WO2006093337A1

WO2006093337A1 - 癌の予防・治療剤

Info

Publication number: WO2006093337A1
Application number: PCT/JP2006/304532
Authority: WO
Inventors: Ryosuke Katsuyama; Shinichi Kondo
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2006-09-08
Anticipated expiration: 2007-09-03
Also published as: JPWO2006093337A1; EP1854473A1; CA2599875A1

Abstract

本発明は、新規癌予防・治療標的分子の同定および該分子をターゲットとする癌予防・治療剤、即ち、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体、上記タンパク質のアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくは上記タンパク質のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）、上記タンパク質の発現および／または活性を調節する物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害剤、癌の予防・治療剤を提供する。また、本発明は、上記タンパク質（好ましくはそれを産生する細胞）および上記タンパク質に対する抗体もしくは上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる、細胞のアポトーシス促進および／または増殖阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。

Description

明細書

癌の予防■治療剤技術分野

本発明は、新規な癌予防 ·治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤に関する。詳細には、本発明は、新規標的タンパク質の発現およびまたは活性を調節する物質を含有してなる癌予防■治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤に関する。また、本発明は、該標的タンパク質またはそれをコードする遺伝子の発現を検出し得る物質を含有してなる癌の診断剤に関する。さらに、本発明は、該標的タンパク質またはそれをコードする核酸を用いた癌予防■治療、癌細胞のアポトーシス促進および Zまたは増殖阻害物質のスクリーエング方法に関する。

背景技術

分子生物学の急速な進歩により、癌細胞の增殖あるいは悪性化の分子機構が明らかにされつつある。そして、それらの機構に関与する分子標的とその機能の解明を通じて、機能を制御することによって治療に結びつけようとする分子標的治療という新しいコンセプトによる研究が始まり、これまでにハーセプチン、ダリベック、ィレッサなどの新しい分子標的薬が開発され、一定の成果を収めてはいる。しかしながら、これらの薬剤の有効性はあくまで限定的であることから、癌治療のための新たな創薬ターゲット分子の探索は依然として重要な課題である。癌において、遺伝子のマイクロアレイプロファイリングデータでその病態が評価されうることが予見され、実際、白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告されている。また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、その分類を積み重ねることによって、特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考えられる。具体的には、ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して（i) その発現量を低下させる、（ii) 機能を抑制する、 . （iii) 該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。これと同時に、抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。以上のように発現プロファイル解析は、癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。

Desmocol lin- 3遺伝子は 1994年、ヒト膀胱癌細胞株 HT- 1376 c D N Aライブラリーより単離された遺伝子である。 Desmocollin- 3遺伝子は、 Desmocollin- 3a遺伝子（Refseq Accession No. 丽— 001941) およびそのスプライシングバリアントである Desmocollin- 3b遺伝子（Refseq Accession No. NM— 024423) よりなり、それぞれ 896 アミノ酸（Refseq Accession No. NP— 001932) および 839 アミノ酸 (Refseq Accession No. NP— 077741) よりなるタンパク質をコードしている（以 " 、 Desmocollin - 3a jigfeナぉよび Desmocollin - 3b遺伝子 ¾■ Desmocollin- 3と総称することもある）。さらに、 Desmocollin-3a遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（RefSeq Accession No. 丽ー 007882) がクローニングされており、 895 ァミノ酸からなるタンパク質をコードしている（RefSeq Accession No. NP— 031908)。このマウス遺伝子は Destnocollin-3a遺伝子に対して塩基配列で約 78%、アミノ酸配列で約 78 %の相同性を有している。 Desmocollin- 3a 遺伝子および Desmocollin- 3b遺伝子がコードするタンパク質は、いずれも Desmocollinフアミリーに属しており、第 1アミノ酸から第 831アミノ酸までは同一であるが、細胞内領域にあたる第 832ァミノ酸以降の C末端側のァミノ酸配列が異なっている。 Desmocollinファリーは、 Desmocollin - 1、 Desmocol丄 in - 2、 Desmocollin- 3の 3 つのサブファミリーより構成される（以下、これらを Desmocol linと総称することもある）、カドへリンス一パーファミリーに属する分子群である。 Desmocollin は、デスモソームの主要構成分子の一つとして、細胞外で細胞間接着分子として機能している。 Desmocollin は一回膜貫通型分子であり、細胞外領域に高度に保存された 4 つの細胞外サブドメイン EC1 - EC4 が存在する。 Desmocollin-3a と Desmocollin- 3b の機能上の相違は明らかとされていないが、細胞内で Desmocollin - 3a力 S Plakoglobin、 Plakophilinファミリ一に属する多くのタンパク質と結合するのに対し、 Desmoco 11 in-3bと結合することが明らかとなっているのは、現在までのところ Plakophilin- 3のみである。

Desmocol lin は、細胞外でトランス結合を形成する。トランス結合の相手分子はへテロフィリックな結合、ホモフィリックな結合を含め多様であるが、一般的には Desmocollinと、同じくデスモソームの主要構成分子である Desraogleinのへテロフィリックな結合が優勢であると考えられている。また、 Desmocollin 分子は細胞内で、アルマジロフアミリーに属する分子、 Plakoglobin、 Plakophilinと結合し、さらにこの結合を介して中間系フィラメントと相互作用している。

近年、 Desmocollin 力細胞間の機械的結合に関わる分子としての機能のみならず、組織の形態形成、あるいは組織内での各細胞の位置関係を決定する分子としての機能を有するという知見が報告されている。例えば、腺管上皮細胞、筋上皮細胞の二層よりなる乳腺上皮組織においては、 Desmocollin- 3 は基底側に存在する筋上皮細胞のみに発現しており（Desmocollin- 2 は両層に発現、 Desmocollin- 1はどちらにも発現しない）、その機能を阻害すると両細胞の位置関係が破綻することが示されている（Nat. Cell Biol. (2001) , 3： 823-830)。

Desmocollin- 3 と癌の関係性については、乳癌細胞株において Desmocollin - 3 の発現量が正常細胞に比して低下しているという報告がある（Int J Oncol. (2001) , 19 (1)： 169 - 174)。さらに、 Desmocollin- 3は、肺癌の診断等に有用であるという報告（TO 2002/86443号公報）、乳癌、卵巣癌の発見等に有用であるという報告（TO 2003/000012号公報）がある。しかし、それらの有用性は遺伝子の発現解析から類推されたものに過ぎず、仮説の実証を伴う具体的事例は何ら明示されていない。

TM4SF13 遺伝子（RefSeq Accession No. 應— 014399) は、テトラスパニンスーパーファミリーに属する 10遺伝子（CD9、 CD37、 CD53、 CD63、 CD81、 CD82、 CD151、 Co - 029、 NAG - 2および Talla- 1)の配列ならびにそれらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列との相同性を指標として、 EST ライプラリーより見.出された遺伝子であり、 204 アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（RefSeq Accession No. NP_055214)。さらに、 TM4SF13遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（RefSeq Accession No. M_025359) がマウス糸且織由来の c D N Aからクローユングされており、 204 アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（RefSeq Accession No. NP_079635)。このマウス遺伝子は、 TM4SF13 遺伝子に対して塩基配列で約 88%、ァミノ酸配列で約 96%の相同性を有している。 TM4SF13は NET- 6 という異名を持ち、 4 回膜貫通型分子フアミリーであるテトラスパニンスーパーフアミリーに属しており、細胞膜上に局在すると予想されている。

TM4SF13は、癌の検出に有用なタンパク質の一つである（W0 2000/53756号公報）、乳癌の検出等に有用な遺伝子の一つである（US 2002/081609号公報）と報告されている。しかし、それらの有用性は遺伝子の発現解析から類推されたものに過ぎず、仮説の実証を伴う具体的事例は何ら明示されていない。また一方で、 TM4SF13 レベルはエストロゲンレセプター陰性の高グレードの乳癌で減少し、その異所性発現は癌の増殖 ·浸潤に阻害効果を有することから、 TM4SF13 は乳癌抑制遺伝子であることを示唆する報告もあり、該遺伝子の癌における位置付けは依然として不明のままである。

TM4SF6遺伝子（RefSeq Accession No. 羅— 003270) は、ヒト胎児肺 c D N Aライブラリーより単離された遺伝子であり、 245 アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（RefSeq Accession No. NP— 003261)。さらに、 TM4SF6遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（RefSeq Accession No. 画— 019656) がマウス組織由来の c D N Aからクローユングされており、 245 アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（RefSeq Accession No. NP— 062630)。このマウス遺伝子は、 TM4SF6 遺伝子に対して塩基配列で約 87%、アミノ酸配列で約 93%の相同性を有している。 TM4SF6は 4回膜貫通型分子フアミリーであるテトラスパニンスーパーフアミリーに属しており、細胞膜上に局在すると予想されている。

TM4SF6は、癌の診断等に有用なタンパク質の一つである（W0 2003/057160号公報）、大腸癌の診断等に有用な遺伝子の一つである（W0 2001/22920号公報.）と報告されている。しかし、それらの有用性は遺伝子の発現解析から類推されたものに過ぎず、仮説の実証を伴う具体的事例は何ら明示されていない。

LY-6K 遺伝子（RefSeq Accession No. NM_017527 ) は頭頸部粘膜癌細胞株 UM - SCC - 22A c D N Aより単離された遺伝子であり、 223 アミノ酸からなるタンパク質をコードしている (RefSeq Accession No. NP_059997)。 LY- 6Kは HSJ001348 という異名を持ち、 LY-6ファミリーに属する分子である。

LY- 6Κ遺伝子は前立腺癌（TO 2002/30268号公報）、肺癌（TO 2002/86443号公報）の診断等に有用な遺伝子であると報告されている。しかし、それらの有用性は遺伝子の発現解析から類推されたものに過ぎず、仮説の実証を伴う具体的事例は何ら明示されていない。

発明の開示

上述の通り、癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な新規薬剤が切望されている。癌細胞において、有意に発現が変動し得る遺伝子は多く知られているが、それらの中で、どの遺伝子おょぴその発現産物が、癌治療における創薬ターゲットとなり得るかについては、依然として不明な点が多い。したがって、本発明の目的は、癌分子標的治療の新規ターゲットとなり得る分子を同定し、該標的分子の発現や機能を制御することによる癌の予防 ·治療手段を提供することであり、また、該標的分子を用いて癌予防 '治療活性を有する物質をスクリーニングする手法を提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、癌組織で発現が顕著に増加する遺伝子を見出した。さらに、これらの遺伝子に対する siRNA が癌細胞の増殖を抑制することを見出し、該遺伝子が癌予防 ·治療のための標的となり得ることを実証した。さらにまた、本発明者らは、 TM4SF13 がインテグリンと相互作用することにより、細胞外マトリックスとの関係性に影響を及ぼすことを見出し、該遺伝子の癌への作用メカニズムの一部を解明することに成功した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 .

すなわち、本発明は、

(1) 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ぺプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤、

(2) 癌の予防 ·治療用である上記（1) 記載の剤、

(3) 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および/または増殖阻害剤、

(4) 癌の予防■治療用である上記（3) 記載の剤、

(5) 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現およびまたは活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤、

(6) 癌の予防 ·治療用である上記（5) 記載の剤、

(7) 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現おょぴノまたは活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は増殖阻害方法、 ·

(8) 癌の予防 ·治療のためである上記（7) 記載の方法、

(9) 癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害剤の製造のための、配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現およびまたは活性阻害物質の使用、

(1 0) 癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤が癌の予防■治療用である上記（9) 記載の使用、

(1 1) 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害物質のスクリ一ユング方法、

(1 2) 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ぺプチドがそれを産生する細胞の形態で提供される、上記（1 1) 記載の方法、

(1 3) 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドに対する抗体、並ぴに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、上記（1 2) 記載の方法、

(14) 癌の予防 '治療物質のスクリーユング用である上記（1 1) 記載の方法、

(1 5) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質の発現および/または該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質を含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は増殖阻害剤、

(16) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質が、該タンパク質に対する中和抗体である上記（15) 記載の剤、

(17) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質の発現を調節する物質が、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相捕的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドである上記（15)記載の剤、 (18) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質が、該タンパク質に対する非中和抗体である上記（15) 記載の剤、 (1 9) 抗体がァゴニスト抗体である上記（1 8) 記載の剤、

(20) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質の発現を調節する物質が、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドである上記（1 5) 記載の剤、

(2 1) 癌の予防 '治療用である上記（1 5) 記載の剤、

(22) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質の発現および/または該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節することを含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は増殖阻害方法、

(23) 癌の予防■治療のためである上記（22) 記載の方法、

(24) 癌細胞のアポトーシス促進おょぴノまたは増殖阻害剤の製造のための、配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および/または該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質の使用、

(25) 癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤が癌の予防 -治療用である上記（24) 記載の使用、

(26) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分べプチドを用いることを含む、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害物質のスクリーニング方法、

(27) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ぺプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、上記（26) 記載の方法、

(28) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、上記（27) 記載の方法、 .

(29) 癌の予防 ·治療物質のスクリーニング用である上記（26) 記載の方法、

(30) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチド、およびインテグリンを用いることを含む、癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害物質のスクリーニング方法、

(31) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ぺプチド、および Zまたはインテグリンが、それらを産生する細胞の形態で提供される、上記（30) 記載の方法、

(32) 癌の予防 '治療物質のスクリーユング用である上記（30) 記載の方法、

(33) 配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ぺプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および/または増殖阻害剤、

(34) 癌の予防 ·治療用である上記（33) 記載の剤、

(35) 配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質をコ^"ドするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤、

(36) 癌の予防 ·治療用である上記（35) 記載の剤、

(37) 配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質の発現および Zまたは活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および Zまたは増殖阻害剤、 (38) 癌の亍防■治療用である上記（37) 記載の剤、 (39) 配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質の発現およびまたは活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は増殖阻害方法、

(40) 癌の予防 ·治療のためである上記（39) 記載の方法、

(41) 癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤の製造のための、配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現およびまたは活性阻害物質の使用、

(42) 癌細胞のアポトーシス促進および Zまたは増殖阻害剤が癌の予防■治療用である上記（41) 記載の使用、

(43) 配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進おょぴノまたは增殖阻害物質のスクリーニング方法、

(44) 配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ぺプチド力それを産生する細胞の形態で提供される、上記（43) 記載の方法、

(45) 配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ぺプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、上記（44) 記載の方法、

(46) 癌の予防 ·治療物質のスクリーニング用である上記（43) 記載の方法などを提供する。

配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質やこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌組織に特異的に発現し、癌の診断マーカーとなり得る。さらに、上記タンパク質に対する抗体、上記ポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、上記タンパク質の発現おょぴノまたは活性を調節する物質は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 - 治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌などの予防 -治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして安全に使用することができる。また、上記タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記抗体などは、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 ·治療物質（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、瞵臓癌などの予防 '治療物質）、癌細胞のアポトーシス促進物質、癌細胞の増殖阻害物質などのスクリーニングに有用である。

図面の簡単な説明

図 1は、各種癌組織由来 niRNAおよび周辺正常組織由来 mRNAを用いて作製した、 Desmocollin-3の遺伝子発現プロフアイルを示す。

図 2は、 Desmocollin- 3遺伝子の siRNA投与の結果を示す。図 2 A： siRNA投与により、ヒト肺癌細胞株の細胞増殖が抑制されたことを示す；図 2 B ： siRNA投与により、 Desmocol lin- 3遺伝子の mRNA発現量が低下したことを示す；図 2 C ： siRNA投与により、 Desmocollin-3タンパク質の発現量が低下したことを示す。図 3は、各種癌組織由来 mRNAおよぴ周辺正常組織由来 mRNAを用いて作製した、 TM4SF13の遺伝子発現プロファイルを示す。

図 4は、 TM4SF13遺伝子の siRNA投与の結果を示す。図 4 A : siRNA投与により、ヒト乳癌細胞株の細胞増殖が抑制されたことを示す；図 4 B : siRNA投与により、 TM4SF13遺伝子の mRNA発現量が低下したことを示す。

図 5は、 TM4SF13タンパク質が細胞質膜に局在していることを示す。左から DAPI 染色、蛍光免疫染色、それらを 1つにした染色像をそれぞれ示す。図 6は、 TM4SF13タンパク質がインテグリン一ひ 3と相互作用することを示す。 T： TM4SF13- 3xFLAG； V：空ベクター（コントロール）

図 7は、 TM4SF13タンパク質がインテグリンー α 5と相互作用することを示す。 Τ： TM4SF13 - 3xFLAG； V ：空べクター（コントローノレ）

図 8は、 TM4SF13タンパク質発現による細胞の形態変化を示す。上段はブイプロネクチンコートしたプレート、下段はラミニンコートしたプレート上で、それぞれ細胞を培養した結果を示す。左から TM4SF13発現細胞、 LacZ発現細胞、非トランスフエタタント（N T ) を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明で用いられるタンパク質 (本発明のタンパク質と称することもある）は、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明のタンパク質は、ヒトゃ他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニヮトリ、ゥサギ、プタ、ヒッジ、ゥシ、サルなど）の細胞 [例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、眸臓 β 細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、 Τ細胞、 Β細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など] もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 [例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膝臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、平滑筋、骨格筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、白色脂肪組織、褐色脂肪組織）など] 等から単離，精製されるタンパク質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成されたタンパク質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。

配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、好ましくは約 6 0 %以上、より好ましくは約 7 0 %以上、いっそう好ましくは約 8 0 %以上、特に好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なァラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％) を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、 Trp、 Tyr) 、脂肪族アミノ酸（Ala、 Leu、 Ile、 Val) 、極性アミノ酸（Gln、 Asn) 、塩基性アミノ酸（Lys、 Arg、 His) 、酸性アミノ酸（Glu、 Asp) 、水酸基を有するアミノ酸（Ser、 Thr) 、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met) などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、 Bowieら, Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。

本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、以下の条件（期待値 =10；ギヤップを許す；マトリクス =BL0SUM62；フィルタリング =0FF) にて計算することができる。ァミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、 Karlinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは MBLASTおよび XBLASTプログラム（version 2. 0)に組み込まれている (Altschul ら， Nucleic Acids Res. , 25 : 3389 - 3402 (1997) ) ] 、 Needle瞧ら， J. Mol. Biol. , 48 ： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアノヽ。ッケージ中の GAPプログラムに組み込まれている] 、 Myersおよび Miller, CABI0S, 4： 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは CGC配列ァラインメントソフトウエアパッケージの一部である ALIGNプログラム（version 2. 0) に組み込まれている] 、 Pearsonら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれている] 等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。

より好ましくは、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8 もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列とは、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と約 5 0 %以上、好ましくは約 6 0 %以上、より好ましくは約 7 0 %以上、いっそう好ましくは約 8 0 %以上、特に好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の同一性を有するアミノ酸配列である。

本発明で用いられるタンパク質は、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質である。

実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などが挙げられる。ここで「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に (例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約 0. 01〜約 100倍、好ましくは約 0. 1〜約 10倍、より好ましくは 0. 5〜2倍）や、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。

リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことができるが、例えば、後述する本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法において用いられる方法等に従って行うことができる。

