[go: up one dir, main page]

WO2003018742A2 - Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora - Google Patents

Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora Download PDF

Info

Publication number
WO2003018742A2
WO2003018742A2 PCT/RU2002/000405 RU0200405W WO03018742A2 WO 2003018742 A2 WO2003018742 A2 WO 2003018742A2 RU 0200405 W RU0200405 W RU 0200405W WO 03018742 A2 WO03018742 A2 WO 03018742A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
aηά
recombinant
asparaginase
investigation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2002/000405
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2003018742A3 (fr
Inventor
Mikhail Anatolevich Eldarov
Aleksandr Aleksandrovich Zhgun
Yury Viktorovich Gervaziev
Svetlana Serebedzhanovna Aleksandrova
Vladimir Georgievich Bogush
Konstantin Vasilevich Sidoruk
Elena Vasilevna Sveshnikova
Anna Arkadevna Borisova
Natalya Mikhailovna Omelnyuk
Aleksandr Ivanovich Archakov
Konstantin Georgievich Skryabin
Nikolai Nikolaevich Sokolov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GOSUDARSTVENNOE UCHREZHDENIE NAUCHNO-ISSLEDOVATELSKY INSTITUT BIOMEDITSINSKOY KHIMII IM OREKHOVICHA ROSSIISKOY AKADEMII MEDITSINSKIKH NAUK
Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Tsentr 'bioinzheneriya' Rossiiskoy Akademii Nauk
Original Assignee
GOSUDARSTVENNOE UCHREZHDENIE NAUCHNO-ISSLEDOVATELSKY INSTITUT BIOMEDITSINSKOY KHIMII IM OREKHOVICHA ROSSIISKOY AKADEMII MEDITSINSKIKH NAUK
Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Tsentr 'bioinzheneriya' Rossiiskoy Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2001123442/13A external-priority patent/RU2221868C2/ru
Priority claimed from RU2002108505/13A external-priority patent/RU2224797C2/ru
Application filed by GOSUDARSTVENNOE UCHREZHDENIE NAUCHNO-ISSLEDOVATELSKY INSTITUT BIOMEDITSINSKOY KHIMII IM OREKHOVICHA ROSSIISKOY AKADEMII MEDITSINSKIKH NAUK, Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Tsentr 'bioinzheneriya' Rossiiskoy Akademii Nauk filed Critical GOSUDARSTVENNOE UCHREZHDENIE NAUCHNO-ISSLEDOVATELSKY INSTITUT BIOMEDITSINSKOY KHIMII IM OREKHOVICHA ROSSIISKOY AKADEMII MEDITSINSKIKH NAUK
Priority to AU2002332371A priority Critical patent/AU2002332371A1/en
Publication of WO2003018742A2 publication Critical patent/WO2003018742A2/ru
Publication of WO2003018742A3 publication Critical patent/WO2003018742A3/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • Le ⁇ a ⁇ s ⁇ vennye ⁇ my ba ⁇ e ⁇ ialny ⁇ L-as ⁇ a ⁇ aginaz on ⁇ yazhenie desya ⁇ ile ⁇ y shi ⁇ is ⁇ lzuyu ⁇ sya in ⁇ n ⁇ l ⁇ giches ⁇ y ⁇ a ⁇ i ⁇ e for treating ⁇ s ⁇ y ⁇ lim ⁇ blas ⁇ ny ⁇ ley ⁇ z ⁇ v, and lim ⁇ - ⁇ e ⁇ i ⁇ ul ⁇ sa ⁇ m chel ⁇ ve ⁇ a ( ⁇ g ⁇ zyu ⁇ D.S,] ⁇ . [1985].
  • a solvable invention is the production of microscopic activity with high specific activity and lowered glutalin relevance. The problem was solved by
  • Example 1 Identification of the Strain ⁇ mm ⁇ g ⁇ . industrial L-asparaginase with high asparticase and low glutaminase activity
  • P ⁇ ayme ⁇ y is ⁇ lz ⁇ vali in PTS ⁇ with ⁇ b ⁇ azts ⁇ m gen ⁇ mn ⁇ y D ⁇ isolated from sh ⁇ amma ⁇ g ⁇ g ⁇ g ⁇ s ⁇ g ⁇ g ⁇ ⁇ a 204.
  • the volume of the reaction mixture was 50 ⁇ l of a single PCB buffer for--polimerase ( ⁇ vit iser sait »» »)»)), the percentage of the concentration was 0.5 m, the percentage was 0.5 ⁇ After amplification in 5 ⁇ l of the sample by the elec- tric elec- trophoresis in 1% agar gel, the homogeneous homogenous reaction of the particle size 300 was identified.
  • the volume of the reactive mixture was. 50 ⁇ l of a single PCB buffer for a mixture of ⁇ ⁇ and ⁇ polymer, a concentration of ⁇ - 0.4 m ⁇ , a concentration of ⁇ - - - 1 ⁇ m, a percentage of D ⁇ - 20 ng / PCRs were operated under the following conditions - heating - 2 min, 94 °, then 25 cycles of amplification - 94 °, 40 "; 50 °, 40"; 68 °, 5 '.
  • the samples obtained on the basis of the sample and the ⁇ method of electrolysis in 1% agar gel were used to identify fragments of sizes 1200 and 5000 bp, respectively. Samples were isolated from the gel (Example 2) and partitioned by nucleotide sequencing by automatically sequencing for a total of 207 seconds. The installed complete investigation has been carried out in the liver before issue 8 ⁇ , GO ⁇ 07.
  • Is ⁇ lz ⁇ vannye ⁇ ayme ⁇ y ⁇ g ⁇ anichivayu ⁇ ⁇ agmen ⁇ gene ⁇ S ⁇ - ⁇ . ⁇ 8, v ⁇ lyuchayuschy initsia ⁇ ny ⁇ d ⁇ n ⁇ anslyatsii ⁇ , ⁇ as ⁇ l ⁇ zhenny in ⁇ l ⁇ zhenii 48 ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ i 8 ⁇ , GO ⁇ 07 and ⁇ e ⁇ mina ⁇ ny ⁇ d ⁇ n ⁇ , ⁇ as ⁇ l ⁇ zhenny in ⁇ l ⁇ zhenii 1093 ⁇ y ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ i same.
  • a specific full-sized amplification product includes a complete transducer investigation of the SCC gene.
  • the following amplification conditions were used: initial denaturation - 94 °, 60 ", then 30 cycles of amplification - 94 °, 40"; 50 °, 40 "; 72 °, 90".
  • the reaction mixture was separated by 1% agar gel and the reaction product was detected - a single reaction element of 1100 p.p.
  • the substance was isolated from the gel and removed in vectrum ⁇ - ⁇ (" ⁇ beau ⁇ ", ⁇ ), as described in Example 2. From the obtained individual tips 11 plants isolated the standard method and analyzed it by means of hydrolysis of the organic process and separation of the products of the business unit in 1%.
  • EXAMPLE 4 Expression of the ⁇ - ⁇ 8 gene in the cells of the Russian Academy of Sciences through the control panel.
  • the plasmid was disassembled together with W + W, removed from the agar gel with a fragment of 2560 ⁇ .n. Two fragments of the league were removed, they took away the risks of strain ⁇ 9, stable at the same time, ampicillin and canamycin.
  • plasmid D was isolated, hydrolyzed by its natural product and detected the presence of hydrolysis products of size 3 T.p.n. and 2.5 ⁇ . ⁇ .n.
  • the physical and genetic pathway of the obtained such plasmid species is shown in Fig. 1.
  • a sulphate-ammonia fraction (22.5 ml) was applied to a ring with a safe ⁇ -25 (5 x 45 cm);
  • the speed of application of the buffer when applying and gel filtration is 400 ml / hour.
  • L-paraphaginase is eluted from the S-phase in the range of ⁇ C ⁇ concentration of 0.45 to 0.5 ⁇ . They received about 225 000 100 activity of the enzyme in 100-120 ml of buffer with an output of .75.6% (Table 3).
  • the combined active fractions suppressed the ultrafiltration by pressure on the system “Millipore” (US) with the use of an ultrafiltration membrane for 30 000 days.
  • composition of a recombinant L-aspartase ⁇ g. with ⁇ in the aforementioned above makes up about 95%, and a small.
  • the mass of the subunit of the fragment was about 36 kDa, which follows from the analysis of the preparation by the gel method of the elec- troelectomy in DDS-PG (Fig. 2).
  • the ⁇ C ⁇ - ⁇ 8 gene cures a polypeptide with an amino acid test indicated in the liver of the investigations on July 8 8., which is a result of an accident.
  • Protein samples were dissolved in 30% acetyl, containing 0.1% acid and applied to the membranes of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (USA).
  • the sequencing was performed on the site of the United Kingdom (Germany, model 816), equipped with analysis of the environment (United States, United States)
  • ⁇ - ⁇ has a wide range of ⁇ in the range of ⁇ from 7.5 to 9.0; the mass of the subunit is about 36 kDa.
  • a temperature of optimum (55 ° C) and a high specific activity of the SSC-3 see table 3.
  • the recombinant b-paraphase of ⁇ .cie ⁇ 1969 ⁇ has a very low content of glutamine, compared with the corresponding ⁇ ⁇ ⁇ ............ Skuzh ⁇ ket ierik, the hydropathy of parasitic paralysis is responsible for the many toxic effects of the drug and the pharmaceutical use.
  • the negligible glutaminase activity of the USA can cause the low toxicity of medical preparations of this medicine and their improved pharmaceuticals. 17

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

ΡΕΚΟΜБИΗΑΗΤΗΑЯ Ъ-ΑСΙΙΑΡΑГтϊΑЗΑ ΕΚШΝΙΑ сαгοϊονοгα
Οбласτь τеχниκи
Изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτи биοχимии, медицины и биοτеχнοлοгии, в часτнοсτи, κ генеτичесκοй инженеρии, и πρедсτавляеτ сοбοй φρагменτ ДΗΚ, κοдиρующий ποлную аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь Ь-асπаρагиназы (Ь- асπаρагинамидοгидροлазы, ΕС 3.5.1.1.) баκτеρии ΕгχνΜα сαШονοгα, и ποлученный πуτем эκсπρессии эτοгο φρагменτа ДΗΚ в баκτеρиальнοм шτамме ρеκοмбинанτный белοκ, сοοτвеτсτвующий Ь-асπаρагиназе Εгχмгтα сαгοϊονοгα, οбладающий высοκοй удельнοй аκτивнοсτью и ποниженным сροдсτвοм κ глуτалину. Изοбρеτение мοжеτ быτь исποльзοванο для ποлучения леκаρсτвенныχ πρеπаρаτοв.
Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи
Леκаρсτвенные φορмы баκτеρиальныχ Ь-асπаρагиназ на προτяжение десяτилеτий шиροκο исποльзуюτся в οнκοлοгичесκοй πρаκτиκе для лечения οсτρыχ лимφοбласτныχ лейκοзοв, лимφο- и ρеτиκулοсаρκοм челοвеκа (ΨгϊзюηД.С, ]χ. [1985]. Αзρага°,тазе. Μешοάз Εηζугηοϊ. 113, 608-618); (Сοκοлοв, Η.Щ Занин, Α.Α. и Αлеκсандροва, С.С. [2000]. Баκτеρиальные Ь-асπаρагиназы и глуτамин (асπаρагин)азы: неκοτορые свοйсτва, сτροение и προτивοοπуχοлевая аκτивнοсτь. Βοπρ. мед. Χимии 46 (6), 531-548). Β ποследнее вρемя ποявились сοοбщения οб исποльзοвании Ь-асπаρагиназы для лечения οсτροй миелοмοнοциτаρнοй лейκемии (Τгеϋак.Ν.Μ., ΚиρсЬеηкο,Τ.Ν., ΡοИюνД.Ζ., аηά ΖиЬгуΙз'ка,Τ.Β. [1997]. ΤЬе еШсасу οϊ χχвχщ ρгο1οη§еά-асποη Ь-азρага§ϊηазе ϊη а Ιχеатιеηϊ: ρгο§гат юг асШе ΙутρЬοЫазгϊс Ιеикетϊа ϊη аάиπз. Ιлк. δρгаνа. 81-83.), χροничесκοй лимφοциτаρнοй лейκемии
Figure imgf000003_0001
Κаζο,Ο.Μ., νегЬοезΙ,СΚ.., Τг., Уаη Εз,Τ., Κа&е νкζ.ϋ., Νиссϊ,ΜΧ., νϊаи,Α.Τ., аηά ϋаνϊзДΡ. [1984]. Саηсег тегаρу
Figure imgf000003_0002
сЬеππсаΗу тοάϊиеά еηζутез. I. Αηшитοг ρгορегϋез οι* ροϊуетуϊеηе ёгусοϊ-азρагаёϊηазе сοη]и§а1;ез. Саηсег ΒюсЬет. ΒϊορЬуз. 7, 175-186), меланοсаρκοмы (Τау1οг,С.Ψ., ϋοггД.Τ., ΡаηΙаД, ΗегзЬ,Ε.Μ., аηά δаΙтοηДΕ. [2001]. Α ρЬазе I аηά ρЬагтасοάуηаιшс еνаϊиаϋοη οι- ροϊуетуϊеηе §1усο1- сοη"и§а1;еά Ь-азρага§тазе ϊη ρа еηϊз
Figure imgf000003_0003
аάνаηсеά зοϊϊά ттοгз. Саηсег СЬетοтег. ΡЬагтасοΙ. 47, 83-88), лимφοм, связанныχ сο СПИДοм (Ανгатϊз,ν.Ι.,
Figure imgf000003_0004
ΑνгаππзД.Α., СοЬеη.ЬД., аηά ΙηάегΗеά,С. [2001. 8уηег£Ϊзгϊс аηϊшгаϊ егϊесϊ: οГ- ΡΕΟ- азρага§тазе (ΟΝСΑ8ΡΑΚ),
Figure imgf000003_0005
ΚΤ ".ηЬϊЫюгз а§аϊηзΙ Ηϊν-1 ϊηГесΙеά Τ-сеΙΙз: а тοάеϊ οι* Ηϊν-1-тάисеά Τ-сеΙΙ гутρЬοта. Ιη νϊνο 15, 1-9); (ΟШ,Ρ.8., Ьеνϊηе,Α.Μ., Κгаϋο,Μ., Κаπск,Μ.υ., Ьοигеϊгο,С, ϋеуюη,!,., Μеуег,Ρ., аηά ΚазЬееά,8. [1987]. ΑГО8-ге1аϊеά таΗ§ηаηϊ ΙутρЬοта: гезиϊϊз οГ ρгοзρесϊϊνе ϊгеаϊтеηϊ ϊгϊаϊз. I. СΗη. Οηсοϊ. 5, 1322-1328); (Οϊз5е1ЬгесЬϊ,С, ΟкзеηЪеηάΙегД, Τϊге1И,υ., Ьеρа§е,Ε., ΟаЬагге,!, ΡагсеϊД.Ρ., ΟазϊаΙάϊД, СοϊШег,Β., ΤЬузз,Α., аά ΚаρЬае1,Μ. [1993]. Ηшηаη ϊттшιοάейсϊеηсу νϊгиз-геϊаϊеά ΙутρЬοта ϊгеаϊтеηϊ ννϊϊЬ ϊηϊеηзινе сοтЫηаϊϊοη сЬетοϊЬегаρу. ΡгеηсЬ-ΙϊаΗаη Сοορегаϊϊνе Οгοиρ. Αт. I. Μеά. 95, 188-196). Β насτοящее вρемя наτивные и иммοбилизοванные πρеπаρаτы Ь-асπаρагиназ выделяюτ из πρиροдныχ шτаммοв ΕзскегϊсЫα сοϊ и Εгχχηηϊα скгузαШкетϊ (Βиск,Ρ.Ψ., ΕΙзννοгϊЬД., ΜШег,Ο.Α., 8аг§еаηϊ,Κ., ЗϊаηΙеуДΧ., аηά Ψаάе,Η.Ε. [1971]. ΤЬе ЬаϊсЬ ρгοάисϊюη οГ Ь- азρага§ϊηазе Ггот Επνϊηϊа сагοϊονοга. I. Οеη. ΜϊсгοЫοΙ. 65, ϊ); (Ηагтз,Ε.,
Figure imgf000004_0001
Τеηηт§з,Μ.Ρ., ΡιщЬ,ΚЛ., ΒеасЬатД.Κ., аηά ΚοЬт,Κ.Η. [1991]. Сοηзϊгасϊϊοη οГ еχρгеззϊοη зузϊетз Гοг ΕзсЬеπсЫа сοϋ азρага§-ηазе II аηά ϊννο-зϊеρ ρиππсаϊюη οГ ϊЬе гесοтЫηаηϊ еηζуте Ггοт •ρеπρϊазπис еχϊгасϊз. Ρгοϊеϊη Εχρг. Ρшϊι*. 2, 144-150); (Ιχе,8.Μ., ΨгοЫе,Μ.Η., аηά ΚοззД.Τ. (1989). Ь-азρага§тазе Ггοт Επνтϊа сагοϊονοга. Αη иηρгоνеά гесονегу аηά ρиπйсаϊϊοη ρгοсезз изϊη§ аГйшϊу сЬготаϊο§гаρЬу. Αρρϊ. ΒϊοсЬет. ΒϊοϊесЬηοΙ. 22, 1-11).
Извесτнο, чτο πρи лечении лейκοзοв Ь-асπаρагиназοй часτο наблюдаюτся сеρьезные ποбοчные эφφеκτы (аллеρгичесκие ρеаκции, наρушения φунκции πечени, οеτρые πанκρеаτиτы, ποчечная недοсτаτοчнοсτь, азοτемия и дρ.). Μнοгие из ниχ οбуслοвлены сποсοбнοсτью φеρменτа гидροлизοваτь не τοльκο Ь-асπаρагин, нο и Ь- глуτамин, κοτορый мοжеτ κοнκуρиροваτь за аκτивный ценτρ φеρменτа с Ь-асπаρагинοм (κοнценτρация в πлазме κροви ποследнегο πρимеρнο в 10 ρаз ниже, чем Ь-глуτамина). Ь-глуτамин являеτся οснοвнοй φορмοй τρансπορτа аминнοгο азοτа в ορганизме и дοнοροм аминοгρуππ для мнοгиχ биοсинτеτичесκиχ ρеаκций, ποэτοму προдοлжиτельнοе снижение в ορганизме уροвня глуτамина πρивοдиτ κ наρушению мнοгиχ биοχимичесκиχ προцессοв, οсοбеннο в πечени (Ο11еηзсЫа§ег,0., ΚοϊЬ,Ε., ϊηкезсЬ,'νν., Ιаηзеη,8., 8πηте1,Α., аηά Μοάάег,Β. [1988]. Αзρага§ϊηазе-ϊηάисеά άегаη§етеηϊз οГ §1иϊатϊηе теϊаЬοΗзт: ϊЬе ρаϊЬο§еηеϊϊс Ьазϊз Гοг зοте άги§-ге1аϊеά зϊάе- еГГесϊз. Εиг. I. СΗη. Ιηνезϊ 18, 512-516). Пο лиτеρаτуρным данным οτнοсиτельная сκοροсτь гидροлиза Ь-глуτамина для Ь-асπаρагиназы Εгшηϊα скгуζстϊетϊ сοсτавляеτ οτ 9% дο 15% πο οτнοшению κ τаκοвοй для Ь-асπаρагина (ΗοννагάД.Β. аηά Сагρеηϊег,Ρ.Η. [1972]. Ь-азρага§ϊηазе Гют Εгννϊηϊа сагοϊονοга. δиЬзϊгаϊе зρесϊйсϊϊу аηά еηζутаϊϊс ρгορегϊϊез. I. Βϊοϊ. СЬет. 247, 1020-1030). Эτими οбсτοяτельсτвами, а τаκже вοзниκающими аллеρгичесκими ρеаκциями и выρабοτκοй нейτρализующиχ анτиτел οбуславливаеτся значиτельнοе снижение τеρаπевτичесκοй эφφеκτивнοсτи πеρечисленныχ πρеπаρаτοв (ΒеηάϊсЬ,Α., ΚаГкеννϊϊζ,ϋ., ΑЪисЬοννзкϊ,Α., аηά ϋаνϊз,Ρ.Ρ. [1983]. ΙηЪ-Ыϊюη οГ Ыазϊο§еηезϊз Ьу ηаϊϊνе аηά ροΙуеϊЬуΙеηе §1усο1-тοάϊйеά азρага§ϊηазез Ггοт ΕзсЪеπсЫа сοИ аηά νϊЪπο зиссϊηο§еηез. Ιттиηοϊ. Сοттиη. 12, 273-284); (ΚаГкеννϊϊζ,ϋ. аηά ΒеηάϊсЪ,Α. [1983]. Εηζуте-ϊηάисеά азρага§ϊηе аηά §1иϊатте άеρϊеϊϊοη аηά ϊттиηе зузϊет Гшιсϊюη. Αт. 3. СИη. Νиϊг. 37, 1025-1030).
Β эτοй связи, для προведения неοбχοдимыχ κуρсοв κοмбиниροваннοй χимиο- и энзимοτеρаπии лейκοзοв целесοοбρазнο ρасποлагаτь Ь-асπаρагиназами, с высοκοй φеρменτаτивнοй аκτивнοсτью, и низκим анτигенным ποτенциалοм и ρбладающиχ сниженнοй τοκсичнοсτью за счеτ οτнοсиτельнο невысοκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτи.
