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WO2003074716A2 - Verfahren zur herstellung von ungesättigten fettsäuren - Google Patents

Verfahren zur herstellung von ungesättigten fettsäuren Download PDF

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Publication number
WO2003074716A2
WO2003074716A2 PCT/EP2003/002011 EP0302011W WO03074716A2 WO 2003074716 A2 WO2003074716 A2 WO 2003074716A2 EP 0302011 W EP0302011 W EP 0302011W WO 03074716 A2 WO03074716 A2 WO 03074716A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
desaturase
fatty acid
plant
fatty acids
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2003/002011
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English (en)
French (fr)
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WO2003074716A3 (de
Inventor
Andreas Renz
Martijn Gipmans
Ivo Feussner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to AU2003208769A priority Critical patent/AU2003208769A1/en
Publication of WO2003074716A2 publication Critical patent/WO2003074716A2/de
Publication of WO2003074716A3 publication Critical patent/WO2003074716A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Definitions

  • the invention relates to processes for the production of unsaturated fatty acids, preferably conjugated polyunsaturated fatty acids such as conjugated linoleic acid (CLA) by transgenic expression of desaturases from insects of the order Lepidoptera.
  • CLA conjugated linoleic acid
  • According to the invention are also transgenic expression cassettes for the transgenic expression of desaturases from insects of the order Lepidoptera, and the transgenic organisms transformed with them.
  • Fatty acids and triglycerides have a large number of applications in the food industry, animal nutrition, cosmetics and pharmaceuticals.
  • Special ⁇ valuable and sought-after unsaturated fatty acids are the so-called conjugated unsaturated fatty acids.
  • Conjugated polyunsaturated fatty acids are rather rare compared to other polyunsaturated fatty acids.
  • conjugated fatty acids are conjugated linoleic acids (CLA; conjugated linoleic acid), ⁇ -parinaric acid (18: 4 octa-decatetraenoic acid), eleostearic acid (18: 3 octadecatrienoic acid), conjugated linolenic acids, di orphecolic acid and calendula acid (see Scheme 1).
  • CLA conjugated linoleic acids
  • ⁇ -parinaric acid 18: 4 octa-decatetraenoic acid
  • eleostearic acid 18: 3 octadecatrienoic acid
  • conjugated linolenic acids di orphecolic acid and calendula acid (see Scheme 1).
  • CLA is a collective term for positional and structural isomers of linoleic acid, which are characterized by a conjugated double bond system starting at carbon atom 8, 9, 10 or 11. Some examples are given in Scheme 2. Geometric isomers exist for each of these positional isomers, i.e. cis-cis, trans-cis, cis-trans, trans-trans.
  • the CLA isomers (9Z, IIE) -CLA and (10E, 12Z) -CLA are known as the biologically active isomers.
  • CLA is mainly found in foods of animal origin.
  • CLA CLA-associated antiartheriosclerotic. Effect of CLA has been demonstrated (Wilson et al. (2000) Nutr Res 20: 1795-1805). Investigations were carried out both with isomers and with mixtures of isomers.
  • CLA can be produced synthetically via alkaline isomerization of linoleic acid.
  • vegetable oils with a high content of linoleic acid are used, eg sunflower oil or safflower oil. Heating above 180 ° C under alkaline conditions catalyzes two reactions:
  • CLA oils contain a mixture of different CLA isomers as well as other saturated and unsaturated fatty acids. Due to the presence of these biologically inactive and unnatural isomers, complex cleaning of the biologically active isomers (9Z, 11E) CLA and (10E, 12Z) CLA is necessary or it must be shown that the mixture of isomers poses no risk to human or animal health out. So far it has not been possible to produce individual CLA isomers using alkaline isomerization in an economically relevant process. Fractional crystallization enables the isomers (9Z, 11E) -CLA and (10E, 12Z) -CLA to be enriched. However, it is not possible to produce high quality individual isomers in all of the processes mentioned. The reaction products are usually converted into methyl or ethyl esters in the processes mentioned, so that the natural form of the CLA, namely the free fatty acids or the triacylglyceride, is not present.
  • Biocatalysis of linoleic acid to CLA can overcome these disadvantages of chemical conversion.
  • Various rumen rumen microorganisms are able to convert linoleic acid to CLA in the process of biohydrogenation. This is done, among other things, by the enzymatic activity of a CLA isomerase.
  • free fatty acids have disadvantageous sensory properties and are for use in the food or animal feed sector essentially unsuitable. Subsequent conversion of the free fatty acids - for example glycerol or glycerides with lipase catalysis - is possible, but expensive.
  • CLA isomerases convert free linoleic acid to CLA (Cepler and Tove (1967) J Biochem Chem 242: 5686-5692).
  • CLA Clapler and Tove (1967) J Biochem Chem 242: 5686-56912.
  • linoleic acid predominantly exists in esterified form.
  • Lipids like triacylglycerides represent the storage form, thioesters like acyl-CoA the activated form of the fatty acid.
  • Fatty acids with tr ns double bonds are extremely rare. Fatty acids with double bonds are present in the trans position in the seed oil of some plants.
  • an E5 fatty acid has been detected in the seed oil of various Thalictrum species (Rankoff et al. (1971) J Amer Oil Chem Soc 48: 700-701).
  • E5 desaturase activity has been described in Aquilegia vulgaris (Longman et al. (2000) Biochem Soc Trans 28: 641-643).
  • no plants have been described which contain either trans-vaccenic acid (ell-octadecenoic acid) or ElO-octadecenoic acid.
  • fatty acid ACP esters are desaturated and preferably at position 9 by a soluble desaturase
  • membrane lipids especially phosphatidylcholines, are further desaturated at positions 6, 12 and 15 by membrane-bound desaturases.
  • conjugated fatty acids are produced by the activity of a conjugase (Crombie et al. (1984) J Chem Soc Chem Corr-mun 15: 953-955; Crombie et al. (1985) J Chem Soc Perkin Trans 1 : 2425-2434; Fritsche et al. (1999) FEBS Letters 462: 249-253; Cahoon et al. (2001) J Biol Chem 276: 2637-2643; Qiu et al. (2001) Plant Physiol 125: 847-855 ).
  • conjugated fatty acids such as calendulic acid, eleostearic acid or punicinic acid takes place via the desaturation of oleic acid to linoleic acid by a ⁇ 12 desaturase and a further desaturation, combined with a rearrangement of the Z9 or Z12 double bond to the conjugate fatty acid a specific conjugate-forming desaturase (conjugase).
  • conjugated fatty acids such as calendulic acid, eleostearic acid or punicinic acid takes place via the desaturation of oleic acid to linoleic acid by a ⁇ 12 desaturase and a further desaturation, combined with a rearrangement of the Z9 or Z12 double bond to the conjugate fatty acid a specific conjugate-forming desaturase (conjugase).
  • conjugated fatty acids such as calendulic acid, eleostearic acid or punicinic acid takes place via the desaturation of oleic acid to linoleic
  • Lepidoptera pheromone desaturases show a wide variety of substrate specificities and desaturation mechanisms (Roelofs and Wolf (1988) J Chem Ecol 14: 2019-2031; Roelofs (1995) Proc Nat Acad Sei USA 92: 44-49; Tillman et al. (1999 ) Insect Biochem 29: 481-514). These enzyme activities result in the production of unusual unsaturated fatty acid CoA derivatives of various chain lengths and with double bonds at different positions and with different configurations. These act as a starting material for the biosynthesis of pheromones. Liu et.
  • the task was therefore to provide new processes which lead to trigylcerides with a high content of unsaturated fatty acids, preferably conjugated polyunsaturated fatty acids such as CLA. This object is achieved by the present invention.
  • a first subject of the invention relates to processes for the production of trigylcerides comprising unsaturated fatty acids by transgenic expression of at least one fatty acid desaturase from insects of the order Lepidoptera.
  • the fatty acids in the cytosol are mainly present as CoA esters.
  • desaturation of acyl-CoA fatty acids is the main synthetic route for unsaturated fatty acids, whereas this mechanism is rather rare in plants (Cahoon EB et al. (2000) Plant Physiol. 124: 243-251).
  • the transgenic expression of desaturases from Lepidoptera leads to a desaturation of the saturated and. unsaturated fatty acid CoA ester leads.
  • both active CLA isomers are ultimately produced and incorporated into the storage lipids.
  • the process according to the invention has the particular advantage that CLA-containing triglycerides can be produced directly from organisms, preferably plants, with a high oil content, such as rape or sunflower.
  • a high oil content such as rape or sunflower.
  • eukaryotic enzymes from insects of the order Lepidoptera enables one good expression without the toxic effects often associated with prokaryotic proteins.
  • Fatty acid desaturases means enzymes which are capable of introducing a double bond into fatty acids or their derivatives, such as, for example, preferably fatty acid CoA esters. Cofactors such as NADPH, NADH or even oxygen may also be required. Desaturases are preferred which can use acyl-CoA fatty acids as substrates, the fatty acids of which have a chain length of 14, 16, 18 or 20 carbon atoms, preferably 18 carbon atoms.
  • fatty acid desaturases preferably includes those enzymes which are capable of generating a double bond at position C8, C9, CIO, ClI or C12 in fatty acids or their derivatives, such as, for example, preferably fatty acid CoA esters.
  • Desaturases which lead to targeted structural isomers, ie specifically to ice or trans double bonds, are also preferred. Specifically, this means that at least 60%, preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90%, most preferably at least 95% of the respective structural isomer is formed.
  • Desaturases which generate a double bond in fatty acids or their derivatives, such as preferably fatty acid CoA esters, as occurs in a CLA isomer are very particularly preferred.
  • Preferred essential property of a fatty acid desaturase from Lepidoptera means enzymes with at least one of the following properties:
  • Substrate specificity for fatty acids, fatty acid CoA esters or other fatty acid derivatives with a chain length of the fatty acid of 16 and / or 18 carbon atoms means the property of a fatty acid desaturase to convert substrates with the specified chain length faster than substrates with a different chain length.
  • the speed of rotation of the preferred substrate compared to the non-preferred substrates is increased by at least 50%, preferably at least 100%, very particularly preferably at least 200%, most preferably at least 500%. At least one property from i) or ii) is preferably given in each case.
  • Fatty acid desaturases include enzymes that can introduce an isolated double bond, but also conjugases that can generate a conjugated double bond system based on a double bond in a substrate.
  • the first double bond is preferably shifted.
  • conjugases which are preferred are preferred are preferred
  • these enzymes can be referred to as (ElO, Z12) conjugases.
  • These enzymes can also be considered as ElO desaturases.
  • the essential property of the very particularly preferred ElO desaturases is the introduction of a trans double bond in position C-10 of a fatty acid or a fatty acid CoA ester, the fatty acid having a chain length of 18 carbon atoms.
  • these enzymes can be referred to as (Z9, Eil) conjugases. These enzymes can also be considered as ell-desaturases.
  • the essential property of the very particularly preferred Ell desaturases is the introduction of a trans double bond in position C1 of a fatty acid or a fatty acid CoA ester, the fatty acid having a chain length of 18 carbon atoms.
  • ElO-, Eil-, Z10- and Zll-desaturases as well as ZU- (ElO, Z12) -conjugase, Eil- (ElO, Z12) -conjugase, Z10- (Z9, Eil) -conjugase and ElO- (Z9, express) conjugase with a substrate specificity for fatty acid or fatty acid derivatives such as fatty acid CoA esters with a fatty acid chain length of 18 carbon atoms.
  • the fatty acid desaturases preferably originate from a Lepidoptera family selected from the group consisting of Acrolepiidae, Agaristidae, Arctiidae, Bombycidae, Carposinidae, Cochylidae, Cossidae, Eriocraniidae, Gelechiidae, Geometridae, Gracillarii-, Lasocomidae, Lyialiidaidae, Lasialididaidae, Lasialampidaidae, Hepialidaidae, Hepialidaidae, Lasialidaidae, Lai triidae, Lyonetiidae, Nepticulidae, Noctuidae, Notodontidae, Nymphalidae, Oecophoridae, Papilionidae, Pieridae, Psychidae, Pterophoridae, Pyr
  • Ell desaturases or the nucleic acid sequences coding for them are preferably obtained from organisms of the species Diaphania hyelineata, Diaphania nitidalis, Leucinodes orbonalis, Ostrinia nubilalis, Sesamia grisescens, Brachmia macroscopa, Paraargyresthia japonica, Mhesictena edema flavidalis moza, Argyresthia chamaecypariae, Bradina sp., Dichrocrocis punctiferalis, Cryptoblabes gnidiella, Palpita unionalis, Sceliodes cordalis, Anisodes sp.
  • the ell desaturases or the nucleic acid sequences coding therefor are particularly preferably isolated from the pheromone glands of the aforementioned insects.
  • Examples include the ell-desaturase from the pheromone glands of the "light brown apple moth" (Epiphyas postvittana) (SEQ ID NO: 2), from Ostrinia nubilalis (SEQ ID NO: 4) and from Ostrinia furnicalis (SEQ ID NO: 6 ) to call.
  • the ell-desaturases from the organisms mentioned adopt the vegetable acyl-CoA fatty acid derivatives as a substrate.
  • ElO desaturases or the nucleic acid sequences coding for these are preferably obtained from organisms of the species Dichrocrocis chlorophanta, Dichrocrocis punctiferalis, Bombyx mandarina, Bombyx mori, Coloradia velda, Hemileuca eglanterina, Hemileuca electra electra, Hemileuca electra mojavens or Notarcha derogata isolated.
  • the ElO desaturases or the nucleic acid sequences coding therefor are particularly preferably isolated from the pheromone glands of the aforementioned insects.
  • E9-desaturases or the nucleic acid sequences coding for them are preferably obtained from organisms of the species Epiplema plaqifera, Phyllonorycter coryli, Phyllonorycter harrisella, Phyllonorycter sylvella, Gelechiinae, Bryotropha sp., Bryotropha terrella, Gelechia appherice, Oroxairasaporana, Exoxadema sula, Exoxadema sula, Exoxadema sula, Exoxadema sula, Exoxadema sula, Exoxadema sula, Exoxadema sula, Exoxadema s , Loxostege neobliteralis, Ostrinia nubilalis, Dioryctria clarioralis, Dioryctria merkeli,
  • E8 desaturases or the nucleic acid sequences coding for them are preferably obtained from organisms of the types Phyllonorycter saportella, Phyllonorycter sp. or Dichrocrocis punctiferalis isolated.
  • the E8 desaturases or the nucleic acid sequences coding therefor are particularly preferably isolated from the pheromone glands of the aforementioned insects.
  • Zll desaturases such as can be used advantageously for the production of Zll octadecenoic acid, have been described for Bombyx mori (Ando et al. (1988) Agric Biol Chem. 52: 473-478), Trichoplu- sia ni and Helicoverpa zea (Knipple et al. (1998) Proc Nat Acad Sei USA 95: 15287-15292).
  • Zll desaturases or the nucleic acid sequences coding for them can preferably be isolated from Manduca sexta, Diatraea grandiosella, Earias insulana, Earias vittella, Plutella xylostella, Bombyx mori or Diaphania nitidalis.
  • the desaturases from Helicoverpa zea (SEQ ID NO: 8), Trichoplusia ni (SEQ ID NO: 10) and Argyrotenia velutinana (SEQ ID NO: 12) may be mentioned as examples.
  • Zll desaturases or the nucleic acid sequences coding therefor are particularly preferably isolated from pheromone glands of the aforementioned insects.
  • Z10 desaturases or the nucleic acid sequences coding for them are preferred.
  • Organisms of the species Ctenopseustis filicis, Pseudexentera spoliana, Hemileuca eglanterina, Hemileuca electra electra, Hemileuca electra mojavensis, Hemileuca nutleti, Eurhodope advenella, Mamestra configurata or Dichrocis punctiferalisgen insulated, particularly preferably from the perniferous genes, especially preferred from the perniferous genes.
  • the desaturase from Planototrix octo may be mentioned as an example.
  • (ElO, Z12) conjugases or the nucleic acid sequences coding for them can advantageously be obtained from Bombyx mori, Phyllonorycter crataegella, Amorbia euneana, Notocelia incarnatana, Notocelia udmanniana, Bombyx mandarina, Coloradia velda, Hemileuca eglanterinaile, Hemileuca eglanterina, Hemile electra mojavensis, Hemileuca nuttalli, Notarcha derogata, Rondotia menciana, Amphion floridensis, Hyles gallii, Hyloicus pinastri, Manduca sexta, Sphinx drupiferarum, Earias insulana, Nola confusalis or Notarcha basipunctalis can be isolated.
  • the (ElO, Z12) conjugases or the nucleic acid sequences coding therefor are particularly preferably isolated from the
  • (Z9, Eil) conjugases or the nucleic acid sequences coding for them can advantageously be obtained from Diatraea saccharalis, Xyrosaris lichneuta, Dioryctria abietella, Steno a cecropia, Phalonidia manniana, Pelenophorus vilis, Dioryctria abietella; Dioryctria rubella, Myelopsis tetricella, Jodis lactearia, Scopula personata, Spodoptera descoinsi, Spodoptera eridania, Spodoptera latifascia, Spodoptera littoralis or Spodoptera litur can be isolated.
  • the (Z9, Eil) conjugases or the nucleic acid sequences coding therefor are particularly preferably isolated from the pheromone glands of the aforementioned insects.
  • Zll conjugases take the plant-based aeyl-CoA fatty acid derivatives as a substrate, and the combined expression of these two classes of desaturases from Lepidoptera in plants leads to the production of (10E, 12Z) -CLA, which is incorporated into the storage lipids.
  • .pal-mitelaidic acid (9E-hexadecenoic acid) is produced via trans-desaturation at position C-9 - for example by an E9 desaturase. This can then be carried out via the enzymatic. Elongase activity can be extended to trans-vaccenoic acid (Scheme 4).
  • ⁇ 9-desaturases can also catalyze the conversion of trans-vaccenic acid to the (Z9, Eil) -CLA isomer. In a particularly preferred embodiment, this conversion can be further increased by additional expression of a Z9 desaturase.
  • Cytosolic-active Z9 desaturases such as, for example, yeast Z9 desaturase, are preferred.
  • the production of the (Z9, Eil) -CLA isomer in plants is therefore possible through the expression of a trans-desaturase.
  • the particularly advantageous (9Z, 11E) -CLA isomer is formed under the influence of plant Z9 desaturases.
  • ⁇ l2 desaturases catalyzed In a particularly preferred embodiment, this conversion can be further increased by additional expression of a Z12 desaturase.
  • Corresponding (ElO, 12) conjugases from Lepidoptera can also be used. These convert, for example, Zll-octadecenoic acid (cis-vaccenoic acid), Ell-octadecenoic acid (trans-vaccenoic acid) or ZlO-octadecenoic acid into (ElO, Z12) -CLA.
  • stearic acid is first converted to ZU-octadecenoic acid under the action of a Zll-desaturase, as described above, to trans-vaccenoic acid or by a Z10-desaturase to ZlO-octadecenoic acid.
  • (Z9, EU) conjugases from Lepidoptera can also be advantageously combined with (Zll), (Z10) or (ElO) desaturases. Starting from stearic acid, these desaturases produce ZU-octadecenoic acid (cis-vaccenoic acid), ZlO-octadeceno acid or ElO-octadecenoic acid, which are then converted to (Z9, Eil) -CLA by a (Z9 / E11) conjugase.
  • the CLA fatty acids or their derivatives such as CoA fatty acid esters thus produced are stored in the membrane lipids and triacylglycerides.
  • the desirable enzyme activities could be localized in insects of the order Lepidoptera, especially in the insect species mentioned above.
  • the test systems provided in the context of this invention were used for this purpose (Examples 2, 3 and 4).
  • genes coding for these activities enzymes or the genes encoding these nucleic acid sequences can be used in the manner familiar to those skilled ⁇ isolated from the organisms, or derived by mutagenesis from corresponding known sequences.
  • Finding a protein sequence or a corresponding cDNA sequence for an enzymatic activity, functionality or phenotype is a classic task in biochemistry and molecular biology.
  • Various methods are known to the person skilled in the art how he can achieve this object. These methods are based, for example, on the test for determining the desaturase or conjugase activity provided in the context of this invention (see, inter alia, Example 3).
  • the specific activity of a desaturase / conjugase is determined by analyzing the fatty acid pattern, for example by gas chromatography as described in Examples 2, 3 or 4.
  • the expression cloning method can be used as an example. This method has been used in many cases to isolate the gene responsible for this or the corresponding cDNA on the basis of a certain enzymatic activity, a certain functionality or a certain phenotype (Dalboge H (1997) FEMS Microbiology Reviews 21 (1): 29 -42, Simonsen H and Lodish HF (1994) Trends Pharma- col Sei 15 (12) .437-441). The classic method of expression cloning has been widely described, for example for membrane proteins, secreted factors and transmembrane channels (Masu Y et al. (1987) Nature 329 (6142): 836-838; Wong GG et al.
