JP2006069929A

JP2006069929A - 真菌症治療製剤およびその製造方法

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Publication number: JP2006069929A
Application number: JP2004252928A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Aoki; 洋一青木; Eiichi Ueda; 栄一上田
Original assignee: Konica Minolta Medical and Graphic Inc
Current assignee: Konica Minolta Medical and Graphic Inc
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2004-08-31
Publication date: 2006-03-16

Abstract

【課題】
本発明は、超臨界状態の二酸化炭素を用いてリポソームを調製することにより、人体への副作用が軽減され、さらに抗真菌物質の内包率が高いリポソームを含有する真菌症治療製剤およびその製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明に係る真菌症治療製剤は、超臨界状態の二酸化炭素を用いて製造されたリポソームを含有する製剤であって、前記リポソームが、抗真菌物質を内包していることを特徴とする。
また、本発明に係る真菌症治療製剤の製造方法は、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、水性媒体と、超臨界二酸化炭素とを混合し、次いで、二酸化炭素を減圧溜去することにより、抗真菌物質を内包するリポソームを調製することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、超臨界二酸化炭素を用いて製造された、抗真菌物質を内包してなるリポソームを含有する真菌症治療製剤、およびその製造方法に関する。

真菌症の原因となる真菌には、皮膚糸状菌、カンジダ、アスペルギルス、クリコトコッカスなどがある。そして、このような真菌の感染により発病する真菌症は、人体における主な感染病巣部位によって、（１）皮膚や粘膜などに限局する表在性真菌症、（２）爪などに及ぶ深在性皮膚真菌症（深部皮膚真菌症）、（３）内臓諸器官にまで及ぶ深在性真菌症（内臓真菌症）に分類される。

近年、これら真菌症のうちでも（３）内臓真菌症が急激に増加している。その原因は、種々の重症な基礎疾患のために抵抗力が低下し、さらにその治療に使う薬剤などによっても免疫機能が低下するためといわれている。たとえば、抗癌剤、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような膠原病患者に投与するステロイドホルモン、移植患者に使う免疫抑制剤、広域抗生物質を大量投与した場合などが挙げられる。また、カテーテルの先端などにも皮膚常在真菌が入りやすく、それらが原因となって内臓真菌症が引き起こされる。

この（３）内臓真菌症を治療するには、一般に、経口または注射により投与する真菌症治療製剤が用いられており、その薬効成分としては、ポリエン系、イミダゾール系、トリアゾール系などの抗真菌物質が用いられる。しかしながら、抗真菌物質は水への溶解性が低く製剤化が困難である問題があった。

したがって、従来から、抗真菌物質をシクロデキストリンで包接して水性媒体に可溶化させる方法、水に可溶な溶剤に溶解して水性媒体に溶解または分散させる方法、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤を用いて可溶化させる方法、などにより真菌症治療製剤を調製している。しかしながら、このような方法により得られる真菌症治療製剤は、抗真菌物質を溶解させる際に用いられる、溶剤、界面活性剤等による人体への副作用が問題となっていた。

一方、抗真菌物質自体を誘導体化して溶解性を向上させ、この誘導体を生体内で分解させることにより抗真菌活性を発現させる、いわゆるプロドラック化により製剤化する方法も行われている。しかしながら、この方法により得られる真菌症治療製剤は、抗真菌物質の水への溶解性は向上するものの、抗真菌物質自体を誘導体化しているため、抗真菌活性が低下するという問題があった。さらに、抗真菌物質の構造が変化するため、新たな副作用が発現するという問題もあった。

また、従来から、人体に対する副作用がないリポソームが様々な製剤用材料として用いられている。リポソームは、生体膜と類似の構造や機能を有するとともに、リン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の閉鎖小胞体であるため、水溶性の薬剤をその内部に有する水相に、親油性の薬剤を二分子膜の内部に保持するという、いわゆるカプセル構造を構築できる。したがって、このリポソームを用いて、真菌症治療製剤を製造する試みがなされている。

