WO2004087761A1

WO2004087761A1 - ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製

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Abstract

主として治療の用途に使用する、場合によっては、診断および試薬の用途に使用するヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の分離・精製方法を提供し、少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法、　（１）陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および　（２）（１）に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、およびヒト抗体と偶蹄目の動物の抗体を含有する混合物から、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いたpHグラージェントにより該ヒト抗体と該偶蹄目の動物の抗体を分離する方法を提供する。

Description

ヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体の精製技術分野 .

本発明は、抗体精製に関する。より詳細には本発明は主として治療の用途に使用する、場合によっては、診断および試薬の用途に使用するヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクロ一ナル抗体の分離 ·精製方法に関する。背景技術

( 1 ) モノクローナル抗体の精製

抗体の精製においては一般的に Prote in Aカラムが用いられている。近年注目されている抗体医薬、例えばモノクローナル抗体医薬の場合には、治療に用いるために高純度が要求されている。従って、抗体医薬の精製プロセスでは一般に、 Prote in Aア^ ィニティークロマトグラフィーに加えて、コンベンショナルなク口マトグラフィーモード（ゲルろ過、イオン交換、疎水など）による精製が行われている。

例えば、 Rhona Μ· O' Learyらは Protein Aァフィ二ティークロマトグラフィー —陽イオン交換クロマトグラフィ一"陰イオン交換クロマトグラフィーのシークンスで治療用抗体の精製を行っている（BioPharm, September 2001, 10-18) 。しかしながら、この精製方法における「陽イオン交換クロマトグラフィ一"陰ィオン交換クロマトグラフィー」という順番でのカラムの組み合わせでは以下の問題点がある。すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィーに陽イオン交換クロマトグラフィ一での抗体溶出液を供する前に、該抗体溶出液のイオン強度を下げるための希釈（通常は、導電率 5 mS/cm以下）が必要となる。その結果本希釈工程は一連の精製プロセスにおいて例えば、 ①希釈溶液が必要となる、 ②希釈による容量増加の結果装置が大型化する、 ③作業が長時間化する、などの問題を生じる。該希釈工程が必要なのは、陽イオン交換クロマトグラフィーが一般にイオン強度を上げて溶出させる方法であるのに対して、次工程の陰イオン交換クロマトダラフィ一では一般にイオン強度を下げて、抗体を陰イオンカラムから素通りさせて、不純物は陰イオンカラムに吸着させる、という原理に基づいているからである。

( 2 ) 非ヒト動物ポリクローナル抗体からのヒト抗体の精製

ヒト抗体を産生する方法として種々の方法が開発されている。例えば、動物細胞にヒト抗体をコードする DNAを導入することにより、該動物細胞で該ヒト抗体を産生することができる。この場合、該動物細胞の培養には通常非ヒト動物血清を添加するので、該ヒト抗体を含む該動物細胞の培養上清中には、該非ヒト動物抗体が含まれている。

また、ヒトの抗体の遺伝子座を導入したトランスジエニック非ヒト動物が作出されており、該動物を抗原で免疫することにより、該動物中で前記抗原に対するヒト抗体が産生される。しかし、免疫された該動物の体液、例えば乳液あるいは血液、にはヒト抗体だけではなく、該動物自体の抗体も含まれている。

ヒト抗体産生細胞が産生するヒト抗体を精製するにあたり、非ヒト動物由来抗体を含有する血清成分を含む培地から、該ヒト抗体を分離する必要がある。またヒト抗体産生能力を有するトランスジエニック非ヒト動物の体液、例えば乳液あるいは血液、から該ヒト抗体を精製するにあたり、該トランスジエニック非ヒト動物由来の抗体を含有する体液から該ヒト抗体を分離する必要がある。

例えば、マウスモノクローナル抗体とゥシ血清由来のゥシ IgGの分離において、疎水性クロマトグラフィーが用いられる。（Grunfeld Hら、 J Immunol Methods 1997 201 (2) ) 。また、 Protein Aァフィ二ティークロマトグラフィーでの pHグラージェント溶出にて、マウスモノクローナル抗体とゥシ血清由来 IgGを分離した例がある（初めての抗体精製ハンドブック Amersliam Biosciences, 72-0823-01, p 88) 。また、トランスジエニックャギにて生産されたモノクローナル抗体の分離精製に、 Protein Aァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 Protein Gァフィニティ一クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトダラフィ一を用いてャギ由来の IgGを >3 LoglOのレベル低減したという報告がある (Daniel P. Pol lockら、 J I匪 unological Methods 231 1999) 。

しかしながら、これまでにゥシ抗体またはヒッジ抗体とヒト抗体を分離した報告はない。さらにはヒトポリクローナル抗体からゥシポリクロ一ナル抗体、ャギポリクローナル抗体、またはヒッジポリクローナル抗体を分離した報告はない。非特許文献 1 B ioPharm , September 2001, 10-18

非特許文献 2 Grunfeld Hら、 J Immunol Methods 1997 201 (2) , p233 - 241 非特許文献 3 初めての抗体精製ハンドブック Amersham Biosc iences, 72-0823- 01, 88

非特許文献 4 Danie l P. Pol lockら、 J Immunological Methods 231 1999, P147-157 発明の開示

( 1 ) 抗体の精製において、従来の「陽イオン交換クロマトグラフィ一"陰ィオン交換クロマトグラフィー」の一連のプロセスにおいて必須である希釈工程においては、 ①希釈溶液が必要となる、 ②希釈による容量増加の結果装置が大型化する、 ③作業が長時間化する、などの問題があった。（2 ) 有蹄動物の抗体およびヒト抗体を含有する混合物から該ヒト抗体を単離する方法に関しては未解決である。さらにはヒトポリクローナル抗体および有蹄動物のポリクローナル抗体を含有する混合物から該ヒトポリクローナル抗体を単離する方法に関しては未解決である。

本発明は、上記の問題点あるいは未解決課題を解決することを目的とする。本発明者は抗体を効率的に精製することを目的として鋭意検討を進めた。その結果「陰イオン交換クロマトグラフィ陽イオン交換クロマトグラフィー」という精製シークェンスが上記の課題を解決することを見出し、本発明を完成させるに至った。また、一方でヒト抗体とゥシ抗体、ヒッジ抗体またはャギ抗体等の有蹄動物の抗体を含有する混合物からヒト抗体を単離する方法を鋭意検討した。その結果、該混合物を Prote in Aカラムに供した後、溶出方法を pHグラージェントとすることによりヒト抗体を単離できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。

1 . 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(1) 陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および

(2) (1) に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程

2. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(1) プロテイン Aァフィ二ティークロマトグラフィーで精製する工程、および

(2) (1) に次いで、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および

(3) (2) に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程

3. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(1) プロテイン Aァフィ二ティ一クロマトグラフィーで精製する工程、おび

(3) (2) に次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、および

(4) (3) に次いで、疎水性クロマトグラフィーで精製する工程

4. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 1 ) リン酸ナトリゥムおよび塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロティン Aカラムに接触させる工程、および

(2) (1) に次いで、平衡化に用いた（1) の緩衝液で該プロテイン A力ラムを洗浄する工程、および

(3) (2) に次いで、クェン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および (4) (3) に次いで、溶出液をリン酸ナトリウム緩衝液で pH4.0〜8.5に調整する工程、および

(5) (4) に次いで、（4) の溶出液を Tris- HC1緩衝液で ρΗ6.0〜8.5に調整する工程、および

(6) (5) に次いで、 Tris- HC1緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに (5) の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および

(7) (6) に次いで、平衡化に用いた（6) の緩衝液で該陰イオン交換力ラムから該抗体を溶出させる工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を酢酸またはクェン酸で pH4.0〜7.0 に調整する工程、および

(9) (8) に次いで、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム：クェン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（8) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および

(10) (9) に次いで、平衡化に用いた（9) の緩衝液で該陽イオン交換力ラムを洗浄する工程、および

(11) (1 0) に次いで、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム：クェン酸緩衝液ならびに塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

5. さらに、

(12) 上記 4記載の工程（11) に次いで、上記 4記載の工程（11) の溶出液に硫酸アンモニゥムを添加し、水酸化ナトリゥム水溶液で pH6.0〜8.0に調整する工程、および

(13) (12)に次いで、硫酸アンモニゥムおよびリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および

(14) (13)に次いで、平衡化に用いた（13) の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および ( 15) (14)に次いで、（13)の緩衝液中の硫酸アンモニゥム濃度を低下させることにより該疎水性力ラムから該抗体を溶出する工程、

を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

6 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 1から 5のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

7 . ウィルスを不活化する工程が、プロテイン Aクロマトグラフィーで精製する工程の後に行われる、上記 6記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

8 . ウィルスの不活化が、上記 4の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 7 記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

9 . ウィルス除去フィルターを用いてのろ過によるウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法の最終工程で行われる、上記 6から 8のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 0 . 上記 4記載の工程（4 ) のリン酸ナトリウム緩衝液を Tri s- HC1緩衝液に代えた上記 4〜 9のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 1 . 上記 4記載の工程（4 ) および（5 ) を、下記の工程に代えた、上記 4 〜 9のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 3 ) に次いで、溶出液を Tris- HC1緩衝液で ρΗ6. 0〜8. 5に調整する工程

1 2 . 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 1 ) 10〜100mMリン酸ナトリゥムおよび 0〜4. 0M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および

(3) (2) に次いで、 10〜100 クェン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および

(4) (3) に次いで、溶出液を 10〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液で pH4.0 〜8.5に調整する工程、および

(5) (4) に次いで、（4) の溶出液を 0.5〜1.5M Tris-HCl緩衝液で PH6.0〜8.5に調整する工程、および

(6) (5) に次いで、 10〜20mM Tris- HC1緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（5) の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を 0.5〜1· 5M酢酸またはクェン酸で PH4.0〜7.0に調整する工程、および

(9) (8) に次いで、 10〜50mM酢酸ナトリウム緩衝液または 10〜50mMリン酸ナトリウム： 10〜50mMクェン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに

(8) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および

(11) (10)に次いで、 10〜50mM酢酸ナトリゥムまたは 10〜50mMリン酸ナトリゥム： 10〜50 クェン酸緩衝液ならびに 0.1〜1.0M塩化チトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