  • an expression library can be prepared starting from an organism, cells or tissue which are capable of producing a desaturase or conjugase activity.
  • mRNA or preferably poly (A) mRNA is first isolated from said organism, cells or tissue and cDNA is prepared on the basis thereof (Gubler U, Hoffman BJ (1983) Gene 25: 263-269).
  • Various systems for mRNA or poly (A) mRNA isolation are known to the person skilled in the art and are commercially available.
  • the synthesis can be carried out using the "Quick Prep Micro mRNA Purification Kit" (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the first strand cDNA synthesis is preferably carried out with an oligo (dT) primer using a reverse transcriptase (Borson ND et al. (1992) PCR Methods Appl 2: 144-148; Chenchik A et al. (1994) CLONTECHniques 9 ( 1): 9-12).
  • Various systems are known and commercially available which enable the generation of full-length cDNAs.
  • Certain oligonucleotides and the method of long-distance PCR (“long-distance PCR”) are used here. The method is described in Example 4 ,
  • Adapters with single-strand overhangs can be ligated to the double-stranded cDNAs and cloned, for example, into an expression vector which has been cut with restriction enzymes and has compatible cohesive ends.
  • the cloning is preferably directed so that the reading direction is fixed. is placed and an optionally present promoter sense-RNA is generated starting from the cDNA insertion.
  • compatible Sfil (A) and Sfil (B) overhangs are used for directional cloning into a vector cut with Sfil (recognition sequence GGCCNNNN! GGCC).
  • each cDNA molecule is cloned into a vector molecule, so that ultimately a multiplicity of vectors differing in the integrated cDNA, based on the same basic vector, are present, which form the expression library.
  • This expression library also contains vectors which can express a desaturase or conjugase transgene.
  • all expression vectors are suitable which are capable of transgenically expressing desaturases or conjugases in an active form in a transformed organism. Examples include the lambda TriplEX2 vector (after Excision pTriplEX2 vector; manufacturer Clontech) for transgenic expression in E. coli, or the vector pYES2 (manufacturer: Invitrogen) for transgenic expression in the yeast S.cerevisiae (see Example 4).
  • a subtractive expression library Here one compares the cDNAs of an organism, cells or tissue which has a desaturase or conjugase with the cDNAs of an organism, cells or tissue which does not have this activity and is of the same genus and type if possible.
  • Methods are known to the person skilled in the art how to specifically isolate the cDNAs which are only expressed in the biological material with the desaturase or conjugase activity. Appropriate methods and systems have been described and are commercially available.
  • Examples include the "PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit” (manufacturer: Clontech) or “Subtractor TM Kit” (manufacturer: Invitrogen), which enables up to 1000-fold enrichment of rare and / or selectively expressed cDNAs.
  • PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit manufactured by Clontech
  • Subtractor TM Kit manufactured by Invitrogen
  • all of the cDNAs present in both biological materials are removed (Chu ZL et al. (1997) Proc Nat Acad Sei USA 94: 10057-10062; Hudson C et al. (1997) Cell 91: 397 -405; Mueller CGF et al. (1997) J Exp Med 186: 655-663; von Stein OD et al.
  • transgenic expression of the cDNAs contained in the expression library can be realized, for example, in prokaryotic or eukaryotic cells, which are then subjected to a test for the desaturase or conjugase protein, for example a test for a desaturase or conjugase activity.
  • the expression library is preferably transformed into an organism.
  • Individual cells of the said organism are preferably transformed in such a way that each cell or each organism regenerated from this cell is only transformed with one type of vector molecule.
  • all organisms or cells derived from them are suitable for the transformation which are capable of transgenically expressing an active desaturase or conjugase. These can be prokaryotic and eukaryotic organisms. Preferred are all plants, cells derived from them, but also other photosynthetic organisms, such as algae.
  • eukaryotic organisms very particularly preferred are eukaryotic organisms which are able to synthesize fatty acids or aeyl-CoA fatty acids.
  • the expression vectors used for transformation preferably carry a selection marker, for example an antibiotic resistance or an amino acid synthesis gene for selection for amino acid deficiency, one select successfully transformier- 'allows ter cells. Further methods of selection are described further below.
  • the expression cloning can be carried out in yeast.
  • yeast expression system from Invitrogen based on the vector pYES2 can be used for this purpose.
  • pYES2 is a "high-copy" episomal vector for the inducible expression of recombinant proteins in S. cerevisiae.
  • Transformed yeast strains are selected on the basis of uracil deficiency (pYES2 carries the ura3 gene).
  • Further preferred expression vectors and transfection methods for the production of the transformed organisms correspond to the methods generally used for the production of transgenic organisms.
  • the desaturase activity can be demonstrated by cultivating a transformed organism or cells derived from it, digesting in a suitable buffer or solvent, digesting with fatty acids or aeyl-CoA fatty acids and optionally with a co-factor such as NADH or Brings NADPH or oxygen into contact and detects the resulting dehydrated fatty acid or Aeyl-CoA fatty acids.
  • the fatty acids or aeyl-CoA fatty acids can preferably originate from the transformed organism itself if the organism or the cell derived from it are able to synthesize fatty acids or aeyl-CoA fatty acids themselves. Otherwise, fatty acids or Aeyl-CoA fatty acids can also be added.
  • the detection of the fatty acid or aeyl-CoA fatty acid modified by the deaturase or conjugase can, if appropriate after extraction from the incubation mixture, for example with a solvent such as ethyl acetate, be carried out using conventional methods known to the person skilled in the art. Separation methods such as high pressure liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), thin-layer chromatography (DC) and detection methods such as mass spectroscopy (MS or MALDI), UV spectroscopy or auto-radiography can be used. Detection is preferably carried out by gas chromatography as described in Examples 3, 4 or 5.
  • the isolation of the transformed organisms or cells derived from them, which are able to transgenically express a desaturase or conjugase can be done, for example, by dividing the total number of cells into subgroups, cultivating these subgroups separately, if necessary, and isolating the desaturase. or conjugase activity of the individual subgroups.
  • the subgroup in which a cell type is present which transgenically expresses a desaturase or conjugase protein in a functionally active form has an increased desaturase or conjugase activity. This subgroup is further divided and the process is repeated until a monoclonal culture is obtained, ie a culture which contains only a vector with a specific cDNA coding for a desaturase or conjugase.
  • the vector which contains the nucleic acid coding for the desaturase or conjugase can be recovered from the transformed organism or cell. This can be seen, for example, by means of polymerase chain reaction (PCR). OHgonucleotide primers which are complementary to vector sequences flanking the desaturase or conjugase cDNA insert are used for this purpose. Knowledge of the desaturase or conjugase nucleic acid sequence is not necessary for this. Alternatively, if the vector is not integrated into the host's genome, it can be recovered from the cells, transformed into E. coli, propagated and sequenced to. to obtain the DNA encoding the desaturase '.or conjugase nucleic acid sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the desaturase or conjugase nucleic acid sequence can also be isolated from the vector, the desaturase or conjugase nucleic acid sequence according to above-described procedure without knowledge of its sequence using PCR result in isolation '.
  • additional linkers can be added to the amplicon, which enable directional cloning.
  • the cloning can also be carried out by means of a "blunt-end" ligation or T-overhang ligation in a manner familiar to the person skilled in the art.
  • the cDNA of desaturase or conjugase selectively amplified by means of PCR can thus be cloned directly into a vector which is suitable for producing a transgenic organism expressing a desaturase or conjugase, even without prior sequence elucidation.
  • This cloning can be carried out, for example, as a "blunt end” cloning using techniques familiar to the person skilled in the art. Common recombination and cloning techniques
  • the expression cloning described above can particularly preferably be carried out in the yeast Saccharomyces cerevisiae. This can include systems are used, in which the transgene be integrated to "expressing cDNAs by homologous recombination in a generated integration platform (Lagarde D et al (2000) Applied and Environmental Microbiology 66 (1):. 64-72).
  • the expression cloning can also be carried out in vitro using a non-amplified expression library as described above.
  • Corresponding systems have been described and are commercially available.
  • the “TNT TM Coupled Reticulocyte Lysate System” (Promega; Promega Notes Number 67, 1998, p. 02) may be mentioned as an example.
  • an oligo (dT) -primed cDNA library is constructed as described above and cloned into a high copy expression plasmid with a T3, T7 or SP6 promoter.
  • This plasmid library is then transformed into E. coli.
  • Approx. 50 to 100 independent transformants are cultivated on an agar plate with the appropriate selection antibiotic up to a colonial size of approx. 1 mm, collected and combined.
  • Plasmid DNA is isolated from some of these bacteria. This plamid DNA is transcribed and translated as a template directly in a reticolocyte system.
  • the nucleic acid coding for the desaturase or conjugase can be amplified from the vectors contained in this preparation by means of PCR and - if necessary without knowledge and analysis of the sequence - used as described above for the production of an organism expressing a desaturase or conjugase transgenically.
  • wheat germ extract can also be used for the combined transcription / translation (for example using the TNT TM Wheat Germ Extract System from Clontech).
  • the cDNAs can be cloned into a retroviral vector.
  • Retroviral expression vectors and expression systems are described (Kitamura T, International Journal of Hematology 1998, 67: 351-359) and are commercially available (for example from Clontech; New Retroviral & ClonCapture Expression Libraries; CLONTECHniques October 1998, XIII (4): 22-23).
  • the transfection is first carried out in a packaging cell line (for example EcoPack TM -293 or RetroPack TM PT67 Cell Line from Clontech). With the viruses generated in this way, the corresponding target cell line can be transfected and selected for the desired activity.
  • the inserts can then be obtained, for example, by PCR and analyzed. Furthermore, they can be cloned directly into a suitable expression vector, even without prior sequence analysis, as described above, which can then be used to produce a desaturase or conjugase transgenically expressing organism.
  • ElO or Ell desaturases can be obtained by changing known cis-desaturases via mutagenesis in such a way that they are specific for the desaturation in the trans position.
  • the following nucleic acid sequences coding for cis-desaturases can be subjected to mutagenesis as starting sequences:
  • Ell desaturases can also be modified by mutagenesis in such a way that longer-chain fatty acids can be converted better or at all. For example, this can be used as the starting sequence
  • c) a nucleic acid sequence coding for an ell desaturase from Ostrinia furnacalis with SEQ ID NO: 5. It is also conceivable to change the specificity for the position at which the double bond is introduced by the above-mentioned desaturases by mutagenesis.
  • Nucleic acid sequences coding for desaturases / conjugases for use in the method according to the invention can also be isolated from cDNA preparations - or banks of the corresponding above-mentioned Lepidoptera species - by means of a polymerase chain reaction using appropriate degenerate oligonucleotide primers.
  • the oligonucleotide-primer pair described by SEQ ID NO: 15 and 16 or that of the oligonucleotide-primer pair described by SEQ ID NO: 17 and 18 are preferably used.
  • a) contains in its sense strand a sequence motif described by SEQ ID NO: 15 or 17, or
  • b) contains a sequence motif described by SEQ ID NO: 16 or 18 in its antisense strand.
  • the protein sequence of the fatty acid desaturase from Lepidptera used in the process according to the invention is preferably characterized in that it has a homology of at least 65%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90 % of one of the fatty acid desaturases described by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 or 14 and - optionally and preferably - has at least one of the preferred essential properties of a desaturase or conjugase.
  • the proteins identified in this way can also include natural or artificial mutations of one of the abovementioned desaturase nucleic acid sequences and their homologues from other animal or plant genera and species. Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more nucleotide residues. Where insertions, deletions or substitutions, such as transitions and transversions, can be used, techniques known per se, such as in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used. Manipulations such as restriction, "chewing back” or filling in overhangs for "blunt ends” can provide complementary ends of the fragments for the ligation. Analogous results can also be obtained using the polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the nucleic acid sequence coding for the fatty acid desaturase from Lepidptera used in the method according to the invention is preferably characterized in that it has a homology of at least 65%, preferably at least 70%, particularly, preferably at least 80, very particularly preferably has at least 90% of one of the nucleic acid sequences described by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 or 13 and - optionally and preferably - codes for a protein which has at least one of the preferred essential properties of a desaturase or conjugase.
  • GAP World Health between two nucleic acids or polypeptides
  • Gap Weight 12 Length Weight: 4
  • the nucleic acid sequence coding for the fatty acid desaturase from Lepidptera used in the method according to the invention is preferably characterized in that, under standard conditions, it contains one of the above-mentioned nucleic acid sequences coding for desaturases, preferably with the sequence according to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 or 13 hybridized.
  • Standard hybridization conditions are to be understood broadly and mean stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, in Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C.
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can also be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • 0.1X SSC at 65 ° C
  • 0.1X SSC 0.5% SDS at 68 ° C
  • 0.1X SSC 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C
  • 0.2X SSC 0.1% SDS at 42 ° C
  • 2X SSC at 65 ° C (weakly stringent condition).
  • nucleic acid sequence means, for example, a genomic or a complementary DNA (cDNA) sequence or an RNA sequence and semisynthetic or fully synthetic analogues thereof. These sequences can be in linear or circular form, extrachromosomal or integrated into the genome.
  • the nucleotide sequences of the expression cassettes or nucleic acids according to the invention can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA constituents, and consist of different heterogeneous gene segments from different organisms.
  • artificial nucleic acid sequences are suitable as long as they have the have the desired essential property.
  • synthetic nucleotide sequences can be generated with codons which are preferred by plants to be transformed.
  • codons preferred by plants can be determined in the usual way on the basis of the codon usage from codons with the highest protein frequency. Coding nucleotide sequences which have been obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. In order to avoid undesired plant regulatory mechanisms, one can, for example, start from the amino acid sequence of a desaturase from Lepidoptera insects, taking back into account the plant codon usage, retranslate DNA fragments and use them to produce the complete exogenous desaturase sequence optimized for use in the plant.
  • nucleotide sequences can be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • various DNA fragments can be manipulated so that a nucleotide sequence with the correct reading direction and reading frame is obtained.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • transgene means all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods or their use, in which either
  • nucleic acid sequence coding for a desaturase a) the nucleic acid sequence coding for a desaturase,. or
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin or the presence in a genomic library.
  • the natural, genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, particularly preferably at least 1000 bp, very particularly preferably at least 5000 bp.
  • non-natural, synthetic methods such as, for example, mutagenization becomes.
  • Transgenic expression means the use of a transgenic expression cassette for the expression of a nucleic acid sequence.
  • the invention further relates to transgenic expression cassettes which contain a nucleic acid sequence coding for a desaturase, and to vectors comprising these expression cassettes.
  • a nucleic acid molecule coding for a desaturase is preferably functionally linked to at least one genetic control element (for example a promoter) which transgenic expression (transcription and / or translation) of said desaturase in an organism, preferably in plants , guaranteed.
  • a genetic control element for example a promoter
  • plant-specific genetic control elements for example promoters
  • desaturase can also be expressed in other organisms or in vitro. In this, all prokaryotic or eukaryotic genetic control elements (for example promoters) are preferred which allow expression in the organism chosen in each case for the production.
  • a functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of a promoter with the desaturase nucleic acid sequence to be expressed and, if appropriate, further regulatory elements such as a terminator such that each of the regulatory elements can perform its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as, for example, enhancer sequences, can also exert their function on the target sequence from positions which are further away or even from other DNA molecules. Arrangements are preferred in which the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind the sequence which acts as a promoter, so that the two sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • transgenic expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can preferably be integrated in a vector and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
  • transgenic expression cassette should also be understood to mean constructions in which the nucleic acid sequence coding for a desaturase type is placed behind an endogenous promoter such that the expression of the desaturase takes place under the control of the endogenous promoter.
  • the fusion of endogenous promoter and desaturase nucleotide resulting from the insertion Acid sequence is a transgenic expression cassette in the sense of the invention.
  • Plant-specific promoters basically means any promoter that can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants or plant parts, cells, tissues or cultures.
  • the expression can, for example, be constitutive, inducible or development-dependent. Preferred are:
  • “Constitutive” promoter means those promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a relatively long period of plant development, preferably at all times during plant development.
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is preferably used in particular. Particularly preferred is the promoter of the 35S transcript of the CaMV cauliflower mosaic virus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewaker et al. (1985) Virology 140 : 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221-228) or the 19S CaMV promoter (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al.
  • Another suitable constitutive promoter is the "Rubisco small subunit (SSU)" promoter (US 4,962,028), the LeguminB promoter (GenBank Acc. No. X03677), the promoter of nopaline synthase from Agrobacterium, the TR double promoter, the OCS (Octopin Synthase) promoter from Agrobacterium, the Ubi uitin promoter (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), the Ubiquitin 1 promoter (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86: 9692-9696), the Smas promoter, the cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter
  • promoters with specificities for the anthers ovaries, flowers, leaves, stems, roots and seeds. All specific promoters such as the promoter of the phaseoline (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), of the 2S albuming gene (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des Legu ins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326-331), the USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al.
  • HMWG high molecular weight glutenin
  • AG-Pase ADP glucose pyrophosphatase
  • promoters that allow seed-specific expression in monocots such as corn, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • the promoter of the lpt2 or lptl gene (WO 95/15389, WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 (promoters of the hordein gene, the glutelin gene, the oryzine gene, etc.) can be used advantageously Prolamin gene, glidine gene, glutelin gene, zein gene, kasirin gene or secalin gene).
  • Tuber-, storage root- or root-specific promoters such as the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato.
  • Leaf-specific promoters such as a promoter of the cytosolic FBPase from potato (WO 97/05900), the SSU promoter (s all subunit) from Rubisco (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase) or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2451).
  • Flower-specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593).
  • Anther-specific promoters such as the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the glob-1 promoter and the ⁇ -zein promoter.
  • 5126 promoter US 5,689,049, US 5,689,051
  • glob-1 promoter the glob-1 promoter
  • ⁇ -zein promoter the glob-1 promoter
  • Chemically inducible promoters such as the 5126 promoter (US 5,689,049, US 5,689,051), the glob-1 promoter and the ⁇ -zein promoter.
  • the transgenic expression cassettes can also contain a chemically inducible promoter (review article: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol
  • promoters e.g. the PRP1 promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), promoter induced by salicylic acid (WO 95/19443), a promoter induced by benzenesulfonamide (EP 0 388 186), one by Tetra - Cyclin-inducible promoter (Gatz et al.
  • promoters that are induced by biotic or abiotic stress such as the pathogen-inducible promoter of the PRPL gene (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato (US Pat. No. 5,187,267), the cold-inducible alpha-amylase promoter from the potato (WO 96/12814), the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter (EP375091).
  • pathogen-inducible promoter of the PRPL gene Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366
  • the heat-inducible hsp70 or hsp80 promoter from tomato US Pat. No. 5,187,267
  • the cold-inducible alpha-amylase promoter from the potato WO 96/12814
  • the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter EP375
  • Pathogen-inducible promoters include those of genes induced by pathogen attack such as genes from PR proteins, SAR proteins, ⁇ -1, 3-glucanase, chitinase, etc. (e.g. Redolfi et al. (198.3) Neth J Plant Pathol 89: 245-254; Uknes, et al. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol Biol 9: 335-342; Matton et al.
  • wound-inducible promoters such as that of the pinll gene (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat Biotech 14: 494-498), the wunl and wun2 genes (US 5,428,148), the winl and win2 genes (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215: 200-208), the systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), the WIPl gene (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73- 76), the MPI gene (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 (2): 141-150) and the like.
  • suitable promoters are, for example, fruit-ripening-specific promoters, such as, for example, the fruit-ripening-specific promoter made from tomato (WO 94/21794, EP 409 625).
  • Development-dependent promoters partly include the tissue-specific promoters, since the formation of individual tissues naturally development dependent.
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
  • all promoters described above can be used as plant promoters.
  • nucleic acid sequences contained in the transgenic expression cassettes or vectors according to the invention can be functionally linked to further genetic control sequences in addition to a promoter.
  • the concept of genetic control sequences. Zen is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of the transgenic expression cassette according to the invention. Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the inventive transgene expression cassette 5 includes-upstream of the respective transgenically ⁇ expressing the nucleic acid sequence the promoter with specificity for the embryonal epidermis and / or the flower and 3' downstream, sequence, a terminator sequence as additional genetic control, and, where appropriate, further customary regulatory Elements, in each case functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
  • Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties. Genetic control sequences, for example, allow tissue-specific express sion depending on certain stress factors. Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131 -17135) and heat stress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3 ): 246-53, 1989).
