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WO2002006483A1 - Nouveau peptide actif sur le plan physiologique et utilisation associee - Google Patents

Nouveau peptide actif sur le plan physiologique et utilisation associee Download PDF

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WO2002006483A1
WO2002006483A1 PCT/JP2001/006162 JP0106162W WO0206483A1 WO 2002006483 A1 WO2002006483 A1 WO 2002006483A1 JP 0106162 W JP0106162 W JP 0106162W WO 0206483 A1 WO0206483 A1 WO 0206483A1
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WO
WIPO (PCT)
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peptide
amino acid
seq
acid sequence
salt
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2001/006162
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuya Ohtaki
Yasushi Masuda
Yoshihiro Takatsu
Takuya Watanabe
Yasuko Terao
Yasushi Shintani
Syuji Hinuma
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP01951893A priority patent/EP1302542B1/en
Priority to US10/333,192 priority patent/US7045299B2/en
Priority to DE60128916T priority patent/DE60128916T2/de
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Priority to US11/304,129 priority patent/US7419956B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention provides: (1) a peptide or a salt thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21; A protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: or a salt thereof, and represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21; A compound or a salt thereof useful as a prophylactic / therapeutic treatment of gastrointestinal diseases, characterized by using a peptide or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence And the like.
  • Background art
  • G protein guanine nucleotide-binding protein
  • G protein-coupled receptors seven-transmembrane receptors.
  • various hormones and neurotransmitters and their receptor proteins exist and interact with each other to play a significant role in the regulation of biological functions. It is often still unknown whether or not there are receptors (such as hormones and neurotransmitters) and their receptors.
  • receptors such as hormones and neurotransmitters
  • the accumulation of sequence information by random sequencing of human genomic DNA or cDNA derived from various human tissues, and rapid advances in gene analysis technology have led to the rapid elucidation of human genes. .
  • the existence of many genes that are expected to encode proteins with unknown functions has been revealed.
  • G protein-coupled receptors not only have seven transmembrane domains but also have many common sequences in their nucleic acids or amino acids, and are clearly classified as G protein-coupled receptors among such proteins. can do.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such a G protein-coupled receptor gene has also been obtained by the polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method utilizing the structural similarity (Nature Cel). l Biology, Vol. 2, 703-708 (2000)).
  • PCR polymerase chain reaction
  • receptors are called orphan receptors.
  • Such unidentified endogenous ligands for orphan receptors may be involved in biological phenomena for which the ligands were not known and had not been fully analyzed.
  • the development of receptor agonists or antagonists is expected to lead to the creation of innovative drugs (Stadel, J. et al., TiPS, 18, 430-437, 1997, Marchese, A. et al., TiPS, 20, 370-375, 1999, Civell i, 0.et al., Brain Res., 848, 63-65, 1999).
  • novel peptides such as Pr RP (prolactin releasing pepti de), orexin, pe 1 in, ghre 1 in, and GAL P (galanin-like peptide) have been used in the same manner as above. Isolated as a body ligand (Hi A a, S. et al., Nature, 393, 272-276, 1998, Saku rai, T. et al., CelK 92, 573-585, 1998, Tatemoto, K. et al., Bichem. Biophys. Res. Co., 251, 47, 476, 1998, Kojima, M. et al., Nature, 402, 656-660. , 1999, Ohtaki, T. et al., J. Biol. Chem., 274, 3704, 37045, 1999).
  • a receptor for a physiologically active peptide which has not been clarified, may be elucidated by a similar method.
  • the receptor for motilln involved in intestinal contraction was found to be GPR38 (Feighner, SD et al., Science, 284, 2184-2188, 1999), and SLC-1 was melanin-aggregated Identified as a hormone (MCH) receptor (Chambers, J. et al., Nature, 400, 261-265, 1999, Saito, Y. et al. Nature, 400, 265-269 Commun., 261, 622-626, 1999, Lembo, PMC et al., Nature Cell Biol. 1, 267-27. Around 1999, Bactmer, D.
  • MCH has been shown to be involved in obesity because its knockout mice exhibit an emulsified phenotype (Shimada, M. et al., Nature, 396, 670-674, 1998).
  • the clarification of the body has enabled the search for receptor antagonists with potential as antiobesity agents.
  • urotensin II should be administered intravenously to monkeys. Have been reported to exert a potent effect on the cardiovascular system by inducing cardiac ischemia (Ames, RS et al., Nature, 401, 282-286, 1999).
  • the orphan receptor and its ligand are often involved in new physiological actions, and elucidation thereof is expected to lead to new drug development.
  • there are many difficulties in searching for ligands for orphan receptors and only a few of the receptors whose ligands have been revealed while many orphan receptors have been identified so far. Just a department.
  • the present inventors have proposed a novel receptor ZAQ (an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the present specification), which is an orphan G protein-coupled receptor. : In the present specification, it may be simply referred to as ZAQ), but it has not been known what the ligand is. Searching for a ligand for orphan receptor protein ZAQ, Establishing a screening method for compounds characterized by using ZAQ and its ligands has been an issue. Disclosure of the invention
  • the present inventors found that a substance having ZAQ-specific ligand activity was present in the milk extract, separated the substance, and determined the structure. Furthermore, when a gene encoding a human-type peptide of this active component was found and expressed in animal cells, a peptide substance that activates ZAQ-expressing cells was secreted into the culture supernatant. It was confirmed.
  • the present inventors have developed a therapeutic agent for a disease mediated by ZAQ (such as a ZAQ antagonist or agonist) using a screening system using ZAQ and a ZAQ ligand peptide. Found that it can screen for prevention and treatment of gastrointestinal disorders.
  • ZAQ such as a ZAQ antagonist or agonist
  • the peptide according to (1) or a salt thereof and represented by SEQ ID NO: 36 A protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and the peptide or the salt thereof according to the above (1).
  • the protein according to the above (1) or a salt thereof and a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof Characterized in that it has an altered binding property to a protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the peptide or the salt thereof according to the above (1).
  • a method for preventing or treating gastrointestinal diseases which comprises administering an effective amount of a compound that changes the binding property to a salt thereof or a salt thereof.
  • the peptide according to (1) which can be obtained by using the screening method according to (15) or the screening kit according to (17) for producing an agent for preventing or treating a digestive tract disease. Or a salt thereof and a compound having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 or a compound capable of changing the binding property to a salt thereof or a salt thereof. . Furthermore, the present invention provides
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 is at least about 60% (preferably) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 Is about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 9% or more. (5% or more), the peptide or the salt thereof according to the above (1), which is an amino acid sequence having homology
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 is as follows: 1) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 An amino acid sequence in which one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 20) amino acids have been deleted, 2 SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 The amino acid sequence represented by 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 40, more preferably about 1 to 30, and particularly preferably about 1 to 20) amino acids Added amino acid sequence, 3 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 20) ) An amino acid sequence in which the amino acid is replaced with another amino acid, or Wherein the amino acid sequence (1) a peptide or salt thereof according,
  • the labeled peptide according to (1) or a salt thereof contains a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the method according to the above (1) wherein the amount of the labeled peptide or the salt thereof described in the above (1) when the cell is brought into contact with a cell containing the protein to be tested is measured and compared.
  • a screening method for the salt
  • the labeled peptide according to (1) or a salt thereof contains a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the labeled peptide of the above (1) or a salt thereof and a test compound are identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a labeled peptide of the above (1) or a salt thereof is converted to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA containing the encoding DNA and bringing it into contact with the protein expressed on the cell membrane of the transformant;
  • the labeled peptide of (1) or a salt thereof and a test compound are identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein expressed on the cell membrane of a transformant obtained by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing DNA containing DNA encoding a protein containing the same amino acid sequence And measuring and comparing the amount of the labeled peptide or the salt thereof according to the above (1) in the case of contacting with the protein, and comparing the amount with the peptide or the salt thereof according to the above (1).
  • Salt screening method
  • the peptide or the salt thereof described above is brought into contact with the membrane fraction of the cell containing the protein containing the amino acid sequence, the amount of binding of the labeled peptide or salt thereof to the membrane fraction of the cell is measured and compared.
  • the labeled peptide of (1) or a salt thereof encodes a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36
  • C culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA and bringing it into contact with a protein expressed on the cell membrane of the transformant; (1) a peptide or a salt thereof and a test compound, as described above, using a DNA containing a DNA encoding a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36;
  • the above-described (1) wherein the transformant transformed with the containing recombinant vector is cultured and brought into contact with a protein expressed on the cell membrane of the transformant.
  • SEQ ID NO: 36 A method for screening a compound or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, and which changes the binding property to a protein or a salt thereof,
  • the peptide or salt thereof according to (1) which is obtainable by using the screening kit according to (43) to (45), and is substantially or identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the peptide or salt thereof according to (1) which is obtainable by using the screening kit according to (46) to (48), is the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36.
  • a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein or a salt thereof containing the same amino acid sequence is the same as or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36.
  • the antibody according to (13) is competitively reacted with a test solution and a labeled peptide or salt thereof according to (1), and the labeled (B) is bound to the antibody.
  • polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of DNA according to (7) or a part thereof, (57) the polynucleotide according to the above (56), which comprises a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29 or a part thereof;
  • SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 A compound having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49, or a compound capable of changing the binding property to a salt thereof, or a salt thereof;
  • a peptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 or a salt thereof and SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: : 47, a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 1 with a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, or a salt thereof, characterized by using a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49 with a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence or a salt thereof.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 an amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, which can be obtained by using the screening method according to (63) or the screening kit according to (64); SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 48 or a peptide containing the sequence and identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence (ZAQC) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (following FIG. 2). ⁇ ).
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence (ZAQC) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom. ).
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence (ZAQC) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1, and the amino acid sequence deduced therefrom (continuation of FIG. 2).
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence (ZAQT) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (following FIG. 5).
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence (ZAQT) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (following FIG. 4 and following FIG. 6).
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence (ZAQT) of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (continuation of FIG. 5).
  • FIG. 7 shows a hydrophobic plot of the human brain-derived protein of the present invention.
  • FIG. 8 shows the results of analysis of the expression distribution of ZAQ performed in Example 2.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequences of MIT1, human ZAQ ligand precursor peptide (A type) and human ZAQ ligand precursor peptide (G type).
  • MI T1 represents the amino acid sequence of MI ⁇ 1
  • Human (A type) represents the amino acid sequence of a human type Z AQ ligand mature peptide (A type)
  • Human (GtyP e ) "Indicates the amino acid sequence of the human ZAQ ligand mature peptide (G type), respectively.
  • FIG. 10 shows the results of the measurement of the ZAQ activating effect of the purified ZAQ ligand peptide performed in Example 6 (6-3).
  • FIG. 11 shows a restriction map of plasmid pCAN618 used in Example 5 (5-1).
  • Figure 12 shows the human ZAQ ligand peptide and M obtained in Example 8 (8-3). 3 shows the results of measuring the ZAQ receptor activating action of I Tl.
  • numeral 11 denotes human ZAQ ligand peptide
  • numeral 1 denotes MIT1.
  • FIG. 13 shows the results of measurement of the activity of the human ZAQ ligand peptide and MIT1 to activate the I5E receptor performed in Example 8 (8-3).
  • each one indicates a human ZAQ ligand peptide, and each one indicates MIT1.
  • FIG. 14 shows the measurement results of the contraction effect performed in Example 11.
  • each one indicates a human ZAQ ligand peptide, and —Hata— indicates MI Tl.
  • FIG. 15 shows the measurement results of binding assay using the ZAQ membrane fraction performed in Example 12.
