WO2006061965A1

WO2006061965A1 - ヘモゾイン誘導による自然免疫を利用したマラリア感染症の検出・測定、マラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング、及び該自然免疫誘導の調節

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Publication number: WO2006061965A1
Application number: PCT/JP2005/020283
Authority: WO
Inventors: Shizuo Akira; Ken Ishii; Cevayir Coban
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Osaka University NUC
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; University of Osaka NUC
Priority date: 2004-12-09
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2006-06-15
Anticipated expiration: 2007-06-09
Also published as: US10172927B2; US20090041808A1; US9400279B2; JP2012012412A; US20120128725A1; US20160296613A1; JP4961556B2; JPWO2006061965A1

Abstract

　ヘモゾイン（ＨＺ）の誘導を利用したマラリア感染症の検出・測定方法、該検出・測定法を用いたマラリア感染症のワクチン及びマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び該ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節手段を提供するものである。ＨＺの誘導による、ＴＬＲ９を介し、ＭｙＤ８８に依存する自然免疫活性を検出・測定することにより、マラリア感染症の検出・測定を行なう。該マラリア感染症の検出・測定は、マラリア感染症の診断のために用いることができる。また、該検出・測定方法を用いて、マラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニングを行う。更に、ＨＺ又は合成ＨＺ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いて、ＨＺの誘導による自然免疫誘導の調節を行う。

Description

明細書

へモゾイン誘導による自然免疫を利用したマラリア感染症の検出'測定、マラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング、及び該自然免疫誘導の調節

技術分野

[0001] 本発明は、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのへモゾインの誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出 '測定することによるマラリア感染症の検出'測定方法、該検出'測定法を用いたマラリア感染症のワクチン又はマラリア感染症の予防或いは治療薬のスクリーニング、及び該へモゾイン或いは合成へモゾインをアジュバント或、は免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節、へモゾイン、合成へモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有する TLR9作動剤等に関する。

背景技術

[0002] マラリア感染は、特に世界の熱帯地域における、ヒトの疾病や死亡の主要な原因である。マラリアの効果的な免疫治療が必要であるにも関わらず、ライフサイクルの複雑さ及び多型性の早さ (rapid polymorphism)が原因で、宿主一原虫の相互作用及びそれによるマラリア原虫に対する自然免疫応答は、ほとんど理解されていない (Nat. Me d. 4: 520-524, 1998; Nat. Rev. Immunol. 4: 169-180, 2004) ₀マラリア原虫に応答した炎症誘発性サイト力イン（proinflammatory cytokine)の産出を含む、強い自然免疫活性及び Z又は感染し破壊した赤血球から放出された代謝物が、高熱等の主要な症状を導くとされていた（Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 533-542, 1997)。最近の論証は、トール様受容体 (TLR)が Plasmodiumを含む様々な病原体に対する自然免疫応答に関与していることを示唆している（Annu. Rev. Immunol. 20: 197-216, 2002; N at. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004)。

[0003] マウスにおけるマラリア感染では、 TLRを介したサイト力イン産出に必須のアダプタ一分子である骨髄分化因子 88 (MyD88)が、肝臓障害を引き起こす Plasmodium ber ghei原虫による IL— 12誘導に重要であることが示されている（J. Immunol. 167: 5928 -5934, 2001)。最近の研究は、 P. falciparum blood- stage原虫力 MyD88依存性及び TLR9依存性経路を通じて、ヒト plasmacytoid榭状細胞（DC)及びマウス DCを活性ィ匕することを報告して、るが、それに起因する分子はまだ同定されて、な、ものの、シゾント溶解物に含まれるタンパク質あるいはその複合体であることが示唆されている（J. Immunol. 172: 4926-4933, 2004)。

[0004] マラリア色素として知られるへモゾイン（Hemozoin:HZ)は、 Plasmodium原虫の食胞（food vacuoles)に存在するヘム分子の解毒産物である（Int. J. Parasitol. 32: 1645 -1653, 2002; Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997)。細胞間の HZは、シゾントの破壊中に血液に放出され、骨髄細胞に貧食され、細網内皮系内の HZの集中を導く（Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997)。すなわち、赤血球内のマラリア原虫は、宿主ヘモグロビンを、 HZとして知られる疎水性ヘムポリマー（hydoropho bic heme polymer)へと消化し、力かるポリマーはその後血流に放出され、細網内皮系で捕獲され、そこに蓄積する。 P. falciparumから生成された HZは、マクロファージを活性化し、炎症誘発性サイト力イン、ケモカイン、窒素を産出し、ヒト骨髄榭状細胞（ DC)の成熟を亢進することが報告されている（J. Inflamm. 45: 85-96, 1995; Infect. Im mun. 70: 3939-3943, 2002) ₀これらの研究は、 HZが自然免疫を活性化する分子秩序を研究し、マラリア原虫—宿主間の相互作用の理解を深める必要性を促している。

[0005] 非特許文献 1 : Nat. Med. 4: 520-524, 1998。

非特許文献 2 : Nat. Rev. Immunol. 4: 169-180, 2004。

非特許文献 3 : Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 533-542, 1997。

非特許文献 4:Annu. Rev. Immunol. 20: 197-216, 2002。

非特許文献 5 :Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511, 2004。

非特許文献 6 : J. Immunol. 167: 5928-5934, 2001。

非特許文献 7 : J. Immunol. 172: 4926-4933, 2004。

非特許文献 8 : Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002。

非特許文献 9 : Ann. Trop. Med. Parasitol. 91: 501-516, 1997。

非特許文献 11 :J. Inflamm. 45: 85-96, 1995。

非特許文献 12 : Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002。発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明の課題は、マラリア感染における宿主とマラリア原虫の相互作用を解明し、該知見により、マラリア感染症の診断のための、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのへモゾイン（Hemozoin： HZ)の誘導を利用したマラリァ感染症の検出 ·測定方法、該検出 ·測定法を用いたマラリア感染症のワクチン及びマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法、及び該 HZ又は合成 HZ或いはその誘導体をアジュバント或、は免疫賦活剤として用いる自然免疫誘導の調節手段等を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0007] 赤血球内のマラリア原虫は、宿主ヘモグロビンを、へモゾイン（HZ)として知られる疎水'性ヘムポリマー（hydrophobic heme polymer)に消ィ匕し、力かるポリマーはその後血流に放出され、細網内皮系で捕獲され、そこに蓄積される。本発明者は、マラリア原虫一宿主間の相互作用について、 HZが自然免疫を活性化する免疫反応のメカ二ズムを分子レベルで解明すべく研究する中で、ヒト熱帯熱マラリア原虫の該ヘム代謝産物である HZが自然免疫の受容体である Toll様受容体 9 (TLR9)を強く刺激する新規のリガンドであることを見い出した。すなわち、 P. falciparum力も精製した HZが、インビトロ、インビボの両方で TLR9を介し、 MyD88に依存するマウス免疫細胞を活性ィ匕することを見い出した。そして、この活性ィ匕は、公知の抗マラリア薬であるクロロキンにより阻害されることを確認した。