13. さらに、

(12) 上記 12に記載の工程（11) に次いで、上記 12に記載の工程（11) の溶出液に 0.8〜1.2M硫酸アンモニゥム濃度になるように硫酸アンモニゥムを添加し、 1.0〜10.0M水酸化ナトリウム水溶液で pH6.0〜8.0に調整する工程、および (13) (12)に次いで、 0.8〜1.2M硫酸アンモニゥムおよび 10mM〜100niMリン酸ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および

(14) (13)に次いで、平衡化に用いた（13) の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および

(15) (14)に次いで、（13)の緩衝液中の硫酸アンモニゥム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、

14. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 1 2または 1 3に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 5. ウィルスの不活化が、上記 12の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 14記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 6. ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程およびまたは無菌ろ過工程が、上記 1 2の工程（11) に次いで行われる、上記 1 4または 1 5に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 7. ウィルス除去フィルターを用いてのろ過によるウィルスを除去する工程およびまたは無菌ろ過工程が、上記 1 3の工程（15) に次いで行われる、上記 14または 1 5に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 8. 上記 1 2に記載の工程（4) のリン酸ナトリウム緩衝液を 0.5〜1.5M Tris- HC1緩衝液に代えた上記 12〜17のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 9. 上記 12記載の工程（4) および（5) を、下記の工程に代えた、上記 1 2〜1 7のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 3 ) に次いで、溶出液を 0.5〜1.5M Tris- HC1緩衝液で pH6.0〜8.5に調整するェ程

2 0. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 1 ) 10〜20mMリン酸ナトリゥムおよび 0.15M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および

(3) (2) に次いで、 10〜20mMクェン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および

(4) (3) に次いで、溶出液を 10〜100mMリン酸ナトリウム緩衝液で pH4.0 〜8.5に調整する工程、および

( 5) (4) に次いで、（4) の溶出液を 1.0〜L 5M Tris- HC1緩衝液で pH6.0〜8.5に調整する工程、および

(6) (5) に次いで、 10mM Tris- HC1緩衝液で平衡化した陰イオン交換力ラムに（5) の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を 1M酢酸またはクェン酸で pH4.0〜 7.0に調整する工程、および

(9) (8) に次いで、 20 酢酸ナトリウム緩衝液または 20mMリン酸ナトリゥム： lOmMクェン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（8) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および

(10) (9) に次いで、平衡化に用いた（9) の緩衝液で該陽イオン交換力ラムを洗浄する工程、および (11) (10) に次いで、 20mM酢酸ナトリウムまたは 20mMリン酸ナトリウム： 10mMクェン酸緩衝液ならびに 0.3M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

21. さらに、

(12) 上記 2 0に記載の工程（11) に次いで、上記 2 0に記載の工程（11) の溶出液に 1.0M硫酸アンモニゥム濃度になるように硫酸アンモニゥムを添加し、 10.0M水酸化ナ卜リゥム水溶液で pH6.0〜8.0に調整する工程、および

(13) (12)に次いで、 1.0M硫酸アンモニゥムおよび ΙΟπιΜリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および

2 2. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 2 0または 2 1に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

2 3. ウィルスの不活化が、上記 2 0の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 2 2記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

2 4. ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程およびまたは無菌ろ過工程が、上記 2 0の工程（11) に次いで行われる、上記 2 2または 2 3に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

2 5. ウィルス除去フィル夕一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程およびまたは無菌ろ過工程が、上記 2 1の工程（15) に次いで行われる、上記 2 2または 23に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 26. 上記 20に記載の工程（4) のリン酸ナトリウム緩衝液を l. OM Tris - HC1緩衝液に代えた上記 20〜2 5のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

27. 上記 20に記載の工程（4) および（5) を、下記の工程に代えた、上記 20〜25のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(3) に次いで、溶出液を 1.0M Tris- HC1緩衝液で ρΗ6·0〜8.5に調整する工程 28. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(3) (2) に次いで、 10〜2(kMクェン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および

(4) (3) に次いで、溶出液を 10〜100mMリン酸ナトリウム緩衝液で pH7.0 に調整する工程、および

(5) (4) に次いで、（4) の溶出液を 1· 0〜1.5M Tris- HC1緩衝液で pH8.0に調整する工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を 1.0M酢酸またはクェン酸で pH5.0 に調整する工程、および ( 9 ) ( 8 ) に次いで、 20mM酢酸ナトリウム緩衝液または 20mMリン酸ナトリゥム： 10mMクェン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（8 ) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および

(10) ( 9 ) に次いで、平衡化に用いた（9 ) の緩衝液で該陽イオン交換力ラムを洗浄する工程、および

(11) (10) に次いで、 20mM酢酸ナトリゥムまたは 20mMリン酸ナトリゥム： lOmMクェン酸緩衝液ならびに 0. 3M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

2 9 . さらに、

(12) 上記 2 8に記載の工程（11) に次いで、上記 2 8に記載の工程（11) の溶出液に 1. 0M硫酸アンモニゥム濃度になるように硫酸アンモニゥムを添加し、 10. 0M水酸化ナトリゥム水溶液で pH7. 0に調整する工程、および

(13) (12)に次いで、 1. 0M硫酸アンモニゥムおよび lOmMリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および

3 0 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 2 8または 2 9に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

3 1 . ウィルスの不活化が、上記 2 8の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 3 0記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 32. ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および/または無菌ろ過工程が、上記 2 8の工程（11) に次いで行われる、上記 3 0または 3 1に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

33. ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および/または無菌ろ過工程が、上記 2 9の工程（15) に次いで行われる、上記 3 0または 3 1に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

34. 上記 2 8に記載の工程（4) のリン酸ナトリウム緩衝液を 1.0M Tris- HC1緩衝液に代えた上記 2 8〜3 3のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

35. 上記 2 8記載の工程（4) および（5) を、下記の工程に代えた、上記

28〜3 3のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(3) に次いで、溶出液を 1. OM Tris- HC1緩衝液で pH8. 0に調整する工程

36. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(1) pH6.0〜8.5の緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、

(2) (1) に次いで、 pH6.0〜8.5の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、および

(3) (2) に次いで、 ρΗ2·7〜4·0の緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および

(4) (3) に次いで、溶出液を ρΗ4.0〜8.5に調整する工程、および

(5) (4) に次いで、（4) の溶出液を ρΗ6.0〜8.5に調整する工程、および

(6) (5) に次いで、 ρΗ6·0〜8· 5の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（5) の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させるェ程、および

(7) (6) に次いで、 ρΗ6.0〜8.5の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を ΡΗ4· 0〜7.0に調整する工程、および

(9) (8) に次いで、 ρΗ4.0〜7.0の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（8) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させるェ程、および

(10) (9) に次いで、 ρΗ4, 0〜7.0の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および

(11) (10) に次いで、 0. 1〜1.0Μの塩を含有する ρΗ4· 0〜7.0の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

3 7. さらに、

(12) 上記 3 6に記載の工程（11) の溶出液に 0.8〜1.2Μの濃度となるように塩を添加し、さらに ρΗ6.0〜8.0に調整する工程、

(13) (12)の塩を 0.8〜1.2Μの濃度で含有する ρΗ6. (！〜 8.0の緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、

(14) (12)の塩を 0.8〜1.2Μの濃度で含有する、 ρΗ6.0〜8.0の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および

(15) (13)の該緩衝液中の塩濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、

3 8. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 3 6または 3 7に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

3 9. ウィルスの不活化が、上記 3 6の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を ΡΗ4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 3 8記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 0 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程およびまたは無菌ろ過工程が、上記 3 6の工程（1 1) に次いで行われる、上記 3 8または 3 9に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 1 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、上記 3 7の工程（15) に次いで行われる、上記 3 8または 3 9に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 4 2 . 上記 3 6に記載の工程（2 ) の ρΗ6. 0〜8. 5の緩衝液が工程（1 ) の緩衝液と同一であり、上記 3 6に記載の工程（7 ) の pH6. 0〜8. 5の緩衝液が工程

( 6 ) の緩衝液と同一であり、かつ上記 3 6に記載の工程（10) の pH4. 0〜7. 0の緩衝液が工程（9 ) の緩衝液と同一である、上記 3 6記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 3 . 上記 3 7に記載の工程（14)の（12)の塩を 0. 8〜1. 2Mの濃度で含有する、 pH6. 0〜8. 0の緩衝液が工程（13)の緩衝液と同一である、上記 3 7〜4 2のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 4 . 上記 3 6に記載の工程（1 1)の塩が塩化ナトリウムである上記 3 6〜4 3 のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 5 . 上記 3 7に記載の工程（12)の塩が硫酸アンモニゥムである上記 3 6〜4 5のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 4 6 . 上記 3 6記載の工程（1 ) の緩衝液が、 4. 0M以下の塩を含有する上記 3 6〜4 5のいずれかに記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 7 . 塩が塩化ナトリウムである上記 4 6記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 8 . 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 1 ) H6. 0〜8. 5の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および (2) (1) に次いで、 pH6.0〜8.5の緩衝液で該陰イオン交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および

(3) (2) に次いで、（2) の溶出液を ρΗ4· 0〜7.0に調整する工程、および

(4) (3) に次いで、 ρΗ4· 0〜7.0の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（3) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させるェ程、および

(5) (4) に次いで、 ΡΗ4·0〜7.0の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および

(6) (5) に次いで、 0.1〜1· 0Μの塩を含有する ρΗ4.0〜7.0の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

49. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 48記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 0. ウィルスの不活化が、上記 48の工程（1) の前に、抗体含有溶液を ρΗ4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 49記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 1. ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Ζまたは無菌ろ過工程が、上記 48の工程（6) に次いで行われる、上記 4 9または 50に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

52. 上記 48に記載の工程（2) の ρΗ6· 0〜8.5の緩衝液が工程（1) の緩衝液と同一であり、かつ上記 48に記載の工程（5) の ρΗ4.0〜7.0の緩衝液が工程 (4) の緩衝液と同一である上記 48〜51のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

53. 上記 48に記載の工程（6) の塩が塩化ナトリウムである上記 48〜 5

2のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

54. 抗体がヒト抗体である上記 1〜53のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 5 . 抗体がモノクローナル抗体である上記 1〜5 4のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 6 . 抗体が IgGである上記 1〜5 5のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 7 . 抗体が IgG 1、 IgG 2または IgG 4である上記 5 6記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 8 . 抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体である、上記 5 4〜5 7のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 9 . 抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合した上記 5 4〜5 8のいずれかに記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