  • control sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or non-coding 3' regions of genes such as the actin-1 intron, or the Adhl-S introns 1, 2 and 6 (general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes.
  • the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus may be mentioned as an example of translation amplifiers (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) and the like. They can also promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
  • the transgenic expression cassette can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Also at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically before additional advantageous sequences may also be inserted, such as further regulatory elements' or terminators.
  • the nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Polyadenylation signals suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium turne faciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) or functional equivalents thereof.
  • Examples of loading particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator.
  • Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome.
  • Methods such as cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible removal of the transgenic expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B (1998) Methods. 14 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal using the cre recombinase.
  • a transgenic expression cassette and the vectors derived from it can contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, reproduction or function of the transgenic expression cassettes, vectors or organisms according to the invention. Examples include, but are not limited to:
  • Selection markers which are resistant to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc. lend. Particularly preferred selection markers are those which confer resistance to herbicides.
  • Examples include: DNA sequences that code for phosphinothricin acetyltransferases (PAT) and inactivate glutamine synthesis inhibitors (bar and pat gene), 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes (EPSP synthase genes) that are resistant to Glyphosat® (N - (phosphono ethyl) glycine), the gox gene (glyphosate oxidoreductase) coding for the glyphosate® degrading enzymes, the deh gene (coding for a dehalogenase which inactivates dalapon), sulfonylurea and imidazolinone inactivating acetolactate synthases and bxn genes encoding bromoxynil-degrading nitrilase enzymes, the aasa gene conferring resistance to the antibiotic apectinomycin, the streptomycin phosphotransferase (SPT) gene
  • Reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an assessment of the transformation efficiency or the expression site or time.
  • Reporter proteins Schoenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1).-29-44) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Sheen et al. ( 1995) Plant Journal 8 (5): 777-784;
  • E.coli example examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a selectable marker which gives the successfully recombined cells resistance to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglu - Cose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic.
  • the selection marker allows the selection of the transformed cells by untransforced (McCorick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • the transgenic expression cassette according to the invention can have the following structure:
  • the transgenic expression cassette according to the invention preferably has the following structure:
  • a co-transformation with more than one of the above-mentioned examples a) or b) can be advantageous.
  • the transformation with one or more vectors, each of which contains a combination of the above-mentioned transgenic expression cassettes can be advantageous.
  • transgenic expression cassette can contain a nucleic acid sequence whose transgenic expression leads to an increase in fatty acid biosynthesis (as a result of proOIL).
  • This additionally transgenically expressed proOIL nucleic acid sequence can be selected, for example but not restrictively, from nucleic acids coding for acetyl-CoA carboxylase (ACCase), glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT), lysophosphatidate acyltransferase (LPAT), diacyltransferase acyl (DAGAT) and phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (PDAT).
  • ACCase acetyl-CoA carboxylase
  • GPAT glycerol-3-phosphate acyltransferase
  • LPAT lysophosphatidate acyltransferase
  • DAAT diacyltransferase acyl
  • PDAT phospho
  • the proOIL nucleic acid sequences also include those nucleic acids whose transgenic expression produces an antisense-RNA or double-stranded RNA, which likewise increases the fatty acid production.
  • Preferred examples include vectors that contain the following transgenic expression cassettes:
  • Suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, Ml3mp series and pACYC184. Binary vectors which can replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable.
  • the desaturase according to the invention or proOIL nucleic acids or transgenic expression cassettes are preferably used in suitable
  • Transformation vectors inserted. Suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119 (1993). Examples and procedures for transformation are set out below.
  • Another object of the invention relates to transgenic organisms, transformed with at least one transgenic expression cassette according to the invention or a vector according to the invention, and cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots, etc. in plant organisms - or propagation material derived from such organisms.
  • Organism starting or host organisms are understood to mean procaryotic or eukaryotic organisms, such as, for example, microorganisms or plant organisms.
  • Preferred microorganisms are bacteria, yeast, algae or fungi.
  • Preferred bacteria are bacteria of the genus Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Clostrridium, Proionibacterium, Butyribibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Phaeodactylum, - Colpidium, Mortierella or Entomophinium, Entomophinium for example the genus Synechocystis.
  • microorganisms which are capable of infecting plants and thus of transmitting the constructs according to the invention.
  • Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from the species Agrobacterium tumefaciens.
  • Preferred yeasts are Candida, Saccharomyces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred fungi are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Phytophthora infestans or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) on page 15, Table 6 described mushrooms.
  • Plant organisms are particularly preferred as transgenic organisms.
  • Plant organism includes any organism that is capable of photosynthesis, as well as the cells, tissues, parts or reproductive material derived from it (such as seeds or fruits). Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Annual, perennial, monocotyledonous and dieotyledonous plants and gymnosperms are preferred. Included are mature plants, seeds, shoots and seedlings, as well as parts derived therefrom, propagation material (for example bulbs, seeds or fruits), plant organs, tissues, protoplasts, callus and other cultures, for example cell cultures. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant includes all annual and perennial, monocotyledonous and dicotyledonous plants and includes, by way of example but not by way of limitation, those of the genera Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linu, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura,
  • Preferred monocotyledonous plants are selected in particular from the monocotyledonous crop plants, such as, for example, the Gramineae family, such as alfalfa, rice, maize, wheat or other cereal such as barley, millet, rye, triticale or oats, as well as sugar cane and all types of grass.
  • the Gramineae family such as alfalfa, rice, maize, wheat or other cereal such as barley, millet, rye, triticale or oats, as well as sugar cane and all types of grass.
  • the invention is very particularly preferably applied from dicotyledonous plant organisms.
  • Preferred dicotyledonous plants are in particular selected from the dicotyledonous crop plants, such as, for example
  • Asteraceae such as sunflower, tagetes or calendula and others,
  • Compositae especially the genus Lactuca, especially the species sativa (salad) and others,
  • - Leguminosae especially the genus Glycine, especially the type max (soybean) soy, as well as alfalfa, peas, beans or peanuts and others
  • Rubiaceae preferably of the subclass Lamiidae such as, for example, Coffea arabica or Coffea liberica (coffee shrub) and others,
  • Solanaceae in particular the genus Lycopersicon, especially the species esculentum (tomato) and the genus Solanum, particularly the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant), as well as tobacco or peppers and others,
  • Sterculiaceae preferably the subclass Dilleniidae such as. for example Theobroma cacao (cocoa powder) and others,
  • Theaceae preferably of the subclass Dilleniidae, such as, for example, Camellia sinensis or Thea sinensis (tea bush) and others,
  • ornamental plants useful or ornamental trees, flowers, cut flowers, shrubs or lawn.
  • examples include, but are not limited to, angiosperms, bryophytes such as, for example, hepaticae (liverwort) and musci (mosses); Pteridophytes such as ferns, horsetail and lycopods; Gymnosperms such as conifers, cycads, ginkgo and gnetals, the families of rosaceae such as rose, ericaceae such as rhododendrons and azaleas, euphorbiaceae such as poinsettias and croton, caryophyllaceae such as cloves, solanaceae such as petunias, Gesneriaceae such as the Usamalsamineaeaid as the Usambaramineae , Iridaceae such as gladiolus, iris, freesia and crocus, composi
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as algae, cyanobacteria and mosses.
  • Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella. Synechocystis is particularly preferred.
  • plants which are suitable for oil production such as, for example, rapeseed, sunflower, sesame, safflower (Carthamus tinctorius), olive tree, soybean, peanut, castor oil, oil palm, corn, wheat, cocoa or various types of nuts such as walnut, coconut or Almond.
  • rapeseed sunflower, sesame, safflower (Carthamus tinctorius), olive tree, soybean, peanut, castor oil, oil palm, corn, wheat, cocoa or various types of nuts such as walnut, coconut or Almond.
  • Arabidopsis, cotton, flax, flax are also most preferred.
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as algae or cyanobacteria, and mosses.
  • Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella. Protozoa such as dinoflagellates are also preferred.
  • fungi such as Mortierella alpina, Pythium insidiosum or plants such as soybean, rapeseed, coconut, oil palm, safflower, castor bean, peanut, Cocoa bean or sunflower or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, soya, rape, sunflower or Saccharomyces cerevisiae are particularly preferred.
  • Microorganisms are usually in a liquid medium, which contains a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source mostly in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and possibly vitamins, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C attracted with oxygen.
  • the pH of the nutrient liquid can be kept at a fixed value, that is to say it can be regulated during cultivation or not.
  • the cultivation can be batch-wise, semi-batch wise or continuous. Nutrients may be 'the fermentation start submitted or semi-continuous or continuous fed ad.
  • transgenic expression cassette according to the invention into an organism or cells, tissues, organs, parts or seeds of the same (preferably in plants or plant cells, tissues, organs, parts or seeds) can advantageously be implemented using vectors, in which contain the transgenic expression cassettes.
  • the transgenic expression cassette can be introduced into the vector (for example a plasmid) via a suitable restriction site.
  • the resulting plasmid is first introduced into E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the recombinant plasmid is obtained using methods familiar to the person skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can be used to check the cloning step.
  • an expression cassette according to the invention into cells, preferably into plant cells, can advantageously be implemented using vectors.
  • Vectors can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or even agrobacteria.
  • the expression cassette is introduced by means of plasmid vectors.
  • Preferred vectors are those which enable stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • the production of a transformed organism (or a transformed cell or tissue) requires that the corresponding DNA, RNA or protein be introduced into the corresponding host cell. 5
  • transformation or transduction or transfection
  • the cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion.
  • the DNA can also be obtained by protoplast fusion with other DNA-containing ones
  • Electroporation is another suitable method for introducing DNA in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse. Appropriate methods have been described (for example in Bilang et al. (1991) Gene
  • the desaturases or conjugases can be used for the genetic engineering modification of a wide spectrum of organisms, preferably of plants, so that they become a de novo producer of one or more products derived from lipids, such as both CLA isomers. Plants are initially transformed
  • Cloning vectors and techniques for the genetic manipulation of ciliates and algae are known to the person skilled in the art (WO 98/01572; 40 Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1 (3) .239-251; Dunahay et al. (1995) J Phycol 31: 10004-1012).
  • Simple plasmids such as those of the pUC series, pBR322, M13mp series, pACYC184 etc. can be used. If complete plants are to be regenerated from the transformed cells, it is necessary that there is an additional selectable marker gene on the plasmid.
  • a transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. These strains contain a plasmid (Ti or Ri plasmid) which is transferred to the plant after agrobaterium infection. Part of this plasmid, called T-DNA (transferred DNA), is integrated into the genome of the plant cell. Alternatively, binary vectors (mini-Ti plasmids) can also be transferred to plants by Agrobacterium and integrated into their genome.
  • the Agrobacterium-mediated transformation is best suited for dieotyledone, diploid plant cells, whereas the direct transformation techniques are suitable for every cell type.
  • Agrobacterium-mediated transformation Methods for Agrobacterium-mediated transformation are described, for example, by Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f. If Agrobacteria are used, the expression cassette is to be integrated into special plasmids, either into an intermediate vector (English: shuttle or intermediate vector) or a binary vector. If a Ti or Ri plasmid is to be used for transformation, at least the right boundary, but mostly the right and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as the flanking region, is connected to the expression cassette to be introduced. Binary vectors are preferably used for the Agrobacterium transformation. Binary vectors can replicate in both E.coli and Agrobacterium.
  • Agrobacterium usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequences. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187).
  • the selection marker gene allows selection of transformed agrobacteria and is, for example, the nptll gene which confers resistance to kanamycin. Which in this case acting as a 'host organism Agrobacterium should already contain a plasmid with the vir region. This is necessary for the transfer of T-DNA to the plant cell. An Agrobacterium transformed in this way can be used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserda, Chapter V; An et al. ( 1985) EMBO J 4: 277-287).
  • Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711), pBinAR, pPZP200 or pPTV.
  • the agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as e.g. of rapeseed can be used, for example by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • agrobacteria The transformation of plants by agrobacteria is described (White FF, Vectors for Gene
  • transgenic plants can be regenerated in a known manner, which contain the above-described desaturase or conjugase according to the invention, pro-desaturase or conjugase or proOIL nucleic acids or transgenic expression cassettes or vectors.
  • Stably transformed cells ie those which contain the introduced DNA integrated into the DNA of the host cell, can be selected from untransformed ones if a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • a selectable marker As a marker, Each gene acts playfully that can confer resistance to antibiotics or herbicides (such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.) (see above).
  • Transformed cells that express such a marker gene are able to survive in the presence of concentrations of an appropriate antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild type. Examples are mentioned above and preferably comprise the bar gene which confers resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol
  • the selection marker allows the selection of transformed cells from untransformed (McCormick et al. (1986)
  • Plant Cell Reports 5: 81-84 The plants obtained can be grown and crossed in a conventional manner. Two or more generations should preferably be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
  • the mass of shoots and roots can be induced in a known manner.
  • the sprouts obtained can be planted out and grown. Appropriate methods are described (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed nucleic acids can be determined, for example, in vitro by sprout meristem propagation using one of the selection described above.
  • 35 methods can be determined.
  • a change in the type and level of expression of a desaturase or a proOIL nucleic acid sequence and its effect on the CLA and / or fatty acid biosynthesis performance on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • improved CLA production means, for example, the artificial
  • the CLA production in the transgenic organism is preferably increased by 10%, particularly preferably by 50%, very particularly preferably by 100%, compared to the non-genetically modified starting organism.
  • Improved can also mean an advantageously changed qualitative composition of the CLA mixture, ie an increased relative proportion of (9Z, 11E) -CLA and / or (10E, 12Z) -CLA compared to the starting organism.
  • transgenic organisms described above cell cultures, parts - such as roots, leaves, etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits.
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention described above and the cells, cell cultures, parts derived therefrom - such as roots, leaves etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits for the production of food or feed, cosmetics or fine chemicals, such as free fatty acids, especially CLA.
  • transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits for the production of food or feed, cosmetics or fine chemicals, such as free fatty acids, especially CLA.
  • Particularly preferred is the use for the production of CLA-containing lipids, preferably triglycerides.
  • Genetically modified plants according to the invention which can be consumed by humans and animals can also be used as food or feed, for example directly or after preparation known per se.
  • the lipids are usually obtained from the organisms.
  • the organisms can first be digested after harvesting or used directly.
  • the lipids are advantageously mixed with suitable solvents such as apolar solvents such as hexane or ethanol, isopropanol or mixtures such as hexane / isopropanol, phenol / chloroform / isoamyl alcohol at temperatures between 0 ° C to 80 ° C, preferably between 20 ° C * and 50 ° C extracted.
  • suitable solvents such as apolar solvents such as hexane or ethanol, isopropanol or mixtures such as hexane / isopropanol, phenol / chloroform / isoamyl alcohol at temperatures between 0 ° C to 80 ° C, preferably between 20 ° C * and 50 ° C extracted.
  • the biomass is usually extracted with an excess of solvent, for example an excess of solvent to biomass of 1: 4.
  • the solvent is then
  • the crude oil obtained in this way can then be further purified, for example in the turbidity by adding polar Ren solvents such as acetone or chloroform and subsequent filtration or centrifugation are removed. Further cleaning via columns is also possible.
  • polar Ren solvents such as acetone or chloroform
  • Another object of the invention are vegetable oils, fatty acid mixtures and / or triglyceride mixtures with an increased content of unsaturated fatty acids, preferably CLA, which were produced by the above-mentioned methods according to the invention, and their use for the production of foods, animal feed, cosmetics or pharmaceuticals. For this purpose, they are added to the food, animal feed, cosmetics or pharmaceuticals in the usual amounts.
  • unsaturated fatty acids preferably CLA
  • SEQ ID NO: 1 Nucleic acid sequence coding for an acyl-CoA ell-desaturase from Epiphyas postvittana.
  • SEQ ID NO: 2 Protein sequence coding for an acyl-CoA ell-desaturase from Epiphyas postvittana.
  • SEQ ID NO: 3 Nucleic acid sequence coding for an acyl-CoA 10 Z / EU desaturase from Ostrinia nubilalis.
  • SEQ ID NO: 4 Protein sequence coding for an acyl-CoA Z / Ell desaturase from Ostrinia nubilalis.
  • SEQ ID NO: 5 Nucleic acid sequence coding for an acyl-CoA Z / Ell desaturase from Ostrinia furnacalis.
  • SEQ ID NO: 6 Protein sequence coding for an acyl-CoA Z / Ell desaturase from Ostrinia furnacalis.
  • SEQ ID NO: 7 Nucleic acid sequence coding for an acyl-CoA ⁇ ll desaturase from Helicoverpa zea.
  • SEQ ID NO: 8 Protein sequence coding for an acyl-CoA ⁇ ll 25 desaturase from Helicoverpa zea.
  • SEQ ID NO: 9 Nucleic acid sequence coding for an acyl-CoA ⁇ ll desaturase from Trichoplusia ni.
  • SEQ ID NO: 10 Protein sequence coding for an acyl-CoA ⁇ ll desaturase from Trichoplusia ni.
  • SEQ ID NO: 11 Nucleic acid sequence coding for an acyl-CoA ⁇ ll desaturase from Argyrbtaenia velutinana.
  • SEQ ID NO: 12 Protein sequence coding for an acyl-CoA ⁇ ll desaturase from Argyrotaenia velutinana.
  • SEQ ID NO: 13 Nucleic acid sequence coding for an acyl-40 CoA Z10 desaturase from Planotortrix octo.
  • SEQ ID NO: 14 Protein sequence coding for an acyl-CoA Z10 desaturase from Planotortrix octo.
  • SEQ ID NO: 15 5 ⁇ -ATYACHGCCGGKKMYCAYMG-3 ⁇ 16.
  • SEQ ID NO: 16 5 -GGRAABDYGTGRTGGWAGTT-3 ⁇
  • SEQ ID NO: 18 5 x -CCCTCTAGARTGRRWARTTRTGRWA-3 '
  • SEQ ID NO: 19 5 '-TAATACGACTCACTATAG-3 ⁇
  • SEQ ID NO: 20 5 v -ACATAACTAATTACATGAT-3 v
  • cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of the bacteria and sequence analysis of recombinant DNA are carried out as in Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pp. 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from Licor (sales by MWG Biotech, Ebersbach) according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74: 5463-5467).
  • insects are kept in terrariums on suitable host plants.
  • the growth conditions are: 27 ° C, day-night rhythm: 14 h light, 10 hours dark.
  • Insects or larvae are transferred to fresh plants twice a week.
  • Dolls are collected and males and flocks are kept separately in terrariums until the finished insects hatch.
  • the pheromone glands can be isolated about 1 5 to 2 days after hatching.
  • Example 2 Isolation of desaturase or conjugase cDNAs using degenerate primer 10
  • RNA is isolated using, for example, TRIzol (GIBCO / BRL) according to the manufacturer's instructions.
  • TRIzol GEBCO / BRL
  • GIBCO TRIzol
  • approximately 60 to 15 80 ⁇ g of total RNA can be isolated from approximately 30 mg of fresh tissue.
  • About 5 ⁇ g of total RNA is used to produce a first strand cDNA with an oligo (dT) primer. This can be done, for example .
  • the SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH) can be used according to the manufacturer's instructions.
  • This single-strand cDNA serves as a template for a PCR in which the central region of the desaturase / conjugase cDNA is amplified.
  • Two degenerate primers are designed so that they can amplify the conserved central region of the desaturases / conjugases from Lepidoptera and are used in the following PCR protocol: 25
  • the degenerate primers with the 35 SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 are used as the primer pair for the amplification of the central desaturase region.
  • the PCR was carried out under the following cycle conditions:
  • the PCR product is ligated directly, for example, into the linearized TOPO TA PCR 2.1 Vector (INVITROGEN) and then transformed into E.coli TOP 10 competent cells (INVITROGEN). Positive Active colonies are amplified again, the plasmid DNA is purified (QIAGEN Plasmid Mini Kit) and then sequenced.
  • gene-specific primers can be derived and for the aplification of 5'- and
  • SMART RACE cDNA Amplification Kit CLONTECH
  • PCR products are also ligated into the TOPO TA PCR 2.1 Vector (INVITROGEN) and then transformed into TOP 10 competent cells (INVITROGEN). Positive colonies are amplified again and the plasmid DNA is purified (QIAGEN Plasmid Mini Kit) and then sequenced.
  • the complete sequence of a desaturase / conjugase can be assembled using standard cloning techniques and, for characterization, converted, for example, into the pYES2 vector (INVITROGEN) for yeast expression.
  • Saccharomyces INVScl (INVITROGEN) are transformed with the corresponding pYES2 expression vectors using a modified PEG / lithium acetate protocol (Ausubel et al. (1996) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York).
