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WO2005017169A1 - 植物材料への遺伝子導入を行う方法 - Google Patents

植物材料への遺伝子導入を行う方法 Download PDF

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WO2005017169A1
WO2005017169A1 PCT/JP2004/011237 JP2004011237W WO2005017169A1 WO 2005017169 A1 WO2005017169 A1 WO 2005017169A1 JP 2004011237 W JP2004011237 W JP 2004011237W WO 2005017169 A1 WO2005017169 A1 WO 2005017169A1
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WO
WIPO (PCT)
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agrobacterium
plant
plant material
gene
treatment
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/011237
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuji Ishida
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
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Priority to AU2004264463A priority patent/AU2004264463B2/en
Priority to US10/567,866 priority patent/US7812222B2/en
Priority to EP04771264A priority patent/EP1662002B1/en
Priority to JP2005513158A priority patent/JP4532413B2/ja
Priority to AT04771264T priority patent/ATE485381T1/de
Priority to CA2539299A priority patent/CA2539299C/en
Publication of WO2005017169A1 publication Critical patent/WO2005017169A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4636—Oryza sp. [rice]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/823—Nicotiana, e.g. tobacco

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a gene into plant material via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • Gene transfer by the agrobacterium method is a method for transforming a plant utilizing the function of agrobacterium.
  • T DNA which is a part of the Ti (tumor inducing) plasmid involved in the pathogenesis of Agrobacterium tumemi
  • the method for transforming plants by the agrobacterium method is to prepare a transformation plasmid in which the TDNA region of the Ti plasmid has been replaced with a gene desired to be introduced into the plant genome, and to transform the transformation plasmid into the Ti plasmid.
  • This is a method in which a gene desired to be introduced into the plant genome is introduced into the plant genome by utilizing the function of the above-mentioned agrobacterium using agrobacterium prepared as a substitute.
  • Agrobacterium bacteria are assumed to use only dicotyledonous plants as hosts and do not infest monocotyledonous plants
  • the plant transformation method using the Agrobacterium territory method was primarily used for dicotyledonous plants. It was developed as a method for transforming plants.
  • Various attempts have been made to introduce genes into monocotyledonous plants by the agrobacterium method, and a superbinary vector having a part of the virulence gene of the strongly pathogenic agrobacterium has been developed. It has been reported that the method using this vector stably and relatively efficiently transforms monocotyledonous plants such as rice and corn (Hiei, et al., 1994; Ishida, et al.).
  • a transformation method using an agrobacterium is highly efficient, has a low copy number of a gene to be introduced, and can be introduced without fragmenting TDNA and a specific region. It has many excellent features, such as the fact that transformants can be obtained by short-term cultivation, so that there are few variations in culture. For this reason, it is now widely used as the most useful means of transformation for many plant species, both dicotyledonous and monocotyledonous.
  • the composition of a test material and a culture medium are different depending on the plant species.
  • a suspension of agrobacterium is brought into contact with a tissue to be a material in any plant.
  • the common point is that transformed cells are selected after co-culture to produce transformed plants.
  • the plant tissue used as the material is infected with Agrobacterium territory without any special treatment by the power of sterilization as needed (Rogers et al. 1988, Visser 1991, McCormick 1991, Lindsey et al. 1991).
  • Transformation with Agrobacterium is a force reported in many plant species. The problem is that the transformation efficiency varies greatly depending on the plant species, genotype, and tissue used as the material (Potrykus et al. 1998). Having. When cultivating a variety into which a practical gene has been introduced, it is necessary to produce a large number of transgenic plants, and it is important to develop a technology that can provide highly efficient and stable transformation throughout the year. Transformation methods that do not depend on plant species or genotype are extremely useful for efficiently cultivating commercial varieties. Furthermore, the development of a transformation method that does not depend on the plant tissue used as the material is also necessary for efficient transformation.
  • Teasdale et al. Filed a patent application for a transformation method in which a plant tissue was immersed in a medium containing an infectious transformation vector and subjected to reduced pressure or Z or increased pressure (WO 99Z48335). According to Teasdale et al., Pressure treatment is used to facilitate the penetration of the transformation vector into plant tissue.
  • Pressure treatment is used to facilitate the penetration of the transformation vector into plant tissue.
  • the example in which the decompression treatment is performed is described, the example in which the pressure treatment is performed is not described. Therefore, there is no data showing that pressurization actually has the effect of improving gene transfer efficiency.
  • Patent Document 1 International Patent Publication WO 02/12520
  • Patent Document 2 International Patent Publication WO 99/48355
  • Patent Document 3 U.S. Patent Publication No. 6, 492, 174
  • Patent Document 4 Patent Publication No. 2, 649, 287
  • Patent Document 5 Patent Publication No. 3,329,819
  • Patent Document 6 JP-A-2000-342256
  • Patent Document 7 JP-A-2000-342255
  • Patent Document 8 JP-A-2000-342253
  • Patent Document 9 International Patent Publication WO 95/06722
  • Patent Document 10 International Patent Publication WO03Z027290
  • Non-Patent Document l Amoah, BK, Wu, H., Sparks, C. and Jones, HD (2001) Factors influencing Agrobacterium— mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue.Journal of Experimental Botany 52: 1135-1142 .
  • Non-Patent Document 2 Chan, M—T., Cheng, H—H., Ho, S—L., Tong, W—F. And Yu, S—M. (1993) Agrobacterium— mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a—amylaze promoter / ⁇ -glucuronidase gene.Plant Molecular Biology, 22, 491—50 6.
  • Non-Patent Document 3 Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. and Kumashiro, T. (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) med iated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T -DNA. The Plant Journal, 6, 271—282.
  • Non-Patent Document 4 Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P. J.J, and
  • Non-Patent Document 5 Ishida, Y., Saito, ⁇ ., Ohta, S., Hiei, ⁇ ., Komari, ⁇ . And Kumashiro, T. (1996) High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens .Nature Biotech. 14: 745-750.
  • Non-Patent Document b Komari, T. (1990) Genetic characterization of a double--flowered tobacco plant obtained in a transformation experimen t.Theor.Appl.Genet. 80: 167--171.
  • Non-Patent Document 7 Komari, T. and Kubo, T. (1999) Methods of Genet ic Transformation: Agrobacterium tumef aciens. In Vasil, IK (ed.) Molecular improvement of cereal crops. Kluwer Academic Publ ishers, Dordrecht, pp. 43-82.
  • Non-Patent Document 8 Lindsey, K., Gallois, P. and Eady, C. (1991) Reg eneration and transformation of sugarbeet by Agrobacterium tumef aciens.Plant Tissue Culture Manual B7: l-- 13. Kluwer Academic Publishers.
  • Non-Patent Document 9 McCormick, S. (1991) Transformation of tomato with Agrobacterium tumef aciens.Plant Tissue Culture Manual B6: l-- 9.Kluwer Academic Publishers.
  • Non-Patent Document 10 Potrykus, ⁇ ⁇ , Bilang, R., Futterer, J., Sautter, C. and Schrott, M. (1998) Agricultural Biotecnology, NY: Merc el Dekker Inc. pp. 119-159.
  • Non-patent literature ll Rogers, SG, Horsch, RB and Fraley, RT (1988) Gene transfer in plants: Production of transformed plants using Ti plasmid vectors. Method for Plant Molecular Biology, CA: Academic Press Inc. pp. 423-436 .
  • Non-Patent Document 12 Tingay, S., McElroy, D., Kalla, R., Fieg, S., Wang, M., Thornton, S. and Brettell, R. (1997) Agrobacterium m tumef aciens— mediated barley transformation .
  • Non-patent document 13 Trick, H.N. and Finer, J.J. (1997) SAAT: sonicat ion—assisted Agrobacterium—mediated transformation. Transgenic Research 6: 329—336.
  • Non-Patent Document 14 Visser, R.G.F. (1991) Regeneration and transformation of potato by Agrobacterium tumef aciens.Plant Tissue Culture
  • Non-Patent Document 15 Weber, S., Friedt, W., Austin, N., Molinier, J. , Himber, C., Rousselin, P., Hahne, G. and Horn, R. (200 3) Improved Agrobacterium— mediated transformation of sunflower (Helianthus annuus L.): assessment of macerating enzymes and s onication. Plant Cell Reports 21 : 475—482.
  • the present invention provides a method for introducing a gene into a plant material via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • the method of the present invention comprises:
  • the method of the present invention improves the gene transfer efficiency as compared with the case where the pressure treatment in step 1) is not performed.
  • the inventors of the present invention have made intensive studies to solve the above-mentioned problems.
  • the plant tissue was subjected to pressure treatment, and then co-cultured with Agrobacterium terrestrial bacteria to obtain an untreated silk thread.
  • they have found that gene transfer can be performed stably and with high efficiency.
  • the effect of improving the gene introduction efficiency by the pressurization treatment was recognized in both monocots and dicots.
  • the pressure-treated material dramatically improved the transformation efficiency compared to the untreated material. I found something to do.
  • the treatment with pressure increases the growth of plant tissues (eg, callus growth from immature embryos).
  • the present invention provides a method for introducing a gene into a plant material via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium,
  • the pressurization treatment of the plant material is performed before, but not simultaneously with, infection with Agrobacterium.
  • the pressure treatment is not limited, but is preferably in the range of 1.7 to 10 atm. And more preferably in the range of 2.4 to 8 atmospheres. Most preferably, it is between 4 and 8 atmospheres.
  • the range of the above pressure treatment is when the atmospheric pressure is 1 atm. Therefore, for example, a pressurization process at 1.7 atm indicates a state in which 0.7 atm is added to normal pressure, and a pressurization process at 10 atm indicates a state at normal pressure plus 9 atm.
  • the time for the pressure treatment is not limited, but is preferably 0.1 second to 4 hours, more preferably 1 second to 30 minutes.
  • the pressure treatment may be performed in a liquid or a gas.
  • the liquid can be, but is not limited to, water (eg, sterile distilled water), a liquid medium, and other liquids that do not inhibit the growth of plant tissue.
  • the gas may be, but is not limited to, air, oxygen, or any other gas that does not inhibit the growth of plant tissue.
  • the method of the pressurization treatment can be performed, for example, by combining a syringe, sandwiching the syringe with a clamp, and increasing the pressure in the syringe by narrowing the clamp.
  • the strength of pressurization can be calculated, for example, by the rate of decrease in the volume of air in the syringe.
  • the pressurization treatment can be performed by: 1) increasing the internal pressure of the container by sending gas to the container containing the plant tissue with a compressor or the like, or 2) removing the plant tissue from a bag or the like sealed so as not to come in contact with the outside air. It may be performed by submerging in liquid and pressurizing with water pressure.
