WO2002006482A1

WO2002006482A1 - Receptor protein specifically recognizing bacterial dna

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Publication number: WO2002006482A1
Application number: PCT/JP2001/004731
Authority: WO
Inventors: Shizuo Akira; Hiroaki Hemmi
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-07-19
Filing date: 2001-06-05
Publication date: 2002-01-24
Anticipated expiration: 2003-01-19
Also published as: DE60143845D1; US7507872B2; EP1302541B1; CA2385302A1; ATE495256T1; EP1302541A4; JP2002034565A; US20030124655A1; EP1302541A1; CA2385302C

Description

細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質技術分野

本発明は、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質、該受容体夕ンパク質の遺伝子及びそれらの利用に関する。明田

背景技術 .

トール（T o 1 1 ) 遺伝子は、ショウジヨウバエの胚発生中の背腹軸の決定 (Cell 52， 269-279, 1988、 Annu. Rev. Cell Dev. Biol.12, 393-416, 1996)、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であることが知られている（Cell 86， 973-983， 1996)。かかる T o 1 1は、細胞外領域に口イシンリッチリピート（L RR) を有する I型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類ィン夕一ロイキン一 1受容体（ I L— 1 R) の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（ Nature 351， 355-356, 1991、 Amm. Rev. Cell Dev. Biol.12， 393-416, 1996、 J. Leukoc. Biol.63, 650-657, 1998)。

近年、 T o l l様受容体（T L R) と呼ばれる T ο 1 1の哺乳類のホモログが同定され、 TL R 2や TL R 4など現在までに 6つのファミリ —が報告されてレる (Nature 388, 394-397, 1997、 Pro Natl. Acad. Sci. USA 95， 588-593, 1998、 Blood 91, 4020-4027, 1998、 Gene 231, 59-65, 1999)。この TL Rファミリ一は、上記 I L— 1 Rと同様にアダプタータンパク質である My D 8 8を介し、 I L一 1 R結合キナーゼ（ I R A K) をリクルートし、 TRAF 6を活性化し、下流の NF— κ Βを活性ィ匕することが、失口られている (J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998, Mol. Cell 2, 253-258, 1998、 I雇 unity 11, 115-122， 1999)。また、哺乳類における T L Rファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターンゼ、識受谷体 (P R R ： pattern recognition receptor; として、先天白勺な免疫認識に関わっているとも考えられている（Cell 91， 295-298, 1997)。上記 P R Rにより認識される病原体会合分子パターン（P AMP ： patnogen-associated molecular pattern) の一つよ、クフム陰' f生 ¾の外膜の主成分であるリポ多糖（L P S) であって（Cell 91， 295-298, 1997). かかる L P Sが宿主細胞を刺激して宿主細胞に TN F , I L - 1及び I L一 6等の各種炎症性サイトカインを産生させること（Adv. Immunol. 28, 293-450, 1979、 Annu. Rev. Immunol.13, 437-457, 1995) や、 L P S結合タンパク質（L B P : LPS-bindingprotein) により捕獲された L P Sが細胞表面上の C D 1 4 に引き渡されることが知られている (Science 249, 1431-1433, 1990、 Annu. Rev. Immunol. 13， 437-457, 1995)。本発明者らは、 T L R 4のノックアウトマウスを作製し、 T L R 4ノックァゥトウスが上記グラム陰性菌の外膜の主成分である L P S に不応答性であること（J. Immunol.162, 3749-3752， 1999 ) や、 T L R 2ノックアウトマウスを作製し、 TL R 2ノックアウトマウスのマク口ファージがグラム陽性菌細胞壁やその構成成分であるべプチドグリ力ンに対する反応性が低下すること（Immunity, 11, 443-451, 1999 ) を報告している。

他方、細菌 DNA (バクテリア由来 D NA) や非メチル化 C p G配列を含むオリゴヌクレオチドが、マウス及びヒトの免疫細胞を刺激するこ t (Trends Microbiol. 4， 73-76, 1996、 Trends Microbiol. 6, 496-500, 1998)や、 I L一 1 2及び I F Nァの放出に支配される Tヘルパー 1細胞（T h 1 )様炎症性応答を剌激すること（EMBO J.18, 6973-6982, 1999、 J. Immunol. 161, 3042-3049, 1998、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9305-9310， 1999)力、ら、 C p G配列を含むオリゴヌクレオチドは、癌、アレルギ一及び伝染病のワクチンを含むワクチン戦略のアジュバントとしての使用可能性が提唱されている（Adv. Immunol. 73, 329-368， 1999、 Curr. Opin. Immunol. 12, 35-43, 2000、 Immunit 11, 123-129, 1999)。このように臨床実用において効果が期待されるにも関わらず、非メチル化 C p G配列を含む細菌 D N Aが免疫細胞を活性化する分子メカニズムはよくわかっていない。

上記のように、メチル化されていない C p Gモチーフを含有するバクテリア由来 D N Aは免疫細胞を非常に活性化し、 T h lの応答を誘導するが、その分子レベルでの活動はあまり理解されていない。本発明の課題は、細菌 D N Aの非メチル化 C p G配列を含むオリゴヌクレオチドの分子レベルでの作用を明らかにすることができる、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する T L Rフアミリーのメンバ一受容体タンパク質 T L R 9や、それをコードする D N Aや、細菌性伝染病に対する宿主免疫細胞の応答性を調べる上で有用な実験モデル動物を提供することにある。

