CN109134669A - 猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。本发明提供的猪伪狂犬病毒的融合蛋白包括gB区段和gD区段，gB区段由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，gD区段由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为选用经典毒株和当前流行毒株的基因作为研究对象，通过对比分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高融合蛋白抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。本发明还提供了融合蛋白的制备方法及应用和制备的疫苗。

Description

猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗。

背景技术

猪伪狂犬病(porcine pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesbvirus，PRV)引起的、严重危害我国养猪业健康发展的重要传染病之一。该病毒属于疱疹毒科甲型疱疹病毒亚科的线性双链DNA病毒，病毒DNA的G+C含量相对较高。目前已知病毒糖蛋白有11种，即必需糖蛋白和非必需糖蛋白。

伪狂犬病的易感范围很广，新生仔猪多为致死性感染，和其他易感物种相类似，多死于中枢神经系统疾病。成年猪感染该病多表现呼吸系统疾病，大多呈隐性感染，无明显症状。猪感染PRV后，自身的免疫系统受到损害，免疫力下降，因而更易继发其他疾病，例如猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等。给猪伪狂犬病的防治增加了难度。目前，PR的感染和发病率都很高，极易造成巨大的经济损失。

对于2周龄以内的哺乳仔猪来说，在感染初期可能会出现发热、厌食、呕吐、下痢、精神不振等症状；随着病情的加深继而出现神经临诊症状，如发抖、共济失调、倒地四肢划动；常伴有癫痫样发作或肌肉抽搐，昏睡，最后衰竭死亡；死亡率可高达100％。

稍大一些的约3-4周龄的猪主要临诊症状同于2周龄仔猪，但是比2周龄仔猪的病程稍长，伴有便秘现象，死亡率一般可达40-60％；即使耐过，也会伴发有生长发育迟缓、受阻、偏瘫等后遗症。

2月龄以上的猪自身免疫力增强，感染PRV后多呈隐性感染，无明显的临床症状；有症状也较轻微，一过性的发热和咳嗽，也可能会有呕吐现象。

怀孕母猪对PRV易感性较高，感染后表现为咳嗽、精神沉郁、食欲减退等呼吸系统、消化系统症状，继而出现流产症状、产木乃伊胎、产死胎和产弱仔，其中以死胎为主。所产的弱仔猪常伴有腹泻、痉挛、运动失调、角弓反张等症状，通常在24-36h内死亡。

对猪伪狂犬病的防控，国内外均以疫苗免疫预防为主，结合伪狂犬病毒gE抗原和gE抗体检测淘汰、净化野毒感染猪。目前，国内外临床应用的PR疫苗大体可分为以下三类：一是将分离的野毒或强毒经甲醛灭活后，加佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗；二是将分离的野毒或强毒经非猪源细胞或者鸡胚反复传代致弱研制的弱毒疫苗；三是利用基因工程技术构建的基因缺失疫苗。灭活疫苗虽然安全，但免疫效力有限，又不能起到疫病净化的目标。弱毒疫苗安全性存在隐患，生产周期长，成本高。此外，猪伪狂犬病毒用基因缺失活疫苗、全病毒灭活疫苗均在贴壁细胞上生长，且需要动物源蛋白，为疫苗制造带来风险。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，该融合蛋白广谱性好，具有良好的免疫原性，制备得到的抗体滴度高并且可以预防多种亚型的猪伪狂犬病毒。

本发明的第二目的在于提供一种上述融合蛋白的制备方法，该制备方法可以实现大量表达高质量的上述融合蛋白。

本发明的第三目的在于提供上述融合蛋白的应用。

本发明的第四目的在于提供一种包含上述融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，包括gB区段和gD区段；

所述gB区段由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，所述gD区段由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。

进一步地，所述gB区段和所述gD区段的排列顺序为gB-gD，通过Linker连接；

所述Linker具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述融合蛋白为HEK 293-F细胞表达系统表达的蛋白。

一种上述融合蛋白的制备方法，在哺乳动物表达系统中，表达编码所述融合蛋白的基因。

进一步地，在HEK 293-F细胞表达系统中表达编码所述融合蛋白的基因。

进一步地，提供包含编码所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入HEK 293-F细胞中，然后对HEK 293-F细胞进行筛选，得到稳定表达所述融合蛋白的HEK293-F细胞株，所述HEK 293-F细胞株表达得到所述融合蛋白；

优选地，所述筛选包括加压筛选和单克隆筛选。

进一步地，使用遗传霉素筛选系统筛选表达所述融合蛋白的HEK 293-F细胞；

优选地，所述遗传霉素筛选系统中使用的表达载体为pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13，优选为pcDNA3.1。

