WO2006101073A1

WO2006101073A1 - 抗がん剤、並びに新規化合物プラナスタチンの生産菌

Info

Publication number: WO2006101073A1
Application number: PCT/JP2006/305540
Authority: WO
Inventors: Toru Natsume; Kazuo Shinya
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2005-03-22
Filing date: 2006-03-20
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2007-09-22
Also published as: JPWO2006101073A1

Abstract

　【課題】　ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質を探索し、新規抗がん剤を見い出すこと。　【解決手段】　本発明者は、ＧＲＰ７８の発現誘導を抑制する物質として、「化１」の化学式で表される新規化合物を新規に見い出し、プラナスタチンと命名した。プラナスタチンは、公知化合物のＳＷ－１６３Ａと類似構造を持つ物質で、放線菌のストレプトマイセス　ヴィオラセオニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）　４５２１－ＳＶＳ３株などによって、生産できる。本発明に係る化合物を少なくとも含有する医薬組成物は、抗がん剤として、有効な可能性がある。　【化１】　

Description

明細書

抗がん剤、並びに新規化合物ブラナスタチンの生産菌

技術分野

[0001] 本発明は、 GRP78の発現を抑制する新規化合物「ブラナスタチン」、 GRP78の発現を抑制する化合物（「SW163A」などネオアンチマイシン類縁体）、前記化合物を少なくとも含有する抗がん剤、並びに前記化合物を生産できる放線菌株「ストレブトマイセスヴィオラセォニガー 4521— SVS3株」、に関する。

背景技術

[0002] 小胞体は、真核生物の細胞内小器官の一つで、タンパク質の合成、折り畳み、糖鎖修飾などを行う。その小胞体内に、未成熟なタンパク質が蓄積した状態を、「小胞体ストレス」という。例えば、グルコース飢餓などのストレス条件下では、タンパク質の折りたたみ（フォールデイング）が不完全となり、小胞体内に、未成熟なタンパク質が蓄積し、小胞体ストレスの状態になる。

分子シャペロンとは、タンパク質合成過程において、合成タンパク質の折りたたみ（フォールデイング）を制御するタンパク質をいう。真核生物では、「HSP (Heat Shoe k Protein) 70」ファミリーと「シャぺロニン（Hsp60)」ファミリーが代表的なものとして知られている。

細胞には、小胞体ストレスに対する防御機構が存在することが知られている。小胞体内に、折りたたみの不完全なタンパク質が蓄積すると、分子シャペロンの発現が誘導される。細胞は、分子シャペロンの発現を誘導することにより、タンパク質の折りたたみを促進し、小胞体ストレスから細胞を防御する。

そして、分子シャペロンの発現誘導によって小胞体ストレスが解消されない場合、ァポトーシス（細胞死）に至る経路が活性化される（非特許文献 1参照）。

なお、小胞体ストレスは、ッニカマイシンなどの化合物によって、惹起されることが知られている。

[0003] GRP78 (Glucose -Regulated Protein 78— kD)は、 HSPA5 (Heat— Shoe k 70kD Protein 5)若しく i BIP (immunoglo Dulin heavv chain— Binding Protein)とも呼ばれるタンパク質で、 HSP70ファミリーに属する、ストレス応答型の分子シャペロンであり、小胞体内に存在する。

GRP78は、動物細胞において、グルコース飢餓条件下、若しくはッニカマイシンなどの存在下で、発現が誘導されることが知られている（非特許文献 1など参照）。

[0004] 固形がんは、一般的に、正常な組織と異なり、グルコース飢餓状態の領域を持つことが知られており（非特許文献 3など参照）、また、 GRP78の発現が誘導されることが報告されている（非特許文献 4など参照）。その他、グルコース飢餓条件下などにおいて、 GRP78の発現誘導がアポトーシス誘導を抑制することが報告されている（非特許文献 5参照）。

前記の各知見は、グノレコース飢餓状態において、 GRP78の発現誘導を抑制することによりアポトーシスなどを惹起できること、即ち、 GRP78の発現誘導を抑制することにより飢餓状態の細胞（がん細胞）を死滅できる可能性を示唆する。

そこで、新規杭がん剤として、 GRP78の発現誘導を抑制する物質を探索する試み、各種、行われている (特許文献 1、非特許文献 3〜非特許文献 9など参照)。

[0005] ここで、本発明と関連性のある化合物、ネオアンチマイシン類縁体について説明する。ネオアンチマイシン類縁体は、下記の一般式 [化 5]で表される化合物で、 SW16