[0008] そして、これらの知見に基いて本発明者は、該 HZの誘導による、 TLR9を介し、 M yD88に依存する自然免疫活性を検出 ·測定することにより、マラリア感染症の検出 · 測定を行なうことが可能であり、該マラリア感染症の検出'測定をマラリア感染症の診断のために用いることが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。また、該 HZの誘導による自然免疫活性の検出 ·測定によるマラリア感染症の検出 '測定方法を用いて、マラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことが可能であることを見い出し、本発明をなした。更に、上記知見に基!、て、 HZ又は合成 HZ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いて、 HZの誘導による TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫誘導の調節を行うことが可能であることを見い出した。すなわち、へモゾインカ、 TLR9- MyD88依存経路を経由して、 Thlを誘導する選択的な免疫応答制御'活性化効果を持つリガンドであり、他の TLRファミリーや非 MyD88依存経路である TRIF依存経路を活性ィ匕しないことを初めて実証した。本発明は以上の知見により完成するに至つたものである。

すなわち本発明は、（1)マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性へムポリマーのへモゾイン誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出'測定することを特徴とするマラリア感染症の検出'測定方法や、 (2)へモゾイン誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性の検出 ·測定力へモゾインによる、 TLR9を介し、 MyD88に依存する免疫細胞の活性ィ匕であることを特徴とする前記（1)記載のマラリア感染症の検出 ·測定方法や、 (3)へモゾイン誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する免疫細胞の活性ィ匕の検出'測定力へモゾインの誘導による免疫細胞のサイト力インの産生の検出 '測定であることを特徴とする前記（2)記載のマラリア感染症の検出'測定方法や、（4)へモゾインの誘導による免疫細胞のサイト力インの産生の検出'測定力 TNF— a、 IL—12p40、 MCP—1、 IL 6、及び IFN aのいずれ力 1以上のサイト力インの産生の検出'測定であることを特徴とする前記（3)記載のマラリア感染症の検出 ·測定方法や、（5)TLR9を介し、 My D88に依存する免疫細胞の活性化が、 TLR9を介し、 MyD88に依存する脾臓細胞又は榭状細胞の活性ィ匕であることを特徴とする前記（2)〜 (4)の、ずれか記載のマラリア感染症の検出'測定方法や、 (6)前記（1)〜（5)の、ずれか記載のマラリア感染症の検出 ·測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用いることを特徴とするマラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法や、（7)被検物質の存在下、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのへモゾイン又は合成へモゾイン或いはその誘導体の誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出'測定することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（8)TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出'測定する方法が、前記（2)〜（5)のいずれか記載の TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性の測定方法であることを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。

[0010] また本発明は、（9)マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマ一のへモゾイン又は合成へモゾイン或いはその誘導体からなる、 TLR9を介し、 My D88に依存する自然免疫誘導調節用アジュバントや、（10)マラリア原虫のへモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのへモゾイン又は合成へモゾイン或いはその誘導体を活性成分とする、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫誘導用免疫賦活剤からなる。

[0011] また本発明は、（l l) MyD88^+/+及び TLR9^+/+の非ヒト動物に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイト力インの産生量と、 MyD88 及び Z又は TLR9一 Z一の非ヒト動物に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイト力インの産生量とを測定'評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリー二ング方法や、（12)非ヒト動物におけるサイト力インの産生量を、非ヒト動物における血清サイト力インの量として ELISAにより測定することを特徴とする前記（11)に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（13)非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする前記（11)又は（12)に記載のスクリーニング方法や、（14) MyD88^+/+及び TLR9^+/+の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量と、 MyD88^_/_及び Z又は TLR9^_/_の遺伝子が発現している細胞に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量とを比較'評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（15)細胞が、脾臓細胞又は榭状細胞であることを特徴とする前記（14)に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（16)細胞におけるサイト力インの産生量を、細胞の培養上澄中のサイト力インの量として ELISAにより測定することを特徴とする前記（14)又は（15)に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、（17)サイト力インの産生量の測定が、 TNF— a、 IL一 12p40、 MCP— 1、 IL— 6、及び IFN αのいずれか 1 以上のサイト力インの産生量の測定であることを特徴とする前記（ 11)〜（ 16)のいずれかに記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関する。

[0012] また本発明は、（18)へモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体力もなるリガンドに対する、以下の（a)又は (b)に記載のタンパク質の受容体としての使用方法や、（a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；（19)タンパク質が、配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAにコードされることを特徴とする前記（18)に記載の使用方法や、（20)タンパク質が、配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAにコードされることを特徴とする前記（18)記載の使用方法や、 (21)以下の（a)又は (b)に記載の受容体タンパク質に対する、へモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体のリガンドとしての使用方法や、 (a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力もなるタンパク質；（b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；（22)タンパク質が、配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAにコードされることを特徴とする前記 (21)に記載の使用方法や、（23)タンパク質が、配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAにコードされ、かつへモゾインに対して反応性を有するタンパク質であることを特徴とする前記（21)記載の使用方法に関する。

[0013] また本発明は、（24)へモゾイン、合成へモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有することを特徴とする TLR9作動剤や、 (25) MyD88を活性ィ匕することを特徴とする前記（24)記載の TLR9作動剤や、（26) TLR— MyD88依存経路による免疫応答を誘導することを特徴とする前記（25)記載の TLR9作動剤や、 (27) TLR- MyD88依存経路による免疫応答力 TNF— a、 IL 12p40、 MCP—1、 IL— 6、及び IFN aの、ずれか 1以上のサイト力インの産生であることを特徴とする前記（26) 記載の TLR9作動剤や、（28) TLR9を選択的に活性ィ匕することを特徴とする前記（2 4)〜（27)のいずれか記載の TLR9作動剤や、（29) TLR2、 TLR4、 TLR7、 TRIF を活性ィ匕しないことを特徴とする前記（28)記載の TLR9作動剤や、（30)自然免疫制御剤として用いられることを特徴とする前記（24)〜（29)の、ずれか記載の TLR9 作動剤に関する。