そのようなものとして、特許文献１には、抗真菌物質および脂質の溶液を作成し、この溶液から溶媒を除去して残留物を得た後、この残留物を緩衝剤の溶液に懸濁し、この懸濁液を攪拌およびホモジナイズすることによりリポソームの水性分散液を調製する方法が開
示されている。しかしながら、この方法は有機溶媒を多量に使用するため、完全に除去できなかった有機溶媒が製剤中に残留する問題があり、人体への副作用が生ずる問題があった。さらに、リポソーム内に抗真菌物質を充分に内包させることができず、真菌症治療製剤を大量に投与する必要があるため患者に過度の負担となる問題があった。

一方、特許文献２には、脂質成分を有機溶媒に溶解した溶液と、抗真菌性物質の懸濁液とを混合してＯ／Ｗ型エマルションを調製し、このＯ／Ｗ型エマルションを水性媒体に分散させた後、有機溶媒を除去することによりリポソームの水性分散液を調製する方法が開示されている。しかしながら、この方法はクロロホルムなどの有機溶媒を使用しているため、上記と同様に人体への副作用が生ずる問題があり、さらにリポソーム内に抗真菌物質を充分に内包させることができない問題も依然としてあった。

また、リポソームを生体内へ投与しても、その多くが肝臓、脾臓などの網内系組織で捕捉されるため、所期の効果が得られないことも指摘されている（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。したがって、抗真菌物質を効率よく封入して安定的に保持でき、かつ安全性に
問題のないリポソームを含有する真菌症治療製剤が望まれている。
特開平５−１４８１３７号公報特表平１０−５０２６６７号公報

本発明は、従来技術の問題を解決するものであって、超臨界状態の二酸化炭素を用いてリポソームを調製することにより、抗真菌物質の内包率が高いリポソームを含有し、さらに人体への副作用が軽減された真菌症治療製剤およびその製造方法を提供することを目的とする。

本発明に係る真菌症治療製剤は、超臨界状態の二酸化炭素を用いて製造されたリポソームを含有する製剤であって、前記リポソームが、抗真菌物質を内包していることを特徴とする。

前記リポソームが、実質的に一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームであることが好ましい。
本発明に係る真菌症治療製剤の製造方法は、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、水性媒体と、超臨界二酸化炭素とを混合し、次いで、二酸化炭素を減圧溜去することにより、抗真菌物質を内包するリポソームを調製することを特徴とする。

また、懸濁液を調製する際に、ポリエチレングリコール基を有する化合物をさらに混合して懸濁液を調製することが好ましい。
前記ポリエチレングリコール基を有する化合物が、ポリエチレングリコール基を有する脂質であることも好ましい。

前記抗真菌物質が、アムホテリシンＢ、ミコナゾール、フルコナゾール、またはミカファンギンであることが好ましい。

本発明の真菌症治療製剤は、超臨界状態の二酸化炭素を用いて製造された、抗真菌物質を内包するリポソームを含有している。このようにして得られるリポソームは、抗真菌物質の内包率が高いため、該リポソームを含有する真菌症治療製剤は、大量に投与する必要がなく、患者に対する負担が軽減されている。さらに、本発明の真菌症治療製剤は、真菌
物質を内包する材料としてリポソームを用いているため、人体への安全性が高い。したがって、本発明の真菌症治療製剤は、経口剤または注射剤等の全身投与製剤として好適に用いることができる。

本発明に係る真菌症治療製剤は、超臨界状態の二酸化炭素を用いて製造されたリポソームを含有する製剤である。リポソームは、リン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の層間に親油性の化合物を有し、さらに、リポソームの内部の水相には親水性の化合物を有する。本発明の真菌症治療製剤に用いられる抗真菌化合物は、ほとんどが親油性の化合物であるため、リン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の層間に存在するが、リポソームの内部の水相にもその一部が溶解または分散していると考えられる。

超臨界状態の二酸化炭素を用いて調製されたリポソームは、後述するように実質的に一枚膜若しくは数枚膜の脂質膜で構成されるリポソームの生成率が高いため、リポソーム膜構成成分に対する抗真菌物質の内包率が高い。なお、数枚膜とは、２〜５枚程度の膜が、所定距離離間して層状に重なり合っている状態を表す。したがって、かかるリポソームを含有する真菌症治療製剤を注射剤や経口剤として用いる場合、大量に投与する必要がなく、患者に過度の負担を与えることがない。本発明の真菌症治療製剤は、真菌物質を内包する材料としてリポソームを用いているため、人体への安全性が高い。