  • the method of the present invention is characterized by using, as a plant material to be infected with a bacterium belonging to the genus Agrobacterium, a material subjected to a pressure treatment, and using a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • Well-known methods can be directly applied to the gene transfer or transformation method itself.
  • Gene transfer using a bacterium of the genus Agrobacterium generally comprises the following steps: a) preparing plant material;
  • step c) a step of infecting the plant material prepared in step a) with the bacteria of the genus Agrobacterium prepared in b).
  • the “plant” used for gene transfer herein includes both monocotyledonous plants and dicotyledonous plants.
  • Monocotyledonous plants include, but are not limited to, rice, corn, wheat, wheat, asparagus, sorghum, and others.
  • it is rice or corn.
  • Dicots include, but are not limited to, tobacco, soybeans, potatoes, sunflowers, and others.
  • it is tobacco.
  • the "plant material” includes, but is not limited to, cells, leaves, roots, stems, nuts, and any other parts of the plant to be used for transformation of the plant by the agrobacterium method. It encompasses all aspects of a plant such as a plant tissue, an immature embryo, a callus or an adventitious embryo-like tissue (hereinafter referred to as callus or simply callus in the present specification), or a complete plant.
  • the form of the plant used in the method of the present invention is preferably an immature embryo or callus, and most preferably an immature embryo.
  • an immature embryo refers to an embryo of an immature seed that is in a ripening process after pollination.
  • the stage (ripening stage) of the immature embryo used in the method of the present invention is not particularly limited, and may be any stage after pollination. However, those after 2 days after pollination are preferred. After transformation, it is preferable to use an immature embryo scutellum capable of inducing callus having the ability to regenerate a normal individual.
  • the immature embryos are preferably immature embryos of inbred, F1 between inbred, Fl between inbred and naturally pollinated varieties, and F1 varieties for sale.
  • callus refers to an undivided cell mass that grows randomly.
  • cells obtained by dividing plant tissues are cultured in a medium containing a plant growth regulator such as auxin (for example, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)) or cytokinin. (Referred to as a dedifferentiation medium).
  • auxin for example, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)
  • cytokinin Referred to as a dedifferentiation medium.
  • the process for obtaining this callus is called a dedifferentiation process, and this process is called a dedifferentiation process.
  • step a if necessary, plant tissues, immature embryos, and the like are removed from plants, seeds, and the like. And prepare the optimal material for transformation. If desired, the plant material may be cultured prior to infection with Agrobacterium.
  • the present invention is characterized in that the plant material is subjected to a pressure treatment in the step of preparing the plant material in step a) or after the preparation and before infecting the agrobacterium in step c).
  • T DNA Since T DNA is integrated into the plant genome due to infection with Agrobacterium, it was expected that inserting the desired gene into T DNA would also integrate this gene into the plant genome. However, since the Ti plasmid is as large as 190 kb or more, it was difficult to insert the gene into the T DNA on the plasmid using standard genetic engineering techniques. Therefore, a method for inserting a foreign gene on T DNA was developed.
  • LBA4404 Hoekema et al., 1983
  • C58Cl pGV3850
  • GV3Til which are disarmed strains in which the hormone synthesis gene has been removed from the T DNA of the neoplastic Ti plasmid.
  • Force made such as lSE By using these, two methods have been developed to introduce the desired gene into the T DNA of the Ti plasmid of agrobacterium or to introduce the T DNA having the desired gene into the agrobacterium.
  • One of them is an intermediate vector, which is easy to manipulate and can insert the desired gene, and is capable of replicating in E. coli. This is a method of introducing the DNA into the T DNA region of the rasmid by homologous recombination through a triparental mating method, and is called an intermediate vector method.
  • the other is the so-called binary vector method, in which the vir region is required for the integration of T-DNA into a plant. Not based on results.
  • the vir region includes vir A, virB, virC, virD, virE, and virG. (Encyclopedia of Plant Biotechnology (published by Enterprises Co., Ltd. (1989))), the vir region is defined as vir A, virB, virC , VirD, virE and virG. Therefore, the binary vector is obtained by incorporating TDNA into a small plasmid that can be replicated in both agrobacterium and Escherichia coli, and this is introduced into an agrobacterium having a disarmed Ti plasmid. Used.
  • the introduction of the binary vector into the agrobacterium can be carried out by a known method such as an electoral poration method or a three-way crossing method.
  • a known method such as an electoral poration method or a three-way crossing method.
  • binary vectors such as pBIN19, pBI121, and pGA482, and many new binary vectors have been constructed based on these and used for transformation.
  • Ri plasmid system a similar vector is constructed and used for transformation.
  • Agrobacterium A281 is a super-virulent strain, has a broad host range, and has a higher transformation efficiency than other strains. This characteristic is due to the Ti plasmid pTiBo542 of A281. So far, two new systems have been developed using pTiBo542. One uses strains EHA101 and EHA105, which have the disarmed Ti plasmid of pTiBo542.By applying these strains to the above-described binary vector system, various plant traits can be obtained as a system with high transformation ability. Used for conversion!
  • the other is a 'super-binary' vector (Hiei et al. (1994); Ishida et al. (1996); Komari et al. (1999); WO95 / 067 22) system. (Example: FIG. 4 of JP-A-2000-342256).
  • This system includes a disarmed Ti plasmid and T plasmid having vir regions (virA, virB, virC, virD, virE, and virG (hereinafter, these may be referred to as “vir fragment regions”).
  • Plasmids containing DNA are a type of binary vector system.
  • a binary vector a fragment containing at least virB or virG, more preferably (a fragment containing virB and virG).
  • the host Agrobacterium genus as the host is not particularly limited, for example, AgroDacterium tumefaciens (eg, AgroDacterium tu mefaciens LBA4404 (Hoekema et al., 1983) and EHA101 Can be preferably used!
  • AgroDacterium tumefaciens eg, AgroDacterium tu mefaciens LBA4404 (Hoekema et al., 1983) and EHA101 Can be preferably used!
  • a gene transfer system based on the expression of a gene group of a virulent (vir) region in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium can have a significant effect without any particular limitation. Can be obtained. Therefore, the present invention can be used for misaligned vector systems such as the above-described intermediate vector, binary vector, strongly pathogenic binary vector, and super binary vector, and the effects of the present invention can be obtained. The same applies to the case where different vector systems in which these vectors are modified are used (for example, part or all of the vir region of Agrobacterium spp.
  • the desired gene to be introduced into the plant can be incorporated into a restriction enzyme site in the TDNA region of the above-described plasmid by a conventional method, and can be used for a drug such as kanamycin or paromomycin simultaneously or separately incorporated into the plasmid. Selection can be performed based on an appropriate selection marker such as a gene having resistance. For large ones with many restriction sites, it may not always be easy to introduce the desired DNA into the TDNA region using conventional subcloning techniques. In such a case, the DNA of interest is derived by utilizing the homologous recombination in the cells of the genus Agrobacterium by the three-way hybridization method. You can enter. Without limitation, the size of the gene to be introduced is preferably about 100 bp! —200 kbp.
  • the operation of introducing a plasmid into Agrobacterium genus bacteria such as Agrobacterium tumefaciens can be performed by a conventional method.
  • the method include the above-described three-way hybridization method, the electoral method, the electoral method, and the electoral method.
  • Injection method, method by chemical treatment such as PEG, etc. are included.
  • the gene to be introduced into a plant is basically located between the left and right border sequences of T DNA, as in the conventional technique.
  • the plasmid is circular, the number of boundary sequences may be one or more. If multiple genes are to be arranged at different sites, there may be three or more boundary sequences. It may also be located on a Ti or Ri plasmid or on another plasmid in the bacterium of the genus Agrobacterium. Furthermore, it may be arranged on a plurality of types of plasmids.
  • the method of introducing a gene via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium can be performed by simply bringing the plant material into contact with the bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • a suspension of Agrobacterium bacterium having a cell concentration of about 10 6 to 10 11 cells Zml is prepared, and the plant material is immersed in the suspension for about 3 to 10 minutes, and then placed on a solid medium. It can be performed by co-culturing for several days.
  • the plant material is co-cultured with the Agrobacterium at the same time that the plant material is infected with the Agrobacterium, or after the infection and before the Agrobacterium is removed.
  • a known medium can be used for the culture solution.
  • nN6-As medium, nNB-As medium, LS-AS medium or other mediums such as N6S3-AS medium and 2N6-AS medium (Hiei et al. 1994) used in Examples are known.
  • At least one treatment selected from the group consisting of heat treatment, centrifugal treatment, and ultrasonic treatment is carried out before or during the step c) of infecting the plant material with the Agrobacterium territory. May be done on plant material.
  • These treatments also apply to the method of introducing genes into plant materials via bacteria of the genus Agrobacterium! It is known that the efficiency of gene transfer is improved.
  • centrifugation see, for example, WO 02/12520, 00—342256 [This is described, preferably, by centrifugation at 100 G or 250,000 G for 1 hour or less for 4 hours.
  • the heat treatment is described in, for example, JP-A-2000-342255.
  • the heat treatment is performed in a temperature range of 33 ° C. to 60 ° C. for 5 seconds to 24 hours.
  • sonication is described, for example, in Trick and Finer 1997, A moah et al. 2001.
  • any of these treatments such as pressurization, heating, and centrifugation may be performed alone or in combination of two or more.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-342253 describes that heat treatment and centrifugal treatment are performed in combination!
  • the step of selecting transformed cells means that at least one, and preferably both, of the phenotypic data and the physical data select cells having the desired trait.
  • the phenotypic data is obtained by, for example, determining the transformation efficiency by introducing a marker gene and Z or a selectable marker gene together with a gene desired to be introduced into a plant and evaluating the expression.
  • the marker gene and the Z or selection marker one gene, for example, a GUS (
  • the transformation efficiency can be evaluated by evaluating the color-forming ability of X-gulc (5-bromo-4,3,3,3-indolyl, ⁇ -D-glucuronic acid) following cleavage by GUS. it can.
  • an antibiotic resistance gene is used as a selectable marker gene, it can be evaluated from the degree of growth on a selection medium to which an antibiotic has been added after transformation.
  • the transformant selected as desired may be regenerated to grow a regenerated individual, and a complete plant may be obtained!
  • a known method for example, Hiei et al. 1994, Ishida et al. 1996) can be used.
  • the method of the present invention improves the gene transfer efficiency and the Z or transformation efficiency as compared with the case where no pressure treatment is performed.
  • the gene transfer efficiency can be evaluated, for example, by examining the range of transient expression of the introduced gene.
