JP3329819B2

JP3329819B2 - 未熟胚の胚盤を用いた単子葉植物の形質転換方法

Info

Publication number: JP3329819B2
Application number: JP50803795A
Authority: JP
Inventors: 秀章斎藤; 祐二石田; 祐弘樋江井; 敏彦小鞠
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 2002-09-30
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: DE69433809D1; EP0672752B1; CA2148499C; AU687863B2; EP0672752A1; DE69433809T2; DK0672752T3; CA2148499A1; ES2220913T3; US7939328B1; WO1995006722A1; PT672752E; EP0672752A4; ATE267870T1; AU7546094A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、単子葉植物の形質転換方法に関する。

背景技術単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレ
クトロポレーション法、ポリエチレングリコール法（PE
G法）、パーティクルガン法その他が知られている。

エレクトロポレーション法は、プロトプラストと目的
のDNAを混合し、電気刺激で細胞膜に穴を開けることに
よりDNAを細胞内に導入し形質転換を図る方法である。
この方法で種々の遺伝子が単子葉植物、特にイネに導入
されている（Toriyama K.et al.,1988;Biotech.6:1072
−1074,Shimamoto K.et al.,1989;Nature 338:274−27
6,Rhodes C.A.et al.,1988;Science 240:204−207）。
しかしながら、この方法は、１）プロトプラストからの
個体再生系が確立されている植物種のみに適応可能であ
る、２）プロトプラストから個体再生までには数カ月を
要するので、形質転換体を得るのに時間がかかる、３）
培養期間が長期化するので、それに伴う培養変異の頻度
が高くなり、正常な形質転換体を得る頻度が低くなる、
という問題点を有する。

PEG法は、目的遺伝子とプロトプラストとを混合し、P
EGで処理することによって遺伝子の導入を図る方法であ
り、エレクトロポレーション法とは電気刺激がPEGに変
わった点で異なる。導入効率はエレクトロポレーション
法よりはいくぶん低いと考えられる。この方法で形質転
換体を得た報告はあるものの、広く用いられているとは
言い難い。プロトプラストを用いるため、エレクトロポ
レーション法と同様な問題点を持つ（Zhang W.et al.,1
988;Theor.Appl.Genet.76:835−840,Datta S.K.et al.,
1990;Biotech.8:736−740）。

また最近、弱い酵素処理をしたトウモロコシ未熟胚お
よびカルスに電気刺激によって遺伝子を導入する方法が
報告された（Ｄ′Halluin K.et al.,1992;Plant Cell
4:1495−1505）。導入された遺伝子の存在は再分化植物
体においても確認されている。しかし、まだこの方法で
の形質転換の成功例は一報のみである。

パーティクルガン法は、目的の遺伝子を微細な金属粒
子に付着させ、金属粒子を高速で細胞あるいは組織に撃
ち込むことによって形質転換を行わせる方法である。従
って、原理的にはあらゆる組織を対象に形質転換を行な
うことができ、特にプロトプラストからの再生系が確立
されていない植物種に有効であるとされている。

今までにトウモロコシではタイプIIカルス（Armstron
g C.L.and Green C.E.,1985;Planta 164:207−214）を
材料にパーティクルガン法により形質転換を行ない、そ
こから正常な稔性を有する形質転換体を得た報告がいく
つかある（Gordon−Kamm W.J.et al.,1990;Plant Cell
2:603−618,Fromm M.E.et al.,1990;Biotech.8:833−83
9,Walters D.A.et al.,1992;Plant Mol.Biol.18:189−2
00 Vain P.et al.,1993;Plant Cell Rep.12:84−88）。
しかし、これらの報告のほとんどは、培養容易性の品種
を材料として使用しており、まだ、あらゆる品種に適用
できる技術には至っていない。

Vasilらはパーティクルガンによってコムギのエンブ
リオジェニックカルスにバスタ、ビアラフォス等の除草
剤の主成分であるホスフィノスリシンをアセチル化する
bar遺伝子（Thompson,C.J.et al.,1987;EMBO J.6:2519
−2523）とGUS遺伝子を導入し、バスタ抵抗性のカルス
および再生植物体を得た。これらのカルスおよび再生植
物体における、導入遺伝子の産物である酵素の活性を確
認し、またbar遺伝子が存在することをサザン分析で確
認した（Vasil V.et al.,1992;Biotech.10:667−67
4）。

Liらはパーティクルガンによってイネの未熟胚および
エンブリオジェニックカルスにハイグロマイシン抵抗性
遺伝子を導入後、選抜を行ない、ハイグロマイシン抵抗
性再生植物体を得た。この植物体でのハイグロマイシン
抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で確認した。この後代
の種子のハイグロマイシン抵抗性は3:1の分離が見られ
た（Li L.et al.,1993;Plant Cell Rep.12:250−25
5）。

Christouらはパーティクルガンによってイネの未熟胚
にbar、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子およびGUS遺伝子
を導入し、ハイグロマイシンまたはビアラフォスに抵抗
性でGUS活性を示す植物体を得て、導入遺伝子の存在を
サザン分析によって確認した（Christou P.et al.,199
1;Biotech.9:957−962）。

Kozielらはパーティクルガンによってトウモロコシ未
熟胚にbar遺伝子とBt毒素合成遺伝子を導入し、ホスフ
ィノスリシン抵抗性植物体を得た。この植物体はBr毒素
蛋白の合成と、サザン分析により導入遺伝子の存在が確
認された（Koziel M.G.et al.,1993;Biotech.11:194−2
00）。

その他の方法としては、１）種子、胚とDNAの共存培
養（Topfer R.et al.,1989;Plant Cell 1:133−139,Led
oux L.et al.,1974;Nature 249:17−21）、２）花粉管
への処理（Luo and Wu 1988;Plant Mol.Biol.Rep.6:165
−13）リポソーム法（Caboche M.1990;Physiol.Plant.7
9:173−176,Gad A.E.et al.,1987;Theor.Appl.Genet.7
5:30−36）があるが、形質転換の効率、再現性、あるい
は汎用性に関して問題があり、一般的な方法とは言い難
い。

一方、アグロバクテリウム属細菌のTiプラスミドをベ
クターとして用いた遺伝子導入法は、タバコ、ペチュニ
ア、ナタネ等の双子葉作物の形質転換法として普遍的に
用いられている。しかしながら、アグロバクテリウム属
細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には
寄生しないとされている（De Cleene M.1976;Bot.Rev.4
2:389−466）。

アグロバクテリウムによる単子葉植物の形質転換に関
してはアスパラガス（Bytebier B.et al.,1987;Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA.84:5345−5349）、そしてヤム（Diosc
orea bulbifera）（Schaferw,et al.,1987;Nature 327:
529−532）で報告されているが、その他の単子葉植物、
特にイネ科作物にはこの方法を適用できないとされてい
る（Potrykus I.1990;Biotechnology 8:535−543）。

GrimsleyらはアグロバクテリウムのＴ−DNAの中にト
ウモロコシストリークウイルス（Maize streak virus）
のDNAを挿入したものをトウモロコシ生長点に接種した
ところ、トウモロコシストリークウイルスの感染を確認
したことを報告している。トウモロコシストリークウイ
ルスのDNAを接種しただけではこのような感染症状が認
められないことから、上の観察はアグロバクテリウムが
トウモロコシにDNAを導入することができることを示す
ものと解釈している（Grimsley et al.,1987;Nature 32
5:177−179）。しかし、ウイルスは核ゲノムに組み込ま
れなくても増殖する可能性があるので、この結果はＴ−
DNAが核に組み込まれたことを示すものではない。その
後、感染効率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種した
ときが最も高く（Grimsley et al.,1988;Biotech.6:185
−189）、感染にはアグロバクテリウムのプラスミドのv
irC遺伝子が必須であることを示した（Grimsley et a
l.,1989;Mol.Gen.Genet.217:309−316）。