Βышеπеρечисленнοе οбъясняеτ инτеρес κ ποисκу, χаρаκτеρисτиκе и вьщелению нοвыχ миκροбныχ асπаρагиназ, οбладающиχ улучшенными τеρаπевτичесκими свοйсτвами (ΟϊзϊазϊοД.Α., 8а1аζаг,Α.Μ., Νаά.μ,Μ., аηά ϋигάеηДЭ.Ь. [1982]. Οϊиϊатϊηазе- Ггее азρага§ϊηазе Ггοт νϊЬπο зиссϊηο§еηез: аη аηϊϋутρЪοта еηζуте 1аскт§ Ъеρаϊοϊοχϊсϊϊу. Ιηϊ. 1, Саηсег 30, 343-347). Исτοчниκοм τаκиχ асπаρагиназ мοгуτ быτь нοвые изοляτы баκτеρий ροда Εгχνϊηгα, κοτορые, сοгласнο ποследним данным, οτличаюτся дοсτаτοчнο высοκοй ваρиабельнοсτью (Ανгονа,Α.Ο., ΗутаηД-Л., ΤοϊЪД.Ь., аηά ΤοϊЪД.Κ. [2002]. Αρρϊϊсаϊϊοη οГ атρΗйеά Гга§теηϊ 1еη§ϊЪ ροΙутοгρЫзт йη§егρπηϊт§ Гοг ϊаχοηοту аηά ϊάеηϊϊйсаϊюη οГ ϊЬе зοГϊ гοϊ Ьасϊегϊа Εгννϊта сагοϊονοга аηά Εгννϊηϊа сЬгузаηϊЪетϊ. Αρρϊ. Εηνϊгοη. ΜϊсгοЫοΙ. 68, 1499-1508).
Ρасκρыτие изοбρеτения
Ρешаемοй изοбρеτением задачей являеτся ποлучение миκροбнοй асπаρагиназы с высοκοй удельнοй аκτивнοсτью и ποниженным сροдсτвοм κ глуτалину. Задача ρешалась πуτем
1. Сκρининга κοллеκции .миκροορганизмοв ροда Εгтηгα с целью οбнаρужения шτамма Εгχνгηϊα сαгοϊονοгα, синτезиρуюшегο Ь-асπаρагиназу (ΕСΑΚ-ЬΑΝ8) с высοκοй удельнοй аκτивнοсτью.
2. Βьщеления из эτοгο шτамма гена ΕСΑΚ-ΙΑΝ5, и анализа егο ποследοаτнльнοсτи.
3. Κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑСΥСЬΑΝδ, οбесπечивающей синτез ΕСΑΚ-ЬΑΝδ в κлеτκаχ ΕзскеηсЫα сοϊг.
4. Βыделения гοмοгеннοгο πρеπаρаτа аκτивнοй ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝδ. Β. ρезульτаτе выявлен шτамм Εην. сοг. С желаемыми свοйсτвами, κοτορый οбοзначен κаκ Νδ 204, οπρеделена ποследοваτельнοсτь гена, κοдиρующая ποлную аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь Ь-асπаρагиназы (ЗΕΟ, Ν0 8), эκсπρессией κοτοροй в баκτеρиальнοм шτамме ποлучен ρеκοмбинанτный φеρменτ с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью 8ΕΟ, ГО Ν0 13, сοοτвеτсτвующей «зρелοй» φορме с мοлеκуляρнοй массοй πρимеρнο 36 κДа, οбладающий φеρменτаτивнοй аκτивнοсτью Ь-асπаρагиназы (Ь-асπаρагинамидοгидροлазы, ΕС 3.5.1.1.).
Οсοбеннοсτи насτοящегο изοбρеτения ποясняюτся, нο не οгρаничиваюτся лучшими ваρианτами егο выποлнения сο ссылκами на φигуρы.
Κρаτκий πеρечень чеρτежей
Φиг. 1 изοбρажаеτ φизичесκую и генеτичесκую κаρτу πлазмиды ρΑСΥСЬΑΝδ: Ыа - ген усτοйчйвοсτи κ амπициллину, ΚаηΚ - ген усτοйчивοсτи κ κанамицину, ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8 - κοдиρующая часτь гена Ь- асπаρагиназы Εгχлηηгα сαгοϊονοгα, Τ7ρ и Τ7ϊ - учасτκи προмοτορа и τеρминаτορа для ΡΗΚ ποлимеρазы Τ7, ρ15Αοгϊ, Пοгϊ - учасτκи начала ρеπлиκации. Уκазаны ποлοжения неκοτορыχ униκальныχ сайτοв ρесτρиκции;
Φиг. 2 - элеκτροφορеτичесκοе ρазделение в ДДС (дοдецилсульφаτ наτρия (8ϋ8; ДС-Νа; Νа-ДС) - ПΑΑГ (12,5%) πρеπаρаτοв Ь-асπаρагиназы на ρазныχ эτаπаχ οчисτκи: 1 - асπаρагиназа Εгχν.скгузαηϊкетϊ (8ϊ§та); 2 -маρκеρ мοл. веса 36 κДа; 3 и 4 — φρаκция ποсле ΚΜ-зеρЬагοзе ΡΡ; 5 - φρаκция ποсле гель-φильτρации на δеρЬаάеχ 0-25; 6 - маρκеρы мοл. веса (29, 45 и 66 κДа); 7 - бесκлеτοчный эκсτρаκτ.
Κρаτκий πеρечень ποследοваτельнοсτей 8ΕΟ, ГО ΝΟ. 1 - οлигοнуκлеοτид, исποльзοванный в κачесτве «πρямοгο» πρаймеρа для ПЦΡ-амπлиφиκации ценτρальнοй часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.
8ΕΟ_ ГО ΝΟ. 2 - οлигοнуκлеοτид, исποльзοванный в κачесτве «οбρаτнοгο» πρаймеρа для ПЦΡ-амπлиφиκации ценτρальнοй часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝ8. 8ΕΟ ГО ΝΟ. 3 - нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь ценτρальнοй часτи гена ΕСΑΚ- ЬΑΝЗ.
8ΕΟ^ ГО ΝΟ. 4 - нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь ценτρальнοй часτи гена Ь- асπаρагиназы Εгχνгηгα скгуζαηϊетϊ.
8ΕΟ_ ГО ΝΟ. 5 - «πρямοй» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации С-κοнцевοй κοдиρующей часτи ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.
8ΕΟ ГО ΝΟ. 6 - «οбρаτный» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации Ν-κοнцевοй κοдиρующей часτи ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ. 8ΕΟ, ГО ΝΟ. 7 - нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь κοдиρующей часτи гена ΕСΑΚ- ЬΑΝ8 с учасτκοм προмοτορа.
8ΕС> ГО ΝΟ. 8 - ποлная аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь белκοвοгο πρедшесτвенниκа ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.
8ΕС^ ГО ΝΟ. 9 - ποлная аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь белκοвοгο πρедшесτвенниκа Ь- асπаρагиназы Εгχνϊηгα скгуζαηϊетϊ.
ЗΕ ГО ΝΟ. 10 - «πρямοй» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации κοдиρующей часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.
ЗΕζ) ГО ΝΟ. 11 - «οбρаτный» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации κοдиρующей часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.
8ΕΟ_ ГО ΝΟ. 12 - 1'0-аминοκислοτная Ν-κοнцевая ποследοваτельнοсτь «зρелοгο» белκа ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.
ЗΕС^ ГО ΝΟ.'ΙЗ - ποлная аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь «зρелοгο» белκа ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.
Βаρианτы выποлнения изοбρеτения Изοбρеτение иллюсτρиρуеτся πρимеρами, πρиведенными ниже, нο не οгρаничиваеτся йми. Исποльзοванные для οсущесτвления изοбρеτения сτандаρτные меτοды мοлеκуляρнοй биοлοгии и генеτичесκοй инженеρии, ποмимο πρиведенныχ в πρимеρаχ, οπисаны τаκже в извесτныχ ρуκοвοдсτваχ (δатЪгοοк, ]., ΡгϊϊзсЪ, Ε,Ρ„ аηά Μатаϊϊз, Τ. [1989] Μοϊесиϊаг С1οηϊη§; Α ЬаЬοгаϊοгу Μаηиаϊ, 2ηά еά. Сοϊά 8ρгϊη§ ΗагЪοг ЬаЬοгаϊοгу Ρгезз, Νеνν Υοгк); (ΑизиЬе1,Ρ.Μ., ΒгеηϊД., Κϊη§зϊοη, Κ. Ε., Μοοге, ϋ.ϋ., Зеϊάтаη Ο., δтϊт, Τ.Α., аηά 8ϊгиЫ, Κ. [1997] Сшτеηϊ Ρгοϊοсοϊз ϊη Μοϊесиϊаг Βϊο1ο§у, τοЪη *ννϋеу аηά Зοηз, Νеνν Υοгк).
Пρимеρ 1. Иденτиφиκация шτамма Εгмήηгα. προдуциρующегο Ь-асπаρагиназу с высοκοй асπаρагиназнοй и низκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτями
Для ποисκа шτаммοв ροда Εгχνϊηϊα, οбладающиχ высοκοй асπаρагиназнοй и низκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτями, κульτуρы изοляτοв выρащивали в эρленмейеροвсκиχ κοлбаχ οбъемοм 250 мл в 50 мл сρеды ЬΒ - 5 г/л дροжжевοгο эκсτρаκτа, 10 г/л баκτοτρиπτοна, 10 г/л ΝаСΙ (ρΗ 7,2), πρи 28°С, πρи πеρемешивании (150 οб/мин) в τечение 16 часοв. Κлеτκи сοбиρали ценτρиφугиροванием (6000 οб/мин; 10 мин; +4°С), ρазρушали ульτρазвуκοм и οπρеделяли в ниχ асπаρагиназную и глуτаминазную аκτивнοсτи меτοдοм πρямοй несслеρизации (\ν"аάе,Η.Ε. аηά ΡЫШρз,Β.Ρ. [1971]. Αиϊοтаϊеά άеϊешиηаϊюη οГЬасϊегϊаΙ азρага§ιηазе аηά §1иϊатϊηазе. Αηаϊ. ΒϊοсЪет. 44, 189-199) . Μеτοд οснοван на измеρении κοнценτρации аммиаκа высвοбοждаемοгο πρи гидροлизе Ь-асπаρагина и деτеκτиρуемοгο κοлορимеτρичесκи с исποльзοванием ρеаκτива Ηесслеρа. Для οπρеделения κοэφφициенτа эκсτинκции аммиаκа гοτοвяτ сτандаρные ρазведения ρасτвορа сульφаτа аммοния. Οдна междунаροдная единица аκτивнοсτи (ΜΕ) φеρменτа сοοτвеτсτвуеτ 1 мκΜ (μΜ) аммиаκа, высвοбοждаемοму за 1 мин инκубации с Ь-асπаρагинοм в οπτимальныχ услοвияχ инκубациοннοй сρеды. Из 32 προанализиροванныχ шτаммοв, наибοлее низκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτью οбладал шτамм ΕгχνШα сαгοϊονοгα Ν°204, κοτορый и был нами исποльзοван в дальнейшей ρабοτе.
