JP2627755B2 - アシルノイラミネートシチジルトランスフェラーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、エシェリヒア属に属するアシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ（Acylneuraminatec
ytidylyltransferase）生産菌由来のアシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を含む染色体
DNA（以下、染色体DNAと略称する）断片を組込んでなる
新しい組換え体プラスミド、該プラスミドを導入して形
質転換した微生物、及び該微生物を用いたアシルノイラ
ミネートシチジリルトランスフェラーゼを製造する方法
に関する。

アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
［EC2.7.7.43］はシチジントリホスフェートとシアル酸
からシチジンモノホスホシアル酸を合成する酵素であ
り、シチジンモノホスホシアル酸、なかんずくシチジン
モノホスホＮ−アセチルノイラミン酸は、中枢神経及び
末梢神経系における神経刺激の障害、及び癌等の治療に
有用である。

（従来の技術） アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
は、ウシ、ブタの顎下腺、その他の動物組織、あるいは
髄膜炎菌（Neisseria menigitidis）、大腸菌（Escher
ichia coli）等の微生物の一部に存在することが知ら
れている。

（発明が解決しようとする問題点） アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
を動物組織から調製するにあたっては、該酵素の失活を
免れるために、屠殺後速やかに該組織を摘出し、酵素を
抽出する必要があること、また、原料の動物組織を確保
しなければならないという規模的な難点があり、大量調
製が難しい。

他方、前記の微生物から調製する場合は微生物の大量
培養は可能であるが、微生物菌体中のアシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ含量は極めて低いも
のであり、該菌体中にシチジントリホスフェート分解酵
素が含まれているため、シチジンモノホスホシアル酸の
合成に使用するに際しては、その収量を上げるためには
アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼを
イオン交換クロマトグラフィー等で高度に精製して該分
解酵素を除去した後、使用する必要がある等の難点を有
している。

このような煩雑な精製操作をしなくても、アシルノイ
ラミネートシチジリルトランスフェラーゼ生産能が高い
微生物によるアシルノイラミネートシチジリルトランス
フェラーゼの製造法、即ちシチジンモノホスホシアル酸
合成収率の高い該酵素の製造法の開発が望まれている。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、かかる欠点を解決するために種々検討
した結果、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明はエシェリヒア属に属するアシルノイラ
ミネートシチジリルトランスフェラーゼ生産菌由来の染
色体DNA断片を抽出し、これをプラスミドに組込んで組
換え体プラスミドを作成し、この組換え体プラスミドを
エシェリヒア属に属する微生物に導入することによって
形質転換させた微生物を取得し、この形質転換微生物を
栄養培地に培養することによって培養物中にアシルノイ
ラミネートシチジリルトランスフェラーゼを著量蓄積さ
せるものである。

以下、本発明を詳述する。

エシェリヒア属に属するアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼ生産菌、例えばアシルノイラミ
ネートシチジリルトランスフェラーゼ活性を有する大腸
菌等から染色体DNAを単離する方法は常法に従って、例
えばBiochimica et Biophysica Acta Vol.72,pp619
−629（1963）記載のフェノール法により行うことがで
きる。

染色体DNAのプラスミドへの組込みは常法に従って、
例えば染色体DAN及びプラスミドを制限酵素でそれぞれ
切断してDAN断片を調製した後、両DNA断片を混合し、DN
Aリガーゼで処理することによって行うことができる。

ここでベクターDNAとして用いられるプラスミドとし
ては、適当な選択マーカーを有し、多コピーのものが好
適で、例えば、pBR322,pUC18,ラムダファージ等が挙げ
られる。

また、制限酵素としては、例えばBamH I,EcoR I,Hind
III,Pst I,Sal I等が例示されるが、Hind IIIが好適に
用いられる。また、DNAリガーゼとしては例えばT4ファ
ージ由来のT4−DNAリガーゼが好適に用いられる。