  • pYES2DESAT transformants pYES2DESATa-d
  • one pYES2 transformant are selected for further cultivation and functional expression.
  • Preculture 20 ml of CMdum liquid medium with 2% (w / v) raffinose were inoculated with the transgenic yeast clones (pYES2DESATa-d, pYES2) and grown for 3 T at 30 ° C., 200 rpm until an optical density of 600 nm (OD600) of 1.5-2 was reached.
  • pYES2DESATa-d the transgenic yeast clones
  • Fatty acid analysis The total fatty acids were extracted from yeast cultures and analyzed by gas chromatography. Cells from 5 ml culture were centrifuged (1000 x g,
  • the cell sediments are snap frozen in N2 liq. and lyophilized under N2 gas at 30 a C.
  • the pellet is homogenized in 1% sodium methoxide in methanol and incubated for 20 minutes at room temperature. 5 Then equal volumes of 1 M NaCl and n-heptane are added, mixed and the supernatant transferred to a GC tube.
  • the samples are separated on a DB Wax capillary column (30 m, 0.25 mm, 0.25 ⁇ m; Agilent J & W) in a Hewlett Packard 6890 gas chromatograph with a flame ionization detector.
  • DB Wax capillary column (30 m, 0.25 mm, 0.25 ⁇ m; Agilent J & W) in a Hewlett Packard 6890 gas chromatograph with a flame ionization detector.
  • the oven temperature was raised from 60 ° C (hold 5 min) to 200 ° C at a rate of 20 ° C / min (hold 20 min) and finally to 250 ° C (hold 30 min) at a rate of 20 ° C / min programmed.
  • Nitrogen was used as the carrier gas (1.6 ml / min).
  • the fatty acids were compared to the retention times of FAME standards (SIGMA)
  • fatty acids are preferably used as standard: c9-16: l, t9-16: l, 18: 0, c9-18: l, t9-18: l, cll-18: l, tll-18: l, c9 , cl2-18: 2, t9, tl2-18: 2, c9, tll-18: 2, tlO, cl2-18: 2.
  • c9-16 l, t9-16: l, 18: 0, c9-18: l, t9-18: l, cll-18: l, tll-18: l, c9 , cl2-18: 2, t9, tl2-18: 2, c9, tll-18: 2, tlO, cl2-18: 2.
  • Example 4 Expression cloning of desaturase / conjugase from 30 Lepidoptera in Saccharomyces cerevisiae
  • TRIzol GIBCO / BRL
  • GIBCO TRIzol
  • approximately 60 to 80 ⁇ g of total RNA can be isolated from approximately 30 mg of fresh tissue.
  • About 5 ⁇ g of total RNA is used to create a cDNA library.
  • the SMART cDNA Library Construction Kit (CLONTECH) can do this
  • the isolated double-stranded cDNA is finally ligated into the linearized pYES2 (INVITROGEN) yeast expression vector.
  • the multiple cloning site of the pTriplEx2 vector (CLONTECH) is first inserted in pYES2.
  • the double-stranded cDNA is then cloned into the vector modified in this way after digestion with SfilA and SfilB.
  • yeast transformation
  • plasmid DNA is transformed with the Saccharomyces cerevisiae EASY COMP transformation kit (INVITROGEN) into INVScl (INVITROGEN) according to the manufacturer's instructions.
  • Two 50 ⁇ l batches are plated on selection medium in a large square petri dish (245 ⁇ 245 mm) and incubated for 3 days at 30 ° C.
  • MTP microtiter plates
  • the preculture takes place in 200 ⁇ l medium [1 x CSM-Ura; 1 x YNB without amino acids and sugar; 0.5% raffinose; 5% glycerin; 40 mg / 1 adenine sulfate; 0.5% ammonium sulfate] for 72 hours at 30 ° C and 250 revolutions / minute.
  • a. OD600 set from 0.2 in the main culture.
  • the main culture takes place in 1 ml medium [1 x CSM-Ura; 1 x YNB without amino acids and sugar; 0.5% raffinose; 2% galactose; 0.2% Tergitol NP-40; 40 mg / 1 adenine sulfate; 0.5% ammonium sulfate; 0.3 mM fatty acid substrate] for 2 to 3 weeks at 16 ° C and 250 revolutions / minute until an OD600 of 3 to 4 is reached.
  • the yeast cells are sedimented (1000 xg, 10 min, 4 ° C) and stored at -80 ° C until further processing.
  • FES fatty acid methyl esters
  • the cell sediments are snap frozen in N2 liq. and lyophyllized under N2 gas at 30 e C.
  • the pellet is homogenized in 1% sodium methoxide in methanol and incubated for 20 minutes at room temperature. Then equal volumes of 1 M NaCl and n-heptane are added, mixed and the supernatant transferred to a GC tube.
  • the samples are separated on a DB Wax capillary column (30 m, 0.25 mm, 0.25 ⁇ m; Agilent J & W) in a Hewlett Packard 6890 gas chromatograph with a flame ionization detector.
  • the furnace temperature was (min- hold 5) to 200 ° C at a rate of 20 ° C / min (hold min 20) of 60 ° C and finally to 250 ° C (30 hold min) at a rate of '20 ° C / min programmed.
  • Nitrogen was used as the carrier gas (1.6 ml / min).
  • the fatty acids were identified by comparison with retention times of FAME standards (SIGMA). The same standards - as listed in Example 3 - are used.
  • the vector pBinAR is used to produce chimeric DNA constructs for the production of transgenic A.thaliana or B.napus plants which express the desaturases / conjugases from Lepidoptera (Höfgen and Willmitzer (1990) Plant Sei 66: 221- 230).
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • EMBO J 3 835-846
  • Wild-type Arabidopsis thaliana plants (Columbia) are transformed with the Agrabacterium tumefaciens strain (GV3101 [pMP90]) on the basis of a modified vacuum filtration method (Clough S and Bent A (1998) Plant J 16 (6): 735-43; Bechtold N et al . (1993) in: Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sei Pa- ris 1144 (2): 204-212). The Agrobacterium tumefaciens cells used had previously been transformed with the plasmids.
  • Seeds of the primary transformants are selected on the basis of antibiotic resistance.
  • Antibiotic-resistant seedlings are planted in soil and used as fully developed plants for biochemical analysis.
  • transgenic rapeseed plants are based on a protocol by Bade JB and Damm B (in Gene Transfer to Plants, Polypus I and Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in which also the composition of the 15 media and buffers used is indicated.
  • the transformations are carried out with the Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 [pMP90].
  • the plasmids pBinAR-TkTP / Vit E-AT are used for transformation. Brassica napus var. We-
  • An overnight culture of the Agrobacterium strain is set up at 29 ° C. in luria broth medium with kanamycin (20 mg / l), of which 2 ml in 50 ml of luria broth medium without kanamycin for 4 hours at 29 ° C. until an OD ⁇ oo of Incubated 0.4 to 0.5. After pelleting the culture at 2000 rpm for 25 min, the cell pellet is resuspended in 25 ml of basal medium. The concentration of the bacteria in the solution is adjusted to an OD ⁇ oo of 0.3 by adding further basal medium.
  • the callus induction medium is removed from the rape explants using sterile pipettes, 50 ml of Agrobacterium solution are added, 45 carefully mixed and incubated for 20 min.
  • the agrobacteria suspension is removed, the oilseed rape explants are washed for 1 min with 50 ml of callus induction medium and then 100 ml callus induction medium added.
  • the co-cultivation is carried out for 24 h on a rotary shaker at 100 rpm.
  • the co-cultivation is stopped by removing the callus induction medium and the explants are washed twice for 1 min with 25 ml and twice for 60 min with 100 ml washing medium at 100 rpm.
  • the washing medium with the explants is transferred to 15 cm petri dishes and the medium is removed with sterile pipettes.
  • the seeds of transgenic plants are homogenized directly in 1% sodium methoxide in methanol and incubated for 20 minutes at room temperature. Then equal volumes of 1 M NaCl and n-heptane are added, mixed and the supernatant is transferred to a GC tube. The samples are separated on a DB-Wax capillary column (30 m, 0.25 mm, 0.25 ⁇ m; Agilent J & W) in a Hewlett Pakard-6890 gas chromatograph with a flame ionization detector.
  • the oven temperature was raised from 60 ° C (hold 5 min) to 200 ° C at a rate of 20 ° C / min (hold 20 min) and finally to 250 ° C (hold 30 min) at a rate of 20 ° C / min programmed.
  • Nitrogen was used as the carrier gas (1.6 ml / min).
  • the fatty acids were identified by comparison with retention times of FAME standards (SIGMA). The same standards - as listed in Example 3 - are used.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von ungesättig­ten Fettsäuren, bevorzugt von konjugierten mehrfach-ungesättigten Fettsäuren wie konjugierter Linolsäure (CLA) durch transgenen Ex­pression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera. Erfindungsgemäss sind ferner transgene Expressionskassetten zur transgenen Expression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera, sowie die mit diesen transformierten transgene Orga­nismen.

Description

Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von ungesättig- ten Fettsäuren, bevorzugt von konjugierten mehrfach-ungesättigten Fettsäuren wie konjugierter Linolsäure (CLA) durch transgenen Expression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera. Erfindungsgemäß sind ferner transgene Expressionskassetten zur transgenen Expression von Desaturasen aus Insekten der Ordnung Lepidoptera, sowie die mit diesen transformierten transgene Organismen.
Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereic . Besonderes ■wertvolle und gesuchte ungesättigte Fettsäuren sind die sogenannten konjugierten ungesättigten Fettsäuren. Konjugierte mehrfach ungesättigte- Fettsäuren sind im Vergleich zu anderen mehrfach ungesättigte Fettsäuren eher selten. Beispiele für konjugierte Fettsäuren sind die konjugierten Linol- säuren (CLA; conjugated linoleic acid), α-Parinarsäure (18:4 Octa- decatetraensäure) , Eleostearinsäure (18:3 Octadecatriensäure) , die konjugierten Linolensäuren, Di orphecolsäure und Calendula- säure (siehe Schema 1) .
Schema 1: Konjugierte polyungesättigte Fettsäuren
Calendulasäure
α-Parinarsäure
Figure imgf000002_0001
α-Eleostearinsäure
Dimorphecolsäure
Figure imgf000002_0002
CLA ist ein Sammelbegriff für positionelle und strukturelle Isomere der Linolsäure, die sich durch ein konjugiertes Doppelbindungssystem beginnend am Kohlenstoffato 8, 9, 10 oder 11 auszeichnen. Einige Beispiele sind in Schema 2 angegeben. Geometrische Isomere existieren für jedes dieser positioneilen Isomere, also cis-cis, trans-cis, cis-trans, trans-trans .
Schema 2 : Vier Isomere der konjugierten Linolsäuren
Figure imgf000003_0001
Figure imgf000003_0002
Die CLA Isomere (9Z,llE)-CLA und (10E, 12Z) -CLA sind als die biologisch wirksamen .Isomere bekannt. CLA ist überwiegend in Lebensmitteln tierischen Ursprungs enthalten. V.a. im Fleisch und in Milchprodukten von Wiederkäuern sind hohe CLA-Konzentrationen enthalten: ca. 3 bis 4 mg CLA/g Fett in Rind- und Lammfleisch (Chin et al. (1992) J Food Comp Anal 5:185-197) sowie ca. 3 bis 7 mg CLA/g Fett in Milchprodukten (Dhi an et al. (1999) J Dairy Sei 82:2146-56), wobei (9Z, 11E) -CLA mit ca. 80 % jeweils das Hauptisomer ist. Höhere Pflanzen enthalten nur Spuren von CLA wobei beide biologisch aktive CLA-Isomeren bis jetzt nicht in Pflanzen gefunden worden sind.
Für CLA sind eine Reihe positiver Effekte nachgewiesen worden, so reduziert die Verabreichung von CLA das Körperfett in Mensch und Tier bzw. erhöht den Futterumsatz in Körpergewicht bei Tieren (Park et al. (1997) Lipids 32:853-858; Park et al . (1999) Lipids 34:235-241; WO 94/16690; WO 96/06605; WO 97/46230; WO 97/46118). Durch Gabe von CLA lassen sich auch beispielsweise Allergien (WO 97/32008) oder Krebs (Banni et al. (1999) Carcinogenesis 20: 1019-1024, Thompson et al. (1997) Cancer Res 57:5067-5072) posi- tiv beeinflussen. Auch eine antiartheriosklerotische. Wirkung von CLA ist belegt (Wilson et al . (2000) Nutr Res 20:1795-1805). Untersuchungen wurden sowohl mit Isomeren als auch mit Isomeren- gemischen durchgeführt .
CLA kann synthetisch über alkalische Isomerisierung von Linolsäure hergestellt werden. Großtechnisch werden hierzu v.a. pflanzliche Öle mit einem hohen Gehalt an Linolsäure verwendet, z.B. Sonnenblumenöl oder Distelöl . Erhitzen über 180°C unter alkalischen Bedingungen katalysiert zwei Reaktionen:
(1) die Fettsäure-Esterbindungen des Triglyceridgerüsts werden hydrolisiert und die freien Fettsäuren werden freigesetzt.
(2) unkonjugierte, ungesättigte Fettsäuren mit zwei oder mehr Doppelbindungen werden konjugiert.
Kommerziell erhältliche CLA-Öle enthalten eine Mischung verschiedener CLA Isomere sowie andere gesättigte und ungesättigte Fettsäuren. Durch die Gegenwart dieser biologisch inaktiven und unnatürlichen Isomere ist eine aufwendige Reinigung der biologisch aktiven Isomere (9Z,11E) CLA und (10E,12Z) CLA notwendig oder es muss gezeigt werden, dass von der Isomerenmischung keine Gefahr für die Gesundheit von Mensch und Tier ausgehen. Bisher ist es nicht möglich, über alkalische Isomerisierung in einem ökonomisch relevanten Verfahren einzelne CLA Isomere herzustellen. Durch fraktionierte Kristallisation ist es möglich, die Isomere (9Z,11E)-CLA bzw. (10E, 12Z) -CLA anzureichern. In allen genannten Verfahren ist es aber nicht möglich einzelne Isomere in hoher Qualität herzustellen. Die Reaktionsprodukte werden in den genannten Verfahren üblicherweise zu Methyl- oder Ethylestern umgesetzt, so dass nicht die natürliche Form des CLA, nämlich die freien Fettsäuren oder das Triacylglycerid vorliegen.
Durch Biokatalyse von Linolsäure zu CLA können diese Nachteile der chemischen Umwandlung überwunden werden. Verschiedene Mikroorganismen des Pansens von Wiederkäuern sind zum Beispiel in der Lage, beim Prozess der Biohydrogenierung Linolsäure zu CLA umzusetzen. Dies geschieht .unter anderem durch, die enzymatische Aktivität einer CLA-Isomerase. Diese Enzymaktivität wurde beschrieben in Butyrivibrio fibrisolvens (Kepler and Tovee (1966) J Biol Chem 241:1350), Propionibacterium acnes (Deng et al., Ist Internatio- nal Conference on CLA, 2001, Alesund, Norway) , Clostridium sporo- genes und Lactobacillus reuteri (WO 99/32604; WO 01/00846) . Die bisher beschriebenen CLA-Isomerasen verwenden freie Fettsäuren als Substrat. Die Gene kodierend für CLA-Isomerase aus Lactobacillus reuteri und Propionibacterium acnes wurden kloniert, und die Isomerase aus Propionibacterium konnte in heterologe Mikroorganismen funktional exprimiert werden. Die biologische Umsetzung von Linolsäure zu CLA durch Mikroorganismen hat zwar qualitative Vorteile gegenüber der alkalischen Isomerisierung, sie ist aber aufgrund der Fermentationskosten ökonomisch nachteilig und liefert lediglich freie Fettsäuren, aber keine Triglyceride .
Freie Fettsäuren haben jedoch nachteilige sensorische Eigenschaften und sind für den Einsatz im Lebens- oder Futtermittelbereich im wesentlichen ungeeignet. Eine nachfolgende Umsetzung der freien Fettsäuren - beispielsweise Glycerin oder Gylceriden unter Lipase-Katalyse - ist möglich, jedoch aufwendig.
Die Übertragung der auf bakteriellen CLA-Isomerasen basierenden Verfahren auf andere Organismen, ist nicht unbedingt möglich. Bisher konnte nachgewiesen werden, dass CLA-Isomerasen freie Linolsäure zu CLA umsetzen (Cepler and Tove (1967) J Biochem Chem 242:5686-5692). In höheren Organismen, wie beispielsweise Pflan- ' zen, liegt Linolsäure jedoch hauptsächlich in veresterter Form vor. Lipide wie Triacylglyceride stellen die Speicherform dar, Thioester wie Acyl-CoA die aktivierte Form der Fettsäure.
Fettsäuren mit tr ns-Doppelbindungen sind ausgesprochen selten. Im Samenöl einiger Pflanzen sind Fettsäuren mit Doppelbindungen in trans-Position vorhanden. So ist im Samenöl von verschiedene Thalictrum-Arten eine E5-Fettsäure detektiert worden (Rankoff et al. (1971) J Amer Oil Chem Soc 48:700-701). Außerdem ist in Aqui- legia vulgaris eine E5-Desaturase Aktivität beschrieben worden (Longman et al . (2000) Biochem Soc Trans 28:641-643). Es sind aber keine Pflanzen beschrieben worden die- entweder trans-Vaccen- säure (Ell-Octadecensäure) oder ElO-Octadecensäure enthalten.
Es ist bekannt das die Desaturierung von Fettsäuren in Pflanzen hauptsächlich durch zwei Mechanismen erfolgen kann:
(1) In Piastiden werden Fettsäuren-ACP-Ester durch eine lösliche Desaturase vorzugsweise an Position 9 desaturiert und
(2) am Endoplas atischen Reticulum werden Me branlipide, vor allem Phosphatidylcholine, durch Membran-gebundene Desaturasen bevorzugt weiter an Positionen 6, 12 und 15 desaturiert.
In manchen Pflanzen werden konjugierte Fettsäuren durch die Akti- vität einer Konjugase hergestellt (Crombie et al. (1984) J Chem Soc Chem Corr-mun 15:953-955; Crombie et al . (1985) J Chem Soc Per- kin Trans 1:2425-2434; Fritsche et al. (1999) FEBS Letters 462: 249-253; Cahoon et al . (2001) J Biol Chem 276:2637-2643; Qiu et al. (2001) Plant Physiol 125:847-855). Die Biosynthese von konju- gierte Fettsäuren wie Calendulasäure, Eleostearinsäure oder Puni- cinsäure läuft über die Desaturierung von Ölsäure zu Linolsäure durch eine Δ12-Desaturase und eine weitere Desaturierung, verbunden mit einer Umlagerung der Z9- oder Z12-Doppelbindung zur Kon- jutrien Fettsäure durch eine spezifische Konjutrien-bildende De- saturase (Konjugase) . Neben der Herstellung von Calendulasäure wird von Qui et al . (2001) Plant Physiol 125:847-855) auch die Herstellung von konjugierte Linolsäure durch die enzymatische Ak- tivität der Konjugase beschrieben. Von Nachteil ist bei dieser Nebenaktivität jedoch, dass durch die enzymatische Wirkung das unerwünschte 8,10-Isomer der konjugierte Linolsäure entsteht.
Pheromon-Desaturasen aus Lepidoptera zeigen eine große Diversität an Substratspezifitäten und Desaturierungsmechanismen (Roelofs and Wolf (1988) J Chem Ecol 14:2019-2031; Roelofs (1995) Proc Nat Acad Sei USA 92:44-49; Tillman et al . (1999) Insect Biochem 29:481-514). Diese Enzymaktivitäten bewirken die Herstellung von ungewöhnlichen ungesättigte Fettsäuren-CoA-Derivate verschiedenster Kettenlänge und mit Doppelbindungen an unterschiedliche Positionen und mit unterschiedlichen Konfigurationen. Diese fungieren als Edukt für die Biosynthese von Pheromonen. Liu et. al beschreiben eine Ell-Desaturase aus der Pheromondrüse einer Mot- tenart ("light brown apple moth"), die vermutlich eine Funktion in der Pheromonbiosynthese spielt (Liu WT et al. (2002) Proc Natl Acad Sei USA 99 (2) : 620-624.
Es stellte sich daher die Aufgabe, neue Verfahren bereit zu stel- len, die zu Trigylceriden mit einem hohen Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt konjugierten mehrfach-ungesättigten Fettsäuren wie CLA führen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von ungesättigte Fettsäuren umfassenden Trigylceriden durch transgene Expression mindestens einer Fettsäuredesaturase aus Insekten der Ordnung Lepidoptera.
