WO2005071071A1

WO2005071071A1 - Ptd-human choline acetyltransferase fusion protein and its application

Info

Publication number: WO2005071071A1
Application number: PCT/CN2005/000086
Authority: WO
Inventors: Qian Li; Manji Sun; Ailing Fu
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2004-01-20
Filing date: 2005-01-19
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2006-07-20
Also published as: CN1648135A

Description

转导肽一人源胆碱乙酰基转移酶

融合蛋白及其应用发明领域

本发明涉及一种转导肽 -人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白以及含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本发明还涉及含有上述核酸分子的表达载体。本发明还涉及所述融合蛋白用于制备治疗神经退行性病变疾病或预防早老性痴呆、促进学习记忆功能，促进智力的药物的用途。本发明特别涉及舍有所述融合蛋白的药物组合物，其可由注射、舌下含服、肺吸人、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收等多种方式给药。发明背景

乙酰胆碱 ( Acetylchol ine, Ach )的生物合成酶- -胆碱乙酰转移酶（chol ine acetyl transferase, ChAT ， EC 2. 3. 1. 6 ), 是中枢和外周神经系统中胆碱神经元中的重要酶类。胆碱能神经元与学习、记忆、觉醒、睡眠和运动等功能相关密切，脑内 ChAT的含量的降低或酶活性的变化直接反应胆碱能神经元功能的变化。因此 ChAT 与许多胆碱能神经系统疾病密切相关。

早老性痴呆 D )是一种进行性的神经退变性疾病，以组织选择性损害和特征性病理改变为基础的一种痴呆。有证据显示胆碱能系统异常与疾病的痴呆特征关系最为密切，在 AD病人中观察到基底前脑胆碱能神经元的特异丟失。生化方面表现为大脑皮层中胆碱乙酰转移酶和乙酰胆碱酯酶（Acetylchol ines terase, AChE ), 特别是酶的 10s G4分子型水平的下降，同时也表现为神经递质乙酰胆碱合成水平低下，以及高亲和力胆碱摄入减少。 AD患者的 ChAT酶活性降低，神经冲动引发的量子中 Ach含量不足是 AD发病的直接原因。肌萎缩性侧索硬化和亨廷森氏疾病等其他神经退行性疾病中胆碱能神经元也受到影响发生病变。最近发现中桥脑胆碱能系统和精神分裂症以及婴儿猝死综合症正相关。其中 CMT的变化与之关系密切。

Ohno等人（Tsuj ino, A. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 2001 , 98: 2017- 2022 )在频发致死性窒息的先天性肌无力综合症（CMS-EA) 的病人中发现 ChAT发生突变， 5个 CMS- EA病人的 CMT基因有 10 个隐性突变，一个是移码突变， 3个无义突变，大大的降低了 ChAT 的表达及活性。 5 个病人自出生或婴儿的早期都有肌无力症状，但没有检测到抗 AchR的抗体，因此 CMT的基因突变是导致婴儿的肌无力症状的原因。。

Ach 是第一个被发现的神经递质（Loewi 0， Pf lugers Arch Gesamte Phyiol, 1921 , 189: 239-242 ), 在脑中起重要的作用如学习，记忆，睡眠等。此外，老年人胃肠道括约肌、骨酪肌神经肌肉接头及自主神经节前纤维和副交感神经节后纤维 Ach释放量的不足是许多老年人无力和行动迟緩，及胃液及肠液的反流诱发炎症和癌变的原因。此外，也是性功能低下原因之一。胆碱乙酰转移酶是催化神经递质 ACh生物合成的酶，它催化乙酰辅酶 A的乙酰基转移到胆减的反应。 ChAT催化合成 Ach 的步驟只有一步，是 Ach合成的限速酶。因此增加 CHAT基因的表达可促进神经递质 Ach的合成，从而有效地改善学习记忆和老年人因 Ach分泌不足而引起的各种衰老症状。

人胆碱乙酰转移酶中存在多种 ChAT raRNA, 但翻译的 ChAT成熟蛋白质的序列没有差异。目前已在多种表达系统中进行了 CMT 的基因表达，但原核表达的 ChAT没有酶活性。

