孔サイズ (0. 03-0. 08 ^ m 程度）に比べて異常に大きぐ 0. 1〜0. 2 m程度の大きさの分子でも血管壁力漏れ出るため、上記範囲のリボソームであれば癌組織へ選択的に集中させることができる。これは「EPR効果」として知られており、癌組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことを利用するものである。

[0082] 粒径は薬物を内包するリボソームを含む分散液を凍結し、その後破砕した界面を力一ボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること (凍結破砕 TEM法）により測定することができる。ここで「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径を指している。

[0083] さらに、上記のようにして得られるリボソームは、実質的に一枚膜もしくは数枚膜からなるリボソームである。一枚膜のリボソームとは、リン脂質二重層が一層としてなる膜（ unilamellar vesicle)で構成されるリボソームであり、凍結かつ断（Freeze fractu re )レプリカ法による透過型電子顕微鏡 (TEM)による観察にぉ、て、レプリカが概ね 1つの層として認められるリン脂質二重層によりリボソームが構成されているものである。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものが一枚膜と判定される。また、「実質的に」とは、本発明のリボソーム製剤において、このような一枚膜のリボソームまたは数枚膜で構成されるリボソームを、製剤中に含まれる全リボソームのうち、少なくとも 80%、好ましくは 90%以上含むことを意味する。

[0084] 上記の一枚膜リボソームまたは数枚膜からなるリボソームは、脂質類の溶媒として前記超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸化炭素を使用し、水による相分離方法により効率よく作製できる。一枚膜または数枚膜のリボソームは、多重層膜 (multilame liar vesicles ; MLV)からなるリボソームと比較して、リボソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点がある。これに対して従来のリボソーム作製方法によると、様々なサイズ、形態の MLVがかなりの割合で存在することが多ぐ一枚膜または数枚膜のリボソームの比率を高めるためには、さらに超音波を照射する力一定孔サイズのフィルターに何度も通すなどの操作を必要としていた。しかしながら、本発明のようにさらに、超臨界二酸ィ匕炭素を使用してリボソームを調製することにより、一枚膜リボソームまたは数枚膜からなるリボソームを効率よく調製することができ、さらにリボソーム内への薬物の内包率を向上させることができる。

[0085] 本発明のリボソーム含有製剤のように、造影剤ゃ抗がん性ィ匕合物などの薬物をリポノームに封入する場合には、抗がん性ィ匕合物などの送達効率および保持安定性に加えてリボソームの膜構成成分の重量も考慮する必要がある。具体的には、リポソ一ム内への薬物の封入量は、リボソーム膜構成成分に対して 1〜8、好ましくは 3〜8、より好ましくは 5〜8の重量比で薬物が内包されて、ることが望まし、。

[0086] リボソーム内に内包された薬物の重量比が 1未満であると、比較的多量の製剤を投入することが必要となり、結果的に薬物の送達効率が悪くなる。また製剤の粘度が増大し、注入する際に加える力が増大するため、患者に与える苦痛が大きくなる。一方、リボソーム内に内包された薬物の重量比が 8を超えると、リボソームは構造的にも不安定となり、貯蔵中または生体内に注入された後に、リボソーム力薬物が拡散、漏出する。

[0087] 本発明のリボソーム含有製剤は、そのリボソーム内に、上記したように様々な薬物類を内包させることができ、薬物の作用効果や保存安定性などを考慮して、製剤形態が決定される。造影剤ゃ抗がん性ィ匕合物などの薬物をリボソームに封入して用いる場合には、リボソーム含有製剤は注射剤または点滴注入剤として用いられ、この製剤は、非経口的に、具体的には患者の血管内に投与される。

実施例

以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する力本発明はこれらの実施例に限定されるものではな、。

[0088] 実施例 1

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC、日本油脂株式会社製） 300mgと、 PE G—リン脂質（SUNBRIGHT DSPE— 020CN、日本油脂株式会社製） lOOmgとを、ステンレス製の圧力容器に仕込み、次いで液体二酸化炭素 13gを注入した後、容器内を 50°C、 120kgZcm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま、ィォへキソール溶液（ョード含有率 240mgZmL) 10gを混合し、マグネチックスターラー（攪拌子:長さ 15mm、直径 5mmの略円柱状）を用いて回転数 lOOOr pmで 10分間激しく攪拌を行う。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm 2まで下げて二酸ィ匕炭素を排出する。容器内の圧力を利用して、容器内から分散液を排出回収して、ィォへキソールを含有するリボソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 0. 45 mで加圧濾過を行った。濾過後、リポノームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレーブ殺菌し、リボソーム含有製剤を得た。