次いで、上記方法で得られた組換え体プラスミドは常
法、例えばMolecular Cloning,A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory pp250−253（19
82）に記載の塩化カルシウム処理法や塩化カルシウム−
塩化ルビジウム処理法等により、宿主菌細胞となるエシ
ェリヒア属に属する微生物菌体内、例えば大腸菌内に導
入する。

所望の組換え体プラスミド（即ち、アシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼの遺伝情報を担う染
色体DNA断片を組み込んだプラムミド）を含有する菌株
は、菌体をトルエン処理し、その懸濁液を酵素試料とし
て常法、例えばMethods in Enzymology Vol.8,pp208
−210（1966）に記載の方法でアッセイすることによ
り、選択し、取得することができる。

かくして得られた組換え体プラスミドを含有する微生
物としては、例えばエシェリヒア・コリKJ537（微工研
菌寄第9682号）が挙げられる。

上記の如くして取得した本発明の微生物は、培養すれ
ば培養物中に著量のアシルノイラミネートシチジリルト
ランスフェラーゼを蓄積する。

本発明の微生物の培養に用いられる培地としては、炭
素源、窒素源、無機塩等を含む天然培地または合成培地
のいずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコ
ース、フラクトース、シュークロース等、また窒素源と
しては、例えば塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム等の無機態窒素の他、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス等の有機態窒素を使用できる。また、
無機塩としては、例えば塩化マグネシウム、塩化マンガ
ン等の添加が効果的である。用いる炭素源の濃度は0.05
−5WT％，好適には0.5WT％，窒素源の濃度は0.05−5WT
％，好適には0.5WT％，また、無機塩は0.005WT％程度添
加するのが好ましい。

培養は振とう培養、あるいは通気攪拌培養等の好気条
件下に行われ、培養温度は20−42℃，好適には37℃、ま
た、培養pHは６−８、好適には７が好ましく、培養時間
は通常12−48時間で完了する。

次に、上記培養液から遠心分離等の方法で培養した菌
体を集め、更に、この菌体からアシルノイラミネートシ
チジリルトランスフェラーゼを抽出する場合は、超音波
処理、フレンチプレス処理、凍結融解処理等によって細
胞を破砕し、該酵素を抽出する。更に、この菌体破砕抽
出液から、アシルノイラミネートシチジリルトランスフ
ェラーゼを精製する場合は硫安塩析法、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過法等の常法により、精製酵素
を得ることができる。

シチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸等のシ
チジンモノホスホシアル酸の製造に際しては、遠心分離
等の方法で集めた上記の培養菌体を各種界面活性剤等で
処理し、その処理菌体を直接使用することによっても、
また上記の菌体破砕抽出液を何ら処理することなく使用
することによっても、シチジントリホスホフェートとシ
アル酸から高効率で生産することができる。

（実施例） 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

実施例１ （１）染色体DNAの調製 アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
活性を有する大腸菌、エシェリヒア・コリATCC13027をL
B−培地（トリプトン10g/L,酵母エキス5g/L,塩化ナトリ
ウム10g/L,pH7）200ml中、37℃で16時間振とう培養した
後、遠心分離により菌体を分離した。かくして得られた
1.2gの菌体（湿重量）より、フェノール法［Biochimica
et Biophysica Acta Vol.72,pp619−629（196
3）］で染色体DNAを抽出し、約1.6mgの染色体DNAを得
た。

（２）染色体DNA断片を組み込んだ組換え体プラスミド
の調製 （１）で得られた染色体DNA2μｇに、制限酵素Hind I
IIを37℃で２時間反応させて断片化し、フェノール処
理、次いでエーテル処理し、染色体DNA断片溶液を得
た。別にベクターとして使用するプラスミドpUC18 １
μｇをHind IIIで37℃、２時間処理し、更に、Ullrich
らの方法［Science Vol.196,pp1313−1319（1977）］
でアルカリホスファターゼ処理した後、フェノール処
理、次いでエーテル処理してHind III切断pUC18溶液を
得た。