ChAT 是分子量为 69kD 的大分子蛋白，因此不能通过血脑屏障。中枢神经系统疾病必须中枢给药，目前中枢给药方法，主要有植入法、移植法、侧脑室注射法、及神经祖细胞脑内移植法等，都存在操作复杂、技术要求高、危险性大（感染、意外事故等）等问题。

转导肽技术的出现为 ChAT蛋白质分子高效通过血脑屏障治疗神经系统疾病，提供了一条有效的新的治疗途径。

转导肽是一种能高效穿过生物膜的蛋白转导结构域（Protein Transduct ion Doma in, PTD ), 它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及 DNA等分子跨膜导入几乎所有的組织和细胞，包括破骨细胞、外周血单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以穿过血脑屏障（Schwarze SR， Dowdy SF, Trends Pharmacol Sci. 2000， 21 (2) : 45-8)。 1988年 Green ( Cell. 1988， 55: 1179- 1188 ) 发现 HIV 的 Tat 蛋白能够高效地自由的进出细胞。 1994 年 Fawel KProc Nat l Acad Sci U S A. 1994 Jan 18; 91 (2) : 664-8. ) 将 TAT的 36 Aa的区域化学交连到异源蛋白上后，交联蛋白也可转导入细胞内。

Schwarze SR, et al. ( Science, 1999, 285: 1569-1572. )将 TAT的 PTD区域短肽与大分子半乳糖苷酶在原核细胞中融合表达后，将融合蛋白在小鼠体内注射，发现有活性的酶分子在体内的各组织中都有表达，尤为重要的是短肽可以携带大分子通过血脑屏障。具体地，转导肽是一段富含精氨酸的多肽。 TAT 能自动跨过细胞膜是由于 TAT蛋白上位于 47-57位的一段多肽 YGRKKRRQRRRGG (SEQ ID NO: 1)的作用。除 TAT肽夕卜，来自果蝇触角足同源异型转录因子 Antp 的 43-58 位的多肽序列 ( Deross i D, et al. The Journal of Biological chemistry. 1996， 27 (30) : 18188- 18193 ) ;来自疮疹单病毒 DNA结合蛋白 VP22的 267- 300序列（El l iott C, Ohare P. Cel l. 1997, 88: 223-233 ) 均具有与 TAT 肽完全相似的转导功能和转导机制，它们也因此被统称为 PTD ( Ford K G, et al. Gene Therapy. 2001, 8: 1-4 )。

本发明人利用转导肽构建转导肽 -人源胆碱乙酰酶融合蛋白，直接将 ChAT导入机体，从源头上解决神经突触释放 Ach水平低下的问题，提高 Ach在胆碱能突触嚢泡中的含量，有效解决了嚢泡中 ACh 不够充盈的问题。发明内容

本发明一个方面涉及转导肽 -人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白。本发明中，用于转导所述人源胆碱乙酰基转移酶的转导肽可以选自反式激活蛋白 TAT的 PTD序列、果蝇同源异型转录因子 ANTP和单纯包疹病毒 I型 VP22转录因子的 PTD序列或其功能性类似物或片段。特别优选的，所述转导肽由 SEQ ID NO: 1所述氨基酸序列或其功能性片段组成。实际上，只要能够转导本发明所述人源胆碱乙酰转移酶的转导肽均适用于本发明。本发明中编码所述转导肽的核苷酸序列示于 SEQ ID NO: 2。

本发明中，用于构建所述融合蛋白的人源胆碱乙酰转移酶含有 SEQ ID NO: 3的氨基^^列或其功能性片段。优选的，人源胆碱乙酰基转移酶由 SEQ ID NO: 3组成。编码所述人胆碱乙酰转移酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 4 所示。

在一个优选实施方案中，本发明所构建的转导肽-人胆碱乙酰转移酶融合蛋白具有 SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或其功能等同性变体。本发明中，所述融合蛋白功能等同性变体的氨基^ ^列源自对 SEQ ID NO: 5 所述氨基酸序列的保守性修饰而基本上不改变所述融合蛋白的功能，包括对所述氨基酸序列的一处或多处保守性氨基酸残基的替换、添加或删除。