[0014] また本発明は、（31)へモゾイン、合成へモゾイン又はそれらの誘導体を TLR9のリガンドとして使用する方法や、（32) TLR9— MyD88依存経路による免疫応答を誘導させる方法を含むことを特徴とする前記（31)記載の使用する方法や、 (33) TLR MyD88依存経路による免疫応答が、 TNF α、 IL 12p40、 MCP 1、 IL 6 、及び IFN aの、ずれか 1以上のサイト力インの産生であることを特徴とする前記（32 )記載の使用する方法や、 (34)自然免疫の制御方法を含むことを特徴とする前記（3 1)〜（33)の、ずれか記載の使用する方法に関する。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]本発明の実施例において、 P. falciparum由来の精製 HZが、マウス免疫システムを活性化するかどうかを調べるために、脾臓細胞及び DC (ヒト骨髄榭状細胞)を、インビトロで精製 HZで刺激し、培養上澄み中の炎症誘導性サイト力インの産出を EL ISAによって測定した結果を示す図である。

[図 2]本発明の実施例において、 HZ誘導性の自然免疫の活性化が、 MyD88にのみ依存的であることを確認するために、 MyD88非依存性経路に必須のアダプター分子である TRIF (TollZlL— 1レセプター（TIR)領域含有アダプター）が欠損しているマウスを用い、 TNF a又は IL— 12p40の産生量を ELISAで分析し、定量した結果を示す図である。

[図 3]本発明の実施例において、 HZ誘導性の自然免疫活性ィ匕が障害されているか、又は変更されているかを調べるために脾臓細胞及び DCを用いて、 CD40及び CD 88の発現をフローサイトメトリーで分析した結果 (b)、 FL— DCによる IFN aの産生を、 ELISAで分析した結果 (c)を示す図である。

[図 4]本発明の実施例において、合成 HZが TLR9依存形式で、自然免疫システムを活性ィ匕しているかどうか調べるために、野生型マウス又は TLR9^_/_マウスに、合成 HZを注入し、血清内の IL 6及び MCP— 1産生量を ELISAで測定した結果を示す図である。

[図 5]本発明の実施例において、 P. falciparumの培養物中、又は P. falciparum培養物力も HZ調製中に混入物が入る可能性を排除するために、 HZの精製度を定量するための分析を行った結果を示す図である。（a)は、 DNAの混入を検出するために、 HZをァガロースゲル上に移し、臭化ブロマイドで染色した結果を、（b)は、 C57/B6 マウスの FL— DCを、 HZ又は DNase処理、熱失活、及び Z又は CQ (10 M)でインキュペートした後、 ELISAで TNF a又は IL— 12p40を測定した結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 本発明は、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーの HZ 誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出 ·測定することによりマラリア感染症の検出 ·測定を行う方法よりなるものである。本発明において、 H Z誘導による自然免疫活性の検出 ·測定には、脾臓細胞又は榭状細胞のような免疫細胞の HZによる、 TLR9を介し、 MyD88に依存する活性化の状況を検出'測定すること〖こより行うことができる。該 HZによる、 TLR9を介し、 MyD88に依存する活性ィ匕の検出'測定は、 HZの誘導による免疫細胞のサイト力インの産生を検出 ·測定することにより行うことができる。該サイト力インの産生の検出'測定としては、 TNF— a、 IL 12p40、 MCP— 1、 IL— 6、及び IFN αのいずれか 1以上のサイト力インの産生の検出'測定により行うことができる。該サイト力インの産生の検出'測定には、サイトカイン ELISA法のような公知のサイト力インの検出'測定法を用いることができる。本発明のマラリア感染症の検出'測定方法により、マラリア感染症の診断を行うことが可能である。

[0017] また本発明は、本発明の HZ誘導によるマラリア感染症の検出'測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用い、マラリア感染症のワクチンのスクリーニング方法又は検査方法として用いること力もなる。該ワクチンのスクリーニング又は検査方法は、ワクチンの開発或いは開発したワクチンの製造に際しての検査等における被検ワクチンの評価方法として用いることができる。更に、本発明は、本発明のマラリア感染症の検出'測定方法を、マラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法として用いることよりなる。該スクリーニング方法は、被検物質の存在下、 HZ又は合成 HZ或いはその誘導体の誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出'測定する本発明の方法により行うことができる。

[0018] また、本発明は、本発明において TLR9の新規リガンドとして見い出された HZ又は合成 HZ或いはその誘導体を、自然免疫誘導調節用アジュバントとして、或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いることよりなる。 HZ又は合成 HZ或いはその誘導体を自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤として用いること〖こより、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫誘導の調節を行うことができる。本発明において、 HZは（不溶性クリスタロイド構造）は、 P. falciparum (3D7 株)で感染した赤血球から精製する方法で調製することができる（Infect. Immun. 70: 3 939-3943, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865—11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991)。また、合成 HZ ( j8へマチン）は、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づく Jaramillo et al.のプロトコール（J. Immunol. 172:3 101-3110)を用いて精製し、製造することができる。自然免疫誘導調節用アジュバント或いは自然免疫誘導用免疫賦活剤の利用は、 V、ずれも公知の利用形態にしたがつて行うことができる。

[0019] また本発明は、野生型マウス等の MyD88^+/+及び TLR9^+/+の非ヒト動物に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイト力インの産生量と、 MyD88"^ 及び Z又は TLR9^_/_の非ヒト動物に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイトカインの産生量とを測定'評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、 MyD88^+/+及び TLR9^+/+の遺伝子が発現している脾臓細胞、榭状細胞等の細胞に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量と、 MyD88^_/_及び Z又は TLR9^_/ —の遺伝子が発現している細胞に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量とを比較'評価するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法に関し、上記サイト力インとしては、 TNF— a、 IL 12p40、 MCP— 1、 IL— 6、 IFN α等を例示することができ、また、上記非ヒト動物におけるサイト力インの産生量は、非ヒト動物における血清サイト力インの量として ELISAにより測定することができ、細胞におけるサイト力インの産生量は、細胞の培養上澄中のサイト力インの量として ELISAにより測定することができる。そして、 MyD88^_/—マウスや MyD88_' の遺伝子が発現している細胞は WOO 0Z41561号公報に記載の方法により、 TLR9^_/_マウスや TLR9^_/_の遺伝子が発現している細胞は特開 2002— 34565号公報に記載の方法により調製することができる。