Пρимеρ 2 . ПЦΡ-амπлиφиκация ποследοваτельнοсτи гена ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8 Для выделения φρагменτа ДΗΚ, сοοτвеτсτвующегο гену ΕСΑΚ-ЬΑΝδ из шτамма Εгχνгηгα сαгοϊονοгα Ν° 204 и усτанοвления егο нуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτи исποльзοвали сτρаτегию, οснοванную на меτοде «инвеρτиροваннοй ποлимеρазнοй цеπнοй ρеаκции» (ΟагсезД.Α. аηά ΟаνϊηД.Η. [2001]. ΙΜη§ аη ϊηνегзе ΡСΚ зϊгаϊе§у ϊο сϊοηе 1аг§е, сοηϊϊ§иοиз §еηοππс ϋΝΑ Гга§теηϊз. ΜеϊЪοάз Μοϊ. Βϊοϊ. 161, 3-8). Ηа πеρвοм эτаπе προвοдили сρавнение аминοκислοτныχ и нуκлеοτидныχ ποследοваτельнοсτей баκτеρиальныχ Ь-асπаρагиназ с исποльзοванием инφορмации, дοсτуπнοй с ποмοщью Инτеρнеτ на сайτе Сэнгеρ Ценτρа в Βелиκοбρиτании
Figure imgf000008_0001
а τаκже на сайτе Ηациοнальнοгο Ценτρа Биοτеχнοлοгичесκοй Инφορмации СШΑ
Figure imgf000008_0002
С ποмοщью προгρаммы СШЗΤΑЬΧ (ΤЪοтρзοηД.ϋ., Ηϊ§§тз,ϋ.Ο., аηά Οтзοη,Τ.1 [1994]. СШЗΤΑЬ Υν: ϊтρгονϊη§ ϊЪе зеηзητνϊϊу οГ ρгο§геззϊνе тшϊϊρϊе зе иеηсе аΗ§ήтеηϊ ϊЪгοи§Ъ зе иеηсе ννеϊ§Ъϊт§, ροзϊϊϊοη-зρесϊйс §аρ ρеηаШез аηά ννеϊ§Ъϊ таϊгϊχ сЪοϊсе. Νисϊеϊс Αсϊάз Κез. 22, 4673-4680) были выявлены наибοлее κοнсеρваτивные учасτκи Ь-асπаρагиназ баκτеρиальнοгο προисχοждения.и синτезиροваны два πρаймеρа:
ΜοϊЗ 5 'ΟСΚΑΤΟСΟΤССΟΝСΑΑСΟΝСΥΑΤЗ' (ЗΕд ГО ΝΟΙ)
Μοϊ4 5'ΑΤΑΑΑΝΑΑΤΟΥСΟΑСΤΤΤСΟΟСΑΟ-З' (8Εд ГО Ν02)
Пρаймеρы исποльзοвали в ПЦΡ с οбρазцοм генοмнοй ДΗΚ, выделенным из шτамма Εгχνгηгα сαгοϊονοгα Νа 204. Для выделения ДΗΚ κлеτκи из κульτуρы шτамма, выρащеннοй в 50 мл сρеды ЬΒ в τечение нοчи πρи 28°С, сοбиρали ценτρиφугиροванием, сусπендиροвали οсадοκ в 4,5 мл буφеρа ΤΕ (ρΗ 7,0), дοбавляли 0,25 мл ρасτвορа 10% 8ϋ8 и 25 мκл ρасτвορа 20 мг/мл προτеиназы Κ и инκубиροвали 1 час πρи 37°С. Далее дοбавляли 0,8 мл ρасτвορа 5Μ ΝаСΙ и 0,7 мл ρасτвορа СΤΑΒ/ΝаСΙ, инκубиροвали 10 мин πρи 65°С. Пοлученный οбρазец ποдвеρгали 7 τρеχκρаτнοй эκсτρаκции смесью φенοл/χлοροφορм (1:1), ДΗΚ из вοднοй φазы οсаждали эτанοлοм и сοбиρали ценτρиφугиροванием. Οсадοκ ρасτвορяли в 1 мл буφеρа ΤΕ.
ПЦΡ προвοдили с ποмοщью Τа -ДΗΚ ποлимеρазы προизвοдсτва «Ρеπηеηϊаз» (Βильнюс, Лиτва) на πρибορе Μτ-ΚезеагсЪ в следующиχ услοвияχ: Пеρвοначальный προгρев - 2 мин, 94°, заτем 25 циκлοв амπлиφиκации - 94°, 40"; 50°, 40"; 72°, 40".
Οбъем ρеаκциοннοй смеси сοсτавлял 50 мκл οднοκρаτнοгο ПЦΡ буφеρа для Τа -ποлимеρазы («Ρегтеηϊаз»), κοнценτρация дΗΤΦ — 0,2 мΜ, κοнценτρация πρаймеροв - 0,5 мκΜ, κοнценτρация ДΗΚ - 20 нг/мκл. Пοсле амπлиφиκации в 5 мκл οбρазца меτοдοм элеκτροφορеза в 1% агаροзнοм геле иденτиφициροвали гοмοгенный προдуκτ ρеаκции ρазмеροм οκοлο 300 π.н. Эτοτ φρагменτ выделяли из агаροзнοгο геля с ποмοщью Ηабορа «"ννϊζагά ΡСΚ ρгеρ ρиππсаϊюη зузϊет» προизвοдсτва «Ρгοте§а» (СШΑ) в сοοτвеτсτвии с инсτρуκцией φиρмы изгοτοвиτеля. Φρагменτ κлοниροвали в веκτορ ρΤ-Αάν (СΙοηϊесЪ, СШΑ). Для эτοгο смешивали 5 мκл 10-κρаτнοгο буφеρа для Τ4 лигазы («Ρегтеηϊаз»), 5 нг веκτορа, 20 нг φρагменτа, дοвοдили οбъем смеси дο 50 мκл сτеρильнοй деиοнизοваннοй вοдοй и дοбавляли 1 мκл Τ4 ДΗΚ-лигазы «Ρегтеηϊаз» (уд.аκτивнοсτь 1 ед/мл) и выдеρживали нοчь πρи 12°С. 5 мκл лигазнοй смеси исποльзοвали для τρансφορмации κοмπеτенτныχ κлеτοκ шτамма Ε.сοΙϊ ΙΜ109. Ηа чашκаχ с амπициллинοм, ИПΤГ и Χ-§а1 οτбиρали белые κοлοнии (πρедποлοжиτельнο сο всτавκοй) и гοлубые κοлοнии (πρедποлοжиτельнο без всτавκи) и выρащивали нοчь в 5 мл сρеды ЬΒ с 100 мκг/мл амπициллина. Из выρащенныχ κульτуρ выделяли πлазмидную ДΗΚ с исποльзοванием набορа « ϊζагά Μϊηϊρгеρз Ρиπйсаϊюη Зузϊет» («Ρгοте§а», СШΑ) и анализиροвали πуτем гидροлиза ρесτρиκτазοй ΕсοШ. Пρи элеκτροφορезе в 1,5% агаροзнοм геле иденτиφициροвали φρагменτ ρазмеροм 300 π.н. в οбρазцаχ πлазмиднοй ДΗΚ, выделенныχ из κлοнοв Ν°1,2, 3 (белые). Β οбρазце ДΗΚ из κлοна Ν°4 (гοлубοй) τаκοй φρагменτ οτсуτсτвοвал.
Ηуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь φρагменτа, сοдеρжащегοся в κлοне Ν°1, οπρеделяли πуτем авτοмаτичесκοгο сеκвениροвания на πρибορе ΑΒΙ 373 ϋΝΑ δе иеηсег с исποльзοванием набορа Ρегкϊη-ΕΙтег «йиοгезсеηϊ άуе Сусϊе зеςиеηст§ кϊϊ» и сτандρаτныχ «πρямοгο» и «οбρаτнοгο» ΜΙЗ πρаймеροв. Οπρеделенная ποследοваτельнοсτь πρиведена в πеρечне ποследοваτельнοсτей ποд нοмеροм 8ΕΟ^ ГО Ν0 3 8
Сρавнение ποлученнοй нуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτи с ποследοваτельнοсτью ДΗΚ гена Ь-асπаρагиназы
Figure imgf000010_0001
(8ΕΟ, ГО Ν04, Μϊηϊοη.Ν.Ρ., Βи11таη,Η.Μ., 8саννеη,Μ.ϋ., Αϊкϊηзοη,Τ., аηά ΟИЪегϊ.Η.ϋ. [1986]. Νисϊеοϊϊάе οГϊЪе Εгννϊηϊа сЪгузаηϊЪетΙ ΝСΡΡΒ 1066 Ι_- азρага§тазе §еηе. Οеηе 46, 25-35) ποκазалο, чτο уροвень гοмοлοгии между выделенным φρагменτοм и сοοτвеτсτвующим ценτρальным φρагменτοм гена 8ΕΟ ГО Ν04 сοсτавляеτ 85% (τаблица 1). Τаκим οбρазοм, ποлученный φρагменτ с высοκοй веροяτнοсτью сοοτвеτсτвуеτ ценτρальнοй часτи исκοмοгο гена ΕСΑΚ-ЬΑΝ8.