[0089] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率： %)の測定結果を表 1に示す。

[0090] 実施例 2

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC、日本油脂株式会社製） 900mgを、ステンレス製の圧力容器に仕込み、次いで液体二酸化炭素 40gを注入し、容器内を 40°C、 120kgZcm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま、ィォパミドール溶液 (ョード含有率 200mgZmL) 40gを混合し、攪拌翼 (バタフライ型 4枚羽根、約 φ 50mm)を備えたスリーワンモーターを用いて回転数 2000rpmで 2 0分間激しく攪拌を行う。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm²まで下げて二酸ィ匕炭素を排出する。容器内の圧力を利用して、容器内から分散液を排出回収して、ィオノミドールを含有するリボソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 0. 45 mで加圧濾過を行った。濾過後、リボソームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレープ殺菌し、リボソーム含有製剤を得た。

[0091] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率： %)の測定結果を表 1に示す。

[0092] 実施例 3

ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC、日本油脂株式会社製） 300mgと、コレステロール HP (日本油脂株式会社製) 40mg、グリセロールリン脂質としてジパルミトィルホスファチジルグリセロール（COATSOME MG— 6060LS、日本油脂株式会社製） 50mgとを、ステンレス製の圧力容器に仕込み、次いで液体二酸化炭素 13g を注入した後、容器内を 48°C、 120kgZcm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま、ィォへキソール溶液 (ョード含有率 200mgZmL) 10gを混合し、マグネチックスターラー (攪拌子:長さ 15mm、直径 5mmの略円柱状)を用いて回転数 1200rpmで 3分間激しく攪拌を行う。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm²まで下げて二酸ィ匕炭素を排出する。容器内の圧力を利用して、容器内から分散液を排出回収して、ィォへキソールを含有するリボソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 0. 45 mで加圧濾過を行つた。濾過後、リボソームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレープ殺菌し、リボソーム含有製剤を得た。

[0093] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率： %)の測定結果を表 1に示す。

<測定法 >

(1)リボソーム内包率の測定

リボソーム含有製剤 0. 5gを透析膜中に入れ、生理食塩水中で 3回透析を行った後、エタノール Z水、 3Z1の中に入れてリボソームを壊し、分光光度計で吸光度を測定してリボソーム内のョード化合物量を求めた。（2)平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率：⁰ /₀)

大塚電子製電気泳動光散乱光度計 (ELS— 800型）により測定して求めた。

[0094] [表 1]

[実施例 4]

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 300mgと、ィォへキソール溶液（ョード含有率 200mg/mL) 10gとを混合した後、小型ホモジナイザー (製品名：ウルトラタラックス、 IKA Japan社製）を用いて回転数 6000rpm程度で 5分間分散して、懸濁液を得た。この懸濁液をステンレス製の圧力容器に仕込み、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gを注入した後、容器内を 60°C、 120kgZcm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま 10分間撹拌した。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm²まで下げて二酸ィ匕炭素を排出した後、容器内の圧力を利用して、容器内から分散液を排出回収して、ィォへキソールを含有するリボソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 0. 45 mで加圧濾過を行った。濾過後、リボソームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレープ殺菌し、リボソーム含有製剤を得た。

[0096] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率：％)を以下の測定法により求めた。結果を表 2に示す。

[0097] [実施例 5]

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 300mgと、 PEG—リン脂質（SUNBRI GHT DSPE-020CN,日本油脂株式会社製） lOOmgと、ィォパミドール溶液 (ョード含有率 250mg/mL) 10gとを混合した後、マグネチックスターラー (攪拌子:長さ 15mm、直径 5mmの略円柱状)を用いて回転数 1200rpm程度で 5分間激しく分散し、懸濁液を得た。この懸濁液をステンレス製の圧力容器に仕込み、次いで液体二酸化炭素 13gを注入した後、容器内を 60°C、 120kgZcm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま 5分間撹拌した。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm²まで下げて二酸ィ匕炭素を排出した後、容器内の圧力を利用して、容器内から分散液を排出回収して、ィォパミドールを含有するリボソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 1 μ mで加圧濾過を行った。濾過後、リボソームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレープ殺菌し、リボソーム含有製剤を得た。