細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体として、先天的な免疫認識に関わっている哺乳類における T L Rファミリ一は、現在までに 6 つのメンバ一（T L R 1— 6 ) が公表されており（Nature 388, 394-397, 1997、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 588-593, 1998、 Gene 231, 59-65, 1999)、 T L R 7及び T L R 8の新たな 2つのメンバーが GenBankに登録されている（登録番号 A F 2 4 0 4 6 7及び A F 2 4 6 9 7 1 )。また、 T L R 9についても完全長 c D N Aが見い出され GenBankに登録されている（登録番号 A F 2 4 5 7 0 4 )が、その機能については知られていなかった。本発明者らは、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する T L Rフアミリーのメンバ一受容体夕ンパク質をコードする D NAを、 B L A S Tサーチによりスクリーニングし、既に同定されている各種 TL Rと高い相似性を有する多くのシークェンス ·タグ（E S T) クロ一ンをスクリーニングし、これらの遺伝子フラグメントをプローブにして、マウス ·マクロファージ c DNAライブラリーから完全な長さを有する c DN Aを単離し、これを用いてヒト c DNAも単離した。次に、これら c D N Aの塩基配列を解析し、この TL Rファミリ一に L RR及び T I R領域などの保存領域が存在する T L R 9であることを確認した _t そこで、この TL R 9ノックァゥトマウスを作製し、 TL R 9が細菌 D N Aの非メチル化 C p G配列を含むオリゴヌクレオチドの受容体夕ンパク質であることを明らかにし、本発明を完成するに至った。発明の開示

すなわち本発明は、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする DNA (請求項 1 ) や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質が、以下の（a)又は（b)のタンパク質であることを特徴とする請求項 1記載の DN A(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aに対して反応性を有するタンパク質（請求項 2) や、配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項 1記載の DNA (請求項 3) や、請求項 3記載の遺伝子を構成する DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズすることを特徴とする請求項 1記載の DN A (請求項 4) や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質が、以下の（a) 又は（b)のタンパク質であることを特徴とする請求項 1記載の D N A (a)配列番号 4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（b)配列番号 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化 C P G配列を有する細菌 DN Aに対して反応性を有するタンパク質（請求項 5) や、配列番号 3に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項 1記載の D NA (請求項 6) や、請求項 6記載の遺伝子を構成する DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズすることを特徴とする請求項 1記載の DNA (請求項 7) に関する。

また本発明は、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質（請求項 8 ) や、配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質（請求項 9) や、配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質（請求項 1 0) や、配列番号 4 に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質（請求項 1 1 ) や、配列番号 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質（請求項 1 2) に関する。

また本発明は、請求項 8〜 1 2のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び Z又はべプチドタグとを結合させた融合タンパク質 (請求項 1 3) や、請求項 8〜 1 2のいずれか記載のタンパク質と特異的に結合する抗体（請求項 1 4 ) や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 1 4記載の抗体（請求項 1 5 ) や、請求項 8〜 1 2のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項 1 6 ) に関する。

また本発明は、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子が過剰発現することを特徴とする非ヒト動物（請求項 1 7 ) や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト動物（請求項 1 8 )や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して不反応性であることを特徴とする請求項 1 8記載の非ヒト動物（請求項 1 9 ) や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項 1 7〜 1 9のいずれか記載の非ヒト動物（請求項 2 0 ) に関する。

また本発明は、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、請求項 1〜 7のいずれか記載の D N Aを導入することを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質を発現する細胞の調製方法（請求項 2 1 ) や、請求項 2 1 記載の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を発現する細胞の調製方法により得られることを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞（請求項 2 2 ) に関する。

また本発明は、被検物質の存在下、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を発現している細胞をィンビトロで培養し、 T L R 9活性を測定 ·評価することを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質のァゴニスト又はアンタゴニス卜のスクリ一二ング方法（請求項

2 3 ) や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞の T L R 9活性を測定 ·評価することを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質のァゴニスト又はアン夕ゴニストのスクリ一ニング方法（請求項 2 4 ) や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子が過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞の T L R 9活性を測定 ·評価することを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質のァゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法（請求項 2 5 ) や、非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項 2 4又は 2 5記載の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質のァゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法（請求項 2 6 ) に関する。

また本発明は、請求項 2 3〜 2 6のいずれか記載の非メチル化 C p G 配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質のァゴニスト又はアンタゴニス卜のスクリーニング方法により得られる非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質のァゴニスト又はアンタゴニスト（請求項 2 7 ) や、非メチル化 C p G 配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の全部又はその一部を有効成分として含有する医薬組成物（請求項 2 8 ) や、請求項 2 7記載のァゴニスト又はアンタゴニストを有効成分として含有する医薬組成物（請求項 2 9 ) や、検体中の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする DNA と、請求項 3記載の DN Aとの塩基配列を比較することができる、請求項 3記載の DN Aを含むことを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコ一ドする D N A 配列の欠失、置換及び/又は付加に関連する疾病の診断キット（請求項 3 0 ) に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の T L R 9ノックァゥトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。

第 2図は、本発明の T L R 9ノックァゥトマウスのサザンブロット分析の結果を示す図である。

第 3図は、本発明の T L R 9ノックァゥトマウスの脾臓細胞におけるノーザンブロット分析の結果を示す図である。

第 4図は、本発明の TL R 9ノックアウトマウスと野生型マウスのァミノ酸配列の比較結果を示す図である。

第 5図は、本発明の TL R 9ノックァゥトマウス及び野生型マウスにおける C p G ODN、 P GN又は L P S誘導による TNF «、 I L一 6又は I L 1 2の産生量の結果を示す図である。

第 6図は、本発明の TL R 9ノックアウトマウス及び野生型マウスにおける C p G ODN又は L P S誘導による細胞増殖応答の結果を示す図である。

第 7図は、本発明の T L R 9ノックァゥトマウス及び野生型マウスにおける C p G ODN又は L P S誘導による I L— 1 2の産生量の結果を示す図である。

第 8図は、本発明の TL R 9ノックァゥトマウス及び野生型マウスにおける C p G ODN又は L P S誘導による CD 4 0、 C D 8 0、 CD 8 6及び MH Cクラス IIの発現量の結果を示す図である。

第 9図は、本発明の TL R 9ノックァゥトマウス及び野生型マウスにおける C p G OD N又は L P S誘導による N F - κ Βの活性化の結果を示す図である。

第 1 0図は、本発明の T L R 9ノックァゥトマウス及び野生型マウスにおける C p G ODN又は L P S誘導による J NKの活性化の結果を示す図である。