[0020] また本発明は、へモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、 (a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質;又は (b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質;の受容体としての使用方法に関する。上記タンパク質としては、配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAにコードされるタンパク質;配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAにコードされ、かつへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質;を用いることができる。ここで、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリツドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、 50〜70%以上の相同性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低、DNA同士がハイブリダィズしな!/、条件あるいは通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗ヽの条件である 65。C、 1 X SSC、0. 1%SDS, X«0. 1 X SSC、0. 1 %SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件を挙げることができる。

[0021] 上記本発明の使用方法の具体的態様としては、へモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出 ·測定するマラリア感染症の検出 ·測定方法や、マラリア感染症のワクチンのスクリ一ユング又は品質検査方法や、へモゾイン又は合成へモゾイン或いはその誘導体の誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出 ·測定するマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、 MyD88^+/+及び TLR9^+/+ の非ヒト動物に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイト力インの産生量と、 MyD88^_/_及び/又は TLR9^_/_の非ヒト動物に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイト力インの産生量とを測定'評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、 MyD88^+/+及び TLR9^+/+の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量と、 MyD88^_/_及び Z 又は TLR9^_/_の遺伝子が発現して、る細胞に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量とを比較'評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法や、 TLR9— MyD88依存経路による免疫応答誘導のメカニズムを解明する方法等を挙げることができる。

[0022] また本発明は、へモゾイン、合成へモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有する、 TLR9と相互作用して全活性の細胞内シグナル伝達を引き起こす物質である TLR9作動剤（ァゴ二スト）に関し、力かる TLR9作動剤は、 MyD88を活性ィ匕することや、 TNF— a、 IL—12p40、 MCP— 1、 IL— 6、及び IFN αのいずれか 1以上のサイト力インの産生等を伴う TLR—MyD88依存経路による免疫応答を誘導することや、 TLR2、 TLR4、 TLR7、 TRIFを活性化することなぐ TLR9を選択的に活性化することが可能で、自然免疫制御剤として用いることができる。

[0023] さらに本発明は、へモゾイン、合成へモゾイン又はそれらの誘導体を TLR9のリガンドとして使用する方法に関し、かかる方法は、 TNF— a、 IL— 12p40、 MCP— 1、 I L— 6、及び IFN aのいずれ力 1以上のサイト力インの産生等を伴う TLR9— MyD88 依存経路による免疫応答を誘導させる方法や、自然免疫の制御方法を含み、その具体的態様としては、前記の本発明の使用方法の具体的態様として例示した方法を挙げることができる。

[0024] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

実施例 1 [0025] 『HZの自然免疫活性の活性化とその調節』

[材料及び方法]

(マウス）

変異マウス（MyD88—、 TRIF—、 TLR2—、 TLR4—、 TLR7—、 TLR9欠損マウス）を、 129Z〇la X C57ZBL6又は C57ZBL6をバックグランドとし、文献（Immunit y 9: 143-150, 1999; Immunity 11: 443-451, 1999; Nature 408: 740-745, 2000; Nat. Immunol. 3: 196-200, 2002; Science 301: 640-643, 2003)記載の通りに産出した。同年齢の野生型マウスと変異マウスを実験に使用した。インビボの研究には、 P. falci parum培養物力も精製した HZ 1500 μ gと合成 HZ ( βへマチン）とを、野生型マウス、 MyD88_' マウス又は TLR9 マウスの腹腔内に注入した（J. Immunol. 172: 310 1-3110, 2004) oサイト力イン ELISA用に、 1、 2、 4及び 6時間後に尾から血清を収集した。

[0026] (試薬）

合成 CpGオリゴデォキシヌクレオチド（ODN) D35は、北海道システムサイエンス株式会社より購入、合成した。 Salmonella minnesota Re- 595由来リポポリサッカリド（LP S)、塩化へミン（hemin chloride)及びクロ口キン（CQ)は Sigma- Aldrichより購入した。 DNase (Dnase— I)は Invitrogen力ら購入した。

[0027] (HZ及び合成 HZ ( βへマチン）の調製）

ΗΖ (不溶性クリスタロイド構造）は、 P. falciparum (3D7株)で感染した赤血球力も精製した（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865 -11870, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991)。要約すると、赤血球をサポニンで溶解した後、原虫を超音波処理し、 2%のドデシル硫酸ナトリウム（S DS)で 7〜8回洗浄した。次に、ペレットをプロティナーゼ K(2mgZml)と共に、 37 °Cでー晚インキュベートした。ペレットはその後、 2%の SDS内で 3回洗浄し、 6Mの尿素内で室温で 3時間、シェーカー上でインキュベートした。 HZペレットを 2%の SD Sで洗浄した後、蒸留水で 3〜5回洗浄し、蒸留水に再懸濁し、使用前に再び超音波処理した。いくつかの実験において、文献 (J. Immunol. 167: 2602-2607, 2001)記載の通りに、 HZは、 95°Cで 15分間の熱失活を行うか又は、 lOOUZmlの DNase- 1で 1 時間処理を行った。 DNase-I処理は、 P. falciparumの粗抽出物から完全にゲノム DN Aを除去することによって行った（図 5a)。

[0028] 核酸、タンパク質の定量ィ匕は、分光光度計を使用するか、又はァガロースゲル内の臭化工チジゥム染色法、 BCA法 (Biorad)若しくはピロガロールレッド方法 (和光純薬工業）によって行った。全脂質 (TP)は、 Bligh-Dyer法 (東レリサーチセンター）による TLC (薄層クロマトグラフィー）又は Iatron LQ (三菱ィ匕学ャトロン)を使用した酵素方法によって測定した。合成 HZ ( |8へマチン）は、酢酸処理及びアルカリ炭酸水素塩洗浄に基づく Jaramillo et al.のプロトコール（J. Immunol. 172:3101- 3110)を用いて精製した。エンドトキシンの混入を避けるために、全ての溶液はエンドトキシンを含まない PBS又は蒸留水を用いて調製した。 LAL分析 (Bio-Whittaker)により測定したェンドトキシンの量は、使用した HZlnmole当たり 0. 001EU未満であった。

[0029] (HZ又は合成 HZ (bへマチン)の定量化）

HZ又は合成 HZの濃度は、ヘムポリマーを、 20mM水酸化ナトリウム Z2%SDSの溶液内で、室温で、 2時間脱重合して定量し、 O. D.は 400nmであった（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996)。ヘムのモラ一吸光係数は 400nmで 1 X 105であり、 25 μ gの P. falciparum HZは、ヘム含有量 29nmoleと同等である。