  • Soichi indicates the amount of 125 I-MIT1 specific binding when human ZAQ ligand peptide at a variable concentration (shown on the horizontal axis) was added as a test compound
  • FIG. 16 shows the results of binding assay measurement using the I 5 E membrane fraction performed in Example 12.
  • one bite indicates the specific binding amount of 125 I-MIT1 when human ZAQ ligand peptide at a variable concentration (shown on the horizontal axis) is added as a test compound, and one variable shows the variable concentration (shown on the horizontal axis) 5 shows the amount of 125 I_MIT1 specific binding when MIT1 was added as a test compound.
  • the peptide of the present invention or a salt thereof is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the protein of the present invention).
  • the peptide of the present invention or a salt thereof has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49 Is a peptide or a salt thereof capable of binding to a protein or a salt thereof, and a peptide or a salt thereof capable of binding and activating the protein.
  • the peptide of the present invention or a salt thereof is represented by SEQ ID NO: 20 or A peptide or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 and has the ability to bind to and activate the protein of the present invention, or a salt thereof. .
  • the ability of the peptide of the present invention or a salt thereof to bind to the protein of the present invention and to activate the protein of the present invention can be measured by the methods described below.
  • the peptide of the present invention or a salt thereof may be abbreviated as the peptide of the present invention.
  • the protein of the present invention (G protein-coupled receptor protein) has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (FIGS. It is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as in FIG. 3 or the amino acid sequence in FIGS.
  • the peptide of the present invention and the protein of the present invention may be, for example, human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, rabbits, Evening, hidge, horse, monkey, etc. all cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, vicinal iS cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells) , Fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes ), Megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, Cells or cancer cells) and blood cells (eg, MEL, Ml
  • the peptide of the present invention or the protein of the present invention has a signal sequence
  • the peptide or protein can be efficiently secreted extracellularly.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 include, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21; % Or more (preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more).
  • Amino acid sequence having the property are examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • % Or more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 85% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 Peptides containing substantially the same amino acid sequence and having substantially the same properties as those containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 are preferred.
  • a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 may be referred to as a humanized ZAQ ligand mature peptide.
  • Examples of the peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 include, for example, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 It contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence, and has substantially the same activity as a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • Peptides and the like are preferred, and specific examples include peptides containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23.
  • a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 may be referred to as a human-type ZAQ ligand precursor peptide.
  • Substantially the same activity includes, for example, a binding activity to the protein of the present invention, a signal transduction action via the protein of the present invention, a gastrointestinal (eg, intestinal) contraction activity. And the like. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as the binding activity to the protein of the present invention, the signal transduction action via the protein of the present invention, and the gastrointestinal contractile activity are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the peptide may be different.
  • the peptide of the present invention includes: (1) one or more or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 (preferably, about 1 to 30, more preferably An amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids have been deleted, 2) 1 or 2 or more amino acids (preferably, 1 to 40 amino acids) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 , More preferably about 1 to 30 amino acids, particularly preferably about 1 to 20 amino acids), and 3 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the peptide of the present invention is preferably a human or non-human mammal, more preferably a human-derived peptide.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, 'about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequences having about 98% or more homology include amino acid sequences having about 98% or more homology.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Preferred is a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by formula (1).
  • Examples of the protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, the protein represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • substantially equivalent activities include, for example, ligand binding activity and signal transduction. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as ligand binding activity and signal transduction are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein are different. May be.
  • the activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction activity can be measured according to a known method.
  • the activity can be measured according to a determination method or a screening method described later.
  • ZAQ a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be referred to as ZAQ.
  • the protein of the present invention includes: (1) one or more or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably An amino acid sequence in which several (1 or 2) amino acids have been deleted, (2) one or more (preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 2) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence to which about 10 or more, more preferably several (one or two) amino acids have been added; and 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably An amino acid sequence in which about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 or 2) amino acids are substituted with another amino acid, or a combination thereof.
  • SEQ ID NO: 1 preferably, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably An amino acid sequence in which several (1 or 2) amino acids have been deleted
  • SEQ ID NO: 1 preferably An amino acid sequence to which about 10 or more, more preferably several (one or two)
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 for example, about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 are amino acid sequences having about 98% or more homology.
  • Examples of a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 Proteins containing the qualitatively identical amino acid sequence and having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 are preferred. Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 And a protein having substantially the same activity as that of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, and is specifically described in WO98 / 46620. Protein.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 for example, about 97% or more, preferably about 98% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 Is an amino acid sequence having a homology of about 99% or more, most preferably about 99.5% or more.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 include, for example, a protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40; Preferred are proteins having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40 And a protein having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 for example, about 95% or more, preferably about 96% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 Is an amino acid sequence having about 97% or more, most preferably about 98% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 include, for example, a protein having the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47; Preferred are proteins having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 for example, about 95% or more, preferably about 96% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 are amino acid sequences having homology of about 97% or more, most preferably about 98% or more.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48; A protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 is preferred.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48. Specifically, Biochem. Biophys. Acta, 1491, 369 -P. 375, 2000, and the like.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 for example, about 95% or more, preferably about 96% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 are amino acid sequences having homology of about 97% or more, most preferably about 98% or more.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49; Preferred are proteins having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49.
  • Examples of the protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 include, for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 49
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the acid sequence and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 is preferred. Include proteins described in WO98 / 46620.
  • substantially equivalent activities include, for example, ligand binding activity and signal transduction. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, it is preferable that the activities such as ligand binding activity and signal transduction are equivalent (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein are different. May be.
  • the activities such as the ligand binding activity and the signal information transmission activity can be measured according to known methods.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34
  • An amino acid sequence having a homology of about 80% or more, most preferably about 90% or more, may be mentioned.
  • Examples of the peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 include, for example, the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 And a peptide having substantially the same activity as that of the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 (eg, ileal contraction, distal colon contraction, proximal colon relaxation, etc.) is preferred. However, specifically, MIT 1 described later is cited.
  • peptides and proteins have N-terminal (amino terminal) at the left end and C-terminal (carboxyl terminal) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a C-terminal lipoxyl group (—CO OH), carboxylate (one COO—), amide (—C It may be either ONH 2 ) or ester (—COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, cyclopentyl Le, cyclohexylene, such as cyclohexyl (._ 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, Hiichi Nafu A C 6 ⁇ 2 aryl group such as tyl; for example, a benzyl or phenethyl C i _ 2 alkyl group or a Q!
  • the peptide / protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • the peptide / protein of the present invention also includes those in which the carbonyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the peptide protein of the invention Oite the peptide protein as described above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, C 2 _ 6 Arukanoiru group such as ⁇ Se ethyl group 6 Ashiru also protected by group, etc.), also N-terminal region is dull evening mill group is cleaved in vivo and the produced and pin port dull evening Min oxide, the side chain of an amino acid in the molecule - C E such above substituents (e.g., - OH, - SH, amino group, I imidazole group, indole group, Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., formyl group, etc. C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group (Eg, 6-acyl group), or so-called glycopeptides / glycoproteins / complex peptides / complex proteins to which sugar chains are bonded.
  • peptide of the present invention include, for example, a human-derived (more preferably human brain-derived) peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, or SEQ ID NO: 21
  • examples include human-derived (more preferably human brain-derived) peptides containing an amino acid sequence. More preferably, a human-derived peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
  • protein of the present invention include, for example, a protein derived from human (more preferably from human brain) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the partial peptide of the protein of the present invention may be any partial peptide of the protein of the present invention described above.
  • the protein molecules of the present invention those which are exposed outside the cell membrane and have substantially the same ligand binding activity are used. You can.
  • the extracellular region (Hydrophilic region) in the hydrophobicity plot analysis shown in FIG. I a peptide containing a moiety that was analyzed to be Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used.
  • a peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing multiple domains simultaneously may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention may be at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the protein of the present invention. Peptides and the like are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, most preferably Indicates an amino acid sequence having about 95% or more homology.
  • the partial peptide of the present invention comprises one or more (preferably 1 to About 10 amino acids, more preferably several (1 or 2) amino acids are deleted, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20 and more preferably 1 to 2) About 10 or more, more preferably several (1 or 2) amino acids, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10 or more, more preferably About 1 to 5, more preferably several (one or two) amino acids may be substituted with other amino acids.
  • the C-terminus force Rupokishiru group (one CO OH), the force Lupo Kishireto (one C_ ⁇ _ ⁇ _) amide be any of (one C ONH 2) or ester (-COOR) Good.
  • the partial peptide of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, the partial peptide of the present invention also includes those in which the lipoxyl group is amidated or esterified. .
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention includes a peptide in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and a G-peptide formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • a protecting group for protecting the amino group of the N-terminal methionine residue
  • the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49 is used.
  • it is a partial peptide of a protein containing an amino acid sequence, it may be any.
  • a portion of a protein molecule that is exposed outside the cell membrane and has substantially the same quality Those having a ligand binding activity are used.
  • the number of amino acids in the partial peptide may be at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acids in the constituent amino acid sequences of the protein.
  • a substantially identical amino acid sequence is at least about 50%, preferably at least about 70%, more preferably at least about 80%, even more preferably at least about 90%, most preferably the same as these amino acid sequences. Or about 95% or more homology.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • the peptide or protein of the present invention or a salt thereof, and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 47, or a salt thereof, are as described above.
  • the peptide can be produced from animal cells or tissues by a known peptide / protein purification method, or the peptide of the present invention described below, the protein of the present invention, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: : Four It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by 7. Also, the peptide described below
  • a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 or a salt thereof can be produced according to the method described in Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1491, pp. 369-375, 2000.
  • the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 or a salt thereof can be produced according to the method described in WO98 / 46620.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Purification and isolation can be achieved by combining the chromatography.
  • a commercially available resin for peptide / protein synthesis can be usually used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 -Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4_ (2,4,1-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2,2,4,1-dimethoxyphenyl) Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • amino acids having appropriately protected amino groups and side chain functional groups are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide / protein according to various known condensation methods.
  • peptides and proteins are cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired peptide, protein, or their amide. I do.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt) or may be pre-formed as a symmetrical anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOBt, HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide-protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols such as dimethyl sulfoxide, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. A mixture or the like is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range that can be used for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120: to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, succinylpentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarponyl, 4-methoxybenzyloxyl-ponyl, CI—Z, Br—Z, Adamantyloxycarponyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester) Steryl, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, Yuichi Sharybutoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopenty
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • esterification for example, a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, a t-butyl group and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz and C 1 2 -B z and 2 two Torobenjiru, B r- Z, such as tertiary butyl is used.
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol
  • Cyanomethyl alcohol paranitrophenol
  • H ⁇ NB N-hydroxysuccinimide
  • N-hydroxyphthalimide N-hydroxyphthalimide
  • an ester with HOBt an ester with HOBt
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • Acid treatment with sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia are also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C to 40 ° C.
  • the protection of functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, the removal of the protective groups, and the activation of the functional groups involved in the reaction are performed by known means, and the protective groups used for protecting the functional groups are each known from known groups. Selected and applied as appropriate.
  • Another method for obtaining amides of peptides and proteins is, for example, first protecting the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal with amidation and then extending the peptide chain to the desired length on the amino group side. After that, a peptide / protein in which only the protecting group of the 0! -Amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain has been removed and a peptide / protein in which only the protecting group of the C-terminal lipoxyl group has been removed are produced.
  • Peptide 'Both proteins are condensed in a mixed solvent as described above. The details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude peptide / protein can be purified by various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain an amide of the desired peptide / protein.
  • ester of a peptide / protein for example, after condensing the 0! -Hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester is obtained in the same manner as the amide of the peptide / protein. It is possible to obtain an ester form of the peptide / protein.