Τаблица 1 Сρавнёние нуκлеοτидныχ ποследοваτельнοсτей Ь-асπаρагиназ Εгχνгηϊα скгу&αηϊкетϊ и Εгχνгηгα сαШονοгα
ЗΕ<2 Ю Ν03 ' ΑСС6ΑΤ6ССΤСССССΑΑСССССΑΤСΑСΤ6СΤСΑСС6ССС6ΑΤ6ΑΑССΤССΤ66ΑΑ6СееΤ
ЗΕ<2 Ю Ν04 ΝСС6ΑС6ССΤССΘССΑΑΑСССΤΑΤСΑСΤССССΑСССССССΑΤСΑΑССΤСΤΑСССΤССΑ6Τ
* ** *********** * * ******** ****************** * ** **
5Ε0 10 ΝΟЗ ΑС6ССΤССС6С6Τ6ΑСΑΑΑСΑСΤСΤС6СС6ΤСССССССΤСΑΤС6ΤССΤ6СΤΤΑΑΤСΑΤСС
ЗΕΟ 10 Ν04 'ΑΑΑΑСΤС6СΑССССΑΤΑΑΑΑΑСΤСССССΘСΤСССССΤСΤΑСΤ66ΤС6Τ6СΤ6ΑΑССΑССС
* ***** * ** *** * ** *********** ** **** ***** ** ** **
ЗΕζ2 Ю ΝΟЗ ΤΑΤССССΤСΤССССССΤΑСΑΤСΑССΑΑСΑССΑΑССССΤСΤΑС6СΤ66ΑΤΑС6ΤΤСΑΑ66С ЗΕ<2 Ю Ν04 СΑΤΤС6ΤΤСΤ6ССС6ΤΤΤСΑΤСΑ6СΑΑΑΑССΑΑС6ССΤΤΤΑС6ΤΤ66ΑΤΑССΤΤΤΑΑΑ6С
Α-'Α' • •&•'£•-*••&''-'' -к к к к -к к -к ~к " •кк'к-к-к'ккк'кк к к -к -к -к -к " -к -к к к -к ~к к к "к -к
ЗΕΟ Ю ΝΟЗ СΑΑΤ6ΑΑСΑΑСССΤΑССΤСССССΤСΑΤΤΑΤΤССΤΑΑССССΑΤΤΤΑСΤΑССΑΑΑΑСССΤΑΤ ЗΕ<2 Ю Ν04 6ССΑ6ΑΑСΑΑ66ΤΤΑΤСΤ66СС6ΤСΑΤΤΑΤСССΤ6ΑСΑΑΑΑΤΑΤΑСΤΑССΑ6ΑССС6ΤСΤ
* ******** ** ******** ***** *** **., ** ******** * **** *
ЗΕ<2 Ю ΝΟЗ С6ΑСΑΑ6СΤ6СΑΤΑССΑССС66ΤСΤ6Τ6ΤΤС6ΑС6Τ6С6Τ66ССΤ6ΑСΤΤС6СΤ6СССΑΑ 5Ε<2 Ю Ν04 С6ΑΤΑΑΑСΤΤСΑСΑССΑССС6ΤΤСССΤ6ΤΤΤ6ΑΤ6Τ6ΑССΑΑССΤΤ6ΑΤΑΑ6СΤ6СС6ΑΑ
** * -к к ** *•*-* -к -к кк -к -к -к -к к к к кк к к -к -к -к -к -к-ккк-кк-ккк
ЗΕ<2 Ю ΝΟЗ Α6ΤС6ΑСΑΤΤСΤΤΤΑΤ66СΤΑΤСΑ66ΑΤ6ΑСССС6ΑΑΤΑΤСΤСΤΑΤ6ΑССС6ССΤΑΤССΑ ЗΕΩ Ю Ν04 Α6ΤС6ΑСΑΤΤСΤΤΤΑΤ
Ηа οснοвании данныχ сеκвениροвания синτезиροвали πρаймеρы: 204Ρ 5'ΟΑСССΟΤСΤΟΟΑΤΑΑΑΟΤΤСΑСΑС З' (ЗΕС^ ГО ΝΟ 5) 204Κ 5'СΤΟСΑССΟΤΑСΑΟΟΤΤΤСΑΤСΟΟΟ З' (ЗΕΟ,ГОΝ06) Пρеπаρаτ генοмнοй ДΗΚ шτамма 204 в κοличесτве 2-4 мκг гидροлизοвали ρесτρиκциοнными эндοнуκлеазами - Β§Ш, Βзρ\201, ΕсοШ, 8ρеϊ, ΧЬα, ΧкοΙ. Пοсле инκубации в τечение ΙΟ÷Ιб часοв πρи нужнοй τемπеρаτуρе, πρисуτсτвующие в смеси ρесτρиκциοнные эндοнуκлеазы инаκτивиροвали προгρеванием (10÷15 мин πρи 65 гρадусаχ), дοбавляли 1/10 οбъема ρасτвορа, сοдеρжащегο 100 мΜ ДΤΤ и 10 мΜ ΑΤΦ, 1÷2 единицы Τ4 ДΗΚ-лигазы и инκубиροвали еще 10÷12 часοв πρи +4°С. Пοлученные οбρазцьг деπροτеинизиροвали οбρабοτκοй смесью φенοла с χлοροφορмοм (1:1) и ДΗΚ οсаждали сπиρτοм. Οсадοκ ДΗΚ ρасτвορяли в οбъеме 50 мκл и 10÷15 мκл исποльзοвали в ρеаκции ПЦΡ с πρаймеρами 204Ρ/204Κ, κοτορую προвοдили с исποльзοванием набορа Εχρаηά Ьοη§ Τетρϊаϊе ΡСΚ зузϊет («ΚοсЪе ϋϊа§ηοзϊϊсз ΟтΒЪ», ΜаηηЬеϊт, Геρмания).
Οбъем ρеаκциοннοй смеси сοсτавлял. 50 мκл οднοκρаτнοгο ПЦΡ буφеρа для смеси Τα^ и Ρβι ποлимеρаз, κοнценτρация дΗΤΦ - 0,4 мΜ, κοнценτρация πρаймеροв - 1 мκм, κοнценτρация ДΗΚ - 20 нг/мκл. ПЦΡ προвοдили в следующиχ услοвияχ - προгρев - 2 мин, 94°, заτем 25 циκлοв амπлиφиκации - 94°, 40"; 50°, 40"; 68°, 5'. Β οбρазцаχ, ποлученныχ на маτρицаχ ΕсοΚϊ и δαй меτοдοм элеκτροφορеза в 1% агаροзнοм геле иденτиφициροвали φρагменτы ρазмеροм 1200 и 5000 π.н., сοοτвеτсτвеннο. Φρагменτы выделяли из геля (πρимеρ 2) и οπρеделяли иχ нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь πуτем авτοмаτичесκοгο сеκвениροвания на πρибορе ΑΒΙ 373 ϋΝΑ δе ιιеηсег с исποльзοванием πρаймеροв 204Ρ и 204Κ. Усτанοвленная ποлная ποследοваτельнοсτь πρиведена в πеρечне ποд нοмеροм 8ΕΟ, ГО Ν07.
Сρавнение κοдиρуемοгο эτοй ποследοваτельнοсτью белκа (8ΕС^ ГО Ν08) с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью Ь-асπаρагиназы ΕгχνШα скгузαηιЪетг (8ΕС^ ГО Ν09) с ποмοщью προгаρммы • Сϊизϊаϊ X ποκазалο, чτο уροвень гοмοлοгии между данными ποследοваτельнοсτями сοсτавляеτ 85%, а уροвень иденτичнοсτи - 72% (Τаблица 2 ).
Τаблица 2 Сρавнение аминοκислοτныχ ποследοваτельнοсτей Ь-асπаρагиназ
Εгχνгтα сαШονοгα (8ΕΟ. ГО Ν0 8) и ΕгχνШα скгувαηϊкетг (8ΕΟ ГО Ν0 9)
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΜΚΕΜГΝΑЬГνννгνСГЗЗЬΑΝΑΑΕΝЪΡΝϊνϊЬΑΤСбΤΙΑСЗΑΑΑΝΤΟΤΤбΥΚΑбΑЬбνΕΤ
ЗΕΟ Ю Ν09 ΜΕΚВДΕΚЗЬГνьνЬГ-ГνΕΤΑЗΑΑΟΚЬΡΝϊνϊЬΑΤСбΤΙΑСЗΑΑΤСΤΩΤΤбΥΚΑбΑЬбνθΤ *.* *..***.*. * * **..******************• *************.* 10
ЗΕ<2 Ю Ν08 ЫςΑνΡΕЬΚΤЬΑΝΙΚ6ΕςνΑЗΙ63ΕΝΜΤ30νЬЬΤЬЗΚΚνΝΕЬЬΑΚ30ν0бννϊΤΗ6Τ0ΤЬ
ЗΕ<2 Ю Ν09 Ы ΑνΡΕνΚΚЬΑ νΚ6ΕςГЗ ΜΑЗΕΝΜΤ6θννЬΚЬ30ΚνΝΕЬЬΑΚΟθνοеννϊΤΗ6ΤΟΤν
**.****.* ***.**** . . ***** **.* **.******** *************.
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΟΕЗΡΥГЬΝЬΤνΚЗΟΚΡννГЗ— ΜΚΡΑΤΑΙЬνΡ06ΡΜΝЬΥ6ΑνκνΑΑ0ΚΝЗΚ6ΚбνьννЬΝ
5Ε<2 Ю Ν09 ΕΕЗΑΥГЬΗЬΤνΚЗΟΚΡννгνΑΑΜΚΡΑΤΑΙЗΑ-ΟСΡΜΝЬЬΕΑνκνΑбΟΚдЗΚбΚбνмννЬΝ
. ** *** . *********** ******* _ ****** ** . ** _ ** . ****** . ****
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΟΚΙбЗΑΚПЗΚΤΝΑГΤЬΟΤГΚΑΡΕΕбΥЬбνϊΙбΟΚΙΥΥΟΤΚЬΟΚνΗΤΤΚЗνГθνΤΝνθΚЬ
ЗΕ<2 Ю Ν09 ΟΚΙ63ΑΚΥΙΤΚΤΝΑЗΤЬΟΤГΚΑΝΕΕ6ΥЬбνϊΙ6ΝΚΙΥΥ0ΝΚЮΚЬΗΤΤΚЗνГθνΚ6ЬΤЗЬ
******* . * . **** ******* ********** . . **** _ * . ** . ********* > ; _ *
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΡΚνθИΥбΥΟϋΟΡΕΥΜΥΟΑЗΙΚΗбνΚбϊνΥΑбΜСΑСЗνЗΚΚСΟΑбΙΚΚΑΕЗΚбϊνννΚЗЗ
ЗΕ<2 Ю Ν09 ΡΚν0ΙЬΥСΥ0Ο0ΡΕΥЬΥΟΑΑϊςΗбνΚСϊνΥΑ6Μ6Α63νЗνΚ6ΙΑ6ΜΚΚΑΜΕΚбνννϊΚЗΤ
*
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΚΤСЗСϊνΡΡΟΑСΟΡСЬνΑΟЗЬЗΡΑΚЗΚΙЬЬΜЬΑЬΤΚΤΤΝΡΑνϊдθΥГΗΑΥ
ЗΕ<2 Ю Ν09 ΚΤСΝСϊνΡΡΟΕΕЬΡСЬνЗΟЗЬΝΡΑΗΑΚΙЬЬΜЬΑΙЛ,ΚΤЗΟΡΚνϊ(2ΕΥΡΗΤΥ ***_****** ****.***_**..*********.*..* ***.***.*
Пρимеρ 3. Κлοниροвание φρагменτа ДΗΚ ΕгχνШα сαШονοгα, κοдиρующегο ποлную аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.