第 1 1図は、本発明の T L R 9ノックアウトマウス及び野生型マウスにおける C p G ODN又は L P S誘導による I R AKの活性化の結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明における非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAとしては、 T細胞、 B細胞、抗原提示細胞等の免疫細胞を活性化し、免疫応答を誘導することができる、メチル化されていない C p Gモチーフを有するォリゴデォキシヌクレオチド（ODN) 等のバクテリアに由来する DNA であればどのようなものでもよく、ェセリシァ · コリ、クレブシエラニュ一モニエ、シュ一ドモナス ' ァエルギノサ、サルモネラ ' チフィムリウム、セラチア · マルセッセンス、フレクスナー赤痢菌、ビブリオ - コレレエ、サルモネラ · ミネソタ、ボルフイロモナス · ジンジバリス、スタフィロコッカス · ァゥレウス、コリネバクテリゥム · ジフテリア、ノカルジァ · コエリア力、ストレプトコッカス · ニューモニァなどのバクテリア由来の DN Aを具体的に挙げることができる。

かかる非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質としては、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN A を特異的に認識することができるタンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、配列表の配列番号 2で示されるヒト由来の T L R 9や、配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識することができるタンパク質や、これらの組換えタンパク質を具体的に挙げることができる。かかる非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質は、その DN A配列情報等に基づき公知の方法で調製することができる。

また、本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする DN Aとしては、配列表の配列番号 2で示されるヒ卜由来の TL R 9をコードする DNA、例えば配列番号 1で示されるものや、配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識することができるタンパク質をコ一ドする DNAや、これら D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識することができる夕ンパク質をコ一ドする DN Aも包含され、これらはその D N A配列情報等に基づき、例えばマウス由来の T L R 9においてはマウス R AW 2 6 4. 7 c DNAライブラリーや 1 2 9ZS v Jマウス遺伝子ライブラリ一などから公知の方法により調製することができる。

また、配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、マウス由来の DNAライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーシヨンを行ない、該プロ一ブにハィブリダイズする DNAを単離することにより、受容体タンパク質 T L R 9と同効な目的とする免疫誘導非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする DNAを得ることもできる。かかる DN Aを取得するためのハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、 42 °Cでのハイブリダィゼ一ション、及び 1 X S S C、 0. 1 %の S D Sを含む緩衝液による 4 2 °Cでの洗浄処理を挙げることができ、 6 5 °Cでのハイブリダィゼ一シヨン、及び 0. 1 X S S C, 0. 1 %の S D Sを含む緩衝液による 6 5 °C での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイプリダイゼ一ションのストリンジェンシ —と同等のストリンジエンシーを実現することが可能である。

本発明の融合タンパク質とは、マウス、ヒト等の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質に、マーカ —タンパク質及び/又はペプチドタグを結合させたものをいい、マ一力一タンパク質としては、従来知られているマーカ一タンパク質であればどのようなものでもよく、例えば、アル力リフォスファタ一ゼ、抗体の F c領域、 HR P、 GF Pなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるべプチドタグとしては、 My cタグ、 H i sタグ、 F LAG タグ、 G S Tタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、 N i — NT Aと H i sタグの親和性を利用した非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質の精製や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質の検出や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。

本発明の非メチル化 C G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質を抗原として用いて常法により作製することができるが、'その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクロ一ナル抗体等の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、 T L R 9の変異又は欠失に起因する疾病の診断や T L R 9の制御分子機構を明らかにする上で有用である。

非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒ卜以外）に該非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質若しくはェピトープを含む断片、又は該夕ンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイプリド一マ法（Nature 256, 495-497, 1975)、トリオ一マ法、ヒト B細胞ハイプリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983) 及び E B V—ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985) など任意の方法を用いることができる。以下に非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質として、マウス由来の T L R 9を例に挙げてマウス由来の T L R 9に対して特異的に結合するモノクローナル抗体、すなわち抗 m T L R 9モノクローナル抗体の作製方法を説明する。

上記抗 mT L R 9モノク口一ナル抗体は、抗 mT L R 9モノクロ一ナル抗体産生ハイプリドーマをインビポ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビポ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイプリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやべニシリン等の抗生物質を含む R P M I 1 6 4 0又は MEM等の細胞培養培地を例示することができる。抗 mT L R 9モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、例えば、マウス等から得られた受容体タンパク質 T L R 9を用いて BAL BZcマウスを免役し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウス N S— 1細胞（A T C C T I B— 1 8) とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリ一ニングすることにより、抗 mT L R 9モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離 · 精製方法としては、夕ンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等の液体クロマトグラフィ一を具体的に例示することができる。

また、本発明の上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第 4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジエニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質を発現するクローンを単離 · 同定したり、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一でそのポリペプチドを精製することもできる。非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質に対する抗体は、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。

また上記抗 mTL R 9モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、 F I T C (フルォレセインイソシァネート）又はテトラメチルローダミンィソシァネート等の蛍光物質や、 ¹²⁵ I、 ³² P、 ³⁵ S又は³ H等のラジオアイソトープや、アルカリホスファタ一ゼ、ペルォキシダーゼ、 /3—ガラクトシダ一ゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、ダリ —ン蛍光タンパク質（GF P) 等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合夕ンパク質を用いることによって、上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、 R I A法、 E L I S A法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、ォクタロニー法等の方法を挙げることができる。

本発明はまた、上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、 Davis ら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) 及び Sambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 D E A E—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、トランスべクシヨン (transvection), マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、スクレープローティング (scrape loading)、弾丸入 (ballistic introduction), 感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレブトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフイロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、ァスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフイラ S 2、スポドプテラ S f 9等の昆虫細胞や、 L細胞、 C H O細胞、 C O S細胞、 H e L a細胞、 C 1 2 7細胞、 B A L B Z c 3 T 3細胞（ジヒドロ葉酸レダクタ一ゼゃチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、 B H K 2 1細胞、 H E K 2 9 3細胞、 B o w e sメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。

また、発現系としては、上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、ェピソ一ム及びウィルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、 S V 4 0のようなパポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウイルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドゃファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。

