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KR102501179B1 - 중증 근무력증의 진단 및 치료를 위한 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

중증 근무력증의 진단 및 치료를 위한 펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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KR102501179B1
KR102501179B1 KR1020197009929A KR20197009929A KR102501179B1 KR 102501179 B1 KR102501179 B1 KR 102501179B1 KR 1020197009929 A KR1020197009929 A KR 1020197009929A KR 20197009929 A KR20197009929 A KR 20197009929A KR 102501179 B1 KR102501179 B1 KR 102501179B1
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로버트 에이치. 패어크로프
부 비. 트린
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 대상체에서 중증 근무력증의 중증도를 탐지하거나 결정하는 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 대상체에서 중증 근무력증을 예방하거나 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물은 아세틸콜린 수용체의 주 면역원성 영역에 결합하고, 일부 경우에 병원성 항체 결합 부위를 차단하는 단일 클론 항체에 결합하는 펩티드이다. 다른 구체예에서, 펩티드는 항체 중쇄 단편을 추가로 포함한다. 또한, 중증 근무력증의 중증도를 탐지하거나 결정하고, 예방하거나 치료하는 키트가 제공된다.

Description

중증 근무력증의 진단 및 치료를 위한 펩티드 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 그 개시내용이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함되는, 2016년 9월 8일자 출원된 미국 가출원 제62/384,896호에 대한 우선권을 주장한다.
중증 근무력증(myasthenia gravis)(MG)은 아세틸콜린 수용체(AChR)에 대한 항체-매개 공격으로 발생하는 만성 신경근 자가면역 질환으로, 시냅스후 막 폴딩 구조(postsynaptic membrane folded architecture)의 파괴 및 신경근 접합부에서의 AChR 밀도 감소를 야기한다. AChR의 상실은 흔히 팔다리에서 전반적인 근육 약화를 야기한다. 다른 증상으로는 안검하수(눈꺼풀 처짐)및 겹보임(복시)을 포함한다. MG는 호흡을 조절하는 근육이 영향을 받을 때 치명적일 수 있다. MG는 5천만 내지 2억 명의 사람들에게 영향을 미치고, 매년 3백만 내지 3천만 건의 새로운 진단이 이루어지는 것으로 추정된다.
불행하게도, MG에 대한 치료법은 없다. MG에 대한 여러 가지 치료가 가능하지만, 유효한 치료 옵션은 심각한 부작용과 결부되어 있다. 따라서, MG에 대한 새로운 치료 및 예방책이 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시키며, 관련된 이점도 제공한다.
발명의 요약
일 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 SEHETRLVAX1LFZ1LKWNPX2DYGGX3KKIHZ2LX4YTGH(SEQ ID NO:31), 및 X1, X2, X3, 및 X4로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 위치에서 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 아미노산 변형을 포함하는 분리된 펩티드로서, X1, X2, X3, 및 X4는 독립적으로 선택된 아미노산이고, Z1 및 Z2는 독립적으로 선택된 아미노산을 포함하는 독립적인 길이의 링커 서열인 펩티드를 제공한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X2에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X2는 A이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:2). 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X3에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X3는 I이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:3). 일부 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X4에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:4). 일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X3 및 X4에 존재한다. 일부 경우에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5가 아니다.
일부 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1, X3 및 X4에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X3는 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:6). 또 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1, X2, X3, 및 X4에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X2는 A이고, X3는 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:7).
다른 구체예에서, 펩티드는 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 항체에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 펩티드는 인테인-키틴 결합 도메인 태그(intein-chitin binding domain tag)를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 헥사히스티딘 태그를 추가로 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 펩티드는 펩티드에 컨쥬게이션된 항체 중쇄 단편을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 항체는 인간 면역글로불린 G이다. 다른 경우에서, 중쇄 단편의 힌지 영역은 펩티드의 C-말단에 컨쥬게이션된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 복수의 펩티드는 적어도 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드 및 고체 지지체를 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
일부 구체예에서, 고체 지지체는 멀티웰 플레이트(multiwell plate), ELISA 플레이트, 마이크로어레이(microarray), 칩, 비드, 다공성 스트립 또는 니트로셀룰로즈 필터(nitrocellulose filter)이다. 일부 경우에서, 비드는 키틴을 포함한다. 다른 구체예에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드가 고체 지지체 상에서 고정화된다. 일부 다른 구체예에서, 복수의 펩티드는 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 동일한 항체 또는 상이한 항체에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 중증 근무력증(MG)의 중증도를 탐지하거나 결정하는 방법으로서, 방법이 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드에 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 탐지하는 것을 포함하고, 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드에 결합하는 항체의 존재는 MG의 존재 또는 증가된 중증도를 나타내는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 항체는 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합한다. 다른 구체예에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 SEQ ID NO:2, 3, 4, 6, 및 7로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 다른 구체예에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 얻는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 샘플은 전혈, 혈청, 또는 혈장이다.
특정 구체예에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 고체 지지체에 부착된다. 일부 경우에서, 고체 지지체는 멀티웰 플레이트, ELISA 플레이트, 마이크로어레이, 칩, 비드, 다공성 스트립, 또는 니트로셀룰로즈 필터이다. 일부 경우에서, 비드는 키틴을 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 항체는 웨스턴 블롯(Western blot), 도트 블롯(dot blot), ELISA, 방사면역측정법(radioimmunoassay), 면역침전법(immunoprecipitation), 전기화학발광법(electrochemiluminescence), 면역형광법(immunofluorescence), FACS 분석법, 또는 멀티플렉스 비드 분석법(multiplex bead assay)에 의해 검출된다.
다른 구체예에서, 샘플은 대조군과 비교된다. 일부 경우에서, 대조군은 MG를 갖지 않는 대상체로부터 얻어진다. 다른 경우에서, 대조군은 MG의 증상이 발병하기 전 또는 MG에 대한 치료를 받은 후에 얻어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 중증 근무력증(MG)을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 방법이 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 대상체에서 순환하는 항체와 결합하여 중화 복합체를 형성함으로써 MG를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 순환하는 항체가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합한다. 다른 구체예에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 SEQ ID NO:2, 3, 4, 6, 및 7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 AChR의 MIR에 결합하는 항체를 생성하는 기억 B-세포를 불활성시키거나, 그 수를 감소시킨다.
다른 구체예에서, 대상체는 MG의 증상을 나타낸다. 일부 경우에서, 대상체를 치료하는 것은 MG 증상을 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, 방법은 대상체로부터 중화 복합체를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 중화 복합체는 친화도 혈장분리법(affinity plasmapheresis)에 의해 제거된다. 다른 구체예에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 정맥내, 근육내 또는 이들의 조합으로 투여된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 알파 서브유닛(알파 서브유닛)의 세포외 도메인(ECD)의 코리-폴링-콜툰(Corey-Pauling-Koltun)(CPK) 공간-충진 모델(space-filling model)을 도시한 토르페도 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)의 입체도를 나타낸다. MIR은 AChR 알파 서브유닛의 ECD 상단에 위치한다.
도 2는 토르페도 39MIR(SEQ ID NO:9), 마우스 39MIR(SEQ ID NO:10), 및 인간 39MIR(SEQ ID NO:8) 펩티드의 서열을 나타낸다. 상단에 도시된 아미노산 위치 번호는 SEQ ID NO:28에 기재된 AChR 알파 서브유닛 아미노산 서열의 아미노산 위치 번호에 상응한다. 3개의 비인접 알파 서브유닛 세그먼트(아미노산 1-12, 65-79 및 110-115에 상응함)는 밑줄친 아미노산으로 표시된 링커에 의해 결합된다.
도 3은 4개의 단일 클론 항체(mAb 35, mAb 132A, mAb 198, 및 항-키틴-결합 도메인 mAb)와 6개의 펩티드-인테인-키틴-결합 도메인(IChBD) 융합 단백질(6개의 펩티드는 토르페도 39MIR(SEQ ID NO:9), 인간 39MIR(SEQ ID NO:8), K10N 인간 39MIR 돌연변이체(SEQ ID NO:19), D70A 인간 39MIR 돌연변이체(SEQ ID NO:20), V75I 인간 39MIR 돌연변이체(SEQ ID NO:21), 및 Q111D 인간 39MIR 돌연변이체(SEQ ID NO:22)임)간의 결합을 도시한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 펩티드-IChBD 융합 단백질로 흡착된 키틴 비드가 SDS-PAGE 겔에서 이동되고 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮겨지고 4개의 mAb로 분석되었다.
도 4는 토르페도 39MIR(SEQ ID NO:9) 및 인간39MIR(SEQ ID NO:8) 펩티드의 서열, 뿐만 아니라 8개의 돌연변이체 토르페도 39MIR 펩티드(N10K(SEQ ID NO:11), L12F(SEQ ID NO:12), R66K(SEQ ID NO:13), A70D(SEQ ID NO:14), I75V(SEQ ID NO:15), R79H(SEQ ID NO:16), D111Q(SEQ ID NO:17), 및 K115H(SEQ ID NO:18))의 서열을 나타낸다. 상단에 보여지는 아미노산 위치 번호는 SEQ ID NO:28에 기재된 AChR 알파 서브유닛 아미노산 서열의 아미노산 위치 번호에 상응한다. 3개의 비인접 알파 서브유닛 세그먼트(아미노산 1-12, 65-79, 및 110-115에 상응함)는 밑줄친 아미노산에 의해 표시된 링커에 의해 결합된다.
도 5는 5 개의 단일 클론 항체(mAb 35, mAb 132A, mAb 198, mAb 334, 및 항-키틴-결합 도메인 mAb)와 9개의 펩티드-IChBD 융합 단백질(9개의 펩티드는 토르페도 39MIR(SEQ ID NO:9) 및 8개의 토르페도 39MIR 돌연변이체: N10K(SEQ ID NO:11), L12F(SEQ ID NO:12), R66K(SEQ ID NO:13), A70D(SEQ ID NO:14), I75V(SEQ ID NO:15), R79H(SEQ ID NO:16), D111Q(SEQ ID NO:17), 및 K115H(SEQ ID NO:18)임) 간의 결합을 도시한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 펩티드-IChBD 융합 단백질로 흡착된 키틴 비드가 SDS-PAGE 겔에서 이동되고 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮겨지고 5개의 mAb로 분석되었다.
도 6은 인간39MIR(SEQ ID NO:8) 펩티드 및 4개의 돌연변이체 인간 39MIR 펩티드(K10N(SEQ ID NO:19), D70A(SEQ ID NO:20), V75I(SEQ ID NO:21), 및 Q111D(SEQ ID NO:22))의 서열을 나타낸다. 아미노산 위치 번호는 SEQ ID NO:28에 기재된 AChR 알파 서브유닛 아미노산 서열의 아미노산 위치 번호에 상응한다. 3개의 비인접 알파 서브유닛 세그먼트(아미노산 1-12, 65-79, 및 110-115에 상응함)는 밑줄친 아미노산에 의해 표시된 링커에 의해 결합된다.
도 7은 4개의 단일 클론 항체(mAb 35, mAb 132A, mAb 198, 및 항-키틴-결합 도메인 mAb) 및 8개의 -IChBD 융합 단백질(8개의 펩티드는 토르페도 39MIR(SEQ ID NO:9), 인간 39MIR(SEQ ID NO:8), K10N/D70A 인간 39MIR 이중 돌연변이체(SEQ ID NO:23), K10N/V75I 인간 39MIR 이중 돌연변이체(SEQ ID NO:24), K10N/Q111D 인간 39MIR 이중 돌연변이체(SEQ ID NO25:), V75I/Q111D 인간 39MIR 이중 돌연변이체(SEQ ID NO:5), K10N/V75I/Q111D 인간 39MIR 삼중 돌연변이체(SEQ ID NO:26), 및 K10N/D70A/V75I/Q111D 인간 39MIR 사중 돌연변이체(SEQ ID NO:27)임) 간의 결합을 도시한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 펩티드-IChBD 융합 단백질로 흡착된 키틴 비드가 SDS-PAGE 겔에서 이동되고 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮겨지고 4개의 mAb로 분석되었다.
도 8a 및 8b는 토르페도와 마우스 MIR의 비교를 나타낸다. 도 8a는 토르페도로부터의 알파 서브유닛의 ECD의 입체도를 나타낸다. 도 8b는 마우스로부터의 알파 서브유닛의 ECD의 입체도를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 토르페도와 마우스 코어 MIR의 비교를 나타낸다. 코어는 아미노산 67-76는 상응하며, 어두운 음영으로 표시된다. 도 9a는 토르페도로부터의 알파 서브유닛의 ECD의 입체도를 나타낸다. 도 9b는 마우스로부터의 알파 서브유닛의 ECD의 입체도를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 토르페도와 마우스 간에 상이한 아미노산의 위치를 표시한(표지되고, 어두운 음영으로 표시됨), 토르페도와 MIR의 비교를 나타낸다. 도 10a는 토르페도로부터의 알파 서브유닛의 ECD의 입체도를 나타낸다. 도 10b는 마우스로부터의 알파 서브유닛의 ECD의 입체도를 나타낸다.
도 11은 다양한 인간 혈청 샘플에 대한 4개의 펩티드의 도트 블롯을 나타낸다. 샘플을 정상 대상체(즉, 중증 근무력증(MG)의 진단이 없는) 또는 MG로 진단받은 대상체로부터 얻었다. 샘플을 토르페도 39MIR 펩티드(SEQ ID NO:9), 인간 39MIR 펩티드(SEQ ID NO:8), K10N/V75I/Q11D 인간 39MIR 삼중 돌연변이체(SEQ ID NO:26), 또는 K10N/D70A/V75I/Q111D 인간 39MIR 사중 돌연변이체(SEQ ID NO:27)와 접촉시켰다.
도 12a 및 12b는 본 발명의 조성물을 나타낸다. 도 12a는 본 발명의 펩티드(SEQ ID NO:27) 및 이의 AChR의 MIR의 구조와의 관계를 나타낸다. 도 12b는 항체 Fc 도메인에 컨쥬게이션된 펩티드를 나타낸다.
도 13은 펩티드-Fc 컨쥬게이트(인간 IgG 항체 Fc 도메인 플러스 힌지에 컨쥬게이션된 EQ ID NO:27(키메라), 8(인간) 및 9(토르페도)의 펩티드)로의 mAb 132A 및 198의 결합을 도시한 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 14a 및 14b는 본 발명의 펩티드-Fc 컨쥬게이트가 MG를 예방하거나 치료할 수 있는 여러 방법을 나타낸다. 도 14a는 본 발명의 컨쥬게이트가 병원성 항체의 결합 부위를 차단할 수 있음을 나타낸다. 도 14b는 상기 컨쥬게이트가 병원성 mAb를 만드는데 관여된 B-세포를 불활성화시키거나 그 수를 감소시킬 수 있는 여러 메커니즘을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I. 서론
니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChR)는 신경근 접합부의 시냅스후 막 주름의 융선에서 고밀도로 발현된다. AChR은 아세틸콜린에 결합하는 세포외 도메인(ECD)을 갖는 290 kDa 내재성 막 단백질이다. 중증 근무력증(MG)은 신경근 접합부(NMJ)의 단백질 성분과 관련된 병원성 항체의 B-세포 유도 T-세포 조절 생산으로 인해 발생하는 자가 면역 질환이다. 대부분의 경우, 항체의 표적은 AChR이다. AChR에 대한 항-AChR 항체의 결합은 면역계의 파괴를 일으켜 시냅스후 막 폴딩 구조의 면역 시스템 파괴 및 이에 수반되는 수용체 밀도의 상실을 일으킨다.
본 발명은 부분적으로 AChR의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 병원성 항체에 결합할 수 있는 펩티드의 설계에 기초한다. 펩티드, 펩티드 및 항체 단편을 포함하는 컨쥬게이트 및 이의 사용 방법은 MG의 중증도를 탐지하거나 결정하는데 뿐만 아니라 MG를 예방하고 치료하는데 유용하다.