In vielen Organismen, u.a. in Pflanzen, liegen die Fettsäuren im Cytosol hauptsächlich als CoA-Ester vor. In Hefen und Tieren stellt die Desaturierung von Acyl-CoA-Fettsäuren den Hauptsyntheseweg für ungesättigte Fettsäuren dar während in Pflanzen dieser Mechanismus eher selten ist (Cahoon EB et al. (2000) Plant Phy- siol . 124: 243-251). Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass die transgene Expression von Desaturasen aus Lepidoptera zu einer Desaturierung der gesättigte und. ungesättigte Fettsäuren- CoA-Ester führt. Dies führt dazu, dass letztendlich beide aktive CLA-Isomeren hergestellt und in den Speicherlipiden eingebaut werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat insbesondere den Vorteil, das ausgehend von Organismen, bevorzugt Pflanzen, mit hohem Ölgehalt, wie beispielsweise Raps oder Sonnenblume, direkt CLA-enthaltende Triglyceride hergestellt werden können. Die Verwendung eukaryoti- scher Enzyme aus Insekten der Ordnung Lepidoptera ermöglicht eine gute Expression ohne die mit prokaryotischen Proteinen oft verbundenen toxischen Effekte.
"Fettsäuredesaturasen" meint Enzyme, die in der Lage sind in Fettsäuren oder deren Derivaten, wie beispielsweise bevorzugt Fettsäure-CoA-Estern eine Doppelbindung einzuführen. Dabei können gegebenenfalls Cofaktoren wie NADPH, NADH oder aber auch Sauerstoff zusätzlich erforderlich sein. Dabei sind solche Desaturasen bevorzugt, die Acyl-CoA Fettsäuren als Substrat verwenden können, deren Fettsäure eine Kettenlänge von 14, 16, 18 oder 20 C-Atomen hat, bevorzugt 18 C-Atome.
Bevorzugt u fasst der Begriff der Fettsäuredesaturasen solche Enzyme, die in der Lage sind, in Fettsäuren oder deren Derivaten, wie beispielsweise bevorzugt Fettsäure-CoA-Estern, eine Doppelbindung an der Position C8, C9 , CIO, Cll oder C12 zu erzeugen. Bevorzugt sind ferner solche Desaturasen, die zu gezielten Strukturisomeren, also spezifisch zu eis oder trans Doppelbindungen führen. Spezifisch heißt dabei, dass das jeweilige Strukturisomer zu mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindesten 95% entsteht. Ganz besonders bevorzugt sind Desaturasen, die in Fettsäuren oder deren Derivaten, wie beispielsweise bevorzugt Fettsäure- CoA-Estern eine Doppelbindung generieren, wie sie in einem CLA- Isomer vorkommt.
"Bevorzugte wesentliche Eigenschaft" einer Fettsäuredesaturase aus Lepidoptera meint Enzyme mit mindestens einer der nachfolgenden Eigenschaften:
i) Spezifische Erzeugung einer cis-Doppelbindung in Position C8, C9, C10, Cll oder C12 oder einer trans-Doppelbindung in Position C8, C9, C10, Cll oder C12.
ii) Substratspezifität für Fettsäuren, Fettsäure-CoA-Ester oder andere Fettsäurederivate mit einer Kettenlänge der Fettsäure von 16 und/oder 18 C-Atomen. Substratspezifität meint dabei die Eigenschaft einer Fettsäuredesaturase, Substrate mit der angegebenen Kettenlänge schneller umzusetzen als Substrate mit anderer Kettenlänge. Dabei ist die Umdrehungsgeschwindigkeit des bevorzugten Substrates gegenüber den nicht-bevorzugten Substraten um mindestens 50%, bevorzugt mindestens 100%, ganz besonders bevorzugt mindestens 200%, am meisten bevorzugt mindesten 500% erhöht. Bevorzugt ist mindestens jeweils eine Eigenschaft aus i) oder ii) gegeben.
Fettsäuredesaturasen umfasst Enzyme, die eine isolierte Doppel- bindung einführen können, jedoch auch Konjugasen, die ausgehend von einer Doppelbindung in einem Substrat ein konjugiertes Doppelbindungssystem erzeugen können. Dabei wird die erste Doppelbindung bevorzugt verschoben.
Bevorzugt sind beispielsweise Konjugasen, die
a) eine Zll-Doppelbindung in zwei ElO und Z12 Doppelbindungen umwandeln ( "ZU- (ElO , Z12 ) -Konjugase" ) ,
b) eine Ell-Doppelbindung in zwei ElO und Z12 Doppelbindungen umwandeln ("Eil- (ElO, Z12) -Konjugase" ) ,
c) eine ZlO-Doppelbindung in zwei ElO und Z12 Doppelbindungen umwandeln ( "Z10- (ElO, Z12) -Konjugase" ) .
Zusammengefasst können diese Enzyme als (ElO, Z12) -Konjugasen bezeichnet werden. Diese Enzyme können auch als ElO-Desaturasen gelten. Die wesentliche Eigenschaft der ganz besonders bevorzugten ElO-Desaturasen ist die Einführung einer trans-Doppelbindung in Position C-10 einer Fettsäure oder eines Fettsäure-CoA-Esters, wobei die Fettsäure eine Kettenlänge von 18 C-Atomen hat.
Ferner bevorzugt sind Konjugasen, die
d) eine ZlO-Doppelbindung in zwei Z9 und Eil Doppelbindungen umwandeln ("Z10-(Z9, Eil) -Konjugase") ,
e) eine ElO-Doppelbindung in zwei Z9 und Eil Doppelbindungen umwandelt ( "ElO- (Z9, Eil) -Konjugase")
f) eine Zll-Doppelbindung in zwei Z9 und Eil Doppelbindungen umwandelt ("ZU- (Z9, Eil) -Konjugase") .
Zusammengefasst können diese Enzyme als (Z9, Eil) -Konjugasen be- zeichnet werden. Diese Enzyme können auch als Ell-Desaturasen gelten. Die wesentliche Eigenschaft der ganz besonders bevorzugten Ell-Desaturasen ist die Einführung einer trans-Doppelbindung in Position Cll einer Fettsäure oder eines Fettsäure-CoA-Esters, wobei die Fettsäure eine Kettenlänge von 18 C-Atomen hat. Am meisten bevorzugt sind ElO-, Eil-, Z10- und Zll-Desaturasen, sowie ZU- (ElO, Z12) -Konjugase, Eil- (ElO, Z12) -Konjugase, Z10-(Z9, Eil) -Konjugase und ElO- (Z9 , Eil) -Konjugase mit einer Substratspezifität für Fettsäure oder Fettsäure-Derivate wie Fett- säure-CoA-Ester mit einer Fettsäure-Kettenlänge von 18 C-Atomen.
Bevorzugt stammen die Fettsäuredesaturasen aus einer Lepidoptera- Fa ilie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrolepiidae, Agaristidae, Arctiidae, Bombycidae, Carposinidae, Cochylidae, Cossidae, Eriocraniidae, Gelechiidae, Geometridae, Gracillarii- dae, Hepialidae, Ithomiidae, Lasiocampidae, Lycaenidae, Lyman- triidae, Lyonetiidae, Nepticulidae, Noctuidae, Notodontidae, Nym- phalidae, Oecophoridae, Papilionidae , Pieridae, Psychidae, Ptero- phoridae, Pyralidae, Saturniidae, Sesiidae, Sphingidae, Tortrici- dae, Yponomeutidae und Zygaenidae. Insbesondere bevorzugt sind Fettsäuredesaturasen aus einer Lepidoptera-Familie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tortricidae, Pyralidae, Papilionidae, Noctuidae und Geometridae .
Ell-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäurese- quenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Diaphania hya- linata, Diaphania nitidalis, Leucinodes orbonalis, Ostrinia nubi- lalis, Sesamia grisescens, Brachmia macroscopa, Paraargyresthia japonica, Mhesictena flavidalis, Telorta edentata, Epiplema moza, Argyresthia chamaecypariae, Bradina sp., Dichrocrocis punctifera- lis, Cryptoblabes gnidiella, Palpita unionalis, Sceliodes corda- lis, Anisodes sp. , Caloptilia theivora, Phyllonorycter ringo- niella, Deilephila elpenor, Manduca sexta, Scirpophaga excerpa- lis, Scirpophaga nivella, Andraca bipunctata oder Diatraea sac- charalis isoliert. Besonders bevorzugt werden die Ell-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Phero- mondrüsen vorgenannter Insekten isoliert. Beispielhaft sei die Ell-Desaturase aus den Pheromondrüsen der "light brown apple moth" (Epiphyas postvittana) (SEQ ID NO: 2) , aus Ostrinia nubila- lis (SEQ ID NO:4) und aus Ostrinia furnicalis (SEQ ID NO: 6) zu nennen. Die Ell-Desaturasen aus genannten Organismen nehmen die pflanzlichen Acyl-CoA Fettsäurederivate als Substrat an.
ElO-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäure- Sequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Dichrocrocis chlorophanta, Dichrocrocis punctiferalis, Bombyx mandarina, Bom- byx mori, Coloradia velda, Hemileuca eglanterina, Hemileuca elec- tra electra, Hemileuca electra mojavensis, Hemileuca nuttalli oder Notarcha derogata isoliert. Besonders bevorzugt werden die ElO-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert. E9-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Epiplema plaqifera, Phyllonorycter coryli, Phyllonorycter harrisella, Phyllonorycter sylvella, Gelechiinae, Bryotropha sp., Bryotropha terrella, Gele- chia betulae, Adoxophyes orana, Exartema appendiceu , Zeiraphera canadensis, Loxostege neobliteralis, Ostrinia nubilalis, Dioryc- tria clarioralis, Dioryctria merkeli, Dioryctria resinosella, Spodoptera exigua, Spodoptera triturata oder Polia grandis isoliert. Besonders bevorzugt werden die E9-Desaturasen bzw. die da- für kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
E8-Desaturasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen werden bevorzugt aus Organismen der Arten Phyllonorycter sa- portella, Phyllonorycter sp. oder Dichrocrocis punctiferalis isoliert. Besonders bevorzugt werden die E8-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
Zll-Desaturasen, wie sie zur Herstellung der Zll-Octadecensäure vorteilhaft eingesetzt werden können, sind beschrieben für Bombyx mori (Ando et al. (1988) Agric Biol Chem. 52:473-478), Trichoplu- sia ni und Helicoverpa zea (Knipple et al. (1998) Proc Nat Acad Sei USA 95:15287-15292). Weitere Zll-Desaturasen bzw. die für sie kodierenden Nukleinsäuresequenzen können bevorzugt aus Manduca sexta, Diatraea grandiosella, Earias insulana, Earias vittella, Plutella xylostella, Bombyx mori oder Diaphania nitidalis isoliert werden. Beispielhaft seien die Desaturasen aus Helicoverpa zea (SEQ ID NO: 8), Trichoplusia ni (SEQ ID NO: 10) und Argyro- taenia velutinana (SEQ ID NO: 12) zu nennen. Besonders bevorzugt werden Zll-Desaturasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
ZlO-Desaturasen bzw. die für sie kodierenden Nukleinsäuresequen- zen werden bevorzugt aus. Organismen der Arten Ctenopseustis fili- cis, Pseudexentera spoliana, Hemileuca eglanterina, Hemileuca electra electra, Hemileuca electra mojavensis, Hemileuca nut- talli, Eurhodope advenella, Mamestra configurata oder Dichrocrocis punctiferalis isoliert, besonders bevorzugt aus den Pheromon- drüsen vorgenannter Insekten. Beispielhaft sei die Desaturase aus Planototrix octo (SEQ ID NO: 14) zu nennen.
(ElO, Z12) -Konjugasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen können vorteilhaft aus Bombyx mori, Phyllonorycter cra- taegella, Amorbia euneana, Notocelia incarnatana, Notocelia ud- dmanniana, Bombyx mandarina, Coloradia velda, Hemileuca eglanterina, Hemileuca electra electra, Hemileuca electra mojavensis, Hemileuca nuttalli, Notarcha derogata, Rondotia menciana, Amphion floridensis, Hyles gallii, Hyloicus pinastri, Manduca sexta, Sphinx drupiferarum, Earias insulana, Nola confusalis oder Notarcha basipunctalis isoliert werden. Besonders bevorzugt werden die (ElO, Z12) -Konjugasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
(Z9, Eil) -Konjugasen bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen können vorteilhaft aus Diatraea saccharalis , Xyrosaris lichneuta, Dioryctria abietella, Steno a cecropia, Phalonidia manniana, Pselnophorus vilis, Dioryctria abietella; Dioryctria rubella, Myelopsis tetricella, Jodis lactearia, Scopula perso- nata, Spodoptera descoinsi, Spodoptera eridania,- Spodoptera lati- fascia, Spodoptera littoralis oder Spodoptera litur isoliert werden. Besonders bevorzugt werden die (Z9, Eil) -Konjugasen bzw. die dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus den Pheromondrüsen vorgenannter Insekten isoliert.
Sowohl Zll-Desaturasen als auch. Zll-Konjugasen nehmen die pflanz- liehen Aeyl-CoA Fettsäurederivate als Substrat an, und die kombinierte Expression dieser beider Klassen von Desaturasen aus Lepidoptera in Pflanzen führt zu einer Herstellung von (10E, 12Z) -CLA, welches in den Speicherlipiden eingebaut wird.
Verschiedene Möglichkeiten der Kombination der Konjugasen oder Desaturasen miteinander oder pflanzlichen Enzymen gibt es, um die gewünschten CLA-Isomere, insbesondere (9Z,11E)-CLA und (10E, 12Z) -CLA herzustellen. Nachstehende Verfahren sind beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu verstehen:
1) Ausgehend von Stearinsäure über trans-Desaturierung an Position C-ll - beispielsweise durch eine Ell-Desaturase - trans- Vaccensäure hergestellt werden (Schema 3).
Δ
Figure imgf000012_0001
Schema 3: Biosynthesewege zur Herstellung von (9Z,11E)-CLA und (10E, 12Z)-CLA ausgehend von Stearinsäure
Ausgehend von Palmitinsäure wird über trans-Desaturierung an Position C-9 - beispielsweise durch eine E9-Desaturase - .Pal- mitelaidinsäure (9E-Hexadecensäure) hergestellt.. Diese kann anschließend über die enzymatische. Aktivität einer Elongase zu trans-Vaccensäure verlängert werden (Schema 4) .
Figure imgf000012_0002
fransvaccenicacid
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000012_0004
(E10.Z12) CLA . (29,£I1) CLA
Schema 4: Biosynthesewege zur Herstellung von (9Z,11E)-CLA und (10E, 12Z) -CLA ausgehend von Palmitinsäure Trans-Vaccensäure kann dann von einer Δ9-Desaturase zum (9Z,11E)-CLA Isomer umgesetzt werden. Für Säugetiere und Mensch konnte gezeigt werden, dass trans-Vaccensäure durch die enzymatische Aktivität einer endogenen Δ9-Desaturase zu CLA umgesetzt wird (WO 99/20123; Santora JE et al. (2000) J
Nutr 130:208-215; Adlof RO et al . (2000) Lipids 35: 131-135). Ebenso konnte gezeigt werden das Insektenzellen die eine Ell-Desaturase exprimieren, das entstandene Ell-Fettsäure- Edukt in ein Z9, EU-Fettsäure umwandeln können (Liu WT et al. (2002) Proc Natl Acad Sei USA 99 (2) .-.620-624. Pflanzliche
Δ9-Desaturasen können ebenso die Umsetzung von trans-Vaccen- säure zum (Z9, Eil) -CLA Isomer katalysieren. Diese Umsetzung kann in einer besonders bevorzugten Ausführungsform durch zusätzliche Expression einer Z9-Desaturase weiter gesteigert werden. Bevorzugt sind dabei zytosolisch-aktive Z9-Desatura~ sen, wie beispielsweise die Z9-Desaturase aus Hefe. Die Produktion des (Z9, Eil) -CLA Isomers in Pflanzen ist also möglich durch die Expression einer trans-Desaturase. Das besonders vorteilhafte (9Z,11E)-CLA Isomer wird dabei unter Einfluss pflanzlicher Z9-Desaturasen gebildet.
2) Ausgehend von Stearinsäure wird zunächst über trans-Desaturierung an Position C10 die entsprechende ElO-Octadecensäure gebildet (Schema 3). Alternativ kann ausgehend von Pal itin- säure wird über trans-Desaturierung an Position C8 E8-Hexade- censäure hergestellt. Diese kann anschließend über die enzymatische Aktivität einer Elongase zu ElO-Octadecensäure verlängert werden (Schema 4) . Diese Fettsäure wird durch die Aktivität einer Δl2-Desaturase zum (ElO, Z12) -CLA Isomer u ge- setzt werden. Diese Reaktion wird auch durch pflanzliche
Δl2-Desaturasen katalysiert. Diese Umsetzung kann in einer besonders bevorzugten Ausführungsform durch zusätzliche Expression einer Z12-Desaturase weiter gesteigert werden.
3) Es können auch entsprechende (ElO, 12) -Konjugasen aus Lepidoptera eingesetzt werden. Diese wandeln beispielsweise Zll- Octadecensäure (cis-Vaccensäure) , Ell-Octadecensäure (trans- Vaccensäure) oder ZlO-Octadecensäure in (ElO, Z12) -CLA um. Dazu wird zunächst Stearinsäure unter Wirkung einer Zll-Desa- turase zu ZU-Octadecensäure, wie oben beschrieben zu trans- Vaccensäure oder durch eine ZlO-Desaturase zu ZlO-Octadecensäure umgesetzt. ■
4) Ferner können auch (Z9,EU) -Konjugasen aus Lepidoptera vor- teilhaft mit (Zll)-, (Z10)- oder (ElO) -Desaturasen kombiniert werden. Diese Desaturasen produzieren ausgehend von Stearinsäure ZU-Octadecensäure (cis-Vaccensäure) , ZlO-Octadecen- säure oder ElO-Octadecensäure, welche anschließend durch eine (Z9/E11) -Konjugase zu (Z9, Eil) -CLA umgesetzt werden.
Die so hergestellte CLA-Fettsäuren bzw. deren Derivate wie CoA- Fettsäureester werden in den Membranlipiden und Triacylglyceride gespeichert.
Die wünschenswerten Enzymaktivitäten konnten in Insekten der Ordnung Lepidoptera, insbesondere in den oben genannten Insek- tenarten lokalisiert werden. Dazu wurden die im Rahmen dieser Erfindung bereitgestellten Testsysteme verwendet (Beispiel 2, 3 und 4) .
Die für diese Aktivitäten kodierenden Enzyme, bzw. die für diese kodierenden Nukleinsäuresequenzen, können in der dem Fachmann ■ vertrauten Weise aus den entsprechenden Organismen isoliert werden, oder durch Mutagenese aus entsprechenden bekannten Sequenzen abgeleitet werden.
Das Auffinden einer Proteinsequenz oder einer korrespondierenden cDNA-Sequenz zu einer enzymatischen Aktivität, Funktionalität oder Phänotyp ist eine klassische Aufgabenstellung der Biochemie und Molekularbiologie. Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren bekannt, wie er diese Aufgabe lösen kann. Diese Verfahren basie- ren zum Beispiel auf dem im Rahmen dieser Erfindung zur Verfügung gestellten Tests zur Bestimmung der Desaturase oder Konjugase Aktivität (siehe u.a. Beispiel 3). Die Bestimmung der jeweiligen spezifischen Aktivität einer Desaturase/Konjugase erfolgt über die Analyse des Fettsäuremuεters beispielsweise über Gaschromato- graphie wie in den Beispielen 2, 3 oder 4 beschrieben. Unter Verwendung dieses Tests ist es möglich, ausgehend von einem biologischen Material, in dem eine Desaturase- oder Konjugase-Aktivität detektiert wurde, das entsprechende Protein oder die Nukleinsäu- re, die für ein Protein mit Desaturase- oder Konjugase-Aktivität kodiert, zu isolieren und zu analysieren.
Beispielhaft kann man die Methode der Expressionsklonierung ("expression cloning") anwenden. Diese Methode ist vielfach dazu angewendet worden, ausgehend von einer bestimmten enzymatischen Ak- tivität, einer bestimmten Funktionalität oder einem bestimmten Phänotyp, das dafür verantwortliche Gen oder die korrespondierende cDNA zu isolieren (Dalboge H (1997) FEMS Microbiology Reviews 21(1): 29-42, Simonsen H and Lodish HF (1994) Trends Pharma- col Sei 15 (12) .437-441) . Die klassische Methode der Expressions- klonierung ist vielfach beschrieben, zum Beispiel für Membranproteine, sekretierte Faktoren und Transmembrankanäle (Masu Y et al. (1987) Nature 329 (6142) : 836-838; Wong GG et al. (1985) Science 228(4701) :810-815; Lustig KD et al . (1996) Development 122(12): 4001-4012; Smith WC and Harland RM (1992) Cell 7.0 (5) : 829-840; Le- maire P et al. (1995) Cell 81(l):85-94; Gillissen B et al. (2000) Plant Cell 12 (2) :291-300; Lotan T and Hirschberg J (1995) FEBS Letters 364:125-128).