[0030] (細胞）

脾臓細胞の単一細胞懸濁液（single cell suspension) (5 X 10⁵細胞 Zゥエル）を、 10 %の FCSを添カ卩した完全 RPMI 1640培地内で 48時間培養した。 Flt3リガンド誘導骨髄由来 DC (FL— DC) (1 X 10⁵細胞 Zゥエル）は、骨髄細胞と Flt3リガンド（10 Ong/ml; Pepro Tech社製）とを、 10%の FCSを含む DMEM培地内で 8〜9日間培養して産出した。細胞を、指定の刺激によって刺激し、サイト力イン ELISA用に、上澄みを回収した。

[0031] (サイト力イン ELISA)

マウスの TNF— a、 IL— 12p40、 MCP— 1、 IL— 6(R & D Systems)及び IFN a (PB L Bio. Lab社製）を、上澄み又は血清のいずれかで、製造者の指示に従って ELIS Aで測定した。

[0032] (共刺激による分子発現のフローサイトメトリー分析）刺激した細胞の細胞表面の分子発現を、文献 (J. Exp. Med. 196: 269-274, 2002)記載の通り測定した。要約すると、刺激した細胞を、冷却した PBS内で洗浄し、固定し、坑 CD16抗体の存在下で、 FITC標識抗体、 PE標識抗体、 Cy— Chrome標識抗体及び APC標識抗体で、室温で 30分染色した。染色した細胞を洗浄し、 PBS/0. 1 %BSA/0. l%NaN3内に再懸濁し、 FACSCalliberで分析した後、 CellQuest softw are(BD社製)で分析した。全ての抗体は、 BDより入手した。

[0033] (統計的分析）

統計的な有意差は、 Student' s t-testを用いて分析した。 P< 0. 05は有意とみなした

[0034] [試験、結果及び評価]

(P. falciparum由来の精製 HZの、 MyD88依存性経路を通してのマウスの脾臓細胞及び榭状細胞の活性化）

P. falciparum由来の精製 HZ力マウス免疫システムを活性ィ匕するかどうかを調べるために、脾臓細胞及び DC (マウス骨髄榭状細胞）を、インビトロで精製 HZで刺激し、培養上澄み中の炎症誘導性サイト力インの産出を ELISAによって測定した。 FL-D C (Fit3リガンド誘導骨髄由来 DC)は、 HZに応答して、 TNF a、 IL— 12p40、単球走ィ匕性因子—1 (MCP—1)及び IL— 6を、用量依存的に大量に産出し、その量は C pG ODNとほぼ同様の値だった（図 la)。 HZ誘導性の自然免疫活性化における、 TLRの役割を調べるために、多数の TLRが介するサイト力イン誘導に必須の分子ァダプターである MyD88が欠損しているマウスを用いた（Nat. Rev. Immunol. 4: 499-5 11, 2004) o MyD88 マウス由来の FL— DCでは、 HZ刺激により、 TNF a、 IL12 p40、 MCP— 1及び IL— 6の産出が著しく障害された（図 lb)。

[0035] 同様に、 MyD88^_/_脾臓細胞では、 HZに応答して、 MCP— 1、 IL— 6、 TNF a 、 IL— 12p40及び IFN誘導性タンパク質 10 (IP— 10)を産出する応答が障害されていた（図 lc)。更に、へモゾインは、 FL— DCの CDl lc+、 B220+plasmacytoidDCサブセット及び CDl lc+、 B220—骨髄 DCサブセットの両方を刺激し、 MyD88^_/_マウスにおいて、 FL— DCの両サブセットで阻害されていた CD40及び CD86の発現をアップレギュレートした（図 Id)。 [0036] (自然免疫応答の HZ活性化の TRIF依存性）

HZ誘導性の自然免疫の活性化が、 MyD88にのみ依存的であることを確認するために、 MyD88非依存性経路に必須のアダプター分子である TRIF (TollZlL— 1レセプター（TIR)領域含有アダプター）が欠損して、るマウスを用いた (Nat. Rev. Imm unol. 4: 499-511, 2004) ₀ MyD88"^ マウスとは対照的に、 TRIF マウスの FL — DCは、 HZに応答し、 TNF a及び IL 12p40 (pく 0. 05、 TRIF^_/_vs培地）を産出し、野生型マウス (p >0. 05)の値とほぼ同じであった（図 2)。 LPS誘導性の TN F a及び IL— 12p40は、 TRIF マウスの FL— DCで障害され、 P. falciparum培養物から精製した多量の HZに、 LPSが混入していないことを示唆した。これらのデータは、 HZが MyD88を通してマウスにおける炎症誘発性応答を活性ィ匕することを示し、 MyD88依存性 TLRの 1つが HZの認識に関与していることを示した。

[0037] (自然免疫応答の HZ活性ィ匕の TLR— 9依存性）

TLR2^_/—マウス、 TLR4—, マウス、 TLR7^_/—マウス及び TLR9^_/—マウスから得た脾臓細胞及び DCを用いて、 HZ誘導性の自然免疫活性ィ匕が障害されてヽるか、又は変更されているかを調べるために、さらに実験を行った。 HZは、野生型マウス、 TLR2^_/—マウス、 TLR4—, マウス、 TLR7^_/—マウスにおいて、 FL— DCを刺激し、 CDl lc+、 B220+plasmacytoidDCサブセット及び CDl lc+、 B220—骨髄 DCサブセットの両方で、 CD40及び CD86をアップレギュレートした（図 3a)。対照的に、 T LR9^_/_マウス由来の FL— DCの両サブセットでは、 HZに応答して CD40及び CD 86をアップレギュレートしなかった（図 3a)。

[0038] 同様に、野生型マウス、 TLR2^_/_マウス、 TLR4^_/_マウス、 TLR7^_/_マウス由来の FL— DCは、 HZに応答して、 TNF a、 IL 12p40、 MCP— 1及び IL— 6を産出したが、 TLR9^_/_マウスでは産出しなかった（図 3b)。 HZは FL— DCによって IFN aを誘導しな力つた点は注目すべきであり、 HZ誘導性サイト力インの特性力 K型 C pGODN (B型としても知られて!/、る）と同様であるが、 D型 OCN (A型としても知られている）、細菌性若しくはウィルス性 DNA等の TLR9の既知の天然 DNAリガンドとは異なることを示唆している（図 3c) (Nat. Rev. Immunol. 4: 249-258, 2004) ₀それにもかかわらず、これらのデータは、 TLR9及び MyD88力マウス脾臓細胞及び DCにおける HZ誘導性の活性化に重要であることを、明らかに証明して！/、る。