  • the peptide of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a portion that can constitute the peptide of the present invention or the protein of the present invention.
  • the desired peptide can be produced by condensing the remaining peptide or amino acid with the remaining portion and, if the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in (1) to (4) below.
  • the peptide of the present invention or the partial peptide of the present invention is purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. be able to.
  • a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the peptide or partial peptide obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method.
  • the peptide or partial peptide is obtained by a salt, it can be released by a known method. Can be transformed into a body.
  • the DNA encoding the peptide / protein of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the peptide / protein of the present invention.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell and tissue-derived cDNA, the above-described cell and tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the DNA encoding the peptide of the present invention for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27, or a sequence No. 26 or DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27, containing DNA that hybridizes under high stringent conditions, and having substantially the same activity as the peptide of the present invention (eg, the present invention) Any DNA may be used as long as it encodes a peptide having a protein binding activity, a signal transduction activity via the protein of the present invention, and a gastrointestinal (eg, intestinal) contraction activity.
  • Any DNA may be used as
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 under high stringent conditions include, for example, about 60% or more, and preferably about 70%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of at least about 80% or more is used.
  • Examples of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 include DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29, and the like.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 under high stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 More preferably, a DNA containing a base sequence having about 80% or more homology is used.
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more is used.
  • Hybridization is performed by a known method or a method equivalent thereto, for example, This can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 6 ° to 6 ° C. The condition of 5 is shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
  • examples of the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, and SEQ ID NO:
  • Examples of the DNA encoding the peptide having the amino acid sequence represented by 21 include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22
  • Examples of the DNA encoding the peptide include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, and a DNA encoding the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 Is a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide (oligonucleotide) containing the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA encoding the peptide of the present invention or a part thereof not only includes the DNA encoding the peptide of the present invention but also includes , And RNA.
  • the nucleotide sequence of a DNA encoding a peptide obtained by cloning or determining an antisense (oligo) nucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the peptide gene of the present invention can be designed and synthesized based on the base sequence information.
  • Such (oligo) nucleotides (nucleic acids) are It can hybridize with the RNA of the gene, can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can regulate the expression of the gene of the peptide of the present invention through the interaction with the peptide-related RNA of the present invention. Adjustment ⁇ Can be controlled.
  • (Oligo) nucleotides complementary to the selected sequence of the peptide-related RNA of the present invention, and (oligo) nucleotides capable of specifically hybridizing with the peptide-related RNA of the present invention are used in vivo and It is useful for regulating and controlling the expression of the peptide gene of the present invention in vitro, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • corresponding means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • Corresponding between a nucleotide, a base sequence or a nucleic acid and a peptide usually refers to the amino acids of the peptide as directed by the sequence of nucleotides (nucleic acids) or its complement.
  • the untranslated region, the 3 'end palindrome region, and the 3' end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the gene of the peptide of the present invention may be selected.
  • Antisense (oligo) nucleotides may be 2-deoxy-D-report-containing polydeoxynucleotides, D-report-containing polynucleotides, N-daricosides of purine or pyrimidine bases, or other types of poly-nucleotides.
  • Nucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • other polymers containing special bonds may be present in DNA or RNA
  • a pair of nucleotides as found can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides or unmodified oligonucleotides. , And those with known modifications, such as those known in the art.
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens and aliphatic groups, or on functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
  • the antisense nucleic acids of the present invention are RNAs, DNAs or modified nucleic acids.
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be toxic if it is toxic. Minimize toxicity of chisense nucleic acid.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a given form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance the interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids (for example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol) can be mentioned.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, a sugar, or an intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. .
  • Examples of such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the field, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of an antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a protein.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, it may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention for example, a partial base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3
  • a DNA that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the sequence, or DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, and the protein peptide of the present invention DNA containing a partial base sequence of DNA encoding a protein having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc.) is used.
  • Examples of the DNA that hybridizes under high stringent conditions with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 include, for example, the nucleotide represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the sequence is used.
  • DNA incorporated into an appropriate vector is selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the peptide of the present invention or a DNA fragment labeled with a synthetic DNA.
  • the hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the cloning of DNA that completely encodes the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, abbreviated as the protein of the present invention) is performed in the same manner as the cloning of DNA that completely encodes the peptide of the present invention. It can be carried out.
  • the DNA base sequence can be converted by PCR or a known kit, for example, Mutan TM -super Expression Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the like.
  • the method can be performed according to a known method such as the method, the Gapped Duplex method, the Kunke method, or the like, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned peptide or protein can be used as is, or as desired, after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker. be able to.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the peptide / protein of the present invention may be prepared, for example, by (i) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the peptide / protein of the present invention, and (mouth) expressing the DNA fragment appropriately. It can be produced by ligating downstream of a promoter in a vector.
  • the vector examples include a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pT , 5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, p SH19, pSH15), bacteriophages such as input phages, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXTl, pRcZCMV, pRcZRSV, pcDNAI / Neo, pc DNA3.1, pRc / CMV2, pRc / RSV (Invitrogen) and the like are used.
  • E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, p
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • the promoter includes the SRcu promoter, the SV40 promoter, the HIV-LTR promoter, the CMV promoter, the HSV-TK promoter, and the like. Of these, it is preferable to use the CMV promoter, SR c3 ⁇ 4 promoter and the like.
  • the host is a genus Escherichia, the trp promoter, the lac promoter, the recA promoter, the ⁇ promoter, the 1 ⁇ ⁇ promoter, etc., and if the host is a Bacillus genus, the SPOL promoter,
  • yeast such as the SPO2 promoter and the penP promoter, PH05 Promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • expression vectors include, if desired, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter referred to as SV4 0 ori) may be used.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Ampr) If there is), the neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as N eo r, include G418 resistance) and the like.
  • dhfr gene when used as a selection marker using CHO (dhfr-) cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal of the protein of the present invention.
  • the host sequence includes a signal sequence, subtilisin, signal sequence, etc. If the host is an animal cell, the MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and if the host is an animal cell, the insulin signal sequence, -inu-feron signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of Obs Natl. Acad.. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], J ⁇ 221 [Journal ⁇ Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], ⁇ 101 [Journal of Molecular Biology 'Bioguchi G, 41, 459 (1969)], C 600 [Genetic (Genetics), 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI 114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of 'Biochemistry (Journal of Biochemistry), 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B_12, Schizosaccharomyces ponbe NCYC 1913, NCYC2036, Pichia pastori (Pichia pastoris) and the like are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S S cell), MGl cell derived from the midgut of Tricoplusia ni, and High derived from the egg of Trichoplusia ni Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estiginena acrea are used.
  • Sf cells include, for example, Sf9 cells (AC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), and dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dh fr—) cell. ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, and human FL cells.
  • Bacillus spp. Can be transformed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and includes a carbon source necessary for growth of the transformant.
  • Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, Examples of inorganic or organic substances such as potato extract and inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the pH of the medium may be about 5 to 8 even if yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like are added.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal * Job * Experimentin, Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genomics) etics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is yeast, the medium may be, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., "Processings of the National Academy of Sciences”. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and an SD medium containing 0.5% casamino acid [BiUer, GA et al., "Proc. Prob. Natl. Acad .. Sci. USA, 81, 5330 (1984)], and the National Academy of Sciences.
  • the pH is preferably adjusted to about 5 to 8. Culture is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium used was 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TC, Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives such as serum are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association, Vol. 199, 519 (1967)], 199 Media [Proceding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (1950)] and the like are used.
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually performed at about 30 ° C (: up to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the peptide / protein of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
  • the cells or cells are collected by a known method after culture, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freezing. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • Purification of the peptide / protein contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation / purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting-out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using difference in charge method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • a method utilizing the difference in gender, a method utilizing the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, etc. are used.
  • the peptide / protein thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained in a salt, a known method Alternatively, it can be converted to a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the peptide / protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the peptide / polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the peptide of the present invention thus produced can be determined by the binding experiment between the labeled peptide of the present invention and the protein of the present invention and the specific antibody. It can be measured by means such as a sail.
  • the activity of the produced protein of the present invention can be measured by a binding experiment with a labeled peptide of the present invention and an enzymimnoassay using a specific antibody.
  • An antibody against the peptide of the present invention, the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof is an antibody capable of recognizing the peptide of the present invention or the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof. Any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody may be used.
  • Antibodies against the peptide of the present invention, the protein of the present invention or a partial peptide thereof, or a salt thereof may be abbreviated as the peptide / protein of the present invention. It can be used as an antigen and can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the peptide, protein, etc. of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • mammals to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • myeloma cells monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum is performed, for example, by reacting the labeled peptide / protein of the present invention described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. be able to.
  • the fusion operation is performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Millstein [Nature, 256, 495 (1975)]. can do.
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells to be used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 ° C for about 1 to 10 minutes.
  • the hybridomas may be hybridized to a solid phase (eg, a microplate) on which the antigen of the present invention, such as the peptide or protein, is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Doma culture supernatant is added, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A is added.
  • a method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a protein or the like may be used.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum; RPMI 1640 medium, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or hybridoma culture A serum-free medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies.
  • immunoglobulin separation and purification eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or specific purification by collecting only the antibody using an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody Act].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as the peptide and protein of the present invention) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • ⁇ Production is carried out by collecting antibody-containing substances for proteins, etc., and separating and purifying the antibodies.
  • the type of carrier-protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the fact that the antibody can efficiently react with the hapten immunized by crosslinking with the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio.For example, serum serum albumin, thyroglobulin, keyhole, lysate, hemocyanin, etc. are converted to hapten 1 by weight. On the other hand, a method of pulling at a rate of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier, but an active ester reagent containing a dartalaldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithioviridyl group is used. .
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible, by itself or together with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be preferably collected from blood, such as blood or ascites, of a mammal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the peptide of the present invention, the DNA encoding the peptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention) and the antibody against the peptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) are (1) a prophylactic / therapeutic agent for various diseases involving the peptide of the present invention; (2) screening for a compound or a salt thereof that alters the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention; Quantitation, 4Gene diagnostic agent, ⁇ ⁇ Drug containing antisense DNA, ⁇ ⁇ Drug containing antibody of the present invention, ⁇ Creation of non-human animal containing DNA of the present invention, 8Structurally similar ligand -Useful for drug design based on comparison with the receptor.
  • a compound that changes the binding property of a ligand to the protein of the present invention which is specific to humans and mammals (eg, ZAQ agonists, ZAQ antagonists, etc.) can be screened, and the agonist or gonist can be used as a preventive or therapeutic agent for various diseases.
  • the peptide of the present invention exists as a humoral factor in vivo, activates the protein of the present invention, and intracellular Ca 2+ of cells expressing the protein of the present invention. Increasing the ion concentration revealed that it was a ligand for the protein of the present invention (G protein-coupled receptor).
  • the peptide of the present invention may be a snake venom Mamba Intest inal Toxin 1 (sometimes abbreviated as MIT 1; SEQ ID NO: 34; Toxicon, 28, 847-856, 1990; FEBS Letters, 461, 183-188, 1999) and about 56% homology at the amino acid level.
  • MIT 1 snake venom Mamba Intest inal Toxin 1
  • SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 34
  • Toxicon 28, 847-856, 1990
  • FEBS Letters 461, 183-188, 1999
  • MIT 1 causes contraction of the ileum and distal colon, or relaxation of the proximal colon, to a degree comparable to that of potassium chloride 40 (FEBS Let ters). 461, 183-188, 1999), but the point of action and mechanism of action have not been elucidated.
