[go: up one dir, main page]

WO2006075597A1 - 伸展方向が制御された細胞の培養方法 - Google Patents

伸展方向が制御された細胞の培養方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006075597A1
WO2006075597A1 PCT/JP2006/300184 JP2006300184W WO2006075597A1 WO 2006075597 A1 WO2006075597 A1 WO 2006075597A1 JP 2006300184 W JP2006300184 W JP 2006300184W WO 2006075597 A1 WO2006075597 A1 WO 2006075597A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell culture
cell
culture plate
cells
cultured
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/300184
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ryosuke Nishio
Taiji Nishi
Motohiro Fukuda
Yasuzo Kirita
Seiichi Kanai
Takenori Kitani
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kuraray Co Ltd
Original Assignee
Kuraray Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kuraray Co Ltd filed Critical Kuraray Co Ltd
Priority to US11/813,720 priority Critical patent/US9005970B2/en
Priority to EP06711533.7A priority patent/EP1840207B1/en
Publication of WO2006075597A1 publication Critical patent/WO2006075597A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Definitions

  • the present invention relates to a bioassay method using cultured cells when determining the effect of a drug or the like or testing its toxicity, and a cell culturing method for therapeutic purposes.
  • Methods for testing and examining cells isolated from tissues are indispensable in the field of nanotechnology. It is widely used for diagnosing diseases and conditions, searching for new drugs and determining their efficacy, or for animal testing, plant testing, and environmental pollutant testing.
  • the isolated cells may be used immediately for testing, but many are cultured in culture dishes or test tubes by the cell culture method. Various tests are performed in this culture system.
  • the incubator used for culturing is a uniform one.
  • This incubator is generally used as a culture dish in which a culture dish is generally used.
  • a 384-well plate consisting of a large number of culture dishes with a smaller diameter has begun to be used.
  • this method can be applied only to some bioassay methods or cell cultures intended for some treatments.
  • cardiac muscle cells in a living heart are beating by the transmission of electrical signals from the brain.
  • Biological cardiomyocytes are composed of a directional array in order to perform their pulsating function. Therefore, in the field of nanotechnology, research on tissue regeneration of artificial organs requires cell culture in which the direction of extension is controlled, as is the case with living tissue, but on current culture dishes. In addition to difficulty in three-dimensional culture, culture has problems that cannot be applied for research purposes because the direction of extension cannot be controlled.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-169166
  • Patent Document 2 JP-A-8-322593
  • the present invention has been made to solve such problems, and provides a method for culturing cells in which the growth direction of the cultured cells is controlled, and a cell culture plate used for the method for culturing the cells.
  • the purpose is to do.
  • the present invention for solving the above-mentioned problems has a plurality of side walls, has a plurality of spatial structures for arranging cultured cells formed by these side walls, and further provides an opening in the side walls.
  • a cell culture plate having a connection structure in which a plurality of spatial structures are connected, adhesion spots that become pseudo scaffolds in cell culture are formed on the side wall surface, and cells cultured in the spatial structure are formed on the opposing side walls.
  • the cell culturing method is characterized in that the extending direction of the cultured cells is controlled by the cells that have been stretched and cultured in the respective spatial structures joined together by openings.
  • the side wall force and the height force of the cell culture plate are 3 ⁇ ! This is a method for culturing cells having a thickness of 3 to 1000 ⁇ m and a width of 3 to 3000 ⁇ m. Further, the cell culture plate has a flow path for perfusing the culture solution, and the width of the flow path is 1. This is a method for culturing cells having a size of ⁇ m to 1000 ⁇ m and a depth of 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the cell culture plate has a height or depth of 0.001 ⁇ in the spatial structure in which the cells are arranged! A method for culturing cells having a fine unevenness pattern of ⁇ 50 ⁇ m.
  • Another aspect of the present invention has a plurality of concave or convex patterns, and by providing these concave or convex patterns, a surface communicating with the upper part of the concave pattern or the bottom of the convex pattern is provided.
  • the cell culture plate is used to form adhesion spots that serve as pseudo-scaffolds in cell culture, or on the side wall surface of the concavo-convex pattern.
  • a cell culture method characterized in that the direction is controlled.
  • the present invention has a plurality of side walls, a plurality of spatial structures for arranging cultured cells formed by these side walls, and a plurality of openings by providing openings on the side walls.
  • the cell culture plate having a connection structure in which the spatial structures of the cells are connected and a plurality of concave or convex patterns, and by providing these concave or convex patterns, it communicates with the top of the concave pattern or the bottom of the convex pattern. It is a cell culture plate which has the surface to do.
  • another cell culture plate of the present invention is subjected to a surface treatment for cell immobilization.
  • the cell culture plate of the present invention is made of a resin molded product, and in another cell culture plate of the present invention, the resin molded product is a water-soluble resin molded product.
  • Another aspect of the present invention is a cell culture multilayer plate having a structure in which a plurality of the cell culture plates are stacked.
  • the growth direction of a cultured cell is controlled in a bioassay method using a cultured cell when determining the effect of a drug or the like or testing its toxicity, and cell culture for treatment.
  • the present invention relates to a cell culture method.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an embodiment of a cell culture plate.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an embodiment of a cell culture plate.
  • FIG. 3 is a photograph of cells cultured using the cell culture plate shown in FIG.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of an embodiment of a cell culture plate.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of an embodiment of a cell culture plate.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of an embodiment of a cell culture plate.
  • tissue cells are cultured on a cell culture dish (a petri dish or a well plate), the cultured cells are thinly stretched and take a non-directional form.
  • a method for confirming cell activity researchers use biochemical sensors to measure changes in PH due to waste product discharge and carbon dioxide release, and measurement of cells cultured in a culture dish. We are trying to compare it with the data, but the values that indicate the data of living tissue cannot be reproduced in the culture dish. Therefore, when cultured on a commercially available cell culture dish, it is judged that the cultured cells do not exhibit the functions they had in vivo. Therefore, a fine container pattern suitable for tissue cell growth was formed on the culture dish, cells were cultured in the fine container pattern, and the cells were three-dimensionally proliferated, and were held in vivo. Research has just begun to develop functions.
  • the cell culture method of the present invention has a plurality of side walls, has a plurality of spatial structures for arranging cultured cells formed by these side walls, and further has an opening on the side wall.
  • a cell culture plate having a connection structure in which a plurality of spatial structures communicate with each other, in addition to enabling three-dimensional growth, the extension direction of cultured cells can be controlled and individual spatial structures can be controlled.
  • a tissue similar to a living tissue can be obtained with a desired area and thickness. In other words, it is possible to achieve the desired tissue culture of doctors, medical engineering researchers, and patients.
  • the required aggregate size of a plurality of spatial structures is applicable in a size of 0.5 mm to 30 mm in length and width, and at least lmm to 20 cm.
  • adhesion spots serving as a pseudo-scaffold are formed on the side wall surface.
  • the cells multiply three-dimensionally in the center of the spatial structure to form a skeletal structure.
  • the adhesion spots of cells that have also extended to the opposite side walls are joined by the openings, and the adhesion spots of cells cultured in each spatial structure can be combined to produce a cultured tissue with controlled extension direction.
  • An opening is defined as a structure for connecting spatial structures formed by side walls.
  • a gap between the side walls, a concave structure on the side walls, a tunnel structure formed inside the side walls, and the like are also effective for bonding cell adhesion spots as an opening.
  • the side walls of the cell culture plate and the dimensions of the spatial structure formed by the side walls need to be in an optimum range for the purpose of culturing cells. If the spatial structure formed by the side walls is too large, the cells do not show a steric structure, as in the culture on a flat plate, and the extension direction cannot be controlled. If the spatial structure is too small, cells cannot enter the spatial structure. Therefore, it is desirable that the size of the spatial structure be within a range that can accommodate a single or a plurality depending on the cell type to be cultured. [0029]
  • the preferred side wall height is 3! Preferable to be in the range of ⁇ 1000 zm, more preferred to be in the range of 5 xm to 500 xm.
  • the thickness is preferably in the range of 3 ⁇ to 1000 ⁇ , and is preferably 5 to 111 to 500 to 111.
  • the width is preferably 3 111 to 3000 ⁇ 111, more preferably 5 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a flow path for flowing the culture solution will be described.