本发明另一方面涉及一种含有编码本发明所述转导肽 -人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白的核苷 ^^列的核酸分子。更具体地，所述核酸分子含有 SEQ ID NO: 6所述核苷酸序列，或其简并性序列。本发明的再一方面涉及含有上迷编码本发明转导肽 -人源胆碱乙酰转移酶融合蛋白的核酸分子的表达载体。优选的，本发明所述表达载体为原核或真核表达载体，包括但不限于 pGEX、 pET、 pBV220 和 pcD 。

在本发明的一个实施方案中，通过将所述核酸分子导入原核表达载体 pGEX- 4T-1，通过原核细胞培养获得与转导肽融合表达的人源 ChAT。

本发明所述融合蛋白的表达易于操作、成本低、转导效率高。一方面，所得融合蛋白的纯化可以在变性条件下进行，使以包涵体形式存在的融合蛋白的纯化过程大大简化。而变性蛋白的天然构象变成相对灵活的链状结构，摆脱空间构象的限制，具备更高的能量，使转导效率大大提高。

当本发明所构建的原核表达融合蛋白转入细胞后，在伴侣分子的作用下重新折叠，恢复天然构象，使 ChAT发挥其生物学活性，而与其共价连接的蛋白转导域不影响细胞的正常结构或功能。

本发明又一方面涉及所述转导肽 -人源胆碱乙酰转移酶融合蛋白用于制备治疗进行性神经退变疾病或预防早老性痴呆、促进学习记忆功能，促进智力的药物的用途。本发明所述神经退行性病变疾病包括但不限于阿尔茨海默症、帕金森氏病、重症肌无力症、肌萎缩。

本发明还涉及含有所述转导肽 -人源胆碱乙酰转移酶融合蛋白的药物组合物 , 其特征在于所述药物组合物中含有常用的药学可接受的载体或赋形剂。本发明所述剂型包括但不限于，通过（静脉内）注射、舌下含服、肺吸人、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收等多种方式给药的剂型。本领域普通技术人员知晓，可穿越皮肤、粘膜、角膜、结膜、浆膜、肌膜、血管及淋巴膜、脉络膜、神经膜、血脑屏障等一切细胞膜及生物膜的剂型均能够用于本发明所述药物组合物。利用上述转导肽技术，本发明人成功实现了将人源胆碱乙酰基转移酶 (ChAT)输入机体并高效通过血脑屏障的目的，从而使临床用药更为安全、方便，并使作为神经退行性变疾病的自我长期用药、预防用药及促智保健服用成为现实。

本发明所述方法与将蛋白引入细胞的传统方法如微注射、穿孔蛋白及脂盾体法等相比，转导肽介导的蛋白转导有着显著的优越性。附图说明

图 1。融合蛋白 GST-TAT-CHAT以及 TAT-CHAT的 SDS-PAGE和 Wes tern印迹结果。

图 2。静脉注射不同量人重组 TAT- ChAT或 ChAT后小鼠脑中的 C T水平。

图 3。小鼠脑中静脉注射人重组 TAT-ChAT或 ChAT的浓度变化。图 4。静脉注射 TAT -CHAT或 CHAT的动力学. （A)外源性重组 TAT -CHAT或 CHAT的时间依赖性 ACh水平；（B) 外源性重组 TAT -CHAT或 CHAT的浓度依赖性 ACh水平。