[化 5]

[0006] SW163Aは、 R力 Sメチル基、 Rがアンティソブチル基の化合物であり、 SW163B は、 Rカチル基、 R力 Sイソプロピル基の化合物である。また、ネオアンチマイシンは

1 2

、 R力 Sイソプロピル基、 Rがアンティソブチル基の化合物である。

1 2

SW— 163Aと SW— 163Bは、放線菌「ストレプトマイセス」属の菌株の代謝産物から同定された物質で、免疫抑制剤としての報告はあるが（非特許文献 10)、具体的な作用 ·用途は報告されていなレ、。ネオアンチマイシンは、その化学構造が知られているが (例えば非特許文献 11参照）、具体的な作用'用途は報告されていない。 SW- 163Aの化学構造を、下記の [化 4]に示す。

[化 4]

特許文献 1 : PCT/JP02/12237

非特許文献 1 :生化学辞典第 3版 (東京化学同人）： p422 (グノレコース調節タンパク質の項）、 p607 (GRP94の項）など。

非特許文献 2 :実験医学増刊、「成熟 ·展開するアポトーシス研究」、羊土社、 2004年発行： p66〜72 (小胞体ストレスによるアポトーシス）

非特千文献 3： Ί omida A et al, Drug resistance mediated by cellular stressresponse to the microenvironment of solid tumors Anticancer Drug Des (2): 169-77 (1999) 非特許文献 4 : Jamora C, et al, 'Inhibition of tumor progression by suppression ofstr ess protein GRP78/Bip induction in fibrosarcoma B/C10ME" Proc Natl Acad SciUS A. (15):7690-4 (1996)

非特許文献 5 : Miyake H.， et al 'Stress protein GRP78 prevents apoptosis induced b ycalcium ionophore, ionomycin, in human prostate cancer cells" J Cell Biochem.(3): 396-408 (2000)

特許文献 6： Hae-Ryong Park, et al "Versipelostatin, a novel GRP78/Bip molecula rchaperone down-regulator of microbial origin etrahedron Letters(43) :6941-6945 (2002)

非特許文献 7： Park HR, et al "Effect on tumor cells of bloc ing survival responseto glucose deprivation" J Natl Cancer Inst. (17): 1266- 7 (2004)

非特許文献 8 : Park HR., et al Effect on tumor cells of blocking survival responseto glucose deprivation" J Natl Cancer Inst (17): 1300—10 (2004)

非特許文献 9 : Lee AS., et ai The glucose-regulated protein: stress induction andcli nical application Trends Biochem Sci. (8):504_10 (2001)

非特許文 i¾ 0 : Takahashi K., et al "Sw-163A and B, novel immunosuppressantspro duced by Streptomyces sp." J Antibiot (11):867_73 (2001)

特許文献 11： Takeda Y. , et al "Nuclear magnetic resonance and biosyntheticstudi es of neoantimycin and structure elucidation of isoneoantimycin, a minormetabolite r elated to neoantimycin." J Nat Prod (8):978— 81 (1998)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 前記の通り、がん細胞において、 GRP78の発現誘導を抑制する物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

[0009] そこで、本発明は、 GRP78の発現誘導を抑制する物質を探索し、新規抗がん剤を見い出すことを主な目的とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者は、前記探索を行った結果、 GRP78の発現誘導を抑制する物質として、下記の一般式 [ィ匕 1]で表される新規化合物を新規に見い出し、ブラナスタチン (Pm nustatin)と命名した。また、プラナスタチンの化学構造のうち、 Rカ^チル基、 Rが

1 2 アンティソブチル基の化合物を、プラナスタチン Aと命名した。

[0011] そこで、本発明では、下記の一般式 [ィ匕 1]で表される新規化合物のブラナスタチン又はその塩、並びに下記の化学式 [ィヒ 2]で表される新規化合物のブラナスタチン A 又はその塩、を提供する。なお、一般式 [化 1]中、置換基 R、 Rは、それぞれ、ダリ

1 2

シン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システィン、メチォニン、ァスパラギン、グルタミン、プロリン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、ァスパラギン酸、グノレタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかのアミノ酸の側鎖構造を表す。上記構造のうち、置換基 R、 R 、それぞれ、メチル基（ァラ二