  • One of the purposes of the flow path provided for the flow of the culture solution is to always supply fresh culture solution to the cells, so that the freshness of the culture solution due to the waste products discharged by the cells is reduced, and the cells are alive. It prevents the function that the body had from showing up.
  • the flow direction for flowing the culture solution will allow the direction of culture cell growth to be controlled in the culture plate. It is considered that the culture fluid generates shear stress in the cultured cells by setting the flow rate and the space through which the culture fluid flows in the flow direction, and the extension direction of the cultured cells can be controlled by this shear stress.
  • the flow path for flowing the culture solution can also play a role to collect the product of the cultured cells or supply it to other series of media.
  • the product can be collected and used for drug development, or supplied to other culture plates to create a model that is closer to living tissue It is also possible to do this.
  • the shape of the channel can be any shape as long as the culture solution can be supplied. For example, when the surface having a plurality of spatial structures of the cell culture plate and the substrate are bonded, the culture solution may be flowed using the gap between the entire surface having the spatial structure and the substrate as a flow path.
  • the width or depth of the flow path is miniaturized, it is possible to obtain a high-density cell culture plate. However, it is desirable to select appropriately considering that a sufficient supply amount of the culture medium can be secured. That's right.
  • the width or depth of the flow path is 3 ⁇ m, which is practically 1 ⁇ m and 1000 ⁇ m is preferred from the viewpoint of enabling the supply of culture medium and realizing an efficient integrated cell culture plate. More preferred is m to 500 ⁇ m.
  • the flow path can be provided between a plurality of collective blocks each having a plurality of spatial structures.
  • the wall of the side wall or the bottom of the space structure, etc. There may be a fine concavo-convex pattern for promoting cell growth in the spatial structure.
  • the height or depth of the fine concavo-convex pattern is preferably in the range of from 0.001 x 50 to 50 xm, more preferably from 0.005 111 to 25 mm 111.
  • the vertical or horizontal dimension of the fine concavo-convex pattern is preferably in the range of 0.001 zm force to 50 xm, more preferably 0.005 111 to 25 mm 111.
  • Examples of a method for forming a concavo-convex pattern having a height of 1 ⁇ m or less include a sand blasting process. In the case of forming a smaller concavo-convex pattern, an etching process using Ar plasma can be used.
  • a method for forming a concavo-convex pattern having a height of 1 ⁇ m or more for example, dry etching or wet etching on a silicon material or glass material can be assumed.
  • a method for molding the resin material for example, extrusion molding, injection molding, hot embossing molding, nano-imprint molding, blow molding, calendar molding, cast molding, press molding and the like can be employed.
  • a cell culture plate having a plurality of concave or convex patterns and further having a surface communicating with the top of the concave pattern or the bottom of the convex pattern, it is expected to control the extending direction of the cultured cells. Is done.
  • the cultured cells When cell culture is performed using a cell culture plate having a plurality of concave patterns, it is possible to culture only the upper part of the concave pattern that communicates. If the area of the bottom of the concave pattern is large, the cultured cells will also extend to the bottom, so the vertical and horizontal dimensions of the bottom of the concave pattern, or one of them should be in the range of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m. It is preferable. Only the vertical dimension of the bottom of the concave pattern is in the range of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, and the horizontal dimension is set to lmm, 10mm, 50mm according to the purpose, for example, in the culture of nerve cells and vascular endothelial cells The length of the cultured cell can be realized.
  • the convex pattern is cultured only on the bottom portion that communicates. If the area of the top of the convex pattern is large, the cultured cells will also extend to the top. It is preferable that both the vertical and horizontal dimensions or one of them is in the range of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m. Only the vertical dimension of the upper part of the convex pattern is in the range of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, and the horizontal dimension is set to lmm, 10mm, 50mm according to the purpose, for example, in the culture of nerve cells and vascular endothelial cells The length of the cultured cell can be realized.
  • the depth or height of the concave or convex pattern is necessary for the cells to recognize the irregularities, and is preferably in the range of l x m to 500 x m.
  • Adhesion plaques that serve as pseudo-scaffolds in cell culture are formed on a communicating surface or a side wall surface of a concavo-convex pattern, and the extension direction can be controlled by growing on a communicating surface where cells can extend.
  • the cell culture plate subjected to microfabrication is preferably subjected to surface treatment in order to eliminate bubbles and immobilize cells.
  • it is effective to make the substrate surface hydrophilic.
  • Various methods can be applied as the surface treatment method for hydrophilizing the substrate surface. Examples thereof include a method using low temperature plasma treatment, corona discharge treatment, ultraviolet irradiation, a method in which a hydrophilic polymer material is dissolved in an aqueous solution, a coating method, vapor deposition polymerization, plasma polymerization and the like.
  • a method for improving the dissolution resistance of a coated polymer material in a culture solution a method of grafting a coating material onto a functional group on a substrate surface is known.
  • Examples of immobilization of cells include a method of hydrophobizing the substrate surface, forming a film of an inert metal, or applying collagen or the like as a protein that promotes cell adhesion.
  • Examples of the hydrophobizing method include film formation of a hydrophobic metal by sputtering and vapor deposition, vapor deposition polymerization, and film formation of a polymer material by plasma.
  • Examples of the film formation of the inert metal include a method of evaporating or sputtering gold. Further, in the surface treatment, it is possible to coat one part and modify any part.
  • the material used for the culture plate is preferably a plastic material in view of the efficiency of the surface treatment.
  • a transparent material capable of observing transmitted light is preferable.
  • the resin material is not particularly limited.
  • a silicone resin such as a salt resin resin, a polydimethylsiloxane, an acetic acid resin (trade name: exeval), a polybutyl petit resin, and the like can be given.
  • the molding method is preferably a method of forming a resin molded product using a metal structure as a mold.
  • the method of forming the resin molded product is not particularly limited, and examples thereof include injection transfer, press molding, monomer cast molding, solvent cast molding, roll transfer method by extrusion molding, etc. Injection molding is preferably used.
  • a resin molded product is formed by injection molding using a metal structure with a predetermined dimension selected as a mold, it is possible to reproduce the shape of the metal structure into a resin molded product with a high transfer rate.
  • an optical microscope, a scanning electron microscope (SEM), a transmission electron microscope (TEM), or the like can be used as a method for confirming the transfer rate.
  • These resins may be lubricants, light stabilizers, heat stabilizers, antifogging agents, pigments, flame retardants, antistatic agents, mold release agents, antiblocking agents, ultraviolet absorbers, antioxidants, etc. as necessary. 1 type or 2 types or more can be contained.
  • the cultured cell tissue can be detached from the cell culture plate and obtained alone to dramatically expand the use of cultured cells. If the cultured cells are immobilized on a substrate, the developmental use is limited to the purpose of research tests, such as the assembly to determine toxicity. In order to develop medical applications, especially therapeutic purposes, cell culture plates are limited to use as an alternative to, for example, an artificial dialysis module, and are developed for therapeutic purposes such as repairing myocardial necrotic tissue by transplantation. I can't do it. In addition, when the cultured tissue is detached, if the cells are damaged, they cannot be used for transplantation.
  • the cell culture plate can be made into a water-soluble resin molded product.
  • a water-soluble resin for example, collagen, which is a protein that promotes cell adhesion
  • the cells are allowed to proliferate by satisfying adhesion by means of a collagen coat.
  • After culturing the cells it is possible to take out only the cultured cells by immersing the substrate in the culture solution as it is.
  • water-soluble resins examples include polylactic acid, polyglycolenolic acid, polybulal alcohol resin, ethylene vinyl alcohol copolymer resin, silicone resin such as polydimethylsiloxane, and acetic acid resin (trade name: EXVAL manufactured by Kuraray Co., Ltd.) ), Polybutylar resin, and the like.
  • a plurality of cell cultures By stacking a plurality of cell culture plates, a plurality of cell cultures can be simultaneously performed, and a culture plate suitable for bioassay can be efficiently provided.
  • a culture plate suitable for bioassay By laminating a plurality of cell culture plates, for example, an alternative function of an artificial dialysis module can be expressed.
  • the dialysis function By stacking multiple cell culture plates into a cell culture multi-layer plate, the dialysis function can be enhanced, and the use of actual living tissue can increase the removal efficiency of waste products and extend the life of patients. Expected.
  • liver cells are targeted, treatments used as artificial liver modules and products such as albumin can be obtained by accumulating cultures such as Kupffer cells and epidermal cells in layers of multiple plates. Expected use of drug discovery.