上述融合蛋白或制备方法制备得到的融合蛋白在如下A)-D)中的至少一种的应用：

A)制备猪伪狂犬病毒疫苗；

B)制备猪伪狂犬病毒的抗体；

C)制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒；

D)制备猪伪狂犬病毒诊断抗原。

一种包含上述猪伪狂犬病毒的融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗。

进一步地，所述猪伪狂犬病毒疫苗中融合蛋白的用量为70-90μg/头份；

优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；

优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、卡波姆、蜂胶、MF59佐剂或ISA201，优选使用ISA201。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的猪伪狂犬病毒的融合蛋白包括gB区段和gD区段，gB区段由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列表达，gD区段由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为选用经典毒株和当前流行毒株的基因作为研究对象，通过对比分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高融合蛋白抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。该融合蛋白的广谱性好，具有良好的免疫原性，制备得到的抗体滴度高并且可以预防多种亚型的猪伪狂犬病毒。

本发明提供上述融合蛋白的制备方法，该制备方法可以实现大量表达高质量的上述融合蛋白，并且操作简单，适合规模化生产。

本发明提供包含上述融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗，制备成本低，不到现有疫苗生产成本的1％，同时免疫效果好。用该疫苗免疫21日龄的仔猪后，免疫21日后分别采血测中和抗体，结果显示21日中和抗体不低于1:1000，并且，攻毒结果显示该疫苗既能够有效预防经典强毒(SC株)和当前流行毒株的攻击(JS株)，保护率可以达到100％。该疫苗优于常规疫苗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中gB基因PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL15000、gB基因PCR扩增产物；

图2为本发明实施例2中gD基因PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL15000、gD基因PCR扩增产物。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，包括gB区段和gD区段，其中，gB区段由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列表达，gD区段由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。

gB蛋白作为PRV囊膜构成的主要组成成分，也是PRV重要的免疫原性成分，进入机体后能够刺激机体产生补体依赖性、补体非依赖性的中和抗体。

gD蛋白作为必需糖蛋白之一，是PRV入侵细胞发生感染多必须的糖蛋白，gD诱导产生的中和抗体无论补体是否存在都能够进行PRV的中和反应。

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为选用经典毒株和当前流行毒株的基因作为研究对象，通过对比分析后得到的序列，并将该序列进行密码子的优化和修饰，以达到进一步提高融合蛋白抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。该融合蛋白的广谱性好，具有良好的免疫原性，制备得到的抗体滴度高并且可以预防多种亚型的猪伪狂犬病毒。

在本发明的一些实施方式中，gB区段和所述gD区段的排列顺序为gB-gD，通过Linker连接，其中，Linker具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。通过用Linker将gB和gD进行连接，既达到了蛋白重组的目的，又避免了gB和gD蛋白各自高级结构形成的相互影响。编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一个优选地实施方式中，融合蛋白为HEK 293-F细胞表达系统表达的蛋白。HEK 293-F细胞为哺乳动物表达系统，使用HEK 293-F细胞作为宿主细胞，避免了损失该融合蛋白的构象型的抗原表位。

一种上述融合蛋白的制备方法，在哺乳动物表达系统中，表达编码融合蛋白的基因。该制备方法可以实现大量表达高质量的上述融合蛋白，并且操作简单，适合规模化生产。哺乳动物表达系统例如可以为但不限为HEK 293-F细胞、HEK 293-E细胞、HEK 293-T细胞、CHO细胞或者COS细胞。

在本发明一个优选地实施方式中，在HEK 293-F细胞表达系统中表达编码所述融合蛋白的基因。HEK293是经腺病毒Ad5转染人胚肾细胞之后得到的稳定细胞系，HEK293-F为HEK293的衍生细胞系，具有易转染、高表达、天然糖基化修饰、允许蛋白正确折叠和相关翻译后修饰等优点。

在本发明的一些实施方式中，猪伪狂犬病毒的融合蛋白的指标方法包括：提供包含编码融合蛋白的基因的表达载体，将表达载体导入HEK 293-F细胞中，然后对HEK 293-F细胞进行筛选，得到稳定表达融合蛋白的HEK 293-F细胞株，HEK 293-F细胞株表达得到融合蛋白。优选稳定表达融合蛋白的HEK 293-F细胞株表达量不低于1mg/ml。

在本发明一个优选地实施方式中，筛选包括加压筛选和单克隆筛选。先利用加压筛选有利于快速得到表达融合蛋白的细胞株，再通过单克隆筛选可以得到融合蛋白的高表达纯细胞株。

在本发明一个优选的实施方式中，使用遗传霉素筛选系统筛选表达融合蛋白的HEK 293-F细胞。G遗传霉素(G-148)是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G-418遗传霉素的选择性培养基中生长。

在本发明一个优选的实施方式中，遗传霉素筛选系统中使用的表达载体为pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13，优选为pcDNA3.1。

上述融合蛋白或制备方法制备得到的融合蛋白在如下A)-D)中的至少一种的应用：

A)制备猪伪狂犬病毒疫苗；

B)制备猪伪狂犬病毒的抗体；

C)制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒；

D)制备猪伪狂犬病毒诊断抗原。

一种包含上述猪伪狂犬病毒的融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗。该疫苗制备成本低，不到现有疫苗生产成本的1％，同时免疫效果好。用该疫苗免疫21日龄的仔猪后，免疫21日后分别采血测中和抗体，结果显示21日中和抗体不低于1:1000，并且，攻毒结果显示该疫苗既能够有效预防经典强毒(SC株)和当前流行毒株的攻击(JS株)，保护率可以达到100％。该疫苗优于常规疫苗。