また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（i) 配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（例えば 1〜50個程度、好ましくは 1〜30個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数ひ〜 5、 4、 3もしくは 2)個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上（例えば 1〜50個程度、好ましくは 1~30個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数（1〜5、 4、 3もしくは 2) 個）のァミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii)配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上（例えば 1〜50個程度、好ましくは 1〜30個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数（1〜5、 4、 3もしくは²) 個）のアミノ酸が揷入されたァミノ酸配列、（iv) 配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（例えば 1〜50個程度、好ましくは 1〜30個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数（1〜5、 4、 3もしくは 2) 個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。

上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。本発明で用いられるタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列を含有するヒト Desmocollin- ³a (Refseq Accession No. NP— 001932) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、 GenBank に RefSeq Accession No. NP_031908 として登録されているマウスホモログ）、配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するヒト Desmocollin - 3b (Refseq Accession No. NP_07774l) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を含有するヒト TM4SF13 (RefSeq Accession No. NP_055214) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、 GenBank に RefSeq Accession No. NP— 079635 として登録されているマウスホモログ）、配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を含有するヒト TM4SF6 (RefSeq Accession No. NP_003261) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、 GenBank に RefSeq Accession No. NP_062630 として登録されているマウスホモログ）、配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するヒト LY - 6K (RefSeq Accession No. NP— 059997) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログなどがあげられる。本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従つて左端が N末端（ァミノ末端）、右端が C末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基（- C00H) 、力ルポキシレート（-C00-) 、アミド（- C0NH₂) またはエステル（- C00R) の何れであってもよい。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロヒ。ル、イソプロピル、 n—プチルなどのアルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなどの C ₃_₈シクロアルキル基、例えば、フエニル、 α—ナフチルなどの C₆— ₁₂ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチルなどのフエ二ルーアルキル基もしくは一ナフチルメチルなどの α—ナフチル一アルキル基などの 0₇_₁₄ァラルキル基、ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。本発明で用いられるタンパク質が C末端以外にカルボキシル基（または力ルポキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。

さらに、本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基（例、メチォニン残基）のァミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C wアルカノィルなどのァシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば一O H、一 S H、アミノ基、イミダゾーノレ基、インドール基、グァニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C wアルカノィル基などの C _x_₆ァシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。

本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つ該タンパク質と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定は、前記した本発明で用いられるタンパク質の場合と同様に行うことができる。

例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、好ましくは 5 0個以上、さらに好ましくは 7 0個以上、より好ましくは 1 0 0個以上、最も好ましくは 1 5 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが用いられる。

また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の 1または 2 個以上（好ましくは 1〜20個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数（1〜5、 4、 3もしくは 2) 個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に 1または 2個以上（好ましくは 1〜20個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数〜⁵、 4、 3もしくは 2) 個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ哮配列に 1または 2個以上（好ましくは 1〜²0個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数〜⁵、 4、 3もしくは 2) 個）のアミノ酸が揷入され、または、そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは 1〜20個程度、より好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは数（1〜5、 4、 3もしくは 2) 個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。

また、本発明で用いられる部分ペプチドは C末端がカルボキシル基（- C00H) 、カルポキシレート（- C00— ) 、アミド（- C0NH₂) またはエステル（-C00R) の何れであってもよい。ここでエステルにおける Rとしては、本発明で用いられるタンパク質について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドが C 末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がァミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ぺプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、 C末端のエステルと同様のものなどが用いられる。

さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、 N末端のアミノ酸残基（例、メチォニン残基）のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のァミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ぺプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。

本発明で用いられる部分べプチドは抗体作製のための抗原としても用いることができる。

本発明で用いられるタンパク質またはその部分ぺプチドは遊離体であつてもよいし、塩であってもよレ、（本明細書において、特にことわらない限り同様である）。そのような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基 (例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まレぃ。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロ.ピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明で用いられるタンパク質は、前述したヒトゃ他の温血動物の細胞または組織から、自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞を界面活性剤の存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ一等に付すことにより、本発明で用いられるタンパク質を調製することができる。

本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。

ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによつてもよい。すなわち、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを構成し得る部分ぺプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のタンパク質（ペプチド）を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i) 〜（V) に記載された方法が挙げられる。

(i) M. Bodanszky および Μ, Α. 0ndetti_N ベプチド · シンセシス (Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年)

(ii) Schroederおよぴ Luebke ザ ·ぺプチド (The Peptide)， Academic Press, New York (1965年）

(iii) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株）（1975年）

(iv)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）

(v) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14卷、ペプチド合成、広川書店このようにして得られたタンパク質（ペプチド）は、公知の精製法によ.り精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出 .蒸留 -力ラムクロマトグラフィー■液体クロマトグラフィー■再結晶などが挙げられる。上記方法で得られるタンパク質（ペプチド）が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質（ペプチド）が塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルァミン樹脂、アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2，， 4，ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4― ( 2，， 4，ージメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル）フエノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分べプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに髙希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ぺプチドまたはそれらのアミド体を取得する。

上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルポジイミド類がよい。カルポジィミド類としては、 D C C、 N , N ' —ジイソプロピルカルボジイミド、 N—ェチルー N，一（3—ジメチルァミノプロリル）カルポジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、 H O B t , H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B エステルとしてあらかじめ保護ァミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。

保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチノレビロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルォロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジォキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、ァセトニトリル，プロピオ二トリルなどの二トリル類、酢酸メチル，酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約 - 20〜約 50°Cの範囲から適宜選択される。活性化されたァミノ酸誘導体は通常 1. 5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を操り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。

原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。

原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキシ力ルポニル、イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベンジルォキシカルボニ^/、 C I— Z、 B r—Z、ァダマンチノレオキシカルボニル、トリフルォロアセチノレ、フタロイル、ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、ジブェニルホスブイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、ェチル、プロピル、プチノレ、 t一プチノレ、シクロペンチノレ、シクロへキシノレ、シクロヘプチル、シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状ァノレキルエステル化）、ァラルキルエステル化 (例えば、ベンジルエステル、 4― ュトロべンジノレエステノレ、 4ーメトキシペンジノレエステノレ、 4—クロ口ベンジノレエステル、ベンズヒドリルエステル化) 、フエナシルエステル化、ペンジノレオキシカルボニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。

セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、ァセチル基などの低級（C ^ ₆) アルカノィル基、ベンゾィル基などのァロイル基、ベンジルォキシカルポニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロビラ二ル基、 t—ブチル基などである。

チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、例えば、 B z 1 、 C 1 ₂— B z l 、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。

ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 T o s 、 4—メトキシ - 2 , 3 , 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、ベンジルォキシメチル、 B u m, B o c 、 T r t 、 F m o cなどが用いられる。

保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルアミン、ピぺリジン、ピぺラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリゥムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約- 20°C 〜約 40°Cの温度で行われるが、酸処理においては、例えば、ァニソール、フエノール、チオア二ール、メタクレゾール、ノラタレゾール、ジメチルスルフィド、 1 , 4—ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのィミダゾール保護基として用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、トリプトフアンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。

原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水. 物、アジド、活性エステノレ〔アルコール（例えば、ペンタクロロフエノール、 2， 4， 5—トリクロ口フエノーノレ、 2， 4—ジニトロフエノーノレ、シァノメチノレアルコール、ノラニトロフエノール、 H O N B、 N ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフタルイミド、 H O B t ) とのエステル〕などが用いられる。原料のァミノ基の活 I¹生化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。

タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルポキシ末端アミノ酸の Q!—カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ぺプチド鎖の N末端の α—アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ぺプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはべプチドを精製した後、上記方法によりすベての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。

タンパク質また.はペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはべプチドのエステル体を得ることができる。

本発明で用いられるタンパク質の部分べプチドは、本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコ一ドするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該タンパク質または該部分ぺプチドを分離精製することによつて製造することもできる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドは D N Aであっても R N Aであってもよく、あるいは D N AZR N Aキメラであってもよい。好ましくは D N Aが挙げられる。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖 D NA、二本鎖 R N Aまたは D N A ： R N Aのハイプリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コ一ド鎖）であってもよい。

本発明で用いられるタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、ゲノム D NA、ゲノム D NAライブラリ一、哺乳動物（例えば、ヒト、ゥシ、サノレ、ゥマ、プタ、ヒッジ、ャギ、ィヌ、ネコ、モノレモット、ラット、マウス、ゥサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞 [例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膝 β 細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、綠維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、 Τ細胞、 Β細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など] もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 [例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膝臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など] 由来の c DNA、合成 DNAなどが挙げられる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分べプチドをコードするゲノム DNAおよび c DNAは、上記した細胞 ·組織より調製したゲノム DNA画分および全 RNAもしくは mRNA画分をそれぞれ铸型として用い、 Polymerase Chain Reaction (以下、「P CR法」と略称する）および Reverse Transcriptase - P CR (以下、「R T— PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノム D N A および c DNAは、上記した細胞 ·組織より調製したゲノム DNAおよび全 RN Aもしくは mRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノム DN Aライブラリ一おょぴ c DN Aライプラリ一から、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法または P CR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライプラリーに使用するベクターは、パクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。

本発明で用いられるタンパク質をコードする DN Aとしては、例えば、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表される塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェントな条件下でハイプリダィズする塩基配列を含有し、配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする D N Aであれば何れのものでもよい。

配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズできる DNAとしては、例えば、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表される塩基配列と約 50%以上、好ましくは約 6 0 %以上、より好ましくは約 7 0 %以上、いっそう好ましくは約 8 0 %.以上、特に好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。

本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、以下の条件（期待値 =10；ギヤップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコア =1 ；ミスマッチスコア =- 3) にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。

ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えは、 Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリゥム濃度が約 19〜約 40mM、好ましくは約 19〜約 20mMで、温度が約 50〜約 70°C、好ましくは約 60〜約 65°C の条件を示す。特に、ナトリゥム塩濃度が約 19mMで温度が約 65°Cの場合が好ましい。当業者は、ハイプリダイゼーシヨン溶液の塩濃度、ハイプリダゼーシヨン反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダィゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジエンシーに容易に調節することができる。

本発明で用いられるタンパク質をコードする D N Aは、好ましくは、配列番号： 1で表される塩基配列を含有する D N A (Refseq Accession No. NM_00194l) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、 GenBankに RefSeq Accession No.丽_007882として登録されているマウスホモログ）、配列番号： 3で表される塩基配列を含有する D N A (Refseq Accession No. NM_024423) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ、配列番号： 5で表される塩基配列を含有する D N A (RefSeq Accession No. 画—014399) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモ口グ（例えば、 GenBankに RefSeq Accession No. 麗— 025359として登録されているマウスホモログ）、配列番号： 7で表される塩基配列を含有する D N A (RefSeq Accession No. NM— 003270)あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、 GenBankに RefSeq Accession No. NM_019656として登録されているマウスホモ口グ）、配列番号： 9で表される塩基配列を含有する D N A (RefSeq Accession No. 應_017527) あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログなどが挙げられる。本発明で用いられるタンパク質の部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチド (例、 D N A) としては、前述した本発明で用いられるタンパク質の部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであれぱいかなるものであってもよい。また、ゲノム D N A、ゲノム D N Aライプラリー、前記した細胞 '組織由来の c D NA、前記した細胞 '組織由来の c D N Aライプラリー、合成 D N Aのいずれでもよい。

本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードする D N Aとしては、例えば、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表される塩基配列の部分塩基配列、または配列番号： 1、配列番号： , 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、かつ本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする D N Aなどが用いられる。配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表される塩基配列とハイブリダィズできる D N Aとは、前記と同意義を示す。また、ハイブリダィゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件としては、前記と同様のものが用いられる。

本発明で用いられるタンパク質およびその部分ペプチド（以下、これらをコードする D N Aのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）をコードする D N Aのクローユングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 DN Aプライマーを用いて P C R法によって増幅する力、または適当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする D N A 断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイプリダイゼーシヨンによつて選別することができるノ、イブリダィゼーションの方法は、例えば、 Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライプラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

DNAの塩基配列の変換は、 PCR、公知のキット、例えば、 Mutan™-super Express Km (宝酒造（株））、 Mutan™- K (宝酒造（株） ) 等を用いて、 ODA- LA P CR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。

クローン化されたタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカ一を付加したりして使用することができる。該 DN Aはその 5，末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成 DNAァダプターを用いて付加することもできる。

本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、本発明のタンパク質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができ ¾。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、 p BR 3 22， p BR 32 5, p UC 1 2, p UC 1 3) 、枯草菌由来のプラスミド（例、 pUB 1 1 0, p TP 5, p C 1 94) 、酵母由来プラスミド（例、 p SH 1 9， p SH 1 5)、 λ ファージなどのバタテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pA l— 1 1、 p XT l、 R c/CMV p R c/R S V, p c DNA I ZN e oなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、 SRa プロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス）プロモーター、 S R CK プロモ一ターなどを用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r j)プロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 P_Lプロモーター、 l p pプロモーター、 T 7プロモータ一などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 S PO lプロモーター、 S PO 2プロモーター、 p e n Pプロモータ一などが、宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリへドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 SV40複製オリジン（以下、 SV40ori と略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マ一力一としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 dhfrと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセ一ト（MTX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 Amp¹"と略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 Nee と略称する場合がある、 G418耐性）等が挙げられる。特に、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスタ一細胞を用いて dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。

また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。宿主がェシェリヒァ属菌である場合は、 PhoA 'シグナル配列、 OmpA'シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、アミラーゼ - シグナル配列、サブチリシン ·シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、 MFひ ·シグナル配列、 SUC2 ' シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合には、ィンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン 'シグナル配列.、抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。

このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。宿主としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。

ェシェリヒァ属菌の具体例としては、例えば、ェシェリヒア 'コリ（Escherichia coli) K12 - DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60巻， 160 (1968)〕 , JM103 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1981)〕， JA221 [Journal of Molecular Biology, 120 卷， 517 (1978)〕， HB101 [Journal of Molecular Biology, 41卷， 459 (1969)〕， C600 [Genetics, 39卷， (1954) ) などが用いられる。

バチノレス属菌としては、例えば、バチルス 'サブチルス（Bacillus subtilis) I114 [Gene, 24卷， 255 (1983) ] ， 207-21 [Journal of Biochemistry, 95卷， 87 (1984)〕などが用いられる。

酵母としては、例えば、サッカロマイセス ' セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R -， NA87-11A, DKD-5D, 20B-12、シゾサッカロマイセス · ボンべ（Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036、ピキア 'パストリス (Pichia pastoris) KM71などが用いられる。

昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； Sf細胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルスが BmNPVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx raori N細胞； BmN細胞）などが用いられる。該 Sf 細胞としては、例えば、 Sf9細胞（ATCC CRL1711)、 Sf21細胞〔以上、 Vaughn, J. L. et al. , In Vivo, 13， 213-217 (1977) ] などが用いられる。

昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Maeda et al.， Nature, 315卷, 592 (1985)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞 COS- 1, COS- 3， COS- 7, Vero, チヤィニーズハムスター卵巣細胞（以下、 CH0細胞と略記）， dhfr遺伝子欠損 CH0細胞（以下、 CHO (dhfr—)細胞と略記），マウス L細胞，マウス At T- 20，マウスミエローマ細胞，マウス ATDC5細胞，ラット GH3，ヒト FL細胞，ヒト 293細胞、ヒト HeLa 細胞などが用いられる。

ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69卷， 2110 (1972) や Gene， 17巻， 107 (1982) などに記載の方法に従って行うことができる。

バチルス属菌を形質転換するには、例えば、 Mol. Gen. Genet. , 1δ8卷， 111 (1979) などに記載の方法に従って行うことができる。

酵母を形質転換するには、例えば、 Meth. Enzymol. , 194卷， 182- 1δ7 (1991) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75卷， 1929 (1978) などに記載の方法に従って行うことができる。

昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、 Bio/Technology, 6卷， 47 - 55 (1988) などに記載の方法に従って行うことができる。

動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール， 263-267 (1995) (秀潤社発行）、 Virology, 52巻， 456 (1973) に記載の方法に従って行うことができる。

このようにして、タンパク質をコードする D N Aを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。

宿主がェシエリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ ' リカー、ペプトン、力ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例え.ば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシゥムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添カロしてもよい。培地の pHは約 5〜約 8が望ましい。

ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含む Μ9 :Ι¾·地 [Miller, Journal of Experiments in Molecular

Genetics, 431— 433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕カ好ま Ι ヽ。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、 3 ]3—インドリノレアクリル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がェシェリヒァ属菌の場合、培養は通常約 15〜約 43°Cで約 3〜約 24時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 30〜約 40°Cで約 6〜約 24時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ一ルダー（Burkholder)最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77卷, 4505 (1980)〕や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330 (1984)〕が挙げられる。培地の pHは約 5〜約 8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20〜約 35°Cで約 24〜約 72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、

Grace' s Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962) ) に非働化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地の pHは約 6. 2〜約 6. 4に調整するのが好ましい。培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜約 5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約 5

〜約 20%の胎仔牛血清を含む MEM培地 [Science, 122卷， 501 (1952) ] ， DMEM 培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕， RPMI 1640培地〔J. Am. Med. Assoc. , 199 卷， 519 (1967)〕， 199培地〔Proc. Soc. Biol. Med. , 73卷， 1 (1950)〕などが用いられる。 pHは約 6〜約 8であるのが好ましい。培養は通常約 30〜約 40°Cで約

15〜約 60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。

上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。

本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよびノまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壌したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトン X - 100™などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。

このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および S D S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体ク口マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。

かくして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。

なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、 .トリプシン、キモトリブシン、アルギニルエンドべプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。

かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたェンザィムィムノアツセィゃウェスタンプロッティングなどにより測定することができる。さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコ一ドする D N Aに対応する R N Aを铸型として、ゥサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによつても合成することができる。あるいは、さらに R N Aポリメラーゼを含む無細胞転写/翻訳系を用いて、カルモジュリンまたはその部分ぺプチドをコ一ドする D N Aを铸型としても合成することができる。無細胞タンパク質（転写ノ）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は Pratt J. M.ら， "Transcription and Tranlation" , Hames B. D.および HigginsS. J.編， IRL Press, Oxford 179-209 (1984) に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものは E. coli S30 extract system (Promega社製）や RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製）等が挙げられ、ゥサギ網状赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものは PR0TEI0S™(T0Y0B0社製）等が挙げられる。このうちムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えば Johnston F. B.ら， Nature, 179， 160-161 (1957) あるいは Erickson A. H.ら， Meth. Enzymol. , 96, 38-50 (1996) 等に記載の方法を用いることができる。

タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Pratt, J. M. ら（1984) 前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Spirin A. S.ら， Science, 242, 1162-1164 (1988) )、透析法.（木川ら，第 21回日本分子生物学会， WID6)、あるいは重層法 (PR0TEI0S™ Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書： T0Y0B0 社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、錶型の R N A、アミノ酸、ェネルギ一源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開 2000-333673) 等を用いることができる。

本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記することがある）は、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクロ一ナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくは IgG、 IgMまたは IgA、特に好ましくは IgGが挙げられる。

また、本発明の抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR)を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えば Fab、 Fab，、 F (ab' ) ₂等のフラグメント、 scFv、 scFv- Fc、ミニボディー、ダイアポディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレンダリコール（PEG)等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。