[0039] (炎症誘導性サイト力インの HZ活性化のインビボにおける MyD88ZTLR9依存性 )

HZ活性化力インビボで、 TLR9に介され、 MyD88に依存的であることを確認するために、 P. falciparum精製 HZを、野生型マウス及び MyD88^_/—マウス又は TLR9— /一マウスの腹腔内に注入し、血清サイト力インの産出をモニターした。 HZの注入により、野生型マウスの MCP— 1及び IL 6の血清量が著しく上昇し、その値は 1〜4時間に最大となり、 6時間以内に減少した（図 4a)。対照的に、 MyD88^_/_マウス及び TLR^_/_マウスでは、この上昇は、完全に阻害されていた。 6時間後、サイト力インの量は、野生型マウスで減少した。これらのデータは、インビボ及びインビトロの両方で、 HZ誘導性の炎症誘導性応答力 TLR9及び MyD88によって介されていることを明確に示している。

[0040] 合成 HZ ( βへマチン、実験室条件で短量体ヘムより合成）は、原虫で天然に形成された ΗΖと構造が似ており（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 11865-11870, 1996; P roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 325-329, 1991)、原虫又は培養物由来の混入物を含んでいない。合成 HZが TLR9依存形式で、自然免疫システムを活性ィ匕しているかどうか調べるために、野生型マウス又は TLR9^_/_マウスに、合成 HZを注入し、血清内の IL 6及び MCP— 1産生量をモニターした。野生型マウスへの合成 HZの注入は、血清内の MCP—1及び IL— 6産出を誘導し、その量は 1〜4時間に最大となつた（図 4b)。対照的に、この応答は、 TLR9^_/_マウスでは阻害されていた（図 4b)。これらのデータは、合成 HZと同様 P. falciparum由来精製天然 HZも、マウスの自然免疫システムを刺激していることを示唆し、 HZ誘導性の、 TLR9仲介自然免疫活性ィ匕に他の混入物が関与して、る可能性を排除して、る。

[0041] P. falciparumの培養物中、又は P. falciparum培養物から HZ調製中に混入物が入る可能性を排除するために、上記の多くの精製方法に加えて、 HZの精製度を定量するために、一連の分析を行った（Infect. Immun. 70: 3939-3943, 2002) ₀臭化ブロマイド染色ァガロースゲル（図 5)でも、分光光度計でも、 HZ又は DNase処理 HZ溶液（1 mM)において、 DNAも RNAも検出されなかった。 DNase処理又は熱失活も、 TNF α及び IL— 12p40の HZ誘導 DC産出に影響しなかった（図 5b)。さらに、 P. falcipar umから単離したゲノム DNA及び RNAは、 TNF a及び IL— 12の産出を含む自然免疫応答を著しく活性化しなかった (未公表の実験及び (J. Immunol. 172: 3989-3993, 2004) )。どの方法でも、 HZ溶液（ImM)内に、タンパク質も脂質も検出されなカゝつた。つまり、これらのデータを合わせると、 HZ誘導性、 TLR9—仲介性の自然免疫活性は、他の混入物に起因するものではないことを、強く示唆している。

[0042] (HZ誘導性自然免疫の活性化のクロ口キン感受性）

坑マラリア製剤クロ口キン（CQ)は、エンドソーム Zリソノームの成熟、マラリアへモゾインのクリスタル形成（crystal formation)を阻害するほか、マラリア感染中の炎症誘導性応答を阻害することが報告されてヽるが、 CQの坑マラリア効果の正確なメカニズムは、未だに論争中である（Int. J. Parasitol. 32: 1645-1653, 2002; Life Sci. 74: 1957- 1972, 2004) o最近の論拠は、 CQは、 TLR9仲介性自然免疫活性化も阻害することを示唆している（J. Immunol. 160: 1122-1131, 1998)。 HZ誘導性の炎症誘導性応答に対する CQの効果を調べるために、 CQの存在下で、 FL— DCを HZで刺激した。 HZ誘導性の TNF a及び IL—12p40の産出は、 CQにより減少した（図 5b)。

[0043] これらは、既知のメカニズムである、マラリア病原体による CQ阻害に加えて、 CQが、マラリア感染中の HZ誘導性、 TLR9仲介性の自然免疫応答を阻害することができ、それは治療効果に貢献する可能性があることを示唆している。さらなる研究が必要ではあるが、 HZ形成を阻害する能力にカ卩えて、 CQが HZと TLR9の相互作用に干渉し、又は食胞を含む HZの成熟を阻害し、結果的に以下の自然免疫活性化を阻害する可能性がある。

[0044] TLR9が特異的 IgGにより、細菌性 DNA又は自己 DNAクロマチン複合体中に Cp Gモチーフを認識することは報告されて、るが、 TLR9リガンドとしての非 DNA分子は報告されていない（Trends Immunol. 25: 381-386, 2004; Annu. Rev. Immunol. 20: 709-760, 2002) o最近の研究によって、 TLR9により認識される非 DNAリガンドの最初の論拠が報告されている。 HZは、赤血球力もへモグビンが分解される間に寄生虫の食胞に産出した重合ヘム（ferriprotoporphyrin IX)の結晶形である。マクロファージ、 DC等の貪食細胞に捕獲されると、 HZは、 TLR9が P13キナーゼを経由して、小胞体力補充されることがあるファゴソーム内に蓄積する（J. Exp. Med. 196: 269-274, 2 002; Nat. Immunol. 5: 190-198, 2004) ₀これは、 TLR9が、ファゴソーム内で HZを認識しうることを示唆している。

[0045] HZは、高疎水性であり、最近提案された仮説に従うと、免疫刺激効果に関与する可能性がある（Nat. Rev. Immunol. 4: 469-478, 2004)。 HZは本来、宿主赤血球内のヘモグロビンに由来している力生存し続けるために、原虫によって、毒性のヘムから、原虫に無毒の代謝物である HZへと、変更されることは興味深い。これは、不活性自己分子（inert self molecule) (ヘム）力マラリア感染中に不活性免疫システム内において、活性ィ匕した"非自己"分子となることを示唆している。

[0046] マラリア感染中の HZ誘導性、 TLR9仲介性の自己免疫活性化及びそれに対する宿主の防御の生物学的な役割は現在調査中である。予備的な結果により、マラリア原虫に対する自然免疫応答は、 TLRを含む宿主や Plasmodiumの複数の要因に依存していることを示唆している。最近の研究を含む、マラリア感染中の TLR仲介性の自然免疫活性化力宿主防御免疫（host protective immunity)に寄与しているの力、マラリア免疫逃避メカニズム (malarial immune escape mechanism)に寄与しているの力を、研究することは重要である。また、 TLR9が CpGDNA及び HZを識別する分子メ力-ズムを研究することも重要である。それにもかかわらず、現在までの観察により、マラリア感染中のヘム代謝物である HZは、 TLR9仲介性、 MyD88依存性及びクロ口キンビン敏感性の経路を通して、不活性免疫システムを活性化することを確かに証明しており、これは、不活性免疫におけるマラリア寄生虫一宿主相互作用をさらに理解する鍵となる。

[0047] [図の説明]

図 1. P. Falciparum由来精製 HZは、 MyD88依存性経路を通して、炎症誘発性応答を活性化する：

(a)野生型（WT)マウスの FL— DCを、精製へモゾイン（HZ) (30及び 100 M)で 2 4時間刺激した。 ELISAで、上澄み中の TNF a、 IL— 12p40、 MCP— 1又は IL— 6の産生を測定した。コントロールとして、 3 Mの CpGDNA (D35)を用いた。野生型（黒いバー）、 MyD88 マウス（白いバー）の（b) FL— DCゝ及び（c)脾臓細胞を、 30 /z Mの HZ及び CpGDNA(D35、 3 /z M)又は LPS (lOOngZml)で、 24時間刺激した。培養上澄み中の TNF a、 IL— 12p40、 MCP— 1又は IL— 6の産生を EL ISAで測定した。（d) CD40及び CD86の発現を調べるために、骨髄 DC (CDl lc+、 B220_)及び plasmacytoid DC (CDl lc+、 B220+)を、フローサイトメトリーによって分析した。斜線部分は、 HZで刺激されていない細胞を現し、実線は HZで刺激された細胞を現す。結果は、 2度の培養の平均値 + S. D.を現し、少なくとも 5回の別個の実験の代表例である。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。

[0048] 図 2. HZ誘導性の DC活性ィ匕は TRIF非依存的である：

野生型（WT)マウス及び TRIF^_/_マウスの FL— DCは、 30 μ Μの HZ及び LPS (1 OOngZml)で 24時間インキュベートし、その後上澄みを ELISAで分析し、 TNF a 又は IL 12p40の産生量を定量した。結果は、平均値 +4回の別個の実験の SEM (n=4)である。 P>0. 05、 HZ (WT)vsHZ (TRIF^_/_)。「n.d.」は、「検出されず」を意味する。

[0049] 図 3. TLR9は HZ誘導性の自然免疫活性化を仲介する：

(a)野生型（WT)マウス及び TLR2 マウス、 TLR4 マウス、 TLR7^_/_マウス、 TLR9^_/—マウスの骨髄 DC (CDl lc+、 B220_)及び plasmacytoid DC (CDl lc+、 B 220+)を、フローサイトメトリーで分析し、 CD40及び CD88の発現を定量した。斜線部分は HZで刺激されていない細胞を現し、実線は HZで刺激された細胞を現す。野生型及び TLR9^_/_細胞は指定の刺激でインキュベートし、 (b)脾臓細胞による TN F a、 IL 12p40、 MCP— 1又は IL— 6の産生、及び（c) FL— DCによる IFN α産生を、 ELISAで分析した。結果は、少なくとも 5回の別個の実験の代表例である。 Γ_η. d.」は、「検出されず」を意味する。

[0050] 図 4.インビボの HZ及び合成 HZ ( βへマチン）による血清サイト力インの産生は My D88及び TLR9依存的である：

1500 μ gの（a) P. falciparum精製 HZゝ又は（b)合成 HZ (sHZ)の!、ずれかを、 MyD 88"^ マウス、 TLR9^_/_マウス又は野生型（WT)マウスの腹腔内に注入した。 MC P 1及び IL 6の血清量は指定の時点にお、て ELISAで測定した。

[0051] 図 5.へモゾインは DNAを含まず、 HZ誘導性の炎症誘導性サイト力インの産生は、 DNase耐性及び熱耐性である力クロ口キン感受性である：

(a) DNAの混入を検出するために、 HZをァガロースゲル上に移し、臭化ブロマイドで染色した。 M、マーカー；レーン 1、 HZ溶液（lmM、 5 1)；レーン 2、熱失活 HZ (1 mM、 5 ^ 1)；レーン 3、 DNase処理 HZ (lmM、 5 ^ 1)；レーン 4P.falciparum粗抽出物 (4. 5%の寄生虫血症を含む 100mlの濃縮培養物から 5 1)； DNase処理粗抽出物 (5 /z l)。（b) C57ZB6マウスの FL— DCを、 30 Mの HZ又は DNase処理、熱失活、及び Z又は CQ ( 10 M)で 24時間インキュベートした。その後、上澄みを回収し、 ELISAで TNF a又は IL— 12p40を測定した。コントロールとして、 CpGODN (D35 )を 3 Mで用いた。 D35の TNF aの値を図に示す。結果は、 2度ずつ行った、 3回の別個の実験の内の 1つの代表例である（平均 + S. D. ) o * P. < 0. 05、HZvsH Z + CQ ; * * P. < 0. 05、 CpGODNvsCpGODN + CQ) ₀ 「n.d.」は、「検出されず」を意味する。

産業上の利用可能性

[0052] 本発明において、マラリア原虫一宿主間の相互作用について、 HZが自然免疫を活性ィ匕する免疫反応のメカニズムを分子レベルで解明した。本発明は、この知見に基!、て、マラリア感染症の診断のために用いることができるマラリア感染症の検出'測定方法、該 HZの誘導によるマラリア感染症の検出'測定方法を用いたマラリア感染症のワクチン或いはマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法を開発したものである。更に、上記知見に基いて、 HZ又は合成 HZ或いはその誘導体をアジュバント或いは免疫賦活剤として用いることによる、 HZの誘導による TLR9を介し、 M yD88に依存する自然免疫誘導の調節手段を開発した。

[0053] 本発明は、これらの開発により、マラリア感染症の診断、マラリア感染症のワクチン又は予防或いは治療薬の創製、更にはマラリア感染症に対する免疫療法としての自然免疫誘導の調節、すなわち、 HZ、 TLR9 (Toll様受容体 9)、 MyD88を含む自然免疫関連分子若しくはそのシグナル経路をターゲットにしたマラリア感染症の診断、抗マラリア薬や免疫療法の開発に対処する方策を提示し、これらの分野での利用に大きな貢献が期待できるものである。そして、 TLR9リガンドとして知られている CpG ODNは、自然免疫賦活剤として、癌や感染症の治療薬との CpGODNの併用療法や、抗アレルギー薬、およびワクチンアジュバントとして開発されていることから、へモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体は、 CpGODNと同様に、自然免疫賦活剤として、癌や感染症の治療薬との併用療法や、抗アレルギー薬、およびワクチンアジュバントとして開発され得る。また、へモゾインはマウス PDCにおいて IFN aを誘導しな、ことも、各種の CpGODNの活性と比較するうえで重要な知見である。