  • the transient expression of the GUS gene in the scutellum of immature embryos was evaluated using a five-point index of 1 (spot-like expression is scattered) and 1-5 (expression on the entire scutellum). .
  • the overall expression level is low, it can be evaluated by counting the number of all spots.
  • the transformation efficiency is, for example, the number of the regenerated plants obtained from the inoculated immature embryos, which showed the expression of the GUS gene, was counted as the transformant, and the total number thereof was the number of the inoculated immature embryos. Calculated by dividing. Alternatively, it can also be calculated by counting, among the regenerated plants, those showing resistance to the selection pressure as transformants, and dividing the total number by the number of inoculated immature embryos.
  • the present invention also provides a method for producing a transformed plant.
  • the method of the present invention also provides a method for producing a transformed plant. The method of the present invention
  • the present invention develops a low-cost and simple method for gene transfer with higher efficiency than the conventional agrobacterium method. In addition, it is difficult to introduce genes using the conventional agrobacterium method. Provided is a method that can be adapted to plant species and varieties that have been difficult. The method of the present invention improves the gene transfer efficiency and the Z or transformation efficiency as compared with the case where no pressure treatment is performed.
  • the gene transfer efficiency was improved by two to three times as compared with the case of untreated rice. Further, as shown in FIG. 3, in the tobacco, which is a dicotyledonous plant, the transfection efficiency was improved by a factor of 3 to 4 as compared with the case of the untreated plant.
  • the use of the method of the present invention preferably substantially enhances the gene transfer efficiency, and more preferably improves the gene transfer efficiency by a factor of two or more.
  • the transformation efficiency of rice was increased by a factor of 3 to 9 by applying pressure treatment, as compared with the case of untreated rice. Therefore, by using the method of the present invention, the transformation efficiency is preferably substantially improved, but more preferably 3 times or more.
  • FIG. 1 shows the effect of pressure treatment in gas on gene transfer efficiency (rice, cultivar: Yukihikari). control: no pretreatment pres.w / o water: in gas +5.7 atm, pressurized for 5 minutes pres.in water: distilled water +6.6 atm, pressurized for 5 minutes After each treatment, LBA4404 (pSB134 ), And after 7 days of coculture, GUS analysis was performed.
  • FIG. 2 shows the effect of pressure treatment on gene transfer (maize).
  • LBA4404 pSB131 was inoculated, co-cultured for 3 days, and analyzed by GUS.
  • FIG. 3 shows the effect of pressure treatment on gene transfer efficiency (tobacco, cultivar: Petit Habana SR1). control: no pretreatment, pressure: +6.6 atm, 5 minutes pressurization, LBA4404 (pSB134) was inoculated, co-cultured for 4 days, and analyzed by GUS.
  • a tip of a heated and crushed micropipette was inserted into the tip of a 5 ml disposable syringe, cut off at an appropriate length, and the tip was covered with a thin film.
  • agglobate terium AA major inorganic salt, LS trace inorganic salt, MS vitamin, AA amino acid, 0.2 gZl casamino acid, 4 gZl sucrose, 2 gZl glucose, ⁇ 5.2
  • immature embryos (variety: Yukihikari) collected in syringes not containing liquids such as culture medium and distilled water were added.
  • the syringe was combined, the syringe was clamped, and the pressure in the syringe was increased by narrowing the clamp. The mixture was allowed to stand at room temperature under pressure.
  • the strength of pressurization was calculated as the rate of decrease in the volume of air in the syringe.
  • approximately the same number of immature embryos were collected in a 2 ml Eppendorf tube containing a liquid medium or sterile distilled water and allowed to stand at room temperature.
  • the Agrobacterium strain and the Agrobacterium plasmid vector include Agrobacterium tumefaciens superbinary vector LBA4404 (pSB134) (HPT in which the ubiquitin intron driven by a maize ubiquitin promoter is linked to the T-DNA region. Gene and a GUS gene linked to a castor catalase intron driven by the cauliflower mosaic virus 35S promoter).
  • pSB134 was prepared by inserting a 35S-intron GUS-nos fragment derived from ⁇ SB32 as an expression marker into PKY205 (Komori et al. WO03 / 027290) at the Hindlll site.
  • the syringe was removed from the clamp, and the immature embryos in the syringe were transferred to a 2 ml Etbendorf tube containing a liquid medium.
  • 50mgZ Rere Iguromaishin and 50mgZl scan Bae Kuchinomaishi down and cultured 3-4 days on AB medium containing, Ri O scraped LBA4404 a (pSB134) a platinum loop, a liquid medium containing 100 mu Micromax Asetoshiringon at a concentration of about 10 9 cfuZml lml Suspended in It was.
  • the liquid medium was removed, and 1 ml of the aglobatate suspension was added to an Eppendorf tube.
  • nN6-As medium N6 inorganic salt, N6 vitamin, 0.5 g / l casamino acid, 0.5 g / l L-proline, lmg / 12, 4-D, 0.5 mg / l NAA, 0 lmg / 16 BA, 20 g / l sucrose, 10 g / 1 glucose, 10 ⁇ AgNO, 100 ⁇ acetosyringone, 8 g Zl agaro
  • nNB-As medium N6 major inorganic salt, B5 trace inorganic salt, B5 vitamin, 0.5gZl casamino acid, 0.5g / l L-proline, 2mg / l 2,4-D
  • the cells were placed on lmg / 1 NAA, 1 mg / 16BA, 20 g / l sucrose, lOgZl glucose, 100 ⁇ acetosyringone, 8 gZl agarose, pH 5.2) and cultured in the dark at 25 ° C for 1 week.
  • nN6CC medium N6 inorganic salt, N6 vitamin, 0.5 g Zl casamino acid, 0.5 g / l L-proline, lmg / 1 2, 4-D, 0 5 mg / l NAA, 0.1 mg / 16 BA, 20 g / l sucrose, 55 g / l sorbitol, 250 mg / l cefotaxime, 250 mg Zl carbecillin, 5 g / l gellite, pH 5.8) or N BK4CC (NBK4 major inorganic salt, B5 trace inorganic salt, B5 vitamin, AA amino acid, 0.5 g / l casamino acid, 0.5 g / 1 L-proline, lmg / 12, 4-D, 0.5 mg / l NAA, 0.1 mg / l 6BA, 20 g / l maltose
  • N BK4CC N BK4 major inorganic salt, B5 trace inorganic salt, B
  • the calli were divided into 5 pieces, placed on an nN6CC medium or NBK4CC medium containing 50 mg of hygromycin, and cultured under the same conditions for 10 days.
  • the regrown cell mass containing the proliferated cell mass containing 50 mg Zl of hygromycin (N6 inorganic salt, N6 vitamin, AA amino acid, lg / 1 casamino acid, 0.5 mg / l strength ricetin, 20 g / l sucrose, 3 Og / 1 Sorbitol, 4gZl Gelrite, pH 5.8) or ( ⁇ 4 major inorganic salts, ⁇ 5 trace inorganic salts, ⁇ 5 vitamins, ⁇ amino acids, lg / 1 casamino acid, 2mg / l force ricetin, 2 Og / 1 maltose, 30g / l
  • the cells were placed on sorbitol, 5 g / l gel light, pH 5.8) and cultured under the same conditions for about 2 weeks.
  • the immature embryos after co-cultivation and the leaf pieces from which the individuality of redistribution were also removed were 0.1% Triton X It was immersed in a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) containing —100, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After removing the agrobacterium with a phosphate buffer, 1. Add OmM 5-bromo-4-chloro-3 indolyl ⁇ D-glucuronic acid (X-glue) and a phosphate buffer containing 20% methanol. was added. After treatment at 37 ° C. for 24 hours, a blue-colored tissue was observed under a microscope.
  • spots showing transient expression of the GUS gene are observed over a wide range of the scutellum. Spots observed at distant sites in one scutellum may be derived from independent transfected cells that have been individually transfected. When immature embryos grown after co-culture and resting culture are divided into 4 to 6 clumps, even if they are single immature embryos, they are obtained by dividing 20-30 cell clumps in the presence of hygromycin Callus and its regenerated plants grown in S. cerevisiae are considered to be independent transformants.
  • One callus was selected from the cell masses of the diglomycin-resistant callus that had been grown on the cell mass obtained by dividing and placed on a redistribution medium containing hygromycin. Among the obtained regenerated plants, those showing the expression of the GUS gene were counted as transformants, and the total number was divided by the number of inoculated immature embryos to calculate the transformation efficiency.
  • the collected immature embryos of Koshihikari were placed in a syringe containing a liquid medium, and 0 (normal pressure), 0.6, 1., 4, 3.2, and 6.6 atm pressures were applied for 15 minutes each. Immersed in the suspension. After culturing on a co-culture medium for one week, the transient expression of the GUS gene was examined. In control immature embryos treated at normal pressure, some immature embryos stained blue for about half of the scutellum, but many showed spot-like expression on the scutellum surface. The immature embryos that had been calopressurized at an intensity of 0.6 atm showed the same expression pattern as the control immature embryos.
  • the immature embryos pressurized in sterile distilled water and liquid medium were pressurized, immersed in an agrobacterium suspension, and placed on a co-culture medium.
  • the transient expression of the GUS gene in immature embryos co-cultured for one week was investigated. Do not pressurize!
  • the control immature embryos showed blue in about half of the scutellum in some immature embryos, but most immature embryos showed spot-like expression.
  • all of the immature embryos subjected to the analysis showed the expression of the GUS gene on the entire scutellum regardless of the presence or absence of agrobacterium. There was no difference between sterilized distilled water and liquid medium.
  • the one that is pressurized without coexisting with the agglom battery is the one that is pressurized in the coexistence of the agglom battery. Since the transformation efficiency was higher than when the pressure was increased, the effect of the pressurization treatment on the improvement of the gene transfer efficiency observed in this method was not attributable to the promotion of the penetration of agrobacterium into plant tissues by the pressurization. The lack of power became apparent. That is, it was shown that the present invention is to enhance the gene transfer efficiency by a completely different function from the mechanism described by Teasdale et al. (WO 99/48335).
  • the collected immature embryos were placed in a syringe without liquid and a syringe with sterile distilled water.
  • the syringe without liquid was pressurized at +5.7 atm intensity for 5 minutes.
  • the syringe containing sterile distilled water was pressurized at +6.6 atm intensity for 5 minutes.
  • After the pressurized immature embryo was returned to normal pressure, it was immersed in an agrobacterium suspension and placed on a co-culture medium.
  • the control immature embryos were allowed to stand in sterile water at normal pressure for 5 minutes, immersed in an agrobacterium suspension, and placed on a co-culture medium.
  • Transient expression of the GUS gene in the scutellum of immature embryos co-cultured for one week was determined using a five-step index of 1 (spot-like expression was scattered) and 5 (expression over the entire scutellum). Expression in immature embryos pressurized in gas was slightly inferior to immature embryos pressurized in distilled water, but showed significantly broader expression than untreated control immature embryos (Figure 1).
  • the collected immature embryos (variety: Koshihikari, morning light) were placed in a syringe containing a liquid medium, and a pressure of +6.6 atm was applied for 15 minutes, and then immersed in an agrobabaterium suspension. After culturing on a co-culture medium for one week, the cells were cultured in a medium containing hygromycin, and a transformed plant was selected and re-divided. A portion of the leaves of the hygromycin-resistant plant that had been redistributed was cut out and subjected to GUS analysis. The results are shown in Table 1.
  • a corn immature embryo (variety: A188) having a size of about 1.2 mm was aseptically removed and immersed in a liquid medium for suspension of Agrobacterium teratium (LS-inf, Ishida et al. 1996). Pressurization was performed by placing the immature embryo in a syringe containing the liquid medium and narrowing the width of the clamp sandwiching the syringe. The pressure was applied at +6.6 atm for 5 minutes or +3.2 atm for 10 minutes. For centrifugation, immature embryos were placed in an eppendorf tube containing a liquid medium, and centrifuged at 15, OOO rpm, 4 ° C for 10 minutes with a centrifuge.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB131) strain (Ishida et al. 1996) about lxl0 9 cfu / ml containing Asetoshiringon 100 / z M suspended in LS- i nf medium after immersion And LS-AS co-culture medium. After culturing at 25 ° C in the dark for 3 days, GUS analysis was performed. The control immature embryos were collected, immersed in a liquid medium, and inoculated with agrobacterium by the same method.
  • the control immature embryo showed transient expression of the GUS gene as a blue spot on the scutellum surface.
  • immature embryos inoculated with agrobacterium showed an area-like expression in which about 1Z3 of the scutellum was all stained blue.
  • immature embryos pressurized at +3.2 atm for 10 minutes showed multiple GUS gene expression over the entire scutellum (Fig. 2). It has already been reported that centrifugation of plant tissue before inoculation with Agrobacterium increases the transformation efficiency (Hiei et al., WO02Zl 2520).
  • the above-mentioned force-pressing treatment has a function of improving gene transfer efficiency not only in rice but also in maize of other monocotyledonous plants, and its effect is equal to or higher than that of the previously reported centrifugation treatment. It became clear.
  • the developed leaves of tobacco (variety: Petit Havana SR1) were sterilized by a conventional method, and then made into leaf pieces of about 1 cm square.
  • the control leaf pieces were immersed in LS-R medium (Komari, 1990) in which Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB134) was suspended, gently shaken at 25 ° C for 15 minutes, and then immersed in LS-R medium at 25 ° C. And cultured in the dark for 4 days.
  • Leaf pieces of the pressurized group were pressurized at +6.6 atm for 15 minutes in a syringe containing LS-R medium, and then inoculated with agrobacterium in the same manner as control leaf pieces and cultured.
  • GUS analysis was performed on leaf pieces after co-culture.
  • the collected immature embryos of Koshihikari were pressurized in a liquid medium for suspension of Agrobacterium at +6.6 atm for 15 minutes, and then placed on NBK4CC medium.
  • the control immature embryos were immersed in the same liquid medium under normal pressure, and then placed on NBK4CC medium. After culturing at 25 ° C. in the dark for one week, the fresh weight of 10 immature embryos was measured. The test was performed in 5 replicates. Inoculation of Agrobacterium was not performed in both plots. Table 2 shows the results.
  • the pressurization treatment has a function of activating the proliferation of cells, not only improving the gene transfer efficiency.
  • the improvement of the cell growth rate of plant tissue by high-pressure short-time treatment is achieved by culturing under a low pressure of +0.5 atm for 1 to 10 weeks.
  • the method of U.S. Pat.No. 6,492,174, which increases the rate of callus formation, differs from the method of U.S. Pat. Conceivable.

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Abstract

　本発明は、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法に関する。本発明の方法は、１）植物材料を加圧処理し、次いで、２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させる、ことを含む、ことを特徴とする。

Description

明 細 書
植物材料への遺伝子導入を行う方法
技術分野
[0001] 本出願は、 2003年 8月 13日に提出された日本国特許出願 2003— 293125に基 づく優先権を主張する。
[0002] 本発明は、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法 に関する。
背景技術
[0003] ァグロバタテリゥム法による遺伝子導入は、ァグロバタテリゥムの機能を利用した植 物の形質転換方法である。土壌細菌ァグロバタテリゥム（Agrobacterium tumefac iens)は、植物に感染すると、ァグロバタテリゥムの病原性に関与している Ti (tumor inducing)プラスミドの一部である T DNAが植物ゲノムに組み込まれる機能を有 している。ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換方法は、 Tiプラスミドの T DN A領域を植物ゲノムに導入を所望する遺伝子に置き換えた形質転換用プラスミドを 調製し、当該形質転換用プラスミドを Tiプラスミドの代わりに有するように調製したァ グロバタテリゥムを用いて、上記のァグロバタテリゥムの機能を利用することにより、当 該植物ゲノムに導入を所望する遺伝子を植物ゲノム中に導入する方法である。
[0004] ァグロパクテリゥム属細菌は双子葉植物のみを宿主とし、単子葉植物には寄生しな いとされていたため、当初、ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換法は主として 双子葉植物の形質転換法として発展した。単子葉植物へのァグロパクテリゥム法によ る遺伝子導入にっ ヽても様々な試みがなされ、強病原性ァグロバタテリゥムの病原性 遺伝子の一部を有するスーパーバイナリーベクターが開発され、このベクターを用い た方法においては、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても安定して、比較 的効率よく形質転換されることが報告された (Hiei, et al. , 1994 ;Ishida, et al. , 1996 ;特許第 2, 649, 287号；特許第 3, 329, 819号）。さらに、コムギ、ォォムギ およびソルガムといった単子葉植物についてもァグロバタテリゥム法による形質転換 の成功例が報告され、単子葉植物についてもァグロパクテリゥム法による形質転換が 広く行われるに至った。
[0005] ァグロパクテリゥムによる形質転換法は、一般的に、効率が高い、導入される遺伝 子のコピー数が少な 、、 T DNAと 、う特定の領域を断片化させることなく導入でき る、短期間の培養により形質転換体を得ることができるため培養変異が少ないなど、 多くの優れた特徴を持っている。このため、現在では双子葉、単子葉を問わず多くの 植物種で最も有用な形質転換の手段として広く用いられて 、る。
[0006] ァグロバタテリゥムによる形質転換方法は、植物種により供試材料、培養培地の組 成は異なる力 いずれの植物においても材料となる組織にァグロバタテリゥム懸濁液 を接触させ、共存培養の後に形質転換細胞の選抜を行い、形質転換植物を作出す る点は共通している。一般に、材料となる植物組織は、必要に応じ滅菌処理がなされ る力 それ以外に特別な処理をすることなくァグロバタテリゥムの感染が行われる (Ro gers et al. 1988, Visser 1991, McCormick 1991, Lindsey et al . 1991)。
[0007] ァグロバタテリゥムによる形質転換は多くの植物種で報告されている力 その形質 転換効率は植物の種、遺伝子型そして材料となる組織により大きく異なる（Potrykus et al. 1998)という問題を有する。実用遺伝子を導入した品種を育成する場合、 多数の形質転換植物を作出する必要があり、一年を通じて高い効率で、安定して形 質転 ^¾物の得られる技術の開発は重要である。また、植物の種や遺伝子型によら ない形質転換法は、効率的に実用品種を育成する上で極めて有用である。さらに、 材料となる植物組織によらない形質転換法の開発も、形質転換を効率的に進める上 で必要である。
[0008] このように遺伝子導入効率を向上させる、あるいは遺伝子導入が困難な植物種や 遺伝子型も形質転換できる方法の開発は重要であり、現在までに多くの報告がなさ れている。しかし、その多くは、培地組成やマーカー遺伝子、プロモーターの改変あ るいは供試材料の検討によるものである。ァグロバタテリゥム感染前の植物組織を遺 伝子導入に適した状態にする処理方法を検討した例もあるが、それらはメス (Chan et al. 1993)、パーティクルガン (Tingay et al. 1997)、超音波（Trick and Finer 1997, Amoah et al. 2001)、酵素処理 (Weber et al. 2003) などにより、いずれも組織を付傷することで感染効率を向上させるものである。
[0009] Hieiらは、植物組織を遠心処理した後、ァグロバタテリゥムにより遺伝子導入を行う ことにより無処理の組織に比べ高い効率で形質転換のなされることを見出した (WO 02/12520,特開 2000— 342256)。遠心処理による形質転換効率の向上は機 構の詳細は不明であるが、上述の物理的に組織を付傷する方法とは異なり、遠心処 理することで遺伝子導入が生じやすい生理状態に細胞が変化したものであると考え られる。同様に、熱処理、あるいは遠心処理と熱処理の双方を施した場合も、無処理 の組織に比べ高い効率で形質転換のなされることを見出されている（特開 2000— 34 2255、特開 2000— 342253)。
[0010] Teasdaleらは感染性のある形質転換ベクターを含む培地に植物組織を浸漬し、減 圧あるいは Zまた加圧を行う形質転換方法を特許出願した (WO 99Z48335)。 T easdaleらは、加圧処理は形質転換ベクターの植物組織への浸透を促すために行わ れるとしている。しかし、その実験例では減圧処理を行った例は記載されているもの の、加圧処理を行った例の記載はない。従って、実際に加圧処理が遺伝子導入効 率を向上させる効果のあることを裏付けるデータは全く示されて 、な 、。
[0011] Pullman and Peterは加圧条件下で植物組織を培養することによりェンブリオジ エニックなカルスの形成率を高める方法を特許出願した（US 6, 492, 174)。加圧 強度 1 2. 5atmを 8週間の培養期間中加えた試験では 1. 5atmでの培養が最も高 いカルス形成率を示したとしている。また、その他の試験は全て 1. 5atmという極く低 Vヽ加圧条件下で行われて 、る。加圧処理が遺伝子導入に及ぼす効果につ!ヽての記 載はなされていない。
特許文献 1 :国際特許公開公報 WO 02/12520
特許文献 2 :国際特許公開公報 WO 99/48355
特許文献 3 :米国特許公報 第 6, 492, 174号
特許文献 4 :特許公報 第 2, 649, 287号
特許文献 5 :特許公報 第 3, 329, 819号
特許文献 6：特開 2000— 342256
特許文献 7：特開 2000 - 342255 特許文献 8：特開 2000— 342253
特許文献 9 :国際特許公開公報 WO 95/06722
特許文献 10 :国際特許公開公報 WO03Z027290
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明は、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法 を提供する。本発明の方法は、
1)植物材料を加圧処理し、次いで
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる
ことを含む、ことを特徴とする。本発明の方法は、工程 1)の加圧処理を行わない場合 と比較して、遺伝子導入効率が向上する。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、植物組織を加圧処 理後、ァグロバタテリゥム細菌と共存培養することにより、無処理の糸且織に比べ、安定 して高い効率で遺伝子導入のなされることを見いだした。さらに、加圧処理による遺 伝子導入効率向上の効果は、単子葉、双子葉を問わず認められることを確認した。 また、遺伝子導入された植物材料について、さらに、形質転換細胞の選抜及び形質 転換植物の再分化を行ったところ、加圧処理した材料は無処理の材料に比べ、飛躍 的に形質転換効率が向上することを見いだした。さらに、加圧処理することにより植 物組織の増殖 (例えば、未熟胚からのカルス増殖）が旺盛になることを明らかにした。
[0014] よって、本発明は、ァグロバタテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を 行う方法であって、
1)植物材料を加圧処理し、次いで
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる
ことを含む、方法に関する。即ち、本発明において、植物材料の加圧処理は、ァグロ ノ クテリゥムの感染と同時ではなぐその前に行われる。
[0015] 加圧処理は、限定されるわけではないが、好ましくは 1. 7気圧ないし 10気圧の範 囲、より好ましくは 2. 4気圧ないし 8気圧の範囲で行われる。最も好ましくは、 4気圧か ら 8気圧である。上記加圧処理の範囲は常圧を 1気圧としたときのものである。従って 、例えば、 1. 7気圧の加圧処理とは常圧に 0. 7気圧の圧を加えた状態を示し、同様 に 10気圧の加圧処理とは常圧プラス 9気圧の状態を示す。また、加圧処理時間は、 限定されるわけではないが、好ましくは 0. 1秒間ないし 4時間、より好ましくは 1秒間 ないし 30分間行う。
[0016] 加圧処理は、液体中又は気体中のいずれで行ってもよい。液体は、非限定的に、 水 (例えば、滅菌蒸留水）、液体培地、その他植物組織の生育を阻害しない液体等 を使用可能である。気体は、非限定的に、空気中、酸素中、その他植物組織の生育 を阻害しな!、気体等を使用可能である。
[0017] 加圧処理の方法は、例えば、注射器を組み合わせ、クランプで注射器をはさみ、ク ランプを狭めることにより注射器内の圧を高めることによって行うことができる。加圧の 強度は、例えば、注射器内の空気の体積の減少率力 算出できる。あるいは、加圧 処理は、 1)植物組織を含む容器にコンプレッサー等で気体を送り、容器の内圧を高 める、または、 2)外気と接しないように密封した袋等に入れた植物組織を液体中に沈 下し、水圧により加圧する、ことによって行っても良い。
[0018] 本発明の方法は、ァグロバタテリゥム属細菌に感染させる植物材料として、加圧処 理したものを用いることを特徴とするものであり、ァグロバタテリゥム属細菌を用いた遺 伝子導入あるいは形質転換方法自体としては、周知の方法をそのまま適用すること が可能である。
[0019] ァグロパクテリゥム属糸田 ¾fを用いた遣伝 入 び开^ ff転椽 法
ァグロパクテリゥム属細菌を用いた遺伝子導入は、一般には以下の工程を含む： a)植物材料を調製する工程；
b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むァグロパクテリゥム属細菌を調製する 工程；
c)工程 a)で調製した植物材料を b)で調製したァグロパクテリゥム属細菌に感染さ せる工程。
[0020] さらに、形質転換体を得るために、上記工程 c)に次、で d)形質転換細胞を選抜する工程;及び
e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
を施してもよい。
[0021] 工程 a)について
本明細書に遺伝子導入に供される「植物」は、単子葉植物および双子葉植物の ヽ ずれも含む。単子葉植物には、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ、アスパラガス、 ソルガム、その他が含まれるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、イネ又 はトウモロコシである。双子葉植物にはタバコ、ダイズ、ジャガイモ、ヒマヮリ、その他が 含まれるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、タバコである。
[0022] また、「植物材料」とは、非限定的に、ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換に 供するための当該植物の細胞、葉、根、茎、実、その他いずれの部位の植物組織、 未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織 (以下、本明細書においてカルス等、または単 にカルスという）、または完全な植物体など植物のあらゆる態様を包含する。
[0023] 本発明の方法に用いる植物の形態として望ましいのは未熟胚またはカルスであり、 最も望ましいのは未熟胚である。本明細書において、植物の細胞、組織、完全な植 物体という表現は、技術分野において一般的に用いられる意味で用いられる。本明 細書において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。また、本 発明の方法に供される未熟胚のステージ (熟期）は特に限定されるものではなぐ受 粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受粉後 2日以降のもの が好ましい。形質転換後、正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる、 未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未熟胚はインブレッド、インブレッド間の F 1、インブレッドと自然受粉品種間の Fl、巿販 F1品種の未熟胚であることが好ましい 。本明細書において、カルスとは、無秩序に増殖する未分ィ匕状態の細胞塊をいう。力 ルスを得るためには、植物組織の分ィ匕した細胞をオーキシン (例えば、 2, 4-D (2, 4 ージクロロフヱノキシ酢酸)）またはサイトカイニン等の植物成長調節物質を含む培地（ 脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るための処理 を脱分化処理と ヽ、またこの過程を脱分ィ匕過程と ヽぅ。
[0024] 工程 a)にお 、て、必要に応じ、植物組織、未熟胚などを植物体、種子などから取り 出し、形質転換に最適な材料を調製する。また、所望により植物材料をァグロバクテ リウムに感染させる前に培養してもよい。
[0025] 本発明では、工程 a)で植物材料を調製する過程、あるいは調製後、工程 c)でァグ ロバクテリゥムに感染させる前に、植物材料に加圧処理を施すことを特徴とする。
[0026] 工程 b)について
土壌細菌ァグロバタテリゥム（Agrobacterium tumefaciens)が多くの双子葉植 物に根頭癌腫病（crown gall disease)を引き起こすことは古く力も知られており、 1970年代には、 Tiプラスミドが病原性に関与すること、さらに Tiプラスミドの一部であ る T DNAが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後この T DNAには 癌腫の誘発に必要なホルモン (サイトカイニンとオーキシン)の合成に関与する遺伝 子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。 T-D NAの切り出しと植物への伝達には Tiプラスミド上のヴィルレンス領域 (vir領域）に存 在する遺伝子群が必要であり、また T DNAが切り出されるためには T DNAの両 端に存在するボーダー配列が必要である。他のァグロバタテリゥム属細菌である Agr obacterium rhizogenesも Riプラスミドによる同様なシステムを有して 、る（例えば 、特開 2000— 342256図 3び図 4)。
[0027] ァグロバタテリゥムの感染によって T DNAが植物ゲノムに組み込まれるので、 T DNA上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれることが 期待された。し力しながら、 Tiプラスミドは 190kb以上と巨大であるため、標準的な遺 伝子工学手法ではプラスミド上の T DNA上に遺伝子を挿入することは困難であつ た。そのため、 T DNA上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。
[0028] まず、腫瘍性の Tiプラスミドの T DNAからホルモン合成遺伝子が除去されたディ スアーム型の菌系（disarmed strains)である LBA4404 (Hoekema et al. , 1 983)、 C58Cl (pGV3850)、 GV3Til lSEなど力作製された。これらを用いること により、所望の遺伝子をァグロバタテリゥムの Tiプラスミドの T DNA中に、あるいは 所望の遺伝子を有する T DNAをァグロバタテリゥムに導入する 2種類の方法が開 発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で所望の遺伝子の挿入が可能であ り、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、ァグロバクテリウムのデイスアーム型 Tiプ ラスミドの T DNA領域中に、三系交雑法（triparental mating)を介して相同組換 えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる。
[0029] もう一つは、バイナリーベクター（binary vector)法とよばれるもので、 T—DNAの 植物への組み込みに vir領域が必要である力 機能するために同じプラスミド上に存 在する必要はないという結果に基づいている。この vir領域には vir A、 virB、 virC、 vi rD、 virE及び virGが存在し、（植物バイオテクノロジー事典（ェンタプライズ株式会 社発行（1989) ) )、 vir領域とはこの vir A、 virB、 virC、 virD、 virE及び virGの全て を含むものをいう。したがって、バイナリーベクターは、 T DN Aをァグロバタテリゥム と大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをデイス アーム型 Tiプラスミドを有するァグロバタテリゥムに導入して用いる。
[0030] ァグロバタテリゥムへのバイナリーベクターの導入には、エレクト口ポレーシヨン法や 三系交雑法などの、公知の方法により行うことができる。バイナリーベクターには、 pB IN19、 pBI121、 pGA482など力 Sあり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーべク ターが構築され、形質転換に用いられている。また、 Ri プラスミドのシステムにおい ても、同様なベクターが構築され形質転換に用いられて 、る。
[0031] ァグロバタテリゥム A281は、強病原性（super— virulent)の菌系であり、その宿主 範囲は広ぐ形質転換効率も他の菌系より高い。この特性は、 A281が有する Tiブラ スミドの pTiBo542によるものである。 pTiBo542を用いて、これまでに 2つの新しい システムが開発されて 、る。一つは pTiBo542のデイスアーム型の Tiプラスミドを有 する菌系 EHA101および EHA105を用いたものであり、これらを上述のバイナリー ベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の 植物の形質転換に利用されて!、る。
[0032] もう一つは、スーパーバイナリーベクター（'super— binary' vector) (Hiei et al . (1994)； Ishida et al. (1996)； Komari et al. (1999)； WO95/067 22)システムである（例：特開 2000— 342256の図 4)。このシステムは、 vir領域 (vir A、 virB、 virC、 virD、 virE及び virG (以下、これらをぞれぞれ「vir断片領域」という こともある。））を持つディスアーム型の Tiプラスミドおよび T DNAを有するプラスミド 力 なること力 、バイナリーベクターシステムの一種である。しかしながら、 T-DNA を有する側のプラスミド、即ちバイナリーベクターに vir断片領域のうち、少なくとも一 つの vir断片領域を実質的に取除いた vir領域の断片 (このうち好ましくは少なくとも vi rB又は virGを含む断片、さらに好ましくは virB及び virGを含む断片）を組み込んだ スーパーバイナリーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイナリーベクター を有するァグロバタテリゥムに、所望の遺伝子を組み込んだ T DNA領域を導入する には、三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる。
[0033] 本発明の方法においては、宿主となるァグロバタテリゥム属細菌としては、特に限定 されない力、 AgroDacterium tumefaciens (例 は上 ¾bの AgroDacterium tu mefaciens LBA4404 (Hoekema et al. , 1983)および EHA101を好ましく 用!/、ることができる。
[0034] 本発明の方法によれば、ァグロバタテリゥム属細菌における病原性 (vir)領域の遺 伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく有意な効果 を得ることができる。したがって、上述の中間ベクター、バイナリーベクター、強病原 性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなど 、ずれのベクターシステム に対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができる。これらのベクター 類を改変した異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、 ァグロバタテリゥム属細菌の vir領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド 中に組み込む、 vir領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてァ グロパクテリゥムに導入するなど)。また、本発明の方法によれば、野生型のァグロバ クテリゥム属細菌においても、植物へ野生型の T DNA領域の導入効率を高め、事 実上感染効率を向上させることができる。
[0035] 植物に導入しょうとする所望の遺伝子は、上記プラスミドの T DNA領域中の制限 酵素部位に常法により組み込むことができ、当該プラスミドに同時に若しくは別途組 込んだカナマイシン、パロモマイシン等の薬剤に対する耐性を有する遺伝子等の適 当な選択マーカーに基づ 、て選択することができる。大型で多数の制限部位を持つ ものは、通常のサブクローユングの手法では所望の DNAを T DNA領域内に導入 することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には、三系交雑法により、ァ グロバタテリゥム属細菌の細胞内での相同糸且換えを利用することで目的の DNAを導 入することができる。限定されるわけではないが、導入される遺伝子の大きさは好まし くは約 lOObpな!ヽし 200kbpである。
[0036] また、プラスミドを Agrobacterium tumefaciens等のァグロバタテリゥム属細菌に 導入する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法ゃェ レクト口ポレーシヨン法、エレクト口インジェクション法、 PEGなどの化学的な処理によ る方法などが含まれる。
[0037] 植物に導入しょうとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的には T DNAの左 右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界 配列の数は 1つでもよぐ複数の遺伝子を異なる部位に配置しょうとする場合には、 境界配列が 3個以上あってもよい。また、ァグロバタテリゥム属細菌中で、 Tiまたは Ri プラスミド上に配置されてもよぐまたは他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには 、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
[0038] 工程 c)について
ァグロパクテリゥム属細菌を介して遺伝子導入を行う方法は、植物材料をァグロパク テリゥム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、 106 一 1011細 胞 Zml程度の細胞濃度のァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中 に植物材料を 3— 10分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより 行うことができる。
[0039] 好ましくは、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させると同時に、あるいは感染後、 ァグロバタテリゥムを除去する前に、植物材料をァグロバタテリゥムと共存培養させる。 培養用の液は公知の培地を使用できる。例えば、実施例で使用した nN6— As培地、 nNB— As培地、 LS— AS培地あるいはその他、 N6S3— AS培地、 2N6— AS培地（Hi ei et al. 1994)等の培地が知られている。
[0040] 本発明において、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 c)の前又は最中 に、熱処理、遠心処理、超音波処理からなるグループから選択される、少なくとも 1つ の処理を植物材料に行ってもよい。これらの処理も、ァグロバタテリゥム属細菌を介し て植物材料への遺伝子導入する方法にお！ヽて、遺伝子導入の効率を高めることが 知られている。例えば、遠心処理については、例えば、 WO 02/12520,特開 20 00— 342256【こ記載されており、好ましく ίま、 100Gな!ヽし 25万 Gで 1禾少 な!ヽし 4時 間、遠心することで行う。熱処理については、例えば、特開 2000— 342255に記載さ れており、好ましくは、 33°Cないし 60°Cの温度範囲で、 5秒間ないし 24時間の熱処 理を行う。さらに、超音波処理については、例えば、 Trick and Finer 1997, A moah et al. 2001に記載されている。
[0041] これらの加圧、加熱、遠心等の処理はいずれか 1つを行ってもよぐまた複数組み 合わせて行ってもよい。例えば、特開 2000— 342253は、熱処理と遠心処理を組み 合わせて行うことにつ!/、て記載して 、る。
[0042] 工程 d)及び e)について
さらに所望により、形質転換体を得るためには、上記工程 c)に次いで
d)形質転換細胞を選抜する工程;及び
e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
が必要である。即ち、一般に植物の形質転換を行うためには、植物細胞に外来遺伝 子を導入した後に、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれた植物細胞を選抜 することが必要である。
[0043] 形質転換された細胞を選抜する工程は、表現型のデータ及び物理的データの少な くとも一つ、好ましくは両方が目的の形質を有する細胞を選択する、ことを意味する。
[0044] 表現型のデータは、例えば、形質転換効率は植物への導入を所望する遺伝子と共 に、マーカー遺伝子および Zまたは選抜マーカー遺伝子を導入してその発現を評 価することで行うことで得ることができる。マーカー遺伝子および Zまたは選抜マーカ 一遺伝子としては、例えば、 GUS ( |8—ダルク口ニダーゼ)遺伝子を用いたり、抗生物 質耐性遺伝子 (例えば、 PPT (フォスフィノスライシン)耐性遺伝子、カナマイシン耐性 遺伝子)などを用いることができる。マーカー遺伝子として GUS遺伝子を用いた場合 、形質転換効率の評価は X— gulc (5—ブロモー 4 クロ口— 3—インドリル β— D—グル クロン酸)の GUSによる切断に伴う発色力 評価することができる。選抜マーカー遺 伝子として抗生物質耐性遺伝子を用いた場合には、形質転換した後、抗生物質を加 えた選抜培地上での成長の度合いから評価することができる。
[0045] さらに、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれたことを確認するためには、サ ザンブロット等の物理的データを得ることが好ましい。より好ましくは、有性生殖による 子孫への伝達、並びに子孫集団への遺伝的および分子的分析に基づく選抜、のェ 程を行ってもよい。
[0046] 所望により選抜された形質転換体の再分化を行い、再分化個体を生育させ、そし て完全な植物体を得てもよ!ヽ。選抜した形質転換細胞から完全な植物体を再生する には、公知の方法（例えば、 Hiei et al. 1994, Ishida et al. 1996)により行 うことができる。
[0047] 本発明の方法は、加圧処理を行わない場合と比較して、遺伝子導入効率及び Z又 は形質転換効率を向上させる。遺伝子導入効率は、例えば、導入した遺伝子の一過 性の発現の範囲を調査することによって評価できる。後述の実施例では、未熟胚の 胚盤での GUS遺伝子の一過性の発現を 1 (スポット状の発現が散見）一 5 (胚盤の全 面で発現)の 5段階の指数で評価した。あるいは、全体の発現量が低い場合には全 てのスポット数を数えることにより評価することもできる。
[0048] 形質転換効率は、例えば、接種した未熟胚から得られた再分化植物のうち GUS遺 伝子の発現を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数 で除することによって算出した。あるいは、再分化植物のうち選抜圧にたいし抵抗性 を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数で除すること により算出することもできる。
[0049] 本発明はまた、形質転換植物を生産するための方法を提供する。本発明の方法は
1)植物材料を加圧処理し、
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させ
3)形質転換細胞を選抜し、そして
4)所望により選抜された形質転換体を再分化する
二とを含む。
9)
[0050] 本発明は、従来のァグロパクテリゥム法よりも高い効率で遺伝子導入のなされる安 価で簡便な方法を開発する。また、従来のァグロパクテリゥム法では遺伝子導入が困 難とされていた植物種及び品種にも適応できる方法を提供する。本発明の方法は、 加圧処理を行わな!ヽ場合と比較して、遺伝子導入効率及び Z又は形質転換効率を 向上させる。
[0051] 図 1に示したように、単子葉植物であるイネにおいて加圧処理を行うことにより、未 処理の場合と比較して遺伝子導入効率は 2倍ないし 3倍に向上した。また、図 3に示 したように、双子葉植物であるタバコにおいて、加圧処理を行うことにより、未処理の 場合と比較して遺伝子導入効率は 3倍ないし 4倍に向上した。よって、本発明の方法 を使用することによって、好ましくは遺伝子導入効率が実質的に向上するが、より好 ましくは、 2倍以上向上する。さらに形質転換効率は、表 1に示されたようにイネにお いて、加圧処理を行うことにより、未処理の場合と比較して 3倍ないし 9倍に上昇した 。よって、本発明の方法を使用することによって、好ましくは形質転換効率が実質的 に向上するが、より好ましくは、 3倍以上向上する。
図面の簡単な説明
[0052] [図 1]図 1は、気体中での加圧処理の遺伝子導入効率に及ぼす効果 (イネ、品種：ゆ きひかり）を示す。 control:前処理なし pres. w/o water: 気体中 + 5. 7 atm , 5分間加圧処理 pres. in water: 蒸留水中 + 6. 6 atm, 5分間加圧処理 各処理後、 LBA4404 (pSB134)を接種、 7日間共存培養を行った後、 GUS分析 した。
[図 2]図 2は、加圧処理の遺伝子導入に及ぼす効果（トウモロコシ)を示す。 A:前処理 なし (対照）、 B: 15, 000 rpm、 10分間遠心処理、 C : + 3. 2 atm、 10分間加 圧処理、 D: +6. 6 atm, 5分間加圧処理各処理後、 LBA4404 (pSB131)を 接種、 3日間共存培養を行った後、 GUS分析した。
[図 3]図 3は、加圧処理の遺伝子導入効率に及ぼす効果 (タバコ、品種:プチハバナ SR1)を示す。 control:前処理なし、 pressure : +6. 6 atm, 5分間加圧処理各 処理後、 LBA4404 (pSB134)を接種、 4日間共存培養を行った後、 GUS分析し た。
実施例
[0053] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力 これらは本発明の技術的範 囲を限定するためのものではな 、。当業者は本明細書の記載に基づ 、て容易に本 発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
[0054] 実施例 1 イネ形皙転椽に及ぼす加圧の効果
(1)加圧処理
5mlのデイスポーザブル注射器の先端に先を過熱しつぶしたマイクロピペットのチッ プを差込み適当な長さで切り落とした後、ノ ラフイルムで先端を覆った。注射器にァ グロバタテリゥム懸濁用液体培地 (AA主要無機塩、 LS微量無機塩、 MSビタミン、 A Aアミノ酸、 0. 2gZlカザミノ酸、 4gZlシユークロース、 2gZlグルコース、 ρΗ 5. 2) あるいは滅菌蒸留水 3mlを入れ、その中に無菌的に採取した未熟胚（品種：コシヒ力 リ、朝の光)を入れた。また、培地や蒸留水などの液体を入れない注射器に採取した 未熟胚（品種：ゆきひかり）を入れた。注射器を組み合わせ、クランプで注射器をはさ み、クランプを狭めることにより注射器内の圧を高めた。加圧したまま室温で静置した 。加圧の強度は注射器内の空気の体積の減少率力 算出した。対照はほぼ同数の 未熟胚を液体培地あるいは滅菌蒸留水を入れた 2mlエツペンドルフチューブに採取 し、室温で静置した。
[0055] (2)接糠
ァグロバクテリウムの菌系及びァグロバタテリゥムプラスミドベクターには、 Agrobacte rium tumefaciensスーパーバイナリーベクター LBA4404 (pSB134) (T— DNA 領域に、トウモロコシュビキチンプロモーターでドライブされたュビキチンイントロンを 結合した HPT遺伝子およびカリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーターでドライブ されたヒマカタラーゼイントロンを結合した GUS遺伝子を有する）を用いた。 pSB134 の作成は、 PKY205 (Komori et al. WO03/027290)に発現マーカーとして ρ SB32由来の 35S— intron GUS— nos断片を Hindlll部位に挿入することによって 行った。
[0056] 注射器をクランプカゝら外し、注射器内の未熟胚を液体培地の入った 2mlエツベンド ルフチューブに移した。 50mgZレヽィグロマイシンおよび 50mgZlスぺクチノマイシ ンを含む AB培地上で 3— 4日間培養した、 LBA4404 (pSB134)を白金耳でかきと り、約 109cfuZmlの濃度で 100 μ Μァセトシリンゴンを含む液体培地 lmlに懸濁し た。液体培地を除!、たエツペンドルフチューブにァグロバタテリゥム懸濁液 lmlをカロ え、 30秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、室温で 5分間静置した。未熟胚を nN6— As培地（N6無機塩、 N6ビタミン、 0. 5g/l カザミノ酸、 0. 5g/l L—プロリン、 lm g/1 2, 4— D、 0. 5mg/l NAA、 0. lmg/1 6BA、 20g/l シユークロース、 10 g/1 グルコース、 10 Μ AgNO 、 100 Μ ァセトシリンゴン、 8gZl ァガロー
3
ス、 pH 5. 2)あるいは nNB— As培地（N6主要無機塩、 B5微量無機塩、 B5ビタミン 、 0. 5gZlカザミノ酸、 0. 5g/l L—プロリン、 2mg/l 2, 4— D、 lmg/1 NAA、 1 mg/1 6BA、 20g/l シユークロース、 lOgZl グルコース、 100 μ Μ ァセトシリン ゴン、 8gZl ァガロース、 pH 5. 2)に置床し、暗黒下、 25°Cで 1週間培養した。
[0057] (3)碰、 分化
共存培養後の未熟胚をメスで 4一 6分割し、 nN6CC培地 (N6無機塩、 N6ビタミン、 0. 5gZlカザミノ酸、 0. 5g/l L—プロリン、 lmg/1 2, 4— D、 0. 5mg/l NAA、 0. lmg/1 6BA、 20g/l シユークロース、 55g/l ソルビ卜ール、 250mg/l セ フォタキシム、 250mgZl カルべ-シリン、 5g/l ゲルライト、 pH 5. 8)あるいは N BK4CC (NBK4主要無機塩、 B5微量無機塩、 B5ビタミン、 AAアミノ酸、 0. 5g/l カザミノ酸、 0. 5 g/1 L—プロリン、 lmg/1 2, 4— D、 0. 5mg/l NAA、 0. Img /1 6BA、 20g/l マルトース、 55g/l ソルビトール、 250mg/l セフオタキシム ゝ 250mg/l カルべ-シリン、 5g/l ゲルライ卜、 pH 5. 8)に置床した。
[0058] 照明下 28°Cで 1週間培養後、カルスを 5分割し、ハイグロマイシン 50mgZlを含む nN6CC培地あるいは NBK4CC培地に置床し、同条件で 10日間培養した。増殖し た細胞塊をハイグロマイシン 50mgZlを含む再分ィ匕培地 (N6無機塩、 N6ビタミン、 AAアミノ酸、 lg/1 カザミノ酸、 0. 5mg/l 力イネチン、 20g/l シユークロース、 3 Og/1 ソルビトール、 4gZl ゲルライト、 pH 5. 8)あるいは（ΝΒΚ4主要無機塩、 Β 5微量無機塩、 Β5ビタミン、 ΑΑアミノ酸、 lg/1 カザミノ酸、 2mg/l 力イネチン、 2 Og/1 マルトース、 30g/l ソルビトール、 5g/l ゲルライ卜、 pH 5. 8)に置床し、 同条件で約 2週間培養した。
(4) GUSアツセィ
共存培養後の未熟胚および再分ィ匕個体力も切り取った葉片を 0. 1%の Triton X —100を含む 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH 6. 8)に浸漬し、 37°Cで 1時間静置した。リン 酸緩衝液でァグロバタテリゥムを除去した後、 1. OmM 5—ブロモー 4—クロ口— 3 イン ドリル β D—グルクロン酸 (X— glue)および 20%メタノールを含むリン酸緩衝液を 添加した。 37°Cで 24時間処理した後、青色を呈する組織を顕微鏡下で観察した。
[0059] (5)形皙転椽効率の箄出
形質転換効率の算出は、具体的には以下のように行った。
[0060] ァグロバタテリゥムを接種したイネ未熟胚では、胚盤の広い範囲で GUS遺伝子の 一過性の発現を示すスポットが観察される。 1つの胚盤でも離れた部位で観察される スポットは個々に遺伝子導入のなされた独立の形質転換細胞に由来するものである と考えられる。共存培養後およびレスティング培養後に増殖した未熟胚を 4から 6の塊 に分割した場合、由来は 1つの未熟胚であっても分割して得られた 20— 30の細胞塊 力 ハイグロマイシン存在下で増殖してきたカルスおよびその再分化植物はそれぞ れ独立の形質転換体であると考えられる。
[0061] 分割して得られた細胞塊カゝら増殖したノヽィグロマイシン抵抗性カルスを 1細胞塊か ら 1カルス選び、ハイグロマイシンを含む再分ィ匕培地に置床した。そこ力 得られた再 分化植物のうち GUS遺伝子の発現を示したものを形質転換体として数え、その総数 を接種した未熟胚の数で除し、形質転換効率を算出した。
[0062] (6)加 ffi強度の遣伝子 人効率に ぼす効菜
採取したコシヒカリ未熟胚を液体培地の入った注射器に入れ、 0 (常圧）， 0. 6, 1. 4, 3. 2、 6. 6atmの圧をそれぞれ 15分間加えた後、ァグロバタテリゥム懸濁液に浸 漬した。共存培地上で 1週間培養した後、 GUS遺伝子の一過性の発現を調査した。 常圧で処理した対照の未熟胚では胚盤の約半分が青色に染色される未熟胚も散見 されたが、多くのものは胚盤表面にスポット状の発現を示した。 0. 6atmの強度でカロ 圧した未熟胚は対照の未熟胚と同様の発現様式を示した。これに対し、 1. 4atmの 強度で加圧した未熟胚の約半数は胚盤の約半分が青色に染色された。さらに 3. 2 および 6. 6atmの強度で加圧した未熟胚はほとんどのものが胚盤の全面が青色に染 色され、遺伝子導入効率が著しく向上して!/、ることが示された。
[0063] (7)加圧時間の遺伝子導人効率に及ぼす効果 採取したコシヒカリ未熟胚を液体培地の入った注射器に入れ、 +6. 6atmの圧を 0 、 1、 3、 5又は 60秒間加えた後、ァグロバタテリゥム懸濁液に浸漬した。共存培地上 で 1週間培養した後、 GUS遺伝子の一過性の発現を調査した。 0秒 (常圧)で処理し た対照の未熟胚は胚盤表面にスポット状の発現を示した。これに対し、 +6. 6atmの 強度で 1秒間加圧した未熟胚はそのほとんどが胚盤の全面での一過性の遺伝子発 現を示した。 3秒間以上加圧した未熟胚においても 1秒間と同様の発現様式を示し、 極めて短時間の加圧処理でも遺伝子導入効率を著しく向上させる効果のあることが 示された。