  • the culture plate when the culture plate is developed for medical use, especially for therapeutic purposes, by laminating a plurality of cell culture plates, for example, some tissues are necrotic due to myocardial infarction, and normal pulsation occurs. It is expected to be applied to diseases such as fibrillation that cannot be obtained.
  • water-soluble resin is used as the material for the cell culture plate, multiple carded cell culture plates are stacked and cultured, and then the substrate is dissolved in the culture solution to allow transplanted cardiomyocyte sheets Can be obtained.
  • a resin molded product was molded using the metal structure as a mold.
  • a resist pattern was prepared by photolithography using UV light as the exposure light source, and the surface was sputtered. After depositing 500 A of nickel by electroplating, a nickel structure with a thickness of 0.5 mm was obtained.
  • the nickel metal structure was fixed to the mold cavity, and the resin cell culture plate A shown in FIG. 1 was manufactured by injection molding.
  • the material used for injection molding was Kuraray Co., Ltd. acrylic (Parapet G-HS).
  • the outer shape of the cell culture plate A is a substrate having a diameter of 100 mm and a thickness of 1 mm, and has a structure having a plurality of spatial structures 3 formed by a plurality of side walls 1 in an area of 40 mm length ⁇ 40 mm width in the center.
  • the thickness of side wall 1 is 10 / im, height 15 xm, width 60 xm, and four side walls 1 make one spatial structure 3 100 ⁇ m long ⁇ 100 ⁇ m wide and 15 ⁇ m high. It is formed .
  • the opening 2 for communicating the plurality of spatial structures 3 is a gap between the side walls arranged in a straight line, and the interval between the side walls 1 is set to 40 ⁇ m.
  • this molded product has a flat plate shape, depending on the application, for example, a plate having a plurality of spatial structures 3 formed by a plurality of side walls is attached to the bottom of a petri dish, for example, to increase research efficiency.
  • You may devise as follows.
  • a resin cell culture plate B shown in FIG. 2 was produced by the same production method as that for producing the resin cell culture plate A.
  • the outer shape of the cell culture plate B is a substrate having a diameter of 100 mm and a thickness of 1 mm, and has a structure having a plurality of spatial structures 3 formed by a plurality of side walls 1 in a central area of 40 mm ⁇ 40 mm.
  • ⁇ J wall 1 has a thickness of 10 to 20 zm, a height of 30 xm, and a width of 250 zm.
  • ⁇ J wall 1 has one spatial structure that is 100 ⁇ m long ⁇ 100 ⁇ m wide and 30 ⁇ m high. It is formed.
  • the opening 2 for communicating a plurality of spatial structures 3 was obtained with the interval between the side walls 1 being 40 ⁇ m.
  • this molded product has a flat plate shape, depending on the intended use, for example, a plate having a plurality of spatial structures 2 formed by a plurality of side walls 1 is bonded to the bottom of a petri dish, for example. You may devise so that efficiency may be improved.
  • the tree shown in Fig. 4 is produced using the same production method as that used to produce resin cell culture plate A.
  • a fat cell culture plate C was produced.
  • the outer shape of cell culture plate B is a substrate with a length of 80 mm ⁇ width 140 mm and a thickness of 1 mm, and has a plurality of spatial structures formed by a plurality of side walls in a central area of 40 mm length ⁇ width 40 mm.
  • a structure having two through-holes 4 mm in diameter for perfusing the culture solution on both sides was used.
  • the thickness of the side wall 1 is 10 zm
  • the height is 15 zm
  • the width is 60 zm
  • the four side walls form one space structure 3 that is 100 zm in length x 100 xm in width and 15 ⁇ m in height.
  • the opening 2 for communicating a plurality of spatial structures is a gap between the aligned side walls, and the interval between the side walls 1 is set to 40 xm.
  • the resin cell culture plate C is immersed in a culture solution and overlapped with an acrylic plate, and the culture test is performed in an environment in which the culture solution is circulated through the through holes 4.
  • the flow path 5 through which the culture solution flows is the entire upper surface of the plurality of spatial structures, and the gap with the acrylic plate was 0.5 mm.
  • a resin cell culture plate D shown in FIG. 5 was produced by the same production method as that for producing the resin cell culture plate A.
  • the outer shape of cell culture plate D is a 70 mm long ⁇ 140 mm wide, 1 mm thick substrate, and has a plurality of spatial structures 3 formed by multiple side walls 1 in a central 40 mm long x 40 mm wide area.
  • a structure having two through-holes 4 with a diameter of 2 mm for irrigating the culture solution on both sides was formed.
  • ⁇ J wall 1 has a thickness of 10 zm, a height of 15 zm, a width of 60 zm, and four ⁇ J walls 1 have one spatial structure 3 that is 100 zm in length x 100 xm in width and 25 ⁇ m in height It is formed.
  • the opening 2 for communicating a plurality of spatial structures 3 is a gap between the side walls 1 aligned in a straight line, and the interval between the side walls is set to 40 xm.
  • the resin cell culture plate D is immersed in a culture solution and overlapped with an acrylic plate, and the culture test is performed in an environment in which the culture solution is circulated through the through-hole 4.
  • the flow channel 5 having a width of 2 mm and a length of 40 mm through which the culture solution flows has a structure in which five channels 5 are provided at equal intervals between areas provided with a plurality of spatial structures 3.
  • the acrylic plate and the upper part of the plurality of spatial structures 3 are in close contact with each other.
  • a resin cell culture plate E shown in FIG. 6 was produced by the same production method as that for producing the resin cell culture plate A.
  • the outer shape of the cell culture plate E is a substrate having a diameter of 100 mm and a thickness of 1 mm, and has a structure having a plurality of concave patterns 6 in a central area of 40 mm length ⁇ 40 mm width.
  • the concave pattern 6 had a width of 20 x m, a depth of 30 z m, a length of 180 z m, and a continuous structure at intervals of 80 z m in the vertical direction and 20 z m in the horizontal direction.
  • Cell culture plates A to E were used for sterilization with ultraviolet rays. Next, a plate for culturing cells by applying collagen for promoting cell attachment was prepared, and then fixed in a petri dish.
  • Rat cardiomyocytes were placed on the area where the spatial structure of the cell culture plates A to D was provided and on the comparative plate 1 and immersed in the culture medium.
  • Cell culture plates C to D were immersed in the culture solution and overlapped with acrylic plates, and the culture solution was circulated through the through-hole 4
  • Rat bone marrow stromal cells and chicken embryo wire fibroblasts separated and cultured from rat bone marrow and chicken embryo heart are placed on the concave pattern area of cell culture plate E and comparative culture plate 2, and then cultured. Soaked in.
  • the cell culture test was conducted for 4 days under the above environment. Using cell culture plates C to D In this test, the culture medium was not changed because a fresh culture solution could always be supplied to the cells. However, in the test using the cell culture plates A to B and the comparative culture plate 1, the test started on the third day. The culture medium was replaced.
  • cardiomyocytes were three-dimensionally cultured in the plurality of spatial structures 3 formed by the plurality of side walls 1.
  • Adhesion plaques which serve as a pseudo-scaffold for cardiomyocytes, were formed on the side wall 1 and cultured three-dimensionally in the spatial structure 3.
  • the cardiomyocytes cultured in the spatial structure 3 also formed pseudo-scaffolds that were adhesion spots on the opposite side wall 1.
  • the cardiomyocytes cultured three-dimensionally in each spatial structure 3 are connected by the opening 2 and, as a result, succeeded in obtaining a cardiomyocyte sheet in which the extension method is controlled.
  • the cardiomyocyte sheet with the controlled stretching method thus obtained performs pulsations synchronized in connected units, and the pulsation stroke is confirmed to reproduce the living tissue by controlling the stretching. It was done.
  • Fig. 3 shows the results of culturing rat cardiomyocytes using cell culture plate A.
  • the cultured cells were thin and did not show a three-dimensional structure. Cell spreading was non-directional, and the individual myocardium pulsating independently on the plate was observed. This result shows that the cultured cells show a three-dimensional structure and have a high level, so that the cultured cells have a function that expresses their functions in the body of the cell. Is in a non-directional form. It is predicted that it is difficult to use for the judgment of the test.
  • Rat bone marrow stromal cells and chicken embryo wire fibroblasts were successfully cultured in a controlled form.
  • Rat bone marrow stromal cells and chicken embryo fibroblasts form adhesion spots that form pseudo-scaffolds on the sidewalls of the concave pattern 6 or on the top of the concave pattern 6, and then extend into the concave pattern 6. It was confirmed that it selectively extended to the upper part of the recess, which is the surface 7 to be communicated. That is, the extending direction of the cultured cells is controlled in the direction along the surface 7 that communicates.
  • the force cell culture plate E that could not have a gap on the culture surface can be cultured with the concave pattern 6 controlling the gap on the culture surface.
  • This technology is expected to enable cell culture that more accurately reproduces living tissue by combining cultured cells and co-culturing vascular endothelial cells, for example.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【課題】 　本発明は、薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイオアッセイ法、および治療を目的とした細胞培養に関して、伸展方向が制御された細胞の培養方法ならびに細胞培養プレートを提供することを目的とする。 【解決手段】 　本発明における細胞培養プレートは、側壁１を複数個有し、それらの側壁１によって形成された培養細胞を配置するための空間構造３を複数有し、さらに側壁１に開口部２を設けることにより、複数の空間構造３が連通した構造を有しており、該細胞培養プレートを用いることで、伸展方向が制御された細胞の培養方法が提供される。

Description

明 細 書
伸展方向が制御された細胞の培養方法
技術分野
[0001] 本発明は、薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用い て行うバイオアツセィ法、および治療を目的とした細胞の培養方法に関するものであ る。
背景技術
[0002] 組織から単離した細胞を試験、検査に用いる手法は、ノ ィォテクノロジー関連分野 では欠かせない方法となっている。疾病、病態の診断、新薬の探索および薬効の判 定、あるいは動物検査、植物検査、環境汚染物質の試験などに幅広く用いられてい る。
単離した細胞は、直ちに試験に用いられる場合もあるが、多くは細胞培養の方法に より培養皿や試験管のなかで培養が行われている。この培養系のなかで種々の検查 が行われる。
[0003] これらのアツセィは、通常均一な培養系を設定し、評価する薬物等の量、濃度など を変えてその効果を見るものである。そのため培養に用いる培養器も一定の均一に 形成された物が用いられる。この培養器は、培養皿というものが一般的に用いられる 培養皿として一般的に用いられているものには、シャーレ、または 6ゥヱルプレート、 12ウエノレ、 48ウエノレ、 96ゥヱルの各プレートがある（特許文献 1参照）。また、最近の 微量化への流れから、更に小口径で多数の培養皿からなる 384ゥヱルプレートも使 用され始めている。
[0004] し力しながら、組織細胞の培養は、市販されている細胞培養皿で行うと、細胞が薄く 伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示さなくなってしまう問 題を有
していた。
細胞の活性を確認する方法として、老廃物の排出による PHの変化や、炭酸ガスの 放出を電気化学センサ等で測定が可能である。生体組織の測定データと、培養皿で 培養した細胞の測定データを比較することが試みられてレ、る力 生体組織のデータ を再現する値が、培養皿では再現できていないのが現状である。理由として、 1個の ゥエルプレートは容器形状である力 S、数ミクロン力 数 10ミクロンのサイズである細胞 にとつては、平板上での培養と変わらないことが考えられる。特に、培養が難しい、例 えば肝細胞等の組織細胞の増殖では、生体内で持っていた機能をさせることが更に 困難となる。
[0005] 係る問題を解決する方法として、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器 ノ ターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養させることが試みられて いる（特許文献 2参照）。細胞を微細容器パターン内で培養し、立体的に細胞を増殖 させることで、生体内で持っていた機能を発現しょうとするものである。
[0006] し力しながら、この方法は、一部のバイオアツセィ法、または一部の治療を目的とし た細胞培養にしか適用できないことが現状である。例えば、生体の心臓における心 筋細胞は、脳からの電気シグナルの伝達によって、拍動している。生体の心筋細胞 は、その拍動機能を行うために、方向性を持った配列で構成されている。したがって 、 ノくィォテクノロジー分野のなかで、人工臓器の組織再生に関する研究では、生体 組織と同様、伸展方向が制御された細胞培養が必要とされるのに対し、現状の培養 皿上での培養は、立体的な培養が困難であることに加え、伸展方向が制御できない ため、研究試験の目的においても適用できない問題を有している。
[0007] また、治療を目的とした心筋培養の一つに、心筋梗塞により壊死した心筋組織の一 部に、培養された心筋組織を移植することで、救命するための研究が行われている。 心臓は、脳からの電気シグナルによって、心臓全体が大きく拍動している。心筋梗塞 により、一部の心筋組織が壊死すると、心筋内での信号伝達が遮断されるため、心 臓は細動といわれる小さな収縮を繰り返すことになる。この結果、心臓内への血液の 滞留によって、血栓が生じ、脳組織に運ばれた場合は、脳梗塞といった 2次的な症例 を弓 Iき起こすことになる。細動が長期に至れば、死に至る可能性もある。この治療に おいては、人工臓器そのものを完成することが目的でなぐ一部の組織の代替である ために、早期に実現することが望まれている。 [0008] し力 ながら、現状の培養皿上での培養は、立体的な培養が困難であることに加え 、伸展方向が制御できないため、この目的においても適用できない問題を有している
[0009] 特許文献 1 :特開平 1 1一 169166
特許文献 2 :特開平 8— 322593
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用いて行うバイ オアッセィ法、および治療を目的とした細胞培養において、市販されている細胞培養 皿では、細胞が薄く伸びて方向性のない形態を取り、生体内で持っていた機能を示 さなくなつてしまう問題を有していた。また、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微 細な容器パターンを形成し、その微細な容器パターン内で細胞を培養させる試みに おいても、伸展方向が制御できないため、治療を目的とした心筋細胞の培養に関す る研究においても適用できない問題点があった。
[0011] 本発明は、このような問題点を解決するためになされたもので、培養細胞の伸展方 向が制御された細胞の培養方法および該細胞の培養方法に用いる細胞培養プレー トを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0012] 上記の課題を解決する本発明は、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成 された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を 設けることにより、複数の空間構造が連結した連結構造を有する細胞培養プレートを 用いて、細胞培養における擬似足場となる接着斑を側壁面に形成させ、空間構造内 で培養された細胞は対向する側壁に伸展し、それぞれの空間構造で培養された細 胞が開口部によって結合することにより、培養細胞の伸展方向が制御されることを特 徴とする細胞の培養方法である。
[0013] また、前記細胞培養プレートにおける側壁力 高さ力 3 μ π！〜 1000 z m、厚さが 3 μ m〜1000 μ m、幅が 3 μ m〜3000 μ mである細胞の培養方法である。また、前記 細胞培養プレートが、培養液を灌流する流路を有しており、さらに、該流路の幅が 1 μ m〜1000 μ m、深さが 1 μ m〜1000 μ mである細胞の培養方法である。
[0014] また、前記細胞培養プレートが、細胞の配置される空間構造内に、高さまたは深さ が 0. 001 μ π！〜 50 μ mの微細凹凸パターンを有する細胞の培養方法である。
[0015] また、別の本発明は、複数個の凹、または凸パターンを有し、それら凹、または凸パ ターンを設けることにより、凹パターンの上部、または凸パターンの底部に連通する面 を有する細胞培養プレートを用いて、細胞培養における擬似足場となる接着斑を連 通する面、または凹凸パターンの側壁面に形成させ、細胞は伸展可能な連通する面 に増殖することで培養細胞の伸展方向が制御されることを特徴とする細胞の培養方 法である。
[0016] 一方、本発明は、側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を 配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることにより、 複数の空間構造が連結した連結構造を有する細胞培養プレートおよび複数個の凹 、または凸パターンを有し、それら凹、または凸パターンを設けることにより、凹パター ンの上部、または凸パターンの底部に連通する面を有する細胞培養プレートである。
[0017] さらに、別の本発明の上記細胞培養プレートは細胞固定化のための表面処理が施 されている。また、本発明の上記細胞培養プレートは樹脂成形品よりなり、さらに、別 の本発明の上記細胞培養プレートは前記樹脂成形品が水溶性樹脂成形品である。
[0018] また、別の本発明は、上記細胞培養プレートを複数枚積層させた構造である細胞 培養多層プレートである
発明の効果
[0019] 本発明は、薬物などの効果判定や、その毒性を試験する場合に、培養細胞を用い て行うバイオアツセィ法、および治療を目的とした細胞培養において、培養細胞の伸 展方向が制御される細胞の培養方法に関する。
[0020] 例えば、本発明方法を、心筋梗塞により、一部の心筋組織が壊死した結果、心筋 内での信号伝達が遮断され、心臓が細動を引き起こす症例に適用した場合、心筋細 胞の伸展方向が制御された組織を移植することにより、心筋の信号伝達が回復し、 正常な心臓の拍動を再現することが可能となる。
図面の簡単な説明 [0021] [図 1]細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。
[図 2]細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。
[図 3]図 1に示す細胞培養プレートを用いて培養された細胞の写真である。
[図 4]細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。
[図 5]細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。
[図 6]細胞培養プレートの実施の形態の一例を示す図である。
符号の説明
[0022] 1 :側壁、 2 :開口部、 3 :空間構造、4 :貫通孔、 5 :流路
6 :凹パターン、 7 :連通する面
発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0024] 組織細胞の培養を市販されてレ、る細胞培養皿（シャーレ、またはゥエルプレート）上 で行うと、培養細胞は薄く伸びて方向性のない形態を取る。研究者は、細胞の活性 を確認する方法として、老廃物の排出による PHの変化や、炭酸ガスの放出を電気化 学センサ等によって、生体組織の測定データと、培養皿で培養した細胞の測定デー タとを比較することを試みているが、生体組織のデータを示す値が、培養皿では再現 できていないのが現状である。したがって、市販されている細胞培養皿上での培養で は、生体内では持っていた機能を培養細胞が示していないと判断されている。そこで 、培養皿上に組織細胞の増殖に適した微細な容器パターンを形成し、その微細な容 器パターン内で細胞を培養し、立体的に細胞を増殖させることで、生体内で持ってい た機能を発現せしめるための研究が開始されたところである。
[0025] し力しながら、微細な容器パターンを有する培養皿上で培養した細胞からなる組織 を、実際に治療に適用しようと考えた場合、培養細胞からなる組織の構造が生体と同 じ配列構造を示していないため、細胞の立体的な培養が可能になっても治療用途に 適用するには大きな障害が存在しているのが現状である。例えば、心筋梗塞により一 部の心筋組織が壊死した結果、心筋内での信号伝達が遮断され、心臓が細動を引 き起こす症例に適用する場合、心筋細胞の伸展方向が制御された組織を移植する のでなければ、心筋の信号伝達を回復させ、正常な心臓の拍動を再生させることが できない。
[0026] 本発明に係る細胞の培養方法によると、側壁を複数個有し、それらの側壁によって 形成された培養細胞を配置するための複数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口 部を設けることで、複数の空間構造が連通した連結構造を有する細胞培養プレート を用いることにより、立体的な増殖が可能であることに加え、培養細胞の伸展方向が 制御でき、かつ個々の空間構造で培養した細胞が連結することにより、生体組織と同 様な組織を、所望の面積、厚さで得ることが可能となる。すなわち、医師、医工学の 研究者、患者の望む培養組織を実現できる。
側壁を複数有することで、複数の空間構造を作製し、要求される用途に応じて空間 構造のエリアサイズを設定する。要求される複数の空間構造の集合サイズは、縦'横 0. 5mm〜30mm、少なくとも lmm〜20cmのサイズで、適用可能である。