II. 정의
구체적으로 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본원에서 기술된 방법 또는 재료와 유사하거나 동등한 모든 방법 또는 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상, 다음 용어가 정의된다.
구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 변형 위치는 니코틴성 AChR 알파 서브유닛의 아미노산 서열 내의 위치를 나타낸다. 예로서, 세포외 도메인의 토 르페도 칼리포르니카(Torpedo californica) 니코틴성 AChR 알파 서브유닛 아미노산 1-161에 대한 서열이 SEQ ID NO:28에 제공된다. 비제한적인 예로서, "Q111" 변형은 기준 서열(예를 들어, 인간 서열)에서 정상적으로 Q인 니코틴성 AChR 알파 서브유닛에서 111번째 아미노산에 상응하는 아미노산이 변형되었음을 의미한다. 변형은 Q 이외의 임의의 아미노산에 대한 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 유사하게, "Q111D" 변형은 기준 서열(예를 들어, 인간 서열)에서 정상적으로 Q인 니코틴 성 AChR 알파 서브유닛의 111번째 아미노산에 상응하는 아미노산이 아미노산 D로 치환되었음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 단수형은 하나의 구성원과 관련된 양태 뿐만 아니라 하나 초과의 구성원과 관련된 양태를 포함한다. 예를 들어, 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 그러한 세포의 다수를 포함하고, "작용제"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 작용제에 대한 언급 등을 포함한다.
용어 "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정밀성을 고려하여 측정된 양에 대한 허용가능한 오차 정도를 의미한다. 통상적인, 예시적 오차 정도는 주어진 값 또는 값 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내이다. 다르게는, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내의 값을 의미할 수 있다. 본원에서 주어진 수량은 달리 언급되지 않는 한, 대략적인 것이며, 명시적으로 언급되지 않은 경우 용어 "약" 또는 "대략"이 유추될 수 있음을 의미한다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추 동물, 바람직하게는 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 포유 동물은 뮤린, 래트, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 포함 하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 생체 내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 실체의 조직, 세포 및 이들의 자손 또한 포함된다.
질병 중증도(예를 들어, 중증 근무력증의 중증도)와 관련하여 사용되는 경우 용어 "중증도"는 비제한적인 예로서 신체 검사로 관찰가능한 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 중증도는 근육 약화의 정성적 또는 정량적 측정을 나타낼 수 있다. 중증도는 또한 얼마나 많은 근육 또는 신체 시스템이 근육 약화를 나타내고 있는지를 나타낼 수 있다. 또한, 중증도는 질병으로 인한 다른 후유증을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 호흡 곤란의 발생은 호흡 곤란이 발생하기 전과 비교하여 중증도의 증가로서 해석될 수 있다. 비제한적인 다른 예로서, 중증도는 하나 이상의 측정가능한 값을 반영할 수 있다. 예를 들어, 혈중 산소 수준, 심박수, 혈압, 실험실 검사 결과(예를 들어, 샘플 중 항체 또는 다른 바이오마커의 존재), 방사선 촬영 또는 다른 영상진단 결과, 및 근전도 판독이 모두 질병 중증도의 지표로서 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 중증도는 징후, 증상 또는 다른 관찰 가능하거나 측정 가능한 현상이 얼마나 빨리 변화하는지, 그리고/또는 변화가 영구적인지 또는 일시적인지에 따라 결정되거나, 관련될 수 있다. 질병의 중증도를 결정하기 위한 방법 및 기준은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
본원에 사용되는 용어 "투여하는"은 대상체로의 경구 투여, 국소 접촉, 좌제로서의 투여, 정맥내, 복강내, 근육내, 병변내, 경막내, 비강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 협측, 설하, 구개, 치은, 비강, 질, 직장 또는 경피)를 포함하는 임의의 경로에 의한다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피내, 피하, 복강내, 심실내 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포좀 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
용어 "치료하는"은 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 유익한 또는 바람직한 결과를 얻는 접근법을 의미한다. 치료적 이점은 치료 중에 있는 하나 이상의 질병, 상태 또는 증상에서의 임의의 치료학적으로 관련된 개선 또는 효과를 의미한다. 치료적 이점은 또한 치료 중에 있는 하나 이상의 질병, 상태 또는 증상의 완치를 의미할 수 있다. 예방적 이점을 위해, 조성물은 특정 질환, 상태 또는 증상이 발병할 위험이 있는 대상체에게, 또는 질환, 상태 또는 증상이 아직 발현되지 않았을 수 있더라도 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "충분량"은 유익한 또는 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 펩티드, 핵산 또는 조성물의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 치료되는 대상체 및 질병 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질병 상태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특정량은 선택된 특정 작용제, 표적 세포 유형, 대상체에서의 표적 세포의 위치, 따르게 되는 투약 요법, 다른 화합물과 함께 투여되는 지의 여부, 투여 시기, 및 전달되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
본원의 목적을 위해, 유효량은 당업계에 공지된 바와 같은 고려 사항에 의해 결정된다. 그 양은 중증 근무력증을 앓고 있는 대상체에서 요망하는 치료 효과를 얻는데 효과적이어야 한다. 요망하는 치료 효과는 예를 들어, 중증 근무력증과 관련된 바람직하지 않은 증상을 개선하거나, 증상이 나타나기 전에 그러한 증상의 징후를 예방하거나, 중증 근무력증과 관련된 증상의 진행을 늦추거나, 중증 근무력증과 관련된 근육 기능의 저하를 늦추거나, 중증 근무력증으로 인한 돌이킬 수 없는 손상을 늦추거나 제한하거나, 중증 근무력증의 중증도를 줄이거나 중증 근무력증을 치료하거나, 중증 근무력증으로부터 생존율을 개선하거나 보다 빠른 회복을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 예방적 처치와 관련하여, 상기 양은 또한 중증 근무력증의 발병을 예방하는데 효과적일 수 있다.
유효량은 특히, 치료되어야 하는 질병의 유형 및 중증도 및 치료법에 좌우된다. 유효량은 전형적으로 적절하게 고안된 임상 시험(투여량 범위 연구)에서 결정되며, 당업자는 유효량을 결정하기 위해 그러한 시험을 적절히 수행하는 방법을 알 것이다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 유효량은 표적에 대한 분자(예를 들어, 펩티드)의 친화도, 신체 내의 그것의 분포 프로파일, 다양한 약리학적 파라미터 간의 관계(예를 들어, 신체내 반감기) 및 원하지 않는 부작용 및 기타 요인, 예컨대 연령 및 성별 등을 포함하는 여러 요인에 좌우된다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 세포, 유기체 또는 대상체에 활성제의 투여를 돕는 물질을 지칭한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고 환자에게 심각한 유해한 독성 효과를 유발하지 않는 담체 또는 부형제를 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는 물, NaCl, 생리 식염수, 젖산화 링거, 정상 수크로스, 정상 포도당, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미제, 향료 및 색소, 리포좀, 분산 매질, 마이크로캡슐, 양이온성 지질 담체, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 또한 제형에 안정성, 무균성 및 등장성(예를 들어, 항균 방부제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제)을 제공하기 위한, 미생물(예를 들어, 항균 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등)의 작용을 막기 위해, 또는 제형에 식용가능한 항료 등을 제공하기 위한 물질일 수 있다. 일부 경우에서, 담체는 표적 세포 또는 조직에 펩티드의 전달을 용이하게 하는 작용제이다. 당업자는 다른 약학적 담체가 본 발명에 유용함을 인지할 것이다.
용어 "중증 근무력증(MG)"은 신체의 여러 부위에서 진행성 근육 약화를 유발하고, 적어도 부분적으로 신경근 접합부의 단백질 성분에 관련된 병원성 항체의 B-세포 유도 T-세포 조절 생산으로부터 비롯되는 자가 면역 질환을 지칭한다. 특히, 많은 항체가 신경근 접합부에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChR)에 결합하여, 시냅스후 막 구조의 파괴 및 그에 따른 AChR 밀도의 상실을 초래한다. 시냅스후 막 구조의 파괴 및 AChR 밀도의 감소는 근육이 신경 전달 물질 신호에 반응하는 능력의 감소 또는 완전한 상실을 초래한다.
MG의 초기 증상은 일반적으로 외안근의 약화로부터 비롯된다. 흔한 초기 증상은 겹보임(즉, 복시) 및 안검 하수증(즉, 눈꺼풀을 들어 올리기 어려움)을 포함한다. 일반적인 초기 증상은 구근 근육의 약화로 인해 씹기, 삼키기 및 숨 막힘에 어려움이 있다. 약화는 이어서 다른 안면 근육, 목, 팔, 다리 및 몸통으로 진행되어 물건을 들어 올리기, 걷기, 고개를 꼿꼿이 세우기, 및 말하기에서의 어려움과 같은 증상을 유발할 수 있다. 결국, 근육 약화는 환자가 호흡 곤란을 겪는 시점까지 진행될 수 있으며, 경우에 따라 호흡기로 발전되고, 일부 경우에서 MG가 사망을 유발할 것이다.
MG 진단은 상세한 병력을 얻는 것, 주의 깊게 신체 검사를 수행하는 것, 전기 자극에 대한 특정 근육의 반응을 평가하기 위해 근전도(electromyelogram)를 얻는 것, 실험실 검사(예를 들어, 혈액 검사) 및 CT 영상을 포함할 수 있다.
용어 "토르페도(Torpedo)"는 일반적으로 "전기 가오리", "토르페도 가오리" 또는 "토르페도류(Torpedoes)"로도 불리는 가오리 속을 지칭한다. AChR는 예를 들어, 토르페도 칼라포르니카(Torpedo californica)에서 광범위하게 연구되었다. 토르페도의 다른 종은 토르페도 아데넨시스 (Torpedo adenensis ), 토르페도 알렉산드린시스 (Torpedo alexandrinsis), 토르페도 안데르소니 (Torpedo andersoni ), 토르페도 바우코타 에(Torpedo bauchotae ), 토르페도 푸스코마카타 (Torpedo fuscomacata ), 토르페도 막코라타(Torpedo mackorata ), 토르페도 미크로디스쿠스 (Torpedo microdiscus ), 토르페도 판테라 (Torpedo panthera ), 토르페도 세미펠라기카 (Torpedo semipelagica ), 토르페도 시누스페르시키 (Torpedo sinuspersici ), 토르페도 수에스시 (Torpedo suessii) 및 토르페도 포르페도(Torpedo torpedo)를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
용어 "아세틸콜린 수용체(AChR)"는 신경 전달 물질 아세틸콜린의 결합에 반응하는 내재성 막 단백질을 지칭한다. AChR은 크게 무스카린성 및 니코틴성 AChR의 두 그룹으로 분류된다. 무스카린성 AChR은 두 번째 메신저 신호전달을 통해 이온 채널을 활성화시키는 G-단백질 결합 수용체이다. 무스카린성 AChR은 부교감 신경계의 신경절 이후 섬유로부터 방출되는 아세틸콜린에 의해 자극되는 주요 말단-수용체로서 기능한다. 또한, 무스카린성 AChR은 신경절 이후 뉴런의 회복(니코틴성 AChR에 의해 촉진되는 빠른 탈분극과는 대조적으로, 과분극화 및 느린 탈분극)에 기능하며, 신경분포 조직에서 발견되며(예를 들어, 무스카린성 AChR은 땀샘에서 발견됨), 중추 신경계 전반에 걸쳐 시냅스전 및 시냅스후 위치 모두에서 분포된다. 무스카린성 AChR은 특정 상황에 따라 다른 분류 체계가 사용되지만, 5개의 유형(M1, M2, M3, M4 및 M5)을 포함한다.
니코틴성 AChR는 아세틸콜린에 대한 반응 이외에 니코틴을 비롯한 약물에 반응하는 리간드-게이티드(ligand-gated) 이온 채널인 Cys-루프 단백질이다. 니코틴성 AChR은 말초 신경계에서 적어도 두 가지 중요한 역할을 한다. 첫 번째 역할은 니코틴성 AChR이 교감 및 부교감 신경계의 시냅스전 세포에서 시냅스후 세포로 신호를 전달한다는 것이다. 두 번째 중요한 말초 신경계 역할은 니코틴성 AChR이 골격근에서 발견되며 근육 수축에 필요한 신호를 받는다는 것이다. 니코틴성 AChR은양이온에 비선택적으로 투과성이어서 주어진 채널의 특정 서브유닛의 조합에 따라 나트륨, 칼륨 및 칼슘이 개방 채널을 통과하도록 한다. 전형적으로, 채널 개방시, 이들 양이온의 순 내향 플럭스로, 나트륨은 세포로 전달될 것이고 칼륨은 세포를 떠날 것이다. 니코틴성 AChR을 통한 칼슘의 통과는 다른 신경 전달 물질의 방출 및 제2 메신저 신호 전달을 통한 다른 과정(예를 들어, 유전자 조절 과정)의 활성화를 유도할 수 있다.
니코틴성 AChR은 약 290 kDa의 분자 질량을 가지며, 중앙 공극 주위에 대칭으로 배열된 5개의 서브유닛을 포함한다(참조예: 도 12a에 도시된 토르페도 예). 척추 동물에서, 니코틴성 AChR은 근육형 또는 신경형 수용체로 분류된다. 신경형 수용체는 12개의 상이한 서브유닛: α2, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, β2, β3 및 β4의 다양한 호모머(homomeric) 및 헤테로머(heteromeric) 조합을 포함할 수 있다. 신경근 접합부에서 발견되는 근육형 수용체의 경우, 수용체의 배아 형태는 2:1:1:1 비율로 존재하는 α, β, γ 및 δ 서브유닛을 포함하고, 성인형은 2:1:1:1 비율로 존재하는 α1, β1, δ 및 ε 서브 유닛을 포함한다.
용어 "주 면역원성 영역(MIR)"은 니코틴성 AChR을 표적으로 하는 항체에 대한 결합 부위로서 일반적으로 작용하는 니코틴성 AChR 알파 서브유닛의 세포외 도메인의 영역을 나타낸다. MIR은 전형적으로 단백질 폴딩 후에 물리적으로 가까이에 배열된 알파 서브유닛의 3개의 비인접 세그먼트를 포함한다. 하나의 비제한적인 예로서, MIR은 니코틴성 AChR 알파 서브유닛의 아미노산 1-12, 65-79 및 110-115를 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머 또는 아미노산 잔기의 다중 폴리머의 집합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 폴리머 및 비-자연 발생 아미노산 폴리머에 적용된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 α-아미노산 및 그의 입체이성질체 뿐만 아니라 비천연(비자연 발생) 아미노산 및 그의 입체이성질체를 포함한다. 아미노산의 "입체 이성질체"는 L-아미노산 또는 D-아미노산과 같은 아미노산의 거울상 이성질체를 나타낸다. 예를 들어, 자연 발생 아미노산의 입체이성질체는 자연 발생 아미노산의 거울상 이성질체, 즉 D-아미노산을 지칭한다.
자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 엔코딩되는 것들뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어 하이드록시 프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 자연 발생 α-아미노산은 비제한적으로 알라닌(Ala), 시스테인(Cys), 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu), 페닐알라닌(Phe), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 이소류신(Ile), 아르기닌(Arg), 라이신(Lys), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 아스파라긴(Asn), 프롤린(Pro), 글루타민(Gln), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 발린(Val), 트립토판(Trp), 티로신(Tyr) 및 이들의 조합을 포함한다. 자연 발생 α-아미노산의 입체이성질체는 비제한적으로 D-알라닌(D-Ala), D-시스테인(D-Cys), D-아스파르트산(D-Asp), D-글루탐산(D-Glu), D-페닐알라닌(D-Phe), D-히스티딘(D-His), D-이소류신(D-Ile), D-아르기닌(D-Arg), D-라이신(D-Lys), D-류신(D-Leu), D-메티오닌(D-Met), D-아스파라긴(D-Asn), D-프롤린(D-Pro), D-글루타민(D-Gln), D-세린(D-Ser), D-트레오닌(D-Thr), D-발린(D-Val), D-트립토판(D-Trp), D-티로신(D-Tyr), 및 이들의 조합을 포함한다.