Gouldらはトウモロコシの生長点に針で傷をつけた後
カナマイシン抵抗性遺伝子とGUS遺伝子を持った強病原
性アグロバクテリウムEHA1を接種し、処理後の生長点を
カナマイシンで選抜したところ、抵抗性を示す植物体を
得た。この後代の種子が導入した遺伝子を持つことを確
認するためサザン分析を行ったところ、一部の種子で導
入遺伝子が確認された（Gould J.et al.,1991;Plant Ph
ysiol.95:426−434）。このことはアグロバクテリウム
処理された生長点からカナマイシン選抜により得られた
植物体には形質転換細胞と非形質転換細胞が混在してい
たことを示す（キメラ現象）。

Mooneyらは、アグロバクテリウムを用いて小麦の胚に
カナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試みた。まず、胚を
酵素で処理し、細胞壁に傷をつける処理をし、その後ア
グロバクテリウムを接種した。処理したカルスのうち極
めて少数のカナマイシン抵抗性と思われるカルスが増殖
したが、このカルスから植物体の再生はできなかった。
また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存在をサザン分析で
確認したところ、全ての抵抗性カルスで導入遺伝子の構
造変異がみられた（Mooney P.A.et al.,1991;Plant Cel
l,Tissue,Organ Culture 25:209−218）。

Raineriらはイネの胚盤に傷をつけた後、強病原性の
アグロバクテリウムA281（pTiBo542）をイネの８品種に
処理したところ、日本晴、藤坂５号の２品種で腫瘍状の
組織の増殖がみられた。さらに、Ｔ−DNAからホルモン
合成遺伝子を除いたTiプラスミドにカナマイシン抵抗性
遺伝子とGUS遺伝子を挿入したプラスミドを持つアグロ
バクテリウムをイネの胚に接種したところカナマイシン
抵抗性カルスの増殖がみられた。この抵抗性カルスでは
GUS遺伝子の発現が認められたが、形質転換植物を得る
ことはできなかった。これらのことから、アグロバクテ
リウムのＴ−DNAがイネの細胞に導入されたと解釈して
いる（Raineri et al.,1990;Biotech.8:33−38）。

このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科
の作物でもアグロバクテリウムによる遺伝子導入が可能
であることを示唆する研究報告が現れてきているが、何
れも再現性に問題があるほか、導入した遺伝子の確認に
ついても不完全で、説得できる結果が示されていなかっ
た（Potrykus I.1990;Biotech.8:535−543）。

Chanらは2,4−Ｄ共存下で２日間培養したイネ未熟胚
に付傷後、ジャガイモ懸濁培養細胞を含む培地中でnpt
II遺伝子とGUS遺伝子を持ったアグロバクテリウムを接
種した。処理した未熟胚をG418添加培地上で培養したと
ころ誘導されたカルスから再分化植物体が得られた。再
分化植物体およびその後代の植物体でのGUS遺伝子の所
在をサザン分析で確認したところ、再分化当代、後代い
ずれの植物体でも導入遺伝子の存在が認められたことを
報告している（Chan M.T.et al.,1993;Plant Mol.Biol.
22:491−506）。この結果は、アグロバクテリウムによ
るイネの形質転換を支持するものであるが、形質転換効
率は1.6％と非常に低く、供試した未熟胚数250に対し、
正常な生長を示した再生植物体は１個体に過ぎなかっ
た。イネの未塾胚を摘出するには多大な労力を要するた
め、このように低い形質転換効率では実用的なレベルに
あるとは言い難い。

発明の開示上述のように、イネ科作物における遺伝子導入法は、
エレクトロポレーション法およびパーティクルガン法が
主流である。エレクトロポレーション法の場合、プロト
プラストを用いるため、再生植物を得るまで長期間を要
し、多大な労力がかかり、また長期間の培養により高頻
度で変異体が出現するという危険性がある。また、この
方法はプロトプラストからの再分化系が確立されていな
い作物、例えばトウモロコシには適用できない。細胞を
プロトプラスト化しない程度の酵素処理をした未熟胚に
電気刺激により遺伝子導入を行なう方法（Ｄ′Halluin
K.et al.,1992）も報告されているが、まだ成功例は一
例のみであり、今のところ一般的な手法とは言い難い。
そこで、上述のように、トウモロコシに対しては、タイ
プIIカルスあるいは未熟胚を用いたパーティクルガン法
が試みられている。パーティクルガンを用いた場合、形
質転換体が得られる可能性は高いが、パーティクルガン
という特別な装置が必要であり、この装置なしには形質
転換は不可能である。また微細な金属微粒子の飛散によ
る、実験者に対する危険性も考えられる。またトウモロ
コシに対しては、生長点組織にアグロバクテリウムを感
染させることが試みられている（Gould J.et al.,199
1）。しかし生長点を単離する作業は多くの労力を要
し、大量に調製することは必ずしも容易ではない。また
本願発明者がこの手法によってトウモロコシ形質転換体
の作出を試みたが、形質転換体は得られなかった（表
１）。

従って、本発明の目的は従来の方法に比較して、形質
転換から植物体の再生までの時間が短く、プロトプラス
トからの植物体の再生が確立されていない植物に対して
も普遍的に適用することができ、特殊な装置を必要とせ
ず、さらに用いる材料の調製が容易な単子葉植物の形質
転換方法を提供することである。

本願発明者らは、アグロバクテリウムで処理する単子
葉植物の植物組織、アグロバクテリウムの処理条件、及
びバイナリーベクターの構成等が遺伝子導入効率に及ぼ
す影響等を鋭意研究した結果、単子葉植物の脱分化処理
していない未熟胚をアグロバクテリウム属細菌を用いて
飛躍的に高い効率で形質転換ができること、そしてこの
方法には再現性があり、これによれば上記目的を達成す
ることができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、所望の遺伝子を含有するアグロ
バクテリウム属細菌で単子葉植物の脱分化処理していな
い未熟胚の胚盤を形質転換することから成る、単子葉植
物の形質転換方法を提供する。

本発明の方法により、イネ、トウモロコシ、コムギ、
オオムギ等のイネ科植物を始めとする単子葉植物に目的
の外来遺伝子を再現性良く導入することが初めて可能に
なった。アグロバクテリウムを用いた単子葉植物の形質
転換方法はこれまでにもあるが、前述のとおり確立され
た方法とは言い難い。しかし、本発明ではこれまでに用
いられていない脱分化処理していない未熟胚に本発明で
改良した方法でアグロバクテリウムを接種することによ
り、極めて容易に遺伝子を導入することができた。本発
明の方法では材料調製が容易な未熟胚を用いるので、生
長点を用いる従来技術に比べて供試材料を容易に得るこ
とができる。また、形質転換は未熟胚の胚盤になされる
ため、プロトプラストを形質転換する場合に比べて植物
体再生までの時間が短く、変異の頻度が低下する。ま
た、スーパーバイナリーベクターを用いれば、トウモロ
コシや一部のイネ品種のように培養が困難な品種にも高
い効率で遺伝子を導入することが可能である。

図面の簡単な説明図１は、本発明の方法に用いることができるアグロバ
クテリウム属細菌に含まれるプラスミドの一例であるpT
OK162の構造と本発明の実施例で用いたプラスミドpTOK2
32の構築方法を示す図である。

図２は、図１と同様にpSB1の構造とプラスミドpSB131
の構築方法を示す図である。

発明を実施するための最良の形態本発明の方法により形質転換される単子葉植物は、特
に限定されるものではなく、イネ、トウモロコシ、オオ
ムギ、コムギ、アスパラガスその他、いかなる単子葉植
物にも適用可能である。もっとも、イネ、トウモロコ
シ、オオムギ及びコムギ等を包含するイネ科植物が好ま
しく、とりわけトウモロコシが好ましい。

本発明において、未熟胚とは受粉後の登熟過程にある
未熟種子の胚を言う。また、本発明の方法に供される未
熟胚のステージ（熟期）は特に限定されるものではな
く、受粉後いかなる時期に採取されたものであってもよ
い。もっとも、受精後２日以降のものが好ましい。ま
た、後述の形質転換後、後述の方法により、脱分化し、
正常な個体を再生する能力を有するカルスを誘導できる
未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未熟胚はイ
ンブレッド、インブレッド間のF1、インブレッドと自然
受粉品種間のF1、市販F1品種の未熟胚であることが好ま
しい。