  • the present inventors have clarified that the action of MIT1 is also expressed via the protein of the present invention.
  • the peptide of the present invention has an activity of causing contraction or relaxation of the entire intestinal tract and controlling intestinal motility (digestion activity) (eg, Example 11 described later). Therefore, when the DNA or the like of the present invention is deficient or the expression level is abnormally decreased, various types of diseases such as digestive disorders (eg, enteritis, diarrhea, constipation, and malabsorption symptoms) are used. Disease develops.
  • digestive disorders eg, enteritis, diarrhea, constipation, and malabsorption symptoms
  • the peptide of the present invention and the DNA of the present invention are used as medicines for treating or preventing various diseases such as digestive diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.). can do.
  • digestive diseases eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • the DNA of the present invention is inserted into (oral) cells to express the peptide of the present invention.
  • the role of the peptide of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted. it can.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA is used alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. It can then be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered with a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • the peptide of the present invention when used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it should be at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is preferred to use.
  • the peptide of the present invention may be, for example, a sugar-coated tablet, capsule, It can be used orally as a elixir, microcapsule or the like, or parenterally in the form of an injection such as a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension.
  • the peptide of the present invention is mixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc. in a unit dosage form required for generally accepted formulation practice. Can be manufactured.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • additives that can be mixed with tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • examples include a bulking agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil,
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM, HCO-50, etc.) Is also good.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, benzalkonidum chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives for example, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually parenteral. Is used regularly.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, higgs, bushus, dogs, dogs, cats, dogs, monkeys) Etc.).
  • mammals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, higgs, bushus, dogs, dogs, cats, dogs, monkeys
  • the dosage of the peptide of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the peptide of the present invention is orally administered for the purpose of treating gastrointestinal diseases, it is generally required for an adult (60 kg )
  • the peptide of the present invention is administered in an amount of about 1 mg to 1000 mg, preferably about 10 to 500 mg, more preferably about 10 to 2 Omg per day.
  • the single dose of the peptide of the present invention varies depending on the administration subject, the target disease and the like.
  • the peptide of the present invention is used in the form of an injection for the purpose of treating digestive diseases.
  • the peptide When administered to an adult (with a body weight of 6 Okg), the peptide is injected into the affected area at a rate of about 1 to 100 Omg, preferably about 1 to 20 Omg, more preferably about 10 to 10 Omg per day. It is expedient to administer the drug. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention which comprises using the peptide of the present invention, the protein of the present invention, and the partial peptide.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention characterized by using the peptide of the present invention and the protein of the present invention (hereinafter referred to as the screening method of the present invention, Is abbreviated as “screening kit”.
  • a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention (for example, peptide, protein, non-peptidic compound, Synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof.
  • Such compounds cell stimulating activity via protein of the present invention (e.g., ⁇ Rakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P product, A compound having an activity of promoting or suppressing inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, decrease of pH, etc. (ZAQ agonist) Compounds having no cell stimulating activity (ZAQ antagonists) are included. "Altering the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention” includes both cases of inhibiting and promoting the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention. .
  • the present invention relates to (i) the case where the protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention, and (ii) the case where the above-mentioned protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention and a test compound. And a method of screening for a compound or a salt thereof that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • the screening method of the present invention (i) a case where the above-mentioned protein of the present invention is brought into contact with the peptide of the present invention, and (ii) a case where the above-mentioned protein of the present invention comes into contact with the peptide of the present invention and a test compound.
  • the amount of the peptide of the present invention bound to the protein of the present invention, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention which comprises measuring and comparing the amount of binding to the protein of the present invention
  • the peptide of the present invention is characterized by measuring and comparing the amount of the labeled peptide of the present invention bound to the cell or the membrane fraction when the peptide is brought into contact with the membrane fraction of the cell. Binding to proteins A method for screening a compound to be changed or a salt thereof,
  • the labeled peptide of the present invention is brought into contact with the protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the protein of the present invention;
  • the peptide of the present invention and the test compound were labeled when they were brought into contact with the protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the protein of the present invention.
  • a method for screening a compound or a salt thereof, which changes the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention, comprising measuring and comparing the amount of binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention;
  • the protein of the present invention is mediated.
  • Cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus Activity of promoting or suppressing oxidation, activation of c- ⁇ os, reduction of ⁇ , etc.), and comparing them with the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • Cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus Activity of promoting or suppressing oxidation, activation of c- ⁇ os, reduction of ⁇ , etc.
  • a transformant containing the peptide of the present invention and a DNA encoding the protein of the present invention By contacting the peptide and test compound of the present invention with a protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the protein of the present invention.
  • cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P product, Intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • the protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any protein containing the above-mentioned protein of the present invention.
  • the protein of the present invention and the like, which are expressed in large amounts using recombinants, are suitable for screening.
  • the preparation method described later when a cell containing the protein of the present invention or the cell membrane fraction is used, the preparation method described later may be followed.
  • the cell When a cell containing the protein of the present invention is used, the cell may be immobilized with datalaldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • the cell containing the protein of the present invention refers to a host cell expressing the protein of the present invention, and the host cell includes the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after cell disruption.
  • the cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Warinda blender ⁇ polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, pressing the cells while pressing with a French press, etc. Crushing by ejecting from a fine nozzle can be mentioned.
  • centrifugal fractionation methods such as fractional centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (1500 to 300 rpm).
  • the suspension is usually centrifuged at 0.000 rpm for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed protein of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of protein of the present invention in cells or in the membrane fraction containing the protein of the present invention is preferably from 1 0 3 to 1 0 8 molecules per cell, is 1 0 5-1 0 7 molecules Is preferred.
  • an appropriate protein fraction of the present invention and a labeled peptide of the present invention Is used.
  • the fraction containing the protein of the present invention is preferably a fraction containing the protein of the present invention in its natural form, or a fraction containing the protein of the present invention in a recombinant form having an activity equivalent thereto.
  • “equivalent activity” means equivalent ligand binding activity and the like.
  • the labeled peptide of the present invention for example, the peptide of the present invention labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like can be used.
  • a labeled form of the peptide of the present invention prepared by a known method using a Porton-Hunter reagent can also be used.
  • the buffer 1 may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and peptide sutin is added to suppress the degradation of the protein of the present invention and the peptide of the present invention by the protease.
  • 0.0 lm 1 A fixed amount (5000 cpm to 500,000 cm) of the labeled peptide of the present invention is added to the receptor solution of L Om 1, and 10 4 to 10 — of test compounds are simultaneously allowed to coexist.
  • a reaction tube containing a large excess of the unlabeled peptide of the present invention is also prepared to determine the amount of non-specific binding (NSB).
  • the reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably at 4 ° C to 37, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter and the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a counter.
  • the count (B.-one NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B Q ) when there is no antagonist is 1
  • a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less when the content is set to 0% can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • BIA core manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
  • a peptide of the present invention is immobilized on a sensor chip by an amino coupling method according to a protocol attached to a device, and a cell containing a protein of the present invention or a trait containing a DNA encoding the protein of the present invention.
  • a buffer solution such as a buffer is passed over the sensor chip at a flow rate of 2 to 21 / min.
  • the protein of the present invention and the peptide of the present invention were observed by observing that the coexisting test compound changes the surface plasmon resonance caused by the binding of the peptide of the present invention and the protein of the present invention on the sensor chip. Screening of a compound that changes the bond with the compound can be performed.
  • a protein of the present invention is immobilized on a sensor chip, and a buffer such as a phosphate buffer or a tris buffer containing the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound is passed over the sensor chip.
  • a buffer such as a phosphate buffer or a tris buffer containing the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound is passed over the sensor chip.
  • the measurement can be performed in the same manner by using the method described above.
  • Examples of the test compound include the same compounds as described above.
  • the cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention for example, Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, changes in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, of c- fos Activity for promoting or suppressing activation, pH reduction, etc.
  • the cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention for example, Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, changes in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, of c- fos Activity for promoting or suppressing activation, pH reduction, etc.
  • the cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention for example, Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular
  • cells containing the protein of the present invention are cultured on a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant to generate cells.
  • the quantified product is quantified according to each method.
  • Cell stimulating activity If the production of a substance as an indicator (for example, arachidonic acid) is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay. In addition, activities such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • cells expressing an appropriate protein of the present invention are used.
  • the above-mentioned recombinant cell lines expressing the protein of the present invention are desirable.
  • the protein-expressing cell of the present invention which is a transformant, may be either a stable expression strain or a transient expression strain. The same kind of animal cells as described above are used.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts. Specifically, the following Atssey systems (1) to (12) are used.
  • This method does not use cells containing the protein of the present invention as described in 1 to 4 above, but is an Atsey method using a membrane fraction containing the protein of the present invention as shown in 1 to 3.
  • the cell stimulating activity is measured as shown in 5, and the substance exhibiting the activity of promoting GTPas binding to the membrane fraction containing the protein of the present invention in this assay is an agonist.
  • the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are added, and compared with the case of single administration of the peptide of the present invention, By observing that a change occurs in the activity of promoting GTPas binding to a cell membrane fraction containing the protein of the present invention, a compound that changes the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be screened. At this time, a compound exhibiting an activity of inhibiting the GTPrS binding promoting activity of the peptide of the present invention on the cell membrane fraction containing the protein of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability. on the other hand
  • screening of the agonist can be performed by administering only the test compound and observing the activity of promoting GTPrS binding to the cell membrane fraction containing the protein of the present invention.
  • the cell membrane fraction containing the protein of the present invention is diluted with a membrane dilution buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, 1 M GDP, 0.1% BSA pH 7.4).
  • the dilution ratio depends on the expression level of the protein of the present invention. This aliquoted 0.2ml to Falcon2053 min, the peptide or peptides of the present invention and a test compound of the present invention was added, as further a final concentration of 200 pM added [35 S] GTP ⁇ S.
  • a test compound having a GTPaS binding promoting activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • the amount of intracellular cAMP is reduced by stimulation with the peptide of the present invention.
  • the stimulating activity of the peptide of the present invention on cells expressing the protein of the present invention can be measured.
  • the amount of cAMP produced by various animal cells expressing the protein of the present invention is determined by immunizing mice, rats, rabbits, goats, goats, etc. with anti-cAMP antibodies and 125I- labeled cAMP ( By using RIA or other EIA systems combining anti-cAMP antibody and labeled cAMP, both can be measured. Also anti c SPA method using 125I- labeled cAMP with beads containing scintillant and immobilized scintillant beads using antibodies against AMP antibody to protein A or animal IgG used to produce anti-cAMP antibody (Use a kit manufactured by Amersham Almasia Biotech).
  • the intracellular cAMP level is increased by a ligand such as forskolin or calcitonin which increases the intracellular cAMP level, and the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound are increased.
  • a ligand such as forskolin or calcitonin which increases the intracellular cAMP level
  • the administration of the peptide of the present invention alone changes the suppression of intracellular cAMP level
  • a compound that changes the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention. can be.
  • a compound showing an activity of inhibiting the cAMP production inhibitory activity of cells expressing the protein of the present invention by the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • a compound showing agonist activity can be screened by adding only the test compound and examining the cAMP production inhibitory activity.
  • the screening method is described more specifically below.
  • the protein-expressing CHO cells of the present invention (ZAQC-B1 cells; Example 3 (3-5) described later) are seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well in a 24-well plate and cultured for 48 hours. Wash cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methyl xanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, 0.2 mM 3-isobutyl-methyl xanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES The Hanks buffer (pH 7.4) containing is called a reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and keep incubator for 30 minutes.