비천연(비자연 발생) 아미노산은 비제한적으로, 아미노산 유사체, 아미노산 모방체, 합성 아미노산, N-치환된 글리신 및 N-메틸 아미노산을 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 L- 또는 D-배열로 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 수행된다. 예를 들어, "아미노산 유사체"는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기에 결합된 α 탄소를 갖지만, 변형된 R(즉, 측쇄) 기 또는 변형된 펩티드 백본, 예를 들어 호모 세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 갖는 비천연 아미노산이다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 지칭한다.
아미노산은 본원에서 일반적으로 알려져 있는 3 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회에서 권장하는 1 문자 기호로 지칭될 수 있다. 예를 들어, L-아미노산은 본원에서 일반적으로 알려져 있는 3 문자 기호(예를 들어, L-아르기닌에 대해 Arg)로 또는 대문자로 1 문자 아미노산 기호(예를 들어, L-아르기닌에 대해 R)로 표시될 수 있다. D-아미노산은 본원에서 일반적으로 알려져 있는 3 문자 기호(예를 들어, D-아르기닌에 대해 D-Arg)로 또는 소문자로 1 문자 아미노산 기호(예를 들어, D-아르기닌에 대해 r)로 표시될 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, 당업자는 엔코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 부가 또는 결실이 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 이러한 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산으로 치환시킴을 인지할 것이다. 화학적으로 유사한 아미노산은 비제한적으로 자연 발생 아미노산, 예컨대 L-아미노산, 자연 발생 아미노산의 입체 이성질체, 예컨대 D-아미노산 및 비천연 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 아미노산 모방체, 합성 아미노산, N-치환된 글리신 및 N-메틸 아미노산을 포함한다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 지방족 아미노산(예를 들어, G, A, I, L 또는 V)이 그룹의 다른 구성원으로 치환되는 치환이 이루어질 수 있다. 유사하게, 지방족 극성-비하전 그룹, 예컨대 C, S, T, M, N, 또는 Q은 그룹의 다른 구성원으로 치환될 수 있고; 염기성 잔기, 예를 들어, K, R, 또는 H는 서로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 산성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어, E 또는 D는 각각 비하전된 대응물, 예를 들어, 각각 Q 또는 N으로, 또는 그 반대로 치환될 수 있다. 하기 8개의 그룹 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 그 밖의 예시적인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 라이신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(참조예: Creighton, Proteins, 1993).
용어 "아미노산 변형"은 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 폴리머를 지칭한다. 상기 용어는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및/또는 피리미딘 염기, 또는 그 밖의 천연의 화학적으로 변형되거나, 생화학적으로 변형되거나, 비천연이거나, 합성이거나 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리머를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 오르쏘로그(ortholog), 및 명시적으로 지시된 서열뿐만 아니라 상보 서열을 암묵적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991), Ohtsuka et al., J. Biol . Chem . 260:2605-2608 (1985), and Rossolini et al., Mol . Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 상기 용어 핵산은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 엔코딩된 mRNA와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열" 또는 "유전자"는 펩티드 사슬을 생성하는 데 관여하는 DNA의 세그먼트를 의미하며, 유전자 산물의 전사/번역 및 전사/번역의 조절에 관여하는 코딩 영역(리더 및 트레일러)의 전후 영역, 뿐만 아니라, 개개의 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함한다.
용어 "중화 복합체"는 항체가 그의 항원(예를 들어, AChR의 MIR)에 결합하는 것을 방지/억제/차단하는 펩티드에 결합된 항체를 포함하는 복합체를 의미한다.
용어 "친화도 혈장분리법"은 대상체의 혈장으로부터 해로운 작용제(예를 들어, 질병 유발제)를 제거하기 위한 체외 혈액 정제 절차를 지칭한다.
"서열 동일성 비율"은 비교 윈도우에 대한 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우 내의 서열 일부(예를 들어, 본 발명의 펩티드)는 두 서열의 최적의 정렬을 위해, 부가 또는 결실을 포함하지 않는 기준 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 비율은 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교 윈도우의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 비율을 산출함으로써 계산된다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 기재하는 맥락에서 용어 "퍼센트 동일성(percent identity)" 또는 "퍼센트 서열 동일성(percent sequence identity)"은 동일하거나, 특정 비율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 두 개 이상의 서열 또는 부분 서열(예를 들어, 관심의 대상이 되는 펩티드의 변이체)를 지칭한다. 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사를 사용하여 측정된 비교 영역 또는 지정된 영역에 대한 최대 일치를 위해 비교되고 정렬될 때, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 기준 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지면, 그러한 서열은 "실질적으로 동일하다"라고 한다. 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여, 이 정의는 또한 시험 서열의 보체를 지칭한다. 바람직하게는, 동일성은 적어도 약 6, 7 또는 8개의 아미노산 길이 이상, 보다 바람직하게는 적어도 6-25개 또는 적어도 6-12개의 아미노산 길이의 영역에 대해 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요에 따라 부분 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 기본 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대체 파라미터가 지정될 수 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘이 프로그램 파라미터에 기초하여 기준 서열에 대해 시험 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 핵산과 단백질의 서열 비교를 위해 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘 및 하기 논의되는 기본 파라미터가 사용된다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌(Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌(Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988))의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)에 의해, 또는 수정 정렬 및 육안 검사(참조예: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement))에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 추가의 예는 각각 문헌(Altschul et al., (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410 and Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)에 기술되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트, ncbi.nlm.nih.gov에서 공개적으로 입수할 수 있다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열의 동일한 길이의 단어로 정렬될 때 일부 포지티브-값 임계치 점수 T와 일치하거나 만족시키는, 쿼리 서열의 길이 W의 짧은 단어를 식별함으로써 높은 스코어링(scoring) 서열쌍(HSP)을 식별하는 것을 포함한다. T는 인근 단어 점수 임계치(neighborhood word score threshold)로서 지칭된다(Altschul et al., 상기). 이 초기 인근 단어 히트(hit)는 검색을 개시시키는 시드(seed)로서 작용하여 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾는다. 이후, 단어 히트는 누적 정렬 점수를 올릴 수 있는 한 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M(일치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상> 0) 및 N(불일치하는 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 측정 행렬(scoring matrix)이 누적 점수를 계산하는 데 사용된다. 누적 정렬 점수가 최대 달성 값에서 양 X만큼 떨어질 때 각 방향의 단어 히트의 확장이 중단되고, 누적 점수는 하나 이상의 네거티브-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하가 되거나, 두 서열 중 어느 하나의 끝에 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 대한)은 28의 단어 크기(W), 10의 기대 값(E), M=1, N=-2 및 두 가닥의 비교값을 기본값으로서 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 단어 크기(W) 3, 예상값(E) 10, BLOSUM62 측정 행렬을 기본값으로 사용한다(참조예: Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(참조예: Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 하나의 측정은 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산의 기준 핵산에 대한 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 펩티드가 실질적으로 동일하다는 표시는 제1 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드가 제2 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응한다는 것이다. 따라서, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 펩티드는 전형적으로 제2 펩타이드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 하기 기술되는 바와 같이, 두 분자 또는 이들의 보체가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머가 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다는 것이다.
III. 구체예의 상세한 설명
A. 분리된 펩티드
일 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 SEHETRLVAX1LFZ1LKWNPX2DYGGX3KKIHZ2LX4YTGH(SEQ ID NO:31)을 포함하는 분리된 펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 X1, X2, X3, 및 X4로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 위치에서 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 아미노산 변형을 추가로 포함하며, 여기서 X1, X2, X3, 및 X4는 독립적으로 선택된 아미노산이고, Z1 및 Z2는 독립적으로 선택된 아미노산을 포함하는 독립적인 길이의 링커 서열이다. 예를 들어, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X2, X1 및 X3, X1 및 X4, X2 및 X3, X2 및 X4, X3 및 X4, X1, X2, 및 X3, X1, X2, 및 X4, X1, X3, 및 X4, X2, X3, 및 X4, 또는 X1, X2, X3, 및 X4에서 이루어질 수 있다.
링커 Z1 및 Z2는 독립적으로 선택된 아미노산을 포함한다. 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직한 구체예에서, Z1 및 Z2는 아미노산 G 및 S를 포함한다. 일부 경우에서, Z1은 아미노산 서열 GGGS를 포함한다. 다른 경우에서, Z2는 아미노산 서열 GS를 포함한다. 일부 경우에서, Z1 및 Z2는 길이가 동일하다. 다른 경우에서, Z1 및 Z2는 길이가 상이하다. 각 링커의 길이는 임의의 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 아미노산 길이가 약 1 내지 10개(즉, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)이다. 다른 구체예에서, 링커는 아미노산 길이가 약 10 내지 30개(즉, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개)이다. 또 다른 구체예에서, 링커는 아미노산 길이가 약 30 내지 100개(즉, 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 100개)이다.
일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:8에 기재된 아미노산 서열에 대해 K10, D22, V27, 및 Q35로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 위치에서 아미노산 변형을 포함하며, 여기서 K10, D22, V27, 및 Q35는 펩티드 내의 위치를 나타낸다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X2에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X2는 A이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:2). 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:8에 기재된 아미노산 서열에 대해 위치 K10 및 D22에 존재하고, 여기서 K10 및 D22는 펩티드 내의 위치를 나타낸다. 일부 경우에서, 펩티드는 SEQ ID NO:23에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X3에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X3는 I이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:3). 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:8에 기재된 아미노산 서열에 대해 위치 K10 및 V27에 존재하고, 여기서 K10 및 V27는 펩티드 내의 위치를 나타낸다. 일부 경우에서, 펩티드는 SEQ ID NO:24에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X4에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:4). 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:8에 기재된 아미노산 서열에 대해 위치 K10 및 Q35에 존재하며, 여기서 K10 및 Q35는 펩티드 내의 위치를 나타낸다. 일부 경우에서, 펩티드는 SEQ ID NO:25에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X3 및 X4에 존재한다. 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:8에 기재된 아미노산 서열에 대해 위치 V27 및 Q35에 존재하며, 여기서 V27 및 Q35는 펩티드 내의 위치를 나타낸다. 일부 경우에서, 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5가 아니다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1, X3 및 X4에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X3는 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:6). 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:8에 기재된 아미노산 서열에 대해 위치 K10, V27, 및 Q35에 존재하며, 여기서 K10, V27, 및 Q35는 펩티드 내의 위치를 나타낸다. 일부 경우에서, 펩티드는 SEQ ID NO:26에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1, X2, X3 및 X4에 존재한다. 일부 경우에서, X1은 N이고, X2는 A이고, X3는 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이다(SEQ ID NO:7). 다른 구체예에서, 아미노산 변형은 SEQ ID NO:8에 기재된 아미노산 서열에 대해 위치 K10, D22, V27, 및 Q35에 존재하며, 여기서 K10, D22, V27, 및 Q35는 펩티드 내의 위치를 나타낸다. 일부 경우에서, 펩티드는 SEQ ID NO:27에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 경우에, 펩티드는 SEQ ID NO:29에 기재된 아미노산 서열로 이루어지지 않는다.
일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 및 7에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 및 7에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 및 7에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 특정 구체예에서, 링커 서열(예를 들어, Z1 및/또는 Z2 링커 서열)은 퍼센트 서열 동일성을 결정할 때 고려되지 않는다.
일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 및 7에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드(예를 들어, 분리된 펩티드)는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 및 7에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드(예를 들어, 분리된 펩티드)는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 및 7에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 아미노산을 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 링커 서열(예를 들어, Z1 및/또는 Z2 링커 서열)은 퍼센트 서열 동일성을 결정할 때 고려되지 않는다.
일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는다. 특정 구체예에서, 링커 서열(예를 들어, Z1 링커 서열, 예컨대 GGGS 및/또는 Z2 링커 서열, 예컨대 GS)은 퍼센트 서열 동일성을 결정할 때 고려되지 않는다.
일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드(예를 들어, 분리된 펩티드)는 SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드(예를 들어, 분리된 펩티드)는 SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 링커 서열(예를 들어, Z1 링커 서열, 예컨대 GGGS 및/또는 Z2 링커 서열, 예컨대 GS)은 퍼센트 서열 동일성을 결정할 때 고려되지 않는다.
일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 인접 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 및 30 중 어느 하나에 기재된 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 인접 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 펩티드는 아미노산 길이가 약 6 내지 약 50개(예를 들어, 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개)이다. 일부 구체예에서, 펩티드는 아미노산 길이가 약 30 내지 약 40개(예를 들어, 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개)이다. 특정 구체예에서, 펩티드는 아미노산 길이가 약 39개이다. 일부 구체예에서, 펩티드는 아미노산 길이가 적어도 약 50개 아미노산(예를 들어, 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상)이다.
일부 구체예에서, 펩티드는 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 항체에 결합한다. 일부 경우에서, AChR는 니코틴성 AChR이다. 또 다른 구체예에서, 펩티드는 인테인-키틴 결합 도메인 태그를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 폴리히스티딘 태그를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 폴리히스티딘 태그는 헥사히스티딘 태그이다.
일부 구체예에서, 펩티드는 펩티드에 컨쥬게이션된 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 추가로 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 경쇄, 중쇄, 이들의 단편, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 가변 도메인(VH), 힌지 영역 및 불변(CH1, CH2, 및 CH3) 도메인을 포함하는, 중쇄 도메인 또는 영역의 임의의 단편 또는 조합이 펩티드에 컨쥬게이션될 수 있다. 특정 경우에, 항체 단편의 힌지 영역은 펩티드의 C-말단에 컨쥬게이션된다. 다른 경우에서, 항체 단편은 중쇄의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 경우에, 항체 단편은 인간 IgG 중쇄의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 하나 또는 항체 단편은 하나 이상의 Fc 도메인, 하나 이상의 Fab 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다.
임의의 수의 동물로부터의 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 펩티드에 컨쥬게이션될 수 있다(예를 들어, 토끼, 염소, 새, 마우스, 래트, 파충류, 상어, 영장류, 인간). 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 항체 또는 이의 단편은 인간이다. 일부 경우에서, 항체 또는 이의 단편은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 것이다. 특정 경우에, 항체 또는 이의 단편은 인간 IgG으로부터 유래된 것이다.
B. 분리된 핵산
다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술된 분리된 펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 일부 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 펩티드를 엔코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 펩티드를 엔코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 펩티드를 엔코딩한다. 특정 구체예에서, 링커 서열(예를 들어, Z1 링커 서열, 예컨대 GGGS 및/또는 Z2 링커 서열, 예컨대 GS)은 퍼센트 서열 동일성을 결정할 때 고려되지 않는다. 일부 경우에서, 핵산에 의해 엔코딩된 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5가 아니다. 다른 경우에서, 핵산에 의해 엔코딩된 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:29가 아니다.
일부 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 및 30에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 인접 아미노산을 포함하는 펩티드를 엔코딩한다. 일부 구체예에서, 핵산은 SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 및 30 중 어느 하나에 기재된 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 엔코딩한다.
본 발명은 또한 본원에서 제공된 분리된 핵산을 포함하는 벡터, 본원에서 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 본원에서 제공된 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드를 제공한다. 벡터는 적합한 숙주 세포에서 발현을 수행하기 위해 적절한 전사 및/또는 번역 조절 요소(예를 들어, 발현을 조절하기 위한 서열)에 작동 가능하게 연결된 펩티드-엔코딩 핵산을 포함할 수 있다. 조절 요소는 포유 동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 개시 서열, 종결 서열, 복제 기원 및 리더 및 수송 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 조절 요소는 요망하는 숙주 세포에서 최적의 발현을 위해 선택된다. 유용한 발현 벡터는 당업자에게 공지된 방법에 의해 작제될 수 있고, 또한 상업적으로 입수 가능하다. 예시적인 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus), 파보바이러스(parvovirus), 덴소바이러스(densovirus) 및 바쿨로바이러스(baculovirus) 벡터를 포함한다.