真菌症治療製剤の製造方法
本発明の真菌症治療製剤は、以下のように製造することができる。
具体的には、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、水性媒体と、超臨界二酸化炭素とを混合し、次いで、二酸化炭素を減圧溜去することにより、抗真菌物質を内包するリポソームを調製することにより製造される。

本発明の真菌症治療製剤は、超臨界状態の二酸化炭素を用いて製造されており、有機溶媒を用いないで若しくは大幅に軽減して調製することができる。したがって、製剤中に有機溶媒が残留することがなく人体に対する安全性が高い。

以下、各成分について説明する。
（リポソーム膜構成成分）
本発明のリポソーム製剤に含まれるリポソームの脂質膜成分として、一般にリン脂質および／または糖脂質が好ましく使用される。好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。

その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来するか、または半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、合成により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、
ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などを挙げることができる。

これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種
以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。中性リン脂質と荷電リン脂質を併用する場合、重量比として通常、２００：１〜３：１、好ましくは１００：１〜４：１、より好ましくは４０：１〜５：１である。

糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。

リポソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、膜安定化剤として作用するステロール類、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロールなどが挙げられる。また１−Ｏ−ステロールグルコシド，１−Ｏ−ステロールマルトシドまたは１−Ｏ−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリポソームの安定化に効果があることが示されている（特開平5-245357号公報）。特にコレステロールが好ましい。

ステロール類の使用量として、リン脂質１重量部に対して0.05〜1.5重量部、好ましく
は0.2〜1重量部、より好ましくは0.3〜0.8重量部の割合が望ましい。0.05重量部未満であると混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化が発揮されず、1.5重量部
を超えるとリポソームの形成が阻害されるか、形成されても不安定となる。

リポソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンオキシド導入用のアンカーにもなり得る。特開平09−3093号公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、リポソーム形成用の成分として利用することができる新規なコレステロール誘導体が開示されている。

上記ステロール類の他にリポソーム膜の構成成分として、グリコール類を加えてもよい。グリコール類として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、1,4-ブタンジオールなどが挙げられる。グリコール類の使用量として、脂質全質量に対して0.01〜20質量％、好ましくは0.5〜10質量％の割合が望ましい。

本発明では、リポソーム膜の一成分として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する化合物、好ましくはポリエチレングリコール基を有するリン脂質またはコレステロールを用いることが望ましい。誘導体化されるリン脂質は、上記に例示されたリン脂質から適宜選択される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する化合物は、−（ＣＨ₂Ｃ
Ｈ₂Ｏ）_n−ＨであらわされるＰＥＧ基のオキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。ＰＥＧ基として、オキシエチレン単位（ｎ）が10〜3500、好ましくは100〜2000のポリエチレングリコールが好適である。
ポリエチレングリコールを使用する場合の使用量は、該リポソームを構成する脂質に対して0.1〜30質量％、好ましくは1〜15質量％程度含むのがよい。ポリエチレングリコール基を有する化合物は、特開平7-165770号に記載の方法により製造することができる。

このようなポリエチレングリコール基を有する化合物を用い、超臨界二酸化炭素でリポソームを調製すると、有機溶媒を使用することなく内包率の高いリポソームを調製することができる。

（抗真菌物質）
抗真菌物質としては、抗真菌作用を有すれば特に限定されることなく用いることができ、例えば、アムホテリシンＢ、ミコナゾール、フルコナゾール、ミカファンギン、硝酸ブトコナゾール、クロトリマゾール、ナイスタチン、ピマリシン、硝酸オキシコナゾール、チオコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、テルビナフィン、ブテナフィン、アモロルフィン、ナフチフィン、エコナゾール、ボリコナゾール、ケトコナゾール、ポサコナゾール、スルコナゾール、アニデュラフンギン、カスポファンギン、ジアフェニルスルホン、ハロプロジン、ウンデシレン酸塩などが挙げられる。本発明の真菌症治療製剤は注射剤または経口剤として用いることが好ましく、アムホテリシンＢ、ミコナゾール、フルコナゾール、またはミカファンギンが好ましく用いられる。これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明に係る真菌症治療製剤は、上記のような成分を用いて、超臨界二酸化炭素を使用して製造することができる。二酸化炭素は、臨界温度が３１．１℃、臨界圧力が７５．３ｋｇ／ｃｍ²と比較的扱いやすく、不活性なガスであるため残存しても人体に無害であり
、高純度流体が安価で容易に入手できるなどといった理由により好適である。本発明においては、亜臨界状態を含めて超臨界状態とする。