  • the amount of cAMP produced by forskolin stimulation was defined as 100%, and the amount of cAMP suppressed by the addition of 1 nM of the peptide of the present invention was defined as 0%.
  • the effect of the test compound on the sex is calculated.
  • a test compound that inhibits the activity of the peptide of the present invention and has a cAMP production activity of, for example, 50% or more can be selected as a candidate substance having competitive inhibition ability.
  • cAMP produced by adding the test compound to the protein-expressing CHO cells of the present invention without adding forskolin is quantified by the above method.
  • DNA containing a CRE (cAMP response element) can be transferred to Pitka Gene Basic Vector or Pitka Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.)
  • CRE-reporter gene vector Into the multi-cloning site upstream of the luciferase gene, and use this as the CRE-reporter gene vector.
  • stimulation with elevated cAMP induces CRE-mediated luciferase gene expression and subsequent luciferase protein production. That is, by measuring the luciferase activity, it is possible to detect a change in the amount of cAMP in the cells into which the CRE-reporter gene vector has been introduced.
  • CRE Screening of a compound that alters the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention using cells obtained by transfecting the gene vector of the present invention into cells expressing the protein of the present invention. Can do it. The specific screening method is described below.
  • CRE- reporter gene protein expression cells of the invention has been introduced were seeded at 5xl0 3 cell / well in 24 well plate over preparative, cultured for 48 hours. Wash cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.23_isobutylmethylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES. (PH7.4) is called the reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in the incubator.
  • the effect of the compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with that of the case where the peptide of the present invention is administered alone.
  • the administration of the peptide of the present invention suppresses an increase in the amount of luminescence due to forskolin stimulation, and a compound that reverses this suppression can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • agonists can be screened by administering the test compound alone and observing the same suppression of the amount of luminescence increased by forskolin stimulation as the peptide of the present invention.
  • alkaline phosphatase As a reporter gene, other than luciferase, for example, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyltransferase or) 3 galactosidase can also be used.
  • the enzyme activities of the gene products of these reporter genes can be easily measured using a commercially available measurement kit as follows. Alkaline phosphatase activity was determined by, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and chloramphenicol acetyl transferase activity was determined by, for example, FAST CAT chrolainphenicol Acetyl transferase Assay Kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the galactosidase activity can be measured by, for example, Aurora Gate XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the cells expressing the protein of the present invention release arachidonic acid metabolites extracellularly as a result of stimulation with the peptide of the present invention.
  • arachidonic acid having radioactivity By incorporating arachidonic acid having radioactivity into cells in advance, this activity can be measured by measuring the radioactivity released outside the cells.
  • the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound by adding the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound, and examining the effect of the peptide of the present invention on the arachidonic acid metabolite releasing activity, the peptide of the present invention and the present invention were determined. Compounds that affect the binding of light proteins can be screened.
  • a compound that inhibits the arachidonic acid metabolite release activity of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability. Also, by adding only the test compound and examining the arachidonic acid metabolite release activity of the protein-expressing cells of the present invention, a compound showing agonist activity can be screened. Screening of a compound that affects the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention — More specifically described below.
  • Protein expression CHO cell of the present invention were seeded at 5xl0 4 cell / well in 24-well plates, cultured for 24 hours, added to a 0.25 Ci / well of [3 ⁇ 4] Arakidon acid. [3 ⁇ 4] Sixteen hours after the addition of arachidonic acid, the cells were washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, and each well was treated with Hanks buffer (pH 7. Add the peptide of the present invention at a final concentration of 10 nM dissolved in 4) or a buffer containing 10 nM of the peptide of the present invention and a test compound to 500 / l.
  • Hanks buffer pH 7.4 containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES is referred to as a reaction buffer. After incubating at 37 ° C for 60 minutes, 400 l of the reaction solution is added to the scintillator overnight, and the amount of [3 ⁇ 4] arachidonic acid metabolite ”released into the reaction solution is measured by a scintillation counter.
  • the effect of the test compound on the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention is calculated by assuming that the amount of the substance is 100%.
  • a test compound having an arachidonic acid metabolite-producing activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • the intracellular Ca 2+ ion concentration increases.
  • the effect of the test compound on the binding between the peptide of the present invention and the peptide of the present invention can be examined. Specifically, it can be examined by a method according to Example 3 (3-5) and Example 5 (5-3-4) described later.
  • the protein-expressing cells of the present invention are seeded on a sterilized cover glass for a microscope. Two days later, the culture solution is replaced with HBSS in which 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories) is suspended, and at room temperature. Leave for 2 hours and 30 minutes. After washing with HBSS, set the coverslip on the cuvette, and use a fluorimeter to measure the excitation wavelength when the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound are added at 340 nm and 505 nm at 380 nm. Measure the increase in fluorescence intensity ratio.
  • HBSS in which 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories) is suspended, and at room temperature. Leave for 2 hours and 30 minutes. After washing with HBSS, set the coverslip on the cuvette, and use a fluorimeter to measure the excitation wavelength when the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound are added at 340 n
  • a compound which affects the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention by measuring the change in fluorescence intensity caused by the addition of the test compound as compared to when the peptide of the present invention is administered alone. Screening Can be performed.
  • FLIPR Molecular Devices
  • Fluo-3 AM manufactured by Dojindo Laboratories
  • the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and a test compound were added to the FLIPR apparatus in the same manner as in the case of Fura-2, and observed by the addition of the test compound as compared with the case where the peptide of the present invention was administered alone.
  • a compound that affects the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention can be screened.
  • a compound that suppresses an increase in fluorescence intensity due to the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • agonists can be screened by observing an increase in the fluorescence intensity due to the addition of the test compound alone.
  • the protein-expressing cells of the present invention the gene (eg, Aeduorin etc.) Unatanpakushitsu by which light emission by increasing the intracellular C a 2 + ions were allowed to co-express, the increase in the intracellular C a 2 + ion concentration, the gene (eg, Aeduorin etc.) by utilizing the fact that the light emitting Ri Do and C a 2 + bound, the peptide or peptides and test compounds of the present invention of the present invention was added, the peptide of the present invention alone
  • the script of the compound that affects the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention is measured. Can be performed.
  • the method is the same as above except that the fluorescent substance is not incorporated.
  • the radioactivity eluted with 0.1M HC00H is measured with a liquid scintillation counter.
  • the radioactivity in the medium by the reaction buffer without addition of the peptide of the present invention is set to 0%, and the radioactivity in the medium when the peptide of the present invention is added is set to 100%.
  • the effect of the present invention on the binding of protein is calculated.
  • a test compound having an inositol monophosphate production activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • agonist screening can also be performed by observing an increase in inositol / phosphate production by the addition of the test compound alone.
  • DNA containing TRE (TPA response element) is transferred to Pitka Gene Basic Vector or Pitka Gene Enhansa Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.)
  • TRE-reporter gene vector Into the multiple cloning site upstream of the luciferase gene, and use this as the TRE-reporter gene vector.
  • stimulation with an increase in intracellular Ca 2+ ion concentration induces TRE-mediated luciferase gene expression and subsequent luciferase protein production. That is, by measuring the luciferase activity, it is possible to detect a change in the amount of calcium ions in the cells into which the TRE-repo-one-night gene vector has been introduced.
  • a specific method for screening a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention using cells obtained by transfecting the TRE-repo overnight gene vector into the cells of the present invention is described below.
  • the TRE-reporter gene-introduced protein-expressing cells of the present invention are seeded on 24 well plates at 5 ⁇ 10 3 cells / well and cultured for 48 hours. After washing the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEP ES, 10 nM of the peptide of the present invention or 10 nM of the peptide of the present invention and a test compound are added. Incubate at 37 ° C for 60 minutes. Lyse the cells with a cell lysing agent for Pitka Gene (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) and add a luminescent substrate (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) to the lysate.
  • Hank's buffer pH 7.4
  • BSA Hank's buffer
  • 20 mM HEP ES 10 nM of the peptide of the present invention or 10 nM of the peptide of the present invention and a test compound are added
  • Luminescence by luciferase is measured by a luminometer, a night body scintillation counter or a top counter.
  • a compound that alters the binding of the peptide of the invention to the peptide of the invention The effect can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with the case where the peptide of the present invention is administered alone.
  • administration of the peptide of the present invention increases the amount of luminescence due to an increase in intracellular Ca 2+ ion concentration, and a compound that suppresses this increase can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing an increase in the amount of luminescence similar to the peptide of the present invention.
  • alkaline phosphatase As a reporter gene, other than luciferase, for example, alkaline phosphatase, chloramphenicol-acetyltransferase or 3-galactosidase can also be used.
  • the enzymatic activity of these repo overnight gene products can be easily measured using a commercially available assay kit as follows. Alkaline phosphatase activity was measured by, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and chloramphenicol acetyl transferase was measured by, for example, FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay Kit by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the i3-galactosidase activity can be measured by, for example, Aurora Gate XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • Proliferation of cells expressing the protein of the present invention in response to the peptide of the present invention is observed by activating MAP kinase.
  • This proliferation can be measured by MAP kinase activity, thymidine incorporation, and cell count (eg, MTT).
  • MTT cell count
  • the MAP kinase activity was determined by adding a peptide of the present invention or a peptide of the present invention and a test compound to cells, and then obtaining a MAP kinase fraction from the cell lysate by immunoprecipitation using an anti-MAP kinase antibody. after, for example, Wako Junyaku Co.
  • MAP Kinase Assay Ki t and ⁇ - can easily be determined using the [32 P] -ATP.
  • Thymidine uptake activity is plated evening protein expressing cells of the present invention, after a peptide or peptides of the present invention and a test compound of the present invention was added, [methy Bok 3 H] - thymidine was added, then incorporated into the cells
  • the radioactivity of the labeled thymidine can be measured by lysing the cells and counting with a liquid scintillation counter.
  • Proliferation of the protein-expressing cell of the present invention is carried out by seeding the expressing cell with the peptide of the present invention.
  • MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) is added after adding the peptide of the present invention and the test compound, and intracellularly.
  • MTT can also be measured by lysing the cells with isopapanol made acidic with MTT formazan, whose MTT has been changed to MTT, and measuring the absorption at 570 nm.
  • the cells expressing the protein of the present invention are seeded on a 24-well plate at 500 cells per well and cultured for one day. The cells are then starved in a serum-free medium for 2 days. After the peptides or peptides of the present invention and a test compound of the present invention were cultured was added to the cells for 24 hours, [methy Bok 3 H] -. Thymidine per Ueru 0 culturing 0 1 5 MBQ added 6 hours . After washing the cells with PBS, add methanol and let stand for 10 minutes. Then, add 5% trichloroacetic acid and let stand for 15 minutes. Wash the fixed cells 4 times with distilled water.
  • the effect of a compound that alters the binding of the peptide of the present invention to the protein of the present invention can be measured by comparing the increase in radioactivity due to incorporation of thymidine with that of the peptide of the present invention administered alone. it can.
  • a compound that suppresses an increase in radioactivity due to administration of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing an increase in radioactivity similar to that of the peptide of the present invention.
  • the cells expressing the protein of the present invention are incubated for 2 hours in a medium containing lmCi / ml of 86 RbCl. Wash the medium thoroughly and completely remove 86 R1 in the external solution.
  • the peptide or the peptide of the present invention and the test compound are added to the cells, and after 30 minutes, the external solution is recovered, and the radioactivity is measured using an counter. Effect of the compound that alters the binding of the protein of the peptide and the invention of the present invention, be measured by compared to administration alone peptides of the present invention an increase in [8 3 ⁇ 4b] efflux by radioactivity Wear.
  • a compound that suppresses an increase in radioactivity due to administration of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing the same increase in radioactivity as the peptide of the present invention.