1 2

ンの側鎖構造）、イソプロピル基 (パリンの側鎖構造）、アンティソブチル基（ロイシンの側鎖構造）、のいずれかである場合が、特に、好適である。

[化 1]

また、前記探索の結果、前記一般式 [化 5]で表した化合物（以下、「ネオアンチマイシン類縁体」とする。）にも、 GRP78の発現を抑制する作用があることを、新規に見い出した。そこで、本発明では、 GRP78の発現を抑制する、下記の一般式 [化 3]で表されるネオアンチマイシン類縁体又はその塩、並びに GRP78の発現を抑制する、下記の化学式 [ィ匕 4]で表される SW—163A又はその塩をも提供する。なお、下記の一般式 [化 3]中、置換基 R、 Rは、それぞれ、グリシン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソ

1 2

ロイシン、セリン、トレオニン、システィン、メチォニン、ァスパラギン、グノレタミン、プロリン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、ァスパラギン酸、グノレタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかのアミノ酸の側鎖構造を表す。上記構造のうち、置換基 R、 R力それぞれ、メチル基（ァラニンの側鎖構造）、イソプロピル基 (パリン

1 2

の側鎖構造）、アンティソブチル基（ロイシンの側鎖構造）、のいずれかである場合が、特に、好適である。

[化 3]

[化 4]

[0013] 前記の通り、がん細胞において、 GRP78の発現誘導を抑制する物質は、抗がん剤として、有効な可能性がある。従って、上述の各化合物のいずれかを少なくとも含有する医薬組成物は、抗がん剤として、有効な可能性がある。

[0014] なお、上記各化合物は、例えば、ストレプトマイセスヴィオラセォニガー（Strepto myces violaceoniger) 4521— SVS3株（茨城県つくば巿東 1— 1— 1中央第 6に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、受託番号 FERM BP— 10548 寄託日平成 18年 3月 3日）などの代謝産物として、生産できる。

発明の効果

[0015] 本発明に係る化合物は、 GRP78の発現誘導を抑制し、がん細胞のアポトーシス（細胞死）を誘導すると推定されるため、杭がん剤として、有効な可能性がある。

図面の簡単な説明

[0016] [図 1]ブラナスタチンに、 GRP78発現誘導抑制作用があることを示すグラフ。

[図 2]SW_ 163Aにも、 GRP78発現誘導抑制作用があることを示すグラフ。 (Prunus tation Aおよび SX- 163Aの HT1080 G-L細胞における GRP78プロモーター制御ルシフェラーゼ産生抑制効果（黒丸： Prunustation A、黒三角： SW-163A)

[図 3]ブラナスタチン力 HSP70発現誘導にはほとんど影響を与えないことを示すグラフ。

[図 4]ブラナスタチン力グルコース飢餓条件下においてのみ、 GRP78の発現誘導を抑制することを示すウェスタンプロット写真。

[図 5]ブラナスタチン力 S、アポトーシス（細胞死）を誘導することを示したグラフ。

[図 6]ストレプトマイセスヴィオラセォニガー 4521—3¥33株の電子顕微鏡写真（低倍率)。

[図 7]ストレプトマイセスヴィオラセォニガー 4521— SVS3株の電子顕微鏡写真（高倍率)。

発明を実施するための最良の形態

[0017] <本発明に係る化合物について > :

本発明に係るブラナスタチンの一例として、ブラナスタチン Aの物理学的性状を表 1 に示す。

[0018] なお、各データは、以下の手順で分離'精製したブラナスタチン Aについて測定したデータである。まず、ストレプトマイセスヴィオラセォニガー 4521— SVS3株の培養液（2L)から菌体を遠心分離し、培養菌体をアセトンで抽出した。次に、アセトン抽出物を濃縮後、酢酸ェチルで 2回抽出し Na SOを用いて脱水した後、減圧下で

2 4

濃縮乾固した。次に、粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、 n—へキサン—酢酸ェチル（2 : 1)で展開し、活性化区分を濃縮した。次に、 Sephadex LH —20カラムクロマトグラフィー（内径 20mm、長さ 500mm)に供し、クロ口ホルム一メタノール（1 : 1)でゲル濾過を行レ、、活性画分を集め濃縮した。さらに、 80%メタノーノレを展開溶媒として用いた逆相 HPLC (PEGASIL 〇DS、内径 20mm、長さ 250m m)を行うことにより、 2Lの培養液力、らプラナスタチン Aを 2. 5mg単離した。

[表 1]

Prunustatin A

Appearance Pale yellow powder

MP 103 ~ 106°C

[afo +24.7。（c 0.32, CHCI₃)

Molecular formula C3 H 0N2O12

HRFAB-MS (mlz)

Found 669.2668 (M+H)⁺

Calcd 669.2660

UV ^?^Hnm (e) 340 (6,500)

IR v瞧 (KBr) cm"¹ 3400, 1750, 1720,

1640, 1250 表 1中、

(1)「Appearance」は物質の性状を示し、「Pale yellow powder」は青黄色粉末状であることを示す。

(2)「MP」は融点（Melting Point)を示す。

(3) [ひ ]は、比旋光度を示す。「27」は測定温度を示し、「D」はナトリウム D線を用いて測定したことを示す。「c0. 32」は溶液濃度を、「CHC1」はクロ口ホルム中で測定し

3

たことを示す。

(4)「Molecular formula」は分子式を示す。

(5)「HR_FAB MS (High— Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectra)」は高分解能 FAB質量分析装置によって測定した、ブラナスタチン Aの精密質量 (m/z)を示す。「found」は実測値（[M + H] ⁺)を、「calcd」は計算値を示す。

(6)「UV」は紫外線吸収スペクトルを、「え nm ( ε )」は極大吸収を、「MeOH」は max

メタノール中で測定したことを示す。 (7)「IR」は赤外線吸収スペクトルを、「 υ cm" Jは極大吸収を、「KBr」は臭化力

max

リウム錠剤法で測定したことを示す。

また、プラナスタチン Aの¹³ C—核磁気共鳴スペクトル及び¹ H—核磁気共鳴スぺタトル^表 2に示す。表 2中、「CDC1」は重クロ口ホルム溶液を用いて測定したことを示

3

す。

[表 2]

Ή and C NMR were observed at 500 and 125 MHz, respectively.

[0021] なお、ネオアンチマイシン類縁体（SW— 163A、 SW— 163B、ネオアンチマイシン

)の物理学的性状については、公知である（非特許文献 10、 11参照）。

[0022] その他、本発明に係る各化合物には、その塩、溶媒和物なども含まれる。塩としては、例えば、アルカリ金属塩 (ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩など）、金属塩（アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩など）、無機塩 (酢酸塩、アンモニゥム塩など）、有機アミン塩 (ジべンジルァミン塩、ダルコサミン塩、エチレンジァミン塩、ジェチルァミン塩、トリェチルァミン塩、ジシクロへキシルァミン塩、ジエタノールアミン塩、テトラメチルアンモニア塩など）、アミノ酸塩（グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オル二チン塩、ァスパラギン塩など)などが適用できる。

[0023] <本発明に係る杭がん剤について >：

本発明に係る杭がん剤は、本発明に係るブラナスタチン (それらの塩を含む)若しくはネオアンチマイシン類縁体 (それらの塩を含む）力少なくとも含有していればよぐ医薬組成物の剤型などによって、狭く限定されない。また、本発明に係る化合物など以外の組成物が含まれる場合も、本発明に係る杭がん剤に含まれる。

[0024] 即ち、本発明に係る抗がん剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤などに製剤化してもよい。また、本発明に係る抗がん剤の成分中に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などを適宜添加してもよい。

[0025] <本発明に係る化合物の生産菌並びに生産方法について（一例） >：

プラナスタチン及びネオアンチマイシン類縁体は、例えば、放線菌の「ストレプトマイセスヴィオラセォニガー 4521— SVS3株」を用いて生産できる。本菌株は寄託を行った (茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1中央第 6に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、受託番号 FERM BP— 10548 寄託日平成 18年 3月 3日）。なお、本菌株の同定については後述する。

[0026] 本菌株の培養は、通常の放線菌 (ストレブトマイセス）と同様の方法により行うことができる。例えば、培養温度 27°C (24〜30°C)、好気的条件 (振盪培養、通気撹拌培養など)で培養を行う。

大量液体培養を行う場合、例えば、まず、 2〜3日前培養を行った後、本培養を行つてもよい。少量の培地で前培養を行うことにより、菌株の増殖を活性化できるため、前培養後、その培養液を大量の培地に摂取することにより、培養の効率化を図ることができる。

なお、培養温度、通気量、培養時間などの培養条件は、適宜、変更可能である。

[0027] 本発明に係るブラナスタチン又はネオアンチマイシン類縁体の分離'精製は、公知の方法により、行うことができる。

例えば、まず、前記培養液を遠心分離又はろ過などした後、菌体成分を分離し、その上清又はろ液を回収する。

次に、ブラナスタチンの精製を行う。ブラナスタチンの精製は、例えば、シリカゲルなどの担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過用樹脂を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換若しくは陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー、 HPLC、 GRP78の発現活性抑制を利用した方法などにより、行うことができる。

[0028] その他、 SW—163Aは、例えば、プラナスタチン Aを、 NaBH4 (ソディウムボロハイドライド）を用いて還元することによつても、得ることができる。

実施例 1

[0029] 実施例 1は、本発明に係るブラナスタチンに、 GRP78発現誘導抑制作用があることを示す実験である。

[0030] 実験の概要は次の通りである。

「ルシフェラーゼ」は、発光物質ノレシフェリンの酸化反応を触媒する酵素である。ルシフェリンはルシフェラーゼの作用により、酸化し、発色する。

そこで、まず、ベクターに、 GRP78のプロモーター遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）を揷入する。ルシフェラーゼ遺伝子は、プロモーターの下流に揷入する。次に、そのベクターをがん細胞に導入する。

これにより、 GRP78の発現を促進する物質が、がん細胞に供給されると、その候補物質がプロモーター部位に作用し、ルシフェラーゼを発現する。発現したルシフェラーゼは、ルシフェリンを酸化し、発色させるため、発色強度を検出することにより、 GR P78の発現誘導を検出できる。

なお、本実験では、がん細胞として、 HT1080G— L細胞を用いた。

[0031] 結果を図 1に示す。図中、縦軸「Relative luciferase activity」は、ルシフェラーゼ活性 (検出した発色強度）を示す。「control」は無添カ卩の場合の発色強度、「2—

DG」は前記がん細胞に 2—デォキシグルコース（2— deoxyglucose)を 1 OnM添カロした場合の発色強度、「P. A.」は前記がん細胞にブラナスタチン Aを添加した場合の発色強度、をそれぞれ表す。

なお、デォキシグノレコースは、グノレコース代謝阻害剤であり、がん細胞内において

、小胞体ストレスを誘導する化合物である。

[0032] 図 1の左から二番目のバーが示すとおり、がん細胞にデォキシグルコースを供給した場合、 GRP78の発現が誘導された。即ち、がん細胞における小胞体ストレスは、 G

RP78の発現を誘導することを確認できた。

[0033] それに対し、図 1の左から三番目から一番右までの各バーが示すとおり、がん細胞にデォキシグノレコースとブラナスタチン Aを供給すると、 GRP78の発現誘導が抑制された。また、ブラナスタチン Aの供給量が大きいほど、 GRP78の発現誘導は、大きく抑制された。

[0034] 以上の結果は、本発明に係るプラナスタチン A力がん細胞において、 GRP78の発現誘導を抑制する作用があることを示す。

実施例 2

[0035] 実施例 2は、本発明に係るネオアンチマイシン類縁体にも、 GRP78発現誘導抑制作用があることを示す実験である。実験概要は、実施例 1とほぼ同様である。

[0036] 結果を図 2に示す。図中、縦軸「Relative luciferase activity」は、ルシフェラーゼ活性（検出した発色強度）を、横軸「Concentration (nM)」はプラナスタチン A又は SW—163Aの濃度を、それぞれ示す。図中、黒丸はプラナスタチン Aのルシフエラーゼ活性を、黒三角は SW163Aのルシフェラーゼ活性を、それぞれ示す。

[0037] 図 2に示すとおり、がん細胞に SW—163Aを供給した場合にも、プラナスタチン Aと同様、発色強度が減少した。また、両化合物とも、濃度が高くなるに従い、発色強度が減少した。なお、ブラナスタチン Aの IC 値 (発色強度が 50%阻害される濃度）は 1

50

. 9nM、 SW— 163Aの IC 値は、 12· 9nMだった。

50

[0038] 以上の結果は、 SW— 163Aにも、 GRP78の発現誘導を抑制する作用があることを示す。実施例 3

[0039] 実施例 3は、本発明に係るブラナスタチンに、 HSP70発現誘導抑制作用があるか、調べた実験である。

[0040] 「HSP70」は、 GRP78と同じファミリーに属する分子シャペロンで、ヒートショック（熱ショック）が加わると、発現が誘導されることが知られてレヽる。

本実験は、プラナスタチン力 GRP78だけでなぐ他の分子シャペロンの発現誘導を抑制する作用があるかどうか、調べた実験である。実験の概要は、ほぼ実施例 1と同様である。

[0041] 結果を図 3に示す。図中、縦軸「Relative luciferase activity」は、ルシフェラーゼ活性 (検出した発色強度）を示す。「none」はヒートショックを加えない場合の発色強度、「Heat shock」は前記がん細胞にヒートショックを加えた場合の発色強度、「P . A.」は前記がん細胞にブラナスタチン Aを添加した場合の発色強度、をそれぞれ表す。

[0042] 図 2の左から二番目のバーが示すとおり、がん細胞にヒートショックを加えた場合、

HSP70の発現が誘導された。

[0043] それに対し、図 2の左から三番目から一番右のバーが示すとおり、がん細胞にヒートショック付加とブラナスタチン A添カ卩の両方を行った場合、 HSP70の発現誘導はほとんど抑制されなかった。

[0044] 以上の結果は、本発明に係るブラナスタチン力 HSP70の発現誘導にはほとんど影響を与えないこと、即ち、本発明に係るブラナスタチンが、 GRP78の発現誘導抑制に、特異的に作用することを示す。

実施例 4

[0045] 実施例 4は、本発明に係るプラナスタチン力グルコース飢餓下でのみ、 GRP78発現抑制作用を有することを示した実験である。

[0046] 前述の通り、 GRP78は、グルコース飢餓条件下、若しくはツユ力マイシンなどの存在下で、発現が誘導されることが知られている。そこで、本実験では、ブラナスタチン力ッニカマイシン存在下においても、 GRP78発現誘導抑制作用を持つか、調べた [0047] 実験の概要は次の通りである。

まず、 HeLa細胞（がん細胞）を DMEM培地で培養した。次に、培地中に、プラナスタチン Aを各濃度添カ卩し、その 30分後に、 2—デォキシグルコース若しくはッニカマイシンを各濃度添加し、 18時間培養した。

次に、培養した細胞を集めた後、抗 GRP78抗体を用いて、ウェスタンプロットを行レ、、発現した GRP78を検出した。

[0048] 結果を図 4に示す。図中、上の写真は 2 _デォキシグノレコースを添カ卩した場合のゥエスタンブロット写真、下の写真はツユ力マイシンを添加した場合のウェスタンブロット写真である。「2_DG」は 2_デォキシグルコースを、「Prunusutatin A」はプラナスタチン Aを、「TM」«ツユ力マイシンを、それぞれ示し、各数値は添加量を示す。「 GRP78」は GRP78のバンドの位置を、「actin」はァクチンのバンドの位置を、それぞれ示す。なお、ァクチンのバンドは、各実験条件において、集めた細胞数がほぼ同量であることを示すコントロールである。

[0049] 図 4の上のウェスタンブロット写真にっレ、て、左から二番目及び三番目のレーンでは、 GRP78のバンドが検出された。これは、 2—デォキシグルコースの添加により、 G RP78の発現が誘導されたことを示す。

それに対し、左力四番目力一番右の各レーンでは、 GRP78のバンドは減衰し、特に、左から四番目力六番目までの各レーンでは、バンドがほとんど消失した。これは、ブラナスタチン A添カ卩により、 GRP78の発現誘導が抑制されたことを示す。

[0050] 図 4の下のウェスタンブロット写真にっレ、て、左から二番目及び三番目のレーンでは、 GRP78のバンドが検出された。これは、ッニカマイシンの添加により、 GRP78の発現が誘導されたことを示す。

また、左から七番目力も一番右までの各レーンでも、左から二番目及び三番目のレーンと同様のバンドが検出された。これは、ツユ力マイシンの添加により GRP78の発現を誘導した場合、ブラナスタチン Aが、 GRP78の発現誘導を抑制しないことを示す

[0051] 従って、以上の結果は、ブラナスタチン力グルコース飢餓条件下におレ、てのみ、 GRP78の発現誘導を抑制することを強く示唆する。実施例 5

[0052] 実施例 5は、本発明に係るブラナスタチンが、 GRP78発現誘導を抑制するだけでなぐアポトーシス（細胞死)も誘導することを示した実験である。

[0053] 実験の概要は次の通りである。

「propidium iodide」は、核酸染色色素の一つで、死細胞内に入り込み、死細胞内の DNA二重らせんにインター力レートする蛍光色素である。そこで、がん細胞にプラナスタチン Aを供給した後、 propidium iodideで死細胞を染色し、死細胞の数を計測することにより、アポトーシスが起こっているかどうか調べた。

[0054] 具体的な手順は次の通りである。

まず、 HT1080細胞（がん細胞）を、プラナスタチン Aと、ッニカマイシン又は 2—デォキシグルコースと、で処理した。次に、前記細胞を propidium iodideで染色した。次に、落射蛍光顕微鏡を用いて、 propidium iodideで染色された死細胞の細胞数を計測した。

[0055] 結果を図 5に示す。図中、縦軸は細胞死率（％)を示す。「control」は無添力卩の場合、「TM」はッニ力マイシンを添加した場合、「2— DG」は 2—デォキシグルコースを添加した場合、「PA」はプラナスタチン Aを添カ卩した場合、であることを示す。

[0056] 図 5中、左から八番目力 ^—番目までのバーと比較して、左から十二番目から一番右までのバーでは、細胞死率が顕著に上昇した。

[0057] この結果は、プラナスタチンが GRP78の発現誘導を抑制することにより、アポトーシスが誘導されることを強く示唆する。即ち、ブラナスタチンは、抗がん剤として、有効である可能性を強く示唆する。

実施例 6

[0058] ストレプトマイセスヴィオラセォニガー 4521— SVS3株の同定について、実施例

6に記載する。

[0059] 本菌株は、沖網県久米町で採取した土壌から分離された放線菌である。その形態的性質、培養的性質、生理学的性質は、次の通りである。

[0060] (1)形態的性質：

本菌株の電子顕微鏡写真を図 6、図 7に示す。気菌糸は、長い主軸を形成し、その主軸は不規則に分枝していた。分枝の先端には、 10又はそれ以上からなる、コンパクトな 3〜6回転のらせん状の胞子鎖が形成されていた。基生菌糸の分断は観察されなかった。

胞子は、非運動性で、培養初期にはシースに覆われ胞子の形態が判別できなかつたが、培養開始から 3週間経過すると、胞子がシースから突出し、楕円形の胞子が観察された。菌核、胞子嚢、その他の特殊形態は観察されなかった。

細胞壁化学型は、（I)型であり、 LL—ジアミノピメリン酸を含んでいた。 DNAの GC 含量は、 73. 2。/。であった。

(2)培養的性質：

培養的性質を表 3に示す。集落表面の菌叢色は灰色系列であるが、培養が長期に及ぶと黒湿化した。裏面色は無機塩スターチ寒天培地、オートミール寒天培地、チロシン寒天培地などでは淡黄色を呈した力 S、その他の寒天培地では赤紫色から喑赤紫色を呈し、また、 pHにより変化しなかった。拡散性色素の生成は認められなかった

[表 3]

. Streptomyces violaceoniger 4521-SVS3株の培養性状

培地集落表面の菌叢色集落の裏面色拡散性色素シュク口ース · 灰色系列赤紫色なし

硝酸塩寒天グノレコ一ス · 灰色系列喑赤味灰色なし

ァスパラギン寒天グリセリン · 灰色系列赤紫色なし

ァスパラギン寒天無機塩灰色系列淡黄色なし

スターチ寒天チロシン寒天灰色系列黄味茶色なし栄養寒天気菌糸なし淡黄色なし

1―ス卜 · ：^; i大灰色系列紫味灰色から暗赤味紫色なしォートミール ·寒天灰色系列淡黄色なし

(3)生理学的性質：

生理学的性質を表 4に示す。本菌株は、中温性であり、メラニン様色素の産生は、チロシン寒天培地、ペプトン 'イースト '鉄寒天培地、トリプトン 'イースト 'ブロスでは、認められなかった。

[表 4] Streptomyces violaceoniger 4521-SVS3株の生理的性状

生育温度範囲 17一 40。C

最適温度 20一 37。C

メラニン様色素

チロシン寒天

ペプトン ' ィ- スト鉄寒天

トリプトン ·イースト ·ブロス

スターチの加水分解

ゼラチンの液化

脱脂粉乳のぺプトン化

脱脂粉乳の凝固

硝酸塩の還元

炭素源の同化

D-グゾレコ一ス +

L-ァラビノ- ス

D-キシ口- ス +

D-フラクト- ス +

シュクロース +

レラムノ- ス +

ラフイノース

i-イノシト― ル +

D-マンニット +

ガラクトース +

ァドニトール

セ /レビオース +

ィヌリン

メルビオース + 本菌株は、胞子がらせん状に長く連鎖する胞子鎖形態を持っていること、及び、細胞壁化学型が（I)型であること、より、ストレブトマイセス属に位置する菌種であると推定した。