6 0 . ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から、プロテイン Aァフィ二ティークロマトグラフィーにより該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。

6 1 . 有蹄動物が、ゥシ、ャギおよびヒッジからなる群から選択される上記 6 0記載の該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。

6 2 . 分離が、 pHグラージェント溶出である上記 6 0または 6 1記載の方法。 6 3 . 分離が、 pH段階溶出である上記 6 0または 6 1記載の方法。

6 4 . 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

( 1 ) リン酸ニナトリウム、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロティン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および ( 2 ) ( 1 ) についで、（1 ) の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、および

( 3 ) ( 2 ) についで、（1 ) の緩衝液中の pHを低下させることにより該プロティン Aカラムから該ヒト抗体を溶出する工程

6 5 . 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される上記 6 4 記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

6 6 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルタ一を用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 6 4または 6 5に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

6 7 . ウィルスの不活化が、上記 6 4の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 6 6記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

6 8 . ウィルス除去フィルタ一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記 6 6または 6 7 記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

6 9 . pHの低下が、グラージェント的である上記 6 4〜6 8のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 0 . pHの低下が、段階的である上記 6 4〜6 8のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 1 . 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

( 1 ) 0. 05〜0, 15Mリン酸ニナトリゥム、 0. 05〜0. 15M酢酸ナトリゥム、 0. 05 〜0. 15Mダリシンおよび 0. 05〜0. 20M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロティン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および

( 2 ) ( 1 ) についで、（1 ) の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、および

( 3 ) ( 2 ) についで、（1 ) の緩衝液中の pHを低下させることにより該プ口ティン Aカラムから該ヒト抗体を溶出する工程

7 2 . 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される上記 7 1 記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 3 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 7 1または 7 2に記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 4 . ウィルスの不活化が、上記 7 1の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 7 3記載のヒト抗体を、ヒ小抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 5 . ウィルス除去フィルタ一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程および/または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記 7 3または 7 4 に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 6 . pHの低下が、グラージェント的である上記 7 1〜7 5のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。 7 7 . pHの低下が、段階的である上記 7 1〜7 5のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。。 7 8. 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

(1) 0· 10Mリン酸ニナトリウム、 0.10M酢酸ナトリウム、 0.10Mグリシンおよび 0.15M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロティン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロティン Aカラムに接触させる工程、および

(2) (1) に次いで、（1) の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、および

(3) (2) に次いで、（1) の緩衝液中の pHを低下させることにより該プロティン Aカラムから該ヒ卜抗体を溶出する工程

7 9. 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される上記 7 8 記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

80. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルタ一を用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 7 8または 7 9に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 1. ウィルスの不活化が、上記 7 8の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 80記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

82. ウィルス除去フィルタ一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程およびまたは無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記 80または 8 1 に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

83. pHの低下が、グラージェント的である上記 7 8〜82のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 4 . pHの低下が、段階的である上記 7 8〜8 2のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 5 . 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

( 1 ) pH7. 5〜8. 5の緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロティン Aカラムに接触させる工程、

( 2 ) pH7. 5〜8. 5の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、

( 3 ) ( 2 ) の緩衝液の pHを低下させることにより該プロテイン Aカラムから該ヒト抗体を溶出する工程

8 6 . 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される上記 8 5 記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 7 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、上記 8 5または 8 6に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 8 . ウィルスの不活化が、上記 8 5の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、上記 8 7記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 9 . ウィルス除去フィルタ一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程および/または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、上記 8 7または 8 8 に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。 9 0 . pHの低下が、グラージェント的である上記 8 5〜8 9のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。 9 1 . pHの低下が、段階的である上記 8 5〜8 9のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 2 . 上記 8 5記載の工程（2 ) の ρΗ7. 5〜8· 5の緩衝液が、工程（ 1 ) の緩衝液と同一である、上記 8 5〜9 1のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 3 . 上記 8 5記載の工程（1 ) の ρΗ7. 5〜8. 5の緩衝液が、 0. 05〜0. 20Μの濃度で塩を含有する、上記 8 5〜9 2のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 4 . 塩が塩化ナトリウムである、上記 9 3記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 5 . ヒト抗体がヒトポリクローナル抗体である上記 6 0〜9 4のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 6 . 有蹄動物の抗体がゥシポリクローナル抗体、ャギポリクローナル抗体およびヒッジポリクローナル抗体からなる群から選択される上記 6 0〜9 5のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 7 - ヒト抗体が IgGである上記 6 0〜9 6のいずれかに記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 8 . ヒ卜抗体が IgGl、 IgG2または IgG4である、上記 9 7記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 097407号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、ヒトポリクロ一ナル抗体 Prote in Aァフィ二ティーク口マトグラフィ一力ラム溶出曲線を示す図である。図 2は、ゥシポリクローナル抗体 Prote in Aァフィ二ティ一クロマトグラフィ一力ラム溶出曲線を示す図である。

図 3は、ヒトポリクローナル抗体、ゥシポリクロ一ナル抗体混合物 Prote in A ァフィ二ティ一クロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。

図 4は、ャギポリクローナル抗体 Prote in Aァフィ二ティーク口マトグラフィ一力ラム溶出曲線を示す図である。

図 5は、ヒトポリクローナル抗体とャギポリクロ一ナル抗体混合物の Protein Aァフィ二ティ一クロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。

図 6は、ヒッジポリクローナル抗体 Protein Aァフィ二ティ一クロマトグラフィ一カラム溶出曲線を示す図である。

図 7は、ヒトポリクローナル抗体とヒッジポリクローナル抗体混合物の Protein Aァフィ二ティークロマトグラフィーカラム溶出曲線を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の抗体を含有する混合物から該抗体を精製する方法において、抗体を含有する混合物には、抗体を産生するハイプリドーマ、 NS0等のミエローマ細胞、抗体をコードする遺伝子で形質転換され該抗体を発現産生し得る動物細胞、酵母等の培養上清が含まれる。好ましくは、本発明の方法による精製を行なうときはこれらの培養上清は清澄化しておく。清澄化は例えば、 0. のメンブランフィル夕一による濾過等により行なえばよい。本発明で精製する抗体には、限定はなく例えばヒト抗体、マウスやゥシ、ャギ、ヒッジなどの有蹄動物等の非ヒト動物抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等が含まれ、好ましくはヒト抗体である。更に好ましくはヒトモノクローナル抗体である。また、抗体のクラス、サブクラスは限定されず、いずれのクラス、サブクラスの抗体も本願発明において精製し得るが、好ましくは IgG、その中でも IgG l、 IgG 2および IgG 4である。また、抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体であってもよい。さらに、抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合していてもよい。

本発明においては、少なくとも前記抗体を含有する混合物は陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーにより、この順番で精製される。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する前に Prote in Aァフィ二ティークロマトグラフィーにより精製してもよく、また陽イオンクロマトグラフィ一の後に疎水性クロマトグラフィーにより精製してもよい。さらに、 Prote in A ァフィ二ティークロマトグラフィーの代わりに Prote in G ァフィニティークロマトグラフィーを行なってもよい。またさらに、疎水性クロマトグラフィ一の代わりにゲルろ過、ハイドロキシァパタイ卜クロマトグラフィーあるいは金属キレ一トァフィニティークロマトグラフィーを行ってもよい。

これらのクロマトグラフィーには、それぞれ陰イオン交換樹脂を含むカラム、陽イオン交換樹脂を含むカラム、 Prote in A結合樹脂を含むカラムおよび疎水性リガンドを結合させた樹脂を含むカラムが用いられる。これらのカラムとしては市販の分取クロマトグラフィー用のカラムを用いてもよいし、市販のまたはガラス管から作製した空カラムに上記樹脂を詰めて用いてもよい。前記樹脂としても市販のものを用いることができる。

市販の Protein Aカラムとしては、 Amersham B iosc iences社製 MabSe lect、 Prote in A Sepharose FF、 Mi l l ipore社製 Prosep rA、 Prosep A、 Appl ied B iosys tems社製 POROS A/20などがあり、市販の陰イオン交換カラムとしては Amersham Biosc iences社製 Q Sepharose XL , Q Sepharose FF、 DEAE Sepharose FF、 ANX Sepharose FF等があり、市販の陽イオン交換カラムとしては、 Amersham Biosc iences社製 SP Sepharose FF、 CM Sepharose FF、 Appl ied Biosys tems社製 Poros 50 HS等がある。さらに、市販の疎水性カラムとしては、 Amersham Biosc iences社製 Phenyl Sepharose HP 、 Phenyl Sepharose FF 、 Butyl Sepharose FF、東ソ一社製 Phenyl Toyopearl 650 S、 Phenyl Toyopearl 650 M 等がある。

また、カラム作製のためのイオン交換クロマトグラフィー用樹脂もイオン交換基を結合させた Sepliarose、 Sephadex, Ce l lulof ine等のセルロース、ァガロース、デキストラン、シリカ、合成ポリマー等の樹脂を用いることができ、陰イオン交換基としては、ジェチルアミノエチル（DEAE)基や、それより塩基性の強い第四級アミノエチル（QAE)基等を、陽イオン交換基としては、カルポキシメチル（CM)基や、それより酸性度の強いスルホプロピル（SP)基、リン酸基等を選択すればよい。また、疎水性クロマトグラフィ一に用いる樹脂に結合した疎水性リガンドも Phenyl. ButyK Oc tyK Ethyl等がありいずれも用いることができる。

以下、各クロマトグラフィーによる精製方法について記載するが、以下の記載は例えば、目的の抗体を 700mg/Lの濃度で含む混合物を 220〜1500mL用いる場合を想定している。用いる抗体の濃度、量は限定されず、濃度、量によりカラムサイズ、使用緩衝液量等を適宜調整することができる。

陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう場合、あらかじめカラムを pH6〜8. 5、好ましくは pH8. 0の緩衝液で平衡化しておく、この時用いる緩衝液は Tris- HC1 ( 2-Amino-2-hydroxyme thyl-l, 3 - propaned io l ) や B i s - Tris Propane ( 1， 3- bis [t ris (Hydroxymethyl) -methyl amino] ropane) ) 等がある。この時の緩衝液の濃度は 10mM〜20mMが好ましく、 lOmMがさらに好ましい。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液の pHと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の容積にもよるが、例えば長さ 2. 5〜30cmのものを用いればよい。陰イオン交換カラムにアプライする抗体含有混合物または Prote in Aァフィ二ティーク口マトグラフィ一により精製した抗体含有混合物は、 pH6. 0〜8. 5、好ましくは pH8. 0に調整しておく。この際、 pHの調整に用いる緩衝液の種類は限定されず、例えばリン酸ナトリウム緩衝液あるいは Tri s- HC 1緩衝液等が用いられるが、陰イオン交換カラムの平衡化に用いた緩衝液と同じ種類の緩衝液を用いるのが好ましく、平衡化に用いる緩衝液の PHと抗体含有混合物の pHを同等に調整しておくか、平衡化に用いる緩衝液の PHをやや高く調整しておくのが望ましい。サンプルをアプライした後に、カラム容量の数倍、好ましくは約 3倍の量の pH6. 0〜8. 5の緩衝液、好ましくは平衡化に用いた緩衝液を流し、溶出する。カラム非吸着画分に目的の抗体が含まれている。この際緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、 50〜 500cm/hの範囲で選択すればよい。

次いで、得られた陰イオン交換カラム非吸着画分を陽イオン交換クロマトダラフィ一により精製する。陽イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、あらかじめカラムを pH4. 0〜7. 0、好ましくは pH5. Gの緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液やクェン酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液あるいは MES； 2-Morphol inoethanesul fonic ac id等が挙げられる。この際の緩衝液の濃度は、 10〜50mMが好ましく、 20mMがさらに好ましい。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液の PHと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の容積にもよるが、例えば長さ 2. 5〜 30cmのものを用いればよい。陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにアプライする陰イオン交換カラム非吸着画分は、 pH4. 0〜7. 0、好ましくは PH5. 0に調整しておく。この際、 pHの調整に用いる溶液、緩衝液は適宜選択できる。例えば酢酸、クェン酸や酢酸、クェン酸緩衝液が挙げられる。酢酸を用いて pHを調整する場合、酢酸の濃度は 0. 5〜 1. 5Mが好ましく、 1. 0Mがさらに好ましい。結果として陽イオン交換カラムの平衡化に用いる緩衝液の pHと陰イオン交換カラム非吸着画分の pHを同等に調整しておくか、平衡化に用いる緩衝液の pHをやや低く調整しておくのが望ましい。陰ィォン交換カラム非吸着画分をアプライした後に、カラム容量の数倍、好ましくは約 5倍量の緩衝液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝液としては、 pH4. 0〜7. 0の緩衝液が挙げられ、好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。次いで、カラム容量の数倍、好ましくは約 5倍の量の 0. 1M〜1. 0Mの塩を含有する緩衝液を流し目的の抗体を溶出する。この際、平衡化に用いた緩衝液、例えば 10〜50mM、好ましくは 20mMの酢酸ナトリゥムに塩化ナトリゥムを 0. 1〜1. 0M、好ましくは 0. 3M添加した緩衝液を用いればよい。または、 20mM酢酸ナトリウムの替りに、 20mMリン酸ナトリゥム- 10mMクェン酸緩衝液を用いてもよい。塩は適宜選択可能であり塩化ナトリゥム以外に、例えば塩化力リゥムなども使用できる。カラム非吸着画分に目的の抗体が含まれている。この際緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、 50〜500cm/liの範囲で選択すればよい。また、この際塩化ナトリゥム濃度を徐々に増加させていく塩濃度勾配溶出により溶出してもよい。この際の勾配容量はカラム体積の 5〜40倍、好ましくは 20倍である。濃度勾配溶出を行うためには、自動混合装置を用いたり、あるいは、 2つの溶媒槽のあるグラージェント作成器を用いればよい。さらに、この際塩濃度は段階的に上げていってもよい。ここでダラ一ジェント溶出とは、カラム中を流下させる溶媒の濃度あるいは組成を連続的に変化させることによって溶出を行う方式をいい、段階溶出とは、カラム中を流下させる溶媒を、濃度あるいは組成を異にしていて、溶出能がより高いものに、不連続的に切替えて溶出を行う方式をいう。 pHグラージェント溶出とは溶媒の pHを連続的に変化させて行う溶出であり、 pH段階的溶出とは pHを不連続的に切替えて行う溶出である。グラージェント的とは、変化が連続的であることをいい、段階的とは変化が不連続的であることをいう。陰イオン交換クロマトグラフィーの前に Prote in Aァフィ二ティークロマ卜グラフィ一による精製を行なう場合は以下のように行なう。あらかじめカラムを pH6. 0〜8. 5、好ましくは pH7. 0の緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、 HEPES ; 2- [4- (2-Hydroxyethyl) -l- piperaz inyl] e thanesul fonic acid、 MES ; 2-Morphol inoethanesul fonic ac id等がある。さらに好ましくは、該緩衝液は 0〜4. 0Mまでの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む。例えば、 10〜100mM、好ましくは 10〜20 リン酸ナトリウムおよび 0〜4. 0M、好ましくは 0. 15M塩化ナトリウムを含有する緩衝液が例示できる。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液の PHと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の量にもよるが、例えば長さ 5〜30cmのものを用いればよい。抗体含有混合物をアプライした後に緩衝液、例えば pH6. 0〜8. 5、好ましくは pH6. 0〜7. 0の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液は好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。また、この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば 5カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。緩衝液を流す線速度もカラムサィズにより異なるが、 50〜1000cm/hの範囲で選択すればよい。次いで、 pH 2. 7〜 H 4. 0、好ましくは pH3. 4~3. 5の緩衝液、例えばクェン酸ナトリウム緩衝液で抗体をカラムから溶出する。この際のクェン酸ナトリウム緩衝液の濃度は、 10〜 lOOmMが好ましく、 20mMがさらに好ましい。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば 5カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。線速度もカラムサイズにより異なるが、 50〜1000cm/hの範囲で選択すればよい。溶出液中に目的の抗体が含まれている。この Prote in Aァフィ二ティークロマトグラフィー溶出液を pH4. 0〜8. 5、好ましくは pH8. 0に調節して次の陰イオンクロマトグラフィー精製を行なう。この際、用いる緩衝液としては例えばリン酸ナトリウム緩衝液あるいは Tri s- HC1緩衝液等がある。

この際、リン酸ナトリウム緩衝液および Tri s- HC1緩衝液の両方を用いて、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、 Tri s- HC 1緩衝液の順番に添加してもよいし、リン酸ナトリゥム緩衝液または Tri s- HC 1緩衝液の一方のみを用いてもよい。用いるリン酸ナトリウムおよび Tris_HCl緩衝液の濃度は、それぞれ 10〜200mMおよび 0. 5〜 1. 5Mが好ましく、 lOOmMおよび 1. 0Mがさらに好ましい。

Prote in Aァフィ二ティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィ一および陽イオン交換ク口マトグラフィ一精製を行なうことにより、抗体の純度は 98%になり、精製収率は約 70%である。抗体純度は例えば、ゲル濾過 HPLCにより測定できる。

さらに、上述の陽イオン交換クロマトグラフィー精製の後に、疎水性クロマトグラフィ一により以下のような方法で精製してもよい。

あらかじめカラムを塩 0. 8〜1. 2Mを含有する pH6. 0〜8. 0の緩衝液で平衡化しておく。平衡化に用いる緩衝液として、例えば pH6. 0〜8. 0、好ましくは pH7. 0の 0. 8 〜1. 2M、好ましくは 1. 0Mの硫酸アンモニゥムを含む緩衝液である。例えば 10ηιΜ〜 100mM、好ましくは lOmMのリン酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。このカラムに、陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液に 0. 8〜1. 2Mとなるように塩を添加し pH6. 0〜8. 0に調整したものをアプライする。この調整は、例えば 1. 0Mになるように硫酸アンモニゥムを添加し、さらに必要ならば水酸化ナトリゥム水溶液を添加し、 pHを 6. 0〜8. 0、好ましくは pH7. 0に調整する。この pH調整に用いる硫酸アンモニゥムは硫酸アンモニゥム濃度が 0. 8〜1. 2M、好ましくは 1. 0Mになるように添加し、水酸化ナトリウム水溶液の濃度は、 1. 0〜10, OM、好ましくは 5. 0Mである。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体混合物の量にもよるが、例えば長さ 2. 5〜20cmのものを用いればよい。抗体混合物をアプライした後に平衡化緩衝液、例えば塩 0. 8〜1. 2Mを含有する pH6. 0〜8. 0の緩衝液でカラムを洗浄し、非吸着画分を洗い流す。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば 5カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。緩衝液を流す線速度もカラムサイズにより異なるが、 50〜200cm/hの範囲で選択すればよい。次いで、 10〜50mM、好ましくは 10mMのリン酸ナトリゥム緩衝液中の硫酸アンモニゥム濃度を徐々に低下させる塩濃度勾配溶出を行なう。この際の勾配容量は 5〜30好ましくは、 10カラム容積である。場合によっては、塩濃度を一定あるいは段階的に上げていってもよい。線濃度は 50〜200cm/hの範囲で選択すればよい。

疎水性クロマトグラフィーを行なうことにより、抗体純度は 99 %以上になる。なお、精製しょうとする抗体によっては、それぞれのクロマトグラフィーの前に洗浄工程を追加してもよい。例えば、 Prot e in Aァフィ二ティ一クロマトダラフィ一の場合には、抗体を溶出する前に 20mM リン酸ナトリウム 1M塩化ナトリウム緩衝液（PH 6. 0) 又は/および 10mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 0) の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去できる。この際用いる緩衝液の量は限定されず、例えば 5カラム容量の緩衝液を用いればよい。また、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、抗体を溶出する前に lOmM リン酸ナトリウム緩衝液（PH 6. 0， 6. 5， 7. 0) でカラムを洗浄し、不純物を除去できる。この際用いる緩衝液の量は限定されず、例えば 5カラム容量の緩衝液を用いればよい。