上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質は、後述するように本発明のスクリーエング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、 F. Pieti'i-Ro腿 1 (Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997) らの方法な

5 どを用いることができ、また、かかる非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニゥムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ァニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ一、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ二ティ一ク口マトグラフィ一、ハイドロキシァパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、ァフィ二ティークロマトグラフィ一に用いるカラムとしては、例えば、抗 T L R 9モノクローナル抗体等の抗非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質抗体を結合させたカラムや、上記 T L R 9等の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質に通常のぺプチドタグを付加した場合は、このべプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらの非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質を得ることができる。

本発明において、上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を大量に産生する非ヒト動物をいい、また、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコ一ドする遺伝子の一部若しくは全部が破壊 ·欠損 ·置換等の遺伝子変異により不活性化され、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する

6 受容体夕ンパク質を発現する機能を失なつた非ヒト動物をいう。そして、本発明における非ヒト動物としては、ゥサギや、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明において非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して不反応性とは、細菌 D N Aによる刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることを意味する。したがって、本発明において非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して不反応性の非ヒト動物とは、細菌 D N Aによる刺激に対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ゥサギ等のヒト以外の動物をいう。また、細菌 D N Aによる剌激としては、細菌 D N Aを生体に投与するインビポでの刺激や、生体から分離された細胞に細菌 D N Aを接触させるィンビトロでの刺激等を挙げることができ、具体的には、 T L R 9ノックアウトマウス等の T L R 9遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を挙げることができる。ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち非メチル化 C P G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコ ―ドする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる非メチル化 C p G 配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質のノックアウトマウスやトランスジエニックマウスを例にとつて以下説明する。

例えば、 TL R 9等の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーから P C R等の方法により得られた遺伝子断片を用いて. 上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコ一ドする遺伝子をスクリ一ニングし、スクリーニングされた非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコ一ドする遺伝子をウィルスベクタ一等を用いてサブクローンし、 DN Aシ一ケンシングにより特定する。このクローンの非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質をコ一ドする遺伝子の全部又は一部を p MC 1ネオ遺伝子カセット等に置換し、 3 ' 末端側にジフテリアトキシン Aフラグメント（DT 一 A) 遺伝子や単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ（H S V— t k) 遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクタ一を作製する。

この作製された夕一ゲティングベクターを線状化し、エレクトロボレーシヨン（電気穿孔）法等によって E S細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、 G 4 1 8やガンシクロビア（GA N C)等の抗生物質により相同的組換えを起こした E S細胞を選択する。また、この選択された E S細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンプロット法等により確認することが好ましい。その確認された E S細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとィンタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このへテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N A を特異的に認識する受容体タンパク質ノックァゥトマウスを作製することができる。また、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質ノックァゥトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスから R N Aを単離してノーザンプロット法等により調べたり、またこのマウスの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。

また、作出された T L R 9ノックァゥトマウスが非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAに対して不応答性であることは、例えば、 C p G 〇DNを TL R 9ノックアウトマウスのマクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビポで接触せしめ、かかる細胞における TN F— α、 I L _ 6、 I L一 1 2、 I FN—ァ等の産生量や、脾臓 B細胞の増殖応答や、脾臓 B細胞表面での CD 40、 CD 8 0、 CD 8 6、 MHCクラス II等の抗原の発現量や、 N F— κ B、 J N K、 I RAK等の Τ L R 9のシグナル伝達経路における分子の活性化を測定することにより確認することができる。そして、本発明の TL R 9 ノックアウトマウスは、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N A等の作用機序の解明や細菌感染に対するワクチン開発に有用なモデルとすることができる。

非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質のトランスジエニックマウスは、 TL R 9等の非メチル化 C

9 p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする c DN Aにチキン ]3—ァクチン、マウスニューロフィラメント、 S V 4 0等のプロモーター、及びラビット）3—グロビン、 S V 4 0等のポリ A又はィントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記 c DN Aを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジエニックマウスを創製することができる。また、 c DNAを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗 DN Aを抽出し、導入した非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子をプローブとするドットハイプリダイゼ一ション法や、特異的プライマーを用いた P C R法等により行うことができる。

また、本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコ一ドする D N Aの全部あるいは一部を用いると、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の欠失又は異常に起因する疾病等の遺伝子治療に有効な細胞を調製することができる。本発明におけるこれら細胞の調製方法としては、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、上記本発明の DN Aの全部あるいは一部をトランスフエクシヨン等により導入し、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質を発現する細胞を得る方法を挙げることができ、特に、かかる非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞としては、上記 DNA等が染色体にィンテグレイトされ、スティブルに TL R 9活性を示す細胞を用いることが好ましい。

そしてまた、上記非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする D NA、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質とマーカー夕ンパク質及び Z又はべプチドタグとを結合させた融合非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質に対する抗体、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコ ―ドする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を発現する細胞等を用いると、本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質のァゴニスト又はアン夕ゴニストや、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aに対する反応性の抑制物質又は促進物質をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニングにより得られたものは、細菌感染症に対する抑制物質又は促進物質や、アレルギー性疾患若しくは癌に対する抑制剤、予防剤又は治療薬や、遺伝子治療等において副作用を抑制剤又は阻害剤や、 TL R 9 活性の欠失又は異常に起因する疾病等の診断 ·治療に有用な物質である可能性がある。

上記 TL R 9活性とは、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAと特異的に反応し、細胞内にシグナルを伝達する機能をいい、シグナル伝達機能としては、 TNF— ひ、 I L— 6、 I L一 1 2、 I FN— ァ等のサイト力インを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面において C D 40、 CD 8 0、 CD 8 6、 MH Cクラス II等の抗原を発現する機能や、 NF— κ Β、 J NK、 I R AK等の T L R 9のシグナル伝達経路における分子を活性化させる機能などを具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質のァゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、マクロファージ、脾臓細胞又は樹状細胞などの免疫細胞、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質を発現している細胞、非メチル化 C p G 配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞等の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aに対して反応性を有するタンパク質を発現している細胞をインビトロで培養し、 TL R 9 活性を測定 ·評価する方法や、野生型非ヒト動物、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物、又は、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子が過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ、脾臓細胞、又は樹状細胞などの免疫細胞の TL R 9活性を測定 ·評価する方法等を具体的に挙げることがでさる。