Claims

請求の範囲

[1] マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのへモゾイン誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出 ·測定することを特徴とするマラリア感染症の検出 ·測定方法。

[2] へモゾイン誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性の検出'測定力へモゾインによる、 TLR9を介し、 MyD88に依存する免疫細胞の活性ィ匕であることを特徴とする請求項 1記載のマラリア感染症の検出'測定方法。

[3] へモゾイン誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する免疫細胞の活性化の検出 •測定力へモゾインの誘導による免疫細胞のサイト力インの産生の検出.測定であることを特徴とする請求項 2記載のマラリア感染症の検出'測定方法。

[4] へモゾインの誘導による免疫細胞のサイト力インの産生の検出'測定力 TNF- a、 IL 12p40、 MCP— 1、 IL— 6、及び IFN αのいずれか 1以上のサイト力インの産生の検出 ·測定であることを特徴とする請求項 3記載のマラリア感染症の検出 ·測定方法。

[5] TLR9を介し、 MyD88に依存する免疫細胞の活性化力 TLR9を介し、 MyD88に依存する脾臓細胞又は榭状細胞の活性化であることを特徴とする請求項 2〜4のいずれか記載のマラリア感染症の検出 ·測定方法。

[6] 請求項 1〜5のいずれか記載のマラリア感染症の検出 ·測定方法を、被検ワクチンの評価方法として用いることを特徴とするマラリア感染症のワクチンのスクリーニング又は品質検査方法。

[7] 被検物質の存在下、マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマ一のへモゾイン又は合成へモゾイン或いはその誘導体の誘導による、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出'測定することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[8] TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性を検出'測定する方法が、請求項 2 〜5のいずれか記載の TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫活性の測定方法であることを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[9] マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのへモゾイン又は合成へモゾイン或いはその誘導体カゝらなる、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫誘導調節用アジュバント。

[10] マラリア原虫のヘモグロビン代謝産物である疎水性ヘムポリマーのへモゾイン又は合成へモゾイン或いはその誘導体を活性成分とする、 TLR9を介し、 MyD88に依存する自然免疫誘導用免疫賦活剤。

[11] MyD88^+/+及び TLR9^+/+の非ヒト動物に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン

、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイト力インの産生量と、 MyD88^_/

—及び/又は TLR9 の非ヒト動物に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合におけるサイト力インの産生量とを測定'評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[12] 非ヒト動物におけるサイト力インの産生量を、非ヒト動物における血清サイト力インの量として ELISAにより測定することを特徴とする請求項 11に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[13] 非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項 11又は 12に記載のスクリーニング方法。

[14] MyD88^+/+及び TLR9^+/+の遺伝子が発現している細胞に、被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量と、 MyD88^_/_及び Z又は TLR9 の遺伝子が発現している細胞に被検物質とへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体を投与した場合の細胞におけるサイト力インの産生量とを比較'評価することを特徴とするマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[15] 細胞が、脾臓細胞又は榭状細胞であることを特徴とする請求項 14に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[16] 細胞におけるサイト力インの産生量を、細胞の培養上澄中のサイト力インの量として E LISAにより測定することを特徴とする請求項 14又は 15に記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[17] サイト力インの産生量の測定が、 TNF— a、 IL 12p40、 MCP—1、 IL— 6、及び I FN aのいずれか 1以上のサイト力インの産生量の測定であることを特徴とする請求項 11〜16のいずれかに記載のマラリア感染症の予防又は治療薬のスクリーニング方法。

[18] へモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体からなるリガンドに対する、以下の

(a)又は (b)に記載のタンパク質の受容体としての使用方法。

(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力なるタンパク質；

(b)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつへモゾイン、合成へモゾイン、又はそれらの誘導体に対して反応性を有するタンパク質；

[19] タンパク質力配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAにコードされることを特徴とする請求項 18に記載の使用方法。

[20] タンパク質力配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAにコードされることを特徴とする請求項 18記載の使用方法。

[21] 以下の（a)又は (b)に記載の受容体タンパク質に対する、へモゾイン、合成へモゾィン、又はそれらの誘導体のリガンドとしての使用方法。

(a)配列番号 2に示されるアミノ酸配列力なるタンパク質；

[22] タンパク質力配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAにコードされることを特徴とする請求項 21に記載の使用方法。

[23] タンパク質力配列番号 1に示される塩基配列又はその相補的配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAにコードされ、かつへモゾインに対して反応性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項 21記載の使用方法。

[24] へモゾイン、合成へモゾイン又はそれらの誘導体を有効成分として含有することを特徴とする TLR9作動剤。

[25] MyD88を活性ィ匕することを特徴とする請求項 24記載の TLR9作動剤。

[26] TLR— MyD88依存経路による免疫応答を誘導することを特徴とする請求項 25記載の TLR9作動剤。

[27] TLR—MyD88依存経路による免疫応答力 TNF— α、 IL— 12p40、 MCP—1、 I L— 6、及び IFN aのいずれか 1以上のサイト力インの産生であることを特徴とする請求項 26記載の TLR9作動剤。

[28] TLR9を選択的に活性ィ匕することを特徴とする請求項 24〜27のヽずれか記載の TL R9作動剤。

[29] TLR2、 TLR4、 TLR7、 TRIFを活性化しな!、ことを特徴とする請求項 28記載の TL R9作動剤。

[30] 自然免疫制御剤として用いられることを特徴とする請求項 24〜29のいずれか記載の TLR9作動剤。

[31] へモゾイン、合成へモゾイン又はそれらの誘導体を TLR9のリガンドとして使用する方法。

[32] TLR9— MyD88依存経路による免疫応答を誘導させる方法を含むことを特徴とする請求項 31記載の使用する方法。

[33] TLR—MyD88依存経路による免疫応答力 TNF— α、 IL— 12p40、 MCP—1、 I

L— 6、及び IFN aのいずれか 1以上のサイト力インの産生であることを特徴とする請求項 32記載の使用する方法。

[34] 自然免疫の制御方法を含むことを特徴とする請求項 31〜33のいずれか記載の使用する方法。