また、本発明において、脱分化処理とは、植物組織の
分化した細胞を脱分化培地において培養し、無秩序に増
殖するカルス等の未分化状態の細胞塊を得るための処理
である。

形質転換に用いられるアグロバクテリウム属細菌は、
Tiプラスミド又はRiプラスミドを持つ、従来より双子葉
植物の形質転換に用いられているものを用いることがで
きる。これらのものの多くはAgrobacterium tumefacien
s由来のTiプラスミドのヴィルレンス領域（vir領域）由
来のDNA領域を含むベクターを有しており、植物に付与
しようとする形質を担う遺伝子はこのベクター中に挿入
されるか、またはこのベクターとは別のプラスミド中に
存在し、相同組換え等によりTiプラスミド中にin vivo
で挿入されるものである。また、小鞠らは、Agrobacter
ium tumefaciens A281という強病原性の、形質転換効率
が極めて高い株（Hood,E.E.et al.,1984;Biotech.2:702
−709、Hood,E.E.et al.,1986;J.Bacteriol.168:1283−
1290、Komari,T.et al.,1986;J.Bacteriol.166:88−9
4、Jin,S.et al.,1987;J.Bacteriol.169:4417−4425、K
omari,T.,1989;Plant Science 60:223−229、ATCC3734
9）に含まれるTiプラスミドpTIBo542のヴィルレンス領
域（vir領域）由来のDNA領域を含むベクター（本明細書
において、このベクターを「スーパーバイナリーベクタ
ー」と呼ぶことがある）を開発した（特開平４−222527
号）。本発明では、このようなスーパーバイナリベクタ
ーを好ましく用いることができる。

このようなスーパーバイナリーベクターの例としてpT
OK162（特開平４−222527号）を挙げることができる。
その構造を図１に示す。このプラスミドは、大腸菌およ
びAgrobacterium tumefaciens中で増殖可能であるpTOK1
54と呼ばれるプラスミド（Tiプラスミドから誘導された
公知のpGA472プラスミドとpVCK101と呼ばれる公知の広
宿主域プラスミドから後述の方法により構築された、Ｔ
領域を含むプラスミド）にpTiBo542のヴィルレンス領域
由来の既にクローン化されていた上記15.2キロベースの
Kpnl断片（virB,virG,VirC各遺伝子を含む）を組み込ん
だものである。このpTOK154には、Ｔ領域の２つの境界
配列とその間に単子葉植物に導入しようとする遺伝子と
してカナマイシン耐性遺伝子が配列されており、この例
は、単子葉植物に導入しようとする遺伝子がpTiBo542の
ヴィルレンス領域由来のクローン化されたDNA断片を含
有するプラスミド上に配置されている例である。

単子葉植物に組み込もうとする所望の遺伝子は、上記
プラスミドのＴ−DNA領域中の制限酵素部位に常法によ
り組み込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等
の適当な選択マーカーに基づいて選択することができ
る。もっとも、図１に示すpTOK162のように、大型で多
数の制限部位を持つものは、通常のサブクローンニング
の手法では所望のDNAをＴ領域内に導入することが必ず
しも容易でないことがある。このような場合にはAgroba
cterium tumefaciens細胞内のin vivo系での相同組換え
（Herrera−Estrella,L.et al.,1983;EMBO J.2:987−95
5、Horsch,R.H.et al.,1984;Science 223:496−498）を
利用することにより、目的のDNAをpTOK162に導入するこ
とが可能になる。すなわち、例えば、先ず、pTOK162をA
grobacterium tumefaciensに導入しておいて、この菌を
さらに所望DNAを導入したpBR322と呼ばれるプラスミド
（類似のプラスミドを含む）を導入する。pTOK162のDNA
にはpBR322と相同な部分があるので、pBR322誘導体は相
同配列を介した組換えによりpTOK162に組み込まれるこ
とになる。pBR322はpTOK162と異なりAgrobacterium tum
efaciens中では複製できないので、このような組み込ま
れた状態（pTOK162::pBR322誘導体という）でなければA
grobacterium tumefaciens中で生存することができな
い。そして、pTOK162とpBR322誘導体の各々に特異的な
特性（薬剤耐性等）について選抜すれば、pTOK162::pBR
322誘導体を有するAgrobacterium tumefaciensを得るこ
とができる。さらに、pTOK162を有するAgrobacterium t
umefaciensに各種のプラスミドを導入して研究したとこ
ろ、pBR322誘導体の選抜マーカーとしては、トランスポ
ゾンTn7（De Greve,H.H.et al.,1981;Plasmid 6:235−2
48）由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子（SP）が優れ
ていることが判明した。従って、すでに所望の遺伝子が
pBR322にクローン化されている場合には、SP遺伝子をそ
のプラスミドに挿入すれば、Agrobacterium tumefacien
s内の相同組換えにより、pTOK162のＴ領域に所望の遺伝
子を導入することができる。またその他の場合には、pB
R322由来のDNAとSP遺伝子から構成されるプラスミドを
用意しておいて、これに所望の遺伝子を挿入する方法も
考えられる。この際、Ｔ領域の境界配列を活用すれば、
最終的に、pTOK162上において、カナマイシン耐性遺伝
子と所望の遺伝子を別々のＴ領域中に配置することも可
能である。カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形
質転換した場合、両Ｔ領域とも導入される場合も相当の
比率で生じるわけであるので、目的遺伝子の導入は十分
達成できる。また、両Ｔ領域が別々の染色体に組み込ま
れる場合もあり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイ
シン耐性遺伝子から分離することも可能となる。

寄生となるアグロバクテリウム属細菌としては、特に
限定されないが、Agrobacterium tumefaciensを好まし
く用いることができる。

プラスミドをAgrobacterium tumefaciens等のアグロ
バクテリウム属細菌に導入する操作は従来法により行う
ことができ、例えば、細菌の三系交雑手法（Ditta,G.et
al.,1980;Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7347−7351）に
より行うことができる。

このようにして調製されるアグロバクテリウム属細菌
には、pTOK162由来のヴィルレンス能力の高いDNAが含ま
れるので、高い効率で単子葉植物の形質転換を行うこと
が可能である。

尚、本発明においては、単子葉植物に導入しようとす
る遺伝子は、従来の技術と同様にＴ領域の境界配列の間
に配置されるものであるが、アグロバクテリウム属細菌
中で、Tiプラスミド上に配置されてもよく、または他の
プラスミド上に配置されてもよい。

アグロバクテリウム属細菌で単子葉植物の未熟胚を形
質転換する方法は、未熟胚をアグロバクテリウム属細菌
と単に接触させることにより行うことができる。例え
ば、10⁶〜10¹¹細胞/ml程度の細胞濃度のアグロバクテリ
ウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に未熟胚を３
〜10分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養する
ことにより行うことができる。形質転換に供する未熟胚
は、2,4−Ｄ共存下での培養等の脱分化処理を行うこと
なく、未熟胚をそのまま形質転換処理に供する。従来、
アグロバクテリウム属細菌を用いた植物の形質転換方法
では、アグロバクテリウム属細菌と接触させる前に、2,
4−Ｄとの共存培養等の脱分化処理を行っていたが、本
願発明者らはこの脱分化処理が不要であることを見出し
た。よって、本発明の方法は、従来の方法に比べて簡便
であるという利点を有する。さらに、植物によっては、
特にトウモロコシでは、形質転換処理の前に脱分化処理
を行うと、形質転換効率が低下するので、このような植
物では、前処理を行わない本発明の方法により形質転換
効率を高めることができる。また、従来、アグロバクテ
リウム属細菌で植物を形質転換する際に、感染効率が高
くなるように、植物に傷をつけたり、酵素処理して細胞
壁をある程度溶解してからアグロバクテリウム属細菌を
感染させていた。本発明の方法では、このような前処理
を行ってもよいが、本願発明者らは、このような前処理
を行わなくても効率良く形質転換が行えることを見出し
た。特に、トウモロコシの場合には、付傷すると形質転
換後にカルスへ誘導する効率が低下するので、このよう
な前処理を行わないことが好ましい。