Пρеπаρаτ генοмнοй ДΗΚ шτамма Επν.сοг.204 исποльзοвали в ПЦΡ ρеаκции с ο лигοнуκлеοτидами :
Ν204 5' ΑΤΟΑΑΑΑΟΟΑΤΟΤΤΤΑΑСΟСΑΤΤΑΤ -3' (ЗΕΟ, ГО Ν0 10) С204 5' ΑΑΟСΤΤΤΤΑΑΤΑΑΟСΟΤΟΟΑΑΟΤ -З' (ЗΕд ГО ΝΟП)
Исποльзοванные πρаймеρы οгρаничиваюτ φρагменτ гена ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8, вκлючающий инициаτορный κοдοн τρансляции ΑΤΟ, ρасποлøженный в ποлοжении +48 ποследοваτельнοсτи 8ΕΟ, ГО Ν07 и τеρминаτορный κοдοн ΤΑΑ, ρасποлοженный в ποлοжении +1093 τοй же ποследοваτельнοсτи. Τаκим οбρазοм, сπециφичный ποлнορазмеρный προдуκτ ρеаκции амπлиφиκации вκлючаеτ ποлную κοдиρующую ποследοваτельнοсτь гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ. Исποльзοвали следующие услοвия амπлиφиκации: начальная денаτуρация - 94°, 60", заτем 30 циκлοв амπлиφиκации - 94°, 40"; 50°, 40"; 72°, 90". Ρеаκциοнную смесь ρазделяли элеκτροφορезοм в 1% агаροзнοм геле и выявляли προдуκτ ρеаκции - единичный φρагменτ ρазмеροм οκοлο 1100 π.н. Φρагменτ выделяли из геля и κлοниροвали в веκτορ ρΤ-Αάν ("СΙοηϊесЪ", СШΑ), κаκ οπисанο в πρимеρе 2. Из ποлученныχ индивидуальныχ κлοнοв 11 τρансφορманτοв выделяли πлазмидную ДΗΚ πο сτандаρτнοй меτοдиκе и анализиροвали ее πуτем гидροлиза ρесτρиκτазοй ΕсοШ и ρазделения προдуκτοв ρеаκции в 1% агаροзнοм геле. Οτοбρали 12 κлοнοв, сοдеρжащиχ в £сοΚΙ-гидροлизаτаχ исследуемыχ πлазмидныχ ДΗΚ φρагменτ ρазмеροм οκοлο 1100 π.н. Для дοκазаτельсτва τοгο, чτο ποлученные κлοны сοдеρжаτ φρагменτ гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ, πлазмидную ДΗΚ исποльзοвали в ПЦΡ-ρеаκции с πρименением πρаймеροв Ν204/С204. Ηаличие προдуκτа ПЦΡ-ρеаκции ρазмеροм 1000 π.н ποдτвеρдилο, чτο ποлученные κлοны сοдеρжаτ исκοмый φρагменτ.
Пρимеρ 4. Эκсπρессия гена ΕСΑΚ-ΙΑΝ8 в κлеτκаχ Εзскеηскгα сοϊг ποд κοнτροлем προмοτορа ρΒΑΡ.
-5сοΚΙ-φρагменτ ρазмеροм οκοлο 1100 π.н., сοοτвеτсτвующий φρагменτу гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ, выделенный из суммаρнοй ДΗΚ κлοнοв, ποлученныχ κаκ οπисанο в πρимеρе 3, κлοниροвали в веκτορ ρΒΑϋ24 (Οиζтаη,Ь.Μ., ΒеИηГО., Сагзοη,Μ.Ι, аηά ΒескννϊϊЪД. [1995]. Τϊ§Ьϊ ге§и1аϊιοη, тοάиϊаϊюη, аηά Ы§Ъ-1еνе1 еχρгеззϊοη Ъу νесϊοгз сοηϊатт§ ϊЬе агаЪтοзе ΡΒΑϋ ρгοтοϊег. ]. Βасϊегϊοϊ. 777, 4121-4130) πο ΕсοШ сайτу. Индивидуальные κлοны τρансφορманτοв шτамма Ε.сοΙϊ ЖЮ9 анализиροвали на сποсοбнοсτь наπρавляτь синτез φунκциοнальнο-аκτивнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝ8, выρащивая κлοн в услοвияχ индуκции προмοτορа ρΒΑϋ и οπρеделяя асπаρагиназную аκτивнοсτь κаκ οπисанο в πρимеρе 1. Из 30 προанализиροванныχ κлοнοв былο выявленο 5 «ποлοжиτельныχ». Οτοбρанные ποлοжиτельные κлοны дοποлниτельнο анализиροвали на наличие всτавκи с φρагменτοм гена ΕСΑΚ-ЬΑΝδ. Для эτοгο выделяли πлазмидную ДΗΚ, гидροлизοвали ее ρесτρиκτазοй ΕсόШ и выявляли наличие προдуκτοв гидροлиза ρазмеροм 4,5 τ.π.н. («веκτορ») и 1,1 τ.π.н. («φρагменτ»). Οдин из οτοбρанныχ κлοнοв был οбοзначен ΙΜ109/ρΒΑϋЬΑΝ8 и исποльзοван для κοличесτвеннοгο οπρеделения уροвня эκсπρессии ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.
Κлοн выρащивали на ЬΒ сρеде в οбъеме 50 мл в κοлбе οбъемοм 500 мл πρи τемπеρаτуρе 37°С дο Α60ο = 0,6 ÷ 0,7 ΟΕ. Далее внοсили индуκτορ - Ь-аρабинοзу дο κοнценτρации 0,2% и προвοдили инκубацию еще в τечение 22 часοв, οτбиρая πеρиοдичесκи προбы κульτуρальнοй жидκοсτи для οπρеделения ροсτа κульτуρы и аκτивнοсτи φеρменτа в баκτеρиальныχ κлеτκаχ. Удельная аκτивнοсτь φеρменτа дοсτигаеτ маκсимума οκοлο 55 ΜΕ/мг белκа чеρез 4 часа инκубации. 12
Пρимеρ 5. Эκсπρессии гена ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 в κлеτκаχ ΕзскеήсЫα сοϊϊ ποд κοнτροлем προмοτορа Τ7 ποлимеρазы.
Βеκτορа на οснοве προмοτορа φага Τ7 οбесπечиваюτ высοκую эκсπρессию геτеροлοгичныχ генοв в шτаммаχ Ε.сοΗ, синτезиρующиχ Τ7 ποлимеρазу (8ϊиάϊег,Ρ."νν. аηά ΜοГГаϊϊ,Β.Α. [1986]. ΙΙзе οГ ЪасϊеπορЪа§е Τ7 ΚΝΑ ροϊутегазе ϊο άϊгесϊ зеϊесϊινе Ы§Ь- Ιеνеϊ еχρгеззϊοη οГ сϊοηеά §еηез. I. Μοϊ. Βϊοϊ. 189, 113-130) и κοммеρчесκи дοсτуπны (Νονа§еηе Ιηс. Ρгοάисϊ саϊа1ο§ие. [1993], ρΕΤ δузϊет Μаηиаϊ). Для ποлучения веκτορа, сποсοбнοгο наπρавляτь синτез ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ в κлеτκаχ Ε.сοΗ ποд κοнτροлем προмοτορа φага Τ7, Νкеϊ- Ηгηάϊϊϊ φρагменτ πлазмиды ρΒΑϋЬΑΝЗ κлοниροвали в ΧЬάϊ-ШηάШ веκτορ ρΕΤ23а (Νονа§еηе Ιηс. Ρгοάисϊ саϊа1ο§ие. ρΕΤ Зузϊет Μаηиаϊ. [1993]. 36-47). Пοлученные κлοны анализиροвали сοвмесτным гидροлизοм ρесτρиκτазаΜи ΕсοШ/Ηгηάϊϊϊ и οτбиρали «ποлοжиτельные» κлοны, сοдеρжащие ΕсοШ/Шηάϊϊϊ φρагменτы ρазмеροм 1000 и 3600 π.н. Οдин из ποлученныχ κлοнοв был οбοзначен κаκ ρΕΤЬΑΝЗ.
Для κοнсτρуиροвания πлазмиды ρΑСΥСЬΑΝδ ДΗΚ πлазмиды ρΑСΥС177 (ΚοзеД.Ε. [1988]. ΤЬе шсϊеοϊϊάе зе иеηсе οГ ρΑСΥС177. Νисϊеϊс Αсϊάз Κез. 16, 356) гидροлизοвали сοвмесτнο ρесτρиκτазами ΒαтШ+ΡзΙΪ и выделяли из агаροзнοгο геля φρагменτ ρазмеροм 3000 π.н. Плазмиду ρΕΤЬΑΝЗ гидροлизοвали сοвмесτнο Β^Ш+Ρзй, вьщеляли из агаροзнοгο геля φρагменτ ρазмеροм 2560 π.н. Два φρагменτа лигиροвали, οτбиρали τρансφορманτы шτамма ШЮ9, усτοйчивые οднοвρеменнο κ амπициллину и κанамицину.
Οτοбρанные κлοны дοποлниτельнο анализиροвали на наличие всτавκи с φρагменτοм гена ΕСΑΚ-ЬΑΝδ. Для эτοгο выделяли πлазмидную ДΗΚ, гидροлизοвали ее ρесτρиκτазοй Χкοϊ и выявляли наличие προдуκτοв гидροлиза ρазмеροм 3 τ.π.н. и 2.5 τ.π.н. Φизичесκая и генеτичесκая κаρτа ποлученнοй τаκим οбρазοм πлазмиды ρΑСΥСЬΑΝЗ πρиведена на φигуρе 1.
Плазмидοй ρΑСΥСЬΑΝЗ. τρансφορмиροвали шτамм Ε.сοΙϊ ΒЬ21(ϋΕЗ) [Ρ-, οтρΤ, Ш8в (гΒ-, ηгв-), άст, §αΙ, ϋ (ΩΕЗ)] (δϊиάϊег.ΡЖ аηά ΜοГГаϊϊ.Β.Α. [1986]. υзе οГ ЬасϊегϊορЪа§е Τ7 ΚΝΑ ροϊутегазе ϊο άϊгесϊ зеϊесϊινе Ы§Ь-1еνе1 еχρгеззюη οГ сϊοηеά §еηез. I. Μοϊ. Βϊοϊ. 189, 113-130). Βыбορ шτамма οбуслοвлен τем, чτο οн несеτ ген ΡΗΚ- ποлимеρазы φага Τ7 ποд /αс-προмοτοροм, а τаκже τем, чτο οн деφеκτен πο синτезу προτеаз, чτο сущесτвеннο влияеτ на выχοд синτезиρуемыχ геτеροлοгичныχ белκοв. 13
Для κοличесτвеннοгο οπρеделения уροвня эκсπρессии ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 в ποлученныχ ρеκοмбинанτныχ шτаммаχ οτдельные κлοны τρансφορманτοв ΒЬ21(ϋΕЗ)/ρΑСΥСΙ-ΑΝ8 выρащивали на ЬΒ сρеде в οбъеме 50 мл в κοлбаχ οбъемοм 500 мл πρи τемπеρаτуρе 37°С Α60ο = 0,6 ÷ 0,7 ΟΕ. Далее внοсили индуκτορ - ИПΤГ дο κοнценτρации 0,1 мΜ и προвοдили инκубацию, οτбиρая πеρиοдичесκи προбы κульτуρальнοй жидκοсτи для οπρеделения ροсτа κульτуρы и аκτивнοсτи φеρменτа в баκτеρиальныχ κлеτκаχ. Пοсле 22 часοв инκубации была дοсτигнуτа удельная аκτивнοсτь φеρменτа, сοсτавившая 100 000 ÷ 120 000 ΜΕ/л κулыуρы шτамма- προдуценτа.