さらに、抗体を含む培養上清には、抗体を産生する細胞由来のウィルスが含まれている場合がある。従って、本発明の抗体の精製方法にウィルスを不活化する工程および/またはウィルスを除去する工程を含ませてもよい。ウィルスを不活化するには、精製過程で得られる抗体を含む溶液を一定時間酸性条件下におけばよく、例えばクェン酸溶液等の酸性溶液を添加して、一定時間置けばよい。ウイルス不活化の工程は一連の精製工程のどこに含ませてもよいが、プロティン A力ラムから抗体を溶出する際にクェン酸緩衝液を用いるので、該溶出液に濃いクェン酸溶液、例えば 1 Mクェン酸溶液を添加して pH4以下、好ましくは pH3. 5以下に調製し 1 5分以上、好ましくは 30分以上、さらに好ましくは 45分以上放置すればよい。酸性条件下におけるウィルス不活化を行う場合、より容易に酸性条件に調整できるように、その直前の工程で用いる緩衝液の濃度や pHも低めに調整しておくのが望ましい。例えば、プロテイン Aカラムによる精製工程の後に、ウィルスの不活化を行う場合は、プロティン Aカラムの平衡化が通常 20mMリン酸緩衝液 pH7 を用いて行われるのに対して、 10mMリン酸緩衝液 pH6を用いて行えばよい。また、溶出も通常クェン酸緩衝液 PH3. 5を用いて行われるのに対して、クェン酸緩衝液 pH3. 4を用いて行えばよい。

本発明の方法において、プロテイン Aカラムから溶出した抗体含有溶液は、次いで中和して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけるが、クェン酸溶液を用いてウィルスを不活化した場合には、中和に用いる緩衝液の pHを高くするか、あるいは濃度を大きくする必、要がある。ウィルス不活化工程を含まない場合、プロティン Aカラムから溶出した抗体含有溶液を lOOmMリン酸ナトリゥム緩衝液で pH7. 0 に調整し、その後 1. OM Tris- HC1緩衝液で pH8. 0に調整する例が挙げられるが、この際に例えば、 10mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH8. 2を添加し、次いで 1. 5M Tris - HC1緩衝液を添加して pH8. 0に合わせればよい。

また、ウィルス除去は、ウィルス除去フィルタ一によりろ過することにより行うことができる。ウィルス除去フィルタ一としては、例えば旭化成社製のプラノバ 20Nを用いることができる。さらに本発明の方法で得られた精製抗体は、必要に応じて濃縮あるいは無菌ろ過する。濃縮工程は例えば限外ろ過膜を用いて行えばよい。さらに、抗体の安定化のために濃縮工程時に緩衝液を適当な緩衝液に交換してもよい。例えば、 1〜5 O mMのグルタミン酸緩衝液に交換すればよい。また、この際抗体の安定化を目的として交換緩衝液にソルビトール等を含ませてもよい。また、無菌ろ過工程は、例えば孔径 0. 45 m以下のメンブレンフィルターを用いて行えばよい。上記ウィルス除去工程、濃縮工程、無菌ろ過工程は本発明の精製過程のどこで行ってもよいが、抗体の精製終了後の精製抗体を用いて、すなわち精製過程の最後に行うのが望ましい。例えば、ウィルス除去工程および無菌ろ過工程を、陽イオンクロマトグラフィーで抗体を溶出した後に行えばよく、また精製工程が疎水性クロマトグラフィーで精製する工程を含む場合は、疎水性クロマトグラフィーで抗体を溶出した後に行えばよい。ウィルス除去工程および無菌ろ過工程の順序は限定されないが、好ましくはウィルス除去フィルターを通してウィルス除去を行った後に、無菌ろ過を行う。

本発明は、ヒト抗体とゥシ抗体、ヒッジ抗体またはャギ抗体等の有蹄動物の抗体との混合物からヒト抗体とゥシ抗体、ヒッジ抗体またはャギ等の有蹄動物の抗体を分離する方法をも包含する。ヒト抗体およびゥシ抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはポリクローナル抗体である。例えば、本発明は、ゥシ血清含培地で培養されたヒトモノクローナル抗体、ヒトと非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等を産生し得る CH0細胞、 NS0ミエローマ細胞、ハイプリドーマの培養上清からこれらの抗体とゥシ血清中のゥシ抗体を分離するのに用いることができる。本発明はまた、ヒトモノクローナル抗体、ヒ卜と非ヒト動物とのキメラ抗体、非ヒト動物抗体をヒト化したヒト化抗体等を産生し得るトランスジエニックゥシの体液、例えば血液または乳液、から前記抗体を分離するのに用いられる。本発明は、さらにヒトポリクローナル抗体とゥシ由来の抗体を分離するのに用いられ、例えばヒト抗体の遺伝子座が導入されヒ卜抗体を産生し得るトランスジエニックゥシに抗原を投与して免疫した場合に該ゥシの体液、例えば血液または乳液中にはヒトポリクローナル抗体とゥシポリクローナル抗体が含まれこの混合物からの両抗体の分離に用いられる。

ヒト抗体とゥシ抗体、ヒッジ抗体またはャギ抗体等の有蹄動物の抗体の分離には、 Prote in A ァフィ二ティークロマトグラフィーが用いられる。この際のカラムサイズ、抗体混合物の容積は適宜決定することができる。 Protein Aカラムは pH7. 5〜8. 5、好ましくは pH8. 0の緩衝液で平衡化する。この際に用いる緩衝液として、リン酸ニナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリゥムを含有する緩衝液が挙げられる。リン酸ニナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム、グリシンの濃度は、すべて 0. 05〜0. 15Mが好ましく、さらには 0. 10Mが好ましい。また、塩化ナトリウムの濃度は 0. 05〜0. 20Mが好ましく、さらには 0. 15Mが好ましい。具体的には、例えば、 0. 10M リン酸ニナトリウム- 0. 10M酢酸ナトリウム- 0. 10M ダリシン- 0. 15M塩化ナトリゥム緩衝液（pH8. 0) が例示できる。平衡化したかどうかは、カラムを通過してきた緩衝液の pHと導電率が開始緩衝液と同じであることを確認すればよい。平衡化したカラムに、好ましくは平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で pHを調整したヒト抗体とゥシ等の抗体混合物をアプライする。この際、抗体混合物の抗体濃度等により、 pH調整のために添加する緩衝液の容積や濃度を適宜決定すればよい。次いで平衡化に用いた緩衝液、例えば pH7. 5〜8. 5、好ましくは pH8. 0の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば 5カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。その後、カラムに流す 0. 10M リン酸ニナトリウム- 0. 10M酢酸ナトリウム- 0. 10M ダリシン - 0. 15M塩化ナトリゥム緩衝液（pH8. 0) に 0. 10M 酢酸ナトリゥム- 0. 10M グリシン- 0. 15M塩化ナトリウム緩衝液（pH2. 5) を徐々に添加し、 pHを徐々に低下させる、グラージェント的な溶出すなわち pHダラ一ジェント溶出を行うことによりヒト抗体とゥシ抗体を分離することができる。この際の勾配容量は、 20から 40、好ましくは 30カラム容量である。 pHグラージェント溶出における pHの下限は、例えば pH2. 0〜3. 0であり、好ましくは pH2. 5である。線速度はカラムサイズにより異なるが、 50〜150cm/hの範囲で選択すればよい。また、この際 pH段階的な溶出を行ってもよい。

以上のクロマトグラフィー操作は、自動機器を用いて自動的に行うことができる。例えば、中高圧液体クロマトグラフィー（F P L C ) を適当なプログラム制御の下で用いて行うことができる。

以下、本発明の実施例を説明するが、本実施例の態様は本発明を限定するものではない。実施例 1 ヒトモノクローナル抗体の精製

デプスフィルターおよび 0. 2 mのメンブランフィルターで清澄化したヒ卜モノクロ一ナル抗体（ヒト IgG l ) を含む CH0細胞無血清培養上清（ヒトモノクローナル抗体発現量： 700 mg/L) 220mlを 20mM リン酸ナトリゥム -0. 15M塩化ナトリウム緩衝液（PH 7. 0) で平衡化した Protein Aカラム（Amersham Biosc iences社製 MabSe lect 8匪 ID x 20 cm) に添加した（線速度 500 cm/h) 。培養上清添加後、 5カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度 500 cm/h) 。次に 5カラム容量の 20mMクェン酸ナトリウム緩衝液（pH 3. 5) によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度 500 cm/h) 。溶出液に lOOmMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 8. 0) を添加し pH7. 0とした。本操作は、 100mMリン酸ナトリウム緩衝液の替りに 1. OM Tris- HC1緩衝液を用いることでも実施できた。

MabSelec t溶出液を 1M Tri s- HC1 (pH 9. 0) にて pH 8. 0に調整後、 lOmM Tri s - HC1 緩衝液（pH 8. 0) で平衡化した陰イオン交換カラム（Amersham Biosc iences 社製 Q Sepharose XL 7 龍 ID x 15 cm) に添加した（線速度 300 cm/h) 。添加終了後、 3カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した（線速度 300 cm/h) 。力ラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。

Q Sepharose XLプール液を 1 M酢酸にて ρΗ 5. 0に調整後、 20 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5. 0) で平衡化した陽イオン交換カラム（Amersham B iosc iences社製 SP Sepharose FF 10匪 ID x 10 cm) に添加した（線速度 300 cm/h) 。添加終了後、 5カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度 300 cm/h) 。次に 5カラム容量の 20mM酢酸ナトリウム- 0. 3M塩化ナトリウム緩衝液（pH 5. 0) を通液し、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度 300 cm/h) 。

本方法によるヒトモノクローナル抗体の精製収率は約 70%であり、ゲルろ過 HPLC分析の結果、純度は 98%であった。

また、抗体によってはカラムから抗体を溶出する前に洗浄工程を入れた。例えば、 Prote in Aァフィ二ティークロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクロ一ナル抗体をクェン酸ナトリゥム緩衝液で溶出する前に 5カラム容量の 20mM リン酸ナトリウム - 1M塩化ナトリウム緩衝液（pH 6. 0) 又は/および 10mM リン酸ナトリゥム（pH 6. 0) の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去した。また、陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体を 20mM酢酸ナトリゥム- 0. 3M塩化ナトリゥム緩衝液で溶出する前に 5カラム容量の lOmM リン酸ナトリウム緩衝液（PH 7. 0) でカラムを洗浄し、不純物を除去した。

さらには、抗体によっては Prot e in Aァフィ二ティ一クロマトグラフィ一" ^陰イオン交換クロマトグラフィ一" ^陽イオン交換クロマトグラフィーの精製シークエンスの後に疎水性クロマトグラフィーの工程を入れる場合もある。