本発明の真菌症治療製剤の製造方法は、超臨界状態の二酸化炭素を用い、実質的に有機溶媒を用いないで行うことができる。したがって、得られる真菌症治療製剤中に有機溶媒が残留することがなく、人体に対する安全性が高い。

本発明の真菌症治療製剤の製造方法は、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、水性媒体と、超臨界二酸化炭素とを混合し、次いで、二酸化炭素を減圧溜去することにより、抗真菌物質を内包するリポソームを調製することにより行われる。以下に、詳細に説明する。

本発明の真菌症治療製剤の製造方法は、
圧力容器内に、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、液化二酸化炭素とを加えるとともに、これらを攪拌混合し（第１工程）、
次いで、圧力容器内を加温加圧することにより液化二酸化炭素を超臨界状態とし（第２工程）、
リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、超臨界二酸化炭素とを攪拌混合しながら水性媒体を供給して、混合溶液を調製し（第３工程）、
前記混合溶液を得た後に、圧力容器内を減圧して混合溶液から二酸化炭素を減圧溜去し、抗真菌物質が内包されたリポソームの水性分散液を調製する（第４工程）ことにより行われる。

第１工程においては、圧力容器内に、リポソーム膜構成成分と、疎水性の抗真菌物質と、液化二酸化炭素とを加えるとともに、これらを攪拌混合する。
圧力容器としては、５００気圧まで耐圧可能であり、内部をガラス窓により目視観察することができるように構成されているステンレス製のオートクレーブが好ましく用いられる。

リポソーム膜構成成分と抗真菌物質は無菌状態に管理されていることが好ましく、圧力容器内に投入する際にも菌が混入しないように行う。リポソーム膜構成成分の添加量は、抗真菌物質の種類、製剤スケール等に応じて適宜決定され、一方、抗真菌物質の添加量は、抗真菌物質の抗真菌活性や、リポソームの内包化率等に応じて適宜決定される。

液化二酸化炭素は、従来公知の方法により、気体の二酸化炭素を冷却、加圧することによって得られ、この液化二酸化炭素を圧力容器内に投入する。この液化二酸化炭素も、無
菌状態に管理されていることが好ましく、圧力容器内に投入する際には液化二酸化炭素を濾過滅菌することが好ましい。濾過滅菌は、液化二酸化炭素を、濾過滅菌フィルターを通すことにより行う。濾過滅菌フィルターは、孔径０．４５μｍ以下であるのが好ましい。例えば、孔径０．２μｍの濾過滅菌フィルターが用いられる。濾過滅菌は、液化二酸化炭素の状態を維持しながら行う。

また、圧力容器内に、リポソーム膜構成成分と、疎水性の抗真菌物質と、液化二酸化炭素ととともに、前記ポリエチレングリコール基を有する化合物を投入し、攪拌混合することも好ましい。

このようなポリエチレングリコール基を有する化合物を、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、液化二酸化炭素とともに攪拌混合することにより、リポソーム膜構成成分や抗真菌物質を極性の液体二酸化炭素中に良好に分散させ、溶解させることができる。すなわち、ポリエチレングリコール基を有する化合物を用いることにより、有機溶媒を用いることなく真菌症治療製剤を製造することができ、抗真菌性化合物の内包率も高いリポソームを得ることができる。