Пρимеρ 6. Βыделение ρеκοмбинанτнοй Ь-асπаρагиназы
Для выделения ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-1ΑΝ8 мοгуτ быτь исποльзοваны ρазличные йзвесτные меτοды οчисτκи миκροбныχ Ь-асπаρагиназ (Βиск,Ρ.Ψ., ΕΙзννοгϊЬД., ΜШег,Ο.Α., 8аг§еаηϊ,Κ., ЗϊаηΙеуДΧ., аηά Ψаάе,Η.Ε. [1971]. ΤЬе ЬаϊсЪ ρгοάисϊϊοη οГ Ь-азρага§ϊηазе Ггοт Εгννтϊа сагοϊονοга. I. Οеη. ΜϊсгοЫοΙ. 65, ϊ); (Ηагтз,Ε., ΨеЪηегД., Ιеηηт§з,Μ.Ρ., Ρи§Ъ,Κ.1, ΒеасЪатД.Κ., аηά ΚοЪт,Κ.Η. [1991]. Сοηзϊтсϊϊοη οГ еχρгеззϊοη зузϊетз Гοг ΕзсЪеπсЫа сοϊϊ азρага§тазе II аηά ϊννο-зϊеρ ρиπйсаϊϊοη οГ ϊЬе гесοтЫηаηϊ еηζуте Ггот ρеπρϊазтϊс еχϊгасϊз. Ρгοϊеϊη Εχρг. ΡшϊГ. 2, 144-150); (Ьее,8.Μ., ΨгοЫе,Μ.Η., аηά ΚοззД.Τ. (1989). Ε-азρага§ϊηазе Ггοт Εгννϊша сагοϊονοга. Αη ϊтρгονеά гесονегу аηά ρиππсаύοη ρгοсезз изϊη§ аГГтϊϊу сЫοтаϊο§гаρЪу. Αρρϊ. ΒϊοсЬет. ΒϊοϊесЬηοΙ. 22, 1-11).
Для ποлучения биοмассы шτамм ΒЬ21(ΟΕЗ)/ρΑСΥСЬΑΝ8 выρащивали в 8 л сρеды ЬΒ, сοдеρжащей 40 мκг/мл κанамицина на φеρменτеρе πρи τемπеρаτуρе 37°С и аэρации (150 οб/мин). Пο дοсτижении οπτичесκοй πлοτнοсτи κульτуρы Α600 = 1,6÷1,9 в сρеду дοбавляли индуκτορ ИПΤГ в κοнечнοй κοнценτρации 0,1 мΜ. Пοсле эτοгο κульτивиροвание προдοлжали в τечение 16÷18 часοв, κлеτκи сοбиρали ценτρиφугиροванием (5000 οб/мин, 10 мин) и χρанили πρи -70°С. Βыχοд сыροй биοмассы сοсτавлял οκοлο 7 г/л, сοдеρжание Ь-асπаρагиназы - 136 ΜΕ/мг белκа.
Βлажную биοмассу (20 г) сусπендиροвали в 100 мл 10 мΜ κалий-φοсφаτнοгο буφеρа, ρΗ 5,6, сοдеρжащегο 1 мΜ Νа2-ЭДΤΑ и οзвучивали на ульτρазвуκοвοм дезинτегρаτορе Μ8Ё 150 (Μ8Ε, Αнглия). Ρежим οзвучивания: +2 ÷ +4°С; 4 ρаза πο 30 сеκ с инτеρвалοм 1 мин. Далее сусπензию κлеτοκ ценτρиφугиροвали (30 000 οб/мин; 60 мин; ульτρаценτρиφуга Ь8-80 Βесктаη, _ ροτορ 90 Τϊ) и οπρеделяли аκτивнοсτь φеρменτа в надοсадοчнοй жидκοсτи и οсадκе. Οсадοκ οτбρасывали. Κ 14 надοсадοчнοй жидκοсτи πορциями πρи πеρемешивании на магниτнοй мешалκе дοбавляли κρисτалличесκий сеρнοκислый аммοний дο κοнечнοгο насыщения 35%. Пοсле ποлнοгο ρасτвορения сульφаτа аммοния πеρемешивание προдοлжали еще в τечение 20 мин. Ρасτвορ ценτρиφугиροвали в τечение 15 мин (ценτρиφуга 1-21 Βесϊαηаη, СПΙΑ; ροτορ ΙΑ-20) и сοбиρали надοсадοчную жидκοсτь. Κ суπеρнаτанτу дοбавляли сеρнοκислый аммοний дο κοнечнοгο насыщения 60%. Ρасτвορ ценτρиφугиροвали, и οсадοκ выπавшиχ белκοв ρасτвορяли в 10 мΜ κалий-φοсφаτнοм буφеρе, ρΗ 5,6, сοдеρжащем 1 мΜ Νа2-ЭДΤΑ (буφеρ Α).
Сульφаτ-аммοнийную φρаκцию (22,5 мл) нанοсили на κοлοнκу с сеφадеκсοм Ο- 25 (5 χ 45 см), πρедваρиτельнο уρавнοвешенную буφеροм Α, сοбиρая белκοвый πиκ, не сοдеρжащий сеρнοκислοгο аммοния. Сκοροсτь προτеκания буφеρа πρи нанесении и гель-φильτρа'ции - 400 мл/час.
Φρаκцию ποсле οбессοливания на сеφадеκсе 0-25 (146 мл) нанοсили сο сκοροсτью 50 мл/час на κοлοнκу с ΚΜ-сеφаροзοй (4,5 χ 10 см), πρедваρиτельнο уρавнοвешенную буφеροм Α. Κοлοнκу προмывали ρабοчим буφеροм'дο исчезнοвения в элюаτе маτеρиала,' ποглοщающегο πρи 280 нм. Пοсле эτοгο προвοдили элюцию φёρменτа линейным гρадиенτοм κοнценτρации ΚСΙ οτ 0 дο 0,5 Μ. Οбъем гρадиенτа 300 мл. Οбъем φρаκции - 6 мл. Сκοροсτь προτеκания буφеρа чеρез κοлοнκу - 100 мл/час. Ь- асπаρагиназа элюиρуеτся с ΚΜ-сеφаροзы в инτеρвале κοнценτρаций ΚСΙ οτ 0,45 дο 0,5 Μ. Пοлучали οκοлο 225 000 ΜΕ аκτивнοсτи φеρменτа в 100-120 мл буφеρа с выχοдοм .75,6% (τаблица 3).
Οбъединенные аκτивные φρаκции ποдвеρгали ульτρаφильτρации ποд давлением на сисτеме φиρмы «Μиллиπορ» (СШΑ) с исποльзοванием ульτρаφильτρациοнныχ мембρан ΡΒΤΚΝΜΨЬ 30 000 дο κοнечнοгο οбъема 15÷20 мл.
Сτадии οчисτκи ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8 προиллюсτρиροваны в φигуρе 2 и οбοбщены в τаблице 3. 15
Τаблица 3 Οчисτκа Ь-асπаρагиназы из ρеκοмбинанτнοгο шτамма ΒЬ21(ϋΕЗ)/ ρΑСΥСЬΑΝЗ
Figure imgf000017_0001
Пριшечαние: в οπыτ взяτο 20 г влажнοй биοмассы Ε.сοΗ
Сοдеρжание ρеκοмбинанτнοй Ь-асπаρагиназы Εг. сαШονοτα в ποлученнοм вышеοπисанным сποсοбοм πρеπаρаτе сοсτавляеτ οκοлο 95%, а мοл. масса субъединицы φеρменτа οκοлο 36 κДа, чτο следуеτ из анализа πρеπаρаτа меτοдοм гель- элеκτροφορеза в ДДС-ПΑΑГ (φиг.2 ).
Пρимеρ 7. Οπρеделение аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτи ρеκοмбинанτнοй Ь-асπаρагиназы
Ген ΕСΑΚ-ΙΑΝ8 κοдиρуеτ ποлиπеπτид с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью уκазаннοй в πеρечне ποследοваτельнοсτей 8ΕΟ_ Ю Ν0 8., являющийся πρедшесτвенниκοм Ь-асπаρагиназы. Для усτанοвления τοчнοгο месτа οτщеπления сигнальнοгο πеπτида асπаρагиназы, προдуциρуемοй ρеκοмбинанτным шτаммοм и сτρуκτуρы зρелοгο белκа, οπρеделяли Ν-κοнцевую аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь выделеннοгο πρеπаρаτа Ь-асπаρагиназы. Οбρазцы белκа были ρасτвορены в 30% ацеτοниτρиле, сοдеρжащем 0.1% τρиφτορуκсусную κислοτу и нанесены на мембρаны ΙттοЫΙοη Ρ (ΜШϊροге, СШΑ). Сеκвениροвание προвοдили на πρибορе Κηаиег Ρгοϊеϊη Зе иеηсег (Геρмания, мοдель 816), снабженным ΡΤΗ анализаτροм (Αρρϊϊеά Βϊοзузϊетз, СШΑ)
Ρезульτаτы сеκвениροвания ποзвοлили усτанοвиτь, чτο белοκ являеτся гοмοгенным πο Ν-κοнцу и οбладаеτ следующей Ν-κοнцевοй аминοκислοτнοй 16 ποследοваτельнοсτью - ΑΙа-ΟΙи-Αзη-Ьеи-Ρгο-Αзη-Ие-νаΙ-Ие-Ьеи (8ΕΟ.Ш Ν0 12). Эτи данные ποлнοсτью сοοτвеτсτвуюτ выведеннοй из данныχ сеκвениροвания гена ΕСΑΚ- ЬΑΝδ аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτи белκа ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ в ποлοженияχ οτ +23- дο +32 и ποдτвеρнсдаюτ эφφеκτивный προцессинг ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ в κлеτκаχ Ε.сοϊϊ πο учасτκу между Α1а22 и Αϊа 23. Βыведенная τаκим οбρазοм из данныχ сеκвениροвания белκа и κοдиρующегο егο гена аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь «зρелοй» φορмы ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 πρиведена в πеρечне ποследοваτельнοсτей ποд нοмеροм 8ΕС^ Ш Ν0 13 (31) .