また、マクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価するに際し、対照として野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較 ·評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。このことは、以下に示す非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aに対する反応性の抑制物質又は促進物質のスクリー二ングにおいても同様である。

また、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対する反応性の抑制物質又は促進物質のスクリ一ニング方法としては、被検物質と非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aとの存在下、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質、又は該タンパク質を発現している細胞膜をインビトロでインキュベーションし、該夕ンパク質との反応性を測定 ·評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞と被検物質とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aの存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質をコ ―ドする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物から得られるマク口ファ一ジ又は脾臓細胞と非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aとをあらかじめィンビ,トロで接触せしめた後、該マクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定'評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aの存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物から得られるマクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞を被検物質の存在下で培養し、該マクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ若しくは脾臓細胞のマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aに対して反応性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物を細菌により感染させ、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価する方法や、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質をコ ―ドする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物をあらかじめ細菌により感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物におけるマクロファージ活性又は脾臓細胞活性の程度を測定 ·評価する方法などを具体的に挙げることができる。また、これらのスクリーニング方法に用いる非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAとしては、 C p G OD N (T C C -AT G-AC G-TT C - C T G-ATG- C T : 配列番号 5 ) を用いることが好ましいが、これに限定されるのもではない。

本発明はまた、検体中の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコ一ドする D N A配列を、本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする D N A配列と比較することからなる、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断に用いられる診断キットに関する, 非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする D N Aの変異型の検出は、遺伝子に変異がある個体を D N Aレベルで見い出すことにより行うことができ、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の過少発現、過剰発現又は変異発現により生ずる疾病の診断に有効である。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノム D N Aや、 R N A又は c D N Aを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、 P C R等により増幅したものを用いることもできる。そして、塩基配列の欠失や挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出でき、また点突然変異は増幅 D N Aを標識非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子とハイブリダィズさせることで同定することができる。このように、非メチル化 C p G 配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子の変異を検出することで、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の活性又は発現と関連する疾病の診断又は判定をすることができる。

本発明はまた、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする DN A又は RN Aのアンチセンス鎖の全部又は一部からなる非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN A を特異的に認識する受容体夕ンパク質の活性又は発現と関連する疾患の診断用プローブ、及び当該プローブ及び/又は本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質に特異的に結合する抗体を含有してなる非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質の活性又は発現と関連する疾患の診断キットに関する。前記診断用プローブとしては、非メチル化 C P G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコ —ドする DNA (c DNA) 又は RNA (c RNA) のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも 2 0ベース以上）を有するものであれば特に制限されるものではない。かかるプローブ及び/又は本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質に特異的に結合する坊体を細菌感染症等のような症状の疾患の診断薬の有効成分とするためには、プロ一ブが分解されないような適当なバッファー類や滅菌水に溶解することが好ましい。また、これらの診断薬を用いた、免疫染色法（Dev. Biol. 170, 207-222, 1995、 J. Neurobiol.29, 1-17, 1996) や、 In situ ノ Wブリダィゼーション法（j Neurobiol. 29， 1-17, 1996) や、 in situ PGR 法等の方法により細菌感染症等のような症状の疾患を診断することもでさる。

本発明の医薬組成物としては、 TL R 9等の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質の全部又はその一部や、上記受容体タンパク質のァゴニストやアンタゴニストを含むものであれば、どのようなものでもよい。具体的には、細菌感染症に対するワクチンや、癌に対するワクチンや、気管支喘息をはじめとするァレルギー疾患の治療薬や、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療や遺伝子治療において障害となる C p Gモチーフの存在による副作用の克服剤 ·抑制剤 · 阻害剤などを挙げることができる。

前記のように、本発明の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする DNA配列の欠失、置換及び/又は付加に関連する疾病の診断キットとしては、 TL R 9をコードする DNAを含むものであればどのようなものでもよく、かかる T L R 9をコードする D N Aと検体中の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする DNAとの塩基配列を比較することにより、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコ一ドする D N A配列の欠失、置換及び/又は付加に関連する疾病、例えば、癌、アレルギ一、伝染病等の診断が可能となる。

以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例 1 (TL R 9のクロ一ニング）

ヒト T L R 4の D N A配列情報を用いて、 GenBank をサーチした結果、相同性がきわめて高いマウス E S T (登録番号 A A 2 7 3 7 3 1 ; マウス）を見い出した。このマウス E S Tの P C R増幅産物をプローブとして、マウス RAW2 64. 7 c D N Aライブラリ一をスクリ一ニングし、完全な TL R 9オープンリ一ディングフレームを含む配列番号 3 に示される完全長の c DNAクローンを単離した。このマウス TL R 9 の DN A配列情報を用いて GenBank をサーチし、高い相同性を有するヒトゲノム配列を見い出した。このヒトゲノム配列に基づいて、 c DN A端部を増幅し、 U 9 3 7細胞 (J. Immunol.163, 5039-5048, 1999) から、配列番号 1に示される塩基配列を有する完全長のヒト TL R 9の c DNAを単離した。

実施例 2 (TL R 9ノックアウトマウスの作製）

1 2 9ZS V Jマウス遺伝子ライブラリ一（ストラタジーン社製）から T L R 9ゲノム D N Aを単離し、 pBluescriptll SK(+)ベクタ一（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及び DN A 配列決定により特定した。夕一ゲッティングベクターは、 L RR (ロイシンリッチリピ一ト）領域の一部分をコードする 1. O k bのフラグメントを、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（pMCl-neo；ストラ夕ジ一ン社製）に置換し、負の選択マ一カーとして単純へルぺスウィルスチミジンキナーゼ（H S V— TK) を挿入することにより構築した（図 1 )。この夕ーゲッティングベクターを線状化し、胎生 1 4. 1 日目の胚幹細胞（E S細胞）にエレクトポレーシヨンし、 G 4 1 8及びガンシクロビァに抵抗性を示す 2 9 2個のクローンを選択し、 P C R法及びサザンブロット法により 1 4個のクロ一ンをスクリーニングした。