本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、およぴ該抗体の製造法について説明する。

( 1 ) 抗原の調製

本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した本棻明のタンパク質またはその部分べプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる (以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。

本発明のタンパク質またはその部分ペプチドは、上記した通り、例えば、（a) ヒト、サル、ラット、マウス、 -ヮトリなどの温血動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b)ぺプチド ·シンセサイザ一等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c)本発明のタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドする D N Aを含有する形質転換体を培養、あるいは（d)本発明のタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドする核酸を铸型として無細胞転写 Z翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。 (a)温血動物の組織または細胞から本発明のタンパク質を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤ま,たはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた本発明のタンパク質をそのまま免疫原とすることもできるし、ぺプチダーゼ等を用いた限定分解により部分べプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。

(b) 化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成べプチドとしては、例えば上述の（a)の方法を用いて天然材料より精製した本発明のタンパク質と同一の構造を有するもの、具体的には、該タンパク質のアミノ酸配列において 3個以上、好ましくは 6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のァミノ酸配列を 1種あるいは 2種以上含有するぺプチドなどが用いられる。

(c) D N Aを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該 D N Aは、公知のクローニング方法〔例えば、 Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（1)本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインした D N Aプローブを用い、 c D N Aライプラリーからハイブリダィゼーション法により該抗原をコードする D N Aを単離するか、（2)本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインした D N Aプライマーを用い、 c D N Aを錄型として P C R法により該抗原をコードする D N Aを調製し、該 D N Aを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現べクタ一で宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。

(d) 無細胞転写 Z翻訳系を利用する場合、上記（c) と同様の方法により調製した抗原をコードする D N Aを挿入した発現ベクター（例えば、該 D N Aが T 7、 S P 6プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を铸型とし、該プ口モータ一に適合する R N Aポリメラーゼおよび基質（NTPs) を含む転写反応液を用いて m R N Aを合成した後、該 in R N Aを錄型として公知の無細胞翻訳系 (例：大腸菌、ゥサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。

免疫原としては完全な本発明のタンパク質分子やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば 3個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは 4個以上、より好ましくは 5 個以上、いっそう好ましくは 6個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば 2 0個以下の連続するァミノ酸残基からなるもの、好ましくは 1 8個以下、より好ましくは 1 5個以下、いっそう好ましくは 1 2個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例： 1ないし数個）は置換可能な基（例： Cys、水酸基等）によって置換されていていもよい。免疫原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を 1ないし数個含むアミノ酸配列を有する。あるいは、本発明のタンパク質を発現する温血動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。温血動物細胞としては、上記（a)項で述ぺたような天然の細胞、上記（c)項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニヮトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、 HEK293 C0S7、 CHO- Kl、 NIH3T3、 Balb3T3、 FM3A、 L929、 SP2/0、 P3U1、 B16、または P388 などが好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現する天然の温血動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、 RPMI1640) または緩衝液（例、 Hanks ' Balanced Salt Solution) に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。

本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に 1ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約 3， 000以下）の抗原（即ち、本発明のタンパク質の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キヤリァー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばゥシ、ゥサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばゥシ、ゥサギなどの哺乳動物のサイログ口プリン、例えば二ヮトリのオボアルブミン、例えばゥシ、ゥサギ、ヒト、ヒッジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンぺットへモシァニン（KLH) などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビュル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。該キヤリァ一とハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用きれている上記の天然もしくは合成の高分子キヤリァーを、重量比でハプテン 1に対し 0. 1〜100の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。

また、ハプテンとキャリアーの力プリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジァゾ化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、ァミノ基同士を架橋するダルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン一 2， 4 —ジイソシァネートなどのジイソシァネート化合物、チオール基同士を架橋する N， N ' —o—フエ二レンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、ァミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、ァミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルポジィミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋する際にも、一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、 3- (2 - ピリジルジチォ）プロピオン酸 N-スクシンィミジル (SPDP) など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のァミノ基にマレイミド活性ェステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。

( 2 ) モノクローナル抗体の作製

( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製

本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバン 1、や不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 1〜6週毎に 1回ずつ、計 2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒッジ、ャギ、ロバ、ニヮトリが挙げられる。抗 Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおょぴラットが好ましく用いられる。

ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、（i)後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、（ii)後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは（iii)体外免疫法とウィルスによる細胞不死化、ヒト一ヒト（もしくはマウス）ハイプリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗原を取得できる.可能性があることの他、 n gオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。

体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくは Bリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスゃラット細胞の場合、 4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出 *脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルべッコ改変イーグル培地（DMEM) 、 RPMI1640培地、ハム F12培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ゥシ血清（FCS； 5〜20%程度）添加培地に浮遊させて 4〜10 日間程度 C0₂インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば 0. 05〜5 / gが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。

ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、 IL - 2、 IL- 4、 IL-5、 IL- 6等数種のサイト力インおょぴ必要に応じてアジュバント物質 (例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。

モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後 4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。

骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイプリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイプリドーマの選択を.容易にするために、 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としては NS - 1、 P3U1、 SP2/0、 AP - 1 等が、ラット骨髄腫細胞としては R210. RCY3、 Y3 - Ag 1. 2. 3等が、ヒト骨髄腫細胞としては SK0- 007、 GM 1500- 6TG - 2、 LICR-L0N-HMy2、 UC729 - 6等が挙げられる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法 [ネイチヤー (Nature) 、 256卷、 495頁（1975年）] に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくは PEGなどが用いられる。 PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低い PEG1000〜PEG6000が好ましい。 PEG濃度としては例えば 10〜80%程度、好ましくは 30〜50%程度が例示される。 PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例： RPMI1640) 、 5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS) 、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望により DMS0 (例： 10〜20%程度）を添加することもできる。融合液の pHとしては、例えば 4〜10程度、好ましくは 6〜8程度が挙げられる。

抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常 1 : 1〜20 : 1 程度であり、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。

抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウィルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによつても得ることができる。そのようなウィルスとしては、例えばェプスタイン一バー（EB) ウィルス等が挙げれらる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウィルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常の EBウィルスを用いた場合にはウィルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウィルス混入の可能性のない EBシステムとして、 Bリンパ球を不死化する能力を保持するがウィルス粒子の複製能力を欠損した組換え EBウィルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のィツチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。マーモセット由来の B95- 8細胞は EB ウィルスを分泌しているので、その.培養上清を用いれば容易に Bリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びぺュシリン /ストレプトマイシン（P/S)添加培地（例： RPMI1640) もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生 Bリンパ球を適当な濃度（例：約 10⁷細胞/ mL) で浮遊させて、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 0. 5〜2 時間程度ィンキュベートすることにより抗体産生 B細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人は EBウイルス感染細胞に対して傷害性を示す Tリンパ球を有しているので、トランスフォ一メーシヨン頻度を高めるためには、例えばヒッジ赤血球等と Eロゼットを形成させることによって Tリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒッジ赤血球を抗体産生 Bリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的な Bリンパ球はキャップされて表面に IgGを提示しなくなるので、抗 IgG抗体を結合したヒッジ赤血球と混合すると抗原非特異的な Bリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的 Bリンパ球を選別することができる。

トランスフォーメーションによつて無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、ァミノプテリン、チミジン）を添加して、 5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例： RPMI1640) もしくは細胞増殖因子を添加した無血淸培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約 0. lmM、約 0. 4 μ Μ および約 0. 016mM等が挙げられる。ヒト一マウスハイプリドーマの選択にはゥヮバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてゥヮバインに対する感受性が高いので、 10— ⁷〜10—³M程度で培地に添加することによ.り未融合のヒト細胞を排除することができる。

ハイプリドーマの選択にはフィーダ一細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダ一細胞としては、ハイプリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイプリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダ一細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダ一細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上淸が挙げられる。

また、ハイプリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（FACS) を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイプリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。

標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。

アミノブテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は 10〜14 日以内に死滅するので、融合 2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイプリドーマについては通常融合後 4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後 1週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合 7〜10 日後にヒポキサンチンおょぴチミジン（HT) 添加完全培地（例： 10% FCS 添加 RPMI1640) の添加または交換を行う。融合後 8~14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が 1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分べプチド (抗原決定基として用いた部分ァミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例： ¹²⁵1， ¹³¹1, ¾， ¹⁴C) 、酵素（例： β—ガラクトシダーゼ、 ]3— ダルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲ二ン）などで標識した抗免疫グロブリン（IgG) 抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来の IgGに対する抗体が用いられる）またはプロテイン Aを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗 IgG抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。

クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングや FACSを用いたクローユング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローユングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。上記のようにして抗体量を測定して陽性ゥュルを選択する。適当なフィーダ一細胞を選択して 96ゥエルプレートに添加しておく。抗体陽性ゥエルから細胞を吸い出し、完全培地（例： 10% FCSおよび P/S添加 RMPI 1640) 中に 30細胞/ mLの密度となるように浮遊させ、フィーダ一細胞を添加したゥエルプレートに 0. lmL (3 細胞/ゥェル）加え、残りの細胞懸濁液を 10細胞/ mLに希釈して別のゥエルに同様にまき（1細胞/ゥエル）、さらに残りの細胞懸濁液を 3細胞/ mLに希釈して別のゥエルにまく（0. 3細胞/ゥエル）。目視可能なクローンが出現するまで 2〜3 週間程度培養し、抗体量を測定 ·陽性ゥュルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローユングが比較的困難なので、 10細胞/ゥエルのプレートも調製しておく。通常 2回のサブクローユングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ケ月間定期的に再クローユングを行うことが望ましい。

ハイプリドーマはィンビトロまたはインビボで培養することができる。

インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを、細胞密度を例えば 10⁵〜10⁶細胞 /mL程度に保ちながら、また、 FCS濃度を徐々に減らしながら、ゥエルプレートから徐々にスケールアツプしていく方法が挙げられる。

インビポでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（M0PC) を誘導したマウス（ハイプリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、 5〜10 日後に 10⁶~ 10⁷細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、 2〜5 週間後に麻酔下で腹水を採取する方法が挙げられる。

( b ) モノクローナル抗体の精製

モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロプリンの分離精製法 [例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、ィオン交換体（例： DEAE、 QEAE) による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など] に従って行うことができる。

以上のようにして、ハイプリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。

本発明の抗体を癌予防 ·治療に利用する場合、該抗体は抗腫瘍活性を持つものでなければならないので、得られたモノク口一ナル抗体の抗腫瘍活性の程度について調べる必要がある。抗腫瘍活性は、抗体の存在下および非存在下における癌細胞の増殖、アポトーシス誘導などを比較することにより測定することができる。好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウスーヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒトーヒト（もしくはマウス）ハイプリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。

( i ) キメラ抗体の作製

本明細書において「キメラ抗体」とは、 H鎖および L鎖の可変領域（V_Hおよび V_L) の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（C_Hおよび CJ の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイプリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。

キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第 6, 331, 41⁵号に記載される方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ（例えば、マウス一マウスハイブリドーマ）から、常法に従って mRNAもしくは全 RNAを調製し、 cDNA を合成する。該 cDNAを鍀型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマ一として V_Hおよび V_Lの各 N末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴ D' N A、アンチセンスプライマーとして C_Hおよび C_Lの N末端配列をコードする塩基配列とハイプリダイズするオリゴ D N A (例えば Bio/Technology， 9： 88-89, 1991 参照））を用い、常法に従って PCRで V_Hおよび V_Lをコードする DNAを増幅'精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリンパ球等より調製した RNAから RT- PCRにより C_Hおよび C_Lをコードする DNAを増幅■精製する。常法を用いてと C_H、 V_Lとをそれぞれ連結し、得られたキメラ H鎖 DNAおよびキメラ L鎖 DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、 CH0細胞、 COS細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例： CMVプロモーター、 SV40プ口モーター等）を含むベクターなど）に揷入する。両鎖をコードする DNAは別個のベクターに揷入してもよいし、 1個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラ H鎖およびキメラ L鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チヤィニーズハムスター卵巣 (CH0) 細胞、サル由来の C0S-7細胞、 Vero細胞、ラット由来の GHS細胞などが挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクト口ポレーシヨン法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてゥシ、ャギ、ニヮトリ等のトランスジエニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジエニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジエニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションゃエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーテイクガン法や Tiベクター法などを用いてトランスジエニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。

得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すれば Fabが、ペプシンで分解すれば F (ab' ) ₂がそれぞれ得られる。

また、マウス V_Hおよび V_Lをコードする DNAを適当なリンカ"、例えば 1〜40 アミノ酸、好ましくは 3〜30アミノ酸、より好ましくは 5〜20ァミノ酸からなるぺプチド（例： [Ser- (Gly) m] nもしくは [ (Gly) m- Ser] n (mは 0〜10の整数、 nは 1 〜5の整数）等）をコードする DNAを介して連結することにより scFvとすることができ、さらに C_H3をコードする DNAを適当なリンカーを介して連結することにより minibodyモノマーとしたり、C_H全長をコードする DNAを適当なリンカーを介して連結することにより scFv-Fcとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードする DNAは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。

マウス V_Hおよび V_Lをコードする DNAを 1つのプロモーターの下流にタンデムに揷入して大腸菌に導入すると、モノシストロエックな遺伝子発現により Fvと呼ばれるニ量体を形成する。また、分子モデリングを用いて V_Hおよび V_Lの FR中の適当なアミノ酸を Cysに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合により dsFv と呼ばれる二量体が形成される。

(i i) ヒト化抗体

本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域 (CDR) 以外のすべての領域（即ち、定常領域おょぴ可変領域中のフレームワーク領域

(FR) ) の配列がヒト由来であり、 CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイプリド一マを作製することができる動物種が好ましい。

ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第 5, 225， 539号、第 5, 585， 089 号、第 5, 693, 761号および第 5， 693， 762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例：マウス）由来の V_Hおよび V_Lをコードする DNA を単離した後、常法により自動 DNAシークェンサ一（例： Appl ied Biosystems社製等）を用いてシークェンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース [例えば、 Kabat database (Kabat り， I Sequences of Proteins of Immunological Interest J， lb Department of Health and Human Services, Publ ic Health Service, NIH編，第 5版， 1991参照）等] を用いて解析し、両鎖の CDRおよび FRを決定する。決定された FR配列に類似した FR配列を有するヒト抗体の L鎖および H鎖をコードする塩基配列 [例：ヒト κ型 L鎖サブグループ Iおよびヒト H鎖サブグループ Πもしくは I I I (Kabatら， 1991 (上述）を参照） ] の CDRコード領域を、決定された異種 CDRをコ一.ドする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を 20〜40塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように 20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントを DNAシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダィズおよびライゲートさせることにより、ヒト由来の FRと他の哺乳動物種由来の CDRを有する V_Hおよび V_Lをコードする DNAを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来 CDRをヒト由来 V_Hおよび V_Lに移植するには、 PCR による部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平 5-227970号公報に記載の逐次 CDR移植法等が挙げられる。このようにして得られる V_Hおよび V_Lをコードする DNAを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来の C_Hおよび C_Lをコードする DNAとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。

ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いて scFv、 scFv - Fc、 minibody、 dsFv、 Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。

ヒト化抗体作製技術は、例えばハイプリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ニヮトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やィヌゃネコなどのぺット動物などが対象として挙げられる。

(iii) ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製

内因性免疫グロブリン（Ig) 遺伝子をノックアウト（K0) した非ヒト温血動物に機能的なヒト Ig遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイプリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒト Igの H鎖および L鎖のミエ遺伝子を通常のトランスジエニック（Tg) 技術を用いて導入したマウスと、内因性マウス Ig遺伝子を通常の K0技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Immunol.

Today, 17： 391-397, 1996を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒト Igヒト抗体（HAHA) の産生は報告されていない。

その後、 Abgenix社 [商品名： XenoMouse (Nat. Genet. , 15 : 146-156， 1997；米国特許第 5， 939， 598号等を参照） ] や Medarex社 [商品名： Hu- Mab Mouse (Nat. Biotechnol. , 14： 845-851, 1996；米国特許第 5, 545， 806号等を参照） ] が酵母人工染色体（YAC)ベクターを用いてより大きなヒト Ig遺伝子を導入した Tgマウスを作製し、よりレパートリ一に富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒト Ig遺伝子は、例えば H鎖の場合、約 80種の V断片、約 30種の D断片おょぴ 6種の J断片が様々に組み合わされた VDJェクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長は H鎖が約 1. 5Mb (14番染色体）、 fc L鎖が約 2Mb (2番染色体）、 L鎖が約 1Mb (22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各 Ig遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、 BAC、 YAC等）に揷入可能な DNAは通常数 kb〜数百 kbであり、クローユングした DNAを受精卵に注入する従来のトランスジェユック動物作製技術では全長の導入は困難であった。

Tomizukaら（Nat. Genet. , 16： 133-143, 1997) は、 Ig遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（hCF) をマウスに導入して（染色体導入（TC) マウス）、完全長ヒト Ig遺伝子を有するマウスを作製した。即ち、まず、 H鎖遺伝子を含む 14 番染色体および _K L鎖遺伝子を含む 2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒトーマウスハイプリッド細胞を 48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例；コルセミド）で処理して、 1〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウス ES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒト Ig遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイプリッド ES細胞を選択し、通常の K0マウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト 14番染色体断片を伝達する TCマウス系統（TC (hCF14) )およびヒト 2番染色体断片を伝達する TCマウス系統（TC (hCF2) ) を樹立する。常法により内因性 H鎖遺伝子および _K L鎖遺伝子を K0されたマウス（KO (IgH)および K0 (Ig _K ) ) を作製し、これら 4系統の交配を繰り返すことにより、 4種の遺伝子改変をすベて有するマウス系統（ダブル TC/K0) を樹立することができる。

上記のようにして作製されるダブル TC/K0マウスに、通常のマウスモノクロ一ナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクロ一ナル抗体産生ハイプリドーマを作製することができる。しかしながら、 _K L鎖遺伝子を含む hCF2がマウス細胞内で不安定なため、ハイプリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。

一方、前記 Hu- Mab Mouseは κ L鎖遺伝子の約 50%を含むが、可変領域クラスタ一が倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等の c 鎖の多様性を示し (他方、 H鎖遺伝子は約 10%しか含まないので H鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、且つ YACベクター (Ig _K -YAC) によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、 TC (hCF14)マウスと Hu- Mab Mouseとを交配して hCF14と Ig κ -YACとを安定に保持するマウス（商品名： KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイプリドーマ取得効率おょぴ抗体の抗原親和性を得ることができる。

さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、 L L鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法で； L L鎖遺伝子を担持するヒト 22番染色体もしくはその断片を導入した TCマウス（TC (hCF22) ) を作製し、これと上記ダブル TC/K0 マウスや KMマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えば H鎖遺伝子座と鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（HAC) を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Nat. Biotechnol. , 18 : 1086-1090， 2000) 。

本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが望ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイプリドーマの利用を要しないので、ハイプリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジエニック技術は確立されている動物種好ましくはゥシ等の有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、 Nat. Biotechnol. , 20： 889-894, 2002参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによつて精製することがでさる。