벡터는 본원에서 제공된 핵산에 작동 가능하게 연결된 강한 구성성 또는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 적합한 프로모터는 당업자들에게 잘 알려져 있고 용이하게 입수할 수 있으며, 예를 들어, 박테리아, 효모, 바이러스, 포유 동물 및 곤충 프로모터를 포함한다. 예시적인 발현 벡터는 포유 동물 세포와 양립 가능한 벡터이다.
숙주 세포는 본원에서 제공된 벡터 또는 분리된 핵산을 포함할 수 있다. 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유 동물 세포를 포함하는, 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 경우에서, 숙주 세포는 식물 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 식물, 곤충 또는 포유 동물 세포이다. 분리된 핵산 또는 벡터, 예를 들어 발현 벡터는 형질 전환, 트랜스펙션(transfection) 및 감염을 포함하는 당업자에게 공지된 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 트랜스펙션은 임의의 공지된 방법, 예컨대 리포좀-매개 형질 감염, 칼슘 포스페이트-매개 형질 감염, 네이키드 DNA 트랜스펙션, 마이크로인젝션(microinjection) 또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 달성될 수 있다. 원핵 세포에 적합한 형질 전환 방법은 예를 들어 문헌[Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69 : 2110 (1972)]에 기술되어 있다. 진핵 숙주 세포의 형질 전환은 예를 들어 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000))에 기술되어 있다. 분리된 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포는 벡터를 복제하고 관심의 대상이 되는 펩티드를 엔코딩하는 핵산을 발현시키는데, 또는 분리된 핵산을 복제 및 발현시키는데 유용하다.
C. 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 조성물은 본원에서 기술된 분리된 펩티드 중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 본원에서 기술된 분리된 임의의 펩티드 중 둘 이상을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 펩티드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 조성물은 SEQ ID NO:2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 이들의 조합에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 본 발명의 펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 약학적 조성물의 제형은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다(참조예: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). 미생물 오염에 대한 예방은 하나 이상의 다양한 항균제 및 항진균제를 첨가함으로써 달성될 수 있다.
투여에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 전형적인 담체는 예를 들어 물-완충 수용액(즉, 생체 적합성 완충액), 에탄올, 폴리올, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 적합한 혼합물, 계면활성제 또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질을 포함한다.
멸균은 여과, 항균 또는 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 또는 티메로살(thimerosal)의 첨가를 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌, 당업계에 인정된 기술에 의해 달성될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당류 또는 염화나트륨이 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 펩티드(들) 및/또는 조성물(들)을 함유하는 멸균 주사용 용액의 제조는 필요에 따라 상기 열거된 다양한 성분을 지닌 적절한 용매에 화합물(들)을 요구되는 양(들)으로 도입시키고, 이어서 멸균(예를 들어, 필터 멸균)시킴으로써 달성된다. 멸균 분말을 얻기 위해, 상기 멸균 용액은 필요에 따라 진공 건조 또는 동결 건조된다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공되는 펩티드(들) 및/또는 조성물(들)은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위한 단위 투여 형태로의 투여를 위해, 예를 들어, 경구, 비강, 국소, 또는 비경구 투여를 위해 제형화된다. 본원에서 사용되는 단위 투여 형태는 대상체, 예를 들어 치료될 인간 또는 다른 포유 동물에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 함께 요망하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다. 일부 경우에서, 더욱 농축된 투여 형태가 제조될 수 있으며, 이로부터 이후 더욱 희석된 단위 투여 형태가 생산될 수 있다. 이에 따라 더욱 농축된 투여 형태는 실질적으로 펩티드(들) 및/또는 조성물(들)의 양을 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상보다 더 많이 함유할 것이다.
이러한 투여 형태를 제조하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다(참조예: Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기). 투여 형태는 전형적으로 통상적인 약학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 추가로 다른 약제, 담체, 애주번트, 희석제, 조직 투과 촉진제, 가용화제 등을 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 당업계에 잘 알려져 있는 방법(참조예: Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기)에 의해 특정 투여 형태 및 투여 경로에 맞게 조절될 수 있다.
적합한 부형제의 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 물, 염수, 시럽, 메틸셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 히드록시프로필메틸셀룰로즈 및 폴리아크릴산, 예컨대 Carbopol, 예컨대 Carbopol 941, Carbopol 980, Carbopol 981 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 투여 형태는 추가로 윤활제, 예컨대 활석, 마그네슘 스테아 레이트 및 미네랄 오일; 습윤제; 에멀젼화제; 현탁제; 보존제, 예컨대 메틸-, 에틸- 및 프로필-하이드록시-벤조에이트(즉, 파라벤); pH 조절제, 예컨대 무기 및 유기산 및 염기; 감미료; 및 향료를 포함할 수 있다. 투여 형태는 또한 생분해성 폴리머 비드, 덱스트란 및 시클로덱스트린 내포 복합체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 투여용 조성물은 경구 전달 비히클, 예컨대 캡슐, 카시에(cachet) 또는 정제일 수 있으며, 이들 각각은 환자에게 정확한 증분 투여량을 제공하기 위해 소정량의 펩티드를 함유한다. 경구 전달 비히클은 예를 들어 펩티드와 구강 및 상부 위장관 사이의 접촉을 피하는데 유용할 수 있다. 경구 투여의 경우, 치료 유효량은 정제, 캡슐, 에멀젼, 현탁액, 용액, 시럽, 스프레이, 로젠지, 분말 및 서방형 제형의 형태일 수 있다. 경구 투여에 적합한 부형제는 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로즈, 글루코스, 젤라틴, 수크로즈, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다.
일부 구체예에서, 치료 유효량은 환제, 정제 또는 캡슐의 형태를 취하며, 따라서 투여 형태는 본원에 기재된 본원에서 기술된 펩티드(들) 및/또는 조성물(들)과 함께 하기 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토스, 수크로즈, 디칼슘 포스페이트 등; 붕해제, 예컨대 전분 또는 이의 유도체; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 등; 결합제, 예컨대 전분, 아카시아 검, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로즈 및 이들의 유도체.
일부 구체예에서, 적합한 담체는 조성물, 예를 들어 펩티드를 구강 및 상부 위장관으로부터 차폐하고, 투여 동안 이들 부위의 국소 가려움/팽윤 반응을 감소 시키거나 예방한다. 예를 들어, 담체는 하나 이상의 지질, 다당류 또는 단백질 성분을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 담체는 식품이다.
국소 투여의 경우, 치료 유효량은 에멀젼, 로션, 젤, 포움, 크림, 젤리, 용액, 현탁액, 연고 및 경피 패치의 형태일 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 본원에서 기술된 펩티드(들) 및/또는 조성물(들)은 분무기를 통해 건조 분말 또는 액체 형태로 전달될 수 있다. 에어로졸 제형은 허용가능한 가압된 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄에 넣어질 수 있다. 비경구 투여의 경우, 치료 유효량은 멸균 주사 가능한 용액 및 멸균 포장 분말의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 주사 가능한 용액은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH에서 제형화된다.
치료 유효량은 또한 동결 건조된 형태로 제공될 수 있다. 이러한 투여 형태는 투여 전에 재구성하기 위한 완충제, 예를 들어 바이카보네이트를 포함할 수 있거나, 완충제가 예를 들어 물로 재구성하기 위한 동결 건조된 투여 형태에 포함될 수 있다. 동결 건조된 투여 형태는 적합한 혈관 수축제, 예를 들어, 에피네프린을 추가로 포함할 수 있다. 동결 건조된 투여 형태는 재구성된 투여 형태가 즉시 개체에게 투여될 수 있도록 임의로 재구성을 위한 완충액과 함께 포장된 주사기에 제공될 수 있다.
일부 구체예에서, 치료 유효량은 그 밖의 성분, 예를 들어, 항알러지 약물, 예컨대 항히스타민제, 스테로이드, 기관지 확장제, 류코트리엔 안정화제 및 비만 세포 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 항알러지 약물은 당업계에 잘 알려져 있다.
D. 키트
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드 및 고체 지지체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 대상체에서 중증 근무력증의 중증도를 탐지하거나 결정하는데 유용하다. 키트는 또한 대상체에서 중증 근무력증을 예방 하거나 치료하는데 유용하다.
이러한 여러 방법을 수행하기 위한 재료 및 시약은 방법의 실행을 용이하게하는 키트로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "키트"는 공정, 검정, 분석 또는 조작을 용이하게 하는 물품의 조합을 포함한다. 특히, 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 포함하는 키트는 예를 들어 진단, 예후, 치료 등을 포함하는 광범위한 적용 분야에서 유용하다.
일부 구체예에서, 키트는 SEQ ID NO:2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 및 이의 조합에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 적어도 하나의 펩티드(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 펩티드)를 포함한다. 일부 다른 구체예에서, 키트에서 하나 또는 복수의 펩티드는 펩티드 또는 복수의 펩티드에 컨쥬게이션된 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함한다.
다른 구체예에서, 키트에서 복수의 펩티드는 동일한 항-MIR 항체(즉, AChR의 MIT에 결합하는 항체)에 결합한다. 특정 구체예에서, 복수의 펩티드는 상이한 항-MIR 항체에 결합한다.
일부 구체예에서, 고체 지지체는 멀티웰 플레이트, ELISA 플레이트, 마이크로어레이, 칩, 비드, 다공성 스트립 또는 니트로셀룰로즈 필터이다. 일부 경우에서, 비드는 키틴을 포함한다. 다른 구체예에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 고정화는 공유 또는 비공유 결합을 통해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 고정화는 하나 이상의 펩티드에 특이적으로 결합하는 포획 항체를 통해 이루어진다. 특정 경우에, 키트 내 고체 지지체는 하나 이상의 고정화된 펩티드와 함께 제조되어 제공된다.
키트는 화학 시약뿐만 아니라 다른 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 비제한적으로 키트 사용자, 샘플 수집 및/또는 정제를 위한 장치 및 시약, 생성물 수집 및/또는 정제를 위한 장치 및 시약, 샘플 튜브, 홀더, 트레이, 랙, 접시, 플레이트, 용액, 완충제 또는 기타 화학 시약, 표준화, 일반화 및/또는 대조군 샘플을 위해 사용되기에 적합한 샘플에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 예를 들어 뚜껑이 달린 상자에 편리하게 보관하고 안전하게 운송할 수 있도록 포장될 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 또한 하나 이상의 펩티드에 결합하는 항-MIR 자가항체의 존재를 탐지하는데 사용되는 표지된 2차 항체를 포함한다. 2차 항체는 면역글로불린 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 상이한 부류 또는 이소타입(isotype)의 불변 또는 "C" 영역에 결합한다. 일반적으로, IgG 불변 영역에 대한 2차 항체, 예를 들어, 이를 테면 IgG 하위부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 중 하나에 대한 2차 항체가 키트에 포함된다. 2차 항체는 형광 물질(예를 들어, 플루오레세인, 피코에리트린, 양자점(quantum dot), 루미넥스 비드(Luminex bead), 형광 비드), 효소(예를 들어, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제), 방사성 동위 원소(예를 들어, 3H, 32P, 125I) 또는 화학발광성 모이어티를 포함하는 임의의 직접적으로 또는 간접적으로 탐지 가능한 모이어티로 표지될 수 있다. 표지 신호는 비오틴 및 비오틴 결합 모이어티(예를 들어, 비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘)의 복합체를 사용하여 증폭될 수 있다. 형광 표지된 항-인간 IgG 항체는 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 효소 표지된 항-인간 IgG 항체는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO) 및 Chemicon(Temecula, CA)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
키트는 고체 지지체를 대상체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키기 위한, 그리고, 항체의 존재 또는 임계치 수준 이상의 항체 수준을 중증 근무력증의 존재 또는 중증도와 상관시키기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 또한 항체의 검출을 위한 네거티브 및 포지티브 대조군 샘플을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 네거티브 대조군 샘플은 중증 근무력증을 갖지 않는 개체 또는 개체의 그룹으로부터 얻어진다. 다른 경우에서, 포지티브 대조군 샘플은 중증 근무력증이 있는 개체 또는 개체의 그룹으로부터 얻어진다. 일부 구체예에서, 키트는 시험 생물학적 샘플에서 항체의 정량화된 수준을 평가하는데 도움이 되도록, 샘플에서 항체의 적정 곡선을 준비하기 위한 샘플을 함유한다.
E. 중증 근무력증의 중증도를 탐지하거나 결정하는 방법
다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 중증 근무력증(MG)의 중증도를 탐지하거나 결정하는 방법으로서, 방법이 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드에 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 탐지하는 것을 포함하며, 펩티드 또는 복수의 펩티드에 결합하는 항테의 존재가 MG의 존재 또는 증가된 중증도를 나타내는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 복수의 펩티드는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 상이한 펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 펩티드는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 이들의 조합에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 펩티드는 AChR의 MIR에 결합하는 항체에 결합한다. 일부 경우에서, AChR는 니코틴성 AChR이다. 특정 경우에, 각각의 상이한 펩티드는 동일한 항-MIR 항체에 결합하며, 예를 들어, 모든 상이한 펩티드가 AChR의 MIR에 결합하는 동일한 항체에 결합한다. 다른 경우에, 각각의 상이한 펩티드는 상이한 항-MIR 항체에 결합한다.
특정 구체예에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 얻는 것을 추가로 포함한다. 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플과 관련하여, 항체를 함유하는 임의의 유체 샘플이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 타액 또는 뇌척수액(CSF)일 수 있다. 하나 이상의 다른 체액이 하나 이상의 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 평가될 수 있다.
일부 구체예에서, 생물학적 샘플 내의 항체의 수준 또는 역가는 임계치 수준 또는 역가와 비교된다. 임계치 수준 또는 역가보다 큰 생물학적 샘플 내 항체의 수준 또는 역가는 대상체가 MG를 가지거나 MG의 증가된 중증도를 가질 가능성이 증가함을 나타낸다. 마찬가지로, 임계치 수준 또는 역가보다 낮은 생물학적 샘플 내 항체의 수준 또는 역가는 대상체가 MG를 갖지 않거나 MG의 증가된 중증도를 갖지 않음을 나타낸다.
생물학적 샘플(예를 들어, 대상체로부터 얻은 유체) 내 항체의 존재는 MG 증상의 발병 전 또는 후에 결정될 수 있다. 항체의 존재는 필요에 따라 또는 요망에 따라 한번 또는 한번 초과로 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체의 존재 또는 부재 또는 항체의 정량화된 수준은 경우에 따라, 매주, 매달, 일년에 수회(예를 들어, 일년에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상), 또는 더 많이 또는 더 적게 평가된다.
일부 구체예에서, 항체의 존재는 시험 샘플(즉, 대상체로부터의 생물학적 샘플)을 대조군 샘플과 비교하지 않고 이루어진다. 다른 구체예에서, 시험 샘플은 대조군과 비교된다. 대조군은 다른 시점의 동일한 개체로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에서, 대조군은 MG의 증상이 나타나기 전에 대상체로부터 얻어진다. 다른 경우에서, 대조군은 MG의 증상이 나타난 후 및/또는 MG에 대한 치료를 받은 후에 대상체로부터 얻어진다.
대조군은 또한 항체 또는 증상의 존재 또는 MG 진단에 대해 알려진 상태를 갖는 상이한 개체로부터 도출될 수 있다. 대조군은 또한 항체 또는 증상의 존재 또는 MG의 진단에 대해 알려진 상태를 갖는 개체 집단으로부터 계산된 값일 수 있다. 대조군은 포지티브 대조군 또는 네거티브 대조군일 수 있다. 일부 구체예에서, 대조군은 또 다른 개체 또는 개체 집단(예를 들어, MG를 갖지 않는 개체 또는 개체 집단)으로부터의 네거티브 대조군이다. 대조군 샘플의 알려진 상태가 항체 음성인 경우라면, 네거티브 대조군 샘플에서보다 시험 샘플에서 항체의 더 높은 수준은 대상체가 MG를 갖거나 MG의 증가된 중증도를 가짐을 나타낸다. 네거티브 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 항체의 유사한 수준은 대상체가 MG를 갖지 않거나, MG의 증가된 중증도를 갖지 않음을 나타낸다.