在本发明一些优选地实施方式中，猪伪狂犬病毒疫苗中融合蛋白的用量为70-90μg/头份。

在本发明的一些实施方式中，疫苗还包括辅料，辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。

在本发明一些实施方式中，疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、卡波姆、蜂胶、MF59佐剂或ISA201，优选使用ISA201。

为了便于理解本发明提供的技术方案，下面结合实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。

实施例1编码猪伪狂犬病毒的融合蛋白序列

从Genebank上选用经典毒株(SC株)和当前流行毒株(JS株)的基因作为研究对象，通过对比分析，选择出优势表位作为疫苗抗原的成分，根据HEK 293-F细胞密码子的偏嗜性，并将该序列进行密码子的优化和修饰，得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，PCR富集gB序列的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，PCR富集gD序列的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。gB和gD序列的中间用SEQ ID NO.3所示序列连接，以达到进一步提高融合蛋白抗原广谱性和提高抗原表达量的目的。

实施例2表达融合蛋白的重组载体的构建

将上述合成的编码融合蛋白的序列通过Mlu I和Hind III位点插入克隆到真核转移载体pcDNA3.1上。利用T4DNA连接酶在16℃过夜连接后获得连接产物，经大肠杆菌感受态DH5α转化后涂布于含有氨节青霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取阳性菌落在含有氨节青霉素的LB培养基中培养，提取质粒。经过PCR、双酶切和测序验证得到正确的重组质粒。

实施例3重组细胞的加压筛选

将重组质粒转染至生长良好全悬浮的HEK 293-F细胞，72小时后进行细胞传代，并在培养基内加入600μg/ml的G418，加压至活率在10％左右时，停止加压，用常规的培养基培养，当细胞活率达到90％以上时，再加压筛选一次，同样细胞活率达到90％以上时进行下一步筛选。

实施例4重组细胞的单克隆筛选

阳性克隆挑选和检测：培养7天后的平板中，将贴壁生长的细胞挑至96孔板中，利用贴壁培养基培养7天后，加入100μL悬浮培养基Freestyle HEK 293-F培养2天，孔板中培养基用于点杂交检测，将其中高表达克隆转至24孔板，利用贴壁培养基培养2天后换为Freestyle HEK 293-F培养，培养基用于蛋白质印迹法检测，根据实验结果最终得到高表达克隆株。所有细胞的培养条件为37℃，5％CO₂。

经过筛选得到3株表达量相对较高的细胞株，分别命名为293F-gB-gD-1、293F-gB-gD-2、293F-gB-gD-3。

实施例5重组细胞的培养

将经过筛选的HEK 293-F细胞在Freestyle HEK 293-F培养基中重悬细胞，细胞接种密度为0.3×10⁶～0.5×10⁶VC/ml，接种细胞于合适体积的细胞摇瓶，并置于36～38℃，含5％CO₂摇床中进行摇瓶培养48～72小时，继续传代扩增培养细胞。

根据需要进行逐级生物反应器培养发酵，一般进行5～8倍放大，放大到特定体积时进行抗原的表达，在36～38℃培养至第5日将温度降至31～33℃，pH调整至7.5±0.1，并以适宜转速进行培养，在第4日和第9日加入10％起始工作体积的Efficient Feed，每日检测葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于2.5g/L时，补充葡萄糖到3～4g/L。当细胞活率低于80％时，收获上清即为所需抗原。

通过优化该细胞株的培养条件、补料时间和补料量，最终获得了1.0～1.2mg/ml的gB-gD蛋白表达。

实施例6猪伪狂犬病毒疫苗

去细胞碎片将表达的定量后，与ISA201佐剂混合制备成疫苗。其中水相与油相乳化比例为1:1质量比，先将油相导入烧杯中，慢速搅拌，缓慢加入水相，加完后10000r/min剪切乳化5min，在终止乳化前按总量加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌混匀。无菌定量分装，加盖密封，获得猪伪狂犬病毒亚单位疫苗，置2～8℃保存。

用该疫苗免疫21日龄的仔猪后，免疫21日后分别采血测中和抗体，结果显示21日中和抗体不低于1:1000，并且，攻毒结果显示该疫苗既能够有效预防经典强毒(SC株)和当前流行毒株(JS株)的攻击，保护率可以达到100％。所有免疫猪均无体温升高和异常临床症状的产生。

对比例1

用经典强毒(SC株)和当前流行毒株(JS株)攻击健康的21日龄仔猪，结果显示对照猪均出现体温升高41度以上、并伴有神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀等猪伪狂犬病毒的临床症状。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物股份有限公司