(iv) ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製完全ヒト抗体を作製するもう 1つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法である。この方法は PCRによる変異が CDR以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数の HAHA産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウィルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。ファージディスプレイヒト抗体ライプラリーの作製方法としては、例えぼ、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。

用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ffバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、 g3p、 g6p〜g⁹p のコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現■提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのは _g3p.もしくは _g8pの N末端側に融合させる方法である。ファージデイスプレイベクターとしては、 1)ファージゲノムのコートタンパク質遺伝.子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすベて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、 2)融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に揷入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、 3)融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、 1)の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには 2)または 3)のタイプが用いられる。

具体的なベクターとしては、 Holtら（Curr. Op in. Biotechnol. , 11： 445-449, 2000) に記載されるものが例示される。例えば、 pCESl (J. Biol. Chem. , 274： 18218-18230, 1999参照）は、 1つのラクトースプロモーターの制御下に _g3pのシグナルぺプチドの下流に κ L鎖定常領域をコードする DNAと g3pシグナルぺプチドの下流に CH3をコ^ "ドする DNA、His- tag、 c-myc tag,アンバー終止コドン（TAG) を介して g3pコード配列とが配置された Fab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入すると g3pコートタンパク質上に Fabを提示する力アンバー変異を持たない HB2151株などで発現させると可溶性 Fab抗体を産生する。また、 scFv発現型ファージミドベクターとしては、例えば pHENi a. Mol. Biol. , 222 : 581-597， 1991) 等が用いられる。

一方、ヘルパーファージとしては、例えば M13- K07、 VCSM13等が挙げられる。また、別のファ^ "ジディスプレイベクタ一として、抗体遺伝子の 3，末端とコートタンパク質遺伝子の 5，末端にそれぞれシスティンをコ一ドするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシスティン残基同士による S-S結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Morphosys 社の CysMsplay™技術）等も挙げられる。

ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ Z非免疫ライプラリー、合成ライブラリー、免疫ライプラリー等が挙げられる。

ナイーブ /非免疫（non - inmmnized) ライプラリーは、正常なヒトが保有するおよび V_L遺伝子を RT- PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローユングして得られるライブラリ一である。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来の mRNA等が鎊型として用いられる。疾病履歴などの V遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススィツチが起こっていない IgM由来の raRNAのみを増幅したものを特にナイーブラィプラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、 CAT社のライプラリー（J. Mol. Biol. , 222： 581-597, 1991； Nat. Biotechnol. , 14： 309-314, 1996参照）、 MRC 社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol. , 12： 433-455, 1994参照）、 Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem. , 1999 (上述）； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14 : 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。

合成ライプラリーは、ヒト B細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選ぴ、 V遺伝子断片の、例えば CDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードする DNAで置換し、ライプラリー化したものである。最初から機能的な scFvや Fabを産生する V_Hおよび V_L遺伝子の組み合わせでライブライリ一を構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、 Morphosys社の HuCALライプラリー（J. Mol. Biol. , 296： 57 - 86, 2000参照）ゝ Biolnvent社のライプラリー (Nat. Biotechnol" 18： 852, 2000 参照）、 Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 : 3938， 1995 ; J. Immunol. Methods, 272： 219-233, 2003参照）等が挙げられる。

免疫（immunized) ライブラリ一は、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ/非免疫ライプラリーの場合と同様にして . mRNA を調製し、 RT- PCR法によって V_Hおよび V_L遺伝子を増幅し、ライプラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリ一中に含まれるので、比較的小さなサイズのライプラリーからでも目的の抗体を得ることができる。

ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（10^u〜10¹³ファージ）と通常のパンユングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（100〜1, 000ファージ /クローン）を考慮すれば、 10⁸〜10^uクローン程度が適当であり、約 10⁸クローンのライブラリーで通常 10— ⁹オーダーの Kd値を有する抗体をスクリ一ユングすることができる。標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンユングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を 3〜5 回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やァフィ二ティークロマトグラフィ一で用いられる各種担体、例えばァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンプレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（SPR) のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を角いる方法でもよい。例えばビォチン一（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原である内因性リガンドがぺプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、 BSA溶液などのプロッキング液（1-2 回）、 Tween等の界面活性剤を含む PBS (3-5回）などを順次用いることができる。クェン酸緩衝液（pH5) などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例： 0. 1M塩酸など）が用いられるが、特異的プロテア.ーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染 ·増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいは S-S結合の還元（例えば、前記した CysDisplay™では、パンユングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。

パンユングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例： ELISA、 RIA、 FIA等）や FACSあるいは SPR を利用した測定により抗原結合活性を確認する。

選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離 ·精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例： HB2151株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリブラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。 His- tagや C- myc tagを導入しておけば、 IMACゃ抗 c-myc抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンユングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテア一ゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。

ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ニヮトリなどの家畜 (家禽）として広く繁殖されている動物やィヌゃネコなどのぺット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。

( 3 ) ポリクローナル抗体の作製

本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従つて製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。

温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァータンパク質との複合体に関し、キヤリァータンパク質の種類おょぴキヤリァータンパク質とハプテンとの混合比は、キヤリァータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよい力例えば、ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロプリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0. 1〜約 20、好ましくは約 1〜約 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。

また、ハプテンとキャリアータンパク質の力プリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、ダルタルアルデヒドゃカルポジイミド、マレイミド活性ェステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。

縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約 1〜約 6週毎に 1回ずつ、計約 2〜約 10回程度行われる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水.など、好ましくは血液から採取することができる。

抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行うことができる。

目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、即ち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドは、該目的ポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。

本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、 D N A (以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、本発明のタンパク質をコードする D N Aを本発明の D N Aと略記する場合がある））の塩基配列に、相捕的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例、 D N A) の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのァンチセンスポリヌクレオチドであってもよい。

本発明の D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明の D N Aに相補的な塩基配列（すなわち、本発明の D N Aの相補鎖）の塩基配列と、オーバ一ラップする領域に関して、約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列である。ここで「相同性」とは、前記した本発明の D N Aの場合と同義である。特に、本発明の D N Aの相捕鎖の全塩基配列のうち、（a)翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質の N末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約％%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（b) RNaseHによる R N A分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明の D N Aの全塩基配列の相補鎖と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。

具体的には、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表わされる塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは、例えば、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。

本発明の D N Aの塩基配列に相捕的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドともいう）は、クローン化した、あるいは決定された本発明のタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子 (以下、単に本発明の遺伝子ともいう）の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子から転写される R N A (m R N Aまたは初期転写産物）とハイブリダィズすることができ、 m R N Aの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができるか、あるいは本発明の遺伝子に関連する R N Aとの相互作用を介して本発明の遺伝子の発現を調節■制御することができる。本発明の遺伝子に関連する R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明の遺伝子に関連する R N Aと特異的にハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明の遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの標的領域は、アンチセンスポリヌクレオチドがハイプリダイズすることにより、結果として本発明のタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードする m R N Aの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約 10 塩基程度、長いもので m R N Aまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約 10〜約 40塩基、特に約 15〜約 30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、本発明の遺伝子の 5，端ヘアピンループ、 5，端 6-ベースペア ' リピート、 5，端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、 0RF翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3，端パリンドローム領域または 3，端ヘアピンループなどが、ァンチセンスポリヌクレオチドの好ましい標的領域として選択されうるが、本発明の遺伝子内の如何なる領域も対象として選択されうる。例えば、該遺伝子のイント口ン部分を標的領域とすることもできる。

さらに、本発明のアンチセンスポリヌクレ^チドは、本発明のタンパク質の m R N Aもしくは初期転写産物とハイプリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖 D N Aである本発明の遺伝子と結合して三重鎖（トリプレッタス）を形成し、 R N Aの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいは D NA : R N Aハイプリッドを形成して RNaseHによる分解を誘導するものであってもよい。

ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスポリヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチォエート、メチノレホスホネート、ホスホロジチォネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デォキシリボース）は、 2 ' —O—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7もしくは配列番号： 9で表わされる塩基配列を有する D N Aにハイブリダィズするものであればいずれのものでもよい。

アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシ一 D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、 2本鎖 D N A、 1本鎖 D N A、 2本鎖 R N A、 1本鎖 R N A、 D N A : R N Aハイプリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、 1 個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、力ルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチォエート、ホスホロジチォエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレア一ゼ 'インヒビタ一、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ一 L—リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物 (例、アタリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、 ^属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、 α ァノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸 J とは、プリンおょぴピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、ァシル化されたプリンおょぴピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、ァミンなどの官能基に変換されていてよい。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 R N A、 D N Aまたは修飾された核酸（R N A、 D N A) である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チォホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えば Pharm Tech Japan, 8巻， 247頁または 395頁， 1992年、 Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993年などで数多く報告されている。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リボゾーム、ミクロスフエアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロ口ホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の 3 ' 端または 5，端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の 3' 端または 5' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、ェキソヌクレアーゼ、 RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキヤップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。

本発明のタンパク質をコードする mRN Aもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリポザィムもまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含され得る。「リボザィム」とは核酸を切断する酵素活性を有する RN Aをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するォリゴ D N Aも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限り DNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザィムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドゃウィルソィド等の感染性 RNAに見られるセルフスプライシング RNAがあり、ハンマーへッド型ゃヘアピン型等が知られている。ハンマーへッド型は約 40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーへッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約 10塩基程度）を mR N Aの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的 mR N Aのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザィムは、 RNAのみを基質とするので、ゲノム DNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。本発明のタンパク質の mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、 RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウィルス核酸由来の RNAモチーフを連結したハイプリッドリボザィムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)] 。さらに、リポザィムを、それをコードする DN Aを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、 t RNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリポザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res. , 29(13)： 2780-2788 (2001)] 。本明細書においては、本発明のタンパク質の mRN Aもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なオリゴ RNAとその相補鎖とからなる二本鎖 RNA、いわゆる s i RNAもまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含されるものとして定義される。短い二本鎖 RNAを細胞内に導入するとその RNAに相捕的な mRNAが分解される、いわゆる RNA干渉（RNA i ) と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来 [Nature, 411(6836)： 494-498 (2001)] 、リボザィムの代替技術として汎用されている。 s i RNAは標的となる mRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例： RNAi Designer; Invitrogen) を用いて適宜設計することができる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及ぴリボザィムは、本発明の遺伝子の c DN A配列もしくはゲノミック DNA配列に基づいて mRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販の DNA//RNA自動合成機（アブライド - バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。 s i RNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を DNAZRN A自動合成機でそれぞれ合成し、適当なァニーリング緩衝液中、約 90〜約 95°Cで約 1分程度変性させた後、約 30〜約 70°Cで約 1〜約 8時間ァニ一リングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌタレォチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーシヨンすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、 s i RNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ（例えば約 3〜約 10塩基）のリンカ一を介して連結した R NA ( s h RNA) として合成し、導入する動物細胞内の酵素ダイサー (dicer) などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードする DN Aがそれぞれ別個の U 6や H 1などの Pol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介して連結した R N A鎖をコ^"ドす.る D N Aが Pol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、 s i R N Aを形成させてもよい。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外の本発明の遺伝子発現系、または生体内や生体外の本発明のタンパク質翻訳系を用いて調べることができる。

以下に、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする D N A (以下、単に本発明の D NAと略記する場合がある）、上述の本発明の抗体、上述の本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの用途を説明する。

本発明のタンパク質は、癌組織で発現が増加するので、疾患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、癌組織における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。

さらに、本発明のタンパク質のうち Desmocollin- 3、 TM4SF6および LY - 6Kについて、その発現およびまたは活性を阻害することにより、癌細胞のアポトーシスが促進され、癌細胞の増殖が抑制されるので、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の抗体、あるいは上記タンパク質の発現おょぴ Zまたは活性を阻害する物質（例、低分子化合物）を含有する医薬は、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤、従って、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、'精巣癌、甲状腺癌、瞵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 ·治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌などの予防，治療剤）として使用することができる。尚、本明細書において「癌細胞」とは、将来的に癌化するように方向づけられている細胞をも含む概念として用いられる。

一方、 TM4SF13は、インテグリンと相互作用して、インテグリンと細胞外マトリックス成分（例えば、フイブロネクチン、ラミニン等）との関係性を変化させ得る。インテグリンの発現が癌細胞の生体内における増殖速度や転移などの悪性度と密接に関連していることが報告されており、そのリガンドであるフイブロネクチンやラミニンと結合して、基底膜浸潤等の癌細胞の転移過程で重要な役割を果たすと言われている。その一方で、インテグリンの高発現にともなって、 HER- 2 シグナルが抑制され、大腸癌の増殖、腫瘍原性が低下することが報告されている (Mol Biol Cel l. 1995 ; 6 (6) : 725- 740. , J Biol Chem.

2005 ; 280 (19) : 19027—19035. )。

従って、 TM4SF13の発現および/または該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節（阻害または促進など）することにより、癌細胞のアポトーシスが促進され、癌細胞の増殖が抑制されるので、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の抗体、あるいは上記タンパク質の発現おょぴまたは該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質（例、抗体、ポリヌクレオチドなど）を含有する医薬は、癌細胞のアポトーシス促進おょぴノまたは増殖阻害剤、従つて、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防，治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌などの予防 ·治療剤）として使用することができる。

( 1 ) 本発明の抗体を含有する医薬

本発明の抗体（中和抗体）は、本発明のタンパク質の活性を中和することができるため、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、瞵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 - 治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌などの予防-治療剤）として使用することができる。本発明において中和とは、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）、捕体依存性細胞傷害活性（CDC活性）、癌細胞の増殖シグナルの阻害（狭義の中和活性）、アポトーシスの誘導など（これらに限定されない）を包括した概念として定義される。 TM4SF13は、上記のとおり細胞周囲の環境（例えば、臓器、癌種など）に依存して細胞増殖を促進するかまたは抑制するように作用する可能性があるため、 TM4SF13に対する抗体は、細胞周囲の環境に依存して中和抗体または非中和抗体 (好ましくはァゴ-スト抗体）のいずれかであり得る。本発明において、非中和抗体とは、 TM4SF13とインテグリンとの相互作用を全く阻害しないか、あるいは TM4SF13が全体として、癌の抑制に必要なインテグリンとの相互作用を保持する程度にしか TM4SF13を阻害しないことを意味する。即ち、抗体が TM4SF13を安定化することにより該タンパク質レベルが増大するために、個々の TM4SF13分子の活性が部分的に阻害されても全体として所望の活性を発揮し得る場合があるので、見かけ上該抗体は TM4SF13を中和しない。また、本発明において、ァゴニスト抗体とは、 TM4SF13とインテグリンとの相互作用を増強する抗体を意味する。

本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤、促進剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物 (例、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。

本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであつても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによつて調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、プドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アル.コール (例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 、polyoxyethy丄 ene (50mo丄) adduct of hydrogenated castor oi l) 〕 ^ fif ffl L てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。

経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。

上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常 5〜500 、とりわけ注射剤では 5〜： 100mg、その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。

本発明の抗体を含有する上記製剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療 ·予防のために使用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、通常 0. 01〜20ing/kg体重程度、好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1曰 1〜5回程度、好ましくは 1 日 1~3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。

なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。

さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスフアミド、ィフォスフアミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、 5— フルォロウラシル等) 、抗癌性抗生物質 (例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスブラチン、カルポプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体おょぴ上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。

( 2 ) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬

本発明の遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該遺伝子の発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明の遺伝子の機能や作用を抑制し、癌細胞のァポトーシスを誘導することができるので、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、脖臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防，治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、滕臓癌などの予防 ·治療剤）として使用することができる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤、アポト.一シス促進剤、増殖阻害剤などとして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。

また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロゥィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスァソシエーテツドウィルスべクタ一などの適当なベクターに揷入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。

さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。

該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重 60kg) においては、一日にっき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0. 1〜約 lOOmg投与する。

本発明のタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含むポリヌクレオチド（本発明のセンスポリヌクレオチドともいう）および本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明の遺伝子の発現状況を調べるための診断用ヌクレオチドプローブ（もしくはプライマー）として使用することもできる。

( 3 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング

本発明のタンパク質は癌組織で発現が亢進しており、さらに、 Desmocollin- 3、 TM4SF6および LY-6Kタンパク質の発現および/または活性を阻害、あるいは TM4SF13タンパク質の発現およびノまたは該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節すると、癌細胞がアポトーシスを起こし、癌細胞の増殖が抑制され得る。従って、 Desraocollin- 3、 TM4SF6および LY- 61 (タンパク質の発現およぴノまたは活性を阻害する化合物またはその塩、あるいは TM4SF13タンパク質の発現および Zまたは該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する化合物またはその塩は、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 - 治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌などの予防■治療剤）として使用することができる。

したがって、本発明のタンパク質（Desmocollin-3、 TM4SF6および LY- 6K) は、該タンパク質の発現およびまたは活性を阻害する化合物またはその塩のスクリ一ユングのための試薬として有用である。

すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、該タンパク質の発現および Zまたは活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。

本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩をスクリーユングする場合、該スクリーニング方法は、

(a-1)単離された本発明のタンパク質の活性を、被験物質の存在下と非存在下とで比較する方法と、

(a- 2)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における本発明のタンパク質の活性を比較する方法とに大別される。

上記（a-1) のスクリーニング方法において用いられる本発明のタンパク質は、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの製造方法を用いて、単離 ·精製することができる。上記（a- 2)のスクリーユング方法において用いられる本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、それを生来発現しているヒトもしくは他の温血動物細胞またはそれを含む生体試料（例：血液、組織、臓器等）であれば特に制限はないが、例えば、ヒト乳癌細胞株 MCF7、 T47D等が挙げられる。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。

また、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、 C0S7細胞、 CH0細胞、 HEK293細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。被験物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。

上記（a-l)のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の活性の測定は、例えば、（i)本発明のタンパク質、または（ii) 本発明のタンパク質および被験物質を、本発明のタンパク質により細胞増殖シグナルが活性化される温血動物細胞と接触させ、該細胞における細胞増殖またはアポトーシス誘導を測定することによって行うことができる。また、上記（a-I)のスクリーユング方法における本発明のタンパク質の活性の測定は、該本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞における細胞増殖またはアポトーシス誘導を測定することによって行うことができる。

アポトーシス（細胞死）誘導を指標とする場合には、細胞を適当な培地または緩衝液に懸濁し、被験物質を添加し（あるいは添加せずに）、さらに酸化ストレス（例： 0₂添加）等の刺激を加えて、通常約 20〜約 40°C、好ましくは約 30〜約 37°Cで約 6〜約 72時間ィンキュベートした後で、アポトーシス（細胞死）誘導率を測定する。アポトーシス（細胞死）は、例えば、光学顕微鏡、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いた形態学的観察により膜のブレツビング（blebbing) 、細胞サイズの縮小化、クロマチン凝縮、 D N A断片化等を検出することにより調べることができる。例えば、マルチウエルプレート中で細胞を培養し、プレートから剥離した細胞あるいは膜のプレツビングを生じた細胞を顕微鏡下で計数し、視野中の全細胞に占める死細胞の割合（％) を計算する。数視野で観察を行ってそれらの平均値を細胞死誘導率とする。また、トリパンブルー、エリス口シン B、ネグロシン、ェォシン Y、フルォレツセンジアセテート、ァクリジンオレンジ、ェチジゥムプ口マイド等の色素を用いて死細胞を染色、顕微鏡下で計数することによつても細胞死誘導率を導出することができる。さらに、 DAPIやへキスト 33342等の蛍光色素を用いて D N Aを染色し、蛍光顕微鏡下でクロマチン凝縮の起こっている細胞を計数することもできる。あるいは、断片化された D N Aの 3 ' 末端にターミナノレ -デォキシヌクレオチジル' トランスフェラーゼ（TdT) を用いてビォチンや蛍光色素などで標識した d U T Pを付加させ（TUNEL法）、強く染色された細胞数を光学顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いて計数することにより、アポトーシス誘導率を算出することもできる。