일부 구체예에서, 대조군은 또 다른 개체 또는 개체 집단으로부터의 포지티브 대조군이거나 대조군은 항체의 설정된 임계치 수준을 반영한다. 대조군 샘플의 알려진 상태가 항체 양성인 경우라면, 포지티브 대조군 샘플에서보다 시험 샘플에서 항체의 유사하거나 높은 수준은 대상체가 MG를 갖거나 MG의 증가된 중증도를 가짐을 나타낸다. 포지티브 대조군 샘플과 비교하여 시험 샘플에서의 항체의 더 낮은 수준은 대상체가 MG를 갖지 않거나, MG의 증가된 중증도를 갖지 않음을 나타낸다.
대조군 샘플 또는 값과 시험 샘플 간의 차이점은 단지 탐지되기에 충분할 필요가 있다. 일부 구체예에서, 시험 샘플 중의 항체의 증가된 수준, 및 이에 따른 MG의 존재 또는 MG의 증가된 중증도는 네거티브 또는 측정전 대조군과 비교하여 항체 수준이 적어도, 예를 들어, 10%, 25%, 50%, 1배, 2배, 3배, 4배 이상인 경우에 결정된다.
항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예시적인 방법은 비제한적으로 웨스턴블롯, 도트 블롯, 효소-결합 면역 흡착 분석법(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 면역침전법, 면역형광법, FACS 분석법, 전기 화학 발광법 및 멀티플렉스 비드 분석법(예를 들어, 루미넥스 또는 형광 마이크로비드 사용)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체를 검출하는데 사용되는 펩티드 또는 복수의 펩티드는 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 고체 지지체는 예를 들어, 멀티웰 플레이트, 마이크로어레이, 칩, 비드, 다공성 스트립, 또는 니트로셀룰로즈 필터일 수 있다. 일부 경우에서, 비드는 키틴을 포함한다. 고정화는 공유 또는 비공유 결합을 통해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 고정화는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체를 통해 이루어진다.
항체의 검출을 위해, 샘플은 항체를 펩티드에 특이적으로 결합시키는데 충분한 조건(예를 들어, 시간, 온도, 샘플의 농도) 하에 본원에서 기재된 하나 이상의 펩티드와 함께 인큐베이션될 수 있다. 하나 이상의 펩티드는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 펩티드는 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 시간 또는 밤새, 약 8, 10, 12, 14 또는 16시간 동안 샘플에 노출될 수 있다. 그러나, 인큐베이션 시간은 예를 들어, 하나 이상의 펩티드의 조성, 하나 이상의 항체의 조성, 샘플의 희석 및 인큐베이션 온도에 따라 다소 상이할 수 있다. 인큐베이션은 일반적으로 상온(약 25℃) 또는 생물학적 온도(약 37℃)에서 수행되며, 냉장고(약 4℃)에서 수행될 수 있다. 2차 항체를 첨가하기 전에 결합되지 않은 샘플을 제거하기 위한 세척은 공지된 면역측정법에 따라 수행된다.
표지된 2차 항체는 일반적으로 본원에서 기술된 하나 이상의 펩티드에 결합하는 샘플 내 항체를 검출하는데 사용된다. 2차 항체는 면역글로불린 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 상이한 부류 또는 이소타입의 불변 또는 "C" 영역에 결합한다. 일반적으로, IgG 불변 영역에 대한 2차 항체가 본 발명의 방법에 사용된다. IgG 하위부류에 대한 2차 항체, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)가 또한 본 발명의 방법에 사용된다. 2차 항체는 형광 물질(예를 들어, 플루오레세인, 피코에리트린, 양자점, 루미넥스 비드, 형광 비드), 효소(예를 들어, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제), 방사성 동위 원소(예를 들어, 3H, 32P, 125I) 또는 화학발광성 모이어티를 포함하는 임의의 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 모이어티로 표지될 수 있다. 표지 신호는 비오틴 및 비오틴 결합 모이어티(예를 들어, 비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘)의 복합체를 사용하여 증폭될 수 있다. 형광 표지된 항-인간 IgG 항체는 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 효소 표지된 항-인간 IgG 항체는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO) 및 Chemicon(Temecula, CA)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
샘플 내 항체의 존재 또는 부재, 또는 차별적인 존재의 검출 방법은 2차 항체의 표지의 선택에 상응할 것이다. 예를 들어, 본원에서 기술된 하나 이상의 펩티드가 면역블롯팅에 적합한 멤브레인 기질 상으로 옮겨질 경우, 검출 가능한 신호(즉, 블롯)는 효소 표지가 사용된다면 디지털 이미저(digital imager)를 사용하거나, 방사성 동위원소 표지가 사용된다면 x-선 필름 현상제를 사용하여 정량화될 수 있다. 또 다른 예로, 본원에서 기술된 하나 이상의 펩티드가 멀티웰 플레이트로 옮겨질 경우, 검출 가능한 신호는 형광, 화학 발광 및/또는 비색 신호를 검출 및 정량할 수 있는 자동화 플레이트 판독기를 사용하여 정량화될 수 있다. 이러한 검출 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일반적인 면역측정 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 파라미터 최적화에 대한 지침은 예를 들어 문헌(Wu, Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting, and Clinical Application, 2000, AACC Press; Principles and Practice of Immunoassay, Price and Newman, eds., 1997, Groves Dictionaries, Inc.; The Immunoassay Handbook, Wild, ed., 2005, Elsevier Science Ltd.; Ghindilis, Pavlov and Atanassov, Immunoassay Methods and Protocols, 2003, Humana Press; Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Immunoassay Automation: An Updated Guide to Systems, Chan, ed., 1996, Academic Press)에서 찾아볼 수 있다.
특정 구체예에서, 항체의 존재 또는 증가된 존재는 면역 분석법에서 검출 가능한 신호(예를 들어, 블롯, 형광, 화학발광, 색상, 방사능)에 의해 표시되며, 여기서 대상체로부터의 생물학적 샘플은 본원에서 기술된 하나 이상의 펩티드와 접촉된다. 이 검출 가능한 신호는 대조군 샘플로부터의 신호 또는 임계값과 비교될 수 있다. 일부 구체예에서, 시험 샘플 내 항체의 검출 가능한 신호가 대조군 샘플 내 항체의 신호 또는 소정의 임계값과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 50%, 75% 더 큰 경우, 증가된 존재가 탐지되고, MG의 존재 또는 증가된 중증도가 표시된다. 일부 구체예에서, 시험 샘플 내 항체의 검출 가능한 신호가 대조군 샘플 내 항체의 신호 또는 소정의 임계값과 비교하여 적어도 약 1배, 2배, 3배, 4배 이상 더 큰 경우, 증가된 존재가 탐지되고, MG의 존재 또는 증가된 중증도가 표시된다.
일부 구체예에서, 항체 결정의 결과는 유형의 매체(tangible medium)에 기록된다. 예를 들어, 현재의 진단 분석법(예를 들어, 항체의 존재 또는 증가된 존재의 관찰)의 결과 및 MG의 증가된 중증도 또는 존재 여부의 진단은 예를 들어 종이 또는 전자 매체(예를 들어, 오디오 테이프, 컴퓨터 디스크, CD, 플래시 드라이브 등)에 기록될 수 있다.
다른 구체예에서, 방법은 환자(즉, 대상체)에 진단을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
F. 중증 근무력증을 예방하거나 치료하는 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 중증 근무력증(MG)을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 방법이 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 투여하는 것을 포함하며, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 대상체에서 순환하는 항체와 결합하여 중화 복합체를 형성함으로써 MG를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 순환하는 항체는 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합한다. 일부 경우에서, AChR은 니코틴성 AChR이다. 특정 경우에서, 펩티드 또는 복수의 펩티드는 항체 결합 부위에 결합하고 차단한다.
일부 구체예에서, 복수의 펩티드는 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 상이한 펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 복수의 펩티드는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 이들의 조합에서 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 경우에서, 각각의 상이한 펩티드는 동일한 항-MIR 항체에 결합하며, 예를 들어, 모든 상이한 펩티드가 AChR의 MIR에 결합하는 동일한 항체에 결합한다. 다른 경우에, 각각의 상이한 펩티드는 상이한 항-MIR 항체에 결합한다.
특정 구체예에서, 대상체에 투여되는 펩티드 또는 복수의 펩티드는 펩티드 또는 복수의 펩티드에 컨쥬게이션된 하나 이상의 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 경쇄, 중쇄, 이들의 단편, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 가변 도메인(VH), 힌지 영역 및 불변(CH1, CH2, 및 CH3) 도메인을 포함하는, 중쇄 도메인 또는 영역의 임의의 단편 또는 조합이 펩티드(들)에 컨쥬게이션될 수 있다. 특정 경우에, 항체 단편의 힌지 영역은 펩티드의 C-말단에 컨쥬게이션된다. 다른 특정 경우에서, 항체 단편은 중쇄의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 하나 또는 항체 단편은 하나 이상의 Fc 도메인, 하나 이상의 Fab 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다.
항체 단편을 본 발명의 펩티드에 컨쥬게이션시키는 것(예를 들어, 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG 중쇄 단편을 본 발명의 펩티드에 컨쥬게이션시키는 것)은 펩티드의 생체 이용률을 확대시키는데 유용할 수 있다. 또한, 실시 예 2 및 도 14b에서 논의되는 바와 같이, 펩티드-항체 단편 컨쥬게이트는 예를 들어, 보체 활성화, 항체-의존성 세포 매개 독성, 유도된 아폽토시스, 또는 이들의 조합에 의해 병원성 항-MIR 항체의 생산에 관여되는 B-세포를 불활성화시키고/거나 그 수를 감소시키는데 유용하다.
일부 구체예에서, 치료되는 대상체는 MG의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 경우에서, 대상체의 치료는 MG의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 없앤다.
일부 구체예에서, 항체를 함유하는 생물학적 유체는 대상체로부터 제거되고, 본원에서 기술된 펩티드 중 하나 이상과 접촉될 수 있다. 다른 구체예에서, 본원에서 기술된 펩티드 중 하나 이상은 대상체에 투여되어 항체와 이의 AChR 표적 간의 결합을 차단함으로써 항체를 중화시키고, 생물학적 유체 중에 존재하는 중화된 복합체는 친화도 혈장분리법과 같은 체외 요법을 사용하여 제거된다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 펩티드 또는 복수의 펩티드는 정맥내, 근육내, 경막내 또는 이들의 조합으로 대상체에 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상체로부터의 생물학적 유체는 고체 지지체 상에 고정화된 펩티드 중 하나 이상과 접촉된다. 고체 지지체는 예를 들어, 멀티웰 플레이트, ELISA 플레이트, 마이크로어레이, 칩, 비드, 컬럼, 다공성 스트립, 막 또는 니트로셀룰로즈 필터일 수 있다. 비드는 키틴을 포함할 수 있다. 고정화는 공유 또는 비공유 결합을 통해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 고정화는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 포획 항체를 통해 이루어진다. 고체 지지체에 부착된 펩티드(들)은 생물학적 유체 내 항체를 포획하는 고정상을 형성하여 병원성 항-AChR 또는 항-MIR 항체의 수준을 감소시키거나 제거한 생물학적 유체를 즉, 이동상으로서 고체 지지체로부터 분리되게 하고, 대상체로 되돌아 가게 한다.
일부 구체예에서, 생체외 처리된 생물학적 유체는 혈장이며, 항체는 당업계에 잘 알려진 방법인 혈장분리법에 의해 제거된다. 혈장은 하나 이상의 고정화된 펩티드를 지닌 고체 지지체와 접촉된다. 혈장 내의 항체는 고정화된 펩티드와 결합한다. 감소되거나 제거된 수준의 항체를 갖는 혈장은 이후 대상체에게 되돌려진다.
항체의 생체외 제거는 MG의 증상이 발병하거나 진단을 받기 전 또는 후에 대상체에서 수행될 수 있다. 생체외 항체 제거 과정은 대상체로부터 항체를 제거 또는 감소시키기 위해 필요에 따라 1, 2, 3, 4회 이상 수행될 수 있다. 항체의 생체 외 제거는 경우에 따라 매일, 매주, 격주, 매월, 격월로 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체에서 항체의 수준은 모니터링되어, 항체의 존재가 소정의 임계치 수준보다 높을 경우에 생체외 항체 제거가 수행된다. 생체외 항체 제거는 경우에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 20, 30, 40, 또는 50주의 기간, 또는 그 보다 길게 또는 짧게 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체의 생체외 제거는 항체의 수준이 소정의 임계치 수준 아래도 떨어질 경우에 중단될 수 있다.
IV. 실시예
본 발명은 특정 실시예에 의해 보다 상세히 기술될 것이다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되는 것이며, 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하려는 것은 아니다. 당업자들은 본질적으로 동일한 결과를 산출하기 위해 변경 또는 변형 될 수 있는 다양한 비임계적 파라미터를 쉽게 인식할 것이다.
실시예 1. 병원성 항- MIR 항체 결합 및 중증 근무력증 치료를 위한 펩티드 생성
본 실시예는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 대한 항체에 결합하는 펩티드의 생성을 기술하고, 펩티드의 일부가 인간 중증 근무력증(MG) 환자로부터 얻은 혈청 샘플에서 병원성 항-MIR 항체에 결합할 수 있음을 보여준다.
서론
니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChR) 주 면역원성 영역(MIR)은 자가 면역 중증 근무력증(MG) 환자에서 많은 병원성 항체(Ab)의 표적이다. 이 질환은 시냅스후 막 폴딩 구조의 파괴 및 이에 따른 AChR 밀도의 상실을 야기한다(1,2). 토르페도 AChR(TAChR)의 2-D 결정 배열에 결합된 단일 클론 Ab(mAb) 35의 단쇄 Fv 및/또는 Fab 단편의 전자 현미경 사진은 MIR이 2개의 AChR 알파 서브유닛 각각의 세포외 영역의 상부에 있음을 나타낸다(3). MIR은 토르페도 및/또는 Electrophorus 전기 기관 AChR에 대해 래트에서 생성된 mAb의 중첩된 에피토프 그룹으로 이루어진다(4-6). 이들 mAb 중 다수가 인간을 포함하는 많은 상이한 종의 AChR과 교차 반응한다(7,8). 항-TAChR mAb인, mAb 132A의 결합은 전형적인 항-MIR 유도 mAb인 mAb 35에 의해 경쟁적으로 억제된다(9). MIR은 토르페도 또는 Electrophorus 전기 기관 AChR에 대해 생성된 mAb의 상당 부분이 이 영역으로 유도되고, 서로의 결합을 상호 억제함에 따라 상당한 관심을 자극하였다(10,11). 또한, 이들 mAb 중 몇몇은 정맥내 주사시 나이브(naive) 래트에게 근무력증 증상을 수동적으로 전이시키는데 특히 효과적인 것으로 보인다. 이 영역은 또한 폴딩된 어셈블링된 AChR에 존재한다는 난제를 나타내지만, 웨스턴 블롯에서 특정 AChR 서브유닛에 결합하는 mAb에 의해 빈번하게 검출되지 않는다. 그러나, mAb 132A는 웨스턴 블롯에 TAChR 알파 서브유닛에 결합하고, 결과적으로 TAChR 알파 서브유닛의 세 개의 비인접 세그먼트인 α(1-12), α(65-79), 및 α(110-115)에 대해 그것의 에피토프를 맵핑하는데 매우 유용하다는 것이 증명되었다(9). TAChR의 Unwin의 4Å 3-D 모델에서 이들 세그먼트를 찾아내는 것(12)은 서로 가깝게 있음을 나타낸다(도 1). α(1-12)는 N 말단 α-나선의 일부이며, MIR의 코어 세그먼트(13)인 α(65-79) 옆에 있다. α(65-79)는 두 개의 코일/β-가닥 레그(strand leg)인, α(65-68)와 α(75-79) 사이에 자리잡고 있는 짧은 나선인, α(69-74)로 이루어진다. α(65-79)는 α(110-115), β-턴(β-turn) 상에 걸쳐진다(12). α(1-12) 및 α(65-79)는 에피토프 인식 부위로서 기능하는 것으로 보이고, α(110-115)는 α(1-12)/α(65-79) 복합체를 안정화시키는 구조적 앵커 역할을 하는 것으로 보인다(9).