图 5 ChAT基因克隆的重组载体 pGEM-ChAT的构建示意图。

图 6为重组载体 pcDNA - ChAT的构建示意图。实施例 1 转导肽 -CHAT融合蛋白载体的构建

将美国 Mayo临床神经学研究所 Engel教授惠赠的人 ChAT基因的 s 型通过 PCR技术（引物设计：上游引物为 5， GAATTCACCC TACTCCACAC CAGAGG (SEQ ID NO: 11) ; 下游引物为 5 ， ct taagctaaccctccac (SEQ ID NO: 12) ₀ PCR反应条件， 94 。(：变性 60 sec , 55 °(复性60 860 , 72 °C延伸 90 sec , 30个循环，）将 S - ChAT 转变为 M型 ChAT。按照图 5和图 6所示构建路线，在获得克隆载体 GEM-ChAT的基础上，进一步构建真核表达载体 pcDNA-ChAT。 pcDNA是一个真核高效的长期的和暂时表达的哺乳动物细胞表达载体，其启动子 CMV 使载体可在大多数哺乳动物细胞中高水平稳定和非复制型暂时表达。 pGEM- ChAT和 pcDNA3. 1 ( Invi trogen公司产品）都用 EcoRI酶切，然后将切下是 ChAT基因插入到 pcDNA3. 1载体中，得到重组质粒 pcDNA3. 1/CHAT。根据 CHAT核 ^^列（SEQ ID NO: 4 )设计引物，导入 BamHI, Kpnl 和 EcoRI 酶切位点。上游引物为 5 ， GCAGGATCCGCAGGTACCATGGCAGC AAAAACTCCC3' ( SEQ ID NO: 7 )；下游引物为 5， GCT GAATTC TCAAGGTTGGTGTCCCTG3' ( SEQ ID NO: 8 )。利用这对引物，用 pfuTaq高保真酶（北京天为时代公司产品）进行 PCR扩增（ PCR反应条件， 94 °C变性 60 秒， 55°C复性 60秒， 72 °C延伸 90秒， 30个循环）从 pcDNA/CHAT质粒模板上扩增编码 CHAT 的基因。

BamHI和 EcoRI双酶切后，直接导入谷胱甘肽转移酶（ GST )融合蛋白表达载体一 pGEX-4T载体（ Amershara biosciences 公司产品 ) 中。 PCR和酶切验证正确后，进行 BamHI和 Kpnl双酶切，插入转导肽 -PTD 基因片段（ SEQ ID NO: 2 ) ：正义链为 5 ， GATCCTATGGTCGTAAAAAGCGACGCCAACGTAGACGTGG TGGTGGTAC3' ( SEQ ID NO: 9 )；反义链为 5， CACCACCACGTCTACGTTGGCGTCGCTTTTTACGACCAT AG3' ( SEQ ID NO: 10 )。重组转导肽 -CHAT 融合蛋白基因测序分析 (北京博亚公司）正确。实施例 2 转导肽 -CHAT融合蛋白的表达和纯化由实施例 1所述方法制备得到的重组质粒 pGEX- ChAT转入大肠杆菌 BL21 ( E. coli Ul (DE3) pLysS购自北京天为时代公司）中，诱导表达转导肽- CHAT融合蛋白。

菌体培养过夜后，第二天 10% 重新接种于新的 LB培养基内，摇菌至 OD600-0. 6 左右后，于培养基中加入终浓度为 l， 0mmol/L的 IPTG, 30°C诱导培养 4小时，裂解菌体并提取 GST-转导肽 -CHAT, 用凝血酶酶切并纯化转导肽 -CHAT，进行 Wes tern blott ing检测。

Wes tern blot t ing按常规方法进行电泳和转膜，加入羊抗人 CHAT 多克隆抗体 ( Chemicon Internat ional Co. ), 以辣根过氧化物酶标记的兔抗羊 IgG为二抗， MB (二氨基联苯胺）染色。

结果显示融合蛋白 GST-转导肽 -CHAT, 转导肽 -CHAT 均与多克隆抗体结合而呈色，其中 GST-转导肽 -CHAT分子量约为 96KD, GST 26KD, 转导肽 -CHAT 70KD, 蛋白条带实测值与理论值相符（参见附图 1 )。实施例 3 静脉注射转导肽 -CHAT或 CHAT后小鼠脑内 CHAT含量的动力学特征

1实验分组

健康雄性小鼠（上海种， I I级动物）, 体重 25±lg。军事医学科学院动物实验中心提供。小鼠随机分为 2组，每组 3只。第 1组小鼠尾静脉注射 10()μ₈的转导肽 -CHAT或 CHAT, 分别于注射后不同时间点（0， 0. 5， 1， 2， 5, 12h )取脑，进行 CHAT活性测定。第 2组小鼠尾静脉注射不同浓度（ 0— 50(^g/mL )的转导肽- CHAT或 CHAT 0. 2 ml后 2h取脑，进行 CHAT活性测定。以上每组实验均重复 3次。