また、粒子サイズ測定装置（例： Coulter multisizer等）を用いて細胞サイズ分布を測定することにより縮小化 ·断片化した細胞数を計数し、アポトーシス誘導率を計算することができる。あるいは、フローサイトメトリー（FACS) を用いて細胞サイズの縮小 'アポトーシス小体への断片化を検出することにより、生死細胞を分離、細胞死誘導率を算出することもできる。

さらには、常法を用いて細胞から染色体 D N Aを抽出し、ゲル電気泳動して D N Aの断片化の度合をデンシトメ一ターなどを用いて測定することにより、生化学的にアポトーシスを検出することもできる。あるいは、

3- (4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 力 S生細胞によりホルマザンに還元されることを利用して、マイクロプレートリーダーを用いて 570〜630nmにおける吸光度の減少を測定することにより細胞死誘導率を算出することもできる。

例えば、上記（a- 1)のスクリーニング方法において、被験物質の存在下における本発明のタンパク質の活性が、被験物質の非存在下における活性に比べて、約 20%以上、好ましくは 30%以上、より好ましくは約 50%以上阻害された場合に、該被験物質を、本発明のタンパク質の活性阻害物質として選択することができる。上述のように、本発明のタンパク質（Desmocollin- 3、 TM4SF6および LY-6K) の発現を阻害する物質は、.癌細胞のアポトーシス促進おょぴノまたは増殖阻害、従つて癌の予防 ·治療に有効である。また、 TM4SF13タンパク質の発現を調節（促進または阻害）する物質もまた、癌細胞のアポトーシス促進および/または增殖阻害、従って癌の予防 ·治療に有効である。

すなわち、本発明はまた、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞における該タンパク質の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害物質、癌の予防 - 治療物質のスタリーニング方法を提供する。

本発明のタンパク質の発現量は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレォチドとハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得るポリヌクレオチド（即ち、前記した本発明のタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（本発明のセンスポリヌクレオチドともいう）、あるいは本発明のアンチセンスポリヌクレオチド）を用いてその m R N Aを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、'前記した本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質を検出することにより、翻訳レべルで測定することもできる。

従って、より具体的には、本発明は、

(b)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下おょぴ非存在下に培養し、両条件下における本発明のタンパク質をコードする m R N A の量を、本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを用いて測定、比較することを特徴とする、癌細胞のァポトーシス促進およぴ Zまたは増殖阻害物質、癌の予防 '治療物質のスクリーニング方法、および

(c)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における本発明のタンパク質の量を、本発明の抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害物質、癌の予防■治療物質のスクリーニング方法を提供する。上記（b) および（c) のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記（a- 2)のスクリーユング方法において用いられるのと同様のものが好ましく用いられる。

例えば、本発明のタンパク質の m R N A量またはタンパク質量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。

(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、プタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サル、トリなど）に対して、薬剤（例えば、 T N F—《、 I L— 1、 F a s、抗癌剤など）あるいは物理化学的ストレス（例えば、 U V、活性酸素、虚血など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。

得られた細胞に含まれる本発明のタンパク質の m R N Aは、例えば、通常の方法により細胞等から m R N Aを抽出し、例えば、 RT- PCRなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンプロット解析により定量することもできる。一方、本発明のタンパク質量は、ウェスタンプロット解析や以下に詳述する各種ィムノアッセィ法を用いて定量することができる。

(ii) 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれる本発明のタンパク質またはそれをコードする m R N Aを、上記（i) と同様にして定量、解析することがで含る。

本発明のタンパク質の発現量を変化させる物質のスクリーユングは、 (i)正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物に対して、薬剤あるいは物理化学的ストレスなどを与える一定時間前（30分前〜 24時間前、好ましくは 30分前〜 12 時間前、より好ましくは 1時間前〜 6時間前）もしくは一定時間後（30分後〜 3 日後、好ましくは 1時間後〜 2日後、より好ましくは 1時間後〜 24時間後）、または薬剤あるいは物理化学的ストレスと同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後（30分後〜 3日後、好ましくは 1時間後〜 2 日後、より好ましくは 1時間後〜 24時間後）、該動物から単離した細胞に含まれる本発明のタンパク質をコードする _m R N A量、または本発明のタンパク質の量を定量、解析することにより、あるいは

(ii) 形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後（1日後〜 7日後、好ましくは 1 日後〜 3日後、より好ましくは 2日後〜3日後）、該形質転換体に含まれる本発明のタンパク質の m R N A量または本発明のタンパク質の量を定量、解析することにより行うことができる。

被験物質としては、ぺプチド、タンパク質、非ぺプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。

上記（c) のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の量の測定は、具体的には、例えば、

(i)本発明の抗体と、試料液およぴ標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質を検出することにより試料液中の本発明のタンパク質を定量する方法や、

(ii) 試料液と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量

(活性）を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量する方法等が挙げられる。

上記（ii) の定量法においては、 2種の抗体は本発明のタンパク質の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として本発明のタンパク質の C端部と反応するものを用いることができる。

標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵I〕、〔¹³¹I〕、〔〕、〔¹⁴C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、 j3—ガラクトシダーゼ、 β —グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一（ストレブト）アビジン系を用いることもできる。

試料液としては、本発明のタンパク質が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによつて細胞を破壌して得られる細胞破砕液が、本発明のタンパク質が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清から本発明のタンパク質を分離 '精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。

本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体—抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。

抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化 ·固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、ァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。

サンドィツチ法においては不溶化した本発明の抗体に試料液を反応させ（ 1次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（2次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。

本発明の抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などにも用いることができる。

競合法では、試料液中の本発明のタンパク質と標識した本発明のタンパク質とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（F )と、抗体と結合した標識抗原（B ) とを分離し（B / F分離）、 B , Fいずれかの標識量を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（1次抗体) に対する 2次抗体などを用いて B / F分離を行う液相法、および、 1次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは 1次抗体は可溶性のものを用い、 2次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。

ィムノメトリック法では、試料液中の本発明のタンパク質と固相化した本発明のタンパク質とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中の本発明のタンパク質と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化した本発明のタンパク質を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。

また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中の本発明のタンパク質の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザの散乱を利用するレーザ一ネフロメトリーなどが好適に用いられる。

これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。

例えば、入江寛編「ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 4 9年発行）、入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 5 4年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和 5 3年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 2版）（医学書院、昭和 5 7年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 3版）（医学書院、昭和 6 2年発行）、（"Methods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、同 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) )、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、ァカアミックプレス社発行）などを参照することができる。

以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、細胞における本発明のタンパク質の生産量を感度よく定量することができる。

例えば、上記（b) および（c) のスクリーニング法において、被験物質の存在下における本発明のタンパク質（Desmocollin- 3、 TM4SF6および LY_⁶K) の発現量 (m R N A量またはタンパク質量）力被験物質の非存在下における場合に比べて、約 20%以上、好ましくは約 30%以上、より好ましくは約 50%以上阻害された場合、該被験物質を、本発明のタンパク質の発現阻害物質として選択することができる。

上述のように、 TM4SF13タンパク質の発現おょぴ Zまたは該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節（促進または阻害）する物質もまた、癌細胞のアポトーシス促進および/または増殖阻害、従って癌の予防 ·治療に有効である。

TM4SF13タンパク質の発現を調節する物質のスクリ一ユングは、上記した他の本発明のタンパク質の発現を阻害する物質のスクリーユングと同様にして行うことができる。該スクリーニング法において、被験物質の存在下における本発明のタンパク質（TM4SF13) の発現量（m R N A量またはタンパク質量）力被験物質の非存在下における場合に比べて、約 20%以上、好ましくは約 30%以上、より好ましくは約 50%以上阻害または増加された場合、該被験物質を、本発明のタンパク質の発現調節物質として選択することができる。

本発明はまた、 TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害物質、癌の予防 ·治療物質のスクリーニング方法を提供する。

本発明の TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用は、通常用いられる免 ¾；沈降、 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay two- hybrid法、

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)、 SPR (Surface Plasma Resonance)、 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) による蛍光ィメ一ジング、 DPI

(Dual Polarization Interferometry)、これらに基づく方法などによって検出、測定され得るが、方法はこれらに限定されず、タンパク質一タンパク質相互作用を検出できるものであればよい。また、被験物質が、 TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用によってもたらされるインテグリンの機能に与える影響に基づいて、その相互作用を検出する方法も使用され得る。従って、より具体的には、本発明は、

(d) TM4SF13タンパク質およびインテグリンを被験物質の存在下おょぴ非存在下におき、両条件下における該 TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用の量を、上記方法のいずれかを用いて測定、比較することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害物質、癌の予防 ·治療物質のスクリーニング方法を提供する。

例えば、本発明の TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。

(i)タグ化した TM4SF13およびィンテグリンの混合物に被験物質を添加し、抗ィンテグリン抗体で免疫沈降した産物を、標識された抗タグ抗体を用いてシグナル検出することにより、該タンパク質とインテグリンとの相互作用を定量、解析することにより行うことができる。なおこのとき、タグ化するタンパク質はインテグリンであってもよい。

(ii) TM4SF13に対する抗体を固相に吸着させ、 TM4SF13タンパク質、インテグリンおよび被験物質を含む混合物をここに添加し、インテグリンに対する抗体（標識されたもの）で検出する ELISA法を用いて TM4SF1³タンパク質とインテグリンとの相互作用を定量、解析することにより行うことができる。なおこのとき、 TM4SF13に対する抗体とインテグリンに対する抗体とは、その役割が逆であってもよい。

(iii) TM4SF13タンパク質およびインテグリンを baitまたは preyのいずれかとして用いる酵母 two- hybridシステムにおいて、被験物質の存在下で該タンパク質とインテグリンとの相互作用を定量、解析することにより行うことができる。

(vi)被験物質の存在下で、 TM4SF13またはインテグリンを発現する細胞を、それぞれ標識されたインテグリンまたは TM4SF13と混合し、 FACSを用いて標識された細胞を検出することによって、該タンパク質とインテグリンとの相互作用を定量、解析することにより行うことができる。あるいは、 (v)被験物質の存在下で、金属表面に TM4SF13タンパク質またはィンテグリ.ンを吸着させ、 SPRを用いて、該タンパク質とインテグリンとの相互作用を定量、解析することにより行うことができる。

また、インテグリンの機能（シグナル伝達、 ECM成分との結合など）に対する被験物質の影響を定量、解析することによつても、このような測定を行うことができるであろう。

標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵1〕、〔¹³¹1〕、〔〕、〔¹⁴c〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、 J3—ガラクトシダーゼ、 β —グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ノレシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一（ストレブト）アビジン系を用いることもできる。

これら個々の方法を本発明に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてタンパク質一タンパク質相互作用の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。

以上のようにして、 TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用を感度よく定量することができる。例えば、上記（d) のスクリーニング法において、被験物質の存在下における TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用が、被験物質の非存在下における場合に比べて、約 20%以上、好ましくは約 30%以上、より好ましくは約 50%以上阻害または増加された場合、該被験物質を、 TM4SF13タンパク質とインテグリンとの相互作用の調節物質として選択することができる。

本発明のスクリーユング用キットは、本発明のタンパク質またはその部分ぺプチド（以下、単に本発明のタンパク質ともいう）を含有する。本発明のタンパク質は上述のいずれかの方法を用いて、単離 ·精製されたものであってもよいし、あるいは上述のように、それを産生する細胞（温血動物細胞）の形態で提供されてもよレ、。

本発明のスクリーニングキットは、上記本発明のタンパク質を産生する細胞における該タンパク質の発現量を測定するために、上述の本発明の抗体、あるいは本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドをさらに含有することもできる。

該スクリーニングキットは、上記に加えて、任意で、反応緩衝液、プロツキング液、洗浄用緩衝液、標識試薬、標識検出試薬などを含むことができる。

本発明のスクリ一ユング方法またはスクリ一ユング用キットを用いて得られる、本発明のタンパク質の発現および Zまたは活性阻害物質（遊離体であつても塩の形態であってもよい）は、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、'血液腫瘍など）の治療 ·予防剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膝臓癌などの予防，治療剤）として、低毒性で安全な医薬として有用である。本発明のスクリーユング方法またはスクリーユング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防■治療剤として使用する場合、常套手段に従つて製剤化することができる。例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カブセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、プドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性斉 IJ〔例、ポジソノレべ一卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。

上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、とりわけ注射剤では 5〜 1 0

O m g s その他の剤形では 1 0〜2 5 O m gの上記化合物が含有されていることが好ましい。なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、トリ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の発現および Zまたは活性阻害物質を経口投与する場合、一般的に成人（体重 60kg として）においては、一日につき該化合物またはその塩を約 0. 1〜約 100mg、好ましくは約 1. 0〜約 50mg、より好ましくは約 1. 0〜約 20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該阻害物質の 1回投与量は、投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の発現および/または活性阻害物質を注射剤の形で通常成人（体重 60kgとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約 0. 01〜約 30mg、好ましくは約 0. 1〜約 20mg、より好ましくは約 0. 1〜約 10mgを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。 ( 4 ) 癌の診断剤

本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被験液中の本発明のタンパク質の定量などに使用することができる。したがって、上述の本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の発現阻害物質のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の代わりに、被験温血動物から採取した生体試料（例、血液、血漿、尿、生検など）を用いてィムノアッセィを実施することにより、該動物体内における本発明のタンパク質の発現の度合を調べることができ、ひいては癌の診断に用いることができる。ィムノアツセィの結果、該試料中の本発明のタンパク質の増加が検出された場合は、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）を発症しているか、あるいは将来発症する可能性が高いと診断することができる。

同様に、前記した本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブもしくはプライマーとして使用することにより、ヒトまたは他の温血動物 (例えば、ラット、マウス、ハムスター、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、プタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジー、トリなど）における本発明のタンパク質をコードする D N Aまたは m R N Aの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該 D N Aの増幅や m R N Aの発現過多などの遺伝子診断剤、特に癌の診断剤として有用である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレォチドもしくは対応するアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブもしくはプライマーとして必要な長さ（例えば、約 15塩基以上）を有する限り特に制限されない。

本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイプリダイゼーシヨン、定量的 RT- PCR、 PCR-SSCP法、ァレル特異的 PCR、 PCR-SSOP法、 DGGE法、 RNaseプロテクション法、 PCR-RFLP法などにより実施することができる。

例えば、被験温血動物の細胞から抽出した R N A画分についてのノーザンハイプリダイゼーシヨンや定量的 RT-PCRの結果、本発明のタンパク質の発現増加が検出された場合、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）を発症しているか、あるいは将来発症する可能性が高いと診断することができる。

( 5 ) 本発明のタンパク質を含有する医薬

本発明のタンパク質は癌で過剰に発現していることから、癌患者の免疫系を活性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。例えば、強力な抗原提示細胞（例、樹状細胞）を本発明のタンパク質存在下に培養し、該タンパク質を貪食させた後に、再び患者の体内に戻す、所謂養子免疫療法などを好ましく適用し得る。体内に戻された樹状細胞は癌抗原特異的な細胞障害性 T細胞を誘導、活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能である。

また、本発明のタンパク質は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、薛臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防または治療のためのワクチン製剤として、安全に、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ゥサギ、ブタ）に投与することもできる。

該ワクチン製剤は、通常、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体を含有する。担体としては例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、緩衝液（例、リン酸緩衝液）、アルコール（例、エタノール）などの液体の担体があげられる。

ワクチン製剤は、通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができる。

通常、本発明のタンパク質は、生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁される。また、本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、用時それらを混合して用いてもよい。

ワクチン製剤には、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体に加え、アジュバント（例、水酸化アルミニウムゲル、血清アルブミンなど)' 、防腐剤（例、チメロサールなど）、無痛化剤（例、ブドウ糖、ベンジルアルコールなど）などを配合させてもよい。また、本発明のタンパク質に対する抗体産生を促進させるために、例えばサイト力イン（例、インターロイキン一 2などのインターロイキン類、インターフェロン一 γ などのインターフェロン類など）をさらに配合させてもよい。ワクチン製剤として用いる際、本発明のタンパク質は活性体として用いてもよいが、抗原性を高めるために該タンパク質を変性させてもよい。本発明のタンパク質の変性は、通常、加熱処理、タンパク質変性剤（例、ホルマリン、塩酸グァ二ジン、尿素）による処理により行われる。

得られたヮクチン製剤は低毒性であり、通常注射剤として、例えば皮下、皮內、筋肉内に投与してもよく、また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよい。

本発明のタンパク質の投与量は、例えば対象疾患、投与対象、投与ルートなどによって異なるが、例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人（体重 60kg) に皮下的に注射剤として投与する場合、 1回当たり通常 0.；！〜 300mg程度、好ましくは 100〜300tng程度である。ワクチン製剤の投与回数は 1回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約 2週間〜約 6ヶ月の間隔をあけて、該ワクチン製剤を 2 〜4回投与することもできる。

TM4SF13は、上述のように、インテグリンと相互作用することにより、ある種の癌に対しては抑制的に作用し得るので、 TM4SF13タンパク質もしくはその部分ぺプチドは、癌細胞のアポトーシス誘導 ·増殖阻害剤、したがって癌の予防■治療剤として用いることができる。

TM4SF13タンパク質もしくはその部分ぺプチドは、上記本発明の抗体と同様に製剤化することができる。 TM4SF13の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療 '予防のために使用する場合には、該タンパク質を 1回量として、通常 0. 01~20mg/kg体重程度、好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程度、好ましくは 1日 1~3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。 ( 6 ) TM4SF13をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬同様に、 TM4SF13もしくはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドもまた、癌細胞のアポトーシス誘導 ·増殖阻害剤、したがって癌の予防 '治療剤として用いることができる。該ポリヌクレオチドは、好ましくは適当なプロモータ一（即ち、投与対象の細胞内でプロモーター活性を有するプロモーター）の制御下にある形態（例えば、発現ベクター）で投与され得る。該ポリヌクレオチドは上記本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと同様に製剤化することができる。

TM4SF13 もしくはその部分ぺプチドをコードするポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で投与する場合、一般的に成人（体重 60kg) においては、一日につき該ポリヌクレオチドを約 0.1〜約 lOOmg投与する。

(7) DNA転移動物

本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、本発明の外来性 DNAと略記する）またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DNAと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。