실험적 자가면역 중증 근무력증(EAMG) 및 인간 MG 혈청에서 MIR에 대해 유도된 Ab의 병원성 잠재성으로 인해, 토르페도 MIR의 토르페도 39 아미노산(aa) MIR 펩티드 모방체(39MIR)가 합성되고, 특성규명되었다. 모방체는 유연한 GGGS 및 GS 아미노산 링커에 의해 결합된 AChR의 3개의 비인접 세그먼트로 이루어지고, 인테인-키틴 결합 도메인(IChBD)의 아미노 말단에 융합된다(14). 이 모방체는 AChR 자체 와 132A의 복합체의 Kd(3.4 X 10-10 M)와는 대조적으로, mAb 132A를 2.1 X 10-10 M의 Kd로 결합시킨다. 이 펩티드 작제물은 또한 비오티닐화된 mAB 132A의 토르페도 AChR에 대한 결합을 차단하는 EAMG 혈청 내 모든 MIR 유도된 Ab를 흡착할 수 있었다(14). 또 다른 융합 단백질은 인간 및 래트 IgG 항체 중쇄의 힌지의 N-말단에 연결된 39MIR C-말단으로 조작되었다(15). 이들 작제물이 또한 EAMG 혈청에서 MIR 유도된 Ab를 중화시키기 위해 치료학적으로 사용될 수 있거나, 인간 상동체가 MG 혈청에서 MIR-유도된 Ab를 중화시키는데 사용될 수 있다.
또한, 포유 동물 39MIR 상동체가 생산되었다. 포유 동물 MIR 모방체를 만드는 초기 시도는 EAMG 혈청 내 항-TAChR MIR mAb 및 항-TAChR MIR Ab에 의해 인식 된 토르페도 39MIR의 상응하는 위치에 래트/마우스 및 인간 서열을 넣는 것을 포함 하였다. 래트/마우스 및 인간 39MIR은 토르페도 알파 서브유닛으로부터의 것들과 동일한 래트/인간 알파 서브유닛의 세개의 세그먼트: α(1-12), α(65-79), 및 α(110-115)를 포함한다. 토르페도 펩티드와 같이, 이들은 유연한 GGGS 및 GS 링커에 의해 연결된다. 펩티드 상동체를 IChBD 태그에 융합시키고, 키틴 비드 상에 흡착시켜 파쇄된 대장균으로부터 친화성 정제하였다. 인간 상동체는 토르페도 39MIR 서열과는 다른 8개의 아미노산을 함유하는 반면, 래트 상동체는 단지 7 개만을 함유한다(도 2).
AChR MIR은 토르페도와 포유 동물 사이에서 진화적으로 보존되어있다. 토르 페도 및 인간 알파 서브유닛은 80% 서열 유사성을 갖는다(16). 또한, 인간과 토르페도 MIR 모방 세그먼트: α(1-12), α(65-79), 및 α(110-115) 간에는 76%의 서열 유사성이 있다. 전기 기관 AChR에 대해 유발된 일부 MIR-유도된 mAb는 다른 종의 AChR과 교차 반응한다(11). 예를 들어, mAb 35는 토르페도, 소 및 인간의 수용체와 교차 반응한다(8,17,18). 또한, 래트의 토르페도 전기 기관 AChR에 대해 생성된 mAb 132A는 토르페도 MIR에 결합하고, 마우스 및 인간 조직의 신경근 접합부(NMJ)를 착색시키고, 주사시 나이브 래트에서 질병을 일으킨다(7,17). 추가로, EAMG 래트는 래트 MIR에 결합하는 Ab를 생산한다(17-20).
인간 39MIR은 두 mAb 모두가 인간 및 래트/마우스 AChR을 인식한다는 증거에도 불구하고 mAb 35 또는 132A에 결합하지 않는다(4,7). mAb 결합의 상실을 일으키는 아미노산을 확인하기 위해, 토르페도와 인간 39MIR 간에 상이한 위치에서 아미노산을 치환하고, 항-MIR mAb 35, 132A, 198, 334, 및 371A의 결합에 대한 치환 효과를 시험하였다. mAb 35, 132A 및 mAb 198의 결합을 나타내는 두 개의 토르페도/인간 키메라 39MIR를 설계하였다. 또한, 키메라 모방체는 EAMG 혈청 및 인간 MG 혈청으로부터의 Ab를 결합시키고, 항-MIR Ab를 중화시킬 뿐만 아니라 병원성 항-MIR Ab의 생산과 관련된 기억 B-세포를 표적으로 하는 인간 및 래트 IgG 중쇄를 갖는 의사 항-이디오형(pseudo anti-idiotype) Ab 작제물의 생산에 사용될 수 있다.
결론
1. 인간 39MIR 펩티드 모방체는 mAb 198에 의해서는 인식되지만 mAb 35 및 132A에 의해서는 인식되지 않는다.
토르페도(SEQ ID NO:9) 및 인간(SEQ ID NO:8) 39MIR를 각각의 α 서브유닛의 α(1-12), α(65-79) 및 α(110-115) 세그먼트를 GS 링커와 결합시킴으로써 제조하였다. 이들 2개의 MIR 모방체는 키틴 비드 상에서 펩티드 수집을 허용하기 위해 IChBD 태그를 갖는 융합 단백질로서 대장균에서 발현되었다. 이들 두 펩티드는 8개의 아미노산에 의해 서로 상이하다(도 2). 두 모방체 모두를 mAb 198로 조사하였다. 인간 근육 AChR로 면역화된 래트에서 유래된 mAb 198은 포유 동물 뿐만 아니라 토르페도 MIR과 결합하는 MIR-유도 mAb이다(13,21). 또한, 그것은 EAMG를 래트에게 수동적으로 전달하고, 웨스턴 블롯에서 나이브 어셈블링된 AChR 및 α-서브유닛 단편 둘 모두에 결합할 수 있었다(22,23). mAb 198은 웨스턴 블롯에서 토르페도 및 인간 MIR 펩티드 모방체에 결합한다(도 3). 그러나, mAb 198은 인간 MIR 모방체에 비해 약 50배 더 강하게 토르페도 모방체에 결합한다(도 3).
다시 도 3을 참조하면, 인간 39MIR은 웨스턴 블롯에서 mAb 35 또는 132A에 의해 전혀 인식되지 않음을 알 수 있다. 그러나, 두 mAb는 모두 어셈블링된 토르페 도 AChR 및 인간을 비롯한 다양한 종의 AChR에 결합하고(7), 나이브 래트에 질병을 전이시킨다. 이 결과는 아마도 인간 39MIR 모방체가 웨스턴 블롯 포맷에서 토르페도 39MIR과 약간 다르게 폴딩되고, AChR에서 어셈블링된 인간 MIR과 약간 다르게 폴링됨을 시사한다. 이러한 견해에 대한 지지는 또한 4Å AChR 구조(12)에서 추출된 토르페도 39MIR 모방체로부터의 3개의 MIR 세그먼트의 구조와 α-붕가로톡신과 복합체를 이루는 마우스 알파 서브유닛 세포외 도메인의 1.97Å X-선 구조로부터 추출된 3개의 세그먼트의 비교로부터는 나온다. 마우스 39MIR은 토르페도로부터 인간 39MIR과 공통적으로 8개의 아미노산 치환 중 7개를 가지고 있다. 또한, 작은 폴딩 차이에도 불구하고, 두 구조에서 특정 측쇄의 배치에서 차이가 관찰될 수 있다. 예를 들어, 티로신 72는 토르페도 MIR의 세그먼트 중간에서 두드러지게 돌출되어 있는 반면, 마우스 MIR에서 상응하는 세그먼트의 상응하는 잔기는 완전히 묻혀 있다.
2. 토르페도와 인간 39MIR 간의 아미노산 치환의 효과.
토르페도와 인간 AChR MIR 모방체 간의 개별 아미노산 치환의 효과를 조사하기 위해, 8개의 펩티드를 준비하였으며, 각각은 인간 서열로부터 토르페도 서열로 치환된 아미노산을 가졌다. 토르페도 MIR에서 단일 아미노산 치환은 N10K(SEQ ID NO:11), L12F(SEQ ID NO:12), R66K(SEQ ID NO:13), A70D(SEQ ID NO:14), I75V(SEQ ID NO:15), R79H(SEQ ID NO:16), D111Q(SEQ ID NO:17), 및 K115H(SEQ ID NO:18)이다. 서열 정렬이 도 4에 도시된다. 각각이 IChBD 태그에 부착된 이들 펩티드가 대장균 추출물로부터 키틴 비드에서 수거되고, SDS-PAGE 겔에서 이동되고, 도 5에 도시된 웨스턴 블롯에서 5개의 mAb로의 착색을 위해 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮겨졌다. 결합에 대한 효과가 표 1에 기재된다.
mAb 35, 132A 및 334는 모두 항-전기 기관 AChR MIR-유도 mAb이다. mAb 198를, MIR 모방체와 비슷한 정도로 포유 동물 및 토르페도 MIR에 결합된 정제된 인간 AChR에 대해 생성시켰다(14,22,23). 래트 항-플루오레세인 mAb인, mAb 147G는 네거티브 대조군으로서 작용하고, 블롯에서 어느 것과도 결합하지 않는다.
도 5의 웨스턴 블롯(표 1도 참조하라)에서, mAb 35가 I75V, D111Q 또는 K115H 펩티드에 결합하지 않았음을 알 수 있다. mAb 35는 토르페도 39MIR에 대한 결합에 비해 L12F(1.42x) 및 R79H(1.91x) 펩티드에 대한 결합은 개선되었고, N10K(0.29x) 및 R66K(0.62x) 펩티드에 대한 결합은 감소되었다. A70D(0.93x)에 대한 결합은 상대적으로 변하지 않았다.
mAb 132A는 토르페도 39MIR의 mAb 132A 결합에 비해 N10K(0.03x), A70D(0.20x), I75V(0.07x), D111Q(0.07x) 및 K115H(0.40x) 펩티드에 대한 결합은 실질적으로 약화되었고, R66K(1.55x) 및 R79H(1.65x) 펩티드에 대한 결합은 더 강했다(표 1). L12F(1.10x)에 대한 결합은 상대적으로 변하지 않았다.
mAb 198은 N10K(0.82x), I75V(0.16x) 및 D111Q(0.16x) 펩티드에 대한 결합은 감소되었고, 나머지 5개의 키메라 점 돌연변이 펩티드에 대한 결합은 상당히 균일하였다(표 1).
mAb 334은 N10K(0.59x), L12F(0.88x), I75V(0.03x), D111Q(0.02x), 및 K115H(0.42x) 펩티드에 대한 결합은 약화되었고, R66K(2.75x) 및 R79H(2.40x) 펩티드에 대한 결합은 더 강했고, A70D(1.04x) 펩티드에 대한 결합은 변하지 않았다(표 1). 네거티브 대조군인 mAb 147G은 어느 펩티드에도 결합하지 않았다.
N10K, I75V 및 D111Q 치환이 MIR-유도 mAb 결합의 가장 일관된 손상을 초래 하였다. A70D 치환은 주로 mAb 132A의 결합에 영향을 미쳤고, 다른 mAb의 결합에는 영향을 미치지 않았다. K115H 치환은 또한 mAb 35, 132A 및 mAb 334의 결합을 손상 시켰으며, mAb 35 결합을 완전히 없앴다.
3. 최적화된 토르페도/인간 키메라 39MIR 펩티드.
mAb 결합에 대한 이들 아미노산의 기여를 확인하고, 전기 기관 mAb 132A 및 35의 결합을 향상시키기 위한 시도로, 인간 39MIR 펩티드를 점 돌연변이시켜 4개의 위치에서 유사한 토르페도 서열에 상응하는 아미노산 치환을 유도하여 K10N, D70A, V75I 및 Q111D 펩티드(각각 SEQ ID NO:19, 20, 21, 및 22)를 형성하였다(도 6). 인간 39MIR의 단일 점 돌연변이 펩티드 중 3개인 (K10N(0.01), V75I(0.03) 및 Q111D(0.06))가 토르페도 39MIR 펩티드와 비교하여 매우 낮은 수준이기는 하지만 mAb 35 결합을 회복시켰다. D70A 돌연변이 인간 39MIR은 인간 39MIR에 대한 mAb 35의 결합을 회복시키지 못했다. 이들 돌연변이 펩티드 중 어느 것도 mAb 132 결합을 회복시키지 못했다. 인간 39MIR은 원래 mAb 198에 의해 인식되었다. 그러나, K10N(13x), V75I(40x), 및 Q111D(35.7x) 돌연변이가 인간 39MIR에 대한 결합과 비교하여 mAb 198 결합을 크게 개선시켰다. D70A 돌연변이체에 대한 mAb 198 결합은 인간 39MIR에 대한 결합과 유사하였다. 이들 단일 점 돌연변이는 함께 mAb 결합의 상실의 원인이 되지 않는다. 돌연변이의 전부 또는 일부의 조합이 mAb 결합의 상실의 원인이 될 가능성이 더 높다.
또한, 여러 이중 돌연변이체를 MIR-유도 mAb에 대한 결합에 대해 시험하였다. K10N/D70A(SEQ ID NO:23), K10N/V75I(SEQ ID NO:24), K10N/Q111D(SEQ ID NO:25), 및 V75I/Q111D(SEQ ID NO:5) 돌연변이체는 모두 mAb 35, 132A, 및 mAb198와 결합을 회복시켰다(도 7 및 표 2).
K10N//V75I/Q111D 돌연변이체(SEQ ID NO:26)를 위치 70에서 D 아미노산의 기여를 시험하기 위해 제조하였다. 인간 39MIR은 mAb 35 또는 132A에 의해 인식되지 않은 반면, 이 삼중 돌연변이체는 토르페도 39 MIR와 비교할 때 mAb 35(2.97x) 및 132A(2.46x) 둘 모두에 대한 결합을 개선시켰다. 또한, 삼중 돌연변이체는 토르페 도 39 MIR보다 더 양호하게 mAb 198(2.52x)에 결합하여 인간 39MIR에 비해 28배 향상시켰다. 놀랍게도, 이 삼중 돌연변이체는 4개(즉, K10N, D70A, V75I, 및 Q111D)의 모든 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 펩티드보다 mAb를 결합시키는 것이 보다 우수하였다.
삼중 돌연변이체와 마찬가지로, K10N/D70A/V75I/Q111D 돌연변이체(SEQ ID NO:27)는 mAb 35(1.70x) 및 mAb 132A(0.99x)에 대한 결합을 회복시켰다. 또한 mAb 198 인식이 향상되어 인간 39MIR과 비교하여 결합을 11배 향상시켰다(도 7). K10N//V75I/Q111D 삼중 돌연변이체가 MIR-유도 mAb 35, 132A 및 198에 대한 결합에 가장 최적화된 펩티드인 것으로 나타났다. 결과가 표 2에 요약된다.
4. 인간 MG 혈청에서 항체의 펩티드 인식.