かくして得たプラスミドpUC18断片溶液と前記の染色
体DNA断片溶液を混合し、T4−DNAリガーゼで10℃、16時
間処理し、組換え体プラスミドを調製した。

（３）組換え体プラスミドによる大腸菌の形質転換。

アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ
活性を有しない大腸菌、エシェリヒア・コリJM109をLB
−培地20mlで37℃,3時間振とう培養して得た菌体を30mM
塩化カルシウム溶液10mlに懸濁して、０℃、１時間保持
した。次いで、遠心分離により菌体を分離し、2mlの30m
M塩化カルシウム溶液に再懸濁した。この菌体の懸濁液
0.2mlに（２）で調製した組換え体プラスミド溶液を加
え、０℃で１時間保持した後、42℃で90秒間熱処理して
該プラスミドを該菌体の細胞内に取り込ませ形質転換さ
せた。次に、この形質転換させた菌体の懸濁液に1mlのL
B−培地を加えて37℃,1時間放置した後、アンピシリン5
0mg/L,5−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
チオガラクトピラノシド30mg/Lを添加したLB−培地の寒
天平板に塗布し、37℃で18時間培養した。

（４）アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラ
ーゼ生産能を有する形質転換体の分離。

（３）の寒天平板上に生じた白色コロニーを、2mlのL
B−培地で37℃、16時間振とう培養した後、遠心分離で
菌体を分離した。

この得られた菌体を0.5mlの蒸留水と５μｌのトルエ
ンを添加して懸濁し、この懸濁液0.35mlを用いてMethod
s in Enzymology Vol.8,pp208−210（1966）に記載
の方法により、アシルノイラミネートシチジリルトラン
スフェラーゼ活性の有無を判定した。かくして、アシル
ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ生産能を
有する形質転換体エシェリヒア・コリKJ537（微工研菌
寄第9682号）を取得した。

この形質転換体KJ537が保有する組換え体プラスミドp
KJC7のアガロースゲル電気泳動法により作製した制限酵
素切断地図は第１図に示すとうりであり、該プラスミド
には染色体DNA断片が１個組込まれていた。

実施例２ 実施例１で得られた形質転換体KJ537から実施例１と
同様にしてフェノール法によって組換え体プラスミドpK
JC7を抽出し、更に実施例１と同様にしてHind III処
理、次いでT4−DNAリガーゼ処理し、新たなる組換え体
プラスミドを得た。

この新たなる組換え体プラスミドでエシェリヒア・コ
リJM109を実施例１と同様にして形質転換することによ
って形質転換体エシェリヒア・コリKJ404（微工研菌寄
第9681号）を取得した。

この形質転換体KJ404が保有する組換え体プラスミドp
KJC77Rの実施例１と同様な方法により作製した制限酵素
切断地図は第２図に示すとうりであり、該プラスミドに
は染色体DNA断片が２個組込まれていた。

比較例１、２及び実施例３、４ 第１表記載の菌株、即ちエシェリヒア・コリATCC1302
7（従来技術としてのアシルノイラミネートシチジリル
トランスフェラーゼ活性を有する菌株）を比較例１、エ
シェリヒア・コリJM109（アシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼ活性を有せず、本発明の組換え
体プラスミドの宿主として用いた菌株）を比較例２、エ
シェリヒア・コリKJ537（実施例１で得られた本発明の
菌株）を実施例３、エシェリヒア・コリKJ404（実施例
で得られた本発明の菌株）を実施例４とし、それぞれ1.
6LのLB−培地に接種し、37℃で16時間振とう培養した。
培養終了後、それぞれ遠心分離にて菌体を分離し、40ml
の50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8）に再懸濁し、フレン
チプレスにかけた。次いでこれをそれぞれ遠心分離にか
けて菌体抽出液を分離し、同緩衝液を加えて全量を50ml
に調製した。