すなわち、本発明は、

(1) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、

(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（1)記載の動物、

(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（2) 記載の動物、および

(4) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。

本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明の DNA転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リボフヱクシヨン法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、 DEAE—デキストラン法などにより目的とする D N Aを転移することによつて作出することができる。また、該 DNA転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DNA転移動物を作出することもできる。

非ヒト哺乳動物としては、例えば、ゥシ、プタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モノレモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、 C 57B L/6系統， DBA 2系統など、交雑系として、 B 6 C 3 系統， BDF 系統， B eD S Fi系統， BALBZc系統， I C R系統など）またはラット（例えば、 W i s t a r , S Dなど）などが好ましい。

哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。

本発明の外来性 DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。本発明の変異 D N Aとしては、元の本発明の D N Aの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じた DNAなどが用いられ、また、異常 DNAも含まれる。

該異常 DNAとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させる DNAを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させる DNAなどが用いられる。

本発明の外来性 D NAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明の DN Aを対象動物に転移させるにあたつては、該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒト D N Aを転移させる場合、これと相同性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動物（例えば、ゥサ.ギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒ.ト DN Aを結合した DNAコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。

本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、 λ ファージなどのバタテリオファージ、モロニ一白血病ゥイノレスなどのレトロゥイノレス、ワクシニアウイ/レスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。

上記の DNA発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、（i)ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニ一白血病ウィルス、 J Cウイルス、乳癌ウィルス、ポリオウイルスなど）に由来する DNAのプロモーター、 (ii) 各種哺乳動物（ヒト、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、ァブミン、インスリン I I、ゥロプラキン I I、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリァ線維性酸性タンパク質、グルタチオン S—トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子 ]3、ケラチン K l、 10ぉょび 14、コラーゲン I型おょぴ I I型、サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ ]3 Iサブュュット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチ口シンキナーゼ（一般に T i e 2と略される）、ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素（N a， K-AT P a s e) 、二ユーロフィラメント軽鎖、メタ口チォネイン Iおよび I I A、メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原（H— 2 L) 、 H— r a s、レニン、ドーパミン ]3—水酸化酵素、甲状腺ペルォキシダーゼ（TPO) 、ペプチド鎖延長因子 1α (E F- 1 α) 、 β ァクチン、 αおよびミオシン重鎖、ミオシン軽鎖 1および 2、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、 Th y— 1、免疫グロブリン、 H鎖可変部（VNP) 、血清アミロイド Pコンポーネント、ミォグロビン、トロポニン C、平滑筋 OL ァクチン、プレプロエンケファリン k バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子 1 α (E F— 1 α)のプロモーター、ヒトおよびニヮトリ β ァクチンプロモーターなどが好適である。

上記ベクターは、 DN Α転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列（一般にターミネタ一と呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスの SV40ターミネタ一などが用いられる。

その他、目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプライシングシグナノレ、ェンハンサー領域、真核 DNAのイントロンの一部などをプロモーター領域の 5，上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3' 下流に連結することも目的により可能である。

正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DN Aを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常 DNAは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。

該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の DNA工学的手法により作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、対象哺乳動物.の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性 DN Aが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。

本発明の外来性正常 DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性 DNAを安定に保持することを確認して、該 DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。

受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有する。導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 DNAを過剰に有するように繁殖継代することができる。

本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常 DNAが高発現させられており、内在性の正常 DNAの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常 DNA転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。

また、本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防■治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。

一方、本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来 DNAを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとの DNAコンストラタ卜は、通常の DNA工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常 DN Aが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有することを意味する。本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有する。導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。

本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常 DNAが高発現させられており、内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常 DN A転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。

また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常 DNA高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常 DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加痺状を有することから、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に対する予防 ·治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 '治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。

また、上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、例えば、

(i) 組織培養のための細胞源としての使用、

(ii)本発明の D N A転移動物の組織中 D N Aもしくは R N Aを直接分析する力、または

D N Aにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するぺプチドとの関連性についての解析、

(iii) D N Aを有する組織の細胞を標準組織培莾技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、

(iv) 上記（iii)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および

(v) 本発明の変異タンパク質の単離精製およびその抗体作製などが考えられる。さらに、本発明の D N A転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。

また、本発明の D N A転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離した D N A転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行うことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およぴその作用解明のための有効な研究材料となる。さらに、本発明の DN A転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行うために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーユング法を提供することが可能となる。また、本発明の DNA転移動物または本発明の外来性 DNA発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患の DNA治療法を検討、開発することが可能である。

(8) ノックァゥト動物

本発明は、本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。

すなわち、本発明は、

(1) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、

(2) 該 DN Aがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の β—ガラタトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（1) 項記載の胚幹細胞、

(3) ネオマイシン耐性である第（1) 項記載め胚幹細胞、

(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（1) 項記載の胚幹細胞、

(5) ゲッ歯動物がマウスである第（4) 項記載の胚幹細胞、

(6) 本発明の DN Αが不活性化された該 DN Α発現不全非ヒト哺乳動物、

(7) 該 DN Aがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来の β—ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明の DN Αに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（6)項記載の非ヒト哺乳動物、

(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（6) 項記載の非ヒト哺乳動物、

(9) ゲッ歯動物がマウスである第（8) 項記載の非ヒト哺乳動物、および

(10) 第（7) 項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーユング方法を提供する。

本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現能を抑制するか、もしくは該 DNAがコードしている本発明本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウト DNAと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、 E S細胞と略記する）をいう。

非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。

本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該 D N A配列の一部又は全部の削除、他 D N Aを挿入または置換させることによって行うことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。

本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックァゥト E S細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離し、そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいは 1 a c Z(3—ガラクトシダーゼ遺伝子）、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊する力あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる D N A配列（例えば、 p o 1 y A付加シグナルなど）を揷入し、完全なメッセンジャー RNAを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壌するように構築した DNA 配列を有する DNA鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られた E S細胞について本発明の DNA上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明の DNA以外の近傍領域の DNA配列をプライマーとした PC R法により解析し、本発明のノックァゥト E S細胞を選別することにより得.ることができる。また、相同組換え法等により本発明の DN Aを不活化させる元の E S細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 Evans と Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスの E S細胞の場合、現在、一般的には 129系の E S細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 B LZ6マウスや C 57 B LZ 6の採卵数の少なさを DBA/ 2との交雑により改善した BDF マウス (じ 578し/^/6と138 /2との ₁) を用いて樹立したものなども良好に用いうる。 BDFiマウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、 C 57 B L/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られた E S細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 B LZ 6マウスとパッククロスすることでその遺伝的背景を C 57BLノ 6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。

また、 ES細胞を樹立する場合、一般には受精後 3. 5日目の胚盤胞を使用する力これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。

また、雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、通常雄の E S細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。

E S細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、 PCR法により Y染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その 1例としてあげることができる。 ' この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約 10⁶個の細胞数を要していたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞数（約 50個）で済むので、培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。また、第二次セレクションとしては、例えば、 G—バンデイング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 .E S細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞）に再びクローユングすることが望ましい。

このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、 S TO線維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (l〜10000U/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5% 酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気）で約 3 7 °Cで培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/ EDTA溶液（通常 0.00 1〜 0. 5%トリプシン/ 0. 1〜 5 mM ED T A、好ましくは約 0. 1 %トリプシン/ 1 mM E DTA) 処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常 1〜3日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。

ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及ぴ M. H. Kaufman, Nature,第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、ジャーナル ·ォプ■ェンプリォロジ一■アンド 'ェクスペリメンタ ·モ^^フォロジ一、第 87卷、 27頁、 1985 年〕、本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の DNA発現不全細胞は、インビト口における本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物の mRNA量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。

該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明の DNAが不活性化された DNA配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明の DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明の DNAをノックァゥトさせることができる。

本発明の DNAがノックアウトされた細胞は、本発明の DN A上またはその近傍の DN A配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上の DNA配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明の DNA以外の近傍領域の DNA配列とをプライマーとした PCR法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明の DNAが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明の DN A座をもつ細胞と人為的に変異した本発明の DN A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の DNA座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明の DN A座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同士を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。

卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法で DN A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明の DNA座に変異のあるものを選択することにより得られる。

このようにして本発明の DNAがノックァゥトされている個体は、交配により得られた動物個体も該 DNAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。

さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化 DN Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。得られたホモザィゴト動物は、母親動物に対して、正常個体 1、ホモザィゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザィゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化 DN Aを有するホモザィゴートおよびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。

本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明の DNA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。

また、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。

(9 a) 本発明の DNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニング方法

本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の DNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。

すなわち、本発明は、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察，測定することを特徴とする、本発明の DN Aの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば癌などに対して治療■予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーユング方法を提供する。該スタリ一二ング方法において用いられる本発明の D N A発現不全非ヒ.ト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。

試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であつてもよい。

具体的には、本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。

試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。

例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膝臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）に対して治療 '予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。

該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、好ましくは約 3 0 %以上、より好ましくは約 5 0 %以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物として選択することができる。

該スタリ一二ング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療■予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スク.リー- ングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。

該スタリ一ユング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。

該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物 (例えば、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、プタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重 60kg として）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約 0. 1〜約 100mg、好ましくは約 1. 0〜約 50mg、より好ましくは約 1. 0〜約 20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の 1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なる 1 例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重 60kgとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約 0. 01〜約 30mg、好ましくは約 0. 1〜約 20mg、より好ましくは約 0. 1〜約 10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。

( 9 b ) 本発明の D N Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリ一ユング方法本発明は、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。

上記スクリーニング方法において、本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明の D N Aがレポータ一遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。

試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。

レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、ガラクトシダーゼ遺伝子（ 1 a c Z) 、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフエラーゼ遺伝子などが好適である。

本発明の DNAをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。

例えば、本発明のタンパク質をコードする DN A領域の一部を大腸菌由来の β 一ガラクトシダーゼ遺伝子（ 1 a c Z) で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりに β—ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、 5—プロモ一4—クロロー 3—インドリル一一ガラクトピラノシド（X— g a 1 ) のような β—ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（PB S) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、室温または 37°C付近で、約 30分ないし 1時間反応させた後、組織標本を 1 mM E D T AZ P B S溶液で洗浄することによって、 ]3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、 1 a c Zをコードする m R N Aを検出してもよい。

上記スクリーユング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。

該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アル力リ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。 · .

本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の阻害、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、縢臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防 ·治療剤として有用である。

さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。

該スクリーユング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。

このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重⁶0kgとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約 0. 1〜約 100mg、好ましくは約 1. 0〜約 50mg、より好ましくは約 1. 0〜約 20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の 1 回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重 60kgとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約 0. 01〜約 30mg、好ましくは約 0. 1〜約 20mg、より好ましくは約 0. 1〜約 10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。

このように、本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の D N Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ一二ングする上で極めて有用であり、本発明の D N A発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。

また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する D N Aを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわるトランスジエニック動物（遺伝子移入動物）を作製すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。

本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。 DNA ：デォキシリポ核酸

c DNA ：相補的デォキシリボ核酸

A ：アデニン

丁：チミン

G ：グァニン

C ：シトシン

RNA ：リボ核酸

mRNA ：メッセンジャーリポ核酸 d AT P ：デォキシアデノシン三リン酸 d TT P ：デォキシチミジン三リン酸 d GT P ：デォキシグアノシン三リン酸 d C T P ：デォキシシチジン三リン酸

ATP ：アデノシン三リン酸

ED TA ：エチレンジアミン四酢酸

SD S ：ドデシル硫酸ナトリウム

G 1 y ：ダリシン

A 1 a ：ァラニン

V a 1 ：ノリン

L e u ：ロイシン

I 1 e ：ィソロイシン

S e r ：セリン

T h r ：スレ才ニン

C y s ：システィン

Me t ：メチォニン

G 1 u ：グルタミン酸

As ：ァスパラギン酸

L y s ：リジン A r g ：アルギニン

H i s ：ヒスチジン

P h e ：フエニノレアラニン

T y r ：チロシン

T r p ：トリブトファン

P r o ：プロリン

A s n ：ァスパラギン

G 1 n ：グルタミン

p G 1 u ：ピログルタミン酸

S e c ：セレノシスティン (selenocysteine)

また、本明細書中で繁用される置換基保護基および試薬を下記の記号で表記する。

Me ：メチル基

E t ：ェチル基

B u ：ブチル基

P h ：フエニル基

T C チアゾリジン- 4(R) -カルボキサミド基

1 o s p—トノレエンスノレフォニノレ

CHO ホノレミノレ

B z 1

Cl₂-Bzl 2, 6—ジク口口べンジノレ

B om ベンジノレオキシメチノレ

Z ベンジノレォキシカノレポ二ノレ

C 1一 z 2 -クロ口べンジノレォキシカノレポ二

B r -Z 2-プロモベンジノレオキシカノレボ二

B o c t -ブトキシカノレポ二ノレ

DN P ジニト口フエ二ノレ T r t ：トリチル .

B um : t-ブトキシメチノレ

Fmo c ： N— 9-フノレオレエノレメトキシカノレボニノレ

HOB t ： 1-ヒドロキシベンズトリアゾール

HOOB t ： 3， 4 -ジヒドロ _3 -ヒドロキシ -4 -ォキソ—1,2, 3-ベンゾトリァジン

HONB ： 1-ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2, 3-ジカルボキシィミド

D C C ： N， N， -ジシクロへキシルカルポジィミド

本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。

〔配列番号： 1〕

Desmocollin- 3aをコードする DNA (CD S) の塩基配列を示す。

〔配列番号： 2〕

Desmocollin- 3aのァミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 3〕

Desmocollin- 3bをコードする DN A (CD S) の塩基配列を示す。

〔配列番号： 4〕

Desmocollin- 3bのァミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 5〕

TM4SF13をコードする DNA (CDS) の塩基配列を示す。

〔配列番号： 6〕

TM4SF13のァミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 7〕

TM4SF6をコードする DNA (CD S) の塩基配列を示す。

〔配列番号： 8〕

TM4SF6のァミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 9〕

LY- 6Kをコードする DNA (CD S) の塩基配列を示す。〔配列番号： 1 0〕

LY-6Kのァミノ酸配列を示す。

〔配列番号 1 1〕

配列番号 1 2と共に siRNAlaを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 1 2〕

配列番号 1 1と共に siRNAlaを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 1 3〕

配列番号 1 4と共に siRNAlbを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 1 4〕

配列番号 1 3と共に siRNAlbを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 1 5〕

配列番号 1 6と共に siRNAlcを形成する R A配列を示す。

〔配列番号 1 6〕

配列番号 1 5と共に siRNAlcを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 1 7〕

配列番号 1 8と共に siRNAldを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 1 8〕

配列番号 1 7と共に siRNAldを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 1 9〕

配列番号 2 0と共に non- silensing dsRNAlを形成する RNA配列を示す。〔配列番号 2 0〕

配列番号 1 9と共に non - silensing dsRNAlを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 1〕

配列番号 2 2と共に siRNA2a 形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 2〕

配列番号 2 1と共に siRNA2aを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 3〕配列番号 2 4と共に siRNA2bを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 4〕

配列番号 2 3と共に siRNA2bを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 5〕

配列番号 2 6と共に siRNA2cを形成する RNA配列を示す

〔配列番号 2 6〕

配列番号 2 5と共に siRNA2cを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 7〕

配列番号 2 8と共に siRNA2dを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 8 )

配列番号 2 7と共に siRNA2dを形成する RNA配列を示す。

〔配列番号 2 9〕

プライマー Xの塩基配列を示す。

〔配列番号 3 0〕 .

プライマー Yの塩基配列を示す。

〔配列番号 3 1 )

プライマー Zの塩基配列を示す。実施例

以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。実施例 1

がんにおける Destnocollin- 3の発現亢進

がん患者より摘出したがん組織由来 mRNA、および周辺正常組織由来 tnRNAを用い、ハイブリダイゼーション法を行うことにより、遺伝子発現プロフアイルを作製した。遺伝子発現プロファイルの解析の結果、当該遺伝子ががん組織において高発現していることを見出した。特に肺がんにおいて、周辺正常組織に対する顕著な発現亢進が観察された（図 1) 。実施例 2

Desmocollin- 3遺伝子の siRNA投与によるヒト肺がん細胞株の細胞増殖抑制

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC) より購入したヒト肺がん細胞株 NCI- H22⁶を、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMI IMO培地（Invitrogen社）で懸濁し、 1ゥエル当たり 10万個の細胞密度で 6穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、 siRNAをトランスフエクシヨンした。

具体的には、 Desmocollin- 3a遺伝子もしくは Desmocollin- 3b遺伝子の mRNAを切断する活性を持つ siRNAを、 2種の RNA断片（配列番号： 1 1と配列番号： 1 2 (siRNAla) ) をハイブリダィズさせることにより作製した。同様の方法で、 2種の RNA断片（配列番号： 1 3と配列番号： 1 4 (siRNAlb)、または配列番号： 1 5と配列番号： 1 6 (siRNAlc)、または配列番号： 1 7と配列番号： 1 8 (siRNAld) ) をハイブリダィズさせることにより、さらに 3種の siRNAを作製した。作製した計 4種の siRNAを等量ずつ混和しトランスフエクシヨンに供した（以下、 siRNA 1と略する）。コントロールとしては、動物細胞において mRNAを切断する活性を持たない 2種の RNA断片（配列番号： 1 9と配列番号： 2 0 ) を同様にハイプリダイズして用いた（以下、 non_silensing dsRNA lと略する）。 80pmolの siRNA 1、または 80pmolの non - silensing dsRNA lを Optト MEM I (Invitrogen社） 50 / Lに添加し、 Lipofectaraine 2000 (Invitrogen社） 4 μ Lを添カロした Optト MEM I (Invitrogen社） 50 /x Lと混合した後、室温で 20分間放置した。上記混合液を NCI-H226細胞培養液に全量添加し、更に 24時間培養を継続した後、細胞を回収した。回収した細胞を 1 ゥル当たり 3千個の細胞密度で 96穴平底組織培養プレートに播種し、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMI 1640培地（Invitrogen社）中で、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで、さらに 2日間培養した。培地を除去後、プレートを- 80°Cで 5分間静置し、室温で 5分間放置した。 1% PicoGreen ( Molecular Probes社）なら.びに 1% IGEPAL-CA630 (ICN Biomedicals社）を含む水溶液を 1ゥエルあたり 100 μ L添カロし、 20分間放置した後、励起波長 485nm、発光波長 535nmにて蛍光強度を計測することにより、細胞内 DNA含量を測定した。その結果、 siRNA l投与細胞は non-silensing dsRNA l投与細胞に比べて約 59%蛍光強度が低下し、統計学的に有意な差（P < 0. 001) を示した（図 2A；)。実施例 3