形質転換した未熟胚は、その後、公知の方法（Green,
C.E.and Phillips,R.L.,1975;Crop Science 15:417−42
1,Duncan,D.R.et al.,1985;Planta 165;322−332）によ
り脱分化され、脱分化状態で形質転換細胞の選抜、増殖
を行うことが好ましい。選抜は、前記所望の遺伝子の発
現に基づいて行うことができる。脱分化状態の細胞は、
正常個体再生能力を有するカルスであることが好まし
い。形質転換細胞からの植物体の再生は公知の方法（Lu
ppotto,E.and Lusardi,H.C.1988;Maydica XXXIII:163−
177）により行うことができる。これにより所望の形質
を獲得した植物体、好ましくは、所望の形質を獲得し、
正常稔性を有する形質転換植物体を再生することができ
る。なお、これらの具体的操作の一例が下記実施例に詳
述されている。

実施例以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。

（１）供試組織の調製（ｉ）トウモロコシの品種トウモロコシ品種P3732、A188、H84、B37Ht、Mo17H
t、W117Ht、Oh43、H99、W64A Ht rhm、F1（A188 x Blac
k Mexican Sweet）,F1（A188 x B73Ht）,F1（B73Ht x A
188）、F1（H84 x A188）、F1（Mo17Ht x A188）、F1
（C103 x A188）を材料として選定した。P3732は磐田酪
農協同組合より入手。全てのインブレッド及びBlack Me
xican Sweetのいずれの品種も農林水産省生物資源研究
所から入手した。

（ii）イネの品種日本稲品種、月の光を選定して供試した。

（iii）トウモロコシ茎頂組織の調製トウモロコシ種子を70％エタノールに１分間、１％次
亜塩素酸ナトリウムに５分間浸漬後滅菌水で３回洗浄し
た。洗浄後LS固体培地（LS主要塩類、LS微量塩類（Lins
maier E.and Skoog F.1965;Physiol.Plant.18:100−12
7）、0.5mg mlニコチン酸、0.5mg lピリドキシン塩酸
塩、1mg lチアミン塩酸塩、100mg lミオイノシトール、
100mg lカザミノ酸、700mg lプロリン、20g lショ糖、
2.3g lゲルライト）に置床し25℃、照明下で培養した。
約４日後、発芽した幼苗から頂端分裂組織を含む約0.1
×0.3mmの組織を切り出し材料とした。

（iv）トウモロコシ未熟胚の調製花粉受粉後約14日目に雌穂から長さ１〜2mmの未熟胚
を無菌的に単離した。

（ｖ）イネ未熟胚の調製開花後、７〜12日目の未熟種子を頴を除去した後、70
％エタノールに30秒、１％次亜塩素酸ナトリウムに10分
間浸漬することにより消毒した後、未熟胚を取り出し供
試材料とした。

（２）Tiプラスミドハイグロマイシン抵抗性遺伝子（HPT）、ホスフィノ
スリシン（PPT）抵抗性遺伝子（bar）およびGUS遺伝子
をTiプラスミドのＴ−DNA領域に組み込んだ、以下のプ
ラスミドを作製した。

（ｉ）pIG121Hm: ヒマのカタラーゼ遺伝子の第１イントロンを含むGUS
遺伝子と、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子と連結したプ
ラスミド（中村ら、1991;植物バイオテクノロジーII
（現代化学増刊、pp.123−132）。名古屋大学、中村氏
より入手）。

（ii）pTOK232: （ａ）イントロンGUSおよびハイグロマイシン抵抗性遺
伝子の中間ベクターpTOK229への導入 Tn7由来のスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含むCla
I断片（2.5kb）をクレノー処理により末端を平滑化
し、これをpUC19のSma I部位に挿入し、アンピシリンお
よびスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を持つプラスミド
pTOK107（5.2kb）を得た。pTOK107をEcoR I、Hind III
で処理し、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む2.5k
b断片をpGA482のEcoR I、Hind III断片（2.7kb）と連結
し、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子とHind III、Hpa
I部位を含むpTOK170（5.2kb）を得た。

35Sプロモーターにヒマのカタラーゼの第１イントロ
ンとGUS遺伝子を連結したベクターpIG221（Ohta et a
l.,1990,名古屋大学中村氏より譲渡）をEcoR Iで切断後
クレノー酵素により末端を平滑化しHind IIIリンカー
（pCAAGCTTG;タカラ酒造コード4660P）を挿入した。35S
プロモーターおよびイントロンGUSを含む断片をHind II
Iにより切り出し、35Sプロモーターにハイグロマイシン
抵抗性遺伝子を連結したpGL2（J.Paszkowski,Friedrich
Miescher Instituteより入手）のHind III部位に挿入
しpGL2−IG（7.6kb）を得た。なお、pGL2はpDH51（Piet
razak et al.,1986;Nucleic Acids Research 14:5857−
5868）にハイグロマイシン抵抗性遺伝子（Gritz L.and
Davis J.1983;Gene 25:179−188）を挿入したものであ
る。pTOK170をHpa I処理して得られた断片をpGL2−IGの
Pvu II断片（5.2kb）と連結しpTOK229（10.1kb）を得
た。

（ｂ）スーパーバイナリーベクターpTOK162への導入スーパーバイナリーベクターに強病原性アグロバクテ
リウムA281由来のvirB、virC、virG遺伝子を挿入して得
たスーパーバイナリーベクターpTOK162への目的遺伝子
（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、イントロンGUS遺伝
子）の導入は相同組換えによって行なった。すなわち、
両ベクターは大腸菌プラスミドpBR322に由来する部位を
持つので、スペクチノマイシン、カナマイシンで選抜さ
れた菌には両プラスミドの組換えによって生じたプラス
ミドのみが含まれることになる。スーパーバイナリーベ
クターにハイグロマイシン抵抗性遺伝子、イントロンGU
S遺伝子が組み込まれたプラスミドをpTOK232と呼ぶ（図
１参照）。

なお、図１及び後述の図２において、「SP」はスペク
チノマイシン抵抗性遺伝子、「HPT」はハイグロマイシ
ン抵抗性遺伝子、「NPT」はカナマイシン抵抗性遺伝
子、「TC」はテトラサイクリン抵抗性遺伝子、「BAR」
はホスフィノスリシン抵抗性遺伝子、「IG」はイントロ
ンGUS遺伝子、「BR」はＴ−DNAの右ボーダー配列、「B
L」はＴ−DNAの左ボーダー配列、「virB,C,G」は強病原
性アグロバクテリウムA281由来のvir領域、「ORI」はCo
lE1の複製開始点、「COS」はラムダファージのCOS部
位、「Ｋ」は制限酵素Kpn I部位、「Ｈ」は制限酵素Hin
d III部位を示す。

（iii）pSB131 （ａ）pSB131の構築 pTOK170をBamH IおよびBgl IIで切断後閉環し、pYS13
8とした。pYS138をEcoR IおよびAsp718Iで切断し、T4 D
NAポリメラーゼ処理後、Sal Iリンカー（５′−GGTCGAC
C−３′）を挿入し閉環しpYS151を作成した。pYS151をS
al Iで切断し、この部位に、pGA643（An et al.,Plant
Molecular Biology Manual A3:1−19,Kluwer Academic,
Dordrecht、1988）のＴ−DNAを含む4.7kbのSal I断片を
導入しpTOK235を作成した。pTOK235をSac II部位で切断
し、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端化後、Hind III
リンカー（５′−CAAGCTTG−３′）を挿入し閉環し、得
られたプラスミドをpTOK246と命名した。pTOK246をHind
IIIおよびEcoR Iで切断し、Ｔ−DNA中の大部分のDNAを
除去した後、35Sプロモーターにホスフィノスリシンア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子（特表平１−503434）
を接続した遺伝子（bar遺伝子、植物にホスフィノスリ
シン耐性を付与する能力を有する）を含む2.2kbのHind
III−EcoR I断片を挿入しpSB25を得た。さらに、pSB25
をhind IIIで切断し、pIG221より単離した、35Sプロモ
ーターとイントロンGUSを含む3.1kbのHInd III断片を挿
入しpSB31を作製した。すなわち、pSB31は、Ｔ−DNA領
域中に、植物中で発現するイントロンGUS遺伝子とホス
フィノスリシン耐性遺伝子（bar）を含む中間ベクター
である。