2 CHAT活性的测定

断头处死各组动物，尽快取出大脑，剔去小脑和脑千后，立即置于- 20。C冰箱中，冻结备用。实验时在冰浴中用冰冷的生理盐水制成 10°/。的匀浆液（10， 000rpm，每次 10s, 间隔 30s，共 2次）。采用比色法测定 CHAT活性（ChaoLP. Spectrophotometricdetermination of choline acetyltransferase if the presence of dithiothritol. Anal Biochem. 1972, 85， 20 - 22 )。反应体系取 0.5mol/L磷酸钠緩冲液（pH7.0) ， 6.2xlO"³raol/L 乙酰辅酶 A, 1. Oraol/L 氯化胆碱， 7.6xlO"⁴mol/L 甲基硫酸新斯的明， 3mol/L NaCl, 1.1x10— ³mol/L EDTA, 0.5mol/L盐酸肌酸酐和 6.5麵 ol/LDTT各 20μ1，再加蒸熘水至 0.4mL。置 37°C温浴 5min后，加入 200μΙ组织匀浆液， 37。C水浴继续温浴 20min。空白管加等量煮沸过的浆液。然后将各反应管;^ V沸水中 2niin，加 2.5讓 ol/L砷酸钠 0.8mL。室温下离心。取 1. OmL上清液加 3nmol/L 4- PDS 20 L, 25°C温浴 15min后，于紫外可见分光光度计读 3²4nm消光值（A)。各管的消光值均经空白管的校正。酶活性以 nmo/h · mgPr表示。标准管以 0. llmmol/L CoA代替組织匀浆液。蛋白含量测定采用 Lowry法。

3 实验结果

实验结果表明随蛋白浓度的增加，转导肽 -CHAT 注射组小鼠脑内 CHAT活性升高，而 CHAT静脉注射组 CHAT活性无升高迹象，说明转导肽 -CHAT iv后可通过血脑屏障和细胞膜进入细胞，在细胞内重折叠成活性形式， CHAT则难以通过血脑屏障及细胞膜，明确地显示转导肽对蛋白质越膜的引导作用。转导肽 -CHAT静脉注射 2h后的时效曲线表明， CHAT活性达到高峰，随时间的延长， CHAT活性降低，半衰期约 12h (参见附图 2和图 3 )。实施例 4 静脉注射转导肽 -CHAT或 CHAT后小鼠脑内 ACh含量的动力学特征

1实验分组

健康雄性小鼠（上海种， II级动物），体重 25±lg。军事医学科学院动物实验中心提供。小鼠随机分为 2组，每组 3只。第 1組小鼠尾静脉注射 100μ_§的转导肽- CHAT或 CHAT, 分别于注射后不同时间点（0, 0. 5, 1， 2, 5， 12h )取脑，进行 ACh测定。第 2组小鼠尾静脉注射不同浓度 ( 0一 500 g/mL )的转导肽- CHAT或 CHAT 0. 2 ml 后 2h取脑，进行 ACh测定。以上每组实验均重复 3次。。

2ACh含量的测定

采用碱性羟胺比色法。取脑匀浆液 0. 8mL, 加蒸馏水 1. 4mL混合，加 1. 5mmol/L毒扁豆碱 0. 2mL, 緩慢加入 1. 84mol/L三氯乙酸

0. 8mL, 充分混匀，离心取上清液 lmL，加入碱性羟胺 1. OmL，室温放置 15min后，依次加入 4mol/L HC1, 0. 37mol/L FeCl₃各 0. 5mL, 以上各步均充分混匀。以双蒸水为空白对照，用分光光度计 54 Onm处比色。 ACh含量以 nmol/mgProtein表示。标准管以 0. 2μΰΐο1/ιΛ的 ACh 0. 8mL代替匀浆液

