CN116655726A - 基于离子交换层析的抗体纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，包括对待纯化抗体样品依次进行上样至离子交换层析柱、淋洗和洗脱的步骤；其中，所述淋洗包括第一次淋洗、第二次淋洗、第三次淋洗和第四次淋洗，所述第三次淋洗采用的淋洗液包含浓度为1.5mM~3mM的半胱氨酸以及浓度为0.4mM~0.8mM的胱氨酸，pH为7~7.8。上述基于离子交换层析的抗体纯化方法，在离子交换层析的基础上配合采用包含特定浓度的半胱氨酸以及胱氨酸，且pH为7~7.8的淋洗液进行洗脱，能够在实现抗体纯化的同时实现对抗体的修复，使纯化后获得分子结构完整的抗体的含量提升，且蛋白收率高。
Description
技术领域
本申请涉及抗体纯化技术领域，特别是涉及一种基于离子交换层析的抗体纯化方法。
背景技术
抗体（Antibody）是一种由机体免疫系统针对外源物质（如细菌、病毒的蛋白）所产生的一种球状蛋白质，因此又被称为免疫球蛋白（Ig）。近年来，随着抗体药物不断应用于更多治疗领域，抗体药物的结构也变得更为多样化。特别是，随着高滴度细胞培养工艺发展，以及双特异性抗体和三特异性抗体等复杂分子的出现，二硫键配对不完全或错配导致的分子异质性问题屡见不鲜，导致分子结构完整的抗体比例大大降低。
另外，抗体分子通常采用柱层析的方法进行纯化，在纯化过程中不可避免地造成分子结构完整的抗体的进一步的损失，如此使得抗体的生产成本一直居高不下。有方法通过在柱层析的洗脱阶段进行切峰，以去除抗体片段较多的组分提高分子结构完整的抗体比例，但此方法会损失大量蛋白，导致蛋白收率大大降低。
发明内容
基于此，本申请提供一种基于离子交换层析的抗体纯化方法。该抗体纯化方法能够在纯化的同时提升分子结构完整的抗体的含量，且蛋白收率高。
具体技术方案如下：
一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，包括对含抗体的样品依次进行上样至离子交换层析柱、淋洗和洗脱的步骤；
其中，所述淋洗采用的淋洗液包含浓度为1.5mM~3mM的半胱氨酸以及浓度为0.4mM~0.8mM的胱氨酸，pH为7~7.8；所述淋洗包括如下步骤：
室温条件下，采用第一淋洗液进行第一次淋洗，所述第一淋洗液包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6；
室温条件下，采用第二淋洗液进行第二次淋洗，所述第二淋洗液包含浓度为15mM~25mM的磷酸盐缓冲液，pH为7.5~8.5；
35℃~37℃条件下，采用第三淋洗液进行第三次淋洗，所述第三淋洗液包含浓度为1.5mM~3mM的半胱氨酸以及浓度为0.4mM~0.8mM的胱氨酸，pH为7~7.8；所述第三淋洗液的保留时间为5~10分钟；
室温条件下，采用第四淋洗液进行第四次淋洗，所述第四淋洗液包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6。
在其中一些实施例中，所述第一淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；及/或，
所述第二淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟。
在其中一些实施例中，所述第四淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟。
在其中一些实施例中，所述离子交换层析柱的填料为POROS XS树脂。
在其中一些实施例中，所述上样的载量为20~40g/L。
在其中一些实施例中，所述洗脱包括采用洗脱液A和洗脱液B进行等度洗脱的步骤；
所述洗脱液A包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6；
所述洗脱液B包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液以及浓度为0.5M~1.5M的NaCl，pH为5~6。
在其中一些实施例中，所述洗脱液A与洗脱液B的体积百分比为40%:60%~60%:40%。
在其中一些实施例中，所述洗脱液A和洗脱液B的总用量≥5倍柱体积，保留时间≥5分钟。
在其中一些实施例中，所述抗体的平均分子量为90KDa~180KDa。
在其中一些实施例中，所述上样之前还包括对所述离子交换层析柱进行消毒、预平衡和平衡中的一步或多步，所述洗脱之后还包括对所述离子交换层析柱进行再生、消毒和保存中的一步或多步。
上述基于离子交换层析的抗体纯化方法，在离子交换层析的基础上配合采用包含特定浓度的半胱氨酸以及胱氨酸，且pH为7~7.8的淋洗液进行洗脱，能够在实现抗体纯化的同时实现对抗体的修复，使纯化后获得分子结构完整的抗体的含量提升，且蛋白收率高。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本申请的基于离子交换层析的抗体纯化方法作进一步详细的说明。本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本申请中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本申请中的室温一般指4℃~30℃，较佳地指20±5℃。
若无特别说明，本申请中涉及的溶液的溶剂均为注射用水。
若无特别说明，本申请中涉及的步骤均在室温条件下进行。
本申请一些示例提供一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，包括含抗体的样品依次进行上样至离子交换层析柱、淋洗和洗脱的步骤；
其中，所述淋洗采用的淋洗液包含浓度为1.5mM~3mM的半胱氨酸以及浓度为0.4mM~0.8mM的胱氨酸，pH为7~7.8。
具体地，半胱氨酸的浓度包括但不限于：1.5mM、1.8mM、2mM、2.2mM、2.5mM、2.8mM、3mM或前述两者之间的范围。
具体地，胱氨酸的浓度包括但不限于：0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM或前述两者之间的范围。
具体地，淋洗液的pH包括但不限于：7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8或前述两者之间的范围。
在其中一些具体的示例中，采用包含浓度为1.5mM~3mM的半胱氨酸以及浓度为0.4mM~0.8mM的胱氨酸，pH为7~7.8的淋洗液进行淋洗的步骤在35℃~37℃条件下进行。
在其中一些具体的示例中，所述淋洗包括如下步骤S1~S4：
S1：室温条件下，采用第一淋洗液进行第一次淋洗，所述第一淋洗液包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6。