そのクロマトグラフィー条件の実施例を以下に示す。

上記で得られた、 SP Sepharose FFプール液に 1Mになるように硫酸アンモニゥムを添加後、 10M水酸化ナトリウム水溶液で pHを 7. 0に調整した。その溶液を 1 M 硫酸アンモニゥム - 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) で平衡化した疎水性カラム (Amersham B iosc iences社製 Phenyl Sepharose HP 10mm ID 10 cm) に添加した（線速度 160 cm/h) 。添加終了後、 5カラム容量の平衡化緩衝液で力ラムを洗浄した（線速度 160 cm/h) 。次に、 1 M硫酸アンモニゥム- 10 mM リン酸ナトリゥム緩衝液中の硫酸アンモニゥム濃度を低下させることにより（勾配容量：硫酸アンモニゥム濃度 1 M→0Mとするのに 10カラム容量使用）によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度 160 cm/h) 。

疎水性クロマトグラフィー工程を加えることにより、ヒトモノクローナル抗体の純度が 99%以上に向上した（ゲルろ過 HPLC分析）。実施例 2 ヒトポリクローナル抗体とゥシポリクローナル抗体の分離精製

ヒトポリクロ一ナル抗体（SIGMA社製、 Cat No. 14506、商品名： Human IgG f rom Serum) およびゥシポリクロ一ナル抗体（SIGMA社製、 Cat No. 15506、商品名： Bovine IgG f rom Serum) 各 3 mgを 0. 10M リン酸ニナトリゥム _0· 10M酢酸ナトリウム- 0. 10M グリシン- 0. 15M塩化ナトリウム緩衝液（pH8. 0) 3 mlに溶解後、 0. 2 mのフィルタ一に通したものをそれぞれヒトポリクロ一ナル抗体溶液、ゥシポリクローナル抗体溶液とした。 0. 10M リン酸ニナトリゥム- 0. 10M 酢酸ナトリゥム- 0. 10M ダリシン- 0. 15M塩化ナトリウム緩衝液（PH8. 0) で平衡化した 3つの Prote in Aカラム（Appl ied Biosys tems社製 P0R0S A/20 4. 6匪 ID x 5cm) に次の 3サンプルを別個に添加した (線速度 90cm/li) 。 1)ヒトポリクローナル抗体溶液 1 ml、 2)ゥシポリクローナル抗体溶液 1 ml、 3)ヒトポリクローナル抗体、ゥシポリクローナル抗体等量混合溶液 2 mlを別個に添加した。添加終了後、 5カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度 90cm/h) 。次に 0. 10M リン酸ニナトリウム- 0. 10M 酢酸ナトリゥム- 0. 10M ダリシン- 0. 15M 塩化ナトリゥム緩衝液に 0. 10M 酢酸ナトリゥム - 0. 10M グリシン- 0. 15M塩化ナトリウム緩衝液（ρΗ2· 5) を徐々に添加し、 pHを徐々に低下させる、 pHグラージェント溶出（勾配容量： 30カラム容量の使用で pH8. 0→2. 5とした）によりヒトポリクローナル抗体およびゥシポリクローナル抗体を溶出した（線速度 90cm/h) 。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図 1、 2、 3 に示す。

" 図 1、 2に示すように、 pHグラージェント溶出ではゥシポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図 3に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とゥシポリクローナル抗体は分離された。実施例 3 ヒトモノクローナル抗体の精製その 2

デプスフィルタ一および 0. 2 ιηのメンブランフィルターで清澄化したヒトモノクローナル抗体（ヒト IgG l ) を含む CH0細胞無血清培養上清（ヒトモノクロ一ナル抗体発現量： 700 mg/L) 1500mlを 10mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 0) で平衡ィ匕した Prote in Aカラム（Amersham Biosc iences社製 MabSelect 20 mm ID x 20 cm) に添加した（線速度 500 cm/h) 。培養上清添加後、 5カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度 500 cm/h) 。次に 5カラム容量の 20mMクェン酸ナトリウム緩衝液（PH 3. 4) によりヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度 500 cm/h) 。ウィルス不活化の目的で、溶出液に 1M クェン酸を添加し、 pH 3. 5に調整した。室温にて 45分間保持後、この溶液に等量の 10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 8. 2) を添加し中和した。ウィルス不活化後溶液を 1. 5M Tri s- HC 1にて pH 8. 0に調整後、 10mM Tri s-HCl 緩衝液（pH 8. 0) で平衡化した陰イオン交換カラム（Amersliam Biosc iences社製 Q Sepharose XL 10 mm ID x 15 cm) に添加した（線速度 300 cm/h) 。添加終了後、 3カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した（線速度 300 cm/h) 。カラム非吸着画分をヒトモノクローナル抗体溶出液としてプールした。

Q Sepharose XLプール液を 1 Mクェン酸にて pH 5. 0に調整後、 20 リン酸ナトリウム- 10 mMクェン酸- 0. 05M 塩化ナトリウ緩衝液（pH 5. 0) で平衡化した陽ィオン交換カラム（Amersham B iosc iences社製 SP Sepharose FF26 mm ID x 15 cm) に添加した（線速度 300 cm/h) 。添加終了後、 5カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度 300 cm/h) 。次に 5カラム容量の 20 mMリン酸ナトリゥム- 10 mMクェン酸- 0. 3 M塩化ナトリゥ緩衝液（pH 5. 0) を通液し、ヒトモノクローナル抗体を溶出した（線速度 300 cm/h) 。

SP Sepharose FFプール液を 10 mMグルタミン酸ナトリウム- 262 mM D-ソルビトール（pH 5. 5)にて平衡化した限外ろ過膜（Mi l l ipore社製 Biomax 30 50 cm²) で 10 mg/mLまで濃縮後、 10倍量以上の同緩衝液にてバッファー交換した。バッファ —交換後、ヒトモノクローナル抗体溶液を 20 mg/mLまで濃縮し、抗体溶液を回収した。

濃縮 · バッファー交換抗体回収液を 0. 2 ^ mのメンブランフィル夕一 (Mi l l ipore社製デユラポア親水性マルチメディアフィルター）にて無菌ろ過し、最終精製品とした。

本方法によるヒトモノクロ一ナル抗体の精製収率は約 70%であり、ゲルろ過 HPLC分析の結果、純度は 98%であった。

必要に応じて、 SP Sepharose FFプール液をウィルス除去フィルター（旭化成社製ブラノバ 20 N) にてろ過した。ろ過液を限外ろ過膜に供して、濃縮 ·バッファー交した。

また、抗体によってはカラムから抗体を溶出する前に洗浄工程を入れた。例えば、 Prote in Aァフィ二ティークロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクロ一ナル抗体をクェン酸ナトリゥム緩衝液で溶出する前に 5カラム容量の 10mM リン酸ナトリゥム- 1M塩化ナトリゥム緩衝液（pH 6. 0) 又は/および lOmM リン酸ナトリゥム（pH 6. 0) の洗浄工程を入れ、カラムに吸着した非特異的吸着物質を除去した。また、陽イオン交換クロマトグラフィーの場合には、ヒトモノクローナル抗体を 20 mMりん酸ナトリウム -10 mMクェン酸- 0. 3 M 塩化ナトリゥ緩衝液（pH 5. 0) で溶出する前に 5カラム容量の 10mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 6. 0, 6. 5 または 7. 0) でカラムを洗浄し、不純物を除去した。実施例 4 ヒトポリクロ一ナル抗体とャギポリクロ一ナル抗体の分離精製

ヒトポリクロ一ナル抗体（SIGMA社製、 Cat No. 14506、商品名： Human IgG f rom Serum) およびャギポリクローナル抗体（SIGMA社製、 Cat No. 15256、商品名： Goat IgG from Serum) 各 3 mgを 0. 10M リン酸ニナトリゥム- 0. 10M酢酸ナトリゥム- 0. 10M ダリシン- 0. 15M塩化ナトリウム緩衝液（pH8. 0) 3 mlに溶解後、 0. 2 IIIのフィルタ一に通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ャギポリクローナル抗体溶液とした。

0. 10M リン酸ニナトリウム- 0. 10M 酢酸ナトリウム- 0. 10M グリシン- 0. 15M 塩化ナトリウム緩衝液（PH8. 0) で平衡化した 3つの Prote in Aカラム（Appl ied Biosys tems社製 P0R0S A/20 4. 6mmID x 5cm) に次の 3サンプルを別個に添加した (線速度 90cm/h) 。 1)ヒトポリクローナル抗体溶液 1 ml、 2)ャギポリクローナル抗体溶液 1 ml、 3)ヒトポリクローナル抗体、ャギポリクローナル抗体等量混合溶液 2 mlを別個に添加した。添加終了後、 5カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度 90cm/li) 。次に 0. 10M リン酸ニナトリウム- 0. 10M 酢酸ナトリゥム- 0. 10M ダリシン- 0. 15M 塩化ナトリゥム緩衝液に 0. 10M 酢酸ナトリゥム - 0. 10M グリシン- 0. 15M 塩化ナトリウム緩衝液（PH2. 5) を徐々に添加し、 pHを徐々に低下させる、 pHグラージェント溶出（勾配容量： 30カラム容量の使用で pH8. 0→2. 5とした）によりヒトポリクローナル抗体およびャギポリク口一ナル抗体を溶出した（線速度 90cm/h) 。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図 4、 5に示す。

図 4、 5に示すように、 pHグラージェント溶出ではャギポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図 5に示すように両者混合物のクロマトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とャギポリクローナル抗体は分離された。実施例 5 ヒトポリクローナル抗体とヒッジポリクローナル抗体の分離精製

ヒトポリクローナル抗体（SIGMA社製、 Cat No. 14506、商品名： Human IgG f rom Serum) およびヒッジポリクローナル抗体（SIGMA社製、 Cat No. 15131、商品名： Sheep IgG f rom Serum) 各 3 mgを 0. 10M リン酸ニナトリゥム- 0. 10M 酢酸ナトリゥム- 0. 10M ダリシン- 0. 15M塩化ナトリゥム緩衝液（pH8. 0) 3 mlに溶解後、 0. のフィルターに通したものをそれぞれヒトポリクローナル抗体溶液、ヒッジポリクローナル抗体溶液とした。