3 实验结果

实验结果表明随蛋白浓度的增加，转导肽 -CHAT使脑内 ACh水平升高，说明转导肽- CHAT 进入细胞折叠成活性形式后，合成 ACh 增多。而 CHAT静脉注射后不影响 ACh含量。时效曲线表明，转导肽 - CHAT静脉注射后 1- 2h, ACh含量达到高峰，随时间延长， ACh水平降低。与 CHAT活性变化基本一致。参见附图 4。实施例 5 Alzheimer' s (AD)病动物模型的制作

将 Αβ ( 22-35 , Sigma 公司）溶于无菌的生理盐水中，浓度为

1. OmmoU参照 Maur ice的方法（Maurice T， Lockhart BP, Privat A. Amnes ia induced in mice by central ly adminis tered β-amyloid pept ides involves chol inergic dysfunct ion. Brain Res. 1996, 706, 181-193 ), 密封后于 37°C培养箱中 96h, 使其成凝聚态后，小鼠脑室内注射 4 L， 11天后进行学习记忆指标测试。实施例 6 回避实验（ s tep- through tes t )检测转导肽- CHAT对 AD动物模型学习记忆的影响

动物随机分为 5组，每组 6只：（ 1 )对照组：脑室内注射等量的生理盐水；（ 2 ) Αβ组；（ 3 )转导肽 - CHAT+Αβ组：测试前 2h静脉注射 2. Omg/kg的转导肽 -CHAT; ( 4 ) CHAT+Αβ组：方法同 ( 3 ); ( 4 )石杉碱甲（Huperzine A, Hup ) +Αβ组： Αβ模型小鼠于测试前 40min腹腔注射 Hup 0. lrag/kg。

采用 JZZ94多功能回避条件反射仪。利用小鼠趋暗的天性和对电击的记忆能力进行实验。先将小鼠放入箱内自由活动 5min以适应环境，然后将动物背朝洞口放入明室，同时启动自动记录装置及暗室内通 30V电压。小鼠一般经 3次电击后，即学得教训形成记忆，不再进入暗室，用于正式实猃。 3次电击仍不获得记忆者淘汰。

上迷训练 24h后进行记忆测试。将小鼠背对洞口置入明室中，启动自动记录装置，记录受试小鼠 2min内进入暗室的 "错误次数" 及笫一次进入暗室的 "记忆保留时间" （犯错间隔时间）。

实验结果表明， Αβ模型组与正常对照组相比，错误次数增加，进入暗室的间隔期，即记忆保留时间缩短（Ρ<0. 01 )，说明 Αβ能明显降低小鼠的记忆获得。给予转导肽- CHAT或 Hup后能显著减少 Αβ 所致 AD模型小鼠进入暗室的错误次数并延长其记忆保留时间，与正常对照组相比无显著差异（Ρ>0. 05 )。而给予 CHAT对小鼠的学习记忆能力无改善作用（表 1 )。说明转导肽- CHAT与 Hup相似，具有改善 Αβ造成的记忆障碍，具有增强记忆的作用。表 1 TAT -CHAT, CHAT和 Hup治疗緩解回避试验中由 Αβ引起的记忆丧失（^ΔΡ〉0. 05， **Ρ<0. 01:与对照组相比； ^##Ρ<0. 01: 与 Αβ 组相比） . 组别错误数记忆保留对照 0. 10±0. 32 119. 40±1. 90

Αβ 2. 28±0. 49" 17. 17±15. 61"

TAT-CHAT+Αβ 0. 56±0. 38^##Δ 115. 62±12. 37 ^Δ

CHAT+Αβ 2. 87±0. 99" 28. 38±17. 55"

Hup+Αβ 0. 37±0. 26^##Δ 107. 25125. 30^##Δ 实施例 7 水迷宫实验 (water maze) 检测用于测定转导肽 -CHAT 对 AD动物模型学习记忆的影响

动物随机分为 5組，每组 6只：（ 1 )对照组：脑室内注射等量的生理盐水；（2 ) Αβ组；（ 3 )转导肽 -CHAT+Αβ组：测试前 2h静脉注射 2. Omg/kg的转导肽- CHAT; ( 4 ) CHAT+Αβ组：测试前 2h静脉注射 2. Omg/kg的转导肽- CHAT; ( 4 )石杉碱甲 ( Huperzine A, Hup ) +Αβ 组： Αβ模型小鼠于测试前 40min腹腔注射 Hup 0. lmg/kg₀