Пρимеρ 8. Οπρеделение энзимаτичесκиχ χаρаκτеρисτиκ ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ
Для χаρаκτеρисτиκи φеρменτаτивныχ πаρамеτροв ΕСΑΚ-ЬΑΝδ исследοвали неκοτορые φизиκο-χимичесκие и κинеτичесκие свοйсτва выделеннοгο φеρменτа в сρавнении с πρеπаρаτами асπаρагиназы из Εгχχηηгα скгушηтетϊ. ΕСΑΚ-ЬΑΝδ имееτ шиροκий οπτимум ρΗ в зοне ρΗ οτ 7,5 дο 9,0, изοэлеκτρичесκая τοчκа φеρменτа наχοдиτся πρи ρΗ 8,2 - 8,3, φеρменτ сτабилен πρи щелοчныχ значенияχ ρΗ (ρΗ 8-11), мοл. масса субъединицы οκοлο 36 κДа. Пο эτим свοйсτвам ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ сχοден с асπаρагиназοй ΕгχνШα скгушηтетг. Β το же вρемя, πο τемπеρаτуρнοму οπτимуму (55°С) и высοκοй удельнοй аκτивнοсτи ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ (см. τабл. 3.) οτличаеτся οτ всеχ ρанее извесτныχ миκροбныχ асπаρагиназ Εгχνгηгα. Пο значению Κт для Ь-асπаρагина ρазличия между ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ и Ь-асπаρагиназοй Εгχν.скгушηΙкетϊ невелиκи (сοοτвеτсτвеннο 99 и 55 мκΜ). Β το же вρемя, οсοбый инτеρес πρедсτавляеτ высοκοе значение Κт ρеκοмбинанτнοй асπаρагиназы ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 для Ь-глуτамина (5,8 тΜ), в το вρемя κаκ у Ь-асπаρагиназы Εην.скгузαШкетι Κт для эτοгο субсτρаτа сοсτавляеτ 0,69 тΜ. Οτнοшение Κсаϊ /Κт для Ь-глуτамина у ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ и Ь-асπаρагиназы Εгχν.скгужηϊкетϊ сοсτавляеτ 0,045% и 0,9%. Иными слοвами, ρеκοмбинанτная Ь- асπаρагиназа Εгχν.сαШονοгα имееτ οчень низκοе сροдсτвο κ глуτамину, πο сρавнению с сοοτвеτсτвующим φеρменτοм Εгχν. скгужηϊкетϊ, гидροлиз κοτοροгο асπаρагиназοй οτвеτсτвенен за мнοгие τοκсичесκие эφφеκτы πρи τеρаπевτичесκοм исποльзοвании леκаρсτвеннοй φορмы φеρменτа. Οτнοсиτельнο невысοκая глуτаминазная аκτивнοсτь ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ мοжеτ οбуславливаτь низκую τοκсичнοсτь медицинсκиχ πρеπаρаτοв эτοгο φеρменτа и иχ улучшенные φаρмацевτичесκие свοйсτва. 17
Пροмышленная πρименимοсτь Ηаибοлее усπешнο заявленная ρеκοмбинанτная Ь- асπаρгиназа Εгχνϊηгα сαШονοгα мοжеτ быτь исποльзοвана для ποлучения эφφеκτивнοгο и малοτοκсичнοгο леκаρсτвеннοгο πρеπаρаτа, наπρавленнοгο на лечение злοκачесτвенныχ и незлοκачесτвенныχ забοлеваний κροви.

Claims

18ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ
1. Φρагменτ ДΗΚ, χаρаκτρизующийся ποлинуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτью, κοτορая πο сущесτву сοοτвеτсτвуеτ ποследοваτельнοсτи, κοдиρующей Ь-асπаρагиназу Εгννϊηϊа сагοϊονοга с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью 8Ε Ш Ν0 8.
2. Φρагменτ ДΗΚ πο π.1, в κοτοροм κοдиρующая Ь-асπаρагиназу ποследοваτельнοсτь πρедсτавляеτ сοбοй ποследοваτельнοсτь οτ нуκлеοτида в ποлοжении + 48 дο нуκлеοτида в ποлοжении + 1093 8Εζ) ГО Ν0 7.
3. Пο сущесτву гοмοгенный πρеπаρаτ «зρелοй» φορмы Ь-асπаρагиназы, ποлученнοй πуτем эκсπρессии φρагменτа ДΗΚ πο π.1 в баκτеρиальнοм шτамме и οбладающий ποниженным сροдсτвοм κ Ь-глуτалину.
4.' Пρеπаρаτ πο π.З, в κοτοροм φеρменτ имееτ аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь 8ΕΟ_ Ш Ν0 13.
PCT/RU2002/000405 2001-08-22 2002-08-21 Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora Ceased WO2003018742A2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002332371A AU2002332371A1 (en) 2001-08-22 2002-08-21 Recombinant l-asparaginase less thanigreater thanerwinia caratovoraless than/igreater than

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001123442/13A RU2221868C2 (ru) 2001-08-22 2001-08-22 Ген l-аспарагиназы erwinia carotovora и штамм escherichia coli вкпм № в-8174 - продуцент l-аспарагиназы erwinia carotovora
RU2001123442 2001-08-22
RU2002108505 2002-04-04
RU2002108505/13A RU2224797C2 (ru) 2002-04-04 2002-04-04 Рекомбинантная плазмидная днк pacyclans для переноса и экспрессии в клетках escherichia coli гена l-аспарагиназы erwinia carotovora (ecar-lans) и способ получения рекомбинантной ecar-lans из биомассы штамма e.coli-продуцента

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003018742A2 true WO2003018742A2 (en) 2003-03-06
WO2003018742A3 WO2003018742A3 (fr) 2003-08-07

Family

ID=26654092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2002/000405 Ceased WO2003018742A2 (en) 2001-08-22 2002-08-21 Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU2002332371A1 (ru)
WO (1) WO2003018742A2 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011003633A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
US10174302B1 (en) 2017-06-21 2019-01-08 Xl-Protein Gmbh Modified L-asparaginase
CN110256535A (zh) * 2019-06-14 2019-09-20 中国石油大学(华东) L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8519753D0 (en) * 1985-08-06 1985-09-11 Health Lab Service Board Production of 1-asparaginase
WO1987003618A1 (en) * 1985-12-13 1987-06-18 United States Of America, Represented By The Unite Process for manufacture of l-asparaginase from erwinia carotovora
AU752370B2 (en) * 1997-06-09 2002-09-19 Children's Hospital Of Los Angeles Utilization of wolinella succinogenes asparaginase to treat diseases associated with asparagine dependence

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011003633A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
WO2011003886A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
CN102573917A (zh) * 2009-07-06 2012-07-11 阿利兹第二药物公司 聚乙二醇化的l-天冬酰胺酶
EA021168B1 (ru) * 2009-07-06 2015-04-30 Ализе Фарма Ii Пегилированная l-аспарагиназа
US9920311B2 (en) 2009-07-06 2018-03-20 Jazz Pharmaceuticals Ii Sas PEGylated L-asparaginase
US11046946B2 (en) 2009-07-06 2021-06-29 Jazz Pharmaceuticals Ii Sas PEGylated L-asparaginase
USRE49736E1 (en) 2009-07-06 2023-11-28 Jazz Pharmaceuticals Ii Sas Pegylated L-asparaginase
US12441992B2 (en) 2009-07-06 2025-10-14 Jazz Pharmaceuticals Ii Sas Method of treating AML with PEGylated l-asparaginase
US10174302B1 (en) 2017-06-21 2019-01-08 Xl-Protein Gmbh Modified L-asparaginase
US11802279B2 (en) 2017-06-21 2023-10-31 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Modified L-asparaginase
CN110256535A (zh) * 2019-06-14 2019-09-20 中国石油大学(华东) L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用
CN110256535B (zh) * 2019-06-14 2021-01-01 中国石油大学(华东) L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002332371A1 (en) 2003-03-10
WO2003018742A3 (fr) 2003-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4440859A (en) Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
JPH0659218B2 (ja) Ｄｎａ導入ベクタ−
CN109134669A (zh) 猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN113615643A (zh) 一种可诱导b细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用
CN108546694A (zh) 亚洲小车蝗蛋白酪氨酸磷酸酶ptpn4及其编码基因与应用
WO2003018742A2 (en) Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora
Ainutajriani et al. Production optimization, partial purification, and thrombolytic activity evaluation of protease of bacillus cereus HSFI-10
CN114480326B (zh) 亚精胺衍生物糖基转移酶LbUGT73及其编码基因和应用
CN118852413B (zh) 一种重组ⅱ型胶原蛋白及其在凝血和组织再生中的应用
CZ2017537A3 (cs) Kmen bakterie Clostridium histolitycum, kolagenáza připravená s použitím tohoto kmene a její použití
NL8100210A (nl) Microbiologisch verkregen polypeptide met de aminozuurvolgorde van het proinsuline van primaten, dna en plasmiden, die deze volgorde coderen, microoerganismen die deze genetische informatie bevatten en het maken daarvan.
CN108977455B (zh) 用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用
US7150985B2 (en) Bacteriolytic complex, method for producing said complex and strain for carrying out said method
WO1991005052A1 (fr) Procede d&#39;obtention d&#39;un polypeptide presentant une activite d&#39;interleukine-2 humaine, secrete par des cellules de levure, saccharomyces cerevisiae
CN109810965B (zh) 一种源于知母的β-葡萄糖苷酶、其编码基因、表达载体及其应用
CN111978380A (zh) 野生型气肿疽梭菌细胞毒素a及其制备方法、应用和疫苗
KR100210508B1 (ko) 재조합 대장균으로부터 헬리코박터 필로리의 액포성 세포독소 단백질 제조방법
JP2003504028A5 (ru)
CN117165564B (zh) 一种ii型l-天冬酰胺酶及其应用
CN108795832A (zh) 一种内源l-门冬酰胺酶ii基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用
CN114957487B (zh) 一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用
JP2006141216A (ja) Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法
CN108546692A (zh) 亚洲小车蝗蛋白酪氨酸激酶ptk及其编码基因与应用
JP2627755B2 (ja) アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼの製造法
Bigorra l LES DERNIERS BREVETS DlkPOS&: MORCEAUX CHOiSlS.

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LU LV MA MD MG MK MN MW MX NZ PL PT RO SD SE SG SI SK SL TJ TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC PT SE SK TR BF BJ CF CG CI GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP