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WO2003044209A1 - Novel tetronic acid derivative - Google Patents

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Publication number
WO2003044209A1
WO2003044209A1 PCT/JP2002/012237 JP0212237W WO03044209A1 WO 2003044209 A1 WO2003044209 A1 WO 2003044209A1 JP 0212237 W JP0212237 W JP 0212237W WO 03044209 A1 WO03044209 A1 WO 03044209A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vst
cells
grp78
strain
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2002/012237
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuo Shinya
Takashi Tsuruo
Akihiro Tomida
Hae-Ryong Park
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Todai TLO Ltd
Original Assignee
Todai TLO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2002/009279 external-priority patent/WO2003044208A1/ja
Application filed by Todai TLO Ltd filed Critical Todai TLO Ltd
Priority to CA002468046A priority Critical patent/CA2468046A1/en
Priority to AU2002366040A priority patent/AU2002366040A1/en
Priority to JP2003545830A priority patent/JPWO2003044209A1/ja
Priority to EP02803567A priority patent/EP1462526A4/en
Publication of WO2003044209A1 publication Critical patent/WO2003044209A1/ja
Priority to US10/852,766 priority patent/US7358233B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to a novel tetronic acid derivative, and particularly to a tetronic acid derivative derived from actinomycetes.
  • the endoplasmic reticulum is an organ where protein synthesis is performed, and is an organelle that folds the produced protein, modifies the sugar chain, and transports the protein.
  • endoplasmic reticulum stress is induced by disruption of physiological balance or external factors such as protein folding, sugar chain modification, and protein transport normally performed in the endoplasmic reticulum.
  • drugs such as tunicamycin ⁇ brefeldin A induce ER stress.
  • Sinicamycin inhibits glycosylation of proteins in the endoplasmic reticulum, causing unfolding protein to accumulate in the endoplasmic reticulum.
  • Such accumulation of unfolded proteins causes ER stress.
  • Brefeldin A inhibits protein transport between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus, thereby accumulating proteins and inducing endoplasmic reticulum stress.
  • the ER In response to these ER stresses, the ER has a stress response mechanism.
  • Ire a stress sensor, is known to recognize unfolded proteins, induce the expression of molecular chaperones such as GRP78, and promote protein folding.
  • GRP78 molecular chaperones
  • GRP78 molecular chaperones
  • PS1 preselinin-1
  • ER endoplasmic reticulum
  • regulating the endoplasmic reticulum stress response mechanism by molecular chaperones such as GRP78 expression is important for treating diseases such as Alzheimer's disease and improving sensitivity to anticancer drugs. Further, such a substance capable of regulating the endoplasmic reticulum stress response mechanism is useful for the development of a therapeutic drug for Alzheimer's disease or an anticancer drug. Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide a substance capable of regulating an endoplasmic reticulum stress response mechanism and a method for producing the same.
  • the present inventors have tried to search for a substance capable of regulating the expression of GRP78 from natural materials using the expression of GRP78, one of molecular chaperones, as an index.
  • an expression vector holding a cassette in which a luciferase gene was linked as a repo overnight gene was introduced into cells downstream of the GRP78 promoter, and the cells were used for screening for the compound.
  • the cells were contacted with various crude drugs, fungi, actinomycetes and other metabolites, and further administered with tunicamycin to induce ER stress.
  • GRP78 was increased due to the induction of endoplasmic reticulum stress by the administration of tunicamycin, but the increased expression was suppressed in the group to which a metabolite derived from a certain actinomycete Streptomyces strain was added. Purification of the active substance from this metabolite using the activity that can suppress the expression of GRP78 despite the induction of endoplasmic reticulum stress as an index resulted in the isolation and identification of a novel tetronic acid derivative, versipelostatin (also known as JL68). Was successful. Also Strain producing this active substance could also be identified.
  • the present invention provides this novel tetronic acid derivative versipelostatin, a method for producing the same, and a microorganism that produces the compound. Specifically, the present invention provides:
  • a versipelostatin compound represented by
  • composition comprising the compound according to (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • An anticancer agent comprising the compound according to (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the anticancer agent according to (7) which induces cell death on cancer cells in a physiological stress state.
  • VST novel tetronic acid derivative vers ipelos tat in
  • the novel tetronic acid derivative vers ipelos tat in (hereinafter abbreviated as VST) of the present invention has a structure represented by the above formula (I), and has physicochemical properties shown in Examples described later.
  • the VST compound of the present invention also includes salts, solvates and the like.
  • VST salts include alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, lithium salt, etc.), alkaline earth metal salts (calcium salt, magnesium salt, etc.), metal salts (aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt) Salts, nickel salts, etc.), inorganic salts (acetates, ammonium salts), organic amine salts (dibenzylamine salts, dalcosamine salts, ethylenediamine salts, getylamine salts, triethylamine salts, dicyclohexylamine salts, jetanolamine salts, tetramethyl salts) Ammonium salts) and amino acid salts (glycine salts, lysine salts, arginine salts, orditin salts, asparagine salts, etc.).
  • VST has a hydroxyl group in the molecule as shown in the above formula (I), and can be converted into derivatives of various ethers, esters and the like at those functional groups. These derivatives are included in the present invention as long as they retain VST biological activity.
  • the above-mentioned VST can be obtained by culturing the producing microorganism and collecting it from the culture.
  • the actinomycete Streptomyces' Vaciaris 4083-SVS6 strain can be preferably used.
  • S. cerevisiae var. 4083—SVS6 strain was isolated from a soil sample collected in Miyoshi City, Hiroshima Prefecture by the present inventors. This strain has been identified according to the method of the International Streptomyces' Project (ISP) and has the following somatic characteristics: It is on the street.
  • ISP International Streptomyces' Project
  • This strain does not disrupt the basal hypha.
  • These aerial hyphae form a long main axis, and form a spiral spore chain of 10 to 50 or more at the irregularly branched tip.
  • the spores are 0.3-0.5 m wide and 0.7-1.0 m long, non-motile, cylindrical or elliptical, with a smooth spore surface. Black moistening of the spore surface is observed on glycerin-asparagine agar, inorganic salt starch agar, yeast malt agar, oatmeal agar, and the like. Sclerotia, sporangia, and other special forms are not observed.
  • the cell wall chemical type was type (I) having LL-diaminodimeric acid, and the GC content of DNA was 71.3 mol%.
  • Table 1 shows the culture characteristics of this strain when cultured on various culture media for 28 days.
  • the flora color was a gray series on the colony surface, a hygroscopic mass was observed on the spore surface after 2 weeks.
  • the color of the reverse side is a pale yellow to unsharp color such as dark brownish gray, and does not change with pH. No diffusible pigment was observed except for the production of melanin-like pigment.
  • the color tones are based on the Container Harmony Manual (1958 edition) of Container Corporation of America, Inc. (The Color Harmony Manual). Was.
  • This strain is mesophilic and produces melanin-like pigments.
  • This strain is a strain that belongs to the genus Streptomyces (trep tomyces) due to its spirally linked spore form and cell wall chemical type (I). Based on the above properties, a search was made for Streptomyces species listed in the “List of Approved Bacteria Names, 1980” and the list of valid names thereafter, and Streptomyces bacillus as a closely related species was searched. Elected. Table 3 shows a comparison between this strain and this closely related species.
  • Streptomyces bacillus 4083-SVS6 strain was described as the VST-producing microorganism, but the VST-producing microorganism of the present invention is not limited to this.
  • the characteristics of the above-mentioned cells are generally easily mutated and are not constant. The nature of the cells changes naturally, or physical mutagenesis such as X-ray irradiation, scientific mutagenesis such as ethyl methyl sulfonate, or cell engineering mutations such as genetic manipulation It is a well-known fact that it can be modified artificially by means of introduction.
  • the VST-producing microorganism of the present invention is included in the present invention, even if it is a natural mutant or an artificial mutant of the above strain belonging to the genus Streptomyces produced by VST, as long as it can produce VST.
  • a conventional method for culturing actinomycetes (Shinya, K. et al., I. Antibiot. 48: 574-578 (1995)) can be used.
  • a nutrient medium containing a carbon source and a nitrogen source that can be assimilated by microorganisms, and optionally an inorganic salt, an organic nutrient source, and the like can be used as the medium.
  • the above carbon sources include glucose, ara pinose, xylose, fructose, sucrose, rhamnose, and rafinoin.
  • Nitrogen sources include peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, skim milk, soy flour, corn steep liquor, cottonseed flour, casein hydrolyzate, soy protein hydrolyzate, amino acids, urea, etc.
  • Examples include organic nitrogen sources, inorganic nitrogen compounds such as nitrates and ammonium salts, and the like.
  • the above-mentioned carbon source and nitrogen source can be added to the medium alone or in combination.
  • the medium may contain inorganic salts such as sodium salts, potassium salts, ammonium salts, calcium salts, phosphates, sulfates, and carbonates, and cobalt and manganese.
  • Trace metals such as iron, magnesium, etc., trace nutrients capable of promoting the growth of VST-producing strains and VST production, growth promoting substances, precursors, etc. may be added as appropriate.
  • the pH of the medium PH is preferably around neutral, specifically pH 7.0 to 7.6.
  • an antifoaming agent such as a vegetable oil or a surfactant may be appropriately added to suppress foaming during culturing.
  • the cultivation of the VST-producing bacterium is preferably carried out by aerobic culturing such as shaking or aeration-agitation culturing as in the usual culturing of actinomyces.
  • the culturing temperature is preferably 24 to 30 ° C, and more preferably 27.
  • the cultivation time can be usually 2 to 3 days for preculture and 4 to 6 days for main culture.
  • the culture conditions such as culture temperature, aeration rate, and culture time can be appropriately adjusted and selected based on the amount of VST produced.
  • the above culture conditions and the like can be changed according to the type of VST viable bacteria and the culture environment.
  • the culture In order to collect VST from the culture, the culture is centrifuged or filtered to separate the bacterial components, and the supernatant or filtrate is collected. Recovered supernatant or Purification of VST from the filtrate can be performed using the biochemical activity of VST, for example, the GRP78 expression suppression activity shown in Example 1 or the like, or physical properties such as HPLC analysis. . As an example, purification of VST can be performed by the following operation.
  • the culture supernatant or filtrate is extracted with a non-hydrophilic organic solvent such as ethyl acetate, and the extract is concentrated under reduced pressure or dehydrated using a dehydrating agent to obtain crude purified VST.
  • the crude substance is further purified to a pure product by a known method usually used for purifying fat-soluble substances, for example, adsorption column chromatography using a carrier such as silica gel, and HPLC using Senshu Pak (Senshu Ikagaku). be able to.
  • the above purification method is an example, and the present invention is not limited to this method. Therefore, other purification means usually used by those skilled in the art, for example, adsorption column chromatography using another adsorption carrier, gel filtration using a resin for gel filtration, column chromatography, anion exchange or It is also possible to use ion exchange chromatography using a cation exchange resin. These purification means may be used alone or in appropriate combination to separate and purify VST.
  • the VST purified above may be used as a pharmaceutical composition, or may be used as an intermediate for producing a further compound.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition containing VST is not particularly limited, and can be formulated into, for example, tablets, capsules, granules, powders, syrups, and injections. In these formulations, excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, coating agents, and other auxiliary agents are added as long as they do not inhibit VST activity.
  • Such a composition can be an effective composition for treating cancer, Alzheimer's disease, etc., but is preferably used as an anticancer agent.
  • the anticancer agent according to the present invention is preferably an anticancer agent that induces cell death of cancer cells under physiological stress.
  • the physiological stress state include a hypotrophic state and a hypoxic state, but are not limited thereto.
  • the undernutrition state include a glucose-starved state, a low mineral, a low lipid, and a low vitamin, and a glucose-starved state is preferable.
  • the anticancer agent of the present invention directly exhibits an anticancer effect on cancer cells.
  • the anticancer agent can exert a stronger anticancer effect when used in combination with other chemotherapeutic agents or radiation therapy.
  • the anticancer agent of the present invention is an effective anticancer agent for solid tumors.
  • FIG. 1 is a diagram showing the ultraviolet absorption spectrum of VST measured in methanol.
  • FIG. 2 is a diagram showing the ultraviolet absorption spectrum of VST measured in methanol NaOH.
  • FIG. 3 is a diagram showing an ultraviolet absorption spectrum of VST measured in methanol-HC1.
  • FIG. 4 is a diagram showing an infrared absorption spectrum of VST measured by a bromide lithium tablet method.
  • wavelength number 1 is 3454 cm—2 is 2934 cm— 1 and 3 is 2360 cm ” 1
  • 4 is 1758 cm” 1 and 5 is 171 1 cm— 1 and 6 is 1623 cm ” 1 and 7 are 1575 cm - 8 1457 cm one 1, 9 1381 cm one 1, 10 1308 cm "1, 1 1 the 1208 cm- 1, 12 is 1062 cm- 13 is 9 89 cm- 1, 14 is 934 cm" 1
  • 15 indicates 867 ci " 1
  • 16 indicates 830 cm” 1 and 17 indicates 730 cm- 1 signal.
  • FIG. 5 is a diagram showing a VST nuclear magnetic resonance spectrum.
  • FIG. 6 is a diagram showing a 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum of VST.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the inhibitory activity of VST on GRP78 expression.
  • the black symbol indicates the group in which GRP78 expression was induced by adding intracellular endoplasmic reticulum stress by adding VST at different concentrations and then adding tunicamycin.
  • Open symbols indicate the group to which only VST at a different concentration was added and no tunicamycin was added.
  • FIG. 8 shows the results of direct cytotoxicity measurements based on the cell viability when various concentrations of VST were added to various cells. Each symbol corresponds to the cell shown on the right side of the figure.
  • FIG. 9 is a photograph showing the activity of VST to suppress the expression of endogenous GRP78 induced by endoplasmic reticulum stress in HeLa78C6 cells.
  • A shows the dose dependence
  • B shows the evening course
  • C shows the examination for each stress condition.
  • FIG. 10 is a photograph showing whether VST inhibits GRP78 expression induced by various endoplasmic reticulum stresses in cancer cells with enhanced endoplasmic reticulum stress response HT-29 and # 080 cells.
  • A shows HT-29 cells and B shows HT1080 cells.
  • FIG. 11 shows the ability of VST to inhibit colony formation under various ER stress conditions in HT-29 cells.
  • FIG. 12 is a diagram showing induction of apoptosis in HT1080 cells by VST under glucose-starved conditions.
  • FIG. 13 is a graph showing the time course of apoptosis induction by VST in HT1080 cells under glucose-starved conditions.
  • FIG. 14 is a diagram showing the combined effect of the antitumor agents cisplatin and VST effective against solid cancer.
  • FIG. 15 shows the antitumor effect of VST on HT-29 cancer cells in nude mice at the animal level.
  • FIG. 16 is a photograph showing suppression of XBP1 activation which is deeply involved in the induction of GRP78 by VST. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION ''
  • test samples were prepared with the respective metabolites of crude drugs, fungi, and actinomycetes. .
  • the screening system was prepared as follows. Insert the GRP78 promoter region (-132 to +7) containing three ERSEs into the Kpnl-Bglll site of the multicloning site of the pGL3-basic vector (Promega), and reporter downstream of the GRP78 promoter.
  • a vector was constructed in which the luciferase gene was ligated as a gene.
  • a pgk-neo cassette (l, 867 bp) (McBurney et al., Nuclear Acid Res.
  • GRP luciferase vector 1 The vector constructed here (hereinafter referred to as "GRP luciferase vector 1") was introduced into HeLa cells. Transfection into cells was carried out by the lipofectin method using Transastj (Promega). Cells holding the above GRP luciferase vector (these cells are referred to as “HeLa78C6 cells”). ) was selected using a DMEM medium containing G418 (400 g / ml). The selected cells were cultured in a DMEM medium containing 103 ⁇ 4FCS and 400 ig / ml G418 to prepare a HeLa78C6 cell suspension (1.5 ⁇ 10 5 cells, 7 ml).
  • a medium for preculture (containing 10 g starch, 10 g polypeptone, 10 g molasses and 10 g meat extract, adjusted to pH 2 per liter) was prepared and sterilized. The sterilized medium (15 mL) was dispensed into a 50-ml test tube, and this was inoculated aseptically with actinomycetes. After inoculation, the cells were cultured at 27 ° C. for 3 days while shaking the test tube (200 rpm). Next, main culture was performed.
  • the medium for main culture (1 liter Starch 25g Soybean meal 15 g, dry yeast 2g and CAC0 3 4g containing, pH 7. 0) was prepared.
  • the medium (100 ml) of the main culture was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask with a bump, and the preculture (2 ml) was aseptically added thereto. After the addition, the cells were cultured at 27 ° C. for 5 days while shaking (200 rpm).
  • the main culture solution was separated into a culture supernatant and bacterial cells by centrifugation. Using the culture supernatant and the cell product obtained by disrupting the cells, the GRP78 expression inhibitory activity was measured for each fraction by repo overnight analysis in the same manner as in Example 1.
  • Each Ueru of 96 ⁇ E Le plate dispensed the cell suspension (I OO L) min, at 37, and 6 h at 5% C0 2. Thereafter, a solution (10 1) containing the culture supernatant (1 ⁇ 1) or the cell product (1 U) was added, and incubation was carried out at 37 for 30 minutes. Thereafter, a twemycin solution was further added to a final concentration of 2 gZml.
  • luciferase activity in the cells was measured using a luciferase measurement kit. As a result of the measurement, suppression of luciferase activity was observed in the group to which the actinomycetes culture supernatant was added.
  • the actinomycetes 4083-SVS6 strain was cultured in the same manner as in Example 1 except that the scale was increased to prepare a main culture solution (2 liters). 'The culture was centrifuged (10,000 n) in, 10 minutes, and the culture supernatant was collected to remove the cells. The collected culture supernatant was extracted with ethanol acetate and then dehydrated with sodium sulfate. The weight of the crude product after dehydration was 2.57 g. The concentrated acetic acid-ethanol extract after dehydration is concentrated and dried, and then dissolved in a solution of chloroform: methanol (20: 1). This solution is supplied to a silica gel column (column capacity: 3.5 ⁇ 30 cm), and the same solvent Chromatography was performed.
  • the eluted sample was measured by the reporter analysis described in Example 1 above, and an active eluted fraction (250 mg) was separated. Subsequently, the fractions having the above-mentioned activities were collected, concentrated to dryness, dissolved in methanol, and applied to an HPLC column (Senshu Pak: PEGASIL ODS C18, 20 ⁇ 250 marauder, manufactured by Senshu Ichigaku) at 1 ml / min. Chromatography using 80% MeOH at a flow rate of. The eluate was monitored by ultraviolet and visible light (254 nm), and a peak having a retention time of 28 minutes was collected. The collected eluate was dried to obtain 35.7 mg of a pure VST (also known as JL68) compound.
  • VST also known as JL68
  • VST The physicochemical properties of VST are shown below.
  • Example 4 Quantification of VST activity Using the pure VST purified in Example 3, the activity of suppressing the expression of GRP78 promoter was quantified. This quantification was also measured by the same reporter analysis using the luciferase gene as in Example 1. Specifically, HeLa78C6 cells (5 ⁇ 10 5 cels / ml, 1001) were dispensed into a 96-well plate as in Example 1. On the other hand, a VST solution (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 g / ml) diluted step-by-step with a medium was prepared. Diluted to 10% with PBS (-). The solution (101) diluted with PBS was added to a well (100 cell suspension / well).
  • VST alone had no effect on luciferase expression from the GRP78 promoter and was comparable to the relative luciferase activity in cells without sample addition, but responded to endoplasmic reticulum stress due to the addition of tanikimycin. Luciferase expression from GRP78 was increased. However, the increase in expression due to the addition of tunicamycin was suppressed as the concentration of VST increased. These results indicate that VST suppresses the up-regulation of GRP78 expression in response to tunicamycin-induced ER stress.
  • the above reporter analysis and the survival rate when VST was added were measured using various other cultured cells including HeLa cells.
  • HeLa cells human ovarian cancer cells
  • MCF-7 human breast cancer cells
  • PC12NH rat pheochromocytoma
  • MDA-MB-231 human breast cancer cells
  • TIG-3 Human normal fibroblasts
  • HeLa786C cannon human ovarian cancer cells
  • Saos_2 human cancer cells lacking telomerase and p53
  • SUSM-1 human cancer cells lacking telomerase
  • the direct growth inhibitory activity of VST on these cells was measured using the MTT method.
  • the cell suspension (5 ⁇ 10 4 / ml) of each of the above cells was dispensed into each well of a 96-well plate for 100 ⁇ 1 and cultured at 37 ° C. for 6 hours.
  • a VST solution serially diluted in the same manner as in Example 4 was added, and the culture was further performed for 24 hours.
  • a 0.05 g / ml MTT solution (101) was added to each well, and incubation was carried out at 37 for 4 hours. Thereafter, the medium was removed, and DMSO (IOOD was added), and the absorbance was measured at 530 nm (FIG. 8).
  • the results of determining the IC50 from these measured values are shown in Table 5.
  • VST final concentration gZml
  • a slight decrease in viability was observed in a few cell lines.
  • the viability of many cell lines was reduced, but the reduction was up to 50%.
  • Some cell lines still showed no change in viability even at a high concentration of 100 / igZml.
  • the results showed that VST was low in cytotoxicity, and there was no direct cytotoxicity to any of the cells, especially at concentrations of 1 g / ml or less.
  • HeLa78C6 cells were cultured in DMEM medium, VST at each concentration was added 30 minutes before the addition of tunicamycin, and 2 g / ml of tunicamycin was further added, followed by treatment for 18 hours.
  • the cells were collected and GRP78 induction was detected by Western blotting using an anti-GRP78 antibody (Stressgene).
  • Stressgene an anti-GRP78 antibody
  • HeLa78C6 was cultured by the above-mentioned culture method, pretreated with 50 M VST for 30 minutes, and then collected after each addition of tunicamycin, and the protein level of GRP78 was detected by Western blotting. As a result, it was revealed that GRP78 was induced 12 to 18 hours after treatment with 2 ⁇ g / ml of tunicamycin, and that the induction was inhibited by VST (Fig. 9B).
  • Example 6 As a result of Example 6, it was revealed that VST inhibits the induction of endogenous molecular chaperone GRP78 induced by endoplasmic reticulum stress.Therefore, the next cancer cells are those with enhanced endoplasmic reticulum stress response HT-29 cells and ⁇ 080 cells were used to examine the inhibition of GRP78 induction, apoptosis induction, and the effect of combination with other antitumor agents.
  • liver cancer cell HT-29 cells and HT1080 cells were cultured in RMI 1640 medium, and pretreated with 3% and VST for 30 minutes. Next, GRP78 levels 18 hours after each endoplasmic reticulum stress treatment were detected by Western blotting.
  • VST showed that cancer cells HT-29 and And HT1080 cells also inhibited the induction of GRP78 by 2-DG, a physiological endoplasmic reticulum stress, even at a low concentration of 3M.
  • VST did not show a GRP78-induced inhibitory effect on tunicamycin treatment, which is a chemical endoplasmic reticulum stress, even at a concentration of 30 M.
  • tunicamycin treatment which is a chemical endoplasmic reticulum stress
  • VST showed a highly specific inhibitory effect on the endoplasmic reticulum stress response in a glucose starvation test, which is a model that reflects the actual state of solid tumors in the body. This suggests that it is possible to overcome the resistance mechanism of solid tumors where the effects of antineoplastic agents are difficult to appear.
  • VST does not exert an effect on all endoplasmic reticulum stress, but this result indicates that the endoplasmic reticulum stress response pathway is not expressed through a single mechanism.
  • this phenomenon was first clarified in the world by using VST.
  • VST was shown to specifically inhibit the expression of GRP78 by glucose starvation, a physiological endoplasmic reticulum stress. We examined whether cell growth suppression or apoptosis was induced.
  • the HT-29 cells were pretreated with VST at each concentration for 30 minutes, and were treated with tunicamycin, calcium ionophore A23187, glucose starvation and 2-DG stress treatment for 18 hours. Thereafter, the cells were cultured on a plate for one week, fixed with formalin, and colonies were stained and counted by crystal violet staining.
  • VST showed a strong cell growth inhibitory effect under glucose starvation and 2-DG treatment in proportion to the GRP78 induction inhibitory activity (Fig. Lie and D).
  • treatment with tunicamycin did not show a cell growth inhibitory effect as well as GRP78 induction inhibition (FIGS. 11A and B).
  • HT1080 cells were pretreated with VST for 30 minutes, the cells were fixed, the nuclei were stained with propidium iodide, and FACS analysis was performed.
  • VST did not show any effect in the presence of glucose, as did the control, but showed a strong sub-G1 induction after 48 hours in the dark-starch state, suggesting that HT1080 cells induce apoptosis in the glucose-starved state Was done.
  • the number of apoptotic cells in HT1080 cells was extremely limited only by Darcos-starved treatment.
  • FIG. 12B it was suggested that VST induced apoptosis in ⁇ 080 cells under glucose-starved condition in a time-dependent manner.
  • VST specifically induced cell death in glucose-starved cancer cells by inhibiting the induction of GRP78.
  • Enhanced ER stress response promotes survival under malnutrition and has acquired resistance to antitumor agents. Therefore, we decided to study its effects on known antitumor agents.
  • VST alone showed strong apoptosis induction under glucose-starved conditions, so that the effect of combination with other drugs could not be sufficiently examined. Therefore, the activity was maintained even under low glucose against cancer cells. Therefore, the combination effect was examined using cisbratin, which is widely used for solid cancer treatment.
  • cisbratin which is widely used for solid cancer treatment.
  • HT-29 cells were cultured by the above method, pretreated with VST for 30 minutes, and then cultured for 18 hours. Thereafter, the cells were treated with each concentration of cisbratin for 4 hours, and one week later, the ability to form colonies was examined.
  • VST and cisplatin showed enhanced activity under glucose-starved conditions, but it was found that the addition of low concentrations of VST (300 nM and 500 nM) further enhanced the effect of cisplatin. (Fig. 13).
  • Cisplatin is widely used for the treatment of solid cancer, but is known to have strong side effects. Therefore, if the dose can be reduced by VST, it is expected to greatly contribute to the patient's quality of life (Q0L).
  • VST The antitumor effect of VST at the animal level was examined. Specifically, HT-29 cells The transplanted into nude mice were ⁇ the tumor up to 100 Yuzuru 3. After that, each concentration of VST was administered to the tail vein, followed by follow-up, and the tumor was excised at each lapsed day and the size was compared. As a result, as shown in FIG. 14, VST did not show as strong an effect as cisplatin, but showed an antitumor effect. The effect of concomitant use with cDDP (cis bratin) was examined, but the effect of cisplatin was sufficient, and no concomitant effect was observed.
  • cDDP cis bratin
  • VST showed a growth-suppressing effect in a colony formation test, but did not exhibit an apoptosis-inducing effect It became clear.
  • Irela-XBPl pathway which is an endoplasmic reticulum stress response pathway widely stored from yeast to mammalian cells.
  • XBP1 is spliced from the precursor (XBP1 (U)) by endoplasmic reticulum stress and activated by Irela, and becomes an activated form (XBP1 (S)). Binds and induces GRP78 transcription.
  • a plasmid in which a Flag tag was linked to the cloned XBP1 was introduced into # 080, and pretreated with VST for 30 minutes.
  • MG132 which is a proteasome inhibitor was added, and a full-length spliced XBPl was detected using an anti-Flag antibody using a sample prepared from cells cultured for further 6 hours.
  • Fig. 15 shows the results of 2-DG, and the right side shows the formation of spliced forms of XBP1 by treatment with tunicamycin.
  • the spliced form of SBP1 is prone to degradation by the proteasome, making its detection difficult.
  • MG132 a proteasome inhibitor, was added.
  • VST A novel substance has been identified from actinomycetes that can reduce GRP78 expression.
  • a microorganism producing this novel compound, Streptomyces basilis was isolated and identified.
  • This VST suppressed the increase in GRP78 expression induced by the endoplasmic reticulum stress inducer, indicating that VST itself can inhibit GRP78 expression caused by stress response.

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Description

明細書 新規テトロン酸誘導体 技術分野
本発明は、 新規なテトロン酸誘導体に関し、 特に、 放線菌由来テトロン酸誘導 体に関する。 背景技術
小胞体は、 タンパク合成が行われる器官であり、 さらに産生されたタンパク質 の折り畳みや糖鎖修飾さらにはタンパク質の輸送を行うオルガネラである。 近年
、 この小胞体におけるストレスが、 例えばアルツハイマー病 （AD) の発症などの 関連から着目されている。 小胞体ストレスは、 通常小胞体内で行われるタンパク 質の折り畳み、 糖鎖修飾あるいはタンパク質輸送などが生理学的バランスの崩れ や外的因子などにより阻害されることにより誘発されると考えられている。 例え ば、 ッニカマイシン （tunicamycin) ゃブレフ土ルディン A (brefeldin A) など の薬剤は小胞体ストレスを誘発する。 ッニカマイシンは、 小胞体内におけるタン パク質の糖鎖付加を阻害し、 フォールデイングされないタンパク質 （unfolding protein) を小胞体に蓄積させる。 このようなフォ一ルディングされないタンパ ク質の蓄積は、 小胞体ストレスを誘発させる原因となる。 ブレフェルディン Aは 、 小胞体とゴルジ装置の間のタンパク質輸送を阻害することにより、 タンパク質 を蓄積させて小胞体ストレスを誘発させる。
これら小胞体ストレス 対し、 小胞体にはストレス応答機構が備わって^る。 例えば、 ストレスセンサーである Ireはフォールデイングされないタンパク質を 認識し、 GRP78などの分子シャペロンの発現を誘導し、 タンパク質のフォールデ イングを促進することが知られている。 しかしながら、 こうしたストレス応答機 構によっても小胞体ストレスが解消できない場合には、 細胞はアポトーシスによ り死滅することが示唆されている。
小胞体ストレスにおける臨床的な知見もまた報告されている。 家族性アルッハ イマ一病の遺伝的素因の解析では、 主に小胞体 （ER) に存在する膜タンパク質で あるプレセレニン一 1 (PS1) の変異が検出されている。 この PS1変異によりアル ッハイマー病に特徴的な老人斑の形成などの原因となるベータアミロイド産生 を促進することが報告されている以外に、 この変異 PS1を発現する細胞では各種 のアポトーシス刺激に対して感受性が増大し、 アポトーシスが誘導され易くなる ことが報告されている (Guo, Q. ら， J. Neurosci. 17: 4212-4222 (1997) , Guo,
Q. ら， Nat. Med. 5 : 101-106 (1999) )。 こうした PS1 変異による細胞死は、 小 胞体ストレスを低減させ得るような処理、 例えば、 小胞体からのカルシウム放出 を阻害する薬剤ゃ抗酸化剤の処理により抑制されることが示されている。
また一方では、 ヒト癌細胞にストレスを負荷すると、 DNA topoisomerase I Iが 分解されることが判明している。 この際、 癌細胞は、 DNA topoi somerase I Iをタ —ゲットとする抗癌剤 VP-16に耐性を示すことが知られている。 さらに、 このと き分子シャペロンである GRP78の発現が上昇していることが判明している （Yun,
J. ら， Oncol . Res. , 7: 583-590, 1995)。 また、 Proteasome阻害剤を用いたと きの、 ヒト固形癌におけるストレス応答と癌細胞の薬剤耐性を検討した結果、 ス 卜レス応答による Topoi somerase I I の分解が抑制され、 抗癌剤に対する感受性 が向上することが判明している （Ogi so, Y. ら， Cancer Res. , 60 : 2429-2434, 2000)
また、 小胞体ストレスに対する応答は、 固形癌において上昇し、 このストレス 応答上昇が抗癌剤に対する耐性となり得ることが示唆されている。 この癌細胞 上述した GRP78などの分子シャペロンの誘導を阻害することにより、 抗癌剤に対 する感受性が向上することも報告されている （Koomagi, R.ら， Ant icancer Res.
19:4333—6 (1999)、 Fernandez, P. M.ら， Breas t Cancer Res. Treat. 59 : 15-26 ( 2000)、 Katschinski, D.M.ら， J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127:425-32(2001) )o また、 GRP78 は抗癌剤の優れたターゲットであることが判明している （Jamor a, C. ら， Pro Natl. Acad. Sci. 93: 7690-7694, 1996; Toiida, A. and Ts uruo, T. , Anti-Cancer Drug Design, 14: 169-177, 1999; Miyake, H. ら， Ca ncer Cells. J Cell. Biochem., 77: 396-408, 2000; Lee, AS.， TRENDS in Bi ochem. Sci., 26: 504-510, 2001)。
このように GRP78発現などの分子シャペロンによる小胞体ストレス応答機構を 調節することは、 アルツハイマー病などの疾患の治療ゃ抗癌剤に対する感受性の 向上に重要となる。 さらに、 このような小胞体ストレス応答機構を調節し得る物 質は、 アルツハイマー病の疾患の治療薬や制癌剤の開発に有用となる。 発明の開示
そこで、 本願発明は、 小胞体ストレス応答機構を調節し得る物質ならびにその 製造方法を提供することを目的とする。
上記課題に鑑み、 本願発明者らは、 分子シャペロンの一つ GRP78の発現を指標 として、 この GRP78の発現を調節し得る物質を天然材料中から探索することを試 みた。 この探索では、 GRP78プロモータの下流にレポ一夕一遺伝子としてルシフ エラ一ゼ遺伝子を連結させたカセットを保持した発現べクタ一を細胞に導入し、 この細胞を該化合物のスクリーニングに用いた。 スクリーニングでは、 この細胞 に種々の生薬、 かび、 放線菌などの代謝産物を接触させ、 さらにッニカマイシン を投与し小胞体ストレスを誘発させた。 一般にッニカマイシン投与による小胞体 ス卜レス誘発に起因した GRP78の発現上昇が見られたが、 ある放線菌ストレプ卜 マイセス属の菌株由来の代謝産物を添加した群ではその発現上昇が抑制された。 このように小胞体ストレス誘発時にもかかわらず GRP78の発現を抑制し得る活性 を指標として、 この代謝産物から活性物質を精製した結果、 新規テトロン酸誘導 体 versipelostatin (別名 JL68) 化合物を単離、 同定することに成功した。 また 、 この活性物質を産生する菌株も同定することができた。
上記知見より、 本発明は、 この新規テトロン酸誘導体 versipelostatinおよび その製造方法、 さらには該化合物を生産する微生物を提供する。 具体的には、 本 発明は、
Figure imgf000006_0001
で示される versipelostatin化合物、
(2) ストレブトマイセス属に属する上記 （1) 記載の化合物の生産菌を培養し 、 その培養物から該化合物を採取する、 上記 （1) 化合物の製造方法、
(3) 上記 （1) 記載の化合物の生産菌がストレブトマイセス バ一シぺリス 4 083— SVS6株 （FERM BP— 8179) である上記 （2) 記載の製造方法、
(4) ストレブトマイセス属に属し、 上記 （1) 記載の化合物を生産する微生物
(5) ストレプトマイセス バーシぺリス 4083— SVS6株 （FERM BP— 8 179) である上記 （4) 記載の微生物、
(6) 上記 （1) 記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む組成物
(7) 上記 （1) 記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む抗癌剤 ( 8 ) 生理的ストレス状態にある癌細胞に対して細胞死を誘導することを特徴と する、 上記 （7 ) 記載の抗癌剤、
( 9 ) 生理的ストレス状態が低栄養状態または低酸素状態である、 上記 （8 ) 記 載の抗癌剤、
( 1 0 ) 固形癌に対して抗癌作用を示すことを特徴とする、 上記 （7 ) 〜 （9 ) のいずれか記載の抗瘙剤、 である。
本発明の新規テトロン酸誘導体 vers ipelos tat in (以下 VSTと略称する） は、 上記式 （I) で表される構造を有し、 後述する実施例に示された物理化学的性状 を有する。 また、 本発明の VST化合物には、 その塩、 溶媒和物なども含まれる。 VSTの塩としては、 アルカリ金属塩 （ナトリウム塩、 カリウム塩、 リチウム塩な ど）、 アルカリ土類金属塩 （カルシウム塩、 マグネシウム塩など）、 金属塩 （アル ミニゥム塩、 鉄塩、 亜鉛塩、 銅塩、 ニッケル塩など）、 無機塩 （酢酸塩、 アンモ ニゥム塩）、 有機アミン塩 （ジベンジルァミン塩、 ダルコサミン塩、 エチレンジ アミン塩、 ジェチルァミン塩、 トリェチルァミン塩、 ジシクロへキシルァミン塩 、 ジェタノ一ルァミン塩、 テトラメチルアンモニア塩など）、 およびアミノ酸塩 (グリシン塩、 リジン塩、 アルギニン塩、 オル二チン塩、 ァスパラギン塩など） を挙げることができる。 また、 VSTは、 上記式 （I) に示されている通り、 分子内 に水酸基を有するので、 それらの官能基において、 各種のェ一テル、 エステル等 の誘導体に変換することができる。 これら誘導体は VST生物活性を保持する限り 、 本発明に包含される。
上記 VSTはその生産微生物を培養し、 その培養物から採取することにより該化 合物を得ることができる。 VST の生産微生物としては、 好適には放線菌ストレブ トマイセス ' バ一シぺリス 4083— SVS6株を用いることができる。 ストレブトマ イセス バーシぺリス 4083— SVS6 株は、 本願発明者らにより広島県三次市で採 取された土壌試料から分離された。 この菌株は、 インタ一ナショナル ·ストレブ トマイセス 'プロジェクト （I SP) の方法に従い同定され、 菌体学的性状は次の 通りである。
本菌株は基生菌糸を分断しない。 この気菌糸は長い主軸を形成し、 そこより不 規則に分枝した先端に、 10〜50個またはそれ以上からなる螺旋状の胞子鎖を形成 する。胞子は、 幅 0.3〜0.5 mおよび長さ 0.7〜1.0 mのサイズであり、 非運動 性で円柱形あるいは楕円形を呈し、 胞子表面は平滑である。 胞子表面の黒湿化が 、 グリセリン ·ァスパラギン寒天培地や無機塩スターチ寒天培地、 イースト麦芽 寒天培地、 オートミール寒天培地などで観察される。 菌核、 胞子嚢、 その他の特 殊形態は観察されない。 また、 細胞壁化学型は LL -ジアミノジメリン酸を有する (I) 型であり、 DNAの GC含量は 71.3mol%であった。
本菌株を種々の培養基上で 28 、 1 日間培養した際の培養性状は表 1に示す 。 集落表面の菌叢色灰色系列であるが、 2週間過ぎると胞子の表面は黒質化 （hy groscopic mass) が観察された。 裏面色は淡黄色から暗茶味灰色などの不鮮明 色を呈し、 pHによって変化しない。拡散性色素はメラニン様色素の産生以外は認 められなかった。 なお、 色調名は、 コンテイナ一 ·コーポレーション ·ォブ ·ァ メリ力 (Containner Corporation of America) の 「サ ·カラ一 ·ノヽ一モニー ' マニュアル」 （The Color Harmony Manual) (1958年版）に基づいて示した。
表 1
培地 集落表面の菌叢色 集 'Γ各の裏面色 拡散性色素 シュクロ-ス ¼菌糸なし 淡黄色 なし 硝酸塩寒天 ルコ-ス'ァス八。 灰色系列 淡茶味灰色 なし ラキ"ン 寒天 ク"リセリン 'ァスハ。 灰色系列 淡黄味茶色 なし ラキ"ン 寒天 無機塩 灰色系列 淡茶味灰色 なし スタ-チ寒天 チ。シン 寒天 糸なし 暗茶味灰色 明茶味灰色 栄養寒天 糸なし 明茶味灰色 なし
明茶色から
ィ-ス卜，麦芽寒天 灰色系列 茶色 なし
茶味灰色から
オトミ-ル'寒天 灰色系列 暗茶味茶色 なし 本菌株を 28 、 2〜21 日間で培養した際の生理学的性質は表 2に示す c 表 2 生育温度範囲 25 40°C
27 37°C メラニン様色素
チロシン寒天 + ペプトン ·ィース卜鉄寒天 + 卜リプトン ·イースト ·ブロス + スターチの加水分解 + ゼラチンの液化 + 脱脂粉乳のペプトン化 + 脱脂粉乳の凝固 + 硝酸塩の還元
炭素源の同化
D-グルコース + レアラビノース +
D -キシロース +
D—フラク卜ース + シュクロース +
L一ラムノース + ラフイノ一ス + i—イノシ卜一ル +
D—マンニッ卜
ガラク卜ース + ァドニトール
セルビオース + ィヌリン
メルビ才一ス + いて 「+」 は要求性を、 「一」 は非要求性を示す。 本菌株は中温性であり、 メラニン様色素を産生する。 本菌株は胞子が螺旋状に 連鎖する形態と細胞壁化学型が （I) 型であることからストレブトマイセス属 trep tomyces) に位置する菌種である。 上記諸性状を基に 「細菌名承認リスト， 1 980」 およびそれ以降の有効名リストに記載されたストレブトマイセス属の種に ついて検索し、 近縁種としてストレブトマイセス バーシぺリスを選出した。 本 菌株とこの近縁種との比較を表 3に示す。
表 3 本菌株 ス卜レブ卜マイセス
VST バ一シぺリス 胞子鎖形態 螺旋状 + +
胞子表面 平滑 + +
灰色 + +
不鮮明色 + +
pH感受性
拡散性色素産生
pH感受性
メラニン色素産生 + +
スターチの加水分解 + +
硝酸塩の還元
生育温度 45 ° C
炭素源の同化
ァラビノース + +
キシ口一ス + +
イノシ卜一ル + +
マンニッ卜 + +
ラムノース + +
ラフイノ一ス + +
シュクロース + +
フラク卜ース + + 表 3に示すように、 本菌株はストレブトマイセス ·バーシぺリス tr6p tomyc es versipellis) の性状とよく一致している。 従って、 本菌株は、 ストレブトマ イセス 'バーシぺリスに最も近似しているため、 本菌株はストレブ卜マイセス · バーシぺリスに含まれるー菌株と同定し、 ストレブトマイセス 'バーシぺリス 4 083— SVS6株として下記の通り国際寄託した。
(ィ） 国際寄託機関の名称 ·あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6 )
(口） 寄託日 （原寄託日）： 平成 1 3年 1 1月 1 6日
(ハ） 受託番号： F E RM B P— 8 1 7 9
上記において、 VST生産微生物として、 ストレブトマイセス ·バーシぺリス 40 83— SVS6株を説明したが、 本発明の VST産生微生物は、 これに限定されるもので はない。 上述した菌体の諸性状は一般に変異し易く、 一定したものではない。 菌 体の性質は自然的に変化し、 または X線照射などの物理的な変異誘導手段、 ェチ ルメ夕ンスルホネ一トなどによる科学的な変異誘導手段、 もしくは遺伝子操作な どの細胞工学的な変異導入手段によって人工的にも改変し得ることは周知の事 実である。 したがって、 本発明の VST生産微生物には、 VSTの産生するストレブ トマイセス属に属する上記菌株の自然変異株、 人工的変異株であっても、 VST を 産生し得る限り、 本発明に包含される。
VST生産菌の培養は、 通常の放線菌の培養方法 (Shin- ya, K. ら、 I. Ant ib i o t . 48 : 574-578 (1995) )を用い ¾ことができる。 具体的には、 培地としては、 微 生物が同化し得る炭素源、 窒素源、 必要に応じて無機塩， 有機栄養源等を適宜含 有する栄養培地を用いることができる。 上記炭素源としては、 グルコース、 ァラ ピノ一ス、 キシロース、 フラクトース、 シュクロース、 ラムノース、 ラフイノ一 ス、 イノシトール、 マンニット、 ガラクトース、 セルビオース、 メルビオース、 糖蜜、 澱粉、 デキストリン、 セルロース、 グリセリン、 有機酸などを挙げること ができる。
また、 窒素源としては、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 乾燥酵母、 スキム ミルク、 大豆粉、 コーンスティ一プリカ一、 綿実粉、 カゼイン加水分解物、 大豆 蛋白加水分解物、 アミノ酸、 尿素などの有機窒素源、 硝酸塩、 アンモニゥム塩な どの無機窒素化合物等を挙げることができる。
上記炭素源、 窒素源は単独でまたは組み合わせで培地に添加することができる 。 また、 必要に応じて、 培地には、 ナトリウム塩、 カリウム塩、 アンモニゥム塩 、 カルシウム塩、 リン酸塩、 硫酸塩、 炭酸塩等の無機塩や、 コバルト、 マンガン
、 鉄、 マグネシウム等の微量の金属、 VST生産株の生育や VSTの生産を促進し得 る微量栄養素、 発育促進物質、 前駆物質など適宜添加してもよい。 また、 培地 P Hは、 中性付近、 具体的には pH7. 0〜7. 6とすることが好ましい。 また液体培地に おいては、 培養時の発泡を抑制するために、 植物油、 界面活性剤などの消泡剤を 適宜添加してもよい。
VST の産生菌の培養は、 通常の放線菌の培養方法同様、 振とうまたは通気攪拌 培養などの好気的培養方法で行なうことが好ましい。 培養温度は、 24〜30°C、 好 適には 27 とすることがよい。 また、 大量液体培養を行なう場合には、 先ず、 少 量の培地を用いた前培養により保存状態であった菌体の増殖を活性化させ、 その 後、 この前培養液を大量の培地に接種して本培養を行なうことが効率的である。 培養時間は、 前培養の場合、 通常 2〜3日、 本培養の場合には、 4〜6日とするこ とができる。 なお、 これらの培養温度、 通気量、 培養時間などの培養条件は VST の産生量を基に、'適宜調節、 選択することができる。 また、 VST ¾生菌の種類、 培養環境に応じて、 上記培養条件などを変更することもできる。
培養液から VSTを採取するためには、 培養液を遠心分離あるいはろ過などに供 して菌体成分を分離し、 その上清またはろ液を回収する。 回収された上清または ろ液からの VSTの精製は、 VSTの生化学的な活性、 例えば、 実施例 1等に示した GRP78の発現抑制活性、または HPLC分析などの物理的な性質を利用して実行する ことができる。 一例を示せば、 VSTの精製は次の操作で行い得る。
培養上清またはろ液を酢酸ェチルなどの非親水性有機溶媒で抽出し、 抽出液を 減圧濃縮あるいは脱水剤を用いて脱水して粗精製 VSTを得る。 該粗製物質はさら に脂溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、 例えばシリカゲルなどの担体 を用いる吸着カラムクロマトグラフィー、 さらに Senshu Pak (センシュ一科学） などを用いた HPLCにより純品まで精製することができる。
但し、 上記精製方法は一例であり、 この方法に限定されるものではない。 従つ て、 当業者において通常用いられているその他の精製手段、 例えば、 他の吸着担 体を用いた吸着カラムクロマトグラフィ一、 ゲルろ過用樹脂を用いたゲルろ過力 ラムクロマトグラフィー、 陰イオン交換あるいは陽イオン交換樹脂を用いたィォ ン交換クロマトグラフィーを用いることもできる。 これら精製手段は単独または 適宜組み合わせることにより、 VSTを分離精製してもよい。
上記において精製された VSTは、 医薬組成物として用いてもよく、 また、 さら なる化合物を製造するための中間体として用いることができる。 VSTを含む医薬 組成物の剤形には特に限定はなく、 例えば錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シ ロップ剤、 注射剤などに製剤化することができる。 また、 これら製剤化において 、 VSTの活性を阻害しない範囲で賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 矯味矯臭剤 、 溶解補助剤、 懸濁剤、 コーティング剤等の補助剤を適宜添加することができる このような組成物は、 癌、 アルツハイマー病などの治療において有効な組成物 あるが、 好ましくは抗癌剤として使用される。本発明に.おける抗癌剤としては 、 生理的ストレス状態にある癌細胞に対して細胞死を誘導する抗癌剤であること が好ましい。 ここで、 生理的ストレス状態としては、 低栄養状態または低酸素状 態などが挙げられるが、 これらに限定されるものではない。 該低栄養状態としては、 グルコース飢餓状態、 低ミネラル、 低脂質、 低ビタミ ンなどが挙げられるが、 グルコース飢餓状態が好ましい。
また、 本発明における抗癌剤は、 癌細胞に対し直接的に抗癌作用を示すが、 例 えば、 他の化学療法剤や放射線療法との併用により、 より強い抗癌作用を発揮す ることができる。 また、 本発明における抗癌剤は、 固形癌に対しても有効な抗癌 剤である。 図面の簡単な説明
図 1は、 メタノール中で測定した VSTの紫外部吸収スぺクトルを示す図である 図 2は、メタノ一ルー NaOH中で測定した VSTの紫外部吸収スぺクトルを示す図 である。
図 3は、 メタノール—HC1中で測定した VSTの紫外部吸収スペクトルを示す図 である。
図 4は、 臭化力リゥム錠剤法で測定した VSTの赤外部吸収スぺクトルを示す図 である。 図 4において、 波長番号 1は 3454cm— 2は 2934 cm—1 , 3は 2360 cm"1 、 4は 1758 cm"1 , 5は 171 1 cm—1 , 6は 1623 cm"1 , 7は 1575 cm— 8は 1457 cm 一1、 9は 1381 cm一1、 10は 1308 cm"1 , 1 1は 1208 cm—1 , 12は 1062 cm— 13は 9 89 cm— 1、 14は 934 cm"1 , 15は 867 ci"1 , 16は 830 cm"1 , 17は 730 cm— 1のシグ ナルを示す。
図 5は、 VSTの Ή-核磁気共鳴スぺクトルを示す図である。
図 6は、 VSTの1 3 C-核磁気共鳴スぺクトルを示す図である。
図 7は、 VSTの GRP78発現抑制 ¾性を測定した結果を示す図である。 図におい て、 黒塗りのシンポルは濃度を変えた VSTを添加後、 ッニカマイシンを添加して 細胞内の小胞体ストレスを誘発し、 GRP78 の発現を誘導した群を示す。 白抜きシ ンポルは濃度を変えた VSTのみを添加し、 ッニカマイシン非添加の群を示す。 図 8は、 種々の細胞に様々な濃度の VSTを添加した際の細胞の生存率に基づい て、 直接的な細胞毒性を測定した結果を示す図である。 各シンボルは図右に示し た細胞にそれぞれ対応している。
図 9は、 VSTによる HeLa78C6細胞における小胞体ストレスによって誘導される 内在性 GRP78の発現抑制活性について示す写真である。 Aは用量依存性、 Bは夕 ィムコース、 Cは各ストレス条件についての検討を示す。
図 1 0は、 小胞体ストレス応答亢進癌細胞 HT-29および ΗΠ080細胞において 、 各種小胞体ストレスによって誘導される GRP78の発現を VSTが阻害するかにつ いて示す写真である。 Aは HT-29細胞、 Bは HT1080細胞を示す。
図 1 1は、 HT-29細胞において、 各種小胞体ストレス条件下での VSTのコロニ —形成阻害活性能について示す図である。
図 1 2は、 HT1080細胞に対する、 グルコース飢餓条件下での VSTによるアポト —シス誘導について示す図である。
図 1 3は、 HT1080細胞に対するグルコース飢餓条件下 VSTによるアポトーシス 誘導の経時変化を示す図である。
図 1 4は、 固形癌に対して有効な抗腫瘍剤シスブラチンと VSTとの併用効果につ いて示す図である。
図 1 5は、 ヌードマウスにおける HT-29癌細胞に対する、 VSTの動物レベルでの 抗腫瘍効果について示す図である。
図 1 6は、 VSTの GRP78の誘導に深く関与する XBP1の活性化抑制について示す写 真である。 発明を実施するための最良の形態 '
[実施例 1 ] スクリーニング
自然界中における GRP78の発現を調節し得る物質のスクリーニングを行った。 詳細には、 被験試料には、 生薬、 かび、 放線菌のそれぞれの代謝産物を準備した 。 また、 スクリーニング系は、 次の通り調製した。 pGL3- bas ic ベクター （Prome ga) のマルチクロ一ニングサイトの Kpnl- Bgl l l部位に ERSEを 3つ含む GRP78プ ロモ—ター領域 （― 132〜+7)を挿入して、 GRP78プロモータの下流にレポーター遺 伝子としてルシフェラ一ゼ遺伝子を連結させたベクタ一を構築した。 さらに、 こ のベクターに選択マーカ一として、 pgk - neoカセット （l，867bp) (McBurneyら， Nuc l ei c Ac id Res. 19： 5755-5761 (1991) ) を上記べクタ一のマルチクロ一ニン グサイトの Sai l部位に揷入した。 ここで構築されたべクタ一 （以下、 「GRPルシ フェラーゼベクタ一」 という） を HeLa細胞に導入した。 細胞への導入には、 「Tr ans f as tj (Pr omega社） を用いたリポフエクチン法により実行した。 上記 GRPル シフェラーゼベクタ一を保持した細胞 （以下、 この細胞を 「HeLa78C6細胞」 とい う） を G418 (400 g/ml) 含有 DMEM培地を用いて選択した。 選択された細胞は 1 0¾FCS 及ぴ 400 i g/ml G418含有 DMEM培地で培養され、 HeLa78C6細胞懸濁液 （1 . 5 X 105細胞 7ml) を調製した。
96 ゥヱルプレートの各ゥエルに上記細胞懸濁液 （100 1) を分注し、 37°C、 5 %C02にて 6時間インキュベートした。 その後、 上記被験試料 （1 1相当分） を 添加し、 37でにて 30 分インキュベーションを行った。 その後、 さらにッニカマ イシン溶液を最終濃度 2 / gZml となるように各ゥエルに添加した。 ッニカマイ シン添加後、 37°Cにて 18時間インキュベーションを行った。 その後、 細胞にお けるルシフェラ一ゼ活性をルシフェラ一ゼ測定キット （Luc i ferase Assay Sys te m： Proiega, cat* E1501) を用い、 添付のプロトコルに従って測定した。
ッニカマイシンの添加による小胞体ストレス誘発により、 GRP78 プロモータか らの発現が誘導されルシフェラーゼ活性が上昇したが、 放線菌 4083- SVS6株の代 謝 M物を添加した群ではッニカマイシンによるルジフェラ一ゼ活性の上昇が抑 制された。
[実施例 2 ] 放線菌 4083— SVS6株の培養上清による GRP78発現抑制
実施例 1において GRP78発現抑制を示した放線菌 4083— SVS6株の前培養を行 つた。 前培養用の培地 （1 リットル中 スターチ 10 g、 ポリペプトン 10 g、 糖蜜 10gおよび肉エキス 10gを含み、 pH2に調整） を調製し、 滅菌した。 滅菌 済みの培地 （15mL) を 50ml 用試験管に分注し、 ここに放線菌を無菌的に接種し た。 植菌後、 試験管を振とう （200rpm) しながら、 27度にて 3日間培養した。 次に、 本培養を行った。 すなわち、 本培養用の培地 （1 リットル中 スターチ 25g大豆ミール 15g、 乾燥イースト 2gおよび CaC03 4g含有、 pH7. 0) を調製 した。 本培養液の培地 （100ml) を 500ml 用コブ付三角フラスコに分注し、 そこ に前培養液 （2ml) を無菌的に添加した。 添加後、 振とう （200rpm) を行いなが ら、 27度にて 5日間培養を行った。
上記本培養液を遠心分離により培養上清と、 菌体とに分離した。 これら培養上 清と、 菌体を破碎した菌体産物とをそれぞれ用いて、 実施例 1と同様に GRP78発 現抑制活性をレポ一夕一解析法によりそれぞれの画分の活性を測定した。 96ゥェ ルプレートの各ゥエルに上記細胞懸濁液 （I OO L) を分注し、 37で、 5 % C02にて 6時間インキュベートした。 その後、 培養上清 （1 ^ 1) または菌体産物 （1 U) を含む溶液 （10 1) を添加し、 37でにて 30分インキュベーションを行った。 そ の後、 さらにツエ力マイシン溶液を最終濃度 2 gZml となるように添加した。 ッニカマイシン添加後、 37でにて 18時間インキュベーションを行った。 その後 、 細胞におけるルシフェラ一ゼ活性をルシフェラーゼ測定キットを用いて測定し た。 測定の結果、 放線菌培養上清を添加した群において、 ルシフェラーゼ活性の 抑制が観察された。
[実施例 3 ] 放線菌 4083— SVS6株培養上清からの活性物質の精製
放線菌 4083— SVS6 株を実施例 1と同様の培養方法をスケールを上げて行い、 本培養液 （2 リットル） を調製した。'この培養液を遠心分離 （10， 000n)in、 10分 間） にかけ、 培養上清を回収し、 菌体を除去した。 回収した培養上清を酢酸エタ ノールにより抽出し、 その後、 硫酸ナトリウムで脱水した。 この脱水後の粗精製 物の重量は 2. 57gであった。 脱水後の酢酸エタノール抽出物を濃縮乾燥後、 クロ口ホルム：メタノール （20 :1) 溶液に溶解し、 この溶解液をシリカゲルカラム （カラム容量： 3.5ΦΧ 30 cm ) に供与し、 同溶媒にてクロマトグラフィーを行った。 溶出試料を、 上記実施例 1に示したレポ一ター解析で測定し、 活性を有する溶出画分 （250mg) を分離し た。 続いて、 上記活性を有する画分を集め、 濃縮乾固後、 メタノールに溶解し、 HPLCカラム （Senshu Pak： PEGASIL ODS C18、 20 X 250 匪、 センシュ一科学製 ) に供与し、 1 ml/minの流速で 80% MeOHを用いてクロマトグラフィー行った。 溶出液を紫外可視 （254 nm) にてモニターし、 保持時間 28分のピークを回収し た。 回収した溶出液を乾燥させ、 35.7mgの VST (別名 JL68) 化合物の純品が得ら れた。
以下に、 VSTの物理化学的性状を示す。
( 1 ) 物質の性状：白色粉末状物質
(2) 融点： 17ト 175°C
(3) 分子式： C61H9017、 (3) FAB マルスペクトル法による測定した分子量： 1 098 (M) -、 1121 (M+Na) +
(4) 一般式 （I) ：
Figure imgf000019_0001
(5) 高分解能 FAB マススぺクトル法により測定した精密質量 （m/z)： 実 測値 1121.6398 [M+Na]+、 計算値 1121.6389
(6) メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトル （図 1) の極大吸収 （AMe0
H nm (ε))： 248 (8,000), 267 (7,700)、 メタノール— NaOH 中で測定した紫 外部吸収スペクトル （図 2) の極大吸収 UMeQH - MH nm (ε))： 243 (11,400), 269 (8,900)、 メタノール一 HC1 中で測定した紫外部吸収スペクトル （図 3) の 極大吸収 UMe0H_Hcl nm (ε))： 263 (8, 500)
(7) メタノール中で測定した旋光度： [ひ] D:— 52° (c 0.8, MeOH)
(8) 臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトル （図 4) の極大吸収 (IR (KBr) Amax cm—1) : 3446, 2934, 1758, 1711, 1261, 1075
(9) 重クロ口ホルム：重メタノール =1： 1溶液中、 25°Cで測定した Ή-核磁気 共鳴スペクトル （図 5) および 13C-核磁気共鳴スペクトル （図 6) :表 4に示す
表 4 χ
ΙΝΟ. Ι Ο.
1 166.35 32 12.39 0.913
2 103.22 33 16.26 0.92
3 205.1 34 22.8 1.63
4 58.58 35 21.84 1.92,1.88
5 23.44 2.4 36 14.56 0.88
6 49.79 2.46 37 64.72 3.51,3.40
7 210 38 17.07 0.91
8 50.09 2.98,2.40 39 22.25 0.885
9 71.28 3.78 40 20.79
10 47.18 2.29 41 21.41 1.67
11 120.75 5.84 42 19.37 1.03
12 134.16 ι· 100.3 4.77
13 60.01 3.07 2· 37.26 2.11,1.65
14 139.27 3· 67.6 4.638
15 135.94 5.1 4' 80.54 3.21
16 37.9 2.28 5· 68.09 3.76
17 32.23 1.59, 0.59 6' 17.69 1.17
18 35.4 1.94 1" 99.3 4.92
19 91.08 3.2 2" 34.71 2.19,1.53
20 25.19 1.61 3" 73.09 3.46
21 32.23 1.49,1.10 4" 81.13 3.27
22 19.95 1.58,1.33 5" 68.1 3.6
23 34.56 1.53,1.26 6" 17.97 1.24
24 41.41 3"-OCH3 57.25 3.36
25 126.63 5.26 1"' 98.35 5.02
26 135.31 2'" 38.06 2.10,1.61
27 31.13 2.37 3'" 68.18 4.044
28 36.85 2.21,1.75 4'" 72.97 3.22
29 87.31 5'" 69.15 3.64
30 201.81 6'" 18.03 1.22
31 23.44 2.52, 2.12
( 1 0 ) H P L C分析：カラム Sens Pak (PEGASIL ODS C18、 4. 6 X 250 m m、 センシユー科学社製）、 溶媒 80%メタノール、 流速 1 ml/分、 検出 254 n m、 保持時間 14分
[実施例 4 ] VSTの活性の定量 実施例 3において精製された VST純品を用いて GRP78プロモー夕発現抑制活性 を定量化した。 この定量も実施例 1と同様のルシフェラ一ゼ遺伝子を用いたレポ —ター解析により測定した。 詳細には、 実施例 1と同様に 96 ゥエルプレート中 に HeLa78C6細胞（5 X 105cel ls/ml、 100 1)を分注した。 一方、 段階的にメ夕ノ ールで希釈した VST 溶液 （100、 50、 25、 12. 5、 6. 25、 3. 125、 1. 5625 g/ml) を調製し、 この溶液をさらに、 PBS (—） で 10%に希釈した。 これら PBSで希釈 後の溶液 （10 1) をゥエル （100 細胞懸濁液/ゥエル） に添加した。 添加後 、 37で、 5 %C02にて 30分インキュベーションを行った。その後、 一部のゥエルに はさらに一定量のッニカマイシン溶液を最終濃度 2 ^ gZml となるように添加し た。 ッニカマイシン添加後、 37°Cにて 18時間インキュベーションを行い、 最終 的な細胞におけるルシフェラ一ゼ活性をルシフェラ一ゼ測定キット （Promega) を用いて測定した （図 7 )。 なお、 図 7の横軸の数値は、 VSTの最終濃度を示す。
VSTのみでは GRP78プロモータからのルシフェラーゼ発現には影響はなく、 試 料非添加の細胞における相対ルシフェラ一ゼ活性 「1」 と同程度であつたが、 ッ 二力マイシン添加による小胞体ストレスに応答して GRP78からのルシフェラーゼ 発現は上昇した。 しかし、 ッニカマイシン添加による発現上昇は、 VSTの濃度増 加にともなって抑制された。 この結果より、 VST はッニカマイシンによる小胞体 ストレスに応答した GRP78からの発現上昇を抑制することが示された。
[実施例 5 ] 種々細胞における VSTの活性測定
本実施例では HeLa細胞を含め、 その他種々の培養細胞を用いて、 上記レポ一 ター解析および VST添加時の生存率を測定した。 具体的には、 HeLa細胞（ヒト子 宮類癌細胞） の他、 MCF- 7 (ヒト乳癌細胞）、 PC12NH (ラット黒褐色細胞腫)、 MDA - MB- 231 (ヒト乳癌細胞）、 TIG- 3 (ヒト正常繊維芽細胞）、 HeLa786C細砲 （ヒト子 宮顏癌細胞） Saos_2 (テロメラーゼおよび p53 欠損ヒト癌細胞）、 SUSM-1 (テロ メラーゼ欠損ヒト癌細胞） を用いた。
これら細胞に対する VSTの直接の増殖抑制活性を MTT法を用いて測定した。 上 記各細胞の細胞懸濁液 （5X104/ml) を 96ゥエルプレートの各ゥエルに 100^1 分注し、 6時間 37°Cにて培養した。培養後、 上記実施例 4と同様に段階希釈した VST溶液を添加し、 さらに 24時間培養を行った。 24時間培養後、 各ゥエルに 0. 05g/ml MTT溶液（10 1) を添加し、 37 にて 4時間インキュベーションを行つ た。 その後、 培地を除き、 DMSO (IOO D を添加して 530nm吸光度を測定した （ 図 8)。 これら測定値より IC50を求めた結果を表 5に示す。
VST (最終濃度 gZml) では、 生存率に低下は観察されず、 10 ig/ml 程度 の高濃度で、 2〜3細胞株で生存率の若干の低下が観察された。 さらに高濃度 100 ml にすることにより、 多くの細胞株の生存率が低下したが、 その低下程度 は最大 50%程度であった。 また 100/igZmlの高濃度であっても依然として生存 率に変化が見られない細胞株もあった。 この結果より、 VST の細胞毒性は低く、 特に l g/ml 濃度以下では、 いずれの細胞に対しても直接の細胞毒性はないこ とが示された。
表 5
Figure imgf000023_0001
[実施例 6 ] HeLa78C6細胞株に対する VSTの生物活性
HeLa78C6細胞を DMEM培地にて培養し、 各濃度の VSTをッニカマイシン添加 30 分前に添加し、 さらに 2 g/mlのッニカマイシンを添加し 18時間処理した。 本 細胞を集め、 抗 GRP78抗体 （St ressgene) を用いて GRP78の誘導を Wes ternブロ ッティングにて検出した。 その結果、 VST はレポ一夕一アツセィのみならず、 内 因性の分子シャペロン GRP78の誘導を濃度依存的に夕ンパクレベルで阻害するこ とが確認された （図 9 A)。
また、 上記培養法にて HeLa78C6を培養し、 50 Mの VSTで 30分間前処理した 後、 ッニカマイシンを添加した各時間後の細胞を集め、 GRP78 のタンパクレベル を Wes ternブロッテイングにて検出した。その結果、 GRP78は 2 ^ g/mlのッニカ マイシン処理後 12時間から 18時間で誘導されること、 また VSTによりその誘導 が阻害されることを明らかになった （図 9 B)。
さらに、 各記載の小胞体ストレス誘導剤で処理した 18時間後の GRP78レベル を図 9 Aと同様の方法で検出した。 その結果、 VST は何れの小胞体ストレスに対 しても GRP78 の誘導を阻害したが、 その効果は生理的な小胞体ストレスに近い 2-deoxyglucose (2-DG) に対してより選択性が高かった （図 9 C)。
[実施例 7 ] 様々なストレス状況下での HT- 29及び HT1080細胞における GRP78 及び GRP94レベルに対する VSTの影響
実施例 6の結果、 VST は小胞体ストレスによる内因性の分子シャペロン GRP78 の誘導を阻害することが明らかになつたので、 次に癌細胞のうち小胞体ストレス 応答が亢進している癌細胞である HT- 29細胞と ΗΠ080細胞を用いて、 GRP78の誘 導阻害、 アポトーシス誘導および他の抗腫瘍剤との併用効果を検討した。
具体的には、 肝臓癌細胞 HT-29細胞お'よび HT1080細胞を RMI 1640培地にて培 養し、 3 Μおよび の VSTで 30分間前処理をした。 次いで、 各小胞体スト レス処理した 18時間後の GRP78レベルを Wes ternブロッティングにて検出した
(図 1 0 )。 その結果、 VSTは小胞体ストレス応答が亢進している癌細胞 HT- 29お よび HT1080細胞においても、 生理的な小胞体ストレスである 2-DGによる GRP78 の誘導を 3 Mの低濃度でも阻害した。 これに対し、 VSTは 30 Mの濃度でも化学 的な小胞体ストレスであるッニカマイシン処理に対しては、 GRP78誘導阻害効果 を示さなかった。また、データは示さないが、熱ショックプロテインである HSP70 の転写活性には影響を与えないことを確認しており、 VSTは小胞体ストレス応答 特異的に作用することが証明された。 本結果により、 VSTは実際の固形癌の体内 での状態を反映するモデルであるグルコース飢餓試験において、 特に特異性の高 い小胞体ストレス応答抑制効果を示した。 このことは、 抗腫瘍剤の効果が現れに くい固形癌に対し、 その耐性メカニズムを克服することを可能にすることを示唆 するものである。 また、 VSTが全ての小胞体ストレスに対し、 効果を示すのでは ないことが明らかにされたが、 本結果は小胞体ストレス応答経路が単一のメカ二 ズムを介して発現するのではないことを示しているが、 本現象は VSTを用いるこ とにより世界で初めて明らかにされたものである。
[実施例 8 ] ストレス状況下でのアポ卜一シスの誘導
以上に示したよう、 VST は生理的な小胞体ストレスであるグルコース飢餓によ る GRP78の発現を特異的に阻害することが示されたが、 次にこの GRP78の誘導阻 害が癌細胞に対し細胞増殖抑制あるいはアポトーシスを誘導するかを検討した。
HT - 29細胞を各濃度の VSTで 30分間前処理し、 ッニカマイシン、 カルシウムィ オノフォア A23187、 グルコース飢餓および 2- DGの各小胞体ストレス負荷処理を 18時間行った。 その後、 1週間プレート上で培養しフオルマリンで固定後、 クリ スタルバイオレツト染色によりコロニーを染色計測した。その結果、 VSTは、 GRP78 誘導阻害活性と比例して、 グルコース飢餓および 2- DG処理下で強い細胞増殖抑 制効果を示した （図 l i e及び D)。 これに対し、 ッニカマイシン処理に ¾して は、 GRP78誘導阻害同様、 細胞増殖抑制効果も示さなかった （図 1 1 A及び B )。 また、 HT1080細胞を の VSTで 30分間前処理し、 細胞を固定後 propidium iodideで核を染色し、 FACS解析を行った。 その結果、 図 1 2 Aに示すよう、 VST はグルコース存在下ではコントロールと同様、 何の効果も示さなかったが、 ダル コース飢餓状態では 48時間後に強いサブ G1期誘導を示し、 HT1080細胞に対して グルコース飢餓下でアポトーシスを誘導することが示唆された。 これに対し、 HT1080 細胞はダルコ一ス飢餓処理のみではアポトーシスする細胞は極めて限定 されていた。 また、 図 1 2 Bに示すように VSTは時間依存的にグルコース飢餓状 態下で ΗΠ 080細胞にアポトーシスを誘導することが示唆された。
以上の結果より、 VSTは GRP78の誘導を阻害することにより、 グルコース飢餓 状態にある癌細胞に対して特異的に細胞死を誘導することを明らかにした。
[実施例 9 ] VSTと抗癌剤との併用活性
小胞体ストレス応答の亢進は、 低栄養条件下での生存を促進すると共に抗腫瘍 剤への耐性を獲得している。 そのため、 既知の抗腫瘍剤に対する効果を検討する ことにした。 しかしながら、 細胞レベルでの実験ではグルコース飢餓条件下では VST単独でも強いアポトーシス誘導を示すため、 他の薬剤との併用効果を十分に 検討することができなかった。 そこで、 癌細胞に対し低グルコース下でも活性が 維持されることから、 固形癌治療に汎用されるシスブラチンを用いて併用効果を 検討した。 具体的には、 HT- 29細胞を上記の方法により培養し、 VSTで 30分間前 処理した後、 18時間培養した。 その後各濃度のシスブラチンで 4時間処理し、 1 週間後コロニー形成能を検討した。
その結果、 VST、 シスブラチンともグルコース飢餓条件下で活性増強が確認さ れたが、 VSTを低濃度添加することにより （300 nMおよび 500 nM)、 シスプラチ ンの効果をさらに増強することが明らかになった （図 1 3 )。
シスブラチンは、 固形癌治療に汎用されるが、 副作用が強いことが知られてい る。その め VSTにより、投与量を減らすことが可能となれば、患者の qual i ty οί l i f e (Q0L) に大きく貢献することが期待される。
[実施例 1 0 ] 動物試験
VST の動物レベルでの抗腫瘍効果について検討した。 具体的には、 HT- 29細胞 をヌードマウスに移植し、 100讓3になるまで腫瘍を增殖させた。 その後、 各濃度 の VSTを尾静脈投与し、 経過観察し各経過日数時に腫瘍を摘出し大きさを比較検 討した。 その結果、 VSTは図 1 4に示すよう、 シスブラチンほど強い効果は認め られなかったが抗腫瘍効果を示した。 また、 cDDP (シスブラチン） との併用効果 を検討したが、シスブラチンの効果が十分であり、併用効果は認められなかった。 動物試験において in roでの強い効果が認められなかったため、 VSTの HT - 29 細胞に対するアポトーシス誘導効果を再検討した結果、 VSTはコロニー形成試験 で増殖抑制効果を示すが、 アポトーシス誘導効果は発現しないことが明らかにな つた。
[実施例 1 1 ] メカニズム解明研究
VST の活性発現メカニズム解明のため、 小胞体ストレス応答経路で作用する幾 つかの因子に対する効果を検討した。 このうち、 酵母からほ乳類細胞まで広く保 存されている小胞体ストレス応答経路である Irel a -XBPl経路について検討した。 XBP1は、 mRNAレベルで前駆体 （XBP1 (U) ) から小胞体ストレスを受け活性化され た Irel aによりスプライシングされ、 活性化体となり （XBP1 (S) ) 核へ移行し GRP78プロモーターである ERSEに結合し、 GRP78の転写を誘導する。
クローニングした XBP1に Flagタグを繋いだプラスミドを ΗΠ080へ導入し、 30分間 VSTで前処理した。各ストレス負荷 6時間後プロテアソーム阻害剤である MG132を添加し、 さらに 6時間培養した細胞から調製した試料を用いて、 抗 Flag 抗体を用いて全長おょぴスプライシング型 XBPlを検出した。 図1 5 が 2- DG、 右側がッニカマイシン処理による XBP1 のスプライシング型の形成について検討 したものである。 SBP1のスプライシング型はプロテアソームによる分解を極めて 速く受けるため、 その検出が困難である。 この問題を解決するため、 プロテアソ ーム阻害剤である MG132を添加した。 図 1 5 A及び Bとも右 2つのレーンを比較 すると、 2-DG処理では VST添加によりスプライシング型 XBP1の形成が阻害され ているのが観察された。 これに対し、 ツユ力マイシンによる XBP1 のスプライシ 正された 统(；1則 91) ングを VSTは阻害しなかった。 これは、 ΧΒΠの活性化レベルで、 ッニカマイシン とグルコース飢餓とでは小胞体ストレス応答メカニズムが異なることを示唆し ている。 本結果により得られた新しい知見は VSTの発見によって初めて見出され たものである。 また、 XBP1のズプライシングを阻害する物質は VST以外報告され ていない。 産業上の利用の可能性
放線菌から GRP78発現を低減させ得る新規な物質 （VST) が同定された。 また 、 この新規化合物を産生する微生物、 ストレブトマイセス バ一シぺリスが単離 同定された。 この VSTは小胞体ストレス誘発剤による GRP78の発現上昇を抑制し たことから、 VST自身がストレス応答に起因した GRP78の発現を阻害し得ること が示された。 この結果より、 VST を利用し、 化学療法や放射線療法による癌治療 の際に癌細胞のストレス応答機構を抑制し、 癌細胞にこれら化学療法剤や放射線 療法に対する高い感受性を付与する薬剤の開発に有効となる。

Claims

請求の範囲
Figure imgf000029_0001
で示される versipelostatinィ匕合物。
2. ストレブトマイセス属に属する請求項 1記載の化合物の生産菌を培養し、 その培養物から該化合物を採取する、 請求項 1記載の化合物の製造方法。
3. 請求項 1記載の化合物の生産菌がストレブトマイセス バ一シぺリス 408 3— SVS6株 （FERM BP-8179) である、 請求項 2記載の製造方法。
4. ストレブトマイセス属に属し、 請求項 1記載の化合物を生産する微生物。
5. ストレプトマイセス バ一シぺリス 4083— SVS6株 （FERM BP— 8 179) である、 請求項 4記載の微生物。
6. 請求項 1記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む、 組成物
7. 請求項 1記載の化合物またはその薬理学的に許容された塩を含む、 抗癌剤
8. 生理的ストレス状態にある癌細胞に対して細胞死を誘導することを特徴と する、 請求項 7記載の抗癌剤。
9. 生理的ストレス状態が低栄養状態または低酸素状態である、 請求項 8記載 の抗癌剤。
1 0 . 固形癌に対して抗癌作用を示すことを特徵とする、 請求項 7〜9のいず れか記載の抗癌剤。
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