具体地，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度包括但不限于：45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或前述两者之间的范围。
具体地，所述第一淋洗液的pH包括但不限于：5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6或前述两者之间的范围。
S2：室温条件下，采用第二淋洗液进行第二次淋洗，所述第二淋洗液包含浓度为15mM~25mM的磷酸盐缓冲液，pH为7.5~8.5。
具体地，磷酸盐缓冲液的浓度包括但不限于：15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM或前述两者之间的范围。
具体地，所述第二淋洗液的pH包括但不限于：7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5或前述两者之间的范围。
S3：35℃~37℃条件下，采用第三淋洗液进行第三次淋洗，所述第三淋洗液即如上所述淋洗液。
S4：室温条件下，采用第四淋洗液进行第四次淋洗，所述第四淋洗液包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6。
具体地，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度包括但不限于：45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或前述两者之间的范围。
具体地，所述第四淋洗液的pH包括但不限于：5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6或前述两者之间的范围。
在其中一些具体的示例中，所述第一淋洗液的用量≥3倍柱体积。进一步地，用量为3~5倍柱体积。
在其中一些具体的示例中，所述第一淋洗液的保留时间≥5分钟。进一步地，保留时间为5~10分钟。
在其中一些具体的示例中，所述第二淋洗液的用量≥3倍柱体积。进一步地，用量为3~5倍柱体积。
在其中一些具体的示例中，所述第二淋洗液的保留时间≥5分钟。进一步地，保留时间为5~10分钟。
在其中一些具体的示例中，所述第三淋洗液的用量≥5倍柱体积。进一步地，用量为5~8倍柱体积。
在其中一些具体的示例中，所述第三淋洗液的保留时间≥5分钟。进一步地，保留时间为5~10分钟。
在其中一些具体的示例中，所述第四淋洗液的用量≥3倍柱体积。进一步地，用量为3~5倍柱体积。
在其中一些具体的示例中，所述第四淋洗液的保留时间≥5分钟。进一步地，保留时间为5~10分钟。
在其中一些具体的示例中，所述离子交换层析柱的填料为POROS XS树脂。可以理解地，POROS XS树脂为一种强阳离子交换树脂。
在其中一些具体的示例中，所述上样的载量为20~40g/L。具体地，所述上样的载量包括但不限于：20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L或前述两者之间的范围。
在其中一些具体的示例中，所述洗脱包括采用洗脱液A和洗脱液B进行等度洗脱的步骤；
所述洗脱液A包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6。
具体地，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度包括但不限于：45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或前述两者之间的范围。
具体地，所述洗脱液A的pH包括但不限于：5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6或前述两者之间的范围。
所述洗脱液B包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液以及浓度为0.5M~1.5M的NaCl，pH为5~6。
具体地，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度包括但不限于：45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或前述两者之间的范围。
具体地，所述洗脱液B的pH包括但不限于：5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6或前述两者之间的范围。
具体地，NaCl的浓度包括但不限于：0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M或前述两者之间的范围。
进一步地，所述洗脱液A与洗脱液B的体积百分比为40%:60%~60%:40%。具体地，所述洗脱液A与洗脱液B的体积百分比包括但不限于：40%:60%、45%:55%、50%:50%、55%:45%、60%:40%或前述两者之间的范围。
在其中一些具体的示例中，所述洗脱液A和洗脱液B的总用量≥5倍柱体积，保留时间≥5分钟。进一步地，总用量为5~8倍柱体积；进一步地，保留时间为5~10分钟。
另外，在其中一些具体的示例中，所述抗体的平均分子量为90KDa~180KDa。具体地，所述抗体的平均分子量包括但不限于：90KDa、95KDa、100KDa、105KDa、110KDa、115KDa、120KDa、125KDa、130KDa、135KDa、140KDa、145KDa、150KDa、155KDa、160KDa、165KDa、170KDa、174KDa、175KDa、180KDa或前述两者之间的范围。
在其中一些具体的示例中，所述待纯化抗体样品中的抗体为单克隆抗体。
另外可以理解地，所述抗体纯化方法在上样之前还可以包括对离子交换层析柱进行消毒、预平衡和平衡中的一步或多步，洗脱之后还可以包括对离子交换层析柱进行再生、消毒和保存中的一步或多步。
具体地，在其中一些具体的示例中，所述基于离子交换层析的抗体纯化方法，包括如下步骤：
（1）前消毒：使用0.3M~0.7M NaOH溶液冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（2）预平衡：使用预平衡液（45mM~55mM醋酸-醋酸钠缓冲液，0.5M~1.5M NaCl，pH 5~6）冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（3）平衡：使用平衡液（45mM~55mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5~6）冲洗层析柱至少5倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（4）上样：取抗体样品上样，上样载量20~40g/L，工艺保留时间不少于5分钟；