突然変異 TL R 9対立遺伝子を含有していた 3個の標的 E Sクローンを、 C 5 7 B L/ 6マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスを C 5 7 B LZ6雌マウスと交配させ、ヘテロ接合体 F 1マウスを作製し、かかるヘテロ接合体 F 1マウスをインタ一クロスすることによってホモ接合体マウス（TL R 9ノックアウトマウス： TL R 9— ）を得た（図 2)。なお、ホモ接合体マウスの確認は、マウスの尾から抽出した各ゲノム DN Aを S c a Iでダイジェストし、図 1に示すプローブを用いたサザンブロット法により行った。本発明の TL R 9ノックアウトマウス（TL R 9— /— ) はメンデルの法則に従い作製することができ、 1 2週目までは顕著な異常を示さなかった。

突然変異により TL R 9遺伝子の不活性化が生起していることを確認するため、野生型マウス（ + Z + )及び T L R 9ノックアウトマウス（一 /-) の脾臓細胞から抽出した全 RNA ( 1 0 g) を電気泳動にかけナイロン膜に移して、 [³² P] で標識した TL R 9の C—末端フラグメント若しくは N—末端フラグメント、又は 0—ァクチン (/3— a c t i n) に特異的な c DNAを用いてノーザンブロット分析を行った（図 3 ), これらの結果から、 T L R 9 mR N Aの N—末端フラグメントは T L R 9ノックアウトマウスの脾臓細胞からは検出されなかった。また、 C _ 末端フラグメントをプロ一ブとした場合、変異マウス由来の T 1 r 9の転写は野生型マウス由来のものとほぼ同じサイズのものが検出されたが. 生産量においては少ないことがわかった。そこで、変異マウスから得られた脾臓細胞の mR N Aを用いて R T— P C R法を行い、得られた生成物の配列分析を行った。この結果、転写された T 1 r 9遺伝子には n e o遺伝子が含まれており、この n e oの挿入によって、 TL R 9の N—末端部位にストップコドンが出現し、変異マウスにおいて機能的な T L R 9タンパク質が発現しないことがわかった（図 4)。なお、 TL R 9ノックアウトマウスのリンパ細胞をフローサイトメトリーで測定した結果、異常成分は見られなかった。

実施例 3 (腹腔マクロファージの調製）

野生型マウス（w i 1 d - t y p e ) 及び T L R 9ノックアウトマウス（TL R 9—ノ—）のそれぞれの腹腔内に 4 %のチォグリコール酸培地 (D I F CO社製）を 2m lずつ注入し、 3日後に各マウスの腹腔内から腹膜滲出細胞を単離し、これらの細胞を 1 0 %のゥシ胎仔血清（G I B C O社製）を添加した R P M I 1 6 40培地（G I B C〇社製）中で 3 7 °Cにて 2時間培養し、氷温のハンクス緩衝液（Hank's buffered salt solution： H B S S ； G I B C O社製）で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹膜マクロファージとして以下の実験に使用した。

実施例 4 TL R 9ノックァゥトマウスの非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対する応答性）

最近、 C p G ODN (oligodeoxynucleotide) の応答性は、 TL R を介するシグナル伝達経路の中のアダプタータンパク質である My D 8 8に依存していることが明らかになった。この M y D 8 8ノックアウトマウスは C p G 〇D Nに対して応答しないが、 TL R 2ノックアウトマウスや TL R 4ノックァゥトマウスは正常に C p G ODNに対して応答する。これらのことは、 C p G ODNが TL R 2及び T L R 4以外の TL Rによって認識されることを示している。そこで、 TL R 9ノックアウトマウスの C p G ODNに対する応答性を調べてみた。まず、腹腔マクロファージにおける炎症性サイトカインの産生量を以下のように測定した。

実施例 3により調製した各腹膜マクロファージを I N F _T ( 3 0 u n i t /m 1 ) の存在下又は非存在下において、図 5に示された各種濃度の C p G ODN ( 0. 1又は 1. 0 M ; TIB MOLBIOL社製； T C C— ATG - AC G— TTC— CTG— ATG - CT)、 P GN ( 1 0 n g/m 1 ； Sigma and Fluka ¾ ；スタフイロコッカス · ァゥレウス由来）、 L P S ( 1. 0 a g/m 1 ； Sigma 社製；サルモネラ · ミネソタ R e _ 5 9 5由来）といつしょに 24時間培養した。培養後、培養上清中の TNF o!、 1 1^ _ 6及び 1 _ 1 2 p 4 0の各濃度を E L I S A 法により測定した。この結果を図 5に示す。これらの結果から、野生型マウス（W i I d— t y p e ) のマクロファージは C p G ODNに応答して TNF o!、 I L— 6及び I L一 1 2を産生し、さらに I F N T及び C p G ODNで刺激すると、 TNF o!、 I L _ 6及び I L一 1 2の産生量が増加することがわかった。しかし、 TL R 9ノックアウトマウス（TL R 9 -Z— ) 由来のマクロファ一ジは、 I FNァの存在下でさえ、 C p G ODNに対する応答において検出可能なレベルの炎症性サイト力インを産生していなかった。また、野生型マウス及び T L R 9ノックアウトマウス由来のマクロファージは、 L P S又は P GNに対する応答により TNF «、 I L _ 6及び I L— 1 2をほぼ同程度産生することがわかった（図 5 )。なお、それぞれの実験結果は n= 3の平均値を示す。図中の N. D. は検出できなかったことを示す。 ' また、 C p G OD N又は L P Sに対する野生型マウス（W i I d— t y p e ) 及び T L R 9ノックアウトマウス（TL R 9— ^κ— ) の脾臓細胞の応答性について調べてみた。それぞれのマウスの脾臓細胞（ 1 X 1 0⁵) を単離し、図 6に示す各種濃度の C p G ODN又は L P Sにより 9 6ゥエルプレート内で培養して脾臓細胞を刺激した。培養から 4 0 時間後に l ^ C i の [³H] —チミジン（デュポント社製）を添加して更に 8時間培養し、 [³H] の摂取量を jSシンチレーシヨンカウン夕一 (パッカード社製）で測定した（図 6)。この結果から、野生型マウスの脾臓細胞では、 C p G ODNや L P Sの投与量に依存して細胞増殖反応を促進していたが、 T L R 9ノックアウトマウスの脾臓細胞では、いかなる濃度の C p G 〇D N剌激においても C p G ODNによる細胞増殖反応は見られなかった。また、 C p G ODNに応答して、野生型マウス由来の B細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（MHC) クラス IIの発現が増加した。しかし、 T L R 9ノックアウトマウス由来の B細胞では C p G ODNに誘導された MHCクラス II の発現の増加は見られなかった。以上のことから、 TL R 9ノックアウトマウスのマクロファージゃ B細胞は、 C p G ODNに対する応答性を特異的に欠如していることがわかった。