<120> 猪伪狂犬病毒的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2745

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcccgccg gcggcggcct gtggcgcggc ccccgcggcc accgccccgg ccaccacggc 60

ggcgccggcc tgggccgcct gtggcccgcc ccccaccacg ccgccgccgc ccgcggcgcc 120

gtggccctgg ccctgctgct gctggccctg gccgccaccc ccacctgcgg cgccgccgcc 180

gtgacccgcg ccgccagcgc cagccccgcc cccggcaccg gcgccacccc cgacggcttc 240

agcgccgagg agagcctgga ggagatcgac ggcgccgtga gccccggccc cagcgacgcc 300

cccgacggcg agtacggcga cctggacgcc cgcaccgccg tgcgcgccgc cgccaccgag 360

cgcgaccgct tctacgtgtg cccccccccc agcggcagca ccgtggtgcg cctggagccc 420

gagcaggcct gccccgagta cagccagggc cgcaacttca ccgagggcat cgccgtgctg 480

ttcaaggaga acatcgcccc ccacaagttc aaggcccaca tctactacaa gaacgtgatc 540

gtgaccaccg tgtggagcgg cagcacctac gccgccatca ccaaccgctt caccgaccgc 600

gtgcccgtgc ccgtgcagga gatcaccgac gtgatcgacc gccgcggcaa gtgcgtgagc 660

aaggccgagt acgtgcgcaa caaccacaag gtgaccgcct tcgaccgcga cgagaacccc 720

gtggaggtgg acctgcgccc cagccgcctg aacgccctgg gcacccgcgg ctggcacacc 780

accaacgaca cctacaccaa gatcggcgcc gccggcttct accacaccgg caccagcgtg 840

aactgcatcg tggaggaggt ggaggcccgc agcgtgtacc cctacgacag cttcgccctg 900

agcaccggcg acatcgtgta catgagcccc ttctacggcc tgcgcgaggg cgcccacggc 960

gagcacatcg gctacgcccc cggccgcttc cagcaggtgg agcactacta ccccatcgac 1020

ctggacagcc gcctgcgcgc cagcgagagc gtgacccgca acttcctgcg caccccccac 1080

ttcaccgtgg cctgggactg ggcccccaag acccgccgcg tgtgcagcct ggccaagtgg 1140

cgcgaggccg aggagatgat ccgcgacgag acccgcgacg gcagcttccg cttcaccagc 1200

cgcgccctgg gcgccagctt cgtgagcgac gtgacccagc tggacctgca gcgcgtgcac 1260

ctgggcgact gcgtgctgcg cgaggccagc gaggccatcg acgccatcta ccgccgccgc 1320

tacaacaaca cccacgtgct ggccggcgac aagcccgagg tgtacctggc ccgcggcggc 1380

ttcgtggtgg ccttccgccc cctgatcagc aacgagctgg cccagctgta cgcccgcgag 1440

ctggagcgcc tgggcctggc cggcgtggtg ggccccgcca gccccgccgc cgcccgccgc 1500

gcccgccgca gccccggccc cgccggcacc cccgagcccc ccgccgtgaa cggcaccggc 1560

cacctgcgca tcaccaccgg cagcgccgag ttcgcccgcc tgcagttcac ctacgaccac 1620

atccaggccc acgtgaacga catgctgagc cgcatcgccg ccgcctggtg cgagctgcag 1680

aacaaggacc gcaccctgtg gggcgagatg agccgcctga accccagcgc cgtggccacc 1740

gccgccctgg gccagcgcgt gagcgcccgc atgctgggcg acgtgatggc catcagccgc 1800

tgcgtggagg tgcgcggcgg cgtgtacgtg cagaacagca tgcgcgtgcc cggcgagcgc 1860

ggcacctgct acagccgccc cctggtgacc ttcgagcaca acggcaccgg cgtgatcgag 1920

ggccagctgg gcgacgacaa cgagctgctg atcagccgcg acctgatcga gccctgcacc 1980

ggcaaccacc gccgctactt caagctgggc ggcggctacg tgtactacga ggactacagc 2040

tacgtgcgca tggtggaggt gcccgagacc atcagcaccc gcgtgaccct gaacctgacc 2100

ctgctggagg accgcgagtt cctgcccctg gaggtgtaca cccgcgagga gctggccgac 2160

accggcctgc tggactacag cgagatccag cgccgcaacc agctgcacgc cctgaagttc 2220

tacgacatcg accgcgtggt gaaggtggac cacaacgtgg tgctgctgcg cggcatcgcc 2280

aacttcttcc agggcctggg cgacgtgggc gccgccgtgg gcaaggtggt gctgggcgcc 2340

accggcgccg tgatcagcgc cgtgggcggc atggtgagct tcctgagcaa ccccttcggc 2400

gccctggcca tcggcctgct ggtgctggcc ggcctggtgg ccgccttcct ggcctaccgc 2460

cacatcagcc gcctgcgccg caaccccatg aaggccctgt accccgtgac caccaaggcc 2520

ctgaaggagg acggcgtgga ggaggacgac gtggacgagg ccaagctgga ccaggcccgc 2580

gacatgatcc gctacatgag catcgtgagc gccctggagc agcaggagca caaggcccgc 2640

aagaagaaca gcggccccgc cctgctggcc agccgcgtgg gcgccatggc cacccgccgc 2700

cgccactacc agcgcctgga gaacgaggac cccgacgccc cctaa 2745

<210> 2

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgctgctgg ccgccctgct ggccgccctg gtggcccgca ccaccctggg cgccgacgtg 60