第２工程においては、攪拌を継続しながら、圧力容器内を加温加圧することにより液化二酸化炭素を超臨界状態とする。
本発明の製造方法において、二酸化炭素を超臨界状態（亜臨界状態を含む）とする温度は、通常３２〜１００℃、好ましくは３２〜８０℃であることが望ましい。かかる温度範囲の中でも特に好適な温度は、使用するリン脂質の相転移温度またはそれより上である。一方、二酸化炭素を超臨界状態とする圧力は、通常50〜500 kg/cm³、好ましくは90〜150 kg/cm³、特に好ましくは100〜120 kg/cm³範囲であることが望ましい。

このように、超臨界二酸化炭素を調製するには、高熱をかけて脂質類を水中で強制的に融和させる必要がないため、高熱による脂質類の変性、たとえばリン脂質が加水分解してリゾ体を生じたり、不飽和成分の過酸化が起きるといった問題もない。したがって、超臨界二酸化炭素を使用する製造方法によれば、所望のリポソーム膜を形成することができ、さらに製造する度にリポソーム膜の物性が変化することがないため、抗真菌活性が安定した真菌症治療製剤を製造することができる。

第３工程においては、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、超臨界二酸化炭素と、好ましくは溶解助剤とを攪拌混合しながら水性媒体を添加し、混合溶液を調製する。水性媒体の添加方法は、特に限定されず、一度に添加してもよく、間欠的に添加してもよい。なお、親水性の抗真菌物質を用いる場合には、抗真菌物質は水性媒体に溶解させて添加される。

水性媒体としては、蒸留水、局方注射用水、純水などの水のほか、生理食塩水、製剤助剤を含む水溶液などが用いられる。製剤助剤としては、具体的には生理学的に許容される各種の緩衝剤、キレート化剤、浸透圧調節剤、安定化剤、粘度調節剤、ｐＨ調整剤、α‐トコフェロールなどの抗酸化剤、パラオキシ安息香酸メチルといった保存剤などが挙げられる。

また、水性媒体は、濾過滅菌されていることが好ましい。濾過滅菌することにより、圧力容器内を無菌状態に保つことができる。濾過滅菌は、水性媒体を、濾過滅菌フィルターを通すことにより行う。濾過滅菌フィルターは、孔径０．４５μｍ以下であるのが好ましい。例えば、孔径０．２μｍの濾過滅菌フィルターが用いられる。

本発明においては、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、超臨界二酸化炭素とを攪
拌混合しながら水性媒体を供給し、混合溶液を調製する方法によって説明するが、リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、液化二酸化炭素と、水性媒体とを攪拌混合し、次いで液化二酸化炭素を超臨界状態として混合溶液を調製することも好ましい。このように調製することにより、超臨界二酸化炭素を生成した後に水溶性薬剤を添加する必要がないため、温度条件および圧力条件の制御が容易であり、リポソームの生成率と薬剤の内包率が向上する。

第４工程においては、第３工程で混合溶液を得た後に、圧力容器内を減圧して混合溶液から二酸化炭素を減圧溜去し、抗真菌物質が内包されたリポソームの水性分散液を調製する。

混合溶液においては、Ｗ／ＣＯ₂／Ｗエマルション、またはＣＯ₂／Ｗエマルションが形成されていると推定され、系内を減圧して混合溶液から二酸化炭素を排出すると、抗真菌物質を内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。このリポソームは、リン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の層間に抗真菌物質が内包されていると考えられる。また、リポソームの内部にも水性媒体が内包されており、この水性媒体にも抗真菌物質の一部が溶解または分散していると考えられる。つまり、抗真菌物質はリポソームに内包された状態にある。

上述のようにリポソームの水性分散液を得た後に、さらにこの水性分散液を０．１〜０．４μｍの孔径を有する濾過膜で濾過を行う。濾過操作により、リポソームの粒径を容易に調整することができ、均一な粒径のリポソームを含有する真菌症治療製剤が得られる。具体的には、濾過膜として０．１〜０．４μｍの孔径のフィルターを装着したエクストルーダーが用いられる。このようにリポソーム粒子のサイズを調整し、さらに望ましくない物質の除去も併せて可能になる。

本発明の真菌症治療製剤は、リポソームの水性分散液を上記のように濾過膜で濾過し、必要に応じて所定の濃度となるように濃縮し、さらに通常使用される賦形剤、担体、及び希釈剤等の製剤補助剤を適宜混合して、注射剤やシロップ剤などとして得られる。