Desmocollin- 3遺伝子の siRNA投与による Desmocollin- 3遺伝子の mRNA発現量低下実施例 2で用いたヒト肺がん細胞株 NCI- H226を RPMI1640培地に懸濁し、 1ゥェル当たり 10万個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、実施例 2の方法に準じて siRNAをトランスフエクションした。トランスフエクシヨンの後、 24時間培養を継続した後に RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社）を用いてトータル RNAを抽出した。約 100ngのトータノレ RNAを铸型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Appl ied Biosystems社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。 Desmocollin- 3遺伝子の発現量の測定はトータル RNAにして 10ngに相当する cDNAを錄型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社） 5 /i L、 Desmocol lin- 3遺伝子の第 1ェクソンの一部と第 2エタソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含む TaqMan Reagent ( Applied Biosystems社）を 0. 5 z Lを加え、反応液量 10 Lとし、定量的 PCR法を用いて測定した。 PCR反応は、 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C■ 15秒、 60°C■ 1分のサイクルを 40回繰り返した。一方、同量の鎊型 cDNA中に含まれる -ァクチン遺伝子発現量を TaqMan β -actin Control Reagents (Applied Biosystems社) を用いて測定し内部標準とした。

siRNA l投与群では、陰性対照として用いた non- silensing dsRNA l投与群に比して Desmocollin- 3の mRNA発現量は 85%低下しており、統計学的に有意な差（P< 0.001) を示した（図 2B)。これらの結果より、 Desraocollin- 3a遺伝子、 .および Desmocollin- 3b遺伝子の発現量の低下によりヒト肺がん細胞株 NCI- H226の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された。実施例 4

Desmocollin- 3遺伝子の siRNA投与による Desmocollin- 3タンパク質発現量低下実施例 2で用いたヒト肺がん細胞株 NCI- H226を RPMI1640培地に懸濁し、 1ゥェル当たり 10万個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、実施例 2の方法に準じて siRNAをトランスフエクシヨンし、培養を継続した。 72時間後、細胞を PB Sで洗浄後、 R I P A緩衝液〔50mM トリス .塩酸、 pH 7.5、 150mM塩化ナトリウム、 1% Triton X- 100、 0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、 1%デォキシコール酸、 Complete protease inhibitor (Roche Diagnostics社) 、 Phosphatase Inhibitor Cocktail - 2 (Sigma社）〕に溶解した。溶解液の単位量あたりの細胞数を統一するため、各ゥエルに添加する R I P A緩衝液の量は、実施例 2における蛍光強度に応じて決定した。細胞溶解液 20 μ 1を 4%— 20 %濃度勾配ポリアクリルアミドゲルでの SD S— PAGEに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従い PVDF膜 (BI0RAD社）に転写した後、プロッキング溶液（トリス緩衝化生理食塩水、 0. 1 % Tw e e n - 2 0 , 3 %スキムミルク）中に 1時間室温放置した。次に抗 Desmocollin- 3抗体（Progen社）を C a n G e t S i g n a l (東洋紡）溶液 1中に 1 000倍希釈の濃度となるよう加え、室温にて 90分間インキュートし、続いて HR P標識抗マウス I gG抗体（ImmunoResearch Laboratories社）を C a n G e t S i g n a l (東洋紡）溶液 2で 5万倍に希釈した 2次抗体溶液中で 1時間室温放置した。また、内部標準コントロールとして、ブロッキング後、抗 ]3—ァクチン抗体（SIGMA社）をプロッキング溶液中にて 1000倍希釈の濃度となるよう加え、室温にて 90分間インキュベートし、続いて HRP標識抗マウス I g G抗体（ImmunoResearch Laboratories社）をプロッキング溶液にて 5 万倍に希釈した 2次抗体溶液中で 1時間室温放置した。検出は SuperSignal West Chemiluminescent (Pierce社）を用ヽ、添付プロトコ一ノレ【こ従った。

non-silensing dsRNA 1を投与した細胞からは、 Desmocollin-3に対する抗体によって、分子量 1 0 9 k D aおよび 1 0 0 k D a近傍の位置に Desmocollin- 3a， Desmocolli n- 3bタンパク質に由来する特異的なバンドが認められたのに対し、 siRNA lを投与した細胞ではバンドは検出されなかった。また、 β—ァクチンに対する抗体によっては、 non-silensing dsRNA 1を投与した細胞、 siRNA lを投与した細胞から同程度の強度のバンドが検出された（図 2C)。実施例 5

抗 -Desmocollin- 3 抗体を用いた肺がん組織マイクロアレイの免疫染色

抗- Desmocoll in- 3 抗体（Progen社）を用いてヒト肺がん組織マイクロアレイ (Cybridi社）の免疫組織染色をおこなった。免疫染色には VECTASTAIN Elite ABC KIT (VECTOR LABORATORIES社）を利用した。具体的には、標本を貼付したスライドを、キシレンに 5分間、 3回、 100%エタノールに 5分間、 2回、さらに 90%、 80%、 70%ェタノールにそれぞれ 5分間、 1回ずつ浸した後、 pH6. 0のクェン酸緩衝液溶液中に浸漬し、 121°C、 20分間オートクレープ処理をおこなった。減圧後、スライドを上記クェン酸緩衝液中で常温に 20分間放置、水洗により緩衝液を洗い流し、純水に 5分間浸漬した。スライドに 3%過酸化水素水を滴下し、常温でインキュベータ内に 7. 5分間静置、純水で切片上の試薬を洗い流し、 PBSに 5分間浸漬後、上記キットに付属のゥマ正常血清を切片上に滴下し、 20分間、ィンキュベータ内で反応させた。ゥマ正常血清除去後、抗体希釈緩衝液（T_Ween20含）を用いて希釈した抗 -Desmocollin-3抗体（Progen社）を切片上に滴下し、 4°Cー晚静置した。 PBSで切片上の試薬を洗い流し、 PBSに 5分間、 3回浸漬し、上記キットに付属のピオチン標識抗マウス IgG溶液を切片上に滴下、 30分間静置した。 PBSで切片上の試薬を洗い流し、 PBSに 5分間、浸漬した後、上記キットに付属の VECTASTAIN El ite ABC Reagent を切片上に滴下レ、 30分間静置した。 PBSで切片上の試薬を洗い流し、 PBSに 5分間、浸漬した後、切片上に、上記キットに付属の DAB基質を滴下、 5 15分間反応させた。純水で切片上の試薬を洗い流し、純水に浸漬し、へマトキシリン液に 1分間浸漬後、 5分間、水道水で水洗した。スライドを 70% 80% 90%エタノールにそれぞれ 5分間、 1回ずつ浸した後、 100%エタノールに 5分間、 2回、キシレンに 5分間、 3回浸し、マウント剤で封入した。顕微鏡で染色像を確認した結果、肺扁平上皮がん切片における強い染色が確認された（表 1)

表 1

肺扁平上皮がん組織マイクロアレイのまとめ

LCCs:大細胞がん

Ι,Η及び III：扁平上皮がんグレード Ι,Η及ひ "HI 実施例 6

がんにおける TM4SF13の発現亢進

がん患者より摘出したがん組織由来 mRNA、および周辺正常組織由来 tnRNAを用い、ハイプリダイゼーシヨン法を行うことにより、遺伝子発現プロファイルを作製した。遺伝子発現プロファイルの解析の結果、当該遺伝子ががん組織において高発現していることを見出した。特に乳がんおよび前立腺がんにおいて、周辺正常組織に対する顕著な発現亢進が観察された（図 3) 実施例 7

TM4SF13遺伝子の siRNA投与によるヒト乳がん細胞株の細胞増殖抑制

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC) より購入したヒト乳がん細胞株 T-47Dを、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMI IMO培地（Invitrogen社）で懸濁し、 1ゥヱル当たり 10万個の細胞密度で 6穴平底組織培養プレート（BDフアルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晚培養した後、 siRNAをトランスフエクションした。

具体的には、 TM4SF13遺伝子の raRNAを切断する活性を持つ siRNAを、 2種の RNA断片（配列番号： 2 1と配列番号： 2 2 (siRNA2a) ) をハイブリダィズさせることにより作製した。同様の方法で、 2種の RNA断片（配列番号： 2 3と配列番号： 2 4 (siRNA2b)、または配列番号： 2 5と配列番号： 2 6 (siRNA2c)、または配列番号： 2 7と配列番号： 2 8 (siRNA2d) ) をハイブリダィズさせることにより、さらに 3種の siRNAを作製した。作製した計 4種の siRNAを等量ずつ混和しトランスフエクシヨンに供した（以下、 siRNA 2と略する）。コントロールとしては、動物細胞において raRNAを切断する活性を持たない 2種の RNA断片（配列番号： 1 9と配列番号： 2 0 ) を同様にハイプリダイズして用いた（以下、 non- silensing dsRNA 1と略する）。 40pmolの siRNA 2、 40pmol non-silensing dsRNA lを Opti- MEM I (Invitrogen社） 50 μ L に添カ卩し、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen社） 2 / Lを添加した Opti- MEM I (Invitrogen社） 50 μ ίと混合した後、室温で 20分間放置した。上記混合液を T-47D細胞培養液に全量添加し、更に 24時間培養を継続した後、細胞を回収した。回収した細胞を 1ゥュル当たり 3千個の細胞密度で 96穴平底組織培養プレートに播種し、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMI 1640培地（Invitrogen 社）中で、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで、さらに 2日間培養した。培地を除去後、プレートを- 80°Cで 5分間静置し、室温で 5分間放置した。 l% PicoGreen (Molecular Probes社）ならびに 1% IGEPAL- CA O (ICN Biomedicals社）を含む水溶液を 1ゥエルあたり lOO ^ L添加し、 20分間放置した後、励起波長 485nm、発光波長 535nraにて蛍光強度を計測することにより、細胞内 DNA含量を測定した。その結果、 siRNA 2投与細胞は non- silensing dsRNA 1投与細胞に比べて約 30%蛍光強度が低下し、統計学的に有意な差（P < 0. 001) を示した（図 4A)。実施例 8

TM4SF13遺伝子の siRNA投与による TM4SF13遺伝子の mRNA発現量低下実施例 7で用いたヒト乳がん細胞株 T- 47Dを RPMI 1640培地に懸濁し、 1ゥュル当たり 10万個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、実施例 7の方法に準じて siRNA をトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンの後、 24時間培養を継続した後に RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社）を用いてトータル RNAを抽出した。約 lOOngの卜ータノレ RNAを铸型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents

(Appl ied Biosystems社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。 TM4SF6遺伝子の発現量の測定はトータル RNAにして 10ngに相当する cDNAを铸型とし、 TaqMan Universal PGR Master Mix (Applied Biosystems社） 5 z L、 TM4SF13 遺伝子の第 4ェクソンの一部と第 5ェクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含む TaqMan Reagent (Applied Biosystems社) を 0. 5 /z Lを加え、反応液量 10 /i Lとし、定量的 PCR法を用いて測定した。 PCR反応は、 50°C · 2 分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C■ 1分のサイクルを 0回繰り返した。一方、同量の錄型 cDNA中に含まれる 0 -ァクチン遺伝子発現量を TaqMan ]3 -actin Control Reagents (Appl ied Biosystems社）を用いて測定し内部標準とした。 siR A2投与群では、陰性対照として用いた non- silensing dsRNA l投与群に比して TM4SF13の mRNA発現量は 97%低下しており、統計学的に有意な差（P< 0. 001) を示した（図 4B) 。これらの結果より、 TM4SF13遺伝子の発現量の低下によりヒト乳がん細胞株 T-47Dの細胞増殖抑制が誘発されたことが示された。実施例 9

TM4SF13タンパク質の細胞質膜への局在

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC) より購入したヒト胎児腎細胞 HEK293を、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む Eagle's MEM培地（Invitrogen社）で懸濁し、 6穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、 TM4SF13タンパク質をコードする cDNA配列（配列番号： 5 ) を有する動物細胞用発現ベクター p3xFLAG- CMV- 1⁴ - T¾WSF1³をトランスフエクシヨンした。具体的には、 p3xFLAG- CMV-14- TM4SF13 約 4 /z gを Opti- MEM I (Invitrogen社） 250 /x L に添カロし、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen社） 10 μ L を添加した Opti - MEM I (Invitrogen社） 250 /z Lと混合した後、室温で 15分間放置した。上記混合液を HEK293細胞培養液に全量添加し、培養を継続した。細胞を回収した後、細胞培養液に懸濁、 5, 000個の細胞を 2% Gelatinでコートした 4穴タイプのチャンバースライドに播種し、 24時間培養した。細胞を、抗- FLAG M2抗体 (Sigma) 、さらに FITC標識抗マウス IgG抗体（WAK0社）を用いて常法により免疫染色し、蛍光顕微鏡下での染色像を観察した。 TM4SF13- 3xFLAG融合タンパク質は細胞質膜に局在していることが確認された（図 5) 。実施例 1 0

TM4SF13タンパク質とインテグリン一 α 3の相互作用

TM4SF13— 3xFLAG融合タンパク質を強発現する MDA-MB231細胞クローンに、 CaCl₂、 MgCl₂を各 1 mM、 Tris-HCl pH7. 5を 10 mM、 NaClを 150 mM、 Brij98を l°/。、 Complete protease inhibitor (Roche) を 7 mlあたり 1粒含む水溶液を 1 ml添加し、氷上に 20分間静置することによって細胞を溶解した。陰性コントロールとして、 p3xFLAG-CMV-14 (Sigma) をトランスフエクシヨンした MDA-MB231細胞クローンを同様の方法で溶解した。細胞溶解液を回収後、小型遠心機で、 15, 000 rpm、 30分間、遠心分離を行い、上清を回収した。回収液に Protein Gァガローススラリーを 50 1添加し、 4°Cにて 1晚回転攪拌した。攪拌液を小型遠心機で遠心分離、上清を回収した後、抗-ィンテグリン一ひ 3抗体（Chemicon社） 4 μ g添加、さらに Protein Gァガローススラリーを 12. 5 μ 1添加し 4°Cにて 4時間回転攪拌することにより、免疫沈降をおこなった。また、陰性コントロールとして非免疫マウス Ig^ (R&D Systems) を 4 μ g添加、さらに Protein Gァガローススラリーを 12. 5 /z 1添加し 4°C にて 4時間回転攪拌した。攪拌液を小型遠心機で遠心分離した後、上清を除去、沈降した Protein Gァガロースを細胞溶解に用いた上記水溶液 2δ0 μ ΐで 4回洗浄した。洗浄後の Protein Gァガロースに細胞溶解に用いた上記水溶液 65 1および Laemmli's sample buffer (BIORAD社） 75 /xlを添力 13し、 95°Cにて 5分間処理後、液性画分を回収した。

細胞溶解液 10 μ 1を 7.5 %ポリアタリルァミドゲルでの SD S— PAGEに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従い PVDF膜（BIORAD社）に転写した後、プロッキング溶液（トリス緩衝化生理食塩水、 0. 1 % T w e e n— 20、 3 % スキムミルク）中に 1時間室温放置した。次に抗 FLAG- M2抗体（Sigma) を C a n G e t S i g n a l (東洋紡）溶液 1中に 1 000倍希釈の濃度となるよう加え、室温にて 90分間インキュベートし、続いて HR P標識抗マウス I g G抗体 (ImmunoResearch Laboratories t; を C a n G e t S i g n a l (東洋 ' ) 溶液 2で 5万倍に希釈した 2次抗体溶液中で 1時間室温放置した。また、陰性コントロールとして、ブロッキング後、非免疫マウス IgGi (R&D) をブロッキング溶液中にて 1 000倍希釈の濃度となるよう加え、室温にて 90分間インキュベートし、続いて HRP標識抗マウス I g G抗体（ImmunoResearch Laboratories社）をプロッキング溶液にて 5万倍に希釈した 2次抗体溶液中で 1時間室温放置した。検出は SuperSignal West Chemiluminescent (Pierce社）を用い、添付プロトコ一ルに従った。抗-インテグリン一 a 3抗体による免疫沈降産物からは抗 Flag- M2抗体によって TM4SF13— Flag融合タンパク質に由来するシグナルが検出されたのに対し、免疫沈降の陰性コントロール産物からは抗 Flag- M2抗体によるシグナルが検出されなかった。さらに非免疫マウスによっては、抗-インテグリン一 α 3抗体による免疫沈降産物、免疫沈降の陰性コントロール産物ともにシグナルは検出されなかった（図 6) 。実施例 1 1

TM4SF13タンパク質とインテグリン一 ο; 5の相互作用

TM4SF13— 3xFLAG融合タンパク質を強発現する MDA- MB231細胞クローンに、 CaCl₂、 MgCl₂を各 1 mM、 Tris-HCl pH7.5を 10 mM、 NaClを 150 raM、 CHAPSを 1%、 Complete protease inhibitor (Roche) を 7 mlあたり 1粒含む水溶液を 1 ml添加し、氷上に 20分間静置することによって細胞を溶解した。陰性コントロールとして、 .

p3xFLAG-CMV-14 (Sigma) をトランスフェクシヨンした MDA- MB231細胞クローンを同様の方法で溶解した。細胞溶解液を回収後、小型遠心機で、 15,000 rpm、 30分間、遠心分離を行い、上清を回収した。回収液に Protein Gァガローススラリーを 50 μΐ添加し、 4°Cにて 1晚回転攪拌した。攪拌液を小型遠心機で遠心分離、上清を回収した後、抗-インテグリン一 α 5抗体（Sigma) 4 μ g添加、さらに Protein G ァガローススラリーを 12.5 /zl添加し 4°Cにて 4時間回転攪拌することにより、免疫沈降をおこなった。また、陰性コントロールとして非免疫マウス Ig^ (R&D Systems) を 4 /zg添加、さらに Protein Gァガローススラリーを 12.5 μ 1添加し 4°C にて 4時間回転攪拌した。攪拌液を小型遠心機で遠心分離した後、上清を除去、沈降した Protein Gァガロースを細胞溶解に用いた上記水溶液 250 1で⁴回洗浄した。洗浄後の Protein Gァガロースに細胞溶解に用いた上記水溶液 65 _μ1および

Laemmli's sample buffer (BIORAD社） 75 /zlを添加し、 95°Cにて 5分間処理後、液性画分を回収した。

細胞溶解液 10 μ 1を 7.5 °/₀ポリアクリルァミドゲルでの SD S— PAGEに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従い PVDF膜（BIORAD社）に転写した後、プロッキング溶液（トリス緩衝化生理食塩水、 0. 1 % Tw e e n - 20, 3% スキムミルク）中に 1時間室温放置した。次に抗 FLAG- M2抗体（Sigraa) を C a n G e t S i g n a l (東洋紡）溶液 1中に 1000倍希釈の濃度となるよう力 Π え、室温にて 90分間インキュベートし、続いて HR Ρ標識抗マウス I gG抗体 (ImmunoResearch Laboratories社) を C a n G e t S i g n a l (泉洋紘) 溶液 2で 5万倍に希釈した 2次抗体溶液中で 1時間室温放置した。また、陰性コントロールとして、ブロッキング後、非免疫マウス IgG₁ (R&D) をブロッキング溶液中にて 1 000倍希釈の濃度となるよう加え、室温にて 90分間インキュベートし、続いて HRP標識抗マウス I g G抗体（ImmunoResearch Laboratories社）をブロッキング溶液にて 5万倍に希釈した 2次抗体溶液中で 1時間室温放置した。検出は SuperSignal West Chemiluminescent (Pierce社）を用い、添付プロトコ一ルに従った。抗-ィンテグリン— α 5抗体による免疫沈降産物からは抗 Flag.- M2抗体によつて TM4SF13— Flag融合タンパク質に由来するシグナルが検出されたのに対し、免疫沈降の陰性コントロール産物からは抗 Flag- M2抗体によるシグナルが検出されなかった。さらに非免疫マウス 1_§ によっては、杭-インテグリン一 α 5抗体による免疫沈降産物、免疫沈降の陰性コントロール産物ともにシグナルは検出されなかった（図 7) 。実施例 1 2