Bei dem infolge beschriebenen verallgemeinerten Verfahren der Ex- pressionsklonierung verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel FM et al . (1987) Current Proto- cols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience beschrieben sind.
Allgemein kann man ausgehend von einen Organismus, Zellen oder Gewebe, die zur Erzeugung einer Desaturase- oder Konjugase-Akti- vität befähigt sind, eine Expressionsbibliothek herstellen. Beispielhaft isoliert man in der dem Fachmann geläufigen Weise zunächst mRNA oder bevorzugt poly(A)-mRNA aus gesagten Organismus, Zellen oder Gewebe und stellt davon ausgehend cDNA her (Gubler U, Hoffman BJ (1983) Gene 25:263-269). Verschiedene Systeme zur mRNA oder poly(A)-mRNA Isolierung sind dem Fachmann bekannt und kommerziell erhältlich. Beispielhaft kann die Synthese mit dem "Quick Prep Micro mRNA Purification Kit" (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt werden. Die Erststrang-cDNA Synthese wird bevorzugt mit einem Oligo(dT) -Primer unter Einsatz einer reversen Transkriptase ausgeführt (Borson ND et al. (1992) PCR Methods Appl 2:144-148; Chenchik A et al . (1994) CLONTECHniques 9(1) :9-12) . Es sind verschiedene Systeme bekannt und kommerziell erhältlich, die die Erzeugung von vollständigen cDNAs ("full- length cDNAs") ermöglichen. Beispielhaft sei der "SMART1" cDNA Li- brary Construction Kit" (Clontech, Cat . #K1051-1) genannt. Dieser verwendet die SMART™ Technologie (SMART = Switch Mechanism At the 5' end of RNA Templates) zur Erzeugung von cDNA-Bibliotheken (Herrler M (2000) J Mol Med 78(7) :B23) . Hier kommen bestimmte Oligonukleotide und das Verfahren der Längstrecken-PCR ("long-di- stance PCR") zum Einsatz. Das Verfahren ist im Beispiel 4 beschrieben.
An die doppelsträngigen cDNAs können Adaptoren mit Einzelstrangüberhängen ligiert werden, die eine Klonierung beispielhaft in einen Expressionsvektor, der mit Restriktionsenzymen geschnitten wurde und kompatible kohäsive Enden aufweist, erfolgen. Bevorzugt erfolgt die Klonierung gerichtet, so dass die Leserichtung fest- gelegt ist und ein gegebenenfalls vorhandener Promotor sense-RNA ausgehend von der cDNA Insertion erzeugt. Bei dem beispielhaft verwendeten SMART™ -System werden kompatible Sfil (A) und Sfil (B) - Überhänge zu einer gerichteten Klonierung in einen mit Sfil (Erkennungsequenz GGCCNNNN! GGCC) geschnittenen Vektor verwendet. Jeweils ein cDNA-Molekül wird in ein Vektormolekül kloniert, so dass letztlich eine Vielzahl sich in der integrierten cDNA unterscheidende Vektoren, basierend auf dem gleichen Basisvektor, vorliegen, die die Expressionsbibliothek bilden. In dieser Expres- sionsbibliothek sind auch Vektoren enthalten, die eine Desaturase- oder Konjugasetransgen exprimieren können. Prinzipiell sind alle Expressionsvektoren geeignet, die in der Lage sind, Desaturasen oder Konjugasen in aktiver Form in einem transformierten Organismus transgen zu exprimieren. Beispielhaft seien der lambda TriplEX2 Vektor (nach Excision pTriplEX2 Vektor; Hersteller Clontech) zur -transgenen Expression in E.coli, oder der Vektor pYES2 (Hersteller: Invitrogen) zur transgenen in der Hefe S.cerevisiae genannt (siehe Beispiel 4) .
Gegebenenfalls kann man eine Normalisierung durchführen, um Unterschiede in der Expressionshöhe einzelner Gene auszugleichen, so dass die cDNA zu jedem exprimierten Gen - unabhängig von der tatsächlichen Expressionshöhe - mit einer ähnlichen Kopienzahl in der Expressionsbibliothek vertreten ist. Für die Herstellung von poly(A) -mRNA, cDNA und normalisierter cDNA sind verschiedene Systeme beschrieben (US 5,482,845) (Soares MB et al. (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:9228-9232; Carninci P et al . (2000) Genome Res 10:1617-1630; Bonaldo MF et al . (1996) Genome Res 6:791-806).
Alternativ kann man auch eine subtraktive Expressionsbibliothek anfertigen. Hier vergleicht man die cDNAs von einem Organismus, Zellen oder Gewebe, der eine Desaturase- oder Konjugase aufweist, mit den cDNAs eines Organismus, Zellen oder Gewebe, der diese Aktivität nicht aufweist und möglichst von der gleichen Gattung und Art ist. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, wie man gezielt die cDNAs isolieren kann, die nur in dem biologischen Material mit der Desaturase- oder Konjugase-Aktivität exprimiert sind. Entsprechende Verfahren und Systeme sind beschrieben und kommerziell erhältlich. Beispilehaft sei der "PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit" (Hersteller: Clontech) oder "Subtractor™ Kit" (Hersteller: Invitrogen) zunennen, der eine bis zu mehr als 1000-fache Anreicherung seltener und/oder selektiv exprimierter cDNAs ermöglicht. Unter Verwendung einer subtraktiven Hybridisierung werden all die cDNAs entfernt, die in beiden biologischen Materialien vorhanden sind (Chu ZL et al. (1997) Proc Nat Acad Sei USA 94:10057-10062; Hudson C et al. (1997) Cell 91:397-405; Mueller CGF et al. (1997) J Exp Med 186:655-663; von Stein OD et al . (1997) Nucleic Acids Res 25:2598-2602; Wong BR et al . (1997) j'Biol Chem 272:25190- 25194; Yokomizo T et al . (1997) Nature 387:620-624; Z icheng S and Jacobs-Lorena M (1997) J Biol Chem 272:28895-28900).
Die transgene Expression der in der Expressionsbibliothek enthaltenen cDNAs kann beispielhaft in prokaryotischen oder eukaryoti- schen Zellen realisiert werden, die anschliessend einem Test auf das Desaturase- oder Konjugase-Protein, zum Beispiel einem Test auf eine Desaturase- oder Konjugase-Aktivität, unterzogen werden.
Zur Isolierung der Desaturase- oder Konjugase transgen expri ie- renden Vektoren aus der Expressionsbibliothek, wird die Expressionsbibliothek bevorzugt in einen Organismus .transformiert. Vorzugsweise transformiert man einzelne Zellen des besagten Organsi- mus derart, dass jede Zelle oder jeder ausgehend von dieser Zelle regenerierte Organismus jeweils nur mit einer Art Vektormolekül transformiert ist. Im Prinzip sind alle Organismen oder von ihnen abgeleitete Zellen für die Transformation geeignet, die in der Lage sind, eine aktive Desaturase oder Konjugase transgen zu ex- primieren. Dies können prokaryotische und eukaryotische Organismen sein. Bevorzugt sind alle Pflanzen, von ihnen abgeleitete Zellen, aber auch andere photosynthetische Organismen, wie zum Beispiel Algen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien hier Systeme genannt, die auf einer transgenen Expression in Bakterien wie E.coli, Hefen wie Saccharomyces oder Pichia, Säugerzellen wie COS oder CHO, oder Zellen photosynthetisch aktiver Organsi en wie Synechocystis basieren. Bevorzugt sind eukaryotische Organismen, ganz besonders bevorzugt sind eukaryotische Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren oder Aeyl-CoA Fettsäuren zu synthetisie- ren. Bevorzugt tragen die zur Transformation verwendeten Expressionsvektoren einen Selektionsmarker, zum Beispiel eine Antibiotikaresistenz oder ein Aminosäuresynthesegen zur Selektion auf Aminosäuredefizienz, das eine Selektion erfolgreich transformier- 'ter Zellen ermöglicht. Weitere Verfahren der Selektion sind wei- ter unten beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Expressionsklonie- rung in Hefe vorgenommen werden. Dazu kann beispielhaft das auf dem Vektor pYES2 basierende Hefeexpressionssystem der Firma Invi- trogen verwendet werden. pYES2 ist ein "high-copy" episomaler Vektor zur induzierbaren Expression rekombinanter Proteine in S. cerevisiae. Die Selektion transformierter Hefestämme erfolgt auf Basis der Uracil-Defizienz (pYES2 trägt das ura3 Gen) . Weiter bevorzugte Expressionsvektoren und Transfektionsmethoden zur Herstellung der transformierten Organismen entsprechen den allgemein für die Herstellung transgener Organismen verwendeten Verfahren.
Von der Gesamtzahl der transformierten Organismen oder von ihnen abgeleiteten Zellen ausgehend werden diejenigen angereichert und isoliert, die in der Lage sind, eine Desaturase oder Konjugase transgen zu exprimieren und/oder eine entsprechende Desaturase- oder Konjugase Aktivität aufweisen.
Allgemein kann der Nachweis der Desaturase-Aktivität dadurch erfolgen, dass man einen transformierten Organismen oder von ihm abgeleiteten Zellen kultiviert, in einem geeigneten Puffer oder Lösungsmittel aufschliesst, den Aufschluss mit Fettsäuren oder Aeyl-CoA Fettsäuren und gegebenenfalls mit einem Co-Faktor wie NADH oder NADPH oder Sauerstoff in Verbindnung bringt und die entstehende desäturierte Fettsäure oder Aeyl-CoA Fettsäuren nachweist. Die Fettsäuren oder Aeyl-CoA Fettsäuren können bevorzugt aus dem transformierten Organsismus selber stammen, wenn der Organsimus oder die von ihm abgeleiteten Zelle in der Lage sind, selber Fettsäuren oder Aeyl-CoA Fettsäuren zu synthetisieren. Anderenfalls können Fettsäuren oder Aeyl-CoA Fettsäuren aber auch zugesetzt werden.
Der Nachweis der durch die Deaturase oder Konjugase modifizierten Fettsäure oder Aeyl-CoA Fettsäure kann, gegebenen falls nach Extraktion aus dem Inkubationansatz zum Beispiel mit einem Lösungsmittel wie Ethylacetat, über übliche dem Fachmann geläufige Me- thoden erfolgen. Dazu können Separationsmethoden wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) , Gaschromatographie (GC) , Dünnschichtchromatogaphie (DC) und Detektionsmethoden wie wie Massenspektroskopie (MS oder MALDI) , UV-Spektroskopie oder Auto- radiographie zum Einsatz kommen. Bevorzugt erfolgt der Nachweis unter durch GasChromatographie wie in den Beispielen 3, 4 oder 5 beschrieben.
Die Isolierung der transformierten Organismen oder von ihnen abgeleiteten Zellen, die in der Lage sind eine Desaturase oder Kon- jugase transgen zu exprimieren, kann beispielhaft dadurch geschehen, dass man die Gesamtzahl der Zellen in Untergruppen unterteilt, diese Untergruppen gegebenenfalls separat kultiviert und die Desaturase- oder Konjugase-Aktivität der einzelnen Untergruppen mißt. Die Untergruppe, in der eine Zellart vorhanden ist, die ein Desaturase- oder Konjugase-Protein in funktioneil aktiver Form transgen exprimiert, weist eine erhöhte Desaturase- oder Konjugase-Aktivität auf. Diese Untergruppe wird weiter unterteilt und das Verfahren so lange wiederholt, bis man zu einer monoklo- nalen Kultur gelangt, d.h. einer Kultur, die lediglich einen Vektor mit einer bestimmten für eine Desaturase oder Konjugase kodierenden cDNA enthält .
Aus dem transformierten Organismus oder Zelle kann der Vektor, der die Nukleinsäure kodierend für die Desaturase oder Konjugase enthält, zurückgewonnen werden. Dies kann zum Beispiel mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) gesehenen. Dazu Verwendet man OHgonukleotidprimern, die zu Vektorsequenzen, die das Desaturase oder Konjugase cDNA-Insert flankieren, komplementät sind. Die Kenntnis der Desaturase oder Konjugase Nukleinsäuresequenz ist dazu nicht erfrderlich. Alternativ kann der Vektor, wenn er nicht in das Genom des Wirts integriert ist, aus den Zellen rückgewon- nen, in E.coli transformiert, propagiert und sequenziert werden, um. die für die Desaturase'.oder Konjugase kodierende Nukleinsäuresequenz zu erhalten. Auch aus dem isolierten Vektor kann die Desaturase- oder Konjugase-Nukleinsäuresequenz nach oben beschriebenen Verfahren ohne Kenntnis ihrer Sequenzfolge mittels PCR iso- ' liert werden. Nach den PCR-Reaktionen können zusätzlich Linker an das Amplikon angefügt werden, die eine gerichtete Klonierung ermöglichen. Die Klonierung kann aber auch mittels "blunt-end" Li- gation oder T-Überhangsligation in einer dem Fachmann geläufigen Weise, erfolgen. Die mittels PCR selektiv amplifizierte cDNA der Desaturase- oder Konjugase kann so auch ohne vorherige Sequenzaufklärung direkt in einen Vektor kloniert werden, der zur Herstellung eines transgenen, eine Desaturase- oder Konjugase expri- mierenden Organsimus geeignet ist. Diese Klonierung kann beispielsweise als "blunt end" Klonierung unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Techniken erfolgen. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie oben zitiert.
Besonders bevorzugt kann die oben beschriebene Expressionsklonie- rung in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt werden. Dazu können auch Systeme verwendet werden, bei dem die transgen zu" exprimierenden cDNAs mittels homologer Rekombination in eine erzeugte Integrationsplattform integriert werden (Lagarde D et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1): 64-72).
Alternativ kann die Expressionsklonierung auch unter Verwendung einer wie oben beschriebenen nicht-amplifizierten Expressionsbibliothek in vitro vorgenommen werden. Entsprechende Systeme sind beschrieben und kommerziell herhältlich. Beispielhaft sei das "TNT™ Coupled Reticulocyte Lysate System" (Promega; Promega Notes Number 67, 1998, p. 02) genannt. Kirschner et al. haben einen in vitro Ansatz (IVEC = "in vitro expression cloning") entwicklet, der ohne lebende Zellen auskommt (US 5,654,150; King RW et al. (1997) Science 277, 973). Das System ist erfolgreich vor allem auf Enzyme und Kinasen angewendet worden. Kirschner et al . haben Kinasesubstrate und Proteasen identifiziert (Lustig KD et al. (1997) Meth Enzymol 283:83; Stukenberg PT et al. (1997) Curr Biol 7:338; Kothakota S et al. (1997) Science 278 : 294) . Beim "in vitro expression cloning" (IVEC) werden kleine Fraktionen der Expressionsbibliothek eingesetzt. Diese Fraktionen von jeweils ca. 50 bis 100 Klonen von cDNAs sind in Plasmiden enthalten und werden mittels eines gekoppelten in vitro Transkriptions-/Translati- onssystems auf der Basis von Retikolozytenlysat in ihre korrespondierenden Proteine übersetzt. Dazu wird wie oben beschrieben eine oligo(dT) -geprimte cDNA-Bibliothek konstruiert und in ein high copy Expressionsplasmid mit einem T3 , T7 oder SP6 Promoter kloniert. Diese Plasmid-Bibliothek wird dann in E.coli transfor- miert . Jeweils ca. 50 bis 100 unabhängige Tranformanten werden auf einer Agarplatte mit- dem entsprechenden Selektionsantibiotikum bis zu einer Koloniengrösse von ca. 1 mm kultiviert, gesammelt und vereinigt . Aus einem Teil dieser Bakterien wird Plasmid- DNA isoliert. Diese Plamid-DNA wird als Matrize direkt in einem Retikolozytensytem transkribiert und translatiert . Details des Verfahrens können zum Beispiel dem Handbuch des Herstellers entnommen werden (TNT™ Coupled Reticulocyte Lysate Systems Technical Bulletin #TB126, Promega Corporation)". Je nach Anzahl der "full- length" cDNA Klone in der Bibliothek werden ca. 30 bis 50 Pro- teine in jedem Einzelansatz synthetisiert. Die produzierten Proteine werden hinsichtlich ihrer Desaturase- oder Konjugase Aktivität überprüft. Einzelansätze, die eine erhöhte Desaturase- oder Konjugase Aktivität aufweisen werden weiter unterteilt. Unterteilung der Einzelansätze führt zu der für eine Desaturase- oder Konjugase kodierenden cDNA. Aus den in dieser Präparation enthaltenen Vektoren kann mittels PCR. die für die Desaturase- oder Konjugase kodierende Nukleinsäure herausamplifiziert werden und - gegebenenfalls ohne Kenntnis und Analyse der Sequenz - wie oben beschrieben zur Herstellung eines eine Desaturase oder Konjugase transgen exprimierenden Organsimus verwendet werden.
Alternativ zum Kaninchen Retikolozytenextrakt kann auch Weizenkeimextrakt für die kombinierte Transkription/Translation verwendet werden (zum Beispiel unter Einsatz des TNT™ Wheat Germ Ex- tract System der Firma Clontech) .
In einer weiteren vorteilhaften Anwendung können die cDNAs in einen retroviralen Vektor kloniert werden. Dies erlaubt eine hocheffiziente Transformationen der Zellen. Retrovirale Expressions- Vektoren und ExpressionsSysteme sind beschrieben (Kitamura T, International Journal of Hematology 1998, 67:351-359) und kommerziell erhältlich (zum Beispiel von Clontech; New Retroviral & ClonCapture Expression Libraries; CLONTECHniques October 1998, XIII (4) : 22-23 ) . Die Transfektion erfolgt zunächst in eine Verpak- kungszelllinie (zum Beispiel EcoPack™-293 oder RetroPack™ PT67 Cell Line der Firma Clontech) . Mit den so generierten Viren kann die entsprechende Targetzelllinie transfiziert und hinsichtlich dergewünschten Aktivität seletioniert werden. Die Inserts können sodann zum Beispiel über PCR gewonnen und analysiert werden. Ferner können sie - auch ohne vorherige Sequenzanalyse wie oben beschrieben direkt in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden, der dann zur Herstellung eines Desaturase oder Konjugase transgen exprimierenden Organismus verwendet werden kann.
ElO- oder Ell-Desaturasen können erhalten werden, indem bekannte cis-Desaturasen über Mutagenese so verändert werden, dass sie spezifisch für die Desaturierung in trans-Position sind. Dazu können beispielsweise nachfolgende- für cis-Desaturasen kodierende Nukleinsäuresequenzen als Ausgangssequenzen einer Mutagenese unterworfen werden:
i) eine Nukleins uresequenz kodierend für eine Zll-Desaturase .. aus Helicoverpa zea mit der SEQ ID NO: 7,
ii) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Zll-Desaturase aus Trichoplusia ni mit der SEQ ID NO: 9,
iii) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Zll-Desaturase aus Argyrotaenia velutinana mit der SEQ ID NO: 11 oder
iv) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine ZlO-Desaturase aus Planotortrix octo mit der SEQ ID NO: 13.
Auch können Ell-Desaturasen durch eine Mutagenese so verändert werden das längerkettige Fettsäuren besser oder überhaupt umgesetzt werden können. Dazu kann beispielsweise als Ausgangssequenz eingesetzt werden
a) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Ell-Desaturase • aus Epiphyas postvittana mit der SEQ ID NO: 1,
b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Ell-Desaturase aus Ostrinia nubilalis mit der SEQ ID NO: 3, oder
c) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Ell-Desaturase aus Ostrinia furnacalis mit der SEQ ID NO: 5. Auch ist es denkbar die Spezifität für die Position, an der die Doppelbindung durch oben genannte Desaturasen eingeführt wird, durch Mutagenese zu ändern.
Verfahren zur Veränderung der Eigenschaften wie Substratspezfitat von Desaturasen durch Mutagenese ist bekannt (Cahoon et al. (1997) Proc Nat Acad Sei USA 94:4872-4877; WO 98/06735). Weitere geeignete Verfahren sind für andere Enzyme des Lipidmetabolismus wie beispielsweise Lipoxygenasen beschrieben und übertragbar (Hornung et al. (2000) Biochem Soc Trans 28:825-826; Schwarz et al. (2001) J Biol Chem 276:773-779).