次に、 C p G ODNを含有するバクテリア由来 DN Aは樹状細胞を潜在的に刺激し、 T h 1細胞の発達をサポートすることが知られている

(EMBO J.18, 6973-6982, 1999、 J. Immunol.161, 3042-3049, 1998、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9305-9310, 1999)。そこで C p G OD N誘導サイトカインの産生と、骨髄由来の樹状細胞の表面分子のアツプレギユレ一ションを分析した。野生型マウス（W i l d— t y p e) 又は T L R 9ノックアウトマウス（TL R 9— の骨髄細胞を、 1 0 η g / m 1 のマウス顆粒球マクロファージーコロニー刺激因子 (Peprotech社製）を含む 1 0 %のゥシ胎仔血清を添加した R P M I 1 64 0培地で培養し（J. Exp. Med.176, 1693-1702, 1992)、培養後 6日目に未成熟の樹状細胞を回収し、 0. 1 Mの C p G ODN又は 0. 1 n g/m 1 の L P Sの存在下若しくは非存在下において、 1 0 %のゥシ胎仔血清を添加した R PM I 1 64 0培地中で 2 日間培養した。培養後、上清中の I L _ 1 2 p 4 0の濃度を E L I S A法で測定した（図 7)。この結果から、野生型マウス由来の樹状細胞は C p G ODNに応答して I L— 1 2を産生したが、 TL R 9ノックアウトマウス由来の榭状細胞においては、 C p G OD Nは I L— 1 2の産生を誘導しなかつた。

上記 1 0 n g / 1 のマウス顆粒球マク口ファ一ジ―コロニー剌激因子（Peprotech社製）を含む 1 0 %のゥシ胎仔血清を添加した R P M I 1 6 4 0培地で培養し、 6日目に回収された樹状細胞を、 CD 4 0、 C D 8 0、 C D 8 6及び MHCクラス IIに対する、それぞれのピオチン化抗体により染色し、フィコエリトリン（p h y c o e r y t h r i n : P E ；ファーミンジェン社製）で標識したストレブトアビジンで発展させ、これらの細胞をセルクェストソフトウェア (べクトンディツキンソン社製）により蛍光活性化セルソー夕一キヤリバ一（FACS Calibur) で分析した（図 8)。この結果から、 C p G ODNで刺激すると、野生型マウス由来の樹状細胞表面においては、 CD 40、 CD 8 0、 CD 8 6 及び MH Cクラス IIの発現を促進していたが、 TL R 9ノックアウトマウス由来の榭状細胞表面では、 C p G 〇D Nに対する応答によりこれらの分子の発現を促進しなかった（図 8)。 L P Sによる刺激では、野生型マウス由来の樹状細胞も T L R 9ノックァゥトマウス由来の樹状細胞も同様の応答がみられた。以上の結果から、 TL R 9は C p G OD N の細胞応答に不可欠な受容体であることがわかった。

実施例 5 (TL R 9ノックアウトマウス由来のマクロファージの C p G 〇DNに対する応答による NF— / c B、 J NK及び I RAKの活性化） TL Rのシグナルは、アダプタ一分子である My D 8 8を介してセリン /トレオニンキナーゼである I R AKを活性化し、次いで MAPキナ —ゼ及び N F— κ Bを活性化することが知られている（Inmmnity 11, 115-122, 1999)。そこで C p G ODNが、かかる細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを調べてみた。実施例 3により調製した野生型マウス及び T L R 9ノックアウトマウスの腹腔マクロファージ（ I X 1 0⁶ cells) を、 1. O Mの C p G ODN又は 1. O gZm l のサルモネラ · ミネソタ R e— 5 9 5の L P Sで図 9に示された時間刺激し、各マウスのマクロファ一ジから核蛋白質を抽出し、 NF— κ Βの D Ν Α結合部位を含む特異的プローブといつしょにインキュベートし、電気泳動を行い、ォ一トラジオグラフィーにより視覚化した（図 9 )。

この結果から、 C p G ODNで刺激すると、野生型マウス由来のマク口ファージでは N F― κ Bの D N A結合活性が増加するのに対し、 T L R 9ノックアウトマウス由来のマクロファージでは N F— κ Βの DN A結合活性は増加しなかった。 TL R 9ノックァゥトマウス由来のマク口ファ一ジを L P Sで刺激したものは、野生型マウス由来のマクロファ —ジを L P Sで刺激したものと同様の N F— κ Bの活性化が見られた。以上の結果から、 C p G ODNの誘導による N F— κ Bの活性が T L R 9ノックアウトマウス由来のマクロファージにおいて特異的に欠損していることがわかる。なお、図中の矢印は N F— κ Bと特異的プロ一ブとの複合物の位置を示し、矢頭は特異的プローブのみの位置を示している。