gacgccgtgc ccgcccccac cttccccccc cccgcctacc cctacaccga gagctggcag 120

ctgaccctga ccaccgtgcc cagccccttc gtgggccccg ccgacgtgta ccacacccgc 180

cccctggagg acccctgcgg cgtggtggcc ctgatcagcg acccccaggt ggaccgcctg 240

ctgaacgagg ccgtggccca ccgccgcccc acctaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc 300

atcgccgacg gctgcgccca cctgctgtac ttcatcgagt acgccgactg cgacccccgc 360

cagatcttcg gccgctgccg ccgccgcacc acccccatgt ggtggacccc cagcgccgac 420

tacatgttcc ccaccgagga cgagctgggc ctgctgatgg tggcccccgg ccgcttcaac 480

gagggccagt accgccgcct ggtgagcgtg gacggcgtga acatcctgac cgacttcatg 540

gtggccctgc ccgagggcca ggagtgcccc ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacctac 600

aagttcggcg cctgctggag cgacgacagc ttcaagcgcg gcgtggacgt gatgcgcttc 660

ctgaccccct tctaccagca gcccccccac cgcgaggtgg tgaactactg gtaccgcaag 720

aacggccgca ccctgccccg cgcctacgcc gccgccaccc cctacgccat cgaccccgcc 780

cgccccagcg ccggcagccc ccgcccccgc ccccgccccc gcccccgccc ccgccccaag 840

cccgagcccg cccccgccac ccccgccccc cccggccgcc tgcccgagcc cgccacccgc 900

gaccacgccg ccggcggccg ccccaccccc cgcccccccc gccccgagac cccccaccgc 960

cccttcgccc cccccgccgt ggtgcccagc ggctggcccc agcccgccga gcccttcccc 1020

ccccgcacca ccgccgcccc cggcgtgagc cgccaccgca gcgtgatcgt gggcaccggc 1080

accgccatgg gcgccctgct ggtgggcgtg tgcgtgtaca tcttcttccg cctgcgcggc 1140

gccaagggct accgcctgct gggcggcccc gccgacgccg acgagctgaa ggcccagccc 1200

ggcccctaa 1209

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctcccagcc ccagc 15

<210> 4

<211> 3963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcccgccg gcggcggcct gtggcgcggc ccccgcggcc accgccccgg ccaccacggc 60