そこで、ストレブトマイセス属の菌種のうち、上記諸性質と一致するものを、「細菌名承認リスト、 1980」及びそれ以後の有効名リストを用いて、検索した。

その結果、近縁種として、ストレブトマイセスヴィオラセォニガーを発見した。本菌株とストレブトマイセスヴィオラセォニガーとを比較したところ、ァラビノースとラフイノースの炭素源の同化が異なっていたが、その他の性質はよく一致していた（表 5参照 )₀

そこで、発明者は、本菌株を、ストレブトマイセスヴィオラセォニガーに分類される胞裏抱 ¾

叢子面子

ー菌株と鎖表色色して同定し、ストレプトマイセスヴィオラセォニガー 4521— SVS3株と命

形面

名した。態

[表 5] 灰螺赤平不

鮮紫旋色滑

Streptomyces violaceoniger 4521-SVS3株と近縁種との比較

― 4521-SVS3 Streptomyces violaceoniger 状 + +

+ +

明色 + +

色 + +

pH感受性

拡散性色素産生

pH感受性

メラニン様色素産生

スターチの加水分解

確酸塩の還元

生育温度 45T

炭素源の同化

ァラビノ- ス +

キシ口- ス + +

イノシト- ル + +

マンニット + +

ラムノ- ス + +

ラフイノース +

シュクロース + +

フラクトース + +

実施例 7

[0064] 実施例 7では、ストレプトマイセスヴィオラセォニガー 4521— SVS3株の培養方法の一例を示す。

[0065] まず、「表 6」に示した組成の前培養培地 15mlを、 50mlの大型試験管に分注、殺菌後、本菌株を培養スラント上より白金耳接種し、 27°C、 3日間、培養したものを種母とする。

[表 6] 前培養培地（pH7. 2)

S t a r c h 1. 0%

P o 1 y p e p t o n 1. 0%

Mo l a s s e s 1. 0 %

Me a t e x t r a c t 1. 0% 次に、 500ml容コブ付き三角フラスコに、「表 7」に示した組成の生産培地 100mlずつ分注後、殺菌する。次に、各フラスコに、上記種母を 2mlずつ添加し、ロータリーシエーカー上で、 27°C、 5日間、培養する。

[表 7]

[0067] 例えば、上記手順で本菌株を培養することにより、本菌株を大量培養できるため、本発明に係る化合物（ブラナスタチン、 SW163など）を含有する培養液を高効率に得ること力 Sできる。

産業上の利用可能性

[0068] 本発明に係るブラナスタチンは、抗がん剤として、適用可能性がある。

[0069] プラナスタチンは、グルコース飢餓状態においてのみ、 GRP78の発現誘導を抑制するため、がん細胞以外の細胞の反応系に与える影響が少ないと推測する。従って

、本発明に係る杭がん剤は、従来のものよりも、副作用が少なぐ安全性が高い可能十生がある。

Claims

請求の範囲

下記の一般式 [ィ匕 1]で表されるブラナスタチン又はその塩。

(式中、置換基 R、 Rは、それぞれ、グリシン、ァラニン、バリン、ロイシン、イソ口イシ

1 2

ン、セリン、トレオニン、システィン、メチォニン、ァスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルァラニン、チロシン、トリプトファン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかのアミノ酸の側鎖構造を表す。）

下記の化学式 [ィヒ 2]で表されるブラナスタチン A又はその塩。

[化 2]

請求項 1記載のブラナスタチン又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。下記の一般式 [ィヒ 3]で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。

[化 3]

1 2

下記の化学式 [ィ匕 4]で表される SW163A又はその塩を有効成分として含有する抗がん剤。

[化 4]

[6] 請求項 1記載のブラナスタチンを生産できる、ストレブトマイセスヴィオラセォニガ一 4521—SVS3株 (茨城県つくば巿東 1 -1-1中央第 6に所在の独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、受託番号 FERM BP— 105 48 寄託日平成 18年 3月 3日）。