토르페도 39MIR, 인간 39MIR, K10N/V75I/Q111D 삼중 돌연변이체 및 K10N/D70A/V75I/Q111D 사중 돌연변이체 펩티드의 His-태깅된 변이체를 발현시키고 인간 MG 혈청 샘플의 항체와의 결합을 조사하였다. 펩티드를 멤브레인 상에 도트-블롯팅시키고, 본 발명자들의 인간 MG 혈청 라이브러리에서 항체와의 결합을 조사하였다. 토르페도 39MIR 및 인간 39MIR 펩타이드는 MG 혈청 샘플의 어떠한 항체에도 결합하지 않았다. 그러나, K10N//V75I/Q111D 및 K10N/D70A/V75I/Q111D His-태깅된 펩티드 둘 모두 인간 혈청의 항체에 결합하였다. 놀랍게도, 본 발명자들의 병원성 mAb 라이브러리에 보다 높은 친화도를 갖는 삼중 돌연변이체(SEQ ID NO:26)는 단지 어느 한 MG 혈청 샘플의 항체에 결합한 반면, 사중 돌연변이체 펩티드(SEQ ID NO:27)는 본 발명자들의 인간 MG 혈청 샘플의 항체에 결합할 수 있었다. His-태깅된 펩티드 중 어느 것도 정상 인간 혈청 샘플의 임의의 항체에 결합하지 않았다(도 11). 삼중 돌연변이체 펩티드(SEQ ID NO:26)는 mAb 35, mAb 132A, 및 mAb 198에 전체적으로 더 잘 결합하였지만, 사중 돌연변이체 펩티드(SEQ ID NO:27)는 MG 혈청에서 항체 결합이 더 우수하였다. 펩티드가 MG 혈청 샘플에서 병원성 MIR-유도 mAb에 결합할 수 있다는 것은 MG의 치료에 치료적 잠재력을 가짐을 보여준다.
토르페도 및 포유 동물 MIR 구조는 mAb 인식에 영향을 미치기에 충분히 다를 수 있다. 토르페도 MIR 및 포유 동물 MIR의 검사는 중요한 MIR 아미노산의 배향 및 접근 가능성에서 뚜렷한 차이점을 보여준다. 토르페도 알파 서브유닛으로부터의 3개의 MIR 세그먼트는 마우스로부터의 그러한 세그먼트보다 더 느슨하게 패킹되고, 토르페도 N 말단 나선은 마우스 N-말단 나선보다 클러스터로부터 더 돌출된다(도 8). 코어 MIR 세그먼트를 AChR α(67-76)에 맵핑시켰다((5,13). 이 아미노산 클러스터는 토르페도 및 마우스 구조 둘 모두에서 치밀하게 패킹되고, 표면에 접근 가능하다. 그러나, MIR에서의 그들의 구조적 정렬은 아주 상이하다. 코어 MIR은 MIR-유도 mAb 인식에 필수적이다. 토르페도 코어 MIR은 ECD에서 훨씬 더 중앙에 위치하는 반면, 마우스 코어 MIR은 마우스 ECD 구조에서 최상부에 위치한다(도 9). 이러한 코어 MIR의 차이는 인간 39MIR에 대한 mAb 35 및 132A 결합의 결핍을 설명할 수 있다.
진화론적으로 보존된 MIR은 mAb 198이 토르페도 39MIR과 인간 39MIR에 결합할 수 있다는 발견과 관련이 있다. MIR 펩티드 모방체는 아미노산의 차이에도 불구하고 mAb 198에 의해 인식되는 에피토프를 나타내는 구조로 리폴딩된다. mAb 198와는 달리, mAb 35 및 mAb 132A는 인간 또는 래트 39 MIR 모방체와 결합하지 않았다. 두 mAb 모두 포유 동물의 시냅스에 결합하여 나이브 래트에서 EAMG를 수동적으로 전이시키기 때문에 폴딩되고, 어셈블링된 나이브 포유 동물 AChR에서 포유 동물 MIR에 결합한다(7,17,20). 완전히 다른 에피토프 대신에, mA는 토르페도 및 인간 MIR 간에 상이한 잔기에 대해 상이한 선호도를 가질 수 있다. 이들은 중요한 접촉을 방해할 수 있다. 또한, 인간 MIR 모방체가 토르페도 MIR 모방체보다 더 안정적이고, 따라서 mAb 35 및 132A가 인식하는 하위 상태를 나타내지 않는 대안의 보다 작은 구조를 채택할 가능성이 있다.
mAb 35 및 mAb 132A는 둘 모두 TAChR과 결합하고 래트/마우스 및 인간 시냅스에 결합하여 포유 동물 신경근 접합부 뿐만 아니라 토르페도 전기 기관에서의 에피토프의 존재를 시사한다(7). 두 mAb가 토르페도와 결합하지만 인간 MIR 모방체과는 결합하지 않았다는 사실은 놀랍다. 특정 중요 잔기의 배향에서 작지만 중요한 차이가 있을 가능성이 있으며, 이러한 잔기의 표면 노출 상실은 어느 한 mAb에는 중요 할 수 있지만 다른 mAb에는 중요하지 않을 수 있다.
토르페도와 인간 MIR 사이의 8개 아미노산 차이는 mAb 35 및 132A에 의해 모방체를 인식할 수 없게 만들 정도로 충분하였다(도 3). 소수의 아미노산이 mAb 에피토프를 결정하고, 이러한 중요한 아미노산의 변화가 mAb 결합에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, K10, I75 및 D111은 시험 된 모든 mAb에 대해 중요하며, 이는 상동 인간 아미노산으로의 치환이 초기에 전기 기관 AChR에 대해 생성된 mAb의 결합을 현저히 감소시키기 때문이다. 또한, I75 및 D111 돌연변이는 mAb 35에 의한 돌연변이된 모방체에 대한 결합의 완전한 상실을 야기하였다.
I75V 및 D111Q 돌연변이된 펩티드는 MIR-유도 mAb 결합에 대해 가장 극적인 전체 효과를 나타냈다. 인간 39MIR은 각각의 가장 해로운 점 돌연변이로 역돌연변이되었다. 그러나, 단일 역돌연변이 중 어느 것도 mAb 132A 결합을 회복시키지 못한 반면, K10N, V75I, 및 Q111D 돌연변이는 mAb 35 결합을 회복시켰다. 단일 점 돌연변이는 인간 39MIR에 비해 mAb 198 결합을 개선시켰다. 개별적으로 돌연변이가 mAb 결합을 크게 회복시키지는 않았지만, 쌍별 돌연변이는 mAb 35 및 132A에 대한 결합을 회복시키기 시작하였다. K10N/V75I/Q111D 돌연변이체는 토르페도 39MIR과 비교하여 mAb 35와 198에 대한 향상된 결합을 나타냈다. K10N/D70A/V75I/Q111D 돌연변이체는 토르페도 39MIR에 비해 항-MIR mAb 결합을 향상시키지 않았다. 위치 70에서 알라닌은 mAb 결합을 감소시킨다. 아스파르트산으로부터의 양전하는 mAb 결합에 중요하다. 단일 치환이 mAb 132A 결합을 회복시키지 않았지만, 2개 이상의 치환의 조합이 부분 mAb 결합을 회복시킬 수 있었다. mAb 결합에 대한 V75I 돌연변이의 영향은 놀라웠다. 돌연변이는 소수성 아미노산에서 약간 더 큰 소수성 아미노산으로 변하는 사소한 변화였다. K10N 및 D70A 치환은 둘 모두 인간 39MIR로부터 전하를 제거한다.
표 1. 도 5의 웨스턴 블롯의 요약. 수치 값은 토르페도 39MIR에 대한 결합의 배수 변화를 나타냄. '-'는 결합이 없음을 표시함.
Figure 112019035332426-pct00001
표 2. 도 7의 웨스턴 블롯의 요약. 수치 값은 토르페도 39MIR에 대한 결합의 배수 변화를 나타냄. '-'는 결합이 없음을 표시함.
Figure 112019035332426-pct00002
표 3. 단일-치환 인간 39MIR 돌연변이체에 의한 결합의 요약. 수치 값은 토 르페도 39MIR에 대한 결합의 배수 변화를 나타냄. '-'는 결합이 없음을 표시함.
Figure 112019035332426-pct00003
참고문헌
Figure 112019035332426-pct00004
Figure 112019035332426-pct00005
Figure 112019035332426-pct00006
실시예 2. 중증 근무력증의 치료를 위한 Fc -융합 단백질
본 실시예는 본 발명의 펩티드 및 중증 근무력증(MG)의 예방 또는 치료에 적합한 항체 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 설계 및 생성을 나타낸다.
서론
MG 환자의 혈청에서 항-아세틸콜린 수용체(AChR) 항체(Ab)의 70% 이상을 AChR의 주 면역원성 영역(MIR)으로 유도한다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 토르페도 및 인간 MIR 펩티드의 부분(각각 SEQ. ID NO:8 및 9)을 조합하여 설계되었다(SEQ ID NO:27). 이 펩티드는 래트로부터 유래된 항-MIR 단일 클론 항체(mAb)에 결합하고 MG 환자 혈청의 Ab의 일부분에도 결합한다.
결론
키메라 토르페도-인간 펩타이드(SEQ ID NO:27)를 항체 Fc 도메인에 융합시키는 컨쥬게이트가 조작되었다(도 12b). 도 13의 웨스턴 블롯은, 토르페도- 및 인간-기반 펩티드-Fc 컨쥬게이트(즉, 항체 Fc 도메인에 융합된 EQ ID NO; 8 및 9의 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트)는 병원성 mAb 132A 및 198에 결합하지 않지만, 키메라 펩티드-Fc 컨쥬게이트(즉, 항체 Fc 도메인에 융합된 SEQ ID NO:27의 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트)는 두 mAb를 인식하고 결합함을 보여준다. 이것은 키메라 컨쥬게이트가 MG 환자 혈청에서 병원성 Ab를 결합하고 중화시킬 수 있음을 보여준다.
이러한 결과는 본 발명의 펩티드-Fc 컨쥬게이트(예컨대, 항체 Fc 영역에 융합된 SEQ ID NO:27의 펩티드)가 MG의 예방 또는 치료에 유용함을 보여준다. 병원성 항-MIR Ab의 결합 부위에 결합하고 차단할 수 있는 인식 도메인으로서 작용하는 것(도 14a) 이외에, 컨쥬게이트는 또한 MG의 병원성 항-MIR Ab 생성의 원인이 되는 기억 B-세포 상의 B-세포 수용체를 표적으로 할 수 있다(도 14b). 작제물은 B-세포에 결합하여, 보체 활성화, 항체-의존성 세포 매개 세포독성 치사 또는 FcγRIIb 수용체에 대한 B-세포 수용체의 가교를 통해 면역 시스템 파괴를 유도하여 아폽토시스를 유도할 수 있다. 따라서, 컨쥬게이트는 모든 적응 면역 반응을 억제하기 보다는 병원성 Ab 반응 만을 항원-특이적 방식으로 불활성화시키는데 유용하다.
V. 예시적 구체예
본 발명의 개시된 주제에 따라 제공되는 예시적인 구체예는 청구 범위 및 다음의 구체예를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다:
1. 아미노산 서열 SEHETRLVAX1LFZ1LKWNPX2DYGGX3KKIHZ2LX4YTGH(SEQ ID NO:31), 및 X1, X2, X3, 및 X4로 이루어진 군으로부터 선택된 두 개 이상의 위치에서 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 아미노산 변형을 포함하는 분리된 펩티드로서, X1, X2, X3, 및 X4는 독립적으로 선택된 아미노산이고, Z1 및 Z2는 독립적으로 선택된 아미노산을 포함하는 독립적인 길이의 링커 서열인 펩티드.
2. 구체예 1에 있어서, 아미노산 변형이 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X2에서 존재하는 펩티드.
3. 구체예 2에 있어서, X1은 N이고, X2는 A이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2(SEQ ID NO:2)인 펩티드.
4. 구체예 1에 있어서, 아미노산 변형이 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X3에서 존재하는 펩티드.
5. 구체예 4에 있어서, X1은 N이고, X3는 I이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2(SEQ ID NO:3)인 펩티드.
6. 구체예 1에 있어서, 아미노산 변형이 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1 및 X4에서 존재하는 펩티드.
7. 구체예 6에 있어서, X1은 N이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2(SEQ ID NO:4)인 펩티드.
8. 구체예 1에 있어서, 아미노산 변형이 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X3 및 X4에서 존재하는 펩티드.
9. 구체예 8에 있어서, 아미노산 서열이 SEQ ID NO:5가 아닌 펩티드.
10. 구체예 1에 있어서, 아미노산 변형이 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1, X3 및 X4에서 존재하는 펩티드.
11. 구체예 10에 있어서, X1은 N이고, X3는 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2(SEQ ID NO:6)인 펩티드.
12. 구체예 1에 있어서, 아미노산 변형이 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열에 대해 X1, X2, X3 및 X4에서 존재하는 펩티드.
13. 구체예 12에 있어서, X1은 N이고, X2는 A이고, X3는 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2(SEQ ID NO:7)인 펩티드.
14. 구체예 1 내지 구체예 13 중 어느 하나에 있어서, 펩티드가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 항체에 결합하는 펩티드.
15. 구체예 1 내지 구체예 14 중 어느 하나에 있어서, 인테인-키틴 결합 도메인 태그를 추가로 포함하는 펩티드.
16. 구체예 1 내지 구체예 15 중 어느 하나에 있어서, 헥사히스티딘 태그를 추가로 포함하는 펩티드.
17. 구체예 1 내지 구체예 16 중 어느 하나에 있어서, 펩티드에 컨쥬게이션된 항체 중쇄 단편을 추가로 포함하는 펩티드.
18. 구체예 17에 있어서, 항체가 인간 면역글로불린 G인 펩티드.
19. 구체예 17 또는 구체예 18에 있어서, 중쇄 단편의 힌지 영역이 펩티드의 C-말단에 컨쥬게이션되는 펩티드.
20. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 포함하는 조성물.
21. 구체예 20에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를추가로 포함하는 조성물.
22. 구체예 20 또는 구체예 21에 있어서, 복수의 펩티드가 적어도 2, 3, 4, 또는 5개의 상이한 펩티드를 포함하는 조성물.
23. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나의 펩티드 또는 복수의 펩티드 및 고체 지지체를 포함하는 키트.
24. 구체예 23에 있어서, 고체 지지체가 멀티웰 플레이트(multiwell plate), ELISA 플레이트, 마이크로어레이(microarray), 칩, 비드, 다공성 스트립 또는 니트로셀룰로즈 필터(nitrocellulose filter)인 키트.
25. 구체예 24에 있어서, 비드가 키틴을 포함하는 키트.
26. 구체예 23 내지 구체예 25 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 또는 복수의 펩티드가 고체 지지체 상에 고정화되는 키트.
27. 구체예 23 내지 구체예 26 중 어느 하나에 있어서, 복수의 펩티드가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 동일한 항체 또는 상이한 항체에 결합하는 키트.
28. 구체예 23 내지 구체예 27 중 어느 하나에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
29. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나의 분리된 펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산.
30. 대상체에서 중증 근무력증(MG)의 중증도를 탐지하거나 결정하는 방법으로서, 방법이 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나의 펩티드 또는 복수의 펩티드에 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 탐지하는 것을 포함하고, 상기 펩티드 또는 복수의 펩티드에 결합하는 항체의 존재가 MG의 존재 또는 증가된 중증도를 나타내는 방법.
31. 구체예 30에 있어서, 항체가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 방법.
32. 구체예 30 또는 구체예 31에 있어서, 펩티드 또는 복수의 펩티드가 SEQ ID NO:2, 3, 4, 6, 및 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
33. 구체예 30 내지 구체예 32 중 어느 하나에 있어서, 방법이 대상체로부터 샘플을 얻는 것을 추가로 포함하는 방법.
34. 구체예 30 내지 구체예 33 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 전혈, 혈청 또는 혈장인 방법.
35. 구체예 30 내지 구체예 34 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 또는 복수의 펩티드가 고체 지지체에 부착되는 방법.
36. 구체예 35에 있어서, 고체 지지체가 멀티웰 플레이트, ELISA 플레이트, 마이크로어레이, 칩, 비드, 다공성 스트립, 또는 니트로셀룰로즈 필터인 방법.
37. 구체예 36에 있어서, 비드가 키틴을 포함하는 방법.