ggcgccggcc tgggccgcct gtggcccgcc ccccaccacg ccgccgccgc ccgcggcgcc 120

gtggccctgg ccctgctgct gctggccctg gccgccaccc ccacctgcgg cgccgccgcc 180

gtgacccgcg ccgccagcgc cagccccgcc cccggcaccg gcgccacccc cgacggcttc 240

agcgccgagg agagcctgga ggagatcgac ggcgccgtga gccccggccc cagcgacgcc 300

cccgacggcg agtacggcga cctggacgcc cgcaccgccg tgcgcgccgc cgccaccgag 360

cgcgaccgct tctacgtgtg cccccccccc agcggcagca ccgtggtgcg cctggagccc 420

gagcaggcct gccccgagta cagccagggc cgcaacttca ccgagggcat cgccgtgctg 480

ttcaaggaga acatcgcccc ccacaagttc aaggcccaca tctactacaa gaacgtgatc 540

gtgaccaccg tgtggagcgg cagcacctac gccgccatca ccaaccgctt caccgaccgc 600

gtgcccgtgc ccgtgcagga gatcaccgac gtgatcgacc gccgcggcaa gtgcgtgagc 660

aaggccgagt acgtgcgcaa caaccacaag gtgaccgcct tcgaccgcga cgagaacccc 720

gtggaggtgg acctgcgccc cagccgcctg aacgccctgg gcacccgcgg ctggcacacc 780

accaacgaca cctacaccaa gatcggcgcc gccggcttct accacaccgg caccagcgtg 840

aactgcatcg tggaggaggt ggaggcccgc agcgtgtacc cctacgacag cttcgccctg 900

agcaccggcg acatcgtgta catgagcccc ttctacggcc tgcgcgaggg cgcccacggc 960

gagcacatcg gctacgcccc cggccgcttc cagcaggtgg agcactacta ccccatcgac 1020

ctggacagcc gcctgcgcgc cagcgagagc gtgacccgca acttcctgcg caccccccac 1080

ttcaccgtgg cctgggactg ggcccccaag acccgccgcg tgtgcagcct ggccaagtgg 1140

cgcgaggccg aggagatgat ccgcgacgag acccgcgacg gcagcttccg cttcaccagc 1200

cgcgccctgg gcgccagctt cgtgagcgac gtgacccagc tggacctgca gcgcgtgcac 1260

ctgggcgact gcgtgctgcg cgaggccagc gaggccatcg acgccatcta ccgccgccgc 1320

tacaacaaca cccacgtgct ggccggcgac aagcccgagg tgtacctggc ccgcggcggc 1380

ttcgtggtgg ccttccgccc cctgatcagc aacgagctgg cccagctgta cgcccgcgag 1440

ctggagcgcc tgggcctggc cggcgtggtg ggccccgcca gccccgccgc cgcccgccgc 1500

gcccgccgca gccccggccc cgccggcacc cccgagcccc ccgccgtgaa cggcaccggc 1560

cacctgcgca tcaccaccgg cagcgccgag ttcgcccgcc tgcagttcac ctacgaccac 1620

atccaggccc acgtgaacga catgctgagc cgcatcgccg ccgcctggtg cgagctgcag 1680

aacaaggacc gcaccctgtg gggcgagatg agccgcctga accccagcgc cgtggccacc 1740

gccgccctgg gccagcgcgt gagcgcccgc atgctgggcg acgtgatggc catcagccgc 1800

tgcgtggagg tgcgcggcgg cgtgtacgtg cagaacagca tgcgcgtgcc cggcgagcgc 1860

ggcacctgct acagccgccc cctggtgacc ttcgagcaca acggcaccgg cgtgatcgag 1920

ggccagctgg gcgacgacaa cgagctgctg atcagccgcg acctgatcga gccctgcacc 1980

ggcaaccacc gccgctactt caagctgggc ggcggctacg tgtactacga ggactacagc 2040

tacgtgcgca tggtggaggt gcccgagacc atcagcaccc gcgtgaccct gaacctgacc 2100

ctgctggagg accgcgagtt cctgcccctg gaggtgtaca cccgcgagga gctggccgac 2160

accggcctgc tggactacag cgagatccag cgccgcaacc agctgcacgc cctgaagttc 2220

tacgacatcg accgcgtggt gaaggtggac cacaacgtgg tgctgctgcg cggcatcgcc 2280

aacttcttcc agggcctggg cgacgtgggc gccgccgtgg gcaaggtggt gctgggcgcc 2340

accggcgccg tgatcagcgc cgtgggcggc atggtgagct tcctgagcaa ccccttcggc 2400

gccctggcca tcggcctgct ggtgctggcc ggcctggtgg ccgccttcct ggcctaccgc 2460

cacatcagcc gcctgcgccg caaccccatg aaggccctgt accccgtgac caccaaggcc 2520

ctgaaggagg acggcgtgga ggaggacgac gtggacgagg ccaagctgga ccaggcccgc 2580

gacatgatcc gctacatgag catcgtgagc gccctggagc agcaggagca caaggcccgc 2640

aagaagaaca gcggccccgc cctgctggcc agccgcgtgg gcgccatggc cacccgccgc 2700

cgccactacc agcgcctgga gaacgaggac cccgacgccc cccctcccag ccccagcctg 2760

ctggccgccc tgctggccgc cctggtggcc cgcaccaccc tgggcgccga cgtggacgcc 2820

gtgcccgccc ccaccttccc cccccccgcc tacccctaca ccgagagctg gcagctgacc 2880

ctgaccaccg tgcccagccc cttcgtgggc cccgccgacg tgtaccacac ccgccccctg 2940

gaggacccct gcggcgtggt ggccctgatc agcgaccccc aggtggaccg cctgctgaac 3000

gaggccgtgg cccaccgccg ccccacctac cgcgcccacg tggcctggta ccgcatcgcc 3060

gacggctgcg cccacctgct gtacttcatc gagtacgccg actgcgaccc ccgccagatc 3120

ttcggccgct gccgccgccg caccaccccc atgtggtgga cccccagcgc cgactacatg 3180

ttccccaccg aggacgagct gggcctgctg atggtggccc ccggccgctt caacgagggc 3240

cagtaccgcc gcctggtgag cgtggacggc gtgaacatcc tgaccgactt catggtggcc 3300

ctgcccgagg gccaggagtg ccccttcgcc cgcgtggacc agcaccgcac ctacaagttc 3360

ggcgcctgct ggagcgacga cagcttcaag cgcggcgtgg acgtgatgcg cttcctgacc 3420

cccttctacc agcagccccc ccaccgcgag gtggtgaact actggtaccg caagaacggc 3480

cgcaccctgc cccgcgccta cgccgccgcc accccctacg ccatcgaccc cgcccgcccc 3540

agcgccggca gcccccgccc ccgcccccgc ccccgccccc gcccccgccc caagcccgag 3600

cccgcccccg ccacccccgc cccccccggc cgcctgcccg agcccgccac ccgcgaccac 3660

gccgccggcg gccgccccac cccccgcccc ccccgccccg agacccccca ccgccccttc 3720

gccccccccg ccgtggtgcc cagcggctgg ccccagcccg ccgagccctt ccccccccgc 3780

accaccgccg cccccggcgt gagccgccac cgcagcgtga tcgtgggcac cggcaccgcc 3840

atgggcgccc tgctggtggg cgtgtgcgtg tacatcttct tccgcctgcg cggcgccaag 3900

ggctaccgcc tgctgggcgg ccccgccgac gccgacgagc tgaaggccca gcccggcccc 3960

taa 3963

<210> 5

<211> 1320

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Pro Ala Gly Gly Gly Leu Trp Arg Gly Pro Arg Gly His Arg Pro