（ｂ）pNB1の構築 pVCK101（Knauf et al.,Plasmid 8:45−54、1982）を
EcoR Iにより切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理後閉環
することによってEcoR I部位を削除した。さらに、Bgl
IIで切断後閉環する操作を行ったところ、Bgl II部位が
削除できたので、このプラスミドをpVCK101Qと命名し
た。pVCK101QをHind IIIとXho Iで切断し、Hind III−S
al Iで切断したpUC18と結合しpTOK150を作成した。pTOK
150をHind IIIで切断し、T4 DNAポリメラーゼ処理後Eco
R Iリンカー（５′−CCGAATTCGG−３′）を挿入し閉環
することにより、Hind III部位をEcoR I部位に変換し、
pTOK239とした。pGA482をHpa Iで切断し、Xho Iリンカ
ー（５′−CCTCGAGG−３′）を挿入し閉環してpTOK236
を作成した。pTOK236をXba IおよびEcoR Iで分解し、2.
6kb断片を単離した。pTOK239をEcoR IおよびXba Iで切
断し、2.7kb断片を除去し、pTOK236の2.7kb Xba I−Eco
R I断片を挿入し閉環してpNB1を作成した。pNB1は、ア
クセプターベクターの１種であるが、Ｔ−DNAやヴィル
レンス領域由来のDNAなどは含んでいない。

（ｃ）pSB1の構築 pNB1をKpn Iで切断し、pTiBo542（American Type Cul
ture Collection受託番号37349）のヴィルレンス領域の
virBおよびvirG遺伝子を含む15.2kb Kpn I断片を挿入し
て閉環してpSB1とした。pSB1は、アクセプターベクター
の一種であり、これに、Ｔ−DNAを含む中間ベクターを
組込んだハイブリッドベクターを作成した場合、ヘルパ
ープラスミドと組合わせることにより、スーパーバイナ
リーベクターを構成することができる。

（ｄ）pSB31のpSB1への導入 pTOK232の場合と同様に、pSB31を相同組換えによって
pSB1に導入することによってpSB131を作出した（図２参
照）。

（３）寄生アグロバクテリウムＴ−DNA領域を削除した菌系、LBA4404とEHA101とを寄
主バクテリアとして使用した。LBA4404はヘルパープラ
スミド（vir領域を完全な形で持つ）PAL4404を有する菌
系であり、American Type Culture Collectionより入手
可能である（ATCC 37349）。EHA101はヘルパープラス
ミドのvir領域が強病原性アグロバクテリウムA281由来
であり、Hood E.E.et al.1986（上掲）から入手可能で
ある。

（２）項で述べた種々のバイナリーベクターをこれら
２種類のアグロバクテリウムに導入し、以下の菌系を遺
伝子導入用として用いた。これらのプラスミドをアグロ
バクテリウムに導入する方法は細菌の三系交雑手法（Di
tta G.et al.,1980;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:7347−
7351）によった。

LBA4404（pTOK232） LBA4404（pSB131） EHA101（pIG121Hm）（４）アグロバクテリウム懸濁液の調整 AB培地（Drlica K.A.and Kado C.I.1974;Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 71:3677−3681）上で３〜10日間培養した
アグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかきとり、ト
ウモロコシへの接種には細菌懸濁用LS培地（LS主要塩
類、LS微量塩類、0.5mg mlニコチン酸、0.5mg lピリド
キシン塩酸塩、1mg lチアミン塩酸塩、100mg lミオイノ
シトール、1.5mg l2,4−Ｄ、1g lカザミノ酸、100μＭ
アセトシリンゴン、0.2Mショ糖、0.2Mグルコース）に、
イネへの接種には修正AA培地（AA主要無機塩類、AAアミ
ノ酸及びAAビタミン類（Toriyama K.and Hinata K.198
5;Plant Sci.41:179−183）、MS微量塩類（Murashige,
T.and Skoog,F.1962;Physiol.Plant.15:473−497）、1.
0g lカザミノ酸、100μＭアセトシリンゴン、0.2Mショ
糖、0.2Mグルコース）に各々懸濁し、菌濃度を３〜5x10
⁹細胞/mlに調整し用いた。

（５）接種および培養条件供試組織を滅菌水で洗浄後、茎頂組織はガラス針（自
家製）で穿刺後、未熟胚はそのまま上述のアグロバクテ
リウム懸濁液に３〜10分間浸漬した。浸漬処理後、茎頂
組織は100μＭアセトシリンゴン、20g lショ糖、10g l
グルコースを含む修正LS培地（LS主要塩類、LS微量塩
類、0.5mg mlニコチン酸、0.5mg lピリドキシン塩酸
塩、1mg lチアミン塩酸塩、100mg lミオイノシトール、
0.1mg lカイネチン、1.0mg lカザミノ酸、2.3g lゲルラ
イト）に移植し、25℃、照明下で２〜３日間培養した。
その後、250mg lセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄
し、同濃度のセフォタキシムを含むLS培地で培養を続け
た。浸漬処理後のトウモロコシ未熟胚は100μＭアセト
シリンゴン、20g lショ糖、10g lグルコースを含むLSD
1.5共存培地（LS主要塩類、LS微量塩類、0.5mg mlニコ
チン酸、0.5mg lピリドキシン塩酸塩、1mg lチアミン塩
酸塩、100mg lミオイノシトール、1.5mg l2,4−Ｄ、700
mg lプロリン、500mg l MES、8g l寒天）に移植し、25
℃、暗黒下で１〜５日間培養した。その後、洗浄するこ
となく（洗浄すると形質転換植物の再生効率が低下）接
種未熟胚を250mg lセフォタキシムを含むLSD1.5カルス
増殖培地（LSD1.5共存培地からグルコース、アセトシリ
ンゴンを除いた組成）で培養を続けた。また、浸漬処理
後のイネ未熟胚はアセトシリンゴン、ショ糖、グルコー
スを同濃度で含む2N6固体培地（N6の無機塩およびビタ
ミン類（Chu C.C.1978 Proc.Symp.Plant Tissue Cultur
e,Science Press Peking,pp 43−50）1g lカザミノ酸、
2mg l2,4−Ｄ、2g lゲルライト）に移植し、25℃、暗黒
下で２〜５日間培養した。その後、接種未熟胚を250mg
lセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフ
ォタキシムを含む2N6固体培地で３日〜１週間培養を行
なった。

（６）GUS活性の調査方法共存培養処理直後、組織を0.1％Triton X−100を含む
0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に浸漬し、37℃で１時間静
置した。リン酸緩衝液でアグロバクテリウムを除去した
後、1.0mM5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−gluc）および20％メタノール
を含むリン酸緩衝液を添加した。37℃で24時間処理した
後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察し、供試組
織数に対する百分率で表した。また、選抜処理後得られ
た形質転換細胞と考えられるハイグロマイシンあるいは
ホスフィノスリシン抵抗性カルスおよび形質転換植物体
でのGUS活性の判定に際しては、抵抗性カルスおよび植
物体の一部を切取り同様な方法によりGUS染色を行っ
た。

（７）形質転換細胞の選抜と植物体再分化アグロバクテリウムを接種したトウモロコシ未熟胚を
250mg l セフォタキシムおよび０〜100mg lハイグロマ
イシンまたは０〜20mg l PPTを含むLSD1.5カルス増殖培
地で約８週間培養し抵抗性のカルスを選抜した。この抵
抗性カルスを30mg lハイグロマイシンまたは０〜20mg l
PPTを含むLSZ培地（LSD1.5カルス増殖培地から2,4−Ｄ
を除き、50mg lゼアチンを加えた組成）に置床し、25℃
照明下で培養し再分化を行った。

イネ未熟胚を250mg lセフォタキシムおよび50mg lハ
イグロマイシンを含む2N6固体培地で３〜４週間培養
し、抵抗性のカルスを選抜した。さらに、この抵抗性カ
ルスを100mg lハイグロマイシンを含むN6−７培地（N6
無機塩類、N6ビタミン類、2g lカザミノ酸、1mg l2,4−
Ｄ、0.5mg l6BA、30g lソルビトール、20g lショ糖、2g
lゲルライト）で２〜３週間培養したのち、50mg lハイ
グロマイシンを含む植物体再生用のN6S3培地（12濃度N6
主要無機塩類、N6微量無機塩類、N6ビタミン類、1g lカ
ザミノ酸、0.2mg l NAA、1mg lカイネチン、3g lゲルラ
イト）に移植した。なお、培地にはすべて250mg lセフ
ォタキシムを添加した。

（８）トウモロコシ形質転換次世代における導入遺伝子
の発現 LBA4404（pSB131）を接種しPPT選抜により得られた形
質転換当代植物を自殖し次世代種子を得た。これらの種
子を播種後約２週間目の幼苗から葉片を採取しGUS遺伝
子の発現を調査した。またこれらの幼苗の葉の一部に50
0倍に希釈したバスタ（Hoechst,PPTを主成分とする除草
剤）液を塗布し２週間目にPPT抵抗性を調査した。さら
に形質転換当代植物を非形質転換植物（品種A188）と交
配後約２週間目の未熟胚を採取し10mg l PPTを含むLSD
1.5カルス誘導培地に置床した。25℃、暗黒下で３週間
培養後カルス形成の有無を指標にPPT抵抗性を調査し
た。LBA4404（pTOK233）を接種しハイグロマイシン選抜
により得られた形質転換植物も非形質転換植物（品種A1
88）と交配し、次世代植物の幼苗でGUS遺伝子の発現を
調査した。

（９）サザン法による導入遺伝子の分析菌系LBA4404（pSB131）を接種し、PPT選抜により得ら
れた形質転換体当代および次世代のトウモロコシ幼苗か
ら小鞠らの方法（Komari et al.,1989;Theor.Appl.Gene
t.77:547−552）に従いDNAを抽出し、抽出したDNAに制
限酵素BamH Iを処理し、GUS遺伝子およびbar遺伝子をプ
ローブとしたサザン法による導入遺伝子の検出を行っ
た。Ｔ−DNA内部のBamH IサイトからＬボーダー配列の
末端までのDNA領域の長さはGUS遺伝子で約2.3kb、bar遺
伝子で約2.7kbである（図２）。なおサザン法について
はMolecular Cloning（Sambrook et al.1989;Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press）に記載の方法に従って行
った。

（10）トウモロコシ茎頂組織への遺伝子導入 Gouldらの報告（Gould J.et al.,1991;Plant Physio
l.95:426−434）による生長点組織（茎頂組織）を材料
とした形質転換が可能であることを確認するため、前述
のアグロバクテリウム菌系EHA101（pIG121Hm）を単離し
たトウモロコシ茎頂組織に処理し、生長した植物体での
GUS活性を調査した。アグロバクテリウム非処理の組織
ではいずれもGUS遺伝子の発現はみられなかったが、ア
グロバクテリウム処理した組織では針で穿刺した部分に
GUS遺伝子の発現が小さな点状に認められた。しかし、
その後培養を続けた植物体でGUS活性を調査したとこ
ろ、GUS遺伝子の発現を示すものは全くなかった。生長
点近傍は非常に微細な組織であり、そこに穿刺しアグロ
バクテリウムを感染させることは容易でない。本実験の
結果から生長点近傍へのアグロバクテリウムによる形質
転換には生長点の切り出し、穿刺などに熟練した技術が
必要であると考えられた。

（11）トウモロコシ未熟胚への接種トウモロコシ未熟胚を材料として、アグロバクテリウ
ムを処理した場合、供試したいずれの品種でも高率でGU
S遺伝子の発現がみられた。GUS遺伝子の発現部位は肉眼
ではっきりと確認できる大きさであり、広範囲の細胞で
遺伝子発現がなされた。また、EHA101（pIG121Hm）、LB
A4404（pTOK232）およびLBA4404（pSB131）の菌系間で
の遺伝子発現率の差は認められなかった。これらのこと
からアグロバクテリウムによる形質転換法において、未
熟胚は安定して高率の感染を示す適当な材料であると判
断される。

（12）前培養したトウモロコシ未熟胚への接種（比較
例） Chanらはイネのアグロバクテリウムによる形質転換の
材料にN₆RD培地（N₆主要塩類、N₆微量塩類、N₆ビタミン
類、３％ショ糖、0.8％アガロース、2mg l2,4−Ｄ）で
２日間培養（脱分化処理）した未熟胚を用いている（Ch
an M.T.et al.,1993;Plant Mol.Biol.22:491−506）。
トウモロコシ未熟胚を用いた場合にもこの方法が有効で
あるかを確認するため、LSD1.5カルス誘導培地で２日間
培養した未熟胚（品種A188）を材料にアグロバクテリウ
ムによる形質転換を試みた。接種および共存培養は前述
の方法に従った。供試菌系はLBA4404（pSB131）とし
た。対照として採取直後の未熟胚を同様に試験に供し
た。共存培養３日目に両試験区の未熟胚をGUS染色した
ところ、採取直後に接種処理を施した未熟胚のほとんど
が染色されたのに対し、前培養後にアグロバクテリウム
を接種した未熟胚では染色されるものは全く見られなか
った（表３）。このことから、前培養した未熟胚を材料
とした場合、トウモロコシの形質転換は達成されないこ
とが明白である。

（13）トウモロコシ形質転換細胞の確認 30mg lおよび50mg lハイグロマイシン添加培地上で選
抜し、75mg lハイグロマイシンを含む培地で抵抗性の確
認をしたカルスをGUS染色したところ、カルス全体でGUS
遺伝子の発現が認められた。このカルスから小鞠らの方
法（Komari et al.1989;Theor.Appl.Genet.77:547−55
2）に従い抽出したDNAを鋳型とし、GUS遺伝子を増幅さ
せるプライマー（５′−ATGTTACGTCCTGTAGAAAC−３′、
５′−ATGGTGCGCCAGGAGAGTTG−３′）を用いて複製連鎖
反応（PCR）を実施した。反応は、１μｌのDNA溶液、5p
Mの各々のプライマーの混合物、200uMのdATP、dCTP、dG
TPおよびdTTP、PCR緩衝液（宝酒造社製）および2.5UのA
mplitaq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を使用して全
容積100μｌで行なった。反応は下記の温度のプロファ
イルに従って30周期を繰り返した;DNAサーモサイクラー
（パーキンエルマーセタス社製）中で:1分間にわた
り94℃、２分間にわたり55℃、および３分間にわたり72
℃。PCR生成物を、0.7％アガロースゲル上で電気泳動に
よって分離した。アグロバクテリウム非感染カルスから
抽出したDNAを鋳型とした場合、DNAの増幅断片は検出さ
れなかったが、LBA4404（pTOK232）および抵抗性カルス
から抽出したDNAを鋳型とした場合、電気泳動によって
1.8kbpの増幅断片がエチヂウムブロマイド染色法により
検出された。また、アグロバクテリウムのVirG開始コド
ンを含む795bpの領域を増幅させるプライマー（５′−G
ACGTTTATGAAGTAGGCGAGA−３′、５′−TAAAAACGCGAGGAG
AAGATTG−３′）を用いたPCRを実施した。LBA4404（pTO
K232）を鋳型とした場合0.8kbpの増幅断片が検出された
が、抵抗性カルスおよびアグロバクテリウム非感染カル
スから抽出したDNAを鋳型とした場合、増幅断片は検出
されなかった。このことから、抵抗性カルス全体でみら
れたGUS遺伝子の発現はカルスに付着したアグロバクテ
リウムによるものではなく、導入されたGUS遺伝子によ
るものであり、段階的にハイグロマイシン濃度を高めた
培地上で増殖したコンパクトで、こぶ状のカルスは形質
転換体であると考えられた。

（14）トウモロコシ形質転換植物体の選抜共存培養後、30〜100mg lのハイグロマイシンまたは
５〜20mg lのPPTを含む培地上で抵抗性カルスの選抜を
行ったところ、ハイグロマイシン選抜では供試した未熟
胚の11〜27％、PPT選抜では同じく35〜64％から抵抗性
カルスが得られた（表４、６）。これらのカルスをハイ
グロマイシンまたはPPTを含む植物体再分化培地に置床
したところ高率で植物体の再分化がみられた。再生した
植物の葉をGUS染色したところ多くの個体でGUS遺伝子の
発現が認められ（表5,6）、これらは形質転換植物であ
ると考えられた。形質転換植物の得られる頻度は特にPP
Tで選抜を行った場合に高く、また実験間での差も少な
く常に供試した未熟胚の10％以上のものから独立の形質
転換植物が得られた（表６）。このことは本法が安定し
て高頻度で形質転換がなされる方法であることを示唆す
る。次に接種からカルス増殖まで同じ条件で培養、選抜
されたPPT抵抗性カルスを高濃度（20mg l）のPPTを含む
再分化培地とPPTを含まない再分化培地にそれぞれ置床
し、再分化した植物体のGUS発現と調査したところPPTを
含む培地で再分化した植物体ではキメラ個体やエスケー
プ（GUS−）個体が少なく、再分化時のPPT添加による選
抜効果が確認された（表７）。

（15）トウモロコシ形質転換当代における導入遺伝子の
サザン解析形質転換体の全DNAをBamH1で切断した断片に対してba
rおよびGUS遺伝子をプローブとしたサザン法により形質
転換当代における導入遺伝子の検出を行った。いずれの
遺伝子をプローブとした場合でも供試した全ての個体で
１〜数コピーの導入遺伝子の存在が認められた（表
８）。プラスミドpSB131の中ではbar遺伝子を含むBamH1
断片は2.7kb、GUS遺伝子を含む同断片は2.3kbであるの
に対し供試した全ての形質転換体には約3kb以上のバン
ドが認められた。このことはbar、GUSの両遺伝子とも植
物染色体に組み込まれたことを裏付けるものである。ま
た検出されたDNA断片の長さは由来の違う個体では全て
異なった。これはトウモロコシの染色体への遺伝子導入
箇所がそれぞれ異なることを示すものであり、植物体内
でのバクテリアの残存によるものではないことが確認さ
れた。

（16）pTOK233を導入したトウモロコシの次世代におけ
る導入遺伝子の発現と分析ハイグロマイシンによる選抜後得られた形質転換植物
と非形質転換植物を交配して得られた次世代植物の葉を
GUS染色したところGUS陽性と陰性の比は、ほぼ1:1に分
離し予想された分離比に適合した（表９）。

（17）pSB131を導入したトウモロコシの次世代における
導入遺伝子の発現対照品種の葉をGUS染色したところ全て陰性であった
のに対し、形質転換植物を自殖して得られた次世代の葉
は１個体を除き全て陽性を示した。さらにこれらの植物
体にバスタを塗布したところ対照品種の葉は約２週間で
全て枯死したが形質転換次世代の葉はGUS陰性を示した
個体を除き全て健全であった（表10）。GUS遺伝子の発
現、PPT抵抗性ともに２因子分離に適合する遺伝的分離
を示した。次に対照品種より採取した未熟胚をPPT含有
培地で培養したところ全ての未熟胚が増殖を抑制されカ
ルス誘導はみられなかった。これに対し形質転換植物と
非形質転換植物を交配して得られた次世代植物から採取
した未熟胚では供試した両系統とも置床した未熟胚の約
50％からカルスが誘導され、その後同培地上で旺盛な増
殖を示した（表11）。これらの増殖したカルスをGUS染
色したところいずれのカルスでも全体が青色に呈色され
た。

（18）pSB131を導入したトウモロコシの次世代における
導入遺伝子のサザン解析表10に示した形質転換個体No.21を自殖して得られた
次世代植物からDNAを抽出し前述と同様の方法でサザン
法による導入遺伝子の検出を行った。植物体でのGUS遺
伝子の発現が陰性、PPT感受性であった個体を除き、全
ての個体でいずれの遺伝子をプローブとした場合でも導
入遺伝子の存在が認められた（表12）。導入遺伝子の存
在が認められた個体はいずれもbar、GUSのコピー数が一
致し、またそれぞれのバンドの長さは形質転換当代の個
体のものと同一であった。以上の結果から本法によりア
グロバクテリウムを用いてトウモロコシに導入された遺
伝子が植物の細胞の核に組み込まれメンデルの遺伝に従
って安定して後代に遺伝することが確認された。

（19）イネ未熟胚への接種トウモロコシ未熟胚を材料としたときと同様に、イネ
未熟胚においても高率でGUS遺伝子の発現が認められ、
特にスーパーバイナリーベクターを有する菌系であるLB
A4404（pTOK232）を用いた場合に顕著に高い効率でGUS
遺伝子の発現が認められた（表13）。

この実験で使用した２種類のバイナリーベクターはア
グロバクテリウムの細胞の中ではGUS遺伝子は発現しな
いことから、共存培養後のGUS遺伝子を指標とした場
合、アグロバクテリウムはトウモロコシおよびイネの細
胞に遺伝子を導入できることが確認された。

（20）イネ形質転換植物体の選抜イネ未熟胚において、50mg lハイグロマイシン添加培
地上で抵抗性カルスの選抜を行ったところ、スーパーバ
イナリーベクターを有する菌系を用いた場合に、顕著に
高い効率で抵抗性カルスが得られた（表14）。これら
は、選抜マーカーを含む植物体再生培地に移植すること
により、容易に再生植物体が得られた（表14）。また、
再生植物の葉におけるGUS発現を調査したところ、いず
れの個体においてGUS遺伝子の発現が認められ、形質転
換植物であると考えられた。アグロバクテリウムの菌系
EHA101（pIG121Hm）は、強病原性のpTiBo542のヴィルレ
ンス領域を有するものの、スーパーバイナリーベクター
を有していない。Chanらが用いた菌系も同様な菌系であ
り、本実施例の結果と同様に非常に低い形質転換効率し
か得られていない（Chan M.T.et al.,1993;Plant Mol.B
iol.22:491−506）。これに対し、スーパーバイナリー
ベクターを有する菌系を用いることにより、飛躍的にに
高い効率でイネ未熟胚から形質転換植物が得られること
が本実施例において明かとなった。

（21）イネ形質転換個体における導入遺伝子の確認 LBA4404（pTOK232）をイネ未熟胚に処理することによ
り得られた任意かつ独立な形質転換植物３個体につい
て、導入遺伝子の存在を複製連鎖反応（PCR）法により
調査した。GUS遺伝子およびHPT遺伝子のプライマーには
構造領域の両端を用いた。対照として非形質転換体のDN
Aおよび各遺伝子を有するプラスミドDNAを用いた。その
結果、LBA4404（pTOK232）を処理することにより得られ
た形質転換体で、対照のプラスミドにおけるのと同様
に、３個体ともHPT遺伝子の1.1kbの増幅断片が検出され
た。また、GUS遺伝子についてもすべての個体で対照プ
ラスミドと同様の1.8kbの増幅断片が検出された。非形
質転換体ではこれらの断片は検出されなかったことか
ら、供試植物体はアグロバクテリウムにより導入された
遺伝子を有する形質転換植物体であることが確認され
た。

産業上の利用可能性上述のように、本発明の方法は、従来の方法に比較し
て、形質転換から植物体の再生までの時間が短く、プロ
トプラストからの植物体の再生が確立されていない植物
に対しても普遍的に適用することができ、特殊な装置を
必要とせず、さらに用いる材料の調製が容易な単子葉植
物の形質転換方法であるので、本発明は、有用な性質を
有する単子葉植物の育種に利用可能である。

フロントページの続き審査官高堀栄二 (56)参考文献特開平４−222527（ＪＰ，Ａ) ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．22，Ｎｏ．３（1993．）ｐ．491 −506 ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｖｏｌ．４, Ｎｏ．１（1992）ｐ．７−16 ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．25，Ｎｏ．３（19 ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｖｏｌ．４, Ｎｏ．12（1992）ｐ．1495−1505 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A01H 1/00 C12N 15/84 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウ
ム属細菌で単子葉植物の脱分化処理していない未熟胚の
胚盤を形質転換し、形質転換体を得ることからなる、単
子葉植物の形質転換方法。
【請求項２】アグロバクテリウム属細菌で単子葉植物の
脱分化処理していない未熟胚を形質転換し、形質転換体
を得るにあたり、該未熟胚の形質転換が該アグロバクテ
リウム属細菌と該未熟胚とを共存培養することからな
る、請求項１記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項３】アグロバクテリウム属細菌で単子葉植物の
脱分化処理していない未熟胚を形質転換し、形質転換体
を得るにあたり、該未熟胚の形質転換が該アグロバクテ
リウム属細菌と該未熟胚とを接触させた後、共存培養す
ることからなる、請求項１または２のいずれか１項記載
の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項４】該共存培養が個体培地上であることを特徴
とする請求項２または３のいずれか１項記載の単子葉植
物の形質転換方法。
【請求項５】所望の遺伝子を含有し、かつTiまたはRiプ
ラスミドを持つアグロバクテリウム属細菌で単子葉植物
の脱分化処理していない未熟胚を形質転換し、形質転換
体を得ることからなる請求項１乃至４のいずれか１項記
載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項６】該TiまたはRiプラスミドが強病原性アグロ
バクテリウム由来のものである請求項１乃至５のいずれ
か１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項７】該アグロバクテリウム属細菌が強病原性ア
グロバクテリウムに含まれるTiまたはRiプラスミドのヴ
ィルレンス領域由来のDNA領域を含む請求項１乃至６の
いずれか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項８】該アグロバクテリウム属細菌がTiまたはRi
プラスミドを持つアグロバクテリウム細菌であって、さ
らに強病原性アグロバクテリウムのTiまたはRiプラスミ
ドのヴィルレンス領域由来のDNA領域を含むプラスミド
を導入した請求項１乃至７のいずれか１項記載の単子葉
植物の形質転換方法。
【請求項９】該アグロバクテリウム属細菌がTiまたはRi
プラスミドと所望の遺伝子を含有するプラスミドが異な
る請求項１乃至８のいずれか１項記載の単子葉植物の形
質転換方法。
【請求項１０】該アグロバクテリウム属細菌が所望の遺
伝子を含有するプラスミド上に強病原性アグロバクテリ
ウムのTiまたはRiプラスミドのヴィルレンス領域由来の
DNA断片を含む請求項１乃至９のいずれか１項記載の単
子葉植物の形質転換方法。
【請求項１１】該アグロバクテリウムに含まれるTiまた
はRiプラスミドのヴィルレンス領域由来のDNA断片が、
アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacteriu
m Tumefaciens）A281のTiプラスミドpTiBo542のヴィル
レンス領域由来のDNA領域である請求項１乃至10のいず
れか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項１２】該ヴィルレンス領域由来のDNA領域が少
なくともVirB及びVirGを含む領域である請求項１乃至11
のいずれか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項１３】アグロバクテリウム属細菌で単子葉植物
の脱分化処理していない未熟胚を形質転換し、形質転換
体を得るにあたり、該未熟胚の形質転換が該アグロバク
テリウム属細菌と該未熟胚との接触時以降、脱分化処理
することをさらに含む、請求項１ないし12のいずれか１
項に記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項１４】所望の遺伝子を含有し、かつTiまたはRi
プラスミドを持つアグロバクテリウム属細菌で単子葉植
物の脱分化処理していない未熟胚を形質転換し、形質転
換体を得ることからなる請求項13または14のいずれか１
項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項１５】該TiまたはRiプラスミドが強病原性アグ
ロバクテリウム由来のものである請求項13乃至14のいず
れか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項１６】該アグロバクテリウム属細菌が強病原性
アグロバクテリウムに含まれるTiまたはRiプラスミドの
ヴィルレンス領域由来のDNA領域を含む請求項13乃至15
のいずれか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項１７】該アグロバクテリウム属細菌がTiまたは
Riプラスミドを持つアグロバクテリウム細菌であって、
さらに強病原性アグロバクテリウムのTiまたはRiプラス
ミドのヴィルレンス領域由来のDNA領域を含むプラスミ
ドを導入した請求項13乃至16のいずれか１項記載の単子
葉植物の形質転換方法。
【請求項１８】該アグロバクテリウム属細菌がTiまたは
Riプラスミドと所望の遺伝子を含有するプラスミドが異
なる請求項13乃至17のいずれか１項記載の単子葉植物の
形質転換方法。
【請求項１９】該アグロバクテリウム属細菌が所望の遺
伝子を含有するプラスミド上に強病原性アグロバクテリ
ウムのTiまたはRiプラスミドのヴィルレンス領域由来の
DNA断片を含む請求項13乃至18のいずれか１項記載の単
子葉植物の形質転換方法。
【請求項２０】該アグロバクテリウムに含まれるTiまた
はRiプラスミドのヴィルレンス領域由来のDNA断片が、
アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacteriu
m Tumefaciens）A281のTiプラスミドpTiBo542のヴィル
レンス領域由来のDNA領域である請求項13乃至19のいず
れか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項２１】該ヴィルレンス領域由来のDNA領域が少
なくともVirB及びVirGを含む領域である請求項13乃至20
のいずれか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項２２】該共存培養と脱分化処理を同時に行なう
ことを特徴とする請求項13乃至21のいずれか１項記載の
単子葉植物の形質転換方法。
【請求項２３】該未熟胚との接触するアグロバクテリウ
ム属細菌の菌濃度が10⁶〜10¹¹細菌/mlであることを特徴
とする、請求項１乃至22のいずれか１項記載の単子葉植
物の形質転換方法。
【請求項２４】該未熟胚と接触する該アグロバクテリウ
ム属細菌との接触が、該アグロバクテリウム属細菌の懸
濁液中に該未熟胚を浸漬することにより行ない、かつ、
該懸濁液中の菌濃度が10⁶〜10¹¹細胞/mlであることを特
徴とする、請求項１乃至23のいずれか１項記載の単子葉
細胞の形質転換方法。
【請求項２５】該未熟胚が、酵素処理や付傷などの前処
理が行われていない未熟胚である請求項１乃至24のいず
れか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項２６】該未熟胚が、受粉後２日目以降の未熟胚
であることを特徴とする、請求項１乃至25のいずれか１
項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項２７】該未熟胚が、正常な個体を再生する能力
を有するカルスを誘導できる未熟胚であることを特徴と
する請求項１乃至26のいずれか１項記載の単子葉植物の
形質転換方法。
【請求項２８】形質転換後、形質転換細胞を脱分化さ
せ、脱分化状態にて形質転換細胞の選抜、増殖を行ない
形質転換体を得ることを特徴とする請求項１乃至27のい
ずれか１項記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項２９】該未熟胚を形質転換するアグロバクテリ
ウム属細菌が、アグロバクテリウムツメファシエンス
（Agrobacterium Tumefaciens）であることを特徴とす
る請求項１乃至28のいずれか１項記載の単子葉植物の形
質転換方法。
【請求項３０】該未熟胚が未熟胚の胚盤であることを特
徴とする請求項１乃至29のいずれか１項記載の単子葉植
物の形質転換方法。
【請求項３１】該単子葉植物がイネ科植物であることを
特徴とする請求項１乃至30のいずれか１項記載の単子葉
植物の形質転換方法。
【請求項３２】該イネ科植物がイネまたはトウモロコシ
であることを特徴とする請求項１乃至31のいずれか１項
記載の単子葉植物の形質転換方法。
【請求項３３】該イネ科植物がイネであることを特徴と
する請求項１乃至32のいずれか１項記載の単子葉植物の
形質転換方法。
【請求項３４】該イネ科植物がトウモロコシであること
を特徴とする請求項１乃至32のいずれか１項記載の単子
葉植物の形質転換方法。