[0098] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率：％)を以下の測定法により求めた。結果を表 2に示す。

[0099] [実施例 6]

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 300mgと、コレステロール HP (日本油脂株式会社製) 40mgと、グリセロール脂質としてジパルミトイルホスファチジルグリセロール（COATSOME MG— 6060LS、日本油脂株式会社製） 50mgと、ィォパミドール溶液 (ョード含有率 250mgZmL) 10gを混合した後、小型ホモジナイザー (製品名：ウルトラタラックス、 IKA Japan社製）を用いて回転数 6000rpm程度で 3分間分散して、懸濁液を得た。この懸濁液をステンレス製の圧力容器に仕込み、次いで液体二酸化炭素 13gを注入した後、容器内を 55°C、 120kg/cm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま 5分間撹拌した。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm²まで下げて二酸ィ匕炭素を排出した後、容器内の圧力を利用して、容器内から分散液を排出回収して、ィォパミドールを含有するリポソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 1 μ mでカロ圧濾過を行った。濾過後、リボソームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレープ殺菌し、リボソーム含有製剤を得た。

[0100] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率：％)を以下の測定法により求めた。結果を表 2に示す。

[0101] [実施例 7]

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 300mgと、コレステロール HP (日本油脂株式会社製） 40mgと、 PEG—リン脂質（SUNBRIGHT DSPE— 020CN、日本油脂株式会社製） lOOmgと、ドキソルビシン lOmgを生理食塩水 10mlに溶解してなる薬剤溶液とを混合した後、小型ホモジナイザー (製品名：ウルトラタラックス、 IKA J apan社製)を用いて回転数 6000rpm程度で 3分間分散して、懸濁液を得た。この懸濁液をステンレス製の圧力容器に仕込み、次、で液体二酸ィ匕炭素 13gを注入した後、容器内を 60°C、 120kgZcm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま 5分間撹拌した。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm²まで下げて二酸化炭素を排出した後、容器内の圧力を利用して、容器内から分散液を排出回収して、ドキソルビシンを含有するリボソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 0. 45 mで加圧濾過を行った。濾過後、リポソームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレーブ殺菌し、リボソーム含有製剤を得た。

[0102] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率：％)を以下の測定法により求めた。結果を表 2に示す。 [0103] [実施例 8]

ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC) 300mgと、コレステロール HP (日本油脂株式会社製） 60mgと、グリセロール脂質としてジパルミトイルホスファチジルグリセロール（COATSOME MG— 6060LS、日本油脂株式会社製） 20mgと、ィォパミドール溶液 (ョード含有率 250mgZmL) 10gを混合した後、 20kHzの超音波を照射しながら、マグネチックスターラー (攪拌子:長さ 15mm、直径 5mmの略円柱状)を用いて回転数 1200rpm程度で 5分間激しく分散し、懸濁液を得た。この懸濁液をステンレス製の圧力容器に仕込み、次いで液体二酸ィ匕炭素 13gを注入した後、容器内を 55°C、 120kgZcm²として二酸ィ匕炭素を超臨界状態にし、その状態を維持したまま 20分間撹拌した。その後、圧力容器内を減圧して圧力を約 lOkgZcm²まで下げて二酸ィ匕炭素を排出した後、容器内の圧力を利用して、容器内力ゝら分散液を排出回収して、ィオノミドールを含有するリボソームの分散液を得た。さらに、得られた分散液をセルロース系フィルター 0. 45 μ mでカ卩圧濾過を行った。濾過後、リボソームの分散液をガラスバイアル中に入れ、 121°Cで 20分間の条件でオートクレープ殺菌し、リポソーム含有製剤を得た。

[0104] 製剤中に含まれるリボソームの薬剤内包率、平均粒径、粒度分布（1 μ m以上の比率：％)を以下の測定法により求めた。結果を表 2に示す。

[0105] [表 2]