1 5 10 15

Gly His His Gly Gly Ala Gly Leu Gly Arg Leu Trp Pro Ala Pro His

20 25 30

His Ala Ala Ala Ala Arg Gly Ala Val Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

35 40 45

Ala Leu Ala Ala Thr Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ala Val Thr Arg Ala

50 55 60

Ala Ser Ala Ser Pro Ala Pro Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asp Gly Phe

65 70 75 80

Ser Ala Glu Glu Ser Leu Glu Glu Ile Asp Gly Ala Val Ser Pro Gly

85 90 95

Pro Ser Asp Ala Pro Asp Gly Glu Tyr Gly Asp Leu Asp Ala Arg Thr

100 105 110

Ala Val Arg Ala Ala Ala Thr Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro

115 120 125

Pro Pro Ser Gly Ser Thr Val Val Arg Leu Glu Pro Glu Gln Ala Cys

130 135 140

Pro Glu Tyr Ser Gln Gly Arg Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val Leu

145 150 155 160

Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro His Lys Phe Lys Ala His Ile Tyr Tyr

165 170 175

Lys Asn Val Ile Val Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala

180 185 190

Ile Thr Asn Arg Phe Thr Asp Arg Val Pro Val Pro Val Gln Glu Ile

195 200 205

Thr Asp Val Ile Asp Arg Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr

210 215 220

Val Arg Asn Asn His Lys Val Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asn Pro

225 230 235 240

Val Glu Val Asp Leu Arg Pro Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Thr Arg

245 250 255

Gly Trp His Thr Thr Asn Asp Thr Tyr Thr Lys Ile Gly Ala Ala Gly

260 265 270

Phe Tyr His Thr Gly Thr Ser Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Glu

275 280 285

Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp

290 295 300

Ile Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Leu Arg Glu Gly Ala His Gly

305 310 315 320

Glu His Ile Gly Tyr Ala Pro Gly Arg Phe Gln Gln Val Glu His Tyr

325 330 335

Tyr Pro Ile Asp Leu Asp Ser Arg Leu Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr

340 345 350

Arg Asn Phe Leu Arg Thr Pro His Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Ala

355 360 365

Pro Lys Thr Arg Arg Val Cys Ser Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ala Glu

370 375 380

Glu Met Ile Arg Asp Glu Thr Arg Asp Gly Ser Phe Arg Phe Thr Ser

385 390 395 400

Arg Ala Leu Gly Ala Ser Phe Val Ser Asp Val Thr Gln Leu Asp Leu

405 410 415

Gln Arg Val His Leu Gly Asp Cys Val Leu Arg Glu Ala Ser Glu Ala

420 425 430

Ile Asp Ala Ile Tyr Arg Arg Arg Tyr Asn Asn Thr His Val Leu Ala

435 440 445

Gly Asp Lys Pro Glu Val Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala

450 455 460

Phe Arg Pro Leu Ile Ser Asn Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Ala Arg Glu

465 470 475 480

Leu Glu Arg Leu Gly Leu Ala Gly Val Val Gly Pro Ala Ser Pro Ala

485 490 495

Ala Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu

500 505 510

Pro Pro Ala Val Asn Gly Thr Gly His Leu Arg Ile Thr Thr Gly Ser

515 520 525

Ala Glu Phe Ala Arg Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Ala His

530 535 540

Val Asn Asp Met Leu Ser Arg Ile Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gln

545 550 555 560

Asn Lys Asp Arg Thr Leu Trp Gly Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser

565 570 575

Ala Val Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gln Arg Val Ser Ala Arg Met Leu

580 585 590

Gly Asp Val Met Ala Ile Ser Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val

595 600 605

Tyr Val Gln Asn Ser Met Arg Val Pro Gly Glu Arg Gly Thr Cys Tyr

610 615 620

Ser Arg Pro Leu Val Thr Phe Glu His Asn Gly Thr Gly Val Ile Glu

625 630 635 640

Gly Gln Leu Gly Asp Asp Asn Glu Leu Leu Ile Ser Arg Asp Leu Ile

645 650 655

Glu Pro Cys Thr Gly Asn His Arg Arg Tyr Phe Lys Leu Gly Gly Gly

660 665 670

Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Ser Tyr Val Arg Met Val Glu Val Pro

675 680 685

Glu Thr Ile Ser Thr Arg Val Thr Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp

690 695 700

Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Asp

705 710 715 720

Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln Arg Arg Asn Gln Leu His

725 730 735

Ala Leu Lys Phe Tyr Asp Ile Asp Arg Val Val Lys Val Asp His Asn

740 745 750

Val Val Leu Leu Arg Gly Ile Ala Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly Asp

755 760 765

Val Gly Ala Ala Val Gly Lys Val Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val

770 775 780

Ile Ser Ala Val Gly Gly Met Val Ser Phe Leu Ser Asn Pro Phe Gly

785 790 795 800

Ala Leu Ala Ile Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Phe

805 810 815

Leu Ala Tyr Arg His Ile Ser Arg Leu Arg Arg Asn Pro Met Lys Ala

820 825 830

Leu Tyr Pro Val Thr Thr Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Val Glu Glu

835 840 845

Asp Asp Val Asp Glu Ala Lys Leu Asp Gln Ala Arg Asp Met Ile Arg

850 855 860

Tyr Met Ser Ile Val Ser Ala Leu Glu Gln Gln Glu His Lys Ala Arg

865 870 875 880

Lys Lys Asn Ser Gly Pro Ala Leu Leu Ala Ser Arg Val Gly Ala Met

885 890 895

Ala Thr Arg Arg Arg His Tyr Gln Arg Leu Glu Asn Glu Asp Pro Asp

900 905 910

Ala Pro Pro Pro Ser Pro Ser Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu

915 920 925

Val Ala Arg Thr Thr Leu Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro

930 935 940

Thr Phe Pro Pro Pro Ala Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr

945 950 955 960

Leu Thr Thr Val Pro Ser Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His

965 970 975

Thr Arg Pro Leu Glu Asp Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp

980 985 990

Pro Gln Val Asp Arg Leu Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro

995 1000 1005

Thr Tyr Arg Ala His Val Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys

1010 1015 1020

Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg

1025 1030 1035

Gln Ile Phe Gly Arg Cys Arg Arg Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp

1040 1045 1050

Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro Thr Glu Asp Glu Leu Gly

1055 1060 1065

Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn Glu Gly Gln Tyr Arg

1070 1075 1080

Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu Thr Asp Phe Met

1085 1090 1095

Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala Arg Val Asp

1100 1105 1110

Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp Asp Ser

1115 1120 1125

Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe Tyr

1130 1135 1140

Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys

1145 1150 1155

Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Pro Tyr

1160 1165 1170

Ala Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg

1175 1180 1185

Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro

1190 1195 1200

Ala Thr Pro Ala Pro Pro Gly Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg

1205 1210 1215

Asp His Ala Ala Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro

1220 1225 1230

Glu Thr Pro His Arg Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser

1235 1240 1245

Gly Trp Pro Gln Pro Ala Glu Pro Phe Pro Pro Arg Thr Thr Ala

1250 1255 1260

Ala Pro Gly Val Ser Arg His Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly

1265 1270 1275

Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe

1280 1285 1290

Phe Arg Leu Arg Gly Ala Lys Gly Tyr Arg Leu Leu Gly Gly Pro

1295 1300 1305

Ala Asp Ala Asp Glu Leu Lys Ala Gln Pro Gly Pro

1310 1315 1320

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病毒的融合蛋白，其特征在于，包括gB区段和gD区段；

所述gB区段由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，所述gD区段由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述gB区段和所述gD区段的排列顺序为gB-gD，通过Linker连接；

所述Linker具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为HEK293-F细胞表达系统表达的蛋白。

4.权利要求1-3任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，在哺乳动物表达系统中，表达编码所述融合蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在HEK 293-F细胞表达系统中表达编码所述融合蛋白的基因。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，提供包含编码所述融合蛋白的基因的表达载体，将所述表达载体导入HEK 293-F细胞中，然后对HEK 293-F细胞进行筛选，得到稳定表达所述融合蛋白的HEK 293-F细胞株，所述HEK 293-F细胞株表达得到所述融合蛋白；

优选地，所述筛选包括加压筛选和单克隆筛选。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，使用遗传霉素筛选系统筛选表达所述融合蛋白的HEK 293-F细胞；

优选地，所述遗传霉素筛选系统中使用的表达载体为pcDNA3.1、pEE6.4、pEE12.4或pGL4.13，优选为pcDNA3.1。

8.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白或权利要求4-7任一项所述的制备方法制备得到的融合蛋白在如下A)-D)中的至少一种的应用：

A)制备猪伪狂犬病毒疫苗；

B)制备猪伪狂犬病毒的抗体；

C)制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒；

D)制备猪伪狂犬病毒诊断抗原。

9.一种包含权利要求1-3任一项所述猪伪狂犬病毒的融合蛋白的猪伪狂犬病毒疫苗。

10.根据权利要求9所述的猪伪狂犬病毒疫苗，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒疫苗中融合蛋白的用量为70-90μg/头份；

优选地，所述疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；

优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、卡波姆、蜂胶、MF59佐剂或ISA201，优选使用ISA201。