38. 구체예 30 내지 구체예 37 중 어느 하나에 있어서, 항체가 웨스턴 블롯(Western blot), 도트 블롯(dot blot), ELISA, 방사면역측정법(radioimmunoassay), 면역침전법(immunoprecipitation), 전기화학발광법(electrochemiluminescence), 면역형광법(immunofluorescence), FACS 분석법, 또는 멀티플렉스 비드 분석법(multiplex bead assay)에 의해 검출되는 방법.
39. 구체예 30 내지 구체예 38 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 대조군과 비교되는 방법.
40. 구체예 39에 있어서, 대조군이 MG를 갖지 않은 대상체로부터 얻어지는 방법.
41.구체예 39에 있어서, 대조군이 MG의 증상이 발병하기 전 또는 MG에 대한 치료를 받은 후에 대상체로부터 얻어지는 방법.
42. 대상체에서 중증 근무력증(MG)을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 방법이 치료 유효량의 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 펩티드 또는 복수의 펩티드가 대상체에서 순환하는 항체에 결합하여 중화 복합체를 형성함으로써 MG를 예방하거나 치료하는 방법.
43. 구체예 42에 있어서, 순환하는 항체가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 방법.
44. 구체예 42 또는 구체예 43에 있어서, 펩티드 또는 복수의 펩티드가 SEQ ID NO:2, 3, 4, 6, 및 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
45. 구체예 42 내지 구체예 44 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 또는 복수의 펩티드가 AChR의 MIR에 결합하는 항체를 생성하는 기억 B-세포를 불활성화시키거나 그 수를 감소시키는 방법.
46. 구체예 42 내지 구체예 45 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 MG의 증상을 나타내는 방법.
47. 구체예 46에 있어서, 대상체를 치료하는 것이 MG 증상을 감소시키는 방법.
48. 구체예 42 내지 구체예 47 중 어느 하나에 있어서, 대상체로부터 중화 복합체를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
49. 구체예 48에 있어서, 중화 복합체가 친화도 혈장분리법(affinity plasmapheresis)에 의해 제거되는 방법.
50. 구체예 42 내지 구체예 49 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 또는 복수의 펩티드가 정맥내, 근육내 또는 이들의 조합으로 투여되는 방법.
본원에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며, 이에 대한 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며 본 출원의 사상 및 첨부되는 청구범위의 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 서열 참조 번호는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고 문헌으로 포함된다.
비공식 서열 목록
표 4. 펩티드 서열
Figure 112019035332426-pct00007
Figure 112019035332426-pct00008
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California <120> PEPTIDES AND USES THEREOF FOR DIAGNOSING AND TREATING MYASTHENIA GRAVIS <130> 1060227 <140> PCT/US17/50521 <141> 2017-09-07 <150> US 62/384,896 <151> 2016-09-08 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(112) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(227) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <400> 1 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Leu Gln Tyr Thr Gly His 225 230 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(112) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(227) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <400> 2 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Leu Lys Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Leu Gln Tyr Thr Gly His 225 230 <210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(112) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(227) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <400> 3 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Leu Gln Tyr Thr Gly His 225 230 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(112) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(227) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <400> 4 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Leu Asp Tyr Thr Gly His 225 230 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 5 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(112) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(227) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <400> 6 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Leu Asp Tyr Thr Gly His 225 230 <210> 7 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(112) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(227) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <400> 7 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Leu Lys Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Leu Asp Tyr Thr Gly His 225 230 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 8 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly His 35 <210> 9 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 9 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 10 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 11 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 11 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 12 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 13 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 14 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 15 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 16 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 17 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 17 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly Lys 35 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 18 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 19 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly His 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 20 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly His 35 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 21 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly His 35 <210> 22 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 22 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 23 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 23 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly His 35 <210> 24 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 24 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly His 35 <210> 25 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 25 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 26 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 26 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 27 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 27 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 28 <211> 161 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Torpedo sp. <400> 28 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Glu Asn Tyr Asn 1 5 10 15 Lys Val Ile Arg Pro Val Glu His His Thr His Phe Val Asp Ile Thr 20 25 30 Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Ser Val Asp Glu Val Asn Gln 35 40 45 Ile Val Glu Thr Asn Val Arg Leu Arg Gln Gln Trp Ile Asp Val Arg 50 55 60 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile Arg Leu 65 70 75 80 Pro Ser Asp Asp Val Trp Leu Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala 85 90 95 Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val His Met Thr Lys Leu Leu Leu Asp Tyr 100 105 110 Thr Gly Lys Ile Met Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser Tyr Cys 115 120 125 Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Gln Gln Asn Cys Thr Met 130 135 140 Lys Leu Gly Ile Trp Thr Tyr Asp Gly Thr Lys Val Ser Ile Ser Pro 145 150 155 160 Glu <210> 29 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 29 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Asn Leu Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Arg Trp Asn Pro Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Asp Tyr Thr Gly His 35 <210> 30 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <400> 30 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys Lys Ile His Gly 20 25 30 Ser Leu Gln Tyr Thr Gly His 35 <210> 31 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic main immunogenic region (MIR) peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is any amino acid; preferably Xaa is Asn or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(112) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (118)..(118) <223> Xaa is any amino acid; preferably Xaa is Ala or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (123)..(123) <223> Xaa is any amino acid; preferably Xaa is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (129)..(227) <223> Xaa is any amino acid; Xaa may be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (229)..(229) <223> Xaa is any amino acid; preferably Xaa is Asp or Gln <400> 31 Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Xaa Leu Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Leu Lys Trp Asn Pro Xaa Asp Tyr Gly Gly Xaa Lys Lys Ile His Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Thr Gly His 225 230 <210> 32 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic linker peptide <400> 32 Gly Gly Gly Ser 1

Claims (50)

  1. SEQ ID NO:31에 기재된 아미노산 서열 SEHETRLVAX1LFZ1LKWNPX2DYGGX3KKIHZ2LX4YTGH를 포함하는 분리된 펩티드로서,
    (a) SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같이 X1은 N이고, X2는 D이고, X3은 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이거나;
    (b) SEQ ID NO:7에 기재된 바와 같이 X1은 N이고, X2는 A이고, X3은 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이고,
    Z1 및 Z2는 독립적으로 선택된 아미노산으로 구성된 링커 서열인 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:27의 서열을 포함하는, 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 항체에 결합하는 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 인테인-키틴 결합 도메인 태그(intein-chitin binding domain tag); 또는
    (b) 헥사히스티딘 태그를 추가로 포함하는 펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드에 컨쥬게이션된 항체 중쇄 단편을 추가로 포함하는, 펩티드.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 항체 중쇄 단편은 Fc 도메인을 포함하거나;
    (b) 항체가 인간 면역글로불린 G, 면역글로불린 A, 면역글로불린 D, 면역글로불린 E, 면역글로불린 M, 또는 이들의 조합이거나; 또는
    (c) 중쇄 단편의 힌지 영역이 펩티드의 C-말단에 컨쥬게이션되는 것인 펩티드.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 포함하는, 중증 근무력증(myasthenia gravis)(MG)을 치료하기 위한 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 복수의 펩티드 및 고체 지지체를 포함하는, 중증 근무력증을 치료하기 위한 키트(kit).
  10. 제9항에 있어서,
    (a) 고체 지지체가 멀티웰 플레이트(multiwell plate), ELISA 플레이트, 마이크로어레이(microarray), 칩, 비드, 다공성 스트립 또는 니트로셀룰로즈 필터(nitrocellulose filter)이거나;
    (b) 펩티드 또는 복수의 펩티드가 고체 지지체 상에 고정화되거나;
    (c) 복수의 펩티드가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하는 동일한 항체 또는 상이한 항체에 결합하거나; 또는
    (d) 상기 키트가 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 상기 펩티드 또는 복수의 펩티드에 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 탐지하는 방법에 사용하기 위한 것이고,
    상기 방법은
    (a) 상기 생물학적 샘플을 상기 펩티드 또는 복수의 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 웨스턴 블롯(Western blot), 도트 블롯(dot blot), ELISA, 방사면역측정법(radioimmunoassay), 면역침전법(immunoprecipitation), 전기화학발광법(electrochemiluminescence), 면역형광법(immunofluorescence), FACS 분석법, 또는 멀티플렉스 비드 분석법(multiplex bead assay)을 사용하여 결합된 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    (a) 항체가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하거나;
    (b) 방법이 대상체로부터 비수술적으로 샘플을 얻는 것을 추가로 포함하거나;
    (c) 샘플이 전혈, 혈청 또는 혈장이거나;
    (d) 펩티드 또는 복수의 펩티드가 고체 지지체에 부착되거나; 또는
    (e) 샘플이 대조군과 비교되는 것인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 고체 지지체가 멀티웰 플레이트(multiwell plate), ELISA 플레이트, 마이크로어레이(microarray), 칩, 비드, 다공성 스트립 또는 니트로셀룰로즈 필터(nitrocellulose filter)인 조성물.
  15. 제13항에 있어서, (i) 대조군은 MG를 갖지 않는 대상체로부터 얻어지거나; 또는 (ii) 대조군은 MG의 증상이 발병하기 전 또는 MG에 대한 치료를 받은 후에 대상체로부터 얻어진 것인 조성물.
  16. (i) SEQ ID NO:31에 기재된 아미노산 서열 SEHETRLVAX1LFZ1LKWNPX2DYGGX3KKIHZ2LX4YTGH를 포함하는 펩티드로서,
    (a) SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같이 X1은 N이고, X2는 D이고, X3은 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이거나;
    (b) SEQ ID NO:7에 기재된 바와 같이 X1은 N이고, X2는 A이고, X3은 I이고, X4는 D이고, Z1의 길이는 4이고, Z2의 길이는 2이고,
    Z1 및 Z2는 독립적으로 선택된 아미노산으로 구성된 링커 서열인 펩티드; 및
    (ii) 항체 중쇄 단편을 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 중쇄 단편은 Fc 도메인을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 펩티드는 SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:27의 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    (a) 항체가 인간 면역글로불린 G, 면역글로불린 A, 면역글로불린 D, 면역글로불린 E, 면역글로불린 M, 또는 이들의 조합이거나; 또는
    (b) 항체 중쇄 단편이 펩티드의 C-말단에 컨쥬게이션되는 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드는 대상체에서 중증 근무력증(MG)을 예방하거나 치료하는 방법에 사용되며,
    상기 방법은 치료 유효량의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 펩티드 또는 복수의 펩티드가 대상체에서 순환하는 항체에 결합하여 중화 복합체를 형성함으로써 MG를 예방하거나 치료하는 것인 펩티드.
  20. 제19항에 있어서,
    (a) 순환하는 항체가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하거나;
    (b) 펩티드 또는 복수의 펩티드가 AChR의 MIR에 결합하는 항체를 생성하는 기억 B-세포를 불활성화시키거나 그 수를 감소시키거나;
    (c) 대상체가 MG의 증상을 나타내거나;
    (d) 상기 방법은 대상체로부터 중화 복합체를 제거하는 것을 추가로 포함하거나; 또는
    (e) 펩티드 또는 복수의 펩티드가 정맥내, 근육내 또는 이들의 조합으로 투여되는, 펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 대상체를 치료하는 것은 MG 증상의 감소로 귀결되는 것인, 펩티드.
  22. 제20항에 있어서, 중화 복합체는 친화도 혈장분리법(affinity plasmapheresis)에 의해 제거되는 것인, 펩티드.
  23. 대상체에서 중증 근무력증(MG)을 예방하거나 치료하는 방법에 사용되기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 복수의 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 방법은 치료 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 펩티드 또는 복수의 펩티드가 대상체에서 순환하는 항체에 결합하여 중화 복합체를 형성함으로써 MG를 예방하거나 치료하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    (a) 순환하는 항체가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하거나;
    (b) 상기 조성물이 AChR의 MIR에 결합하는 항체를 생성하는 기억 B-세포를 불활성화시키거나 그 수를 감소시키거나;
    (c) 대상체가 MG의 증상을 나타내거나;
    (d) 상기 방법은 대상체로부터 중화 복합체를 제거하는 것을 추가로 포함하거나; 또는
    (e) 상기 조성물이 정맥내, 근육내 또는 이들의 조합으로 투여되는, 조성물.
  25. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    융합 단백질은 대상체에서 중증 근무력증(MG)을 예방하거나 치료하는 방법에 사용되기 위한 것이고,
    상기 방법은 치료 유효량의 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 융합 단백질은 대상체에서 순환하는 항체에 결합하여 중화 복합체를 형성함으로써 MG를 예방하거나 치료하는 융합 단백질.
  26. 제25항에 있어서,
    (a) 순환하는 항체가 아세틸콜린 수용체(AChR)의 주 면역원성 영역(MIR)에 결합하거나;
    (b) 융합 단백질은 AChR의 MIR에 결합하는 항체를 생성하는 기억 B-세포를 불활성화시키거나 그 수를 감소시키거나;
    (c) 대상체가 MG의 증상을 나타내거나;
    (d) 상기 방법은 대상체로부터 중화 복합체를 제거하는 것을 추가로 포함하거나; 또는
    (e) 융합 단백질은 정맥내, 근육내 또는 이들의 조합으로 투여되는, 융합 단백질.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3036130A1 (en) 2016-09-08 2018-03-15 The Regents Of The University Of California Peptides and uses thereof for diagnosing and treating myasthenia gravis
US11986536B2 (en) 2019-03-23 2024-05-21 Ablevia Biotech Gmbh Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient
EP3715374A1 (en) 2019-03-23 2020-09-30 Ablevia biotech GmbH Compound for the sequestration of undesirable antibodies in a patient
KR20220007675A (ko) * 2019-05-13 2022-01-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 아세틸콜린 수용체 키메라 자가항체 수용체 세포의 조성물 및 방법
US20230212300A1 (en) * 2020-05-20 2023-07-06 Remd Biotherapeutics, Inc. Human endothelin receptor a (etar) antagonist antibodies
CN112029880B (zh) * 2020-09-15 2023-04-28 石家庄市人民医院(石家庄市第一医院、石家庄市肿瘤医院、河北省重症肌无力医院、石家庄市心血管病医院) 用于重症肌无力的检测的微生物及应用
US20230381328A1 (en) 2020-09-24 2023-11-30 Ablevia Biotech Gmbh Compound for the prevention or treatment of myasthenia gravis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003509045A (ja) 1999-09-15 2003-03-11 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ ニコチン性アセチルコリン受容体：アルファ１０サブユニット
JP2007183176A (ja) 2006-01-06 2007-07-19 Ind Technol Res Inst 重症筋無力症の診断方法およびそのキット
JP2011032188A (ja) 2009-07-30 2011-02-17 Nihon Pharmaceutical Co Ltd 融合蛋白質

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3391831B2 (ja) * 1993-01-13 2003-03-31 株式会社クラレ 環状ペプチド
US20020081652A1 (en) * 1997-05-07 2002-06-27 Sara Fuchs Recombinant fragments of the human acetylcholine receptor and their use for treatment of myasthenia gravis
CZ20023586A3 (cs) * 2000-03-31 2003-09-17 Corixa Corporation Přípravky obsahující izolované potenciálně imunodominantní peptidy z podjednotky alfa acetylcholinového receptoru
US8530245B2 (en) * 2008-07-29 2013-09-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions related to acetylocholine receptor conjugates
CA3036130A1 (en) 2016-09-08 2018-03-15 The Regents Of The University Of California Peptides and uses thereof for diagnosing and treating myasthenia gravis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003509045A (ja) 1999-09-15 2003-03-11 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ ニコチン性アセチルコリン受容体：アルファ１０サブユニット
JP2007183176A (ja) 2006-01-06 2007-07-19 Ind Technol Res Inst 重症筋無力症の診断方法およびそのキット
JP2011032188A (ja) 2009-07-30 2011-02-17 Nihon Pharmaceutical Co Ltd 融合蛋白質

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Vu Bao Trin, "Therapeutic peptide mimics of the acetylcholine receptor main immunogenic region for treating myasthenia gravis" In: "Ph.D. Thesis. University of California"(2013.01.01.) 1부.*

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