1 jU m以上添加順内包率平均粒径

；比ロ方） £ の比率

1→2→3 (% ) ( jU m )

( % ) 実施例 4 膜成分→薬剤→c o ₂ ホモジナイザー 1 7 0. 3 1 < 5 実施例 5 膜成分→薬剤→0 0₂ 攪拌子 1 6 0 . 3 5 9 実施例 6 膜成分→薬剤→0 0₂ ホモジナイザー 1 7 0 . 2 6 8 実施例 7 膜成分→薬剤→0 0₂ ホモジナイザー 1 9 0 . 2 9 < 5 実施例 8 膜成分→薬剤→0 0₂ 超音波 +攪拌子 1 7 0 . 2 2 < 5

Claims

請求の範囲

[1] 超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するリボソーム膜構成物質と、薬物とを、混合することを特徴とするリボソーム含有製剤の製造方法。

[2] 前記リン脂質の転移温度が、 22〜60°Cの範囲にあることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[3] 前記転移温度を有するリン脂質が、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素添カ卩大豆レシチン、水素添カ卩大豆ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンカゝらなる群より 1種以上選ばれることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[4] 前記転移温度を有するリン脂質が、ジミリストイルホスファチジルコリンおよび Zまたはジパルミトイルホスファチジルコリンであることを特徴とする請求の範囲第 1項力第

3項のいずれかに記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[5] 前記薬物が、造影化合物または抗がん性物質であることを特徴とする請求の範囲第 1項力も第 4項のいずれかに記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[6] 前記造影化合物が水溶性ヨウドィ匕合物であることを特徴とする請求の範囲第 5項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[7] 前記製造方法は、

圧力容器内で、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含有するリボソーム膜構成成分と、液化二酸化炭素とを攪拌混合し (工程 1)、

次いで、圧力容器内を 32〜55°Cに加温するとともに加圧することにより液ィ匕ニ酸化炭素を超臨界もしくは亜臨界状態とし (工程 2)、

前記混合溶液を得た後に、圧力容器内を減圧して混合溶液から二酸化炭素を排出し、薬物が内包されたリボソームの水性分散液を調製する（工程 4)ことにより行われることを特徴とする請求の範囲第 1項力第 6項のいずれかに記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[8] 前記超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素と、前記リボソーム膜構成物質と、前記薬物とを強攪拌下で混合することを特徴とする請求の範囲第 7項に記載のリポソ一ム含有製剤の製造方法。

[9] 前記超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素と、前記リボソーム膜構成物質と、前記薬物とを強攪拌下で混合する（工程 3)ことを特徴とする請求の範囲第 7項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[10] さらに、リボソームの水性分散液を、 0. 1〜1. 0 mの孔径を有する濾過膜で濾過する (第 5工程)ことを特徴とする請求の範囲第 7項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[11] 前記製造方法は、

圧力容器内で、リボソーム膜構成成分と、薬物水溶液とを攪拌混合し (工程 1)、次いで、液化二酸化炭素を該圧力容器内に供給し、該圧力容器内を加温加圧して液ィ匕ニ酸ィ匕炭素を超臨界状態とし (工程 2)、

リボソーム膜構成成分と、薬物と、超臨界二酸化炭素とを所定の時間混合して混合溶液を調製する（工程 3)、

[12] 前記リボソーム膜構成成分と、水溶性薬剤を含有する水溶液とを混合して懸濁液が調製され、次!、で圧力容器内に供給されることを特徴とする請求の範囲第 11項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[13] 前記懸濁液の調製が、超音波を照射しながら行われることを特徴とする請求の範囲第 12項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[14] さらに、リボソームの水性分散液を、 0. 1〜1. 0 mの孔径を有する濾過膜で濾過する (第 5工程)ことを特徴とする請求の範囲第 11項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[15] 前記リボソーム膜構成物質は、更にコレステロールを含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[16] 前記リボソーム膜構成物質は、更にポリエチレングリコール基を有する化合物を含有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載のリボソーム含有製剤の製造方法。

[17] 請求の範囲第 1項力第 16項のいずれかに記載の方法によって製造されたことを特徴とするリボソーム含有製剤。