[0027] 細胞培養において、擬似足場となる接着斑は、側壁面に形成される。そして、細胞 は空間構造内の中央で立体的に増殖し、骨格構造を形成する。対向する側壁にも 伸展した細胞の接着斑は、開口部によって、それぞれの空間構造で培養された細胞 の接着斑どうしが結合し、伸展方向が制御された培養組織を製造することが可能とな る。
培養する細胞種に応じ、側壁、空間構造、開口部の寸法を設定することにより、多 様な培養系において伸展方向の制御が可能になると推測される。開口部とは、側壁 によって形成された空間構造どうしが、連結するための構造を開口部とする。例えば 、側壁どうしの隙間、側壁の凹み構造、側壁の内部に形成されたトンネル構造等も開 口部として細胞の接着斑どうしを結合するのに有効である。
[0028] 細胞培養プレートにおける側壁、および側壁によって形成される空間構造の寸法 は、細胞を培養する目的において最適な範囲であることが必要である。側壁によって 形成される空間構造が、大きすぎると、細胞は平板上での培養と同様、薄く伸びて立 体的な構造を示さず、その伸展方向を制御することはできない。空間構造が小さす ぎると、その空間構造に細胞が入ることができなくなる。したがって、空間構造の寸法 は、培養する細胞種に応じて、単一、または複数個が収納できる範囲とすることが望 ましい。 [0029] 好ましい側壁の高さは、 3 ！〜 1000 z mの範囲であることが好ましぐ 5 x m〜5 00 x mであることがより好ましレ、。厚さは、 3 μ πι〜1000 μ ΐηの範囲であることが好ま しく、 5〃111〜500〃111でぁることカょり好ましレヽ。幅は、 3 111〜3000 ^ 111でぁること が好ましぐ 5 μ m〜1000 μ mであることがより好ましい。
[0030] 培養液を流すための流路について説明する。培養液を流すために設けられる流路 の目的の一つは、常に新鮮な培養液を細胞に供給することによって、細胞が排出し た老廃物による培養液の鮮度が低下し、ひいては細胞が生体内で持っていた機能を 示さなくなることを防止するものである。
[0031] さらに、培養液を流すための流路によって、培養プレートにおいて、培養細胞の伸 展方向を制御することが可能になると期待される。培養液は、その流れ方向において 、流速、培養液がながれる空間などを設定することで培養細胞にずり応力を発生し、 このずり応力によって培養細胞の伸展方向を制御することが可能となると考えられる
[0032] また、培養液を流すための流路は、培養した細胞の産生物を回収したり他系列の 培地に供給したりするために、役割を果たすことも可能である。流路または流路の末 端に取り付けられた微小な流体コネクタによって、その産生物を回収して創薬開発に 利用したり、他の培養プレートに供給することでより生体組織に近いモデルを実現し たりすることも可能となる。流路の形状は、培養液を供給可能であればどのような形状 も可能である。例えば、細胞培養プレートの複数の空間構造を有する面と、基板を密 着させた際、その空間構造を有する面の全体と基板との隙間を流路とし、培養液を 流してもよい。
[0033] 流路の幅、または深さを微細化すれば高密度な細胞培養プレートを得ることが可能 となるが、培養液の十分な供給量を確保できることを考慮し適宜選択することが望ま しい。流路の幅、または深さは、培養液を供給可能とし、効率のよい集積化された細 胞培養プレートを実現する観点から、実質的に 1 μ m力 1000 μ mが好ましぐ 3 μ mから 500 μ mが更に好ましい。前記流路は複数の空間構造からなる複数の集合ブ ロック相互の間に設けることができる。
[0034] 細胞を培養するための空間構造において、側壁の壁部または空間構造の底部など の空間構造内に細胞の増殖を促進するための微細な凹凸パターンを有してもよい。 前記微細な凹凸パターンを有することで、細胞の固定化に必要な擬似足場と呼ばれ る接着斑が形成しやすくなり、細胞の分化、増殖を促進することが可能となる。前記 微細な凹凸パターンの高さまたは深さは、 0. OOl x mから 50 x mの範囲が好ましく 、 0. 005 111カら25〃111カ更に好ましレ、。また、前記微細な凹凸パターンの縦また は横の寸法は、 0. 001 z m力ら 50 x mの範囲カ好ましく、 0. 005 111カら25〃111 が更に好ましい。
[0035] 高さが 1 μ m以下の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、サンドブラスト 処理があげられ、更に小さな凹凸パターンを形成する場合には、 Arプラズマによるェ ツチング処理等があげられる。
[0036] 高さが 1 μ m以上の凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、シリコン材料、 ガラス材料へのドライエッチング、ウエットエッチング等が想定できる。樹脂材料への 成形方法として、例えば、押し出し成形、射出成形、ホットエンボス成形、ナノインプリ ント成形、ブロー成形、カレンダー成形、キャスト成形、プレス成形等が採用可能であ る。
[0037] 複数個の凹または凸パターンを有し、さらに、凹パターンの上部または凸パターン の底部に連通する面を有する細胞培養プレートを用いて、培養細胞の伸展方向を制 御することが期待される。
[0038] 複数個の凹パターンを有する細胞培養プレートを用いて細胞培養を行うと、凹パタ ーンにおいて、連通する上部のみに培養することが可能となる。凹パターンの底部の 面積が広いと、底部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凹パターン底部の 縦、横寸法の両方、または、片方を 1 μ mから 500 μ mの範囲とすることが好ましい。 凹パターン底部の縦寸法のみを 1 μ mから 500 μ mの範囲とし、横寸法は、例えば、 神経細胞や血管内皮細胞の培養において、 lmm、 10mm, 50mmと設定すること により、 目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。
[0039] 複数個の凸パターンを有する細胞培養プレートを用いて細胞培養を行うと、凸パタ ーンにおいて、連通する底部のみに培養することが期待される。凸パターンの上部の 面積が広いと、上部にも培養した細胞が伸展することとなるため、凸パターン上部の 縦、横寸法の両方、または、片方を 1 μ mから 500 μ mの範囲とすることが好ましい。 凸パターン上部の縦寸法のみを 1 μ mから 500 μ mの範囲とし、横寸法は、例えば、 神経細胞や血管内皮細胞の培養において、 lmm、 10mm, 50mmと設定すること により、 目的に応じた培養細胞の長さを実現することが可能となる。
[0040] 凹または凸パターンの深さ、または高さは、細胞が凹凸を認識するために必要であ り、 l x m〜500 x mの範囲とすることが好ましい。
細胞培養における擬似足場となる接着斑は、連通する面または凹凸パターンの側 壁面に形成され、細胞が伸展可能な連通する面に増殖することによって伸展方向が 制御されうる。
[0041] 微細加工を施した細胞培養プレートは、気泡を排除し、細胞を固定化するために、 表面処理を施すことが好ましい。気泡を排除し、基板表面に培養液を接触させるた めには、基板表面を親水化することが効果的である。基板表面を親水化するための 表面処理の方法は、種々の方法が適用できる。例えば、低温プラズマ処理、コロナ 放電処理、紫外線照射などを用いる方法、親水性の高分子材料を水溶液に溶解さ せコートする方法、蒸着重合、プラズマ重合などがあげられる。また、コートした高分 子材料の培養液中への耐溶解性を高める方法としては、基板表面の官能基にコート 材料をグラフトさせる方法が知られている。
[0042] 細胞を固定化するには、基板表面の疎水化、不活性金属の成膜、をまたは細胞の 付着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が挙げられる。疎水化の方 法として、例えば、スパッタリング、蒸着などによる疎水性金属の成膜、蒸着重合、プ ラズマによる高分子材料の成膜などがあげられる。不活性金属の成膜には、例えば、 金を蒸着、またはスパッタリングする方法などがあげられる。また、表面処理の際、一 部分を被覆しておき、任意の部分を改質することも可能である。
[0043] 培養プレートに使用される材質は、表面処理の効率から、プラスチック素材が好適 である。また、細胞の成長過程を観察してレ、く場合、例えば蛍光顕微鏡を用いて観 察するときには透過光観察が可能な透明材料が好ましい。樹脂材料としては特に限 定されないが、例えば、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、スチレン系樹脂 、アクリル 'スチレン系共重合樹脂（MS樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレン テレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビュルアルコール系樹脂、エチレン'ビ ニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマ一などの熱可塑性エラストマ一
、塩ィ匕ビュル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂、酢酸ビュル系樹 脂（商品名：ェクセバール）、ポリビュルプチラール系樹脂等を挙げることができる。
[0044] 成形方法は、金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する方法が好適である。
樹脂成形品の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノ マーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることが でき、生産性、型転写性の観点力 射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選 択した金属構造体を型として射出成形で樹脂成形品を形成する場合、金属構造体 の形状を高い転写率で樹脂成形品に再現することが可能である。転写率を確認する 方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（SEM)、透過電子顕微鏡 (TEM)等 を使用して行うことができる。
[0045] これらの樹脂は必要に応じて滑剤、光安定剤、熱安定剤、防曇剤、顔料、難燃剤、 帯電防止剤、離型剤、ブロッキング防止剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤などの 1種ま たは 2種以上を含有することができる。
[0046] 細胞培養後、培養された細胞組織を細胞培養プレートから剥離して単独で得ること により、培養細胞の展開用途を飛躍的に拡大することが可能となる。培養した細胞が 基板に固定化されていると、展開用途としては毒性などの判定を行うアツセィなど、研 究試験目的に限られることとなる。メディカル用途、なかでも治療目的に展開するに は、細胞培養プレートを、例えば人工透析モジュールなどの代替に用いるまでが限 界となり、心筋の壊死した組織を移植によって回復させるなどの治療目的には展開 することはできなレ、。また、培養した組織を剥離する際、細胞を傷つけてしまっては、 移植に用いることはできなくなる。
[0047] 培養された細胞を傷つけることなく剥離するには、細胞培養プレートを水溶性樹脂 成形品とすることで可能となる。水溶性樹脂で細胞培養プレートを製造した後、例え ば、表面に細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲンなど塗布する。細胞は、コ ラーゲンのコートにより、接着性を満足し、増殖を行う。細胞を培養した後、そのまま 培養液中に基板を浸すことで、培養細胞のみを取り出すことが可能となる。例えば、 細胞培養後、組織を素早く回収するには、培養液温度を高めることで、水溶性樹脂 の溶解性を高め、スピーディーに培養組織を回収することが可能となる。水溶性樹脂 としては、ポリ乳酸、ポリグリコーノレ酸、ポリビュルアルコール系樹脂、エチレン'ビニ ルアルコール系共重合樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン系樹脂、酢酸 ビュル系樹脂（商品名：株式会社クラレ製ェクセバール）、ポリビュルプチラール系樹 脂等あげることができる。