この調製した抽出液10μｌを用いてMethods in Enz
ymology Vol.8,pp208〜210（1966）に記載の方法によ
り、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラー
ゼ活性（１時間に１μmoleのシチジンモノホスホＮ−ア
セチルノイラミン酸を生成する酵素活性を１単位とす
る。以下、酵素活性単位と略す）をそれぞれ測定した。
前記1.6LをLB−培地の単位培養液当りに換算した結果を
まとめて第１表に示す。

これらの結果から明らかなように、本発明の菌株は単
位培養液当りのアシルノイラミネートシチジリルトラン
スフェラーゼ活性が従来の菌株（ATCC13027）の6.5倍
（KJ537）から20倍（KJ404）に達し、酵素生産を効率的
なものとした。

実施例５ 実施例２で得られたエシェリヒア・コリKJ404を1.6L
のLB−培地に接種し、37℃で16時間振とう培養した。こ
の培養液より遠心分離にて菌体を分離し、40mlの50mMト
リス−塩酸緩衝液（pH8）に懸濁した後、フレンチプレ
ス処理し、次いでこれを遠心分離にかけて菌体抽出液を
分離し、得られた菌体抽出液を同緩衝液を加えて50mlに
調製した。

次いで、この調製した抽出液に硫安を加え、硫安50％
飽和で沈澱する画分を採取した。この画分を10mMの塩化
マグネシウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）5
0mlに溶解し、同緩衝液5Lで24時間透析した。透析液を1
0mM塩化マグネシウムを含む1mMリン酸緩衝液（pH7.6）
で平衡化したヒドロキシルアパタイト（40ml,口径3cm）
に通塔し、10mM塩化マグネシウムを含む1mMリン酸緩衝
液（pH7.6）と10mM塩化マグネシウムを含む150mMリン酸
緩衝液（pH7.6）の濃度勾配液で溶出を行った。この溶
出液の活性画分（40ml）を集め、10mM塩化マグネシウム
を含む10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）5Lで24時間透析
した。次に、この透析液を10mM塩化マグネシウムを含む
10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したイオン
交換樹脂カラム（50ml,口径1.5cm、商品名DEAE−トヨパ
ール、東ソー（株）製）に通塔し、10mM塩化マグネシウ
ムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）と0.5M塩化
カリウムを含む同液の濃度勾配液で溶出を行った。この
溶出液の活性画分を集め、10mM塩化マグネシウムを含む
10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）5Lで24時間透析し
た。

透析液を凍結乾燥し、比活性36単位/mgのアシルノイ
ラミネートシチジリルトランスフェラーゼ粉末標品60mg
を得た。

参考例１ 以下に、本発明の形質転換微生物から調製したアシル
ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼを使用し
たシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸の製造
例を述べる。

実施例２で得られたエシェリヒア・コリKJ404を1.6L
のLB−培地に接種し、37℃で16時間振とう培養した。培
養終了後、遠心分離にて菌体を分離し、40mlの50mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH8）に再懸濁し、フレンチプレスに
かけた。これを遠心分離にかけて菌体抽出液を分離し、
得られた菌体抽出液に上記と同じ緩衝液を加えて50mlに
調製した。この調製した菌体抽出液を実施例３と同様に
して、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラ
ーゼ活性を測定した結果、280単位/mlであった。この50
mlに調製した菌体抽出液の内18ml（約5000単位）、Ｎ−
アセチルノイラミン酸1mmole,シチジントリホスフェー
ト1mmole,1Mトリス−塩酸緩衝液（pH9）400ml及び1M塩
化マグネシウム40mlを混合し、水を加えて全量を2000ml
とした。37℃で４時間反応後、イオン交換樹脂（炭酸
型、600ml、商品名ダウエックス１、ダウケミカル
（株）製）に通塔し、水洗後、０〜1M炭酸水素トリエチ
ルアンモニウムで連続的濃度勾配溶出を行った。シチジ
ンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸を含む画分を減
圧濃縮し、濃縮液に５倍量のエタノールを加えて沈澱を
採取した。真空乾燥により、HPLC純度93％のシチジンモ
ノホスホＮ−アセチルノイラミン酸アンモニウム塩の白
色粉末4.672gを得た。収率は72％であった。