Nukleinsäuresequenzen kodierend für Desaturasen/Konjugasen zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung entsprechender degenerierter Oligonukleotidprimer aus cDNA Präparationen - oder Banken der entsprechenden oben- genannten Lepidoptera-Arten isoliert werden. Dabei kommen bevorzugt das Oligonukleotid-Primerpaar beschrieben durch SEQ ID NO: 15 und 16 oder das das Oligonukleotid- Primerpaar beschrieben durch SEQ ID NO: 17 und 18.zum Einsatzt.
Die Nukleinsäuresequenz der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie
a) in ihren sense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 15 oder 17 enthält, oder
b) in ihren antisense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 16 oder 18 enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Proteinsequenz der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera bevorzugt dadurch gekenn- zeichnet, dass sie eine Homologie von mindestens 65%, bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% zu einer der Fettsäuredesaturasen beschrieben durch SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14 hat und - optional und bevorzugt - über mindestens eine der bevorzugten we- sentlichen Eigenschaften einer Desaturase oder Konjugase verfügt.
Die so gekennzeichneten Proteine können auch natürliche oder künstliche Mutationen einer der oben genannten Desaturase-Nu- kleinsäuresequenzen sowie deren Homologen aus anderen Tier- oder Pflanzengattungen und -arten umfassen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z.B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mu- tagenese, "primer repair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing- back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer kommen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Homologie von minde- stens 65%, bevorzugt mindestens 70%, besonders, bevorzugt mindestens 80, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% zu einer der Nukleinsäuresequenz beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 hat und - optional und bevorzugt - für ein Protein kodiert, das über mindestens eine der bevorzugten wesentlichen Ei- genschaften einer Desaturase oder Konjugase verfügt.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren oder Polypetiden wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Pro- grammalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, Üniversity of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12 Length Weight: 4
Average Match: 2,912 Average Mismatch:-2 , 003
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz kodierend für die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommenden Fettsäuredesaturase aus Lepidptera bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie unter Standardbedingungen mit einer der oben genannten für Desaturasen kodierenden Nukleinsäuresequenz, bevorzugt mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13 hybridisiert.
Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbe- dingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Clo- ning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3M Natriumeitrat, 3M NaCl, pH 7.0) . Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung be- vorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
(1) Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC bei 68°C, 100 μg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, d) 4X SSC , 50% Formamid, bei 42°C, e) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung) , oder f) 2X oder 4X SSC, 30 bis 40% Formamid, bei 42°C (schwach stringente Bedingung) .
(2) Waschschritte mit zum Beispiel
a) 0,1X SSC bei 65°C, oder b) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder c) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder d) 0,2X SSC , 0,1% SDS bei 42°C, oder e) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) .
"Nukleinsäuresequenz" meint im Rahmen dieser Erfindung beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA (cDNA) -Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulären Form, extrachromosomal oder integriert in das Genom vorliegen. Die Nu- kleotidsequenzen der erfindungsgemässen Expresεionskassetten oder Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürli- chen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen hetero- logen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Ausserdem sind artifizielle Nukleinsäuresequenzen geeignet, solange sie die gewünschte wesentliche Eigenschaft haben. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt werden, die von zu transformierenden Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können anhand der Kodonnutzung aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit in üblicher Weise bestimmt werden. Besonders geeignet sind kodierende Nukleotidse- quenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz ge äss der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Um unerwünschte pflanzliche Regulationsmechanismen zu umge- hen, kann man beispielsweise ausgehend von der Aminosäuresequenz eines Desaturase aus Lepidoptera-Insekten unter Berücksichtigung der pflanzlichen Kodon-Nutzung DNA-Fragmente rückübersetzen und daraus die vollständige, für einen Einsatz in der Pflanze optimierte exogene Desaturasesequenz herstellen.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotidsequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbau- steinen wie beispielsweise, durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppel- helix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamidit- methode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation eines Nukleinsäure- konstruktes können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Für die Verbindung der Nukleinsäure-Frag ente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
"Transgen" meint bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette, einem Vektor oder einem Organismus alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen oder deren Verwendung, in denen sich entweder
a) die für eine Desaturase kodierende Nukleinsäuresequenz, . oder
b) ' eine mit der für eine Desaturase kodierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollse- quenz, zum Beispiel ein Promotor, oder c ) ( a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die - Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleoti- dreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomi- sehen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination einer für eine Desaturase kodierenden Gensequenz mit ihrem natürlichen Promotor - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, syntheti- sehe ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutageni- sierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815; siehe auch oben).
Transgene Expression meint die Verwendung einer transgenen Ex- pressionskassette zur Expression einer Nukleinsäuresequenz .
Die Erfindung betrifft ferner transgene Expressionskassetten, die eine für eine Desaturase kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten, sowie Vektoren umfassend diese Expressionkassetten.
In besagten transgenen Expressionskassetten steht ein für eine Desaturase kodierendes Nukleinsäuremolekül bevorzugt in funktio- neller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor) , das die transgene Expres- sion (Transkription und/oder Translation) besagter Desaturase in einem Organismus, bevorzugt in Pflanzen, gewährleistet. Soll die transgene Expressionskassette direkt in die Pflanze eingeführt und die Desaturase in plantae exprimiert werden, so sind pflanzenspezifische genetische Kontrollelemente (beispielsweise Promo- toren) bevorzugt. Die Desaturase kann jedoch auch in anderen Organismen oder in vitro erexprimiert werden. In diesem sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen genetischen Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt, die die Expression in den jeweils für die Herstellung gewählten Organismus erlauben. Unter einer funktioneilen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimie- renden Desaturase-Nukleinsäuresequenz und ggf . weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische KontrollSequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Se- quenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positio- nen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu ex- primierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kova- lent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer transgenen Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) , in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular' Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusion- sproteinen führen. Bevorzugt kann die transgene Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu expri- mierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer transgenen Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Desaturasederart hinter einen endogenen Promotor platziert wird, dass die Expression der Desaturase unter Kon- trolle des endogenen Promotors erfolgt. Die durch die Insertion entstehende Fusion von endogenem Promotor und Desaturase-Nuklein- Säuresequenz ist eine transgene Expressionskassetten im Sinne der Erfindung.
Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitu- tiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein. Bevorzugt sind:
a) Konstitutive Promotoren
Bevorzugt sind Vektoren, die eine konstitutive Expression in Pflanzen ermöglichen (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). "Konstitutiver" Promotor meint solche Promoto- ren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflan- zenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al . (1985) Nature 313:810-812; Shewaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al .
(1989) EMBO J 8:2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitu- tiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU) "-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubi uitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor
(US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) , sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
b) Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Same . Sämenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9) : 839-53 ) , des 2S Albumingens (Joseffson LG et al . (1987) J Biol Chem 262:12196-12201), des Legu ins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al . (1991) Mol Gen Genet 225 (3 ): 459-67 ) , des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K "et al . (1996) L Planta 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol
Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13 (10) :1090f) , der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980). Wei- tere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG) , Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AG- Pase) oder die Stärkesynthase . Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lptl-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens , des Glia- din-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens) .
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren wie Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900) , der SSU Promotor (s all subunit) der Rubisco (Ri- bulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . (1989) EMBO J 8:2445-2451).
Blütenspezifische Promotoren wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
- Antheren-spezifische Promotoren wie den 5126-Promotor (US 5,689,049, US 5,689,051), den glob- 1 Promotor und den γ-Zein Promotor. c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die transgenen Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al . (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol
48:89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al . (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443 ) , ein durch Benzolsulfo- namid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186) , ein durch Tetra- zyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al . (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-in- duzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare Promotor des PRPl-Gens (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate (US 5,187,267), der- kälteinduzierare alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel (WO 96/12814) , der licht-induzierbare PPDK Promotor oder der ver- wundungsinduzierte pinll-Promoter (EP375091) .
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls induziert werden wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1, 3-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al . (198.3) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Uknes, et al . (1992) The Plant Cell 4:645-656; Van Loon (1985) Plant Mol Viral 4:111-116; Mari- neau et al . (1987) Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al .
(1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-342; Soms- sich et al. (1986) Proc Natl Acad Sei USA 83:2427-2430; Soms- sich et al. (1988) Mol Gen Genetics 2:93-98; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966; Zhang and Sing (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:2507-2511; Warner, et al . (1993) Plant J
3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968(1989).
Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie der des pinll Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al . (1996) Nat Biotech 14:494-498), des wunl und wun2-Gens (US 5,428,148), des winl- und win2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol Gen Genet 215:200-208), des Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573), des WIPl-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) The Plant J 6 (2) : 141-150) und dergleichen.
e) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise fruchtrei- fung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus, Tomate (WO 94/21794, EP 409 625).. Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil die Gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignet Promotoren sind be- schrieben ' (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al . (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:8402-8406). Besonders bevorzugt sind konstitutive sowie Samen-spezifische Promotoren.
Es können ferner weitere Promotoren funktioneil mit der zu expri- mierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Die in den erfindungsgemässen transgenen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen KontrollSequenzen neben einem Promoter funktioneil verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequen-. zen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der er- findungsgemässen transgenen Expressionskassette haben. Genetische KontrollSequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotisehen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen transgenen Expressionskassetten 5 '-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu ■ exprimierenden Nukleinsäuresequenz den Promoter mit Spezifität für die embryonale Epidermis und/oder die Blüte und 3 '-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontroll- sequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktioneil verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz .
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expres- sion zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Absci- sinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131 -17135) und Hitzestress (Schoffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3) : 246-53 , 1989) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02 , in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3 '-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5 ' -un- translatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für TranslationsVerstärker sei die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).
Die transgene Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzli- ehe vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente' oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium turne faciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3:835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für be- sonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Syn- thase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase) -Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der transgenen Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods . 14 (4) : 381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Eine transgene Expressionskassette und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselernent ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemässen transgenen Expressionskassetten, Vektoren oder Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschrän- kend seien zu nennen:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) , Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Bei- spiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphi- notricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphi- nothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynt- haseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen) , 5-Enolpyru- vylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene) , die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N- (phosphono ethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase) , das deh Gen (kodie- rend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert) , Sulfo- nylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseen- zyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Strepto ycinphospho- transferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hy- gromycinphosphotransferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS) , das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z.B. mutierte ALS-Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation) .
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodie- ren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Bio- technol. 1999; 13 (1) .-29-44) wie das "green fluorescence pro- tein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8 (5) : 777-784;
Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sei USA 94 (6) .-2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12) .-5888-5893; Tian et al . (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL et al . (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al . (1997) Biotechniques . 23 (5) : 912-8) , die Chloramphenicoltrans- ferase, eine Luziferase (Ow et al . (1986) Science 234:856-859; Millar et al . (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), das Aequoringen (Prasher et al . (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) :1259-1268) , die ß-Galactosidase, R- Locus Gen (kodieren ein Protein, das die Produktion von Ant- hoeyaninpigme ten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht; Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al.(1987) EMBO J 6:3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsge- ' mässen transgenen Expressionskassetten oder Vektoren in zum
Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al. : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
- Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selek- tionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Bei- spiel ein Herbizid) , einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglu- cose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransfor ierten (McCor ick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84) .
Beispielhaft - jedoch nicht einschränkend - kann die erfindungs- gemässe transgene Expressionskassette eine folgende Struktur haben:
a) 5 '-Pflanzenspezifischer Promotor / Desaturase / Terminator-3 '
Bevorzugt hat die erfindungsgemässe transgene Expressionskassette eine folgende Struktur:
a) 5'-35S-Promotor / Desaturase / OCS-Terminator-3 ' , oder
b) 5 ' -LeguminB-Pro otor / Desaturase / NOS-Terminator-3 '
Für die erfindungsgemässen vorteilhaften Verfahren zur CLA- Biosynthese kann eine Kotransformation mit mehr als einem der oben genannten Beispiele a) oder b) vorteilhaft sein. Ferner kann die Transformation mit einem oder mehr Vektoren, die jeweils eine Kombination der oben genannten transgenen Expressionskassetten enthalten, vorteilhaft sein.
Zusätzlich kann besagte transgene Expressionskassette eine Nukleinsäuresequenz enthalten, deren transgene Expression zu einer Steigerung der Fettsäure-Biosynthese führt (infolge proOIL) . Diese zusätzich transgen exprimierte proOIL Nukleinsäuresequenz kann bespielhaft aber nicht einschränkend ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase) , Glyce- rol-3-Phosphat Acyltransferase (GPAT) , Lysophosphatidat-Acyl- transferase (LPAT) , Diacylglycerol-Acyltransferase (DAGAT) und phospholipid:diacylglycerol-acyltransferase (PDAT) .
Die proOIL Nukleinsäuresequenzen umfassen auch solche Nukleinsäu- ren, deren transgene Expression eine antisense-RNA oder doppel- strängige RNA erzeugt, die ebenfalls eine Erhöhung der Fettsäure- Produktion bewirkt.
Bevorzugte Beispiele umfassen Vektoren, die folgende transgenen Expressionskassetten enthalten:
a) 5'-35S-Promotor/ Desaturase / OCS-Terminator / LeguminB- Promotor / proOIL / NOS-Terminator-3 ' ;
b) 5 '-35S-Promotor/ proDesaturase oder Konjugase / OCS-Terminator / LeguminB-Promotor / proOIL / NOS-Terminator-3 ' ; Die Konstrukte a) und b) erlauben die gleichzeitige Transformation der Pflanze mit einer Desaturase und einer die Fettsäure- Biosynthese steigernden Sequenz proOIL.
Unter Verwendung' der oben zitierten Rekombinations- und Klonie- rungstechniken können die erfindungsgemässen Desaturase oder proOIL Nukleinsäuren oder transgenen Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli , ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, Ml3mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Die erfindungsgemässen Desaturase oder proOIL Nukleinsäuren oder transgenen Expressionskassetten werden bevorzugt in geeignete
Transformationsvektoren insertiert. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben. Beispiele und Verfahren zur Transformation sind weiter unten ausgeführt.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemässen transgenen Expressionskassette oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden prokaryo- tische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroor- ganismen oder pflanzliche Organismen verstanden.
Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Co- rynebacterium, Bacillus, Clostrridium, Proionibacterium, Butyri- vibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwinia, Agrobacterium, Fla- vobacterium, Alcaligenes, Phaeodactylum,- Colpidium, Mortierella, Entomophthora, Mucor, Crypthecodinium oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis .
Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens . Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neu- rospora, Fusarium, Beauveria, Phytophthora infestans oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.
Als transgene Organismen bevorzugt sind vor allem pflanzliche Organismen. "Pflanzlicher Organismus" umfasst jeden Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, sowie die von diesem abgeleitete Zellen, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) . Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzen- reiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dieotyledone Pflanzen sowie Gymnospermen sind bevorzugt. Eingeschlossen sind reife Pflanze, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte) , Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledo- nen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigo- nella, Vigna, Citrus, Linu , Geranium, Manihot, Daucus, Arabidop- sis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura,
Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Penni- setum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Ama- ranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodia- ceae, Compositae, Crueiferae, Cueurbitaceae, Labiatae, Legumino- sae-, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculia- ceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Alfalfa, Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidear- ten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Crueiferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps) , campestris (Rübe) , oleracea cv Tastie (Kohl) , oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
- Cueurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispiels- weise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz be- sonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie. beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte) ) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Seiarie) ) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annu (Pfeffer) und andere mehr,
sowie Lein, Soya, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi .
Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber' nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose) ; Pteridophy- ten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachen- bäum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Bei- spiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen -der Gattung Haematococcus , Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis .
Am meisten bevorzugt sind Pflanzen, die zur Olproduktion geeignet sind, wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel (Carthamus tinctorius) , Ölbaum, Soja, Erdnuß, Rizinus, Ölpalme, Mais, Weizen, Kakaostrauch oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss, Kokosnuß oder Mandel. Am meisten bevorzugt sind ferner Arabidopsis, Baumwolle, Flachs, Lein.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Ferner bevorzugt sind Protozoen wie Dinoflagellaten genannt.
Aus vorgenannten Organismen sind insbesondere die bevorzugt, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färberdistel, Rizinus, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevi- siae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume oder Saccharomyces cerevisiae.
Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüch- tet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu' beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert werden.
Die Einführung einer erfindungsgemässen transgenen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder 'Samen) , kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgene Expressionskassetten enthalten sind. Die transgene Expressionskassette kann in den Vektor (zum Beispiel ein Plasmid) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das re- kombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Die Einführung einer erfindungsgemässen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacte- rien sein. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Ein- führung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen. Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA, RNA oder Protein in die entsprechende Wirtzelle eingebracht wird. 5
Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537) . So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch
10 Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol , permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden
15 Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene
20 100:247-250; Scheid et al . (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al . (1987) Nature 327:70-73 ,- Howell et al . (1980) Science 208:1265 ; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231 ; DeBlock et al . (1989) Plant
25 Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology
('Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
30 Die Desaturasen bzw. Konjugasen lassen sich zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Organsimen, bevorzugt von Pflanzen verwenden, so daß diese ein de novo Produzent eines oder mehrerer von Lipiden hergeleiteter Produkte, wie beide CLA-Isomere, wird. Pflanzen werden nach Transformation zunächst
35 regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. angebaut.
Klonierungsvektoren und Techniken zur genetischen Manipulation von Ciliaten und Algen sind dem Fachmann bekannt (WO 98/01572; 40 Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1(3) .239-251; Duna- hay et al. (1995) J Phycol 31:10004-1012).
Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus 45 Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida) , Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, 15-38; Jenes B et al . (1993)' Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Haiford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56 (1) : 62-73 ) . Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation' und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion. Im Falle dieser "direkten" Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe, pBR322, M13mp Reihe, pACYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Trans- formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid) , das auf die Pflanze nach Agrobaterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Alternativ können durch Agro- bakterium auch binäre vektoren (Mini-Ti-Plasmide) auf Pflanzen übertragen und in deren Genom integriert werden. Die Agrobacteri- um-vermittelte Transformation ist am besten- für dieotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Trans- formationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen. Verfahren zur Agrobakterium vermittelten Transformation sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al . (1985) Science 225:1229f. Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskas- sette verbunden. Für die Agrobacterium Tranformation werden bevorzugt binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Se- lektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz . Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin ver- leiht. Das in diesem Fall als' WirtsOrganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwen- düng von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Bi- nary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblas- serda , Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell er- hältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBINl9 (Clontech Laboratories, Inc. USA; Bevan et al.(1984) Nucl Acids Res 12:8711), pBinAR, pPZP200 oder pPTV.
Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Raps, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschliessend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF, Vectors for Gene
Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38; Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, in.- Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, S.128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225). Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemässen Desaturase oder Konjugase, pro- Desaturase oder Konjugase oder proOIL Nukleinsäuren oder transgenen Expressionskassetten oder Vektoren enthalten.
Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von un- transformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann bei- spielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s.o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der 5 Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransfor- ierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol
10 21 (5) : 871-884) , das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht . Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al . (1986)
15 Plant Cell Reports 5:81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten vorzugsweise kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
20
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zell-
25 massen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Entsprechende Verfahren sind beschriebe (Fennell et al . (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al . (1994) Theor Appl
30 Genet 89:525-533).
.Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektions e-
35 thoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression einer Desaturase oder einer proOIL-Nukleinsäure- sequenz und deren Auswirkung auf die CLA und/oder Fettsäure Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
40
Aus den transgenen Organismen werden die bevorzugt ausgewählt, die im Vergleich zum untransformierten Wildtyp eine verbesserte CLA Produktion aufweisen. Eine verbesserte CLA Produktion bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Beispiel die künst-
45 lieh erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung wenigstens einer Verbindung aus der Gruppe der CLA deren Estern wie beispielsweise CoA-Ester oder Glyceridester, in dem transgenen Organismen gegenüber dem nicht gentechnisch modifizierten Ausgangsorganismus . Dabei ist die CLA Produktion in dem transgenen Organismus gegenüber dem nicht-gentechnisch modifizierten Ausgangsorganismus bevorzugt um 10 %, besonders bevorzugt um 50 %, ganz besonders bevorzugt um 100 % erhöht. Verbessert kann ebenfalls eine vorteilhaft veränderte qualitative Zusammensetzung des CLA-Gemisches bedeuten, d.h. einer gegenüber dem Ausgangsorganismus erhöhten relativen Anteil an (9Z,11E)-CLA und/oder (10E,12Z)-CLA.
Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.- , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.- , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Kosmetika oder Feinchemikalien, wie freien Fettsäuren, insbesondere CLA. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung zur Herstellung von CLA enthaltenen Lipiden, bevorzugt Triglyceriden.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.
Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst -aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare Lö- sungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C*bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Überschuß an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuß von Lö- sungmittel zu Biomasse von 1:4. Das Lösungmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem C02 erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.
Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit pola- ren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über Säulen ist möglich.
Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyeeriden werden diese in üblicherweise verseift.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind pflanzliche Öle, Fettsäuregemische und/oder Triglyceridgemische mit einem erhöhten Ge- halt an ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt an CLA, die nach den oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika. Hierzu werden diese den Nahrungsmitteln, dem Tierfutter, den Kosmetika oder Pharmazeutika in üblichen Mengen zugesetzt.
Sequenzen
1. SEQ ID NO: 1: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Ell-desaturase aus Epiphyas postvittana.
5
2. SEQ ID NO: 2: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Ell-desaturase aus Epiphyas postvittana.
3. SEQ ID NO: 3: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA 10 Z/EU desaturase aus Ostrinia nubilalis.
4. SEQ ID NO: 4: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z/Ell desaturase aus Ostrinia nubilalis.
15 5. SEQ ID NO: 5: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z/Ell desaturase aus Ostrinia furnacalis .
6. SEQ ID NO: 6: .Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z/Ell desaturase aus Ostrinia furnacalis.
20
7. SEQ ID NO: 7: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δll desaturase aus Helicoverpa zea.
8. SEQ ID NO: 8: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δll 25 desaturase aus Helicoverpa zea.
9. SEQ ID NO: 9: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δll desaturase aus Trichoplusia ni.
30 10. SEQ ID NO: 10: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δll desaturase aus Trichoplusia ni.
11. SEQ ID NO: 11: Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl- CoA Δll desaturase aus Argyrbtaenia velutinana.
35
12. SEQ ID NO: 12: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Δll desaturase aus Argyrotaenia velutinana.
13. SEQ ID NO : 13 : Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Acyl- 40 CoA Z10 Desaturase aus Planotortrix octo.
14. SEQ ID NO: 14: Proteinsequenz kodierend für eine Acyl-CoA Z10 Desaturase aus Planotortrix octo.
45 15. SEQ ID NO: 15: 5 λ -ATYACHGCCGGKKMYCAYMG-3 λ 16. SEQ ID NO: 16: 5 -GGRAABDYGTGRTGGWAGTT-3 λ
17. SEQ ID NO:' 17: 5 * -CCCCAYCRNCTSTGGWCNCA-3 '
18. SEQ ID NO: 18: 5 x-CCCTCTAGARTGRRWARTTRTGRWA-3 '
19. SEQ ID NO: 19: 5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3 λ
20. SEQ ID NO: 20: 5 v-ACATAACTAATTACATGAT-3 v
Beispiele
Die Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert . Dabei werden Abkürzungen mit folgender Bedeutung verwendet: - "
Allgemeine Methoden
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie- rungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro- phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht der Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S.896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, AgaroseGelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463-5467) .
Beispiel 1: Anzucht der Lepidoptera Insekten
Die Insekten werden in Terrarrien auf geeigtneten Wirtspflanzen gehalten. Die Wachstumsbedingungen sind: 27°C, Tag-Nacht-Rhythmus: 14 h Licht, 10 Stunden Dunkelheit. Insekten bzw. Larven werden zweimal in der Woche auf frische Pflanzen umgesetzt. Puppen werden gesammelt und Männchen und Weichchen werden getrennt in Terrarien bis zum Schlüpfen der fertigen Insekten gehalten. Etwa 1 5 bis 2 Tage nach Schlüpfen der Insekten können die Pheromondrüsen isoliert weren.
Beispiel 2: Isolierung von Desaturase- oder Konjugase cDNAs mittels degenerierten Primer 10
Die Pheromondrüsen werden aus dem Hinterleib erwachsener Motten isoliert und in N2 liq. eingefroren bis gesamt RNA isoliert wird mittels, zum Beispiel, TRIzol (GIBCO/BRL) nach Herstellerangaben. Erfahrungsgemäss kann aus ungefähr 30 mg Frischgewebe etwa 60 bis 15 80 μg gesamt RNA isoliert werden. Etwa 5 μg gesamt RNA wird eingesetzt um eine Erststrang-cDNA mit einen oligo (dT) -Primer herzustellen. Hierzu kann zum Beispiel.den SMART RACE cDNA Amplifica- tion Kit (CLONTECH) nach Herstellerangaben verwendet werden. Diese Einzelstrang-cDNA dient als Matrice für eine PCR worin den 20 zentralen Bereich der Desaturase/Konjugase-cDNA amplifiziert wird. Zwei degenerierte Primer werden so entworfen, dass sie die konservierte zentrale Region der Desaturasen/Konjugasen aus Lepidoptera amplifizieren können, und in folgenden PCR-Protokol eingesetzt: 25
5 μl verdünnter Einzelstrang-cDNA 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 0,5 μM 5 '-Primer (SEQ ID NO 8) 0,5 μM 3 '-Primer (SEQ ID NO 9) 30 10 μl 5X Advantage 2 reaction buffer (CLONTECH) -
1 μl 50X Advantage 2 DNA PolymeraseJ mix (CLONTECH) H20 add. 50 μl
Alternativ werden als Primerpaar die degenerierten Primer mit der 35 SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11 für die Amplifikation der zentrale Desaturasenregion verwendet.
Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
40 1 Schritt mit: 94°C (5 min)
35 Zyklen mit: 94°C (30 sec) , 56°C (30 sec) , 72°C (3 min)
1 Schritt mit: 72°C (10 min)
Warteposition: 4°C
45 Das PCR-Produkt wird direkt beispielsweise in den linearisierten TOPO TA PCR 2.1 Vector (INVITROGEN) ligiert und anschließend in E.coli TOP 10 kompetente Zellen (INVITROGEN) transformiert. Posi- tive Kolonien werden nochmals amplifiziert, die Plasmid-DNA auf- gereinigt (QIAGEN Plasmid Mini Kit) und anschließend sequenziert.
Auf Grund der gewonnene Sequenzinformation können gen-spezifische Primer abgeleitet werden und zur Aplifizierung von 5'- und
3 '-Bereiche eingesetzt werden (SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH) ) . Auch diese PCR-Produkte werden in den TOPO TA PCR 2.1 Vector (INVITROGEN) ligiert und anschließend in TOP 10 kompetente Zellen (INVITROGEN) transformiert. Positive Kolonien werden nochmals amplifiziert und die Plasmid-DNA aufgereinigt (QIAGEN Plasmid Mini Kit) und anschließend sequenziert.
Aus den so generierten Fragmenten, kann die vollständige Sequenz einer Desaturase/Konjugase mittels Standardklonierungstechniken zusammengesetzt und zur Charakterisierung beispielsweise in den pYES2 Vektor (INVITROGEN) zur Hefe-Expression überführt werden. Saccharomyces INVScl (INVITROGEN) werden mit den entsprechenden pYES2-Expressionsvektoren mittels eines modifizierten PEG/Lithiü- macetat-Protokolls transformiert (Ausubel et al. (1996) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York) . Nach der Selektion auf CMdum-Agarplatten mit 2 % Glucose werden vier pYES2DESAT-Transformanten (pYES2DESATa-d) und eine pYES2-Transformante zur weiteren Züchtung und funktionellen Expression ausgewählt.
Beispiel 3: Funktionelle Expression einer Desaturase/Konjugase in Hefe
Vorkultur: 20 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2 % (Gew. /Vol.) Raffi- nose wurden mit den transgenen Hefeklonen (pYES2DESATa-d, pYES2) angeimpft und 3 T bei 30°C, 200 rpm gezüchtet, bis eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 1,5-2 erreicht war.
Hauptkultur: Für die Expression wurden 20 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2 % Raffinose und 1 % (Vol. /Vol.) Tergitol NP-40 mit den entsprechende Substrate, wie Stearinsäure, Palmitinsäure oder Myri- stinsäure, auf eine Endkonzentration von 0,003 % (Gew. /Vol.) angereichert. Die Medien wurden mit den Vorkulturen auf eine OD600 von 0,05 angeimpft. Die Expression wurde bei einer OD600 von 0,2 mit 2 % (Gew. /Vol.) Galaktose für 16 Std. induziert, wonach die Kulturen eine OD600 von 0,8 bis 1,2 erreicht hatten.
Fettsäureanalyse: Die Gesamt-Fettsäuren wurden aus Hefekulturen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert. Davon wur- den Zellen von 5 ml Kultur mittels Zentrifugation (1000 x g,
10 min, 4°C) geerntet und einmal mit 100 mM NaHC03 , pH 8,0, gewaschen, um restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Zur Her- Stellung der Fettsäuremethylester (FAMES) werden die Zellsedimente schockgefroren in N2 liq. und unter N2-Gas bei 30aC lyo- phyllisiert. Das Pellet wird in 1 % Natriummethoxyd in Methanol homogenisiert und für 20 minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 5 Anschließend werden gleiche Volumen von 1 M NaCl und n-Heptan zugegeben, gemischt und der Überstand in ein GC-Rörchen überführt. Die Proben werden auf einer DB-Wax-Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm; Agilent J & W) in einem Hewlett Packard-6890-GasChromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die
10 Ofentemperatur wurde von 60°C (5 min halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min (20 min halten) und schließlich auf 250°C (30 min halten) mit einer Rate von 20°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwendet (1,6 ml/min) . Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA)
15 identifiziert. Als Standard werden dazu vorzugsweise nachfolgende Fettsäuren verwendet: c9-16:l, t9-16:l, 18:0, c9-18:l, t9-18:l, cll-18:l, tll-18:l, c9,cl2-18:2, t9,tl2-18:2, c9,tll-18:2, tlO, cl2-18 :2. (Die Nomenklatur der Standards entspricht der für Fettsäuren üblichen und gibt zunächst Konfiguration (c=cis oder
20 t=trans) und Stellung der Doppelbindung bzw. Kettenlänge der Fettsäure an. )
Weitere Fütterungsexperimente mit verschiedenen anderen Fettsäuren (z.B. Laurinsäure, trans-Vaccensäure, cis-Vaccensäure, 25 ElO-Octadecensäure oder ZlO-Octadecensäure) können zur detaillierteren Bestätigung der Substratselektivität dieser Desaturase/ Konjugase durchgeführt werden.
Beispiel 4: Expressionsklonierung von Desaturase/Konjugase aus 30 Lepidoptera in Saccharomyces cerevisiae
a) Herstellung der cDNA-Bibliothek
Die Pheromondrüsen werden aus dem Hinterleib erwachsener Motten 35 isoliert und in N2 liq. eingefroren bis gesamt RNA isoliert wird mittels, zum Beispiel, TRIzol (GIBCO/BRL) nach Herstellerangaben. Erfahrungsgemäss kann aus ungefähr 30 mg Frischgewebe etwa 60 bis 80 μg gesamt RNA isoliert werden. Etwa 5 μg gesamt RNA wird eingesetzt um eine cDNA-Bibliothek herzustellen. Hierfür kann zum Bei- 40 spiel den SMART cDNA Library Construction Kit (CLONTECH) nach
Herstellerangaben verwendet werden. Die isolierte doppelstrangige cDNA wird letzendlich in den linearisierten pYES2 (INVITROGEN) Hefeexpressionsvector ligiert. Dazu wird in den pYES2 zuerst die Multiple-Cloning-Site des pTriplEx2-Vektors (CLONTECH) inser- 45. tiert. In den so modifizierten Vekor wird dann die doppelstrangige cDNA nach Verdau mit SfilA sowie SfilB gerichtet kloniert. b) Hefetransformation
Etwa 1,5 μg Plasmid-DNA wird mit den Saccharomyces cerevisiae EASY COMP Transformation kit (INVITROGEN) in INVScl (INVITROGEN) transformiert nach Herstellerangaben. Zwei 50 μl-Ansätze werden auf Selektionsmedium in eine große eckige Petrischale (245x245 mm) ausplatiert, und für 3 tage bei 30°C inkubiert.
c) Anzucht der Hefen in Microtiterplatten
Einzelne Kolonien werden mit ein Pick-Roboter in Microtiterplatten (MTP) überführt. Die Vorkultur findet in 200 μl Medium [1 x CSM-Ura; 1 x YNB ohne Aminosäuren und Zucker; 0,5 % Raffinose; 5 % Glycerin; 40 mg / 1 Adeninsulfat; 0,5 % Ammoniumsulfat] für 72 Stunden bei 30°C und 250 Umdrehungen/Minute statt. Durch Zugabe eines durchschnittlichen Volumens aus der Vorkultur wird eine . OD600 von 0,2 in der Hauptkultur eingestellt. Die Hauptkultur findet in 1 ml Medium [1 x CSM-Ura; 1 x YNB ohne Aminosäuren und Zucker; 0,5 % Raffinose; 2 % Galactose; 0,2 % Tergitol NP-40; 40 mg/1 Adeninsulfat ; 0,5 % Ammoniumsulfat; 0,3 mM Fettsäure-Substrat] für 2 bis 3 Wochen bei 16°C und 250 Umdrehungen/Minute, bis einer OD600 von 3 bis 4 erreicht wird, statt.
d) Fettsäureanalyse
Die Hefezellen werden sedimentiert (1000 x g, 10 min, 4°C) und bis zur weitere Verabeitung bei -80°C gelagert. Zur Herstellung der Fettsäuremethylester (FAMES) werden die Zellsedimente schockgefroren in N2 liq. und unter N2-Gas bei 30eC lyophyllisiert . Das Pellet wird in 1 % Natriummethoxyd in Methanol homogenisiert und für 20 minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden gleiche Volumen von 1 M NaCl und n-Heptan zugegeben, gemischt und der Überstand in ein GC-Gefäß überführt. Die Proben werden auf einer DB-Wax-Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm; Agilent J & W) in einem Hewlett Packard-6890-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 60°C (5 min- halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min (20 min halten) und schließlich auf 250°C (30 min halten) mit einer Rate von '20°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwen- det (1,6 ml/min) . Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA) identifiziert. Dabei werden die gleichen Standards - wie in Beispiel 3 aufgeführt - verwendet . Weitere Fütterungsexperimente mit verschiedenen anderen Fettsäuren (z.B. Laurinsäure, trans-Vaccensäure, cis-Vaccen- säure, ElO-Octadecensäure oder ZlO-Octadecensäure) können zur de- taillierteren Bestätigung der Substratselektivität dieser Desaturase oder Konjugase durchgeführt werden.
e) Plasmidpräparation der positiven Hefen:
Einzelklone welche positiv getestet worden sind werden erneut über 24 Stunden bei 28°C in 10 ml Minimalmedium [1 x CSM-Ura; 1 x YNB w/o AA, sugars,- 2 % glucose; 40 mg / 1 Adeninsulfat] angezogen und bei einer OD600 größer als 3 durch Zentrifugation sedi- mentiert. Das Hefepellet wird für 20 Minuten bei 37°C in 400 μl SCE-Puffer [1,2 M Sorbit; 0,1 M Na-Citrat, pH 7,0; 10 mM EDTA; 1 mg / ml Lytikase] inkubiert. Anschließend wird 400 μl STE-Puffer [2 % SDS; 50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA] zur Zelllyse zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Präzipita- tion des Zellproteins wird 200 μl 5 M Natriumacetat zugegeben und 30 Minuten auf Eis gestellt. Nach Zentrifugation wird den Überstand überführt und mit 2,5-fachem Volumen Ethanol gefällt. Das sedimentierte Pellet wird mit 70 % Ethanol gewaschen und letztendlich in sterilem Wasser aufgenommen. Die Sequenz der DESATU- RASE/KONJUGASE kann gegebenenfalls durch Sequenzierung unter Verwendung von Vector spezifischen Primern (SEQ ID NO: 12 und 13) ermittelt werden.
Beispiel 5 : Manipulation der pflanzlichen Fettsäure-Biosynthese
a) Erzeugung von DNA Konstrukten zur Expression von Desaturasen/ Konjugasen aus Lepidoptera in transgenen Pflanzen.
Zur Herstellung von Chimären DNA Konstrukten zur Erzeugung trans- gener A.thaliana bzw. B.napus Pflanzen, die die Desaturasen/Kon- jugasen aus Lepidoptera exprimieren, wird der Vektor pBinAR verwendet (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sei 66:221-230). Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al. (1980) Cell 21 (1) :285-294) sowie das Ter inations- Signal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al . (1984) EMBO J 3:835-846) . Nach Klonierung der DESAT/KONJ in diesen Vektor erfolgt Erzeugung transgener A.thaliana bzw. Brassica napus Pflanzen.
b) Herstellung transgener Arabidopis thaliana Pflanzen
Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (Columbia) werden mit dem Agrabacterium tumefaciens Stamm (GV3101 [pMP90] ) auf Grundlage einer modifizierten Vacuuminfiltrationsmethode transformiert (Clough S und Bent A (1998) Plant J 16 (6) :735-43; der Bechtold N et al. (1993) in: Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants . CRAcad Sei Pa- ris 1144 (2) :204-212) . Die verwendeten Agrobacterium tumefaciens Zellen waren im Vorfeld mit den Plasmiden transformiert worden.
Samen der Primärtransformanden werden auf Grundlage der Antibio- 5 tikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet .
b) Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen
10
Die Herstellung transgener Rapspflanzen orientiert sich an einem Protokoll von Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Po- trykus I und Spangenberg G (eds . ) Springer Lab Manual , Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der 15 verwendeten Medien und Puffer angegeben ist .
Die Transformationen erfolgen mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 [pMP90] . Zur Transformation werden die Plasmide pBinAR-TkTP/Vit E-AT verwendet. Samen von Brassica napus var. We-
20 star werden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in l%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen werden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10 bis
25 15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) werden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Ex- plantate werden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in
30 einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusin- duktions edium werden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubier .
Vom Agrobacterium Stamm wird eine Übernachtkultur bei 29°C in Lu- 35 ria Broth-Medium mit Kanamycin (20mg/l) angesetzt, davon 2ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer ODεoo von 0.4 bis 0.5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wird das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der 40 Lösung wird durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine ODβoo von 0.3 eingestellt .
Aus den Raps-Explantaten wird das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobakterium-Lösung hinzuge- 45 fügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobac- terien-Suspension wird entfernt, die Raps-Explantate für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wird für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wird durch Wegnahme des Kallus-Induk- tionsmediums gestoppt und die Explantate zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explantaten wird in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.
Zur Regeneration werden jeweils 20 bis 30 Explantate in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthalten. Die Petrischalen werden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/ 8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage werden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen werden wie von Bade, J.B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus I und Spangenberg G (eds.) Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) be- -schrieben durchgeführt.
c) Analyse des Fettsäuremuster in den transgenen Pflanzen
Die Samen transgener Pflanzen werden direkt in 1 % Natriummetho- xyd in Methanol homogenisiert und für 20 minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden gleiche Volumen von 1 M NaCl und n-Heptan zugegeben, gemischt und der Überstand in ein GC-Rör- chen überführt . Die Proben werden auf einer DB-Wax-Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm; Agilent J & W) in einem Hewlett Pak- kard-6890-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 60°C (5 min halten) bis 200°C mit einer Rate von 20°C/min (20 min halten) und schließlich auf 250°C (30 min halten) mit einer Rate von 2O°C/min programmiert. Stickstoff wurde als Trägergas verwendet (1,6 ml/min) . Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME- Standards (SIGMA) identifiziert. Dabei werden die gleichen Standards - wie in Beispiel 3 aufgeführt - verwendet .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von ungesättigte Fettsäuren u fas- senden Trigylceriden, dadurch gekennzeichnet, dass in einem pflanzlichen Organismus mindestens einer Fettsäuredesaturase aus Insekten der Ordnung Lepidoptera transgen exprimiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuredesaturase in Fettsäuren, Fettsäure-CoA-Estern oder anderen Fettsäurederivaten eine Doppelbindung an der Position C8, C9, CIO, Cll oder C12 erzeugen kann.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuredesaturase spezifisch eine eis oder trans Doppelbindung in Fettsäuren, Fettsäure-CoA-Estern oder anderen Fettsäurederivaten mit einer Kettenlänge der Fettsäure von 16 oder 18 C-Atomen erzeugt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäuredesaturase eine Homologie von' mindestens 65% zu einer der Fettsäuredesaturasen beschrieben durch SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 oder 14 hat.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz der Fettsäuredesaturase
a) in ihren sense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 15 oder 17 enthält, oder
b) in ihren antisense-Strang eine Sequenzmotiv beschrieben durch SEQ ID NO: 16 oder 18 enthält.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, dass die ungesättigten Fettsäuren konjugierte Linolsäure umfassen.
7. Triglyceride hergestellt mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Verwendung von Triglyeeriden nach Anspruch 7 zu Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Kosmetika oder Feinchemikalien.
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