[0048] 複数の細胞培養プレートを積層させることで、複数の細胞培養を同時に行うことが でき、バイオアツセィに好適な培養プレートを効率よく提供することが可能となる。 複数の細胞培養プレートを積層させることで、例えば、人工透析モジュールの代替 機能を発現することが可能となる。複数の細胞培養プレートを積層させ細胞培養多 層プレートとすることで、透析機能を高め、実際の生体組織を使用することで、老廃 物の除去効率が高まり、患者の延命が可能になることが期待されている。
[0049] 肝臓細胞を対象とした場合も、複数のプレートの層別にクッパー細胞、表皮細胞な どの培養を集積して行うことにより、人工肝臓モジュールとして用いた治療や、アルブ ミンなどの産生物を利用した創薬利用が期待される。
[0050] また、培養プレートをメディカル用途、なかでも治療目的に展開した場合、複数の細 胞培養プレートを積層させることで、例えば、心筋梗塞によって一部の組織が壊死し 、正常な拍動が得られず細動を起こすなどの疾患に対しても適用が期待される。細 胞培養プレートの材料に、水溶性樹脂を用いた場合、複数の細胞培養プレートを積 層した培養した後、基板を培養液中に溶解させることで、移植が可能な重層化した 心筋細胞シートを得ることが可能となる。
実施例
[0051] 本発明にしたがって、培養細胞の伸展方向の制御法、および形状について図を参 照しながら以下に説明する。実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発 明はこれら実施例に限定されるものではない。
[0052] <細胞培養プレート Aの製造 >
金属構造体を型として、樹脂成形品を成形した。金属構造体は、 UV光を露光光源 としたフォトリソグラフ法によりレジストパターン体を作製、その表面にスパッタリング法 によりニッケルを 500A堆積させた後、電気メツキを実施し、厚さ 0. 5mmの二ッケノレ 製金属構造体を得た。
次に、ニッケル製金属構造体を成形金型のキヤビティに固定し、射出成形により図 1に示す樹脂製細胞培養プレート Aを製造した。射出成形に用いた材料は、（株)クラ レ製アクリル (パラペット G— HS)を使用した。
細胞培養プレート Aの外形は、直径 100mm、厚さ lmmの基板であり、中央部の縦 40mm X横 40mmのエリアに、複数の側壁 1によって形成された複数の空間構造 3 を有する構造とした。側壁 1の厚さは 10 /i m、高さ 15 x m、幅 60 x mとし、 4個の側 壁 1によって、縦 100 μ m X横 100 μ m、高さ 15 μ mの空間構造 3が 1個形成される 。複数の空間構造 3を連通するための開口部 2は、一直線に並ぶ側壁どうしの隙間 であり、側壁 1の間隔を 40 μ mとした。
本成形品は平板形状であるが、使用用途に応じて、例えば、例えばシャーレの底 部に、複数の側壁によって形成された複数の空間構造 3を有するプレートを張り合わ せるなどし、研究効率を高めるように工夫してもよい。
[0053] <細胞培養プレート Bの製造 >
樹脂製細胞培養プレート Aを製造する方法と同様の製造方法にて、図 2に示す樹 脂製細胞培養プレート Bを製造した。
細胞培養プレート Bの外形は、直径 100mm、厚さ lmmの基板であり、中央部の縦 40mm X横 40mmのエリアに、複数の側壁 1によって形成された複数の空間構造 3 を有する構造とした。佃 J壁 1の厚さは 10〜20 z m、高さ 30 x m、幅 250 z mとし、佃 J 壁 1によって、縦 100 μ m X横 100 μ m、高さ 30 μ mの空間構造が 1個形成される。 複数の空間構造 3を連通するための開口部 2は、側壁 1の間隔を 40 μ mとして得られ た。
本成形品は平板形状であるが、使用用途に応じて、例えば、例えばシャーレの底 部に、複数の側壁 1によって形成された複数の空間構造 2を有するプレートを張り合 わせるなどし、研究効率を高めるように工夫してもよい。
[0054] <細胞培養プレート Cの製造 >
樹脂製細胞培養プレート Aを製造する方法と同様の製造方法にて、図 4に示す樹 脂製細胞培養プレート Cを製造した。
細胞培養プレート Bの外形は、縦 80mmX横 140mm、厚さ lmmの基板であり、中 央部の縦 40mm X横 40mmのエリアに、複数の側壁によって形成された複数の空 間構造を有し、その両側に培養液を灌流するための直径 2mmの貫通孔 4を 2個有 する構造とした。側壁 1の厚さは 10 zm、高さ 15 zm、幅 60 zmとし、 4個の側壁に よって、縦 100 zmX横 100 xm、高さ 15 μ mの空間構造 3が 1個形成される。複数 の空間構造を連通するための開口部 2は、一直線に並ぶ側壁どうしの隙間で、側壁 1の間隔を 40 xmとした。
樹脂製細胞培養プレート Cは、細胞培養試験では、培養液に浸すともにアクリル製 プレートを重ね合わせ、貫通孔 4により培養液を循環させた環境下で培養試験を行う 。培養液が流れる流路 5は、複数の空間構造の上面全体であり、アクリル製プレート との隙間は、 0. 5mmとした。
[0055] <細胞培養プレート Dの製造 >
樹脂製細胞培養プレート Aを製造する方法と同様の製造方法にて、図 5に示す樹 脂製細胞培養プレート Dを製造した。
細胞培養プレート Dの外形は、縦 70mmX横 140mm、厚さ lmmの基板であり、中 央部の縦 40mm X横 40mmのエリアに、複数の側壁 1によって形成された複数の空 間構造 3を有し、その両側に培養液を灌流するための直径 2mmの貫通孔 4を 2個有 する構造とした。佃 J壁 1の厚さは 10 zm、高さ 15 zm、幅 60 zmとし、 4個の佃 J壁 1に よって、縦 100 zmX横 100 xm、高さ 25 μ mの空間構造 3が 1個形成される。複数 の空間構造 3を連通するための開口部 2は、一直線に並ぶ側壁 1どうしの隙間で、側 壁の間隔を 40 xmとした。
樹脂製細胞培養プレート Dは、細胞培養試験では、培養液に浸すともにアクリル製 プレートを重ね合わせ、貫通孔 4により培養液を循環させた環境下で培養試験を行う 。培養液が流れる幅 2mm、長さ 40mm流路 5は、複数の空間構造 3が設けられたェ リアの間に等間隔で 5本有する構造とした。アクリル製プレートと、複数の空間構造 3 の上部は密着している。
[0056] <細胞培養プレート Eの製造 > 樹脂製細胞培養プレート Aを製造する方法と同様の製造方法にて、図 6に示す樹 脂製細胞培養プレート Eを製造した。
細胞培養プレート Eの外形は、直径 100mm、厚さ lmmの基板であり、中央部の縦 40mm X横 40mmのエリアに、複数の凹パターン 6を有する構造とした。凹パターン 6の幅は 20 x m、深さ 30 z m、長さ 180 z mとし、縦方向 80 z m、横方向 20 z mの 間隔にて、連続する構造とした。
く細胞培養プレートの調整 >
(細胞培養プレート A〜E)
細胞培養プレート A〜Eを用い、紫外線による滅菌処理を行った。次に細胞の付着 を促すコラーゲンを塗布して細胞を培養するためのプレートを作製した後、シャーレ 内に固定した。
[0057] (比較用培養プレート 1、 2)
スライドガラス 1、 2を用い、紫外線による滅菌処理を行った。次に細胞の付着を促す コラーゲンを塗布して細胞を培養するためのプレートを作製した後、シャーレ内に固 定化した。
[0058] <培養プレート上の細胞培養環境 >
(細胞培養プレート A〜Dおよび比較用プレート A)
ラットの心筋細胞を、細胞培養プレート A〜Dの空間構造が設けられたエリア、およ び比較用プレート 1上に配置し、培養液に浸した。細胞培養プレート C〜Dは、培養 液に浸すともにアクリル製プレートを重ね合わせ、貫通孔 4により培養液を循環させた
(細胞培養プレート E、および比較用プレート B : )
ラットの骨髄およびニヮトリ胚心臓から分離培養したラット骨髄間質細胞およびニヮ トリ胚線繊芽細胞を、細胞培養プレート Eの凹パターンエリア並びに比較用培養プレ ート 2上に配置し、培養液に浸した。
[0059] <培養プレート上の細胞培養比較 >
(細胞培養プレート A〜Dおよび比較用培養プレート 1)
前記の環境下で 4日間の細胞培養試験を行った。細胞培養プレート C〜Dを用い た試験では常に新鮮な培養液を細胞に供給可能であるため培養液の交換は行わな かったが、細胞培養プレート A〜Bおよび比較用培養プレート 1を用いた試験では、 試験開始 3日目に培養液の交換を行った。
[0060] 細胞培養プレート A〜Dでは、複数の側壁 1によって形成された複数の空間構造 3 のなかで、心筋細胞が立体的に培養されていることが確認された。心筋細胞の擬似 足場となる接着斑は側壁 1に形成され、空間構造 3のなかで立体的に培養された。そ して、空間構造 3内で培養された心筋細胞は、対向する側壁 1にも接着斑である擬似 足場を形成した。そして、それぞれの空間構造 3で立体的に培養された心筋細胞は 、開口部 2によって連結しており、その結果、伸展方法が制御された心筋細胞シート を得ることに成功した。こうして得られた伸展方法が制御された心筋細胞シートは、連 結単位で同期した拍動を行うとともに、その拍動ストロークは、伸展制御することにより 生体組織を再現してレ、ることが確認された。
[0061] こうして得られる伸展方向が制御された心筋細胞シートを積層させることで、将来、 心臓の正常な機能を回復させる治療を目的とした生体移植に適用して、治療効果を 挙げることが期待される。
[0062] また、細胞培養プレート C〜Dを用いた試験では、培養液を交換することなぐ上記 の結果を得ることができた。新鮮な培養液を常に供給しているため、細胞力 排出さ れる老廃物によって、 PHが変化するなどし、培養細胞の活性が低下する懸念がない ため、肝細胞の培養など、細胞の成長が難しいとされる場合にも、これら本発明の細 胞培養プレートを適用できることが期待される。また、培養の自動化も可能となるなど の利点を有する。
細胞培養プレート Aを用いてラットの心筋細胞を培養した結果を図 3の写真に示す
[0063] 一方、比較用培養プレート 1による培養では、培養細胞が薄く伸びて立体的な構造 を示さなかった。細胞の伸展は、方向性のない形態をとり、プレートで個別の心筋が それぞれ単独で拍動している様子が観察された。この結果は、培養細胞が立体構造 を示してレヽなレ、ため、細胞生体内で持ってレ、た機能を発現してレヽなレ、こと示すもので あるのに加え、心筋細胞の伸展方向が方向性のない形態をとつているため、アツセィ 試験の判定に用いることが困難であることを予測させるものである。
(細胞培養プレート Eおよび比較用培養プレート 2)
細胞培養プレート Eによる試験では、ラット骨髄間質細胞およびニヮトリ胚線繊芽細 胞を伸展方向が制御された形態で培養することに成功した。ラット骨髄間質細胞およ びニヮトリ胚線維芽細胞は、凹パターン 6の側壁、または凹パターン 6の上部に擬似 足場となる接着斑を形成させた後、凹パターン 6の内部に伸展することなぐ連通す る面 7である凹部の上部に選択的に伸展することを確認した。すなわち、連通する面 7に沿った方向へ培養細胞の伸展方向が制御されている。
一方、比較用培養プレート 2による試験では、細胞は薄くのびて、スライドガラス一 面に広がる形態となり、伸展方向を制御することはできなかった。
また、スライドガラス上では、培養面に隙間を有することができなかった力 細胞培 養プレート Eでは、凹パターン 6によって培養面の隙間を制御した形で培養すること が可能である。この技術により、培養細胞を複合させ、例えば、血管内皮細胞を共培 養することで、生体組織をより正しく再現した細胞培養が可能になることが期待される