また、本発明の真菌症治療製剤は、常法にしたがって、リポソームの水性分散液からリポソームを凍結乾燥して製剤化することもできる。リポソームを凍結乾燥することにより、より長期保存安定性に優れた真菌症治療製剤を得ることができる。リポソームを凍結乾燥した場合には、使用直前に水性媒体などで再懸濁させて注射剤として用いることができ、また通常使用される賦形剤、担体、及び希釈剤等の製剤補助剤と常法にしたがって混合し製剤化を行い、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などとして得ることもできる。

真菌症治療製剤
本発明の真菌症治療製剤は、上述したような製造方法により、抗真菌物質が内包されたリポソームを調製することにより得ることができる。このようにして得られるリポソームは、リン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の層間に疎水性の抗真菌物質を、さらに、リポソームの内部の水性媒体中には親水性の抗真菌物質が溶解または分散している。

リポソーム内には、抗真菌物質が疎水性である場合には、リポソーム膜構成成分に対して０．２〜２、好ましくは０．８〜２の重量比で含有され、抗真菌物質が親水性である場合には、リポソーム膜構成成分に対して０．５〜８、好ましくは３〜８の重量比で含有されていることが望ましい。

リポソーム内に内包された抗真菌物質の重量比が下限値未満であると、比較的多量の脂
質を投与することが必要となり、製剤の粘度は増大し、結果的に薬物の送達効率が悪くなる。反対に、リポソーム膜脂質に対する抗真菌物質の封入重量比が上限値を超えると、リポソームは構造的にも不安定となり、リポソーム膜外への薬物の拡散、漏出は、貯蔵中または生体内に投与された後でも避けられない。

さらに、上記のようにして得られるリポソームは、実質的に一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームである。一枚膜のリポソームとは、リン脂質二重層が一層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームであり、凍結かつ断（Freeze fracture
）レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察において、レプリカが概ね1
つの層として認められるリン脂質二重層によりリポソームが構成されているものである。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものが一枚膜と判定される。また、「実質的に」とは、本発明の真菌症治療製剤において、このような実質的に一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームを、真菌症治療製剤中に含まれる全リポソームのうち、少なくとも８０％、好ましくは９０％以上含むことを意味する。

本発明の真菌症治療製剤は、実質的に一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームを含有しており、人体に投与した場合、抗真菌化合物の血中濃度が抗真菌効果を発現するレベル以上に速やかに到達し、そのレベルで長期間維持される。これに対し、従来の真菌症治療製剤は、抗真菌物質を溶剤や界面活性剤を用いて可溶化させており、抗真菌化合物の血中濃度が抗真菌効果を発現するレベル以上にすぐに到達するものの、その血中濃度はすぐにそのレベル以下に低下してしまう。したがって、本発明の真菌症治療製剤によれば、体内に投与した後、従来のものよりも長期間その効果を発現させることができる。

また、本発明の真菌症治療製剤は、上述のようにリポソーム粒子のサイズを調整し、１枚膜の中心粒径として０．０５〜０．４０μｍ、好ましくは０．１０〜０．３０μｍ、さらに好ましくは０．１０〜０．２０μｍのリポソームを含有することが望ましい。粒径は抗真菌物質を内包するリポソームを含む分散液を凍結し、その後破砕した界面をカーボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること（凍結破砕ＴＥＭ法）により測定することができる。ここで「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径を指している。

このようにリポソーム粒子のサイズを上記範囲で調整することにより、血液中での滞留性、血管透過性、炎症部位への移行性を向上させることができる。したがって、本発明の真菌症治療製剤によれば、目的とする箇所に効率よく薬剤が移行するため、抗真菌効果およびその持続性が向上する。

上記の一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームは、脂質類の溶媒として前記超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸化炭素を使用し、水による相分離方法により効率よく作製できる。一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームは、多重層膜（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）からなるリポソームと比較して、リポソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点がある。これに対して従来のリポソーム作製方法によると、様々なサイズ、形態のＭＬＶがかなりの割合で存在することが多く、一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームの比率を高めるためには、さらに超音波を照射するか、一定孔サイズのフィルターに何度も通すなどの操作を必要としていた。しかしながら、本発明のようにさらに、超臨界二酸化炭素もしくは亜臨界二酸化炭素を使用してリポソームを調製することにより、一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームを効率よく調製することができ、さらにリポソーム内への薬剤の内包率を向上させることができる。