  • the extracellular pH (acidification rate), which changes in response to the peptide of the present invention by the cell expressing the protein of the present invention, is measured by using a Cytosensor device (Molecular Devices, Inc.).
  • the activity of the peptide can be measured.
  • a specific screening method for a compound that changes the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention by measuring the change in extracellular pH using a Cytosensor device is described below.
  • the protein-expressing cells of the present invention are cultured overnight in a capsule for a Cytosensor device, set in a chamber of the device, and set to an extracellular pH for about 2 hours until RPMI 1640 medium containing 0.1% BSA (Molecular Device) Perfusion). After the pH is stabilized, a change in the pH of the medium caused by perfusing the medium containing the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound is measured. The effect of the compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention is determined by comparing the extracellular pH change of the protein-expressing cells of the present invention with that of the peptide of the present invention administered alone. Can be measured.
  • a compound that suppresses extracellular pH change due to administration of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing the same extracellular PH change as the peptide of the present invention.
  • Yeast Sacharomyces cerevisiae CDhaploid ⁇ -mating Type (MAT) sex pheromone receptor Ste 2 is coupled to G protein Gpa1, and responds to sex pheromone a-mating factor to MAP kinase. Is activated, and Far 1 (cell-cvcle arrest) and the transcriptional activator Ste 12 are activated. Ste 12 induces the expression of various proteins, including FUS1, which are involved in conjugation.
  • the control factor S st 2 functions in a suppressive manner in the above process. In this system, a yeast into which a receptor gene has been introduced is produced, and a signal transduction system in yeast cells is activated by stimulation of a receptor agonist.
  • the gene encoding Ste2 and Gpa1 of the MAT ⁇ yeast is removed, and instead, the gene of the protein of the present invention and the gene encoding the Gpa1-Gai2 fusion protein are introduced.
  • the gene encoding Far is removed to prevent cell-cycle arrest from occurring, and the sensitivity of the response to the peptide of the present invention is improved by removing the gene encoding Sst.
  • a FUS1-HIS3 gene in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS1 is introduced.
  • the above gene recombination operation is performed, for example, by the method described in Price et al. (Price, LA et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp.
  • the transformed yeast thus constructed reacts with high sensitivity to the peptide of the present invention, which is a ligand of the protein of the present invention, and as a result, MAP kinase is activated to synthesize histidine biosynthetic enzyme. It can grow on a histidine-deficient medium. By utilizing this, the response of the protein-expressing yeast of the present invention by the peptide of the present invention can be observed using the growth of the yeast in a histidine-deficient medium as an index.
  • SSTR 2 tosulin receptor type 2
  • the transformed yeast were prepared as described above was cultured overnight in liquid culture medium completely synthetic medium, in addition to dissolving agar medium was removed histidine at a concentration of 2xl0 4 cel l / ml, seeded in square shaped dish 9x9 cm . After the agar solidifies, a sterile filter paper impregnated with the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound is placed on the agar surface, and cultured at 30 ° C for 3 days. The effect of the compound that alters the binding of the peptide of the present invention to the peptide of the present invention is to compare the growth of the yeast around the filter paper with that of the peptide of the present invention administered alone. Can be measured.
  • a compound that suppresses the growth of the yeast due to the administration of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing the growth of yeast similar to the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention was added to the agar medium, and only the test compound was soaked in the sterilized filter paper and cultured. By doing so, it is possible to examine the effect of a compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention.
  • the protein mRNA of the present invention may be prepared from tissues or cells, or may be transcribed in vitro from a plasmid. This is cultured in MBS solution at 20 ° C for 3 days. This is placed in the cavity of the voltage damp device where the Ringer solution is flowing, and the microelectrode for fixing the electric potential and the microelectrode for measuring the electric potential are inserted into the cell. (1) The electrode is placed outside the cell. . When the potential is stabilized, a Ringer solution containing the peptide of the present invention or the peptide of the present invention and the test compound is passed, and the change in potential is recorded.
  • the effect of the compound that alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention was determined by comparing the change in the cell membrane potential of the protein-introduced Xenopus laevis oocytes of the present invention with that of the peptide of the present invention administered alone. Can be measured. At this time, A compound that suppresses a change in cell membrane potential due to administration of the peptide of the present invention can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability. On the other hand, agonists can be screened by administering only the test compound and observing the same change in cell membrane potential as the peptide of the present invention.
  • poly (A) + RNA of various G protein genes can be introduced so that the reaction can be easily measured by increasing the amount of change. Also, by co-injecting poly (A) + RNA of a protein gene that produces luminescence in the presence of C a2 + ions such as aeciuoriii, luminescence is observed instead of membrane potential change and It can also be measured.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between the peptide of the present invention and the protein of the present invention includes a protein of the present invention, a cell containing the protein of the present invention, or a cell containing the protein of the present invention. And a peptide of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • Protein CHO cells expressing the present invention 12-well plates and passaged 5 XI 0 5 pieces Roh holes, 37 ° C, 5% C_ ⁇ 2, which were cultured for 2 days at 95% air.
  • the peptide of the present invention labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S], or the like. Dissolve it in an appropriate solvent or buffer at 4 or -20 ° C, and dilute to 1 // M with the measurement buffer before use.
  • the peptide of the present invention was added to PBS containing 0.1% serum albumin (manufactured by Sigma) in PBS. Dissolve to mM and store at 20 ° C.
  • test compound solution 5 1 l [beta] Micromax, Bae flop tides of the present invention labeled added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 51 to 3 M of the peptide of the present invention is added instead of the test compound.
  • a compound or a salt thereof obtainable by using the screening method or the screening kit of the present invention alters the binding between the peptide of the present invention and the protein of the present invention (inhibits or promotes the binding)
  • a compound having a cell stimulating activity via the protein of the present invention or a salt thereof (so-called agonist of the protein of the present invention (ZAQ agonist)), or a compound having no such stimulating activity (So-called angyo gonist of the protein of the present invention (ZAQ angyo gonist)).
  • ZAQ agonist agonist of the protein of the present invention
  • ZAQ angyo gonist a compound having no such stimulating activity
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a specific method for evaluating whether the protein of the present invention is an agonist or an gonist may be according to the following (i) or (ii).
  • test compound is brought into contact with a cell containing the protein of the present invention, and the cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is an agonist of the protein of the present invention.
  • a compound that activates the protein of the present invention for example, a peptide of the present invention or an agonist of the protein of the present invention
  • a compound to be activated and a test compound are brought into contact with cells containing the protein of the present invention, cell stimulating activities mediated by the protein of the present invention are measured and compared.
  • the compound or its salt that can reduce the cell stimulating activity by the compound that activates the protein of the present invention is an antagonist of the protein of the present invention.
  • the agonist of the protein of the present invention has the same action as the physiological activity of the peptide of the present invention on the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug like the peptide of the present invention. is there.
  • the protein antagonist of the present invention can suppress the physiological activity of the peptide of the present invention on the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the receptor activity.
  • the peptide of the present invention since it has an activity of controlling intestinal contraction and the like, it is used as a therapeutic / prophylactic agent for diseases such as digestive diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.).
  • digestive diseases eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • the protein agonist of the present invention is a gastrointestinal disease (eg, enteritis, diarrhea, constipation , Malabsorption syndrome, etc.).
  • the protein antagonist of the present invention can be used as a treatment-preventive agent for diseases such as digestive diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.).
  • a pharmaceutically acceptable salt or the like is used as a salt of the compound that can be obtained using the above-described screening method or screening kit.
  • a pharmaceutically acceptable salt or the like examples thereof include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt.
  • Suitable examples of salts with organic bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine , N, N'—salts with dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Preferred examples of the salt with an organic acid include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonate, benzenesulfonic acid, and benzoic acid And the like.
  • salts with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, and ortinine
  • salts with an acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, glutamic acid, and the like.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned medicament, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, sugar-coated or enteric-coated It can be used orally as an elixir, microcapsule or the like, or parenterally in the form of an injection such as a sterile solution or suspension in water or another pharmaceutically acceptable liquid.
  • a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, and the like in a generally accepted unit dosage form.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range is obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a leavening agent such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry may be used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection should be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other auxiliaries (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Other solubilizing agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM , HCO-50) may be used in combination.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so For example, it can be administered to humans, mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, bush dogs, dogs, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention varies depending on symptoms and the like.
  • an adult body weight of 60 kg
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • adult patients with gastrointestinal disorders (assuming 6 kg of body weight) About 0.01 to 3 Omg / day, preferably about 0.1 to 2 Omg / day, more preferably about 0.1 to 1 Omg / day.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the peptide of the present invention, it can be used for quantification of the peptide of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay.
  • a method for quantifying the peptide of the present invention in a test solution characterized by comprising:
  • the monoclonal antibody of the present invention In addition to quantification of the peptide of the present invention using a monoclonal antibody against the peptide of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like can also be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the peptide of the present invention using the antibody of the present invention is particularly limited.
  • the amount of the antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (for example, the amount of the peptide of the present invention) in the test solution is detected by chemical or physical means, and the amount is detected by a known amount.
  • Any measurement method may be used as long as it is a measurement method calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing an antigen.
  • nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are suitably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], etc. [1 4 C] used.
  • the enzyme those which are stable and have a large specific activity are preferable, and for example;
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding an antibody or an antigen to a labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody having a different site to which the peptide of the present invention binds. Is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably used, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the peptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably used. Is an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody. Then, the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • a liquid phase method using polyethylene glycol for B / F separation and a second antibody against the above antibody or an immobilized antibody as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, then the immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment can be obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the peptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • gastrointestinal diseases for example, Enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • a decrease in the concentration of the peptide of the present invention for example, the patient is suffering from a gastrointestinal disorder (eg, enteritis, diarrhea, constipation, absorptive syndrome, etc.) or may suffer from the disease in the future. Can be diagnosed as having high propensity.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the peptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • detection of the peptide of the present invention in each fraction at the time of purification analysis of the behavior of the peptide of the present invention in test cells, and the like.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushes, horseshoe, dogs, cats, dogs, monkeys) by using the DNAs as probes.
  • DNA encoding the peptide of the present invention in Or abnormalities (genetic abnormalities) in mRNA for example, as a diagnostic agent for genetic damage such as damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • abnormalities genetic abnormalities
  • mRNA for example, as a diagnostic agent for genetic damage such as damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, 5, 874-879 (1989)). Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86, 2766-2770 (1989)), DNA microarrays, etc. Can be implemented.
  • gastrointestinal diseases eg, enteritis
  • Diarrhea constipation
  • malabsorption syndrome etc.
  • Antisense DNA that can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA can suppress the function of the peptide of the present invention or the DNA of the present invention in vivo.
  • it can be used as a therapeutic / prophylactic agent for diseases caused by excessive expression of the peptide of the present invention (eg, digestive diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.)).
  • the above-mentioned antisense DNA can be used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, similarly to the aforementioned therapeutic / prophylactic agent for various diseases containing the DNA of the present invention.
  • the antisense DNA can be administered alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, and then administered in a conventional manner.
  • the antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant to promote ingestion, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the antisense DNA is used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof. You can also.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the peptide of the present invention, includes, for example, diseases caused by excessive expression of the peptide of the present invention (eg, gastrointestinal diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption) It can be used as a medicament such as a treatment and prophylactic agent.
  • diseases caused by excessive expression of the peptide of the present invention eg, gastrointestinal diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption) It can be used as a medicament such as a treatment and prophylactic agent.