Claims

請求の範囲
側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複 数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることにより、複数の空間構造が 連通した連結構造を有する細胞培養プレートを用いて、細胞培養における擬似足場 となる接着斑を側壁面に形成させ、空間構造内で培養された細胞は対向する側壁に 伸展し、それぞれの空間構造で培養された細胞が開口部によって結合することにより 、培養細胞の伸展方向が制御されることを特徴とする細胞の培養方法。
前記細胞培養プレートにおける側壁力 高さ力 S3 /i m〜： 1000 /i m、厚さが 3 x m〜l 000 μ m、幅が 3 μ m〜3000 μ mであることを特徴とする請求項 1記載の細胞の培 養方法。
前記細胞培養プレートが、培養液を灌流する流路を有する請求項 1または 2記載の 細胞の培養方法。
前記流路の幅が 1 μ m〜1000 μ m、深さが 1 μ m〜1000 μ mである請求項 3に記 載の細胞の培養方法。
前記細胞培養プレートにおいて、細胞が配置される空間構造内に、高さまたは深さ が 0. 001 ！〜 50 z mの微細凹凸パターンを有する、請求項 1から 4のいずれか 1 項に記載の細胞の培養方法。
複数個の凹または凸パターンを有し、それら凹パターンの上部または凸パターンの 底部に連通する面を有する細胞培養プレートを用いて、細胞培養における擬似足場 となる接着斑を連通する面または凹凸パターンの側壁面に形成させ、該細胞を伸展 可能な連通する面に増殖せしめることで培養細胞の伸展方向が制御されることを特 徴とする細胞の培養方法。
側壁を複数個有し、それらの側壁によって形成された培養細胞を配置するための複 数の空間構造を有し、さらに、側壁に開口部を設けることにより、複数の空間構造が 連通した連結構造を有することを特徴とする細胞培養プレート。
複数個の凹、または凸パターンを有し、それら凹、または凸パターンを設けることによ り、凹パターンの上部、または凸パターンの底部に連通する面を有することを特徴と する細胞培養プレート。 [9] 前記細胞培養プレートに細胞固定化のための表面処理が施されていること特徴とす る請求項 7または 8に記載の細胞培養プレート。
[10] 樹脂成形品よりなることを特徴とする請求項 7から 9のいずれ力 4項に記載の細胞培 養プレート。
[11] 樹脂成形品が水溶性樹脂成形品である請求項 10に記載の細胞培養プレート。
[12] 請求項 7〜： 11のいずれ力 1項に記載の細胞培養プレートを複数枚積層させた構造 である細胞培養多層プレート。
PCT/JP2006/300184 2005-01-11 2006-01-11 伸展方向が制御された細胞の培養方法 Ceased WO2006075597A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/813,720 US9005970B2 (en) 2005-01-11 2006-01-11 Method of culturing cells under regulation in the extension direction
EP06711533.7A EP1840207B1 (en) 2005-01-11 2006-01-11 Method of culturing cells under regulation in the extension direction

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005003926A JP4672376B2 (ja) 2005-01-11 2005-01-11 伸展方向が制御された細胞の培養方法
JP2005-003926 2005-01-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006075597A1 true WO2006075597A1 (ja) 2006-07-20

Family

ID=36677622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/300184 Ceased WO2006075597A1 (ja) 2005-01-11 2006-01-11 伸展方向が制御された細胞の培養方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9005970B2 (ja)
EP (1) EP1840207B1 (ja)
JP (1) JP4672376B2 (ja)
WO (1) WO2006075597A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097273A1 (ja) * 2006-02-24 2007-08-30 Kuraray Co., Ltd. 樹脂製細胞培養容器およびその製造方法
WO2008156041A1 (ja) * 2007-06-18 2008-12-24 Kuraray Co., Ltd. 細胞培養容器及び細胞培養方法
WO2010047133A1 (ja) * 2008-10-24 2010-04-29 株式会社クラレ 細胞保存方法、及び細胞輸送方法
US8685733B2 (en) 2007-05-11 2014-04-01 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Cell sheet having good dimensional stability, method for production thereof, and cell culture carrier for use in the method