上記と同様に図 1 0又は図 1 1で示された時間、 C p G 〇DN又は L P Sで刺激した野生型マウス及び T L R 9ノックアウトマウスのマク口ファージを、溶解緩衝液（最終濃度で 1. 0 %のトリトン X— 1 0 0、 1 3 7 mMの N a C 1 、 O mMのトリス一 H C 1 、 5 mMの EDTA、 1 0 %のグリセ口一ル、 1 m Mの P M S F、 2 0 g / 1 のァプロチニン、 2 0 g Zm 1 のロイぺプチン、 1 mMの N a ₃ V O ₄及び 1 0 m Mの ]3—グリセロリン酸を含有する緩衝液； p H 8. 0 ) 中にて溶解し、この細胞溶解物を抗 J NK抗体（サン夕クルス社製）又は抗 I RAK抗体（林原生化学研究所株式会社製）で免疫沈降して、文献（Immunity 11, 115-122, 1999) 記載のように、インビトロキナーゼアツセィを行い、 G S T— c 一 J u n溶解蛋白質（G S T— C — J u n) を基質とした J N K活性及び I R AKの活性を測定した（図 1 0 , 1 1における上段； G S T- c - J u n, Au t o)。

また、上記細胞溶解物を、 S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させ、ニトロセルロース膜に移し、この膜を抗 J NK抗体（サンタクルス社製）又は抗 I RAK抗体（Transduction Laboratories 社製）でブロットして、ェンハンスド · ケミルミネッセンス装置（デュポント社製）を使用して視覚化した（図 1 0 , 1 1における下段； WB)。以上の結果から、 C p G O D Nは野生型マウス由来のマクロファージの J NK及び I R AKを活性化するが、 T L R 9ノックアウトマウス由来のマクロファージでは全く活性化しないことがわかった（図 1 0， 1 1 )。したがって、 C p G OD Nを介する情報伝達は T L R 9に依存していることがわかった。 · 産業上の利用可能性

メチル化されていない C p Gモチーフを含有するバクテリア由来 DN Aは免疫細胞を非常に活性化し、 Th 1の応答を誘導するが、そのパクテリア由来 DNAを認識する受容体は知られていなかった。本発明により、細菌 D N Aの非メチル化 C p G配列を含むオリゴヌクレオチドの受容体が明らかとなったことから、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する T L Rフアミリーのメンバー受容体夕ンパク質 TL R 9や、それをコードする遺伝子 DN A等は、細菌性疾病等の診断や、治療に用いることができ、また T L R 9ノックアウト動物を用いると、バクテリア由来 D N Aの分子レベルにおける作用機作を明らかにすることが可能となる。

Claims

請求の範囲

1. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする DNA。

2. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質が、以下の（a)又は（b)のタンパク質であることを特徴とする請求項 1記載の DNA。

(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質

(b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化 C G配列を有する細菌 DN Aに対して反応性を有するタンパク質

3. 配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項 1記載の D N A。

4. 請求項 3記載の遺伝子を構成する DNAとストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズすることを特徴とする請求項 1記載の DN A。

5. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質が、以下の（a)又は（b)のタンパク質であることを特徴とする請求項 1記載の DNA。

(a)配列番号 4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質

(b)配列番号 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAに対して反応性を有するタンパク質

6. 配列番号 3に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項 1記載の DNA。

7. 請求項 6記載の遺伝子を構成する DN Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズすることを特徴とする請求項 1記載の DN A。

8. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質。

9. 配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質。

1 0. 配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質。

1 1. 配列番号 4に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質。

1 2. 配列番号 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のタンパク質。

1 3. 請求項 8〜 1 2のいずれか記載のタンパク質と、マ一力一タンパク質及び/又はべプチドタグとを結合させた融合タンパク質。

1 4. 請求項 8〜 1 2のいずれか記載のタンパク質と特異的に結合する抗体。

1 5. 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 1 4記載の抗体。

1 6. 請求項 8〜 1 2のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。

1 7. 非メチル化 C G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子が過剰発現することを特徴とする非ヒト動物。

1 8. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徵とする非ヒト動物。

1 9 . 非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して不反応性であることを特徴とする請求項 1 8記載の非ヒト動物。

2 0 . 齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項 1 7〜 1 9 のいずれか記載の非ヒト動物。

2 1 . 非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、求項 1〜 7のいずれか記載の D N Aを導入することを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aに対して反応性を有するタンパク質を発現する細胞の調製方法。

2 2 . 請求項 2 1記載の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質を発現する細胞の調製方法により得られることを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質を発現する細胞。

2 3 . 被検物質の存在下、非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質を発現している細胞をインビトロで培養し、 T L R 9活性を測定 ·評価することを特徴とする非メチル化 C P G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質のァゴニスト又はアンタゴニストのスクリ—ニング方法。

2 4 . 非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞の T L R 9活性を測定 ·評価することを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質のァゴニスト又はアンタゴニス卜のスクリ一ニング方法。

2 5. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質をコードする遺伝子が過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られるマクロファージ又は脾臓細胞の TL R 9活性を測定 · 評価することを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質のァゴニスト又はアン夕ゴニストのスクリ一ニング方法。

2 6. 非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項 24又は 2

5記載の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aに対して反応性を有するタンパク質のァゴニスト又はアンタゴニストのスクリ一ニング方法,

2 7. 請求項 2 3〜 2 6のいずれか記載の非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質のァゴニスト又はァン夕ゴ二ストのスクリ一二ング方法により得られる非メチル化 C p G配列を有する細菌 DN Aを特異的に認識する受容体夕ンパク質のァゴニスト又はアン夕ゴニスト。

2 8. 非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体タンパク質の全部又はその一部を有効成分として含有する医薬組成物。

2 9. 請求項 2 7記載のァゴニスト又はアン夕ゴニストを有効成分として含有する医薬組成物。

3 0. 検体中の非メチル化 C p G配列を有する細菌 D N Aを特異的に認識する受容体タンパク質をコ一ドする DNAと、請求項 3記載の DN A との塩基配列を比較することができる、請求項 3記載の DN Aを含むことを特徴とする非メチル化 C p G配列を有する細菌 DNAを特異的に認識する受容体夕ンパク質をコードする DN A配列の欠失、置換及び Z又は付加に関連する疾病の診断キット。