  • the therapeutic and / or prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, for humans or mammals (eg, rat, rabbit, sheep, pig, pig, etc.). Oral or parenteral administration to mice, cats, dogs, and monkeys.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.
  • the antibody of the present invention is usually used in a single dose, and is usually 0.01 to 2 Omg Z kg.
  • body weight preferably about 0.1 to 1 Omg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg Z kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day It is convenient to administer by intravenous injection. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibodies of the present invention can be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). Syrup, emulsion, suspension and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, etc. Wrap Include.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, etc., are used.
  • propylene glycol polyethylene glycol
  • nonionic surfactant e.g., polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
  • Suppositories to be used for rectal administration are prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a usual suppository base.
  • each dosage unit dosage form is about 5 to 50 mg, especially for injections. It is preferable that about 5 to 100 mg of the above-mentioned antibody be contained in other dosage forms, and about 10 to 25 Omg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • a transgenic non-human animal expressing the protein or the like of the present invention can be produced.
  • Non-human animals include mammals (e.g., rats, mice, egrets, sheep, higgs, bush, sea lions, cats, dogs, monkeys, etc.) and the like (hereinafter abbreviated as animals). Mouse, egret, and the like are preferred.
  • mammals e.g., rats, mice, egrets, sheep, higgs, bush, sea lions, cats, dogs, monkeys, etc.
  • Mouse, egret, and the like are preferred.
  • a gene construct linked downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to animal cells in an animal cell is used.
  • various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to animal cells in an animal cell is used.
  • microphone to fertilized egg By mouth injection, a DNA-transferred animal that highly produces the protein of the present invention can be produced.
  • this promoter for example, a ubiquitous expression promoter such as virus-derived promoter and meta-mouth thionein can be used. Are used.
  • Introduction of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the protein or the like of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA introduction means that all of the offspring of the produced animal contain the protein or the like of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. .
  • the progeny of this kind of animal that has inherited the gene contains the protein of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the animal having the DNA can be reared in a normal breeding environment as the animal having the DNA. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene in both homologous chromosomes are obtained, and all the offspring are obtained by crossing the male and female animals. Can be bred to contain the DNA.
  • the animal into which the DNA of the present invention has been introduced has high expression of the protein or the like of the present invention, and thus is useful as an agonist or an animal for screening an gonist for the protein or the like of the present invention.
  • the DNA-introduced animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • tissue culture For example, by directly analyzing the DNA or RNA in the tissue of the DNA-introduced mouse of the present invention or by analyzing the tissue in which the protein of the present invention expressed by the gene is present, the protein of the present invention can be obtained. Can be analyzed.
  • the cells of a tissue containing the protein etc. of the present invention are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from generally difficult-to-cultivate tissues such as brain and peripheral tissues. be able to.
  • a drug that enhances the function of various tissues can be selected.
  • the protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • the peptide of the present invention and an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 40
  • the method for screening for a compound or a salt thereof that changes the binding property to a protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 49 is described in the above (2). Can be carried out in the same manner as the screening method of the present invention.
  • Amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 or SEQ ID NO: 49 with a peptide having the same amino acid sequence or a salt thereof
  • the compound or a salt thereof obtainable by using the above-described screening method or screening kit is the same as the compound or a salt thereof obtainable by using the screening method of the present invention or the screening kit of the present invention described in (2) above. Can be used for
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in this field, and examples thereof are described below.
  • an amino acid can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • dRNA-liponucleic acid dATP triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate
  • H is or H histidine
  • Xaa unidentified amino acid residue
  • the following symbols are used to represent substituents, protecting groups, reagents, and the like frequently used in the present specification.
  • F ura-2 AM 1-[6-Amino-2- (5-carboxyloxy-2-oxazolyl) -1-5-benzofuradioxy] -2- (2-amino-5-methylphenoxy) N, N ', N' Pentaacetic acid acetate ethoxymethyl ester
  • F 1 uo- 3 AM 1- [2-amino-5- (2,7-dichloro-6-hydroxy--3--3-oxy-9-xanthenyl) phenoxy] —2- (2-amino-5-methylphenoxy) ethane N, N, N ', N'—Pentate tetraacetate methyl ester
  • FIG. 1 shows an amino acid sequence of a protein derived from human brain of the present invention.
  • FIG. 1 shows the base sequence of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (ZAQC).
  • FIG. 1 shows the base sequence of the DNA encoding the human brain-derived protein of the present invention containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (ZAQT).
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer ZAQC Sal used in Example 2 described later.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of the primer ZAQC Spe used in Example 2 described later.
  • Example 7 shows the N-terminal amino acid sequence of the ZAQ activating peptide purified in Example 3 (3-8) described later.
  • [SEQ ID NO: 13] 7 shows the nucleotide sequence of primer ZF2 used in Example 4 described later.
  • Example 3 shows the base sequence at the 3 ′ end of DNA encoding the human ZAQ ligand peptide obtained in Example 4 described later.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment obtained in Example 4 described later.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a DNA fragment obtained in Example 4 described later.
  • SEQ ID NO: 26 This shows the base sequence of DNA encoding the human mature ZAQ ligand peptide represented by SEQ ID NO: 20.
  • Example 7 shows the N-terminal amino acid sequence of the human ZAQ ligand peptide analyzed in Example 6 (6-2) described later.
  • Example 13 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7 described later.
  • Example 13 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 7 described later.
  • Example 7 shows the amino acid sequence of snake venom MIT1 purified in Example 8 described later.
  • 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding human type I 5 E receptor protein.
  • Example 13 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 9 described later.
  • [SEQ ID NO: 38] 13 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 9 described later.
  • rZAQl G protein-coupled receptor protein
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a probe used in Example 10 described later.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a probe used in Example 10 described later.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 10 described later.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 10 described later.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 10 described later.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein (rZAQ2) is shown.
  • GPR73 mouse-derived G protein-coupled receptor protein
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse-derived G protein-coupled receptor protein (ml 5E). [SEQ ID NO: 50]
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse-derived G protein-coupled receptor protein (GPR73).
  • the transformant Escherichia coli DH5 ⁇ / CR 2.1—Z AQ C obtained in Example 1 described below has been used since August 23, 1999, at 11-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 1 Chuo No. 6 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Depositary Depositary Center (formerly National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH)). It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IF ⁇ ) as a deposit number IFO 16301 since April 4th, 2-17-85 Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Japan.
  • IF ⁇ Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli DH5a / pCR2.1.ZAQT obtained in Example 1 described below has been used since August 23, 1999 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary. (Formerly Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH)) Deposited with Fermentation Research Institute (IFO) as a deposit number FERM BP-6856 from August 4, 2001 Deposited under the number I FO 16302.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the transformant Escherichia coli TOPlO / pHMITA obtained in Example 4 described below has been used since July 13, 2000 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry). Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH :)) as the deposit number FERM BP-7219 and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) on May 26, 2000 as the deposit number IFO 16440.
  • the transformant Escherichia coli TOPlO / pHMITG obtained in Example 4 described below has been used since July 13, 2000 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH)) of the Ministry of International Trade and Industry under the deposit number FERM BP-7220 and deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) on May 26, 2000 as IFO 16441. Obtained in Example 9 below.
  • the transformant Escherichia coli DH5 ⁇ / CR2.1-rZAQ1 was launched on August 21, 2000 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (formerly Ministry of International Trade and Industry). Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH)) as deposit number FERM BP-7275 and deposited with the Fermentation Research Institute (IF ⁇ ) on August 1, 2000 as deposit number I FO 1645 9 Have been.
  • the Escherichia coli MM294 (DE3) / pTCh1ZAQ obtained in Reference Example 1 below has been used since April 27, 2001 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST). It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number FERM BP-1 7571 at the Patent Organism Depositary on January 16, 2001 under the deposit number IF ⁇ 16527.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • the human pituitary gland cDNA (CL0NTECH) is type II, and two primers, primer — 1 (5′-GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG-3 ′; SEQ ID NO: 4) and Primer-2 (5′-ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3 ′; sequence)
  • primer — 1 5′-GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG-3 ′; SEQ ID NO: 4
  • Primer-2 (5′-ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3 ′; sequence)
  • the PCR reaction was performed using No. 5).
  • the composition of the reaction solution used in this reaction was one-tenth of the above-mentioned cDNA as type II.
  • the attached buffer was added to the enzyme to a volume of 25 xl.
  • the PCR reaction consists of three cycles of 94 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 100 seconds, and three cycles of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 100 seconds.
  • the cycle of 94T for 20 seconds, 64 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 100 seconds was repeated 38 times, and finally, an extension reaction was performed at 68 ° C for 7 minutes.
  • the reaction product after the PCR was subcloned into a plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen) according to the prescription of a TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli DH5, and clones containing cDNA were selected on LB agar medium containing ampicillin.
  • Primers and probes used for Taqman PCR were searched using Primer Express ver. 1.0 (PE Biosystems Japan), and primer 3 (5'-TCATGTTGCT CCACTGGAAGG-3 '(SEQ ID NO: 6)), Primer 4 (5'-CCAATTGTCTTGAGGTCCAGG-3 '(SEQ ID NO: 7)) and ZAQprobe (5'-TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG-3' (SEQ ID NO: 8)) were selected.
  • FAM (6-carboxyfluoresceiE) was added as a reporter dye for the probe.
  • pAK-ZAQC obtained in Example 3 described below was used as a type II, and primers ZAQC Sal (5'-GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG-3 '(SEQ ID NO: 9)) and ZAQC Spe (5'- ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 1 0) PC R fragment was amplified have use a), it was purified using CHROMA SPIN200 (CLONTECH Laboratories, Inc. ( CA, USA) and), 10 Q - 10 6 copies // Adjusted to xl and used.
  • the obtained supernatant was filtered with a gauze to remove insolubles.
  • the resulting supernatant was put on a rotary evaporator to remove acetone, and finally concentrated to 1350 ml.
  • the obtained concentrated liquid was mixed with 338 ml of getyl ether every 675 ml, mixed vigorously in a separating funnel, and separated into two phases to obtain an aqueous phase.
  • the same operation was repeated once more for the obtained aqueous phase to obtain a clear aqueous phase.
  • the resulting aqueous phase is reduced to 80 Om 1 using a rotary evaporator To obtain a final extract.
  • Each of the obtained solutions I to IV was freeze-dried using a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • a TSKgel ODS-80Ts column for reversed-phase high-performance liquid chromatography (Tosoichi Co., Ltd., 4.6 mm x 25 cm) was used at 40 ° C at a flow rate of 1 ml 1 Zmin and solution A (0.1% trifluoroacetic acid / Distilled water) Volume 91.7% / B solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) Equilibrated by flowing 8.3% volume.
  • the freeze-dried products of Solution I to Solution IV obtained in the above (3-3) were each dissolved in 4 ml of 1 M acetic acid and subjected to a chromatography operation.
  • the eluate was fractionated with 1 ml fraction numbers, and 2 l of each fraction was mixed with 150 ill of 0.2% Bovine Serum Albumin (BSA) / distilled water and freeze-dried. This dried product was used as an assay sample for measuring the intracellular Ca 2+ ion concentration increasing activity described in (3-5) below.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the ZAQ stable expression cell line was prepared as follows. That is, one clone of DH5a / pC2.1-ZAQC obtained in Example 1 was cultured with shaking in an LB medium containing ampicillin to obtain plasmid pCR2.1-ZAQC. This was treated with the restriction enzymes Sa1I and SpeI to cut out the insert coding for ZAQC. Similarly, pAKKO—1.11H (Biochemica et Biophysica Acta 1219 (1 994) 251-259) treated with restriction enzymes Sal I and S pe I, and the insert portion were ligated with a Ligation Express Kit (CLONTECH Labo ratories, Inc.