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1882736A4 (en) * 2005-05-17 2012-05-02 Kuraray Co CELL CULTURE CONTAINER
US8435782B2 (en) 2006-02-24 2013-05-07 Kuraray Co., Ltd. Cell culture container and method of producing the same
JP4806576B2 (ja) * 2006-02-28 2011-11-02 株式会社クラレ 細胞培養容器、その製造方法および細胞培養方法
JP4830563B2 (ja) * 2006-03-17 2011-12-07 スターライト工業株式会社 マイクロ化学デバイス
WO2008118400A1 (en) * 2007-03-22 2008-10-02 Nanologix, Inc. Detection and identification of microorganisms on transparent permeable membranes
WO2008130025A1 (ja) * 2007-04-18 2008-10-30 Public University Corporation Yokohama City University 肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法
JP2009183204A (ja) * 2008-02-06 2009-08-20 Nara Institute Of Science & Technology 細胞培養方法
WO2009099153A1 (ja) 2008-02-06 2009-08-13 National University Corporation Nagoya University 細胞培養方法
WO2009099152A1 (ja) * 2008-02-06 2009-08-13 Public University Corporation Yokohama City University 細胞培養方法及びスクリーニング方法
JP5776162B2 (ja) * 2010-10-13 2015-09-09 東洋製罐グループホールディングス株式会社 接着細胞用培養容器、及び接着細胞用培養容器の製造方法
CN103764190B (zh) 2011-06-15 2019-03-08 查尔斯斯塔克布料实验室公司 与仿生细胞化肾单位有关的系统、方法和装置
CA2839434A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Device and method for culturing cells in a biomimetic environment
JP5822266B2 (ja) * 2011-09-13 2015-11-24 国立研究開発法人物質・材料研究機構 パターン化多孔質材料及びその製造方法
US9790465B2 (en) 2013-04-30 2017-10-17 Corning Incorporated Spheroid cell culture well article and methods thereof
WO2016022930A1 (en) 2014-08-07 2016-02-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Reversible stencils for fabricating micro-tissues
US20170342363A1 (en) * 2014-10-29 2017-11-30 Corning Incorporated Devices and methods for generation and culture of 3d cell aggregates
EP3212761A1 (en) 2014-10-29 2017-09-06 Corning Incorporated Microwell design and fabrication for generation of cell culture aggregates
CN113481097A (zh) 2014-10-29 2021-10-08 康宁股份有限公司 灌注生物反应器平台
SG11201703493SA (en) 2014-10-29 2017-05-30 Corning Inc Cell culture insert
HK1251187A1 (zh) * 2015-07-30 2019-01-25 幼鲨科技责任有限公司 用於增强细胞形成的纹理化物品及其制备方法
JP6758616B2 (ja) * 2016-02-23 2020-09-23 国立大学法人 新潟大学 細胞培養方法及び培養組織
US10876089B2 (en) * 2016-10-05 2020-12-29 Boyang Zhang Apparatus and method for high-fidelity podocyte cultivation
US11857970B2 (en) 2017-07-14 2024-01-02 Corning Incorporated Cell culture vessel
WO2019014610A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Corning Incorporated CELL CULTURE CONTAINER FOR 3D CULTURE AND METHODS OF CULTURING 3D CELLS
WO2019014635A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Corning Incorporated 3D CELL CULTURE CONTAINERS FOR MANUAL OR AUTOMATIC EXCHANGE
WO2019014636A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Corning Incorporated CONTAINER FOR CELL CULTURE
WO2019039485A1 (ja) 2017-08-23 2019-02-28 王子ホールディングス株式会社 細胞シート形成部材、細胞シート形成部材の製造方法、および、細胞シートの製造方法
JP7171696B2 (ja) 2018-07-13 2022-11-15 コーニング インコーポレイテッド 相互接続されたウェルを有するマイクロプレートを備えた流体デバイス
EP3649229B1 (en) 2018-07-13 2021-08-25 Corning Incorporated Cell culture vessels with stabilizer devices
JP7171695B2 (ja) 2018-07-13 2022-11-15 コーニング インコーポレイテッド 液体培地送達面を含む側壁を有するマイクロキャビティ皿
JP7180698B2 (ja) * 2019-02-14 2022-11-30 王子ホールディングス株式会社 細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08322593A (ja) 1995-06-05 1996-12-10 Yukimasa Uehara 細胞培養多ウェルプレート、細胞の培養方法および定量方法
JP2004154027A (ja) * 2002-11-05 2004-06-03 Foundation For The Promotion Of Industrial Science 細胞培養チャンバー
JP2006050975A (ja) * 2004-08-12 2006-02-23 Kuraray Co Ltd 細胞操作用基板およびそれを用いる灌流培養装置

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0670755A (ja) * 1992-08-28 1994-03-15 Mitsubishi Electric Corp 培養神経細胞による神経回路及びその形成方法
EP1013756A1 (en) * 1998-12-21 2000-06-28 Corning Incorporated An apparatus used to hold and grow cells and allow their processes to grow and interconnect the individual cells and a method for making the apparatus
US6448069B1 (en) * 2000-06-09 2002-09-10 Genx International Corp. Embryo-culturing apparatus and method
CA2445110A1 (en) * 2001-05-01 2002-11-07 Universite Du Quebec A Montreal Tridimensional biocompatible support structure for bioartificial organs and uses thereof
AU2003220562A1 (en) * 2002-04-01 2003-10-20 Peter K. Law Cellular transplantation for heart regeneration
JP4294425B2 (ja) * 2003-09-10 2009-07-15 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 細胞培養プレート

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08322593A (ja) 1995-06-05 1996-12-10 Yukimasa Uehara 細胞培養多ウェルプレート、細胞の培養方法および定量方法
JP2004154027A (ja) * 2002-11-05 2004-06-03 Foundation For The Promotion Of Industrial Science 細胞培養チャンバー
JP2006050975A (ja) * 2004-08-12 2006-02-23 Kuraray Co Ltd 細胞操作用基板およびそれを用いる灌流培養装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1840207A4

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007097273A1 (ja) * 2006-02-24 2007-08-30 Kuraray Co., Ltd. 樹脂製細胞培養容器およびその製造方法
US8685733B2 (en) 2007-05-11 2014-04-01 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Cell sheet having good dimensional stability, method for production thereof, and cell culture carrier for use in the method
WO2008156041A1 (ja) * 2007-06-18 2008-12-24 Kuraray Co., Ltd. 細胞培養容器及び細胞培養方法
US8415157B2 (en) 2007-06-18 2013-04-09 Kuraray Co., Ltd. Cell culture container and cell culture method
WO2010047133A1 (ja) * 2008-10-24 2010-04-29 株式会社クラレ 細胞保存方法、及び細胞輸送方法
JPWO2010047133A1 (ja) * 2008-10-24 2012-03-22 株式会社クラレ 細胞保存方法、及び細胞輸送方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP4672376B2 (ja) 2011-04-20
EP1840207A1 (en) 2007-10-03
EP1840207B1 (en) 2018-05-02
EP1840207A4 (en) 2009-07-08
US9005970B2 (en) 2015-04-14
US20090017540A1 (en) 2009-01-15
JP2006191809A (ja) 2006-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4672376B2 (ja) 伸展方向が制御された細胞の培養方法
CN201080483Y (zh) 细胞培养容器
JP3139350U (ja) 細胞培養容器
JP5578779B2 (ja) スフェロイド培養方法及びスフェロイド培養容器
JP5583312B2 (ja) 組織体形成用基材、組織体形成キット、それを用いた組織体形成法、及び該組織体形成法により形成された三次元組織体
JP4389035B2 (ja) 細胞培養装置、バイオリアクター及び細胞培養チャンバー
JP2716646B2 (ja) 細胞凝集体の形成方法
Zhang et al. Micro-and nanotechnology in cardiovascular tissue engineering
CN110029059B (zh) 一种基于纳米纤维膜的细胞共培养系统
WO2010047133A1 (ja) 細胞保存方法、及び細胞輸送方法
US20110165671A1 (en) Process for providing an assembly of cell microcarriers
WO2016021498A1 (ja) 繊維状タンパク質材料の作製方法、および細胞培養方法
JP2017074050A (ja) 肝組織細胞機能の長期維持方法
CN118344971B (zh) 一种高通量血管化肝脏类器官的培养芯片、血管化肝脏类器官模型及其制备方法
JP2005176812A (ja) 培養細胞移動治具及びその利用方法
JP6468714B2 (ja) 培養容器及びそれを利用した複数の積層細胞シートの作製方法
JP6452304B2 (ja) 細胞シート培養基材、細胞シート培養基材複合物、及び細胞シート／培養基材複合の製造方法
JP2013198438A (ja) 細胞培養装置
EP3359213B1 (en) High-throughput platform for bioprinting tissue modules
JP5252828B2 (ja) 上皮系細胞培養方法
CA2372219A1 (en) Modular cell support systems for the three-dimensional cell growth
TWI383048B (zh) 細胞的培養方法，細胞培養皿及細胞培養多層皿
Pahnke et al. Spatial and electrical factors regulating cardiac regeneration and assembly
KR200438627Y1 (ko) 세포 배양 용기
JP2009279337A (ja) 硬組織再生用デバイス

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006711533

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006711533

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11813720

Country of ref document: US