このようにして製造される真菌症治療製剤は、生体膜と類似の構造や機能を有するリポソームを用い、さらに実質的に有機溶媒を含有しない。したがって、従来のように人体に
対する副作用の原因となる溶剤や界面活性剤を多量に用いて製剤化した場合に比べ、副作用が軽減されている。さらに、超臨界状態の二酸化炭素を用いてリポソームを調製しているため、リポソーム内に薬剤を効果的に内包することができるため、真菌症治療製剤を人体に多量に投与する必要がなく患者に過度の負担をかけることがない。

本発明の真菌症治療製剤は、上記したように、注射剤などの非経口投与剤、シロップ剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの経口投与剤として用いることができる。真菌症治療製剤は、経口又は非経口投与により、１日、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与すればよい。
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

リポソーム製剤の作成
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）86mgと、コレステロール38.4mg、ＰＥＧ−リン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）19.2mg、アムホテリシンＢ 45mgの混合物をステンレス製の特製オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に
加熱し、次いで液体二酸化炭素13gを加えた。撹拌を行いながら、50kg/cm²であったオー
トクレーブ内の圧力を、オートクレーブ内の体積を減ずることにより、120kg/cm²にまで
上げて、二酸化炭素を超臨界状態にし、撹拌しながら脂質類を分散・溶解させた。さらに撹拌しながら、生理食塩水5mlを定量ポンプで連続的に50分間かけて注入した。注入終了
後、系内を減圧して二酸化炭素を排出し、抗真菌性物質を含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を60℃まで加熱し、アドバンテック社製のセルロース系フィルター、1.0μmおよび0.45μmで加圧濾過した。

ゲルろ過法により、リポソーム外に遊離しているアムホテリシンＢとリポソーム内に包含されているアムホテリシンＢを定量した結果。仕込んだアムホテリシンＢに対して90％のアムホテリシンＢがリポソーム内に包含されていた。また、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察したところ、リポソーム粒子の周辺に結晶などは認められなかった。また、得られたリポソーム粒子の粒径は、0.12μmであった。粒子径の測定法を以下に示す。

リポソームの粒径
粒径（粒子径）は、リポソームを含む分散液を液体窒素にて急速に凍結し、その後破砕した界面をカーボン蒸着し、形成されたこのカーボンを透過型電子顕微鏡で観察すること（凍結破砕ＴＥＭ法）により測定した。粒径は、観察されたリポソーム粒子、２０個の径の単純平均とした。

Claims

超臨界状態の二酸化炭素を用いて製造されたリポソームを含有する真菌症治療製剤であって、前記リポソームが抗真菌物質を内包していることを特徴とする真菌症治療製剤。
前記抗真菌物質が、アムホテリシンＢ、ミコナゾール、フルコナゾール、またはミカファンギンであることを特徴とする請求項１に記載の真菌症治療製剤。
前記リポソームが、実質的に一枚膜もしくは数枚膜からなるリポソームであることを特徴とする請求項1〜２のいずれかに記載の真菌症治療製剤。
リポソーム膜構成成分と、抗真菌物質と、水性媒体と、超臨界二酸化炭素とを混合して懸濁液を調製し、次いで、該懸濁液から二酸化炭素を減圧溜去することにより、抗真菌物質を内包するリポソームを調製することを特徴とする真菌症治療製剤の製造方法。
ポリエチレングリコール基を有する化合物をさらに混合して、懸濁液を調製することを特徴とする請求項４に記載の真菌症治療製剤の製造方法。
前記ポリエチレングリコール基を有する化合物が、ポリエチレングリコール基を有する脂質であることを特徴とする請求項５に記載の真菌症治療製剤の製造方法。
前記抗真菌物質が、アムホテリシンＢ、ミコナゾール、フルコナゾール、またはミカファンギンであることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の真菌症治療製剤の製造方法。