（5）第一次淋洗：使用第一淋洗液进行淋洗（45mM~55mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5~6）冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（6）第二次淋洗：使用第二淋洗液进行淋洗（15mM~25mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.5~8.5）冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（7）第三次淋洗：35℃~37℃条件下，使用第三淋洗液进行淋洗（1.5mM~3mM半胱氨酸，0.4mM~0.8mM胱氨酸，pH 7.0-7.8）冲洗层析柱至少5倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（8）第四次淋洗：使用第四淋洗液进行淋洗（45mM~55mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5~6）冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（9）洗脱：使用洗脱液A与洗脱液B进行等度洗脱（洗脱液A：45mM~55mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5~6；洗脱液B：45mM~55mM醋酸-醋酸钠缓冲液，0.5M~1.5M NaCl，pH 5~6；洗脱液A与洗脱液B的体积百分比为40%:60%~60%:40%）冲洗层析柱至少5倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（10）再生：使用预平衡液（45mM~55mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，0.5M~1.5MNaCl，pH 5~6）冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（11）消毒：使用0.3M~0.7M NaOH溶液冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟；
（12）保存：使用0.005~0.02 M NaOH溶液冲洗层析柱至少3倍柱体积，工艺保留时间不少于5分钟。
以下为具体的实施例，如无特别说明，实施例中采用的试剂均为市售产品。
实施例1
本申请为一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，采用填料为离子交换层析填料POROS XS（货号：4404336；厂家：Thermo）为离子交换层析柱，目标分子为单克隆抗体分子，分子量174KD。
步骤如下（除第三次淋洗外，其余步骤均在室温条件下进行）：
（1）前消毒：使用0.5M NaOH溶液冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（2）预平衡：使用预平衡液（50mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，1M NaCl，pH 5.5）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（3）平衡：使用平衡液（50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5.5）冲洗层析柱5倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（4）上样：取抗体样品上样，上样载量30g/L，工艺保留时间5分钟；
（5）第一次淋洗：使用第一淋洗液进行淋洗（50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5.5）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（6）第二次淋洗：使用第二淋洗液进行淋洗（20mM 磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH 8）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（7）第三次淋洗：35℃~37℃条件下，使用第三淋洗液进行淋洗（2.5mM半胱氨酸，0.3mM胱氨酸，pH 7）冲洗层析柱5倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（8）第四次淋洗：使用第四淋洗液进行淋洗（50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5.5）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（9）洗脱：使用洗脱液A与洗脱液B进行等度洗脱（洗脱液A：50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5.5；洗脱液B：50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，1M NaCl，pH 5.5；洗脱液A与洗脱液B的体积百分比为50%~50%）冲洗层析柱5倍柱体积，工艺保留时间5分钟；收集洗脱液，紫外收峰范围为峰前50mAU/mm至峰后50 mAU/mm；
（10）再生：使用预平衡液（50mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，1M NaCl，pH 5.5）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（11）消毒：使用0.5M NaOH溶液冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（12）保存：使用0.01 M NaOH溶液冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟。
对纯化前后的样品进行检测，结果如下表1所示：
表1
对比例1
本对比例提供一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，抗体样品批次、目标分子和步骤同实施例1，主要区别在于：未进行步骤（7）。
对纯化前后的样品进行检测，结果如下表2所示：
表2
对比例2
本对比例提供一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，目标分子和步骤同实施例1，抗体样品的获得工艺同实施例1，仅获得批次不同，主要区别在于：未进行步骤（7），且步骤（9）替换如下：
洗脱液A：50mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 5.5；洗脱液B：20mM 磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，0.1M NaCl，pH 7.0；采用梯度洗脱，洗脱液B由40%变化至90%，10CV。即在洗脱阶段进行切峰以去除抗体片段。
对纯化前后的样品进行检测，结果如下表3所示：
表3
对比例3
本对比例提供一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，目标分子和步骤同实施例1，抗体样品的获得工艺同实施例1，仅获得批次不同，主要区别在于：将填料替换为亲和层析填料MabSelect SuRe LX（货号：17547401；厂家：Cytiva），同时，亲和层析填料捕获抗体的原理为特异性结合，不需低pH条件平衡和淋洗，故平衡液和淋洗液稍有差异，另外，亲和层析填料需低pH洗脱，故洗脱液稍有差异。
具体步骤如下：
（1）前消毒：使用0.5M NaOH溶液冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（2）平衡：使用平衡液（50mM Tris，0.15M NaCl，pH7.2）冲洗层析柱6倍柱体积，工艺保留时间10分钟；
（3）上样：取抗体样品上样，上样载量30g/L，工艺保留时间5分钟；
（4）第一次淋洗：使用第一淋洗液进行淋洗（50mM Tris，0.15M NaCl，pH7.2）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（5）第二次淋洗：使用第二淋洗液进行淋洗（20mM 磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH 8）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（6）第三次淋洗：35℃~37℃条件下，使用第三淋洗液进行淋洗（2.5mM半胱氨酸，0.3mM胱氨酸，pH 7）冲洗层析柱5倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（7）洗脱：使用洗脱液50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 3.5冲洗层析柱5倍柱体积，工艺保留时间5分钟；收集洗脱液，紫外收峰范围为峰前50mAU/mm至峰后50 mAU/mm；
（8）再生：使用再生液（1M 醋酸溶液）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（8）后平衡：使用平衡液进行平衡（50mM Tris，0.15M NaCl，pH7.2）冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（9）消毒：使用0.1M NaOH溶液冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟；
（10）保存：使用20%乙醇溶液冲洗层析柱3倍柱体积，工艺保留时间5分钟。
对纯化前后的样品进行检测，结果如下表4所示：
表4
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，包括对含抗体的样品依次进行上样至离子交换层析柱、淋洗和洗脱的步骤；
所述淋洗包括如下步骤：
室温条件下，采用第一淋洗液进行第一次淋洗，所述第一淋洗液包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6；
室温条件下，采用第二淋洗液进行第二次淋洗，所述第二淋洗液包含浓度为15mM~25mM的磷酸盐缓冲液，pH为7.5~8.5；
35℃~37℃条件下，采用第三淋洗液进行第三次淋洗，所述第三淋洗液包含浓度为1.5mM~3mM的半胱氨酸以及浓度为0.4mM~0.8mM的胱氨酸，pH为7~7.8；所述第三淋洗液的保留时间为5~10分钟；
室温条件下，采用第四淋洗液进行第四次淋洗，所述第四淋洗液包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6。
2.根据权利要求1所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述第一淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；及/或，
所述第二淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟。
3.根据权利要求1所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述第四淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟。
4.根据权利要求1~3任一项所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述离子交换层析柱的填料为POROS XS树脂。
5.根据权利要求1~3任一项所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述上样的载量为20~40g/L。
6.根据权利要求1~3任一项所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述洗脱包括采用洗脱液A和洗脱液B进行等度洗脱的步骤；
所述洗脱液A包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5~6；
所述洗脱液B包含浓度为45mM~55mM的醋酸-醋酸钠缓冲液以及浓度为0.5M~1.5M的NaCl，pH为5~6。
7.根据权利要求6所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述洗脱液A与洗脱液B的体积百分比为40%:60%~60%:40%。
8.根据权利要求6所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述洗脱液A和洗脱液B的总用量≥5倍柱体积，保留时间≥5分钟。
9.根据权利要求1~3和7~8任一项所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述抗体的平均分子量为90KDa~180KDa。
10.根据权利要求1~3和7~8任一项所述的基于离子交换层析的抗体纯化方法，其特征在于，所述上样之前还包括对所述离子交换层析柱进行消毒、预平衡和平衡中的一步或多步，所述洗脱之后还包括对所述离子交换层析柱进行再生、消毒和保存中的一步或多步。
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