水迷宫自动控制仪装置为由中国医学科学院药物研究所研制，水池长 130cm，宽 85cra，水深 24cm，水温控制在（20±0. 5)。C。 ( 1 ) 辨别认知训练：将小鼠放在终点的阶梯上 30s使其辨别并记忆方位。然后在起点处将小鼠放入水中，在 3min内未找到阶梯者，则将其引导至终点。（2 )游泳实验：上述训练后的小鼠进行游泳测试。记录小鼠自起点游至终点所需的游泳时间（超过 3min者按 3min记）。每只小鼠每天测试 1次，连测 2天。

通过水迷宫法测定小鼠的空间辨别及记忆能力。结果显示，与正常对照組小鼠相比， Αβ明显延长 AD模型小鼠自起点至终点所需的游泳时间（P<0. 01 )，说明模型组小鼠存在显著的空间辨别及记忆能力障碍。给予转导肽 -CHAT和 Hup后，游泳时间明显缩短（表 2 )。说明转导肽- CHAT与 Hup相似，具有增强记忆及认知的作用。

表 2 TAT -CHAT, CHAT和 Hup在水迷宫实验中恢复由 Αβ诱导的小鼠空间辨别和记忆能力障碍（^ΔΡ>0. 05, **Ρ<0. 01:与对照组相比； Ρ<0. 01: 与 Αβ组相比）

組别游、泳时间

第 1 曰第 2曰第 3曰对照 45. 9±24. 35 36. 4±28. 46 27. 70±20. 82

Αβ 151. 12±31. 21" 122. 12±27. 84** 85. 87±15. 30"

TAT-CHAT+Αβ 51. 67+32. 45^##Δ 20. 89±10. 53^{# Δ} 31. 33±23. 38 ^#Δ

CHAT+Αβ 148. 88+34. 28" 151. 25±41. 53" 104. 62±39. 12"

Hup+Αβ 41. 12+37. 02^##Δ 18. 00±16. 62^m 19. 12±15. 01^##Δ

Claims

1. 转导肽-人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白，其中所述转导肽选自反式激活蛋白 TAT 的 PTD 序列、果蝇同源异型转录因子 ANTP和单纯包疹病毒 I型 VP22转录因子的 PTD序列或其功能性类似物或片段，所述人源胆碱乙酰基转移酶含有 SEQ ID NO: 3 的氨基酸序列或其功能性片段。

2. 权利要求 1的融合蛋白，其中所述转导肽由 SEQ ID NO: 1 所述氨基酸序列或其功能性片段组成，人源胆碱乙酰基转移酶由 SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列组成。

3. 权利要求 1 的融合蛋白，其由 SEQ ID NO: 5所示序列组成。

4. 一种含有编码权利要求 1所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。

5. 权利要求 4所述的核酸分子，其由 SEQ ID NO: 6所述核苷酸序列或其筒并性序列所编码。

6. 一种含有权利要求 4所述核酸分子的表达载体。

7. 权利要求 1所述融合蛋白用于制备治疗进行性神经退变疾病或预防早老性痴呆、促进学习记忆功能，促进智力的药物的用途。

8. 权利要求 7所述的用途，其中所述神经退行性病变疾病为阿尔茨海默症、帕金森氏病、重症肌无力症、肌萎缩。

9. 一种药物组合物，其含有权利要求 1所述融合蛋白以及药学可接受的载体或赋形剂，且其呈选自可穿越皮肤、粘膜、角膜、结膜、浆膜、肌膜、血管及淋巴膜、脉络膜、神经膜、血脑屏障等一切细胞膜及生物膜的剂型，优选的，为选自适于注射、舌下含服、肺吸人、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收方式施用的剂型。

10. —种治疗需要的患者进行性神经退变疾病或预防早老性痴呆的方法，包括給予患者治疗有效量的权利要求 1的融合蛋白或权利要求 9的药物组合物。