0. 10M リン酸ニナトリゥム- 0. 10M酢酸ナトリゥム- 0. 10M ダリシン- 0. 15M塩化ナトリウム緩衝液（PH8. 0) で平衡化した 3つの Prote in Aカラム（Appl ied Biosys tems社製 P0R0S A/20 4. 6mm ID x 5cm) に次の 3サンプルを別個に添加した (線速度 90cm/h) 。 1)ヒトポリクローナル抗体溶液 1 ml、 2)ヒッジポリクローナル抗体溶液 1 ml、 3)ヒトポリクローナル抗体、ヒッジポリクローナル抗体等量混合溶液 2 mlを別個に添加した。添加終了後、 5カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した（線速度 90cm/h) 。次に 0. 10M リン酸ニナトリウム- 0. 10M酢酸ナトリゥム -0. 10M ダリシン _0. 15M 塩化ナトリウム緩衝液に 0. 10M 酢酸ナトリゥム -0. 10M グリシン- 0. 15M 塩化ナトリウム緩衝液（pH2. 5) を徐々に添加し、 pH を徐々に低下させる、 pHダラ一ジェント溶出（勾配容量： 30カラム容量の使用で pH8. 0→2. 5とした）によりヒトポリクロ一ナル抗体およびヒッジポリクローナル抗体を溶出した（線速度 90cm/h) 。各クロマトグラフィーの溶出曲線を図 6、 7に示す。

図 6、 7に示すように、 pHグラージェント溶出ではヒッジポリクローナル抗体の方がヒトポリクローナル抗体より早く溶出し、図 7に示すように両者混合物のク口マトにおいて、ヒトポリクローナル抗体とヒッジポリクローナル抗体は分離された。産業上の利用可能性 ( 1 ) 本発明の「陰イオン交換クロマトグラフィ一"陽イオン交換クロマトグラフィー」という精製シークェンスにより、従来の「陽イオン交換クロマトダラフィ一 ~陰イオン交換クロマトグラフィー」の一連の精製シークェンスにおいて必須である希釈工程が大幅に簡略化され、 ①希釈溶液が必要となる、 ②希釈による容量増加の結果装置が大型化する、 ③作業が長時間化する、などの問題が解決された。（2 ) 本発明により、これまで未解決であった偶蹄目の動物の抗体およびヒト抗体を含有するの混合物から該ヒト抗体を単離する方法が解決された。また、実施例 3に示すように、精製工程にウィルス不活化工程や、ウィルス除去工程を含ませることにより、医薬として安全に使用し得る精製抗体を得ることができる。本明細書に引用されたすベての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲

1. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(1) プロテイン Aァフィ二ティ一クロマトグラフィーで精製する工程、および

(3) (2) に次いで、クェン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および

(4) (3) に次いで、溶出液をリン酸ナトリウム緩衝液で ρΗ4·0〜8· 5に調整する工程、および

(5) (4) に次いで、（4) の溶出液を Tris- HC1緩衝液で ρΗ6· 0〜8.5に調整する工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を酢酸またはクェン酸で ρΗ4·0〜7.0 に調整する工程、および

(11) (10) に次いで、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム：クェン酸緩衝液ならびに塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

5. さらに、

(12) 請求項 4記載の工程（11) に次いで、請求項 4記載の工程（11) の溶出液に硫酸アンモニゥムを添加し、水酸化ナトリゥム水溶液で ρΗ6.0〜8.0に調整する工程、および

( 15) (14)に次いで、（13)の緩衝液中の硫酸アンモニゥム濃度を低下させることにより該疎水性カラムから該抗体を溶出する工程、

6 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 1から 5のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

7 . ウィルスを不活化する工程が、プロテイン Aクロマトグラフィーで精製する工程の後に行われる、請求項 6記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

8 . ウィルスの不活化が、請求項 4の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 7記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

9 . ウィルス除去フィルターを用いてのろ過によるウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法の最終工程で行われる、請求項 6から 8のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 0 . 請求項 4記載の工程（4 ) のリン酸ナトリウム緩衝液を Tri s- HC1緩衝液に代えた請求項 4〜 9のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 1 . 請求項 4記載の工程（4 ) および（5 ) を、下記の工程に代えた、請求項 4〜 9のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 3 ) に次いで、溶出液を Tris- HC1緩衝液で ρΗ6· (！〜 8. 5に調整する工程

1 2 . 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。 ( 1 ) 10〜100mMリン酸ナトリゥムおよび 0〜4.0M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および

(3) (2) に次いで、 10〜100mMクェン酸ナトリウム緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および

(4) (3) に次いで、溶出液を 10〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液で ρΗ4· 0 〜8.5に調整する工程、および

( 5 ) (4) に次いで、（·4) の溶出液を 0.5〜1· 5Μ Tris- HC1緩衝液で pH6.0〜8.5に調整する工程、および

(6) (5) に次いで、 10〜20謹 Tris- HC1緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（5) の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および

(11) (10)に次いで、 10〜50mM酢酸ナトリウムまたは 10〜50mMリン酸ナトリゥム： 10〜50ιιιΜクェン酸緩衝液ならびに 0.1〜1.0M塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

1 3. さらに、 ( 12) 請求項 1 2に記載の工程（11) に次いで、請求項 1 2に記載の工程 ( 11) の溶出液に 0. 8〜1. 2M硫酸アンモニゥム濃度になるように硫酸アンモニゥムを添加し、 1. 0〜10. 0M水酸化ナトリゥム水溶液で pH6. 0〜8. 0に調整する工程、および

( 13) (12)に次いで、 0. 8〜1. 2M硫酸アンモニゥムおよび 10謹〜 lOOmMリン酸ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および

1 4 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 1 2または 1 3に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 5 . ウィルスの不活化が、請求項 1 2の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 1 4記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 6 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、請求項 1 2の工程（11) に次いで行われる、請求項 1 4または 1 5に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 7 . ウィルス除去フィルターを用いてのろ過によるウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、請求項 1 3の工程（15) に次いで行われる、請求項 1 4または 1 5に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 8. 請求項 12に記載の工程（4) のリン酸ナトリウム緩衝液を 0· 5〜1.5M Tris- HC1緩衝液に代えた請求項 1 2〜1 7のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

1 9. 請求項 12記載の工程（4) および（5) を、下記の工程に代えた、請求項 12〜17のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(3) に次いで、溶出液を 0.5〜1.5M Tris-HCl緩衝液で ρΗ6.0〜8· 5に調整するェ程

20. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

( 1 ) 10〜20 リン酸ナトリゥムおよび 0.15M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロテイン Αカラムに、抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および

(5) (4) に次いで、（4) の溶出液を 1.0〜1.5M Tris_HCl緩衝液で pH6.0〜8.5に調整する工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を 1M酢酸またはクェン酸で ρΗ4·0〜 7.0に調整する工程、および (9) (8) に次いで、 20mM酢酸ナトリウム緩衝液または 20 リン酸ナトリゥム： 10mMクェン酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（8) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させる工程、および

(11) (10) に次いで、 20mM酢酸ナトリウムまたは 20mMリン酸ナトリウム： 10mMクェン酸緩衝液ならびに 0.3M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

21. さらに、

(12) 請求項 2 0に記載の工程（11) に次いで、請求項 2 0に記載の工程 (11) の溶出液に 1.0M硫酸アンモニゥム濃度になるように硫酸アンモニゥムを添加し、 10.0M水酸化ナトリウム水溶液で pH6.0〜8.0に調整する工程、および

(13) (12)に次いで、 1.0M硫酸アンモニゥムおよび 10mMリン酸ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、および

2 2. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 20または 2 1に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

2 3. ウィルスの不活化が、請求項 2 0の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 2 2記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

2 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、請求項 20の工程（11) に次いで行われる、請求項 22または 23に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

25. ウィルス除去フィルタ一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、請求項 2 1の工程（15) に次いで行われる、請求項 22または 23に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

2 6. 請求項 2 0に記載の工程（4) のリン酸ナトリウム緩衝液を 1.0M Tris- HC1緩衝液に代えた請求項 20〜25のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

27. 請求項 20に記載の工程（4) および（5) を、下記の工程に代えた、請求項 20〜25のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(3) に次いで、溶出液を 1.簡 Tris- HC1緩衝液で pH6.0〜8.5に調整する工程 28. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(5) (4) に次いで、（4) の溶出液を 1.0〜1.5M Tris- HC1緩衝液で PH8.0に調整する工程、および (6) (5) に次いで、 10mM Tris- HC1緩衝液で平衡化した陰イオン交換力ラムに（5) の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を 1.0M酢酸またはクェン酸で pH5.0 に調整する工程、および

(11) (10) に次いで、 20mM酢酸ナトリウムまたは 20mMリン酸ナトリウム： 10mMクェン酸緩衝液ならびに 0.3M塩化ナトリウムを含有する緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

29. さらに、

(12) 請求項 2 8に記載の工程（11) に次いで、請求項 2 8に記載の工程 (11) の溶出液に 1.0M硫酸アンモニゥム濃度になるように硫酸アンモニゥムを添加し、 10.0M水酸化ナトリウム水溶液で PH7.0に調整する工程、および

(15) (14)に次いで、（13)の緩衝液中の硫酸アンモニゥム濃度を低下させることにより該疎水性力ラムから該抗体を溶出する工程、

3 0. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 28または 29に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

3 1. ウィルスの不活化が、請求項 28の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 30記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

32. ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、請求項 28の工程（11) に次いで行われる、請求項 30または 3 1に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

33. ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、請求項 29の工程（15) に次いで行われる、請求項 30または 3 1に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

3 4. 請求項 2 8に記載の工程（4) のリン酸ナトリウム緩衝液を 1.0M Tris_HCl緩衝液に代えた請求項 28〜33のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

35. 請求項 28記載の工程（4) および（5) を、下記の工程に代えた、請求項 28~33のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(2) (1) に次いで、 pH6.0〜8.5の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、および (3) (2) に次いで、 ρΗ2· 7〜4· 0の緩衝液により該抗体を溶出させる工程、および

(6) (5) に次いで、 ρΗ6.0〜8.5の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに（5) の溶出液を添加し、該溶出液を該陰イオン交換カラムに接触させるェ程、および