比較参考例１ 以下に、エシェリヒア・コリATCC13027から調製した
アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼを
使用したシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸
の製造例を述べる。

エシェリヒア・コリATCC13027を12.8LのLB−培地に接
種し、37℃で16時間振とう培養した。培養終了後、遠心
分離にて菌体を集め、320mlの50mMトリス−塩酸緩衝液
（pH8）を再懸濁し、フレンチプレスにかけた。これを
遠心分離にかけて菌体抽出液を分離し、得られた菌体抽
出液を同緩衝液を加えて400mlに調製した。この調製し
た菌体抽出液のアシルノイラミネートシチジリルトラン
スフェラーゼ活性は実施例３と同様にして測定した結
果、14単位/mlであった。次に、この調製した菌体抽出
液360ml（約5000単位）、Ｎ−アセチルノイラミン酸1mm
ole、シチジントリホスフェート1mmole、1Mトリス−塩
酸緩衝液（pH9）400ml、1M塩化マグネシウム40mlを混合
し、水を加えて全量を2000mlとした。37℃で４時間反応
させ、以下参考例１と同様に処理することにより、HPLC
純度68％のシチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン
酸アンモニウム塩の白色粉末1.431gを得た。収率は22％
であった。本白色粉末には原料のシチジントリホスフェ
ートの分解産物であるシチジンモノホスフェートがなお
多量に混在するため、再精製のために、本粉末を10mlの
10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に溶解し、再度ダウ
エックス１に通塔し、炭酸水素トリエチルアンモニウム
の濃度勾配液で溶出した。シチジンモノホスホＮ−アセ
チルノイラミン酸画分をエタノール沈澱、次いで真空乾
燥し、HPLC純度88％のシチジンモノホスホＮ−アセチル
ノイラミン酸アンモニウム塩0.655gを得た。最終的な収
率は10％であった。

（発明の効果） エシェリヒア属に属するアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼ生産菌由来のアシルノイラミネ
ートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を含む染色体
DNA断片を組込んだ組換え体プラスミドを作成し、この
組換え体プラスミドでエシェリヒア属に属する微生物を
形質転換することにより、アシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼ活性が従来の該活性を有する微
生物よりも強い新規な微生物が得られる。

この形質転換した微生物を栄養培地に培養することに
よって培養物中に著量のアシルノイラミネートシチジリ
ルトランスフェラーゼを蓄積させることができる。

即ち、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェ
ラーゼの生産性を向上せしめることができる。

また、シチジンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸
等のシチジンモノホスホシアル酸の製造に際し、該微生
物中のアシルノイラミネートシチジリルトランスフェラ
ーゼ含量が多いため、即ちアシルノイラミネートシチジ
リルトランスフェラーゼ活性が強いため従来のように微
生物中の該酵素を精製しなくても、本発明の微生物を界
面活性剤処理等をしただけで、若しくは該酵素を上記微
生物より破砕抽出しただけで、精製しないで使用しても
シチジンモノホスホシアル酸を高収率に生産できる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ本発明の組換え体プラス
ミドpKJC7及びpKJC77Rのアガロースゲル電気泳動解析に
よる制限酵素切断地図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エシェリヒア属に属するアシルノイラミネ
   ートシチジリルトランスフェラーゼ生産菌由来のアシル
   ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を
   含む染色体DNA断片を組込んだことを特徴とする組換え
   体プラスミド。
2. 【請求項２】エシェリヒア属に属するアシルノイラミネ
   ートシチジリルトランスフェラーゼ生産菌由来のアシル
   ノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を
   含む染色体DNA断片を組込んでなる組換え体プラスミド
   を、エシェリヒア属に属する微生物に導入したことを特
   徴とする形質転換微生物。