[0064] 18}ァグロバタテリ ム _ ^存 .非共存下での加圧処理の形質転換効率の及ぼす効 採取したコシヒカリ未熟胚を滅菌蒸留水、液体培地及びァグロバタテリゥム LBA440 4 (pSB134)菌を約 lx 109cfu/mlで懸濁したァセトシリンゴン 100 μ Μを含む液 体培地の入った注射器にそれぞれ入れ、 +6. 6atmの強度で 15分間加圧した。ァ グロパクテリゥム懸濁液中で加圧した未熟胚は、加圧後、共存培地に置床した。滅菌 蒸留水及び液体培地中で加圧した未熟胚は加圧後、ァグロパクテリゥム懸濁液に浸 漬した後、共存培地に置床した。 1週間共存培養した未熟胚の GUS遺伝子の一過 性の発現を調査した。加圧処理をしな!、対照の未熟胚は一部の未熟胚で胚盤の約 半分が青色を呈したが、ほとんどの未熟胚はスポット状の発現を示した。これに対し、 加圧処理した未熟胚では、ァグロバタテリゥムと共存させる、させないに関わらず分析 に供した未熟胚の全てが胚盤全面で GUS遺伝子の発現を示した。滅菌蒸留水、液 体培地の間にも差は見られなカゝつた。
[0065] 滅菌蒸留水中で加圧した未熟胚およびァグロパクテリゥムとの共存下で加圧した未 熟胚をハイグロマイシンを含む培地で培養し、形質転換植物の選抜、再分化を行つ た。滅菌蒸留水中で加圧した後に、ァグロパクテリゥムを接種した未熟胚 12個からは 、ノ、イダロマイシン抵抗性かつ GUS陽性の形質転鎌物は 63系統得られた。形質 転換効率は 525%であった。一方、ァグロバタテリゥム懸濁液中で加圧処理した未熟 胚 12個からは 54系統の形質転換植物が得られ、効率は 450%であった。
[0066] ァグロバタテリゥムと共存させずに加圧した方がァグロバタテリゥム共存下で加圧し たときよりも形質転換効率が高かったことから、本法でみられた加圧処理による遺伝 子導入効率向上の効果は加圧による植物組織へのァグロバタテリゥムの浸透の促進 によるものではないことが明ら力となった。すなわち本願発明は Teasdale et al. (WO 99/48335)の述べた機作とは全く別の働きにより遺伝子導入効率を高める ちのであることが示された。
[0067] (9)気体中での加圧処理の遣伝子導入効率に及ぼす効果
採取したゆきひカゝり未熟胚を液体を入れない注射器及び滅菌蒸留水を入れた注射 器にそれぞれ入れた。液体を入れない注射器は + 5. 7atmの強度で 5分間加圧した 。滅菌蒸留水を入れた注射器は + 6. 6atmの強度で 5分間加圧した。加圧した未熟 胚を常圧に戻した後、ァグロパクテリゥム懸濁液に浸漬し、共存培地に置床した。対 照の未熟胚は滅菌水中で常圧で 5分間静置後、ァグロパクテリゥム懸濁液に浸漬し、 共存培地に置床した。 1週間共存培養した未熟胚の胚盤での GUS遺伝子の一過性 の発現を 1 (スポット状の発現が散見）一 5 (胚盤の全面で発現)の 5段階の指数で調 查した。気体中で加圧した未熟胚での発現は蒸留水中で加圧した未熟胚に比べや や劣ったが、無処理の対照の未熟胚に比べ明らかに広範囲な発現を示した（図 1)。
[0068] このように、加圧による遺伝子導入効率向上の効果はァグロバタテリゥム接種前の 植物組織を液体中で加圧した場合だけでなぐ気体中で加圧した場合にも同様にみ られることが明ら力となった。
[0069] ( 10)加 ffi処理の形皙転橼効率に及ぼす効菜
採取した未熟胚（品種:コシヒカリ、朝の光）を液体培地の入った注射器に入れ、 + 6. 6atmの圧を 15分間加えた後、ァグロバタテリゥム懸濁液に浸漬した。共存培地 上で 1週間培養した後、ハイグロマイシンを含む培地で培養し、形質転換植物の選 抜、再分ィ匕を行った。再分ィ匕したハイグロマイシン抵抗性植物の葉の一部を切り取り GUS分析を行った。結果を表 1に示す。
[0070] [表 1] 表 l 加圧処理の形質転換効率に及ぼす効果 （イネ、 品種：コシヒカリ、 朝の光）
HmR, 形質転換効率 ロロ 試験 処理 未熟胚数（A) GUS+植物数（B) (B/A) (%) コシヒカリ I 無処理 12 7 58.3
加圧 12 66 550.0 コシヒカリ II 無処理 12 17 141.7
加圧 12 60 500.0 コシヒカリ III 無処理 12 13 108.3
加圧 12 42 350.0 朝の光 I 無処理 12 40 333.3
加圧 12 119 991.7
HmR, GUS+：ハイグロマイシン抵抗性、 GUS陽性 加圧処理した未熟胚は無処理の未熟胚の 3倍から 9倍以上の形質転換効率を示し 、加圧処理が形質転換効率の向上に極めて効果のあることが明らかとなった。
¾施例 2 トウモロコシ形皙転橼に及ぼす加 ffiの効
大きさ約 1. 2mmのトウモロコシ未熟胚（品種: A188)を無菌的に取り出し、ァグロ バタテリゥム懸濁用液体培地 (LS— inf, Ishida et al. 1996)に浸漬した。加圧処 理は液体培地を入れた注射器に未熟胚を入れ、注射器を挟んだクランプの幅を狭 めることにより行った。加圧の強度は + 6. 6atm、 5分間あるいは + 3. 2atm、 10分 間で行った。遠心処理は液体培地を入れたエツペンドルフチューブに未熟胚を入れ 、遠心機で 15, OOOrpm、 4°C、 10分間遠心分離した。加圧あるいは遠心処理した 未熟胚を、 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB131)菌株（Ishida e t al. 1996)を約 lxl09cfu/mlで懸濁したァセトシリンゴン 100 /z Mを含む LS— i nf培地に浸漬後、 LS— AS共存培地に置床した。 25°C、暗黒下で 3日間培養後、 G US分析を行った。対照の未熟胚は採取後、液体培地に浸漬した後、同方法により ァグロバタテリゥムを接種した。
対照の未熟胚は胚盤表面に青色のスポット状に GUS遺伝子の一過性の発現を示 した。加圧処理あるいは遠心処理した後、ァグロバタテリゥムを接種した未熟胚では 胚盤の約 1Z3が全て青色に染色されるエリア状の発現を示した。特に + 3. 2atm、 10分間加圧した未熟胚では胚盤の全面で GUS遺伝子の発現を示すものが複数み られた（図 2)。ァグロバタテリゥム接種前の植物組織に遠心処理を行うことにより形質 転換効率の高まることは既に報告されている（Hiei et al. , WO02Zl 2520)。 [0072] これらのこと力 加圧処理はイネだけでなく他の単子葉植物のトウモロコシにおいて も遺伝子導入効率を向上させる働きのあること、そしてその効果は既報の遠心処理と 同等かそれ以上であることが明ら力となった。
[0073] 実施例 3 タバコ形皙転椽に及ぼす加圧の効果
タバコ（品種:プチハバナ SR1)の展開葉を常法により滅菌した後、約 lcm角の葉 片とした。対照の葉片は Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB134)を 懸濁した LS— R培地 (Komari, 1990)に浸漬し、 25°Cで 15分間緩やかに振盪した 後、 LS— R培地に浸漬し、 25°C、暗黒下で 4日間培養した。加圧区の葉片は LS— R 培地を入れた注射器内で +6. 6atm、 15分間加圧した後、対照の葉片と同様の方 法でァグロパクテリゥムを接種し、培養した。共存培養後の葉片を GUS分析した。
[0074] GUS分析後の各葉片の示す GUS遺伝子の発現部位の大きさにより、 0 (無発現） から 3 (葉片全体で発現)の 4段階の指数で調査した。結果を図 3に示す。対照の葉 片では葉の切断部分で GUS発現を示す葉片が多くみられ、切断部より内部の広い 範囲で発現を示す葉片はほとんどみられな力つた。これに対し、加圧処理後ァグロバ クテリゥムを接種した葉片では、ほとんどの葉片が切断部および内部の広 、範囲で 濃い青色を呈し、広範に遺伝子導入のなされていることが示された。このことから、加 圧処理はイネ、トウモロコシなどの単子葉植物だけでなぐ双子葉植物においても遺 伝子導入効率を高める効果のあることが明らかとなった。
[0075] u 加 処理のカルス谐 に及ぼす効菜
採取したコシヒカリ未熟胚をァグロバタテリゥム懸濁用液体培地中で + 6. 6atmの 強度で 15分間加圧した後、 NBK4CC培地に置床した。対照の未熟胚は常圧下で 同液体培地に浸漬後、 NBK4CC培地に置床した。 25°C、暗黒下で 1週間培養後 1 0個の未熟胚の生重を測定した。試験は 5反復で行った。ァグロパクテリゥムの接種 は両区とも行わなかった。結果を表 2に示す。
[0076] [表 2] 表 2 加圧処理の細胞増殖に及ぼす効果 （イネ、 品種： コシヒカリ）
未熟胚の生重 （mg 10未熟胚）
処理 反復 1 反復 2 反復 3 反復 4 反復 5 平均 ±標準誤差 ffi処理 69.2 68.5 63.6 71.5 58.5 66.3 ±2,3 加圧 73.1 74.0 77.2 73.2 78.1 75.1 ± 1.1 加圧処理後 1週間培養した未熟胚の生重を調査した。
ァグロパクテリゥムの接種は行っていない。 対照の未熟胚を 1週間培養したときの平均生重は 66. 3mgZlO未熟胚であった。 加圧処理した後、同期間培養した未熟胚では 75. lmgZlO未熟胚であり、有意な 差が認められた。 1週間培養した対照の未熟胚は胚盤表面がややカルス化し、淡い 黄白色を呈した。これに対し、加圧処理した未熟胚ではコブ状のカルス化がみられ、 対照よりも濃い黄白色を示した。肉眼での観察にお 、ても加圧処理した未熟胚の方 がより旺盛に増殖していることが認められた。このように加圧処理は遺伝子導入効率 を向上させるだけでなぐ細胞の増殖を活発にする働きのあることが明らかとなった。 本発明の効果のひとつである高圧力の短時間処理による植物組織の細胞増殖率 の向上は、 +0. 5atmという低い圧力を 1—10週間加えた状態で培養することにより ェンブリオジェニックなカルスの形成率を高めるという米国特許第 6, 492, 174号の 方法とは、処理条件が異なるだけでなぐ処理の結果として得られる効果も異なること から、別の機作によるのものであると考えられる。

Claims

請求の範囲
[I] ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、
1)植物材料を加圧処理し、次いで
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる
ことを含む、前記方法。
[2] 加圧処理が、 1. 7気圧ないし 10気圧の範囲で行われる、請求項 1に記載の方法。
[3] 加圧処理が、 2. 4気圧ないし 8気圧の範囲で行われる、請求項 2に記載の方法。
[4] 加圧処理が、 0. 1秒間ないし 4時間行われる、請求項 1ないし 3のいずれ力 1項に 記載の方法。
[5] 加圧処理が、 1秒間ないし 30分間行われる、請求項 4に記載の方法。
[6] 加圧処理が、液体中又は気体中のいずれかで行われる、請求項 1ないし 5のいず れか 1項に記載の方法。
[7] 植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)の前又は最中に、熱処理、遠心 処理、超音波処理からなるグループから選択される、少なくとも 1の処理を植物材料 に行うことをさらに含む、請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法。
[8] 植物材料が単子葉植物である、請求項 1な!、し 7の 、ずれか 1項に記載の方法。
[9] 植物材料がイネ又はトウモロコシである、請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の 方法。
[10] 植物材料が双子葉植物である、請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の方法。
[II] 植物材料がタバコである、請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の方法。
[12] 植物材料が未熟胚である、請求項 1ないし 11のいずれか 1項に記載の方法。
[13] 植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)に次いで、さらに、
3)形質転換体を選抜し、そして
4)所望により選抜された形質転換株を再分化する
工程を含む、請求項 1ないし 12に記載の方法。
[14] 工程 1)の加圧処理を行わない場合と比較して、遺伝子導入効率が向上する、請求 項 1な!、し 13の!、ずれか 1項に記載の方法。
[15] 1)植物材料を加圧処理し、 2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させ
3)形質転換細胞を選抜し、そして
4)所望により選抜された形質転換体を再分化する ことを含む、形質転,物を生産するための方法。
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