(8) (7) に次いで、（7) の溶出液を ρΗ4.0〜7.0に調整する工程、および

(10) (9) に次いで、 ρΗ4.0〜7.0の緩衝液で該陽イオン交換カラムを洗浄する工程、および

(11) (10) に次いで、 0.1〜1.0Μの塩を含有する ρΗ4·0〜7.0の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

37. さらに、

(12) 請求項 3 6に記載の工程（11) の溶出液に 0.8〜1.2Μの濃度となるように塩を添加し、さらに ρΗ6.0〜8.0に調整する工程、

(13) (12)の塩を 0.8〜1.2Μの濃度で含有する ρΗ6.0〜8.0の緩衝液で平衡化した疎水性カラムに（12)の溶出液を添加し、該溶出液を該疎水性カラムに接触させる工程、

(14) (12)の塩を 0.8〜1.2Μの濃度で含有する、 ρΗ6. (！〜 8.0の緩衝液で該疎水性カラムを洗浄する工程、および

3 8 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 3 6または 3 7に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

3 9 . ウィルスの不活化が、請求項 3 6の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 3 8記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 0 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および/または無菌ろ過工程が、請求項 3 6の工程（1 1) に次いで行われる、請求項 3 8または 3 9に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 1 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、請求項 3 7の工程（15) に次いで行われる、請求項 3 8または 3 9に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 2 . 請求項 3 6に記載の工程（2 ) の pH6. 0〜8. 5の緩衝液が工程（1 ) の緩衝液と同一であり、請求項 3 6に記載の工程（7 ) の pH6. 0〜8. 5の緩衝液が工程 ( 6 ) の緩衝液と同一であり、かつ請求項 3 6に記載の工程（10) の pH4. 0〜7. 0 の緩衝液が工程（9 ) の緩衝液と同一である、請求項 3 6記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 3 . 請求項 3 7に記載の工程（14)の（12)の塩を 0. 8〜1. 2Mの濃度で含有する、 pH6. 0〜8. 0の緩衝液が工程（13)の緩衝液と同一である、請求項 3 7〜4 2のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 4 . 請求項 3 6に記載の工程（1 1)の塩が塩化ナトリウムである請求項 3 6〜 4 3のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

45. 請求項 37に記載の工程（12)の塩が硫酸アンモニゥムである請求項 36 〜45のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

46. 請求項 36記載の工程（1) の緩衝液が、 4.0M以下の塩を含有する請求項 36〜45のいずれか 1項に記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

47. 塩が塩化ナトリウムである請求項 46記載の抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

4 8. 少なくとも以下の工程を含む、抗体を含有する混合物から該抗体を精製するための方法。

(1) pH6.0〜8.5の緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラムに抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該陰イオン交換カラムに接触させる工程、および

(2) (1) に次いで、 ρΗ6.0〜8.5の緩衝液で該陰イオン.交換カラムから該抗体を溶出させる工程、および

(3) (2) に次いで、（2) の溶出液を pH4.0〜7.0に調整する工程、および

(4) (3) に次いで、 pH4.0〜7.0の緩衝液で平衡化した陽イオン交換カラムに（3) の溶出液を添加し、該溶出液を該陽イオン交換カラムに接触させるェ程、および

(6) (5) に次いで、 0.1〜1.0Μの塩を含有する ρΗ4.0~7.0の緩衝液で該陽イオン交換カラムから該抗体を溶出する工程

49. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 48記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 0 . ウィルスの不活化が、請求項 4 8の工程（1 ) の前に、抗体含有溶液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 4 9記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 1 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および/または無菌ろ過工程が、請求項 4 8の工程（6 ) に次いで行われる、請求項 4 9または 5 0に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。 5 2 . 請求項 4 8に記載の工程（2 ) の pH6. 0〜8. 5の緩衝液が工程（ 1 ) の緩衝液と同一であり、かつ請求項 4 8に記載の工程（5 ) の pH4. 0〜7. 0の緩衝液が工程（4 ) の緩衝液と同一である請求項 4 8〜 5 1のいずれか 1項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 3 . 請求項 4 8に記載の工程（6 ) の塩が塩化ナトリウムである請求項 4 8 〜 5 2のいずれか 1項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 4 . 抗体がヒト抗体である請求項 1〜 5 3のいずれか 1項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 5 . 抗体がモノクローナル抗体である請求項 1〜 5 4のいずれか 1項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 6 . 抗体が IgGである請求項 1〜 5 5のいずれか 1項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 7 . 抗体が IgG 1、 IgG 2または IgG 4である請求項 5 6記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 8 . 抗体が、抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列において、天然に存在する重鎖定常領域のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が欠失し、または天然に存在する重鎖定常領域のァミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、または天然に存在する重鎖定常領域に少なくとも一つのアミノ酸が付加した抗体である、請求項 5 4〜5 7のいずれか 1項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

5 9 . 抗体が他の化合物と共有あるいは配位結合した請求項 5 4〜 5 8のいずれか 1項に記載の抗体を含む混合物から該抗体を精製するための方法。

60. ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から、プロテイン Aァフィ二ティ一クロマトグラフィ一により該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。

6 1. 有蹄動物が、ゥシ、ャギおよびヒッジからなる群から選択される請求項

60記載の該ヒト抗体と該有蹄動物の抗体を分離する方法。

62. 分離が、 pHグラージェント溶出である請求項 60または 61記載の方法。

63. 分離が、 pH段階溶出である請求項 60または 61記載の方法。

64. 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

(1) リン酸ニナトリウム、酢酸ナトリウム、グリシンおよび塩化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロティン Aカラムに接触させる工程、

および

(2) (1) についで、（1) の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、および

(3) (2) についで、（1) の緩衝液中の pHを低下させることにより該プロティン Aカラムから該ヒト抗体を溶出する工程

65. 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される請求項 6 4記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

66. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルタ一を用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 64または 65に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

67. ウィルスの不活化が、請求項 64の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 66記載のヒ卜抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

68. ウィルス除去フィルタ一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程および/または無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項 66または 6 7記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

69. pHの低下が、グラ一ジェント的である請求項 64〜68のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

70. pHの低下が、段階的である請求項 64〜 6 8のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。 7 1. 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

(1) 0· 05〜0.15Mリン酸ニナトリウム、 0.05〜0.15M酢酸ナトリウム、 0.05 〜0.15Mダリシンおよび 0.05〜0.20M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロティン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および

(3) (2) についで、（1) の緩衝液中の pHを低下させることにより該プ口ティン Aカラムから該ヒト抗体を溶出する工程

7 2. 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される請求項 7 1記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 3. さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィル夕一を用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 71または 72に記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

74. ウィルスの不活化が、請求項 7 1の工程（3) に次いで、工程（3) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 73記載のヒト抗体を、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

7 5. ウィルス除去フィルタ一を用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項 73または 7 4に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。 76. pHの低下が、グラージェント的である請求項 7 1〜 75のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。。

7 7. pHの低下が、段階的である請求項 7 1〜75のいずれか 1項に記載のヒ卜抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。。 7 8. 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

(1) 0· 10Mリン酸ニナトリウム、 0.10M酢酸ナトリウム、 0.10Mグリシンおよび 0.15M塩化ナトリゥムを含有する緩衝液で平衡化したプロティン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、および

(3) (2) に次いで、（1) の緩衝液中の pHを低下させることにより該プロティン Aカラムから該ヒト抗体を溶出する工程

7 9 . 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される請求項 7 8記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 0 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 7 8または 7 9に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 1 . ウィルスの不活化が、請求項 7 8の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を PH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 8 0記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 2 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程および Zまたは無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項 8 0または 8

1に記載のヒ卜抗体を、該ヒ卜抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 3 . pHの低下が、ダラ一ジェント的である請求項 7 8〜 8 2のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 4 . pHの低下が、段階的である請求項 7 8〜 8 2のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。 8 5 . 少なくとも以下の工程を含む、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

( 1 ) PH7. 5〜8. 5の緩衝液で平衡化したプロテイン Aカラムに、ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物を添加し、該混合物を該プロテイン Aカラムに接触させる工程、

( 2 ) pH7. 5〜8. 5の緩衝液で該プロテイン Aカラムを洗浄する工程、 ( 3 ) ( 2 ) の緩衝液の pHを低下させることにより該プロテイン Aカラムから該ヒト抗体を溶出する工程

8 6 . 有蹄動物がゥシ、ャギおよびヒッジからなる群より選択される請求項 8 5記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 7 . さらに、抗体含有溶液を酸性条件下におくことによりウィルスを不活化する工程、ウィルス除去フィルターを用いて抗体含有溶液からウィルスを除去する工程および抗体含有溶液を無菌ろ過する工程の 1工程、 2工程または 3工程を含む、請求項 8 5または 8 6に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 8 . ウィルスの不活化が、請求項 8 5の工程（3 ) に次いで、工程（3 ) で得られた溶出液を pH4以下に調整し、 30分間以上放置することにより行われる、請求項 8 7記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

8 9 . ウィルス除去フィルターを用いたろ過によりウィルスを除去する工程およびまたは無菌ろ過工程が、ヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法の最終工程において行われる、請求項 8 7または 8 8に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 0 . pHの低下が、グラージェント的である請求項 8 5〜8 9のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 1 . pHの低下が、段階的である請求項 8 5〜8 9のいずれか 1項に記載のヒ卜抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。 9 2 . 請求項 8 5記載の工程（2 ) の pH7. 5〜8. 5の緩衝液が、工程（ 1 ) の緩衝液と同一である、請求項 8 5〜 9 1のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 3 . 請求項 8 5記載の工程（1 ) の ρΗ7. 5〜8. 5の緩衝液が、 0. 05〜0. 20Mの濃度で塩を含有する、請求項 8 5〜9 2のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 4 . 塩が塩化ナトリウムである、請求項 9 3記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 5 . ヒト抗体がヒトポリクローナル抗体である請求項 6 0〜9 4のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 6 . 有蹄動物の抗体がゥシポリクローナル抗体、ャギポリクローナル抗体およびヒッジポリクローナル抗体からなる群から選択される請求項 6 0〜9 5のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 7 . ヒト抗体が IgGである請求項 6 0〜 9 6のいずれか 1項に記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。

9 8 . ヒト抗体が IgGl、 IgG2または IgG4である、請求項 9 7記載のヒト抗体を、該ヒト抗体と有蹄動物の抗体を含有する混合物から単離する方法。