TM4SF13タンパク質発現による細胞外マトリックスコートプレート上での細胞形態変化

TM4SF13タンパク質をヒト乳がん細胞株 MDA- MB231に一過性に発現させ細胞外マトリックスコート上での表現型を観察した。具体的には、 TM4SF13タンパク質（配列番号： 6 ) をコードする cDNA配列（配列番号： 5 ) を有する動物細胞用発現べクタ一を細胞内に導入し、 TM4SF13タンパク質を一過性に発現させたヒト乳がん細胞株 MDA- MB231を、インテグリン一 ο; 3のリガンドであるラミニンをコートした 96 穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）もしくはインテグリン一 5のリガンドであるフイブロネクチンをコートした 96穴平底組織培養プレート（BDフアルコン社）に播種、 10%牛胎仔血清を含まない Leibovitz L- 15培地（Invitrogen社）で 16時間培養したときの表現型を観察した。陰性コントロールとして LacZタンパク質を発現する動物細胞用発現ベクターを上記と同様の方法で細胞内に導入した。

TM4SF13を発現させた群では、ラミニンコートプレートおよぴフイブロネクチンコートプレート上において、 LacZ発現群おょぴ外来遺伝子非導入群に比較して細胞の伸展が抑制され、細胞長が短縮するものが多く観察された（図 8) 。参考例 1

TM4SF13をコードする cDNAのクローユングと塩基配列の決定

ヒト乳がん細胞株 HCC70由来の cDNAを錄型とし、プライマー X (配列番号： 2 9 ) およびプライマー Y (配列番号： 3 0 ) を用いて PCRを行った。該反応における反応液の組成は上記 cDNA 10 ngを鎊型として使用し、 KOD- plus DNA Polymerase

(T0Y0B0社） 1 /i L、プライマー X (配列番号： 2 9 ) およぴプライマー Y (配列番号： 3 0 ) を各 300 nM、 MgS0₄を l mM、 dNTPsを 200 /i M、および lOxKOD- plus Buffer (T0Y0B0社）を力 [Iえ、 50 /z Lの液量とした。 PCRは、 94°C · 2分の後、 94°C ■ 15 秒、 ⁵⁸°C · ³0秒、 72°C■ 1分のサイクルを 35回繰り返した。ァガロースゲル電気泳動で分離、約 745bに相当する DNA断片を確認した。上記 PCR産物を 100倍希釈し、 1 しを錄型として使用し、プライマー X (配列番号： 2 9 ) およびプライマー Z (配列番号： 3 1 ) を用いて PCRを行った。該反応における反応液の組成は上記 PCR産物の 100倍希釈液を 1 レ KOD-plus DNA Polymerase (T0Y0B0社） 1 μレプライマ -X (配列番号： 2 9 ) およびプライマー Ζ (配列番号： 3 1 ) を各 300 nM、 MgS0₄ を 1 mM、 dNTPsを 200 μ M、および lOxKOD- plus Buffer (T0Y0B0社）を 5 /x Lカロえ、 50 /i Lの液量とした。反応液 5 Lをァガロースゲル電気泳動で分離し、約 646 b に相当する DNA断片を確認した。残りの 45 μ L¾rMinElute PCR purification kit (Qiagen社）を用いて精製し、制限酵素 Kpnlおよび Xbalにて処理した。

p3xFLAG-CMV-14 (Sigma社）も制限酵素 Kpnlおよび Xbalにて処理した。それぞれの DNA断片を、 PCR purification kit (Qiagen社）を用いて精製し、 DNA Ligation Kit ver. 2 (TaKaRa Bio社）を用いてライゲーシヨン反応を行った後、大腸菌 DH5 α (TaKaRa Bio社）に導入し、アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、 TM4SF13タンパク質（配列番号： 6 ) をコードする cDNA配列（配列番号： 5 ) を有する動物細胞用発現ベクター p3xFLAG- CMV - 14 - TM4SF13を得た。参考例 2

TM4SF13— 3xFLAG融合タンパク質発現ヒト乳がん細胞株 MDA- MB231クローンの樹立アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC) より購入したヒト乳がん細胞株 MDA- MB231を、. 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む Dulbecco's MEM培地（Invitrogen 社）で懸濁し、 semi- confluentで 12穴平底組織培養プレート（BDフアルユン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晚培養した後、 TM4SF13タンパク質をコードする cDNA配列（配列番号： 5 ) を有する動物細胞用発現ベクター

P3xFLAG-CMV-14- TM4SF13をトランスフエクシヨンした。具体的には、

p3xFLAG-CMV- 14 - TM4SF13約 1 μ gを Opti- MEM I (Invitrogen社） 100 /z Lに添加し、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen社） 4 μ Lを添カ卩した Opti-MEM I (Invitrogen社） 100 /z Lと混合した後、室温で 15分間放置した。上記混合液を MDA- MB231細胞培養液に全量添加し、更に 18時間培養を継続した。陰性コントロールとして、

p3xFLAG- CMV-14を上記と同様の方法でトランスフエクシヨンした。細胞を回収した後、 G418 (Invitrogen社） 500 /i _g/ml、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む Dulbecco's MEM (Invitrogen社）中に懸濁して、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 6日間培養した。増殖した細胞を回収し 5倍に希釈後、 G418 (Invitrogen社） 1000 μ Αι1、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む Dulbecco's MEM (Invitrogen社）中に懸濁して、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで培養した。 G418耐性細胞を回収し、 0. 5 cells/wellになるように、 G418 (Invitrogen社） 1000 /i g/ml、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む Dulbecco's MEM (Invitrogen社）で限界希釈を行い、 96穴平底組織培養プレート（BDフアルコン社）に播種した。増殖した細胞を G41⁸ (Invitrogen社） 1000 /z g/ml、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む Dulbecco's MEM (Invitrogen社）に懸濁して 24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種し、さらに増殖後、同様の方法で 24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。回収したクローンについて TM4SF13— 3xFLAG融合タンパク質の発現強度を抗 FLAG- M2抗体（Sigma) を用いて蛍光フローサイトメトリーで測定した。具体的には、細胞を 4%パラフオルムアルデヒドを含む PBSで 15分間固定し、 PBSで洗浄後、抗 FLAG- M2抗体（Sigma) もしくは陰性コントロールとして非免疫マウス Ig^ (R&D) を 0. 2 μ _δ含む反応溶液（牛血清アルブミンを 1 %、アジ化ナトリウムを 0. 1 %、サポニンを 0. 1 %含む PBS) 200 / L 中に懸濁した後、 30分間氷上に静置した。細胞を反応溶液で洗浄後、 FITC標識抗マウス IgG抗体（ψΑΚΟ社）を上記反応溶液にて 500倍に希釈した 2次抗体溶液中で懸濁後、 30分間氷上に放置した。細胞を上記反応溶液で洗浄後、反応溶液で懸濁し、 FACSにて蛍光強度を測定することによって、 TM4SF13— 3xFLAG融合タンパク質を強発現するクローンを選別した。実施例 1 3

TM4SF6遺伝子の siRNA投与によるヒト肺癌細胞株の細胞増殖抑制

ァメリカンタイプカルチャーコレクシヨン (ATCC) より購入したヒト肺癌細胞株 NCI-H522を、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMI IMO培地（Invitrogen社）で懸濁し、 1 ゥュル当たり 10万個の細胞密度で 6穴平底組織培養プレート（BD ファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、 siRNA をトランスフエクションした。

具体的には、 TM4SF6遺伝子の； m R N Aを切断する活性を持つ 4種の siRNAを混和し、トランスフエクシヨンに供した。コントロールとしては、実施例 2で使用した non- silensing ds R N Aを用いた。 40ριηοΓの TM4SF6遺伝子に対する siRNA または 40pmolの non - silensing ds R N Aを Optト MEM I (Invitrogen ¾) 50 μ Ι \Ζ 添力 Πし、 Lipofectamine 2000 ( Invitrogen 社） 2 /z L を添加した Opti- MEM I (Invitrogen社） 50 μ L と混合した後、室温で 20分間放置した。上記混合液を NCI- H522細胞培養液に全量添加し、更に 24時間培養を継続した後、細胞を回収した。回収した細胞を 1ゥエル当たり 3千個の細胞密度で 96穴平底組織培養プレートに播種し、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMI IMO培地（Invitrogen社）中で、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで、さらに 2日間培養した。培地を除去後、プレート- 80°Cで 5 分間静置し、室温で 5分間放置した。 1% PicoGreen (Molecular Probes社）ならびに 1% IGEPAL-CA630 (ICN Biomedical s社）を含む水溶液を 1 ゥエルあたり 100 μ L添加し、 20分間放置した後、励起波長 485nra、発光波長 535nm にて蛍光強度を計測することにより、細胞内 D N A含量を測定した。その結果、 TM4SF6遺伝子に対する siRNAを投与した細胞は non- silensing ds R N A投与細胞に比べて約 41%蛍光強度が低下し、統計学的に有意な差（P < 0. 001) を示した。実施例 1 4

TM4SF6遺伝子の siRNA投与による TM4SF6遺伝子の raRNA発現量低下

実施例 1 3で用いたヒト肺癌細胞株 NCI- H522を RPMI 1640培地に懸濁し、 1ゥエル当たり 10万個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、実施例 1 3の方法に準じて siRNAをトランスフエクションした。トランスフエクションの後、 24時間培養を維続した後に RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社）を用いてトータル R N Aを抽出した。約 lOOng のトータル R N Aを錄型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems ¾fc; を用ヽて添付プロトコ一ノレ【こ従い逆転写反応した。 TM4SF6遺伝子の発現量の測定はトータル R N Aにして 10ng に相当する c D N Aを錄型とし、 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems社） 5 μ L、 TM4SF6遺伝子の第 1ェクソンの一部と第 2エタソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含む TaqMan Reagent (Applied Biosystems社）を 0. を加え、反応液量 10 /z Lとし、定量的 P C R法を用いて測定した。 P C R反応は、 50°C■ 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。一方、同量の铸型 c D N A中に含まれる /3 - ァクチン遺伝ナ発現 ¾T TaqMan β -actm Control Reagents (Applied Biosystems 社）を用いて測定し内部標準とした。

TM4SF6 遺伝子に対する siRNA を投与した群では、陰性対照として用いた non-silensing dsRNA投与群に比して TM4SF6の m R N A発現量は 93%低下しており、統計学的に有意な差（P< 0. 001) を示した。これらの結果より、 TM4SF6遺伝子の発現量の低下によりヒト肺癌細胞株 NCI-H522 の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された。実施例 1 5

LY-6K遺伝子の s.iRNA投与によるヒト肺癌細胞株の細胞増殖抑制アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC) より購入したヒト肺癌細胞株 NCI- H23を、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMIl^O培地（Invitrogen社）で懸濁し、 1 ゥエル当たり 10万個の細胞密度で 6穴平底組織培養プレート（BD ファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、 siRNA をトランスフエクシヨンした。

具体的には、 LY-6K遺伝子の m R N Aを切断する活性を持つ 4種の siRNAを等量ずつ混和し、トランスフエクシヨンに供した。コントロールとしては、実施例 2で使用した non- silensing dsRNA を用いた。 80praol の LY- 6K遺伝子に対する siRNA ^ または 80pmolの non-silensing dsRNAを Opti-MEM I (Invitrogen社） 50 しに添カ[]し、 Lipof ectaraine 2000 (Invitrogen社） 4 μ Lを添力 tlした Opti - MEM I (Invitrogen社） 50 μ ί と混合した後、室温で 20分間放置した。上記混合液を NCI-H23細胞培養液に全量添加し、更に 24時間培養を継続した後、細胞を回収した。回収した細胞を 1ゥエル当たり 3千個の細胞密度で 96穴平底組織培養プレートに播種し、 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む RPMI1640培地（Invitrogen社）中で、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで、さらに 2日問培養した。培地を除去後、プレート- 80°Cで 5 分間静置し、室温で 5分間放置した。 CyQuant cell proliferation assay kit (Molecular Probes 社）を添付プロトコールに従って使用することにより、細胞内 D N A含量を測定した。その結果、 LY-6K遺伝子に対する siRNAを投与した細胞は non-silensing dsRNA投与細胞に比べて約 17%蛍光強度が低下し、統計学的に有意な差（Pく 0. 001) を示した。実施例 1 6

LY-6K遺伝子の siRNA投与による LY- 6K遺伝子の raRNA発現量低下

実施例 1 5で用いたヒト肺癌細胞株 NCI-H23を RPMI 1640培地に懸濁し、 1ゥル当たり 10万個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、実施例 1 5の方法に準じて siRNAをトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンの後、 24時間培養を継続した後に RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社）を用いてトータル R N Aを抽出した。約 lOOng のトータル R N Aを錶型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems ¾) ¾r用ヽて添付フロトコ一ノレこ従い逆転写反応した。 TM4SF6遺伝子の発現量の測定はトータル R N Aにして 10ng に相当する c D N Aを铸型とし、 TaqMan Universal PGR Master Mix (Applied Biosystems社） 5 /z L、 LY-6K遺伝子の第 2ェクソンの一部と第 3ェクソンの一部に由来する塩基配列を増幅するプライマーセットを含む TaqMan Reagent (Appl ied Biosystems社）を 0. を加え、反応液量 10 /x Lとし、定量的 P C R法を用いて測定した。 P C R反応は、 50°C · 2分、 95で · 10分の後、 95°C■ 15秒、 60°C■ 1分のサイクルを 40回繰り返した。一方、同量の錄型 c D N A中に含まれる ]3 - ') クテン退 125十発量を TaqMan j3— act in Control Reagents (Applied Biosystems 社）を用いて測定し内部標準とした。

LY-6K 遺伝子に対する siRNA を投与した群では、陰性対照として用いた non-silensing dsR A投与群に比して LY- 6Kの m R N A発現量は 84%低下しており、統計学的に有意な差（P< 0. 001) を示した。これらの結果より、 LY- 6K遺伝子の発現量の低下によりヒト肺癌細胞株 NCI- H23の細胞増殖抑制が誘発されたことが示された。

産業上の利用可能性

本発明で用いられるタンパク質やそれらをコードするポリヌクレオチドは、癌組織に特異的に発現し、癌の診断マーカーとなるだけでなく、それらの活性およぴまたは発現を抑制することにより、癌細胞のアポトーシス促進おょぴノまたは増殖阻害効果が得られるので、上記タンパク質に対する抗体、上記ポリヌクレォチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、上記タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、上記タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩などは、癌の予防 ·治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして安全に使用することができる。また、上記タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記抗体などは、癌の予防 ·治療物質、癌細胞のアポトーシス促進物質、およびまたは癌細胞の増殖阻害物質のスクリーユングにも有用である。本出願は、日本特許出願、特願 2005— 05 9277 (出願日： 200 5年 3月 3日）を基礎としており、その內容は全て本明細書に包含される。

Claims

請求の範囲 .

1 · 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害剤。

2 . 癌の予防 '治療用である請求項 1記載の剤。

3 . 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むァンチセン,スポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤。

4 . 癌の予防 ·治療用である請求項 3記載の剤。

5 . 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および/または活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進および/または増殖阻害剤。

6 . 癌の予防 ·治療用である請求項 5記載の剤。

7 . 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および/または活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は増殖阻害方法。

8 . 癌の予防 '治療のためである請求項 7記載の方法。

9 . 癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害剤の製造のための、配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実貧的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現おょぴ Zまたは活性阻害物質の使用。

1 0 . 癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖吗害剤が癌の予防 ·治療用である請求項 9記載の使用。

1 1 . 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害物質のスクリーニング方法。

1 2 . 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ぺプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項 1 1記載の方法。

1 3 . 配列番号： 2もしくは配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ぺプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、請求項 1 2記載の方法。

1 4 . 癌の予防 ·治療物質のスクリーニング用である請求項 1 1記載の方法。

1 5 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現およびまたは該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質を含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は增殖阻害剤。

1 6 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質が、該タンパク質に対する中和抗体である請求項 1 5記載の剤。

1 7 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を調節する物質が、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドである請求項 1 5記載の剤。

1 8 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とィンテダリンとの相互作用を調節する物質が、該タンパク質に対する非中和抗体である請求項 1 5記載の剤。

1 9 . 抗体がァゴニスト抗体である請求項 1 8記載の剤。

2 0 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現を調節する物質が、該タンパク質もしくはその部分べプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドである請求項 1 5記載の剤。

2 1 . 癌の予防 ·治療用である請求項 1 5記載の剤。

2 2 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および/または該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節することを含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は増殖阻害方法。

2 3 . 癌の予防 ·治療のためである請求項 2 2記載の方法。

2 4 . 癌細胞のアポトーシス促進および Zまたは増殖阻害剤の製造のための、配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現おょぴまたは該タンパク質とインテグリンとの相互作用を調節する物質の使用。

2 5 . 癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害剤が癌の予防 ·治療用である請求項 2 4記載の使用。

2 6 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分べプチドを用いることを含む、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害物質のスクリーユング方法。

2 7 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項 2 6記載の方法。

2 8 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、請求項 2 7記載の方法。

2 9 . 癌の予防■治療物質のスクリーニング用である請求項 2 6記載の方法。

3 0 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質またはその部分べプチド、およびインテグリンを用いることを含む、癌細胞のアポトーシス促進およびまたは増殖阻害物質のスクリーユング方法。

3 1 . 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含むダンパク質またはその部分ペプチド、およぴノまたはインテグリンが、それらを産生する細胞の形態で提供される、請求項 3 0記載の方法。

3 2 . 癌の予防 ·治療物質のスクリーニング用である請求項 3 0記載の方法。

3 3 . 配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドに対する抗体を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進およびノまたは増殖阻害剤。

3 4 . 癌の予防■治療用である請求項 3 3記載の剤。

3 5 . 配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進おょぴまたは増殖阻害剤。

3 6 . 癌の予防■治療用である請求項 3 5記載の剤。

3 7 . 配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および Zまたは活性阻害物質を含有してなる、癌細胞のアポトーシス促進おょぴまたは増殖阻害剤。

3 8 . 癌の予防 ·治療用である請求項 3 7記載の剤。

3 9 . 配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現おょぴまたは活性を阻害することを含む、癌細胞のアポトーシス促進及び/又は増殖阻害方法。

4 0 . 癌の予防 ·治療のためである請求項 3 9記載の方法。

4 1 . 癌細胞のアポトーシス促進および Zまたは増殖阻害剤の製造のための、配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現およびまたは活性阻害物質の使用。

4 2 . 癌細胞のアポトーシス促進および Zまたは増殖阻害剤が癌の予防■治療用である請求項 4 1記載の使用。

4 3 . 配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進およぴ Zまたは増殖阻害物質のスクリ一ユング方法。

4 4 . 配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項 4 3記載の方法。

4 5 . 配列番号： 8もしくは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分べプチドに対する抗体、並ぴに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかを、さらに用いることを特徴とする、請求項 4 4記載の方法。

4 6 . 癌の予防 ·治療物質のスクリーニング用である請求項 4 3記載の方法。