  • the plasmid pAK-ZAQC was obtained by transducing CHO / dtiir-cells (American Type Culture Collection) using CellPhect Trans feet ion kit (Amersham Pharmacia Biotech). First, Buffer A (attached to the CellPhect Transfection Kit) 1201 was added to 4 tig of plasmid DNA dissolved in 120 l of distilled water, stirred, and allowed to stand for 10 minutes. (Attached) 240 l was added, and the mixture was vigorously stirred to form a DNA-calcium phosphate complex containing the DNA.
  • the cells were dispersed by tribcine treatment, collected from a Petri dish, and 2 ⁇ 10 4 cells were inoculated into a 6-well plate, dialyzed 10% fetal serum (JRH BIOSCIENCES), 1 mM MEM non-essential amino acid solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) medium containing 100 units / ml Penicillin, 100 g / ml Stretomycin (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37 ° (in 5% CO 2 gas)
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • the transformed CHO cells into which the plasmid was introduced grow in the medium, but the non-transfected cells gradually die, so the medium is changed every two days after the start of the culture to remove the dead cells.
  • RNA was recovered from each of the selected cells using a commercially available RNA isolation kit.
  • CHO expressing ZAQ highly by RT-PCR method The cell B-1 clone (hereinafter referred to as ZAQC-B1 cell) was selected.
  • CHO cell 24th clone expressing ETA endothelin A receptor
  • ETA 24 cell see Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 279, pp. 675-685, 1996) was used.
  • ZAQC-B1 cells and ETA24 cells were subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as dFBS).
  • dFBS dialyzed fetal bovine serum
  • ZAQC- B 1 cells were suspended in culture medium (10% d FBS- DMEM) such that each 15xl0 4 cells / ml of ETA24 cells into a 96-well plate for FL IPR (Black p late clear bottom , Coster , Inc.) a device implantation by 200 1 each Ueru with (3.
  • OXl0 4 cells / 200 l / Ueru were used after overnight culture at 37 ° C for at 5% C0 2 incubator in one (and hereafter cell plate Do).
  • H / HBSS Nisy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g, sodium hydrogencarbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, adjusted to PH7.4 with sodium hydroxide solution, filter sterilized) 20 ml, 250 mM 200 l of Probenecid and 200 l of fetal calf serum (FBS) were mixed.
  • Fluo 3-AM (Dojindo Research Laboratories) ) Dissolve 2 vials (50 g) in dimethylsulfoxide 401, 20% Pluronic acid (Molecular Probes) 401, add to the above H / HBSS-Probenecid-FBS, mix, and mix with 8 pipettes
  • the cells were dispensed into the cell plate from which the culture solution had been removed using 100 ⁇ l / well of each well, and incubated at 37 ° C. for 1 hour in a 5% CO 2 incubator (dye loading).
  • H / HBSS1501 containing 2.5 mM Probenecid and 0.1% CHAPS was added to each fraction to dilute the 96-well plate for FLIPR (V-Bottom Plate, Coster) (hereinafter referred to as sample plate).
  • sample plate After dye loading on the cell plate, wash the cell plate four times using a plate washer (Molecular Devices) with a washing buffer containing 2.5 mM Probenecid added to H / HBSS. After washing, add 100 xl washing buffer. left.
  • the cell plate and the sample plate were set on the FLIPR and subjected to assay (FLIPR transfers a 50 il sample from the sample plate to the cell plate).
  • Solution B concentration was increased in a linear gradient to 33%.
  • the eluate was fractionated by adding a fraction No. to each 500 l.
  • Each 25 l of each fraction was mixed with 0.2% BSA 150 / and lyophilized using a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • H / HBSS 150 containing 2.5 Probenecid, 0.1% CHAPS Add jl, dissolve, and use 50 l of this solution to measure the intracellular Ca 2+ ion concentration increasing activity by the test method described in (3-5) above.
  • the receptor activating effect was measured.
  • the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells that is, the ZAQ activating component, was mainly eluted in fraction Nos. 103-105.
  • Solution A (0.1% heptafluorobutyric acid / distilled water) volume 95% ZB solution (0.1% heptafluorobutyric acid / 100% acetate nitrile) at a flow rate of lm1 / min for 1 minute From 5% volume A solution 65% ZB solution The volume was rapidly increased to 35%, which was then increased at a flow rate of 1 ml 1 Zmin, with a linear gradient to 50% solution A volume and 50% ZB volume over 60 minutes, and the eluate was collected. . The eluate was detected as a single peak by UV absorption at 21 O nm.
  • the eluate was fractionated by assigning a fraction number of 500 l each. From the fractionated fraction, 10 1 each was mixed with 0.2% BSA1501 and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). To this dried product, add H / HBSS 75 ⁇ containing 2.5 niM Probenecid and 0.1% CHAPS to dissolve, and use this solution 501 to test the ZAQ C-B1 cells according to the test method described in (3-5) above. The receptor activating effect was measured. As a result, it was found that the target component having a receptor activating action on ZAQ C-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fraction Nos. 82-84. This activity peak completely coincided with the ultraviolet absorption peak at 210 nm, and it was judged that the protein had been purified to a single peptide.
  • the structure of the ZAQ-activating component obtained in (3-7) was determined by the following method.
  • the purified product of the ZAQ-activating component was freeze-dried, and the obtained freeze-dried product was dissolved in the solvent DMSO (dimethylsulfoxide).
  • a portion of this solution was subjected to amino acid sequence analysis from the N-terminus using a protein sequencer (Pakkin Elmer, PE Biosystems Procise 491cLC).
  • a B 1 ast search of the database using the N-terminal amino acid sequence of a peptide that activates ZAQ purified from milk obtained in Example 3 (SEQ ID NO: 11) as a query revealed that SEQ ID NO: : Human EST (X40467) containing a sequence equivalent to the nucleotide sequence of DNA encoding a peptide having the amino acid sequence represented by 11 was found. Since this sequence did not have a full-length open reading frame, the sequence of the undetermined portion was determined by the RACE method, and a cDNA clone having the full-length open reading frame was subsequently identified. I got it.
  • ZF1 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • ZF2 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • ZF3 5'-CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • the PCR reaction solution of 3 'RACE was 1 l of 50 x Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH) and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 ni KOAc, 35 mM Mg (0Ac) 2 , 37.5 / g / ml BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet-P40) 5 ⁇ , dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo) 4 10 Primer ZF1 1 ⁇ , 10 M Primer API (Primer API is CLONTECH 1 l of Marathon-Ready cDNA KiU (supplied from the company) and 5 ⁇ cDNA (CLONTECH, human testis Marathon-Ready cDNA) , and distilled water were prepared by mixing 331.
  • the reaction conditions were as follows: 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds-72 ° C for 4 minutes after initial denaturation at 94 ° C for 60 seconds, and 5 cycles of reactions for 4 minutes at 94 ° C for 30 seconds -70.
  • the cycle reaction was performed 25 times at 94 ° C. for 30 seconds-68 ° C. for 44 minutes.
  • reaction solution was 1 l of 50 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) and the attached 10 x Advantage
  • PCR buffer 400 niM Tricine-KOH, 150 niM KOAc, 35 mM Mg (OAc) 2 , 37.5 g / ml BSA, 0.05% Tween-20, 0.05% Nonidet-P40
  • dNTP mixture 2.5 mM each, Takara Shuzo 4 n 10 M primer ZF2 1 / il, 10 primer AP2 (primer AP2 is attached to CL0NTECH's Marathon-Ready cDNA KiU) to 1 n ⁇ type DNA (PCR reaction solution 50
  • a double dilution was prepared by mixing 5 ⁇ and 33 with distilled water.
  • the reaction conditions were as follows: after initial denaturation of 94> 60 seconds, 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds _ 72 ° C for 4 minutes and 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds to 70 ° C for 4 minutes The cycle reaction was performed 25 times at 94 ° C for 30 seconds-68 for 44 minutes. .
  • the reaction solution was 50 Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) 11 and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (OAc) 2 , 37.5 xg / ml BSA, 0.05 % Tween-20, 0.05% Nonidet-P40) 51, dNTP mixture (2.5 mM each, Takara Shuzo) 41, 10 M primer ZF3 11, 10 M primer A P2 (Primer AP2 is CL0NTECH's Marathon- Ready cDNA KiU was used.), 1 liter, 5 ⁇ type DNA (50-fold diluted solution of the PCR reaction solution), and 3 liters of distilled water.
  • Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH) 11 and the attached 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (OAc) 2 , 37.5 xg / ml
  • the reaction conditions were as follows: 94 CC for 60 seconds, initial denaturation, 94 3030 s_72 ⁇ ⁇ 04 min, 5 cycles, 94 CC 30 s-70 ° O4 min, 5 cycles, 94 94 C'30 seconds -68 ° C-44 minutes cycle reaction was performed 25 times.
  • the obtained DNA fragment was cloned using the T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the nucleotide sequence of the cloned DNA was decoded using ABI377 DNA seQuencer to obtain a 3 'end sequence (SEQ ID NO: 15).
  • Primers ZAQL-CF (SEQ ID NO: 16) and ZAQL-XR1 (SEQ ID NO: 17) were prepared based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and the information of EST (X40467). Using human testis Marathon-Ready cDNA (CL0NTECH) as type II primers ZAQL-CF and Z PCR was performed using AQL-XR1.
  • ZAQL-CF 5'-CCACCATGAGAGGTGCCACG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • ZAQL-XR1 5'-CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • the PCR reaction solution is 1 uL of PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene), 5 uA of 10x PCR buffer attached, 4 JL of 2.5 mM dNTP mixture.10 Primers ZAQL-CF and ZAQ L-XR1 2.5 ⁇ each, ⁇ type DNA was mixed with 51, and 301 with distilled water.
  • the reaction conditions were 95 ° C for 1 minute after initial denaturation, 95 ° C for 1 minute-60 ° C, 1 minute-72 ° C, 1 minute cycle of 40 times, and 72 ° C for 10 minutes.
  • the final extension reaction was performed.
  • the obtained DNA fragment was cloned using a TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) according to the method described in the attached manual.
  • the plasmid having the DNA fragment containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 was named pHMITA
  • the plasmid containing the DNA fragment containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 was named pHMITG.
  • Escherichia coli was transformed with plasmids PHMITA and pHMITG, and named Escherichia coli ⁇ / ⁇ and Escherichia coli TOPlO / pHMITG, respectively.
  • the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 18 encodes the human ZAQ ligand precursor peptide (A type, 105 amino acid residues) represented by SEQ ID NO: 22 DNA (SEQ ID NO: 28), and the DNA fragment represented by SEQ ID NO: 19 encodes a human Z AQ ligand precursor peptide (G type, 105 amino acid residues) represented by SEQ ID NO: 23 DNA (SEQ ID NO: 29).
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 have typical signal sequences, and the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 is represented by SEQ ID NO: 20.
  • DNA containing 258 base pairs (SEQ ID NO: 26) encoding a human ZAQ ligand mature peptide (A type, 86 amino acid residues), and a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 Is the sequence number : DNA containing 258 base pairs (SEQ ID NO: 27) encoding a human ZAQ ligand mature peptide (G type, 86 amino acid residues) represented by 21.
  • Plasmid pHMITG was digested with EcoR I and Xho I, and the resulting DNA was electrophoresed on a 1.5% agarose gel. I cut it out. The DNA fragment was recovered using the gel clean Gene Clean spin DNA extraction kit (BIO 101). The obtained DNA fragment is used as a promoter for expression of the CMV-IE enhancer and chicken beta-act in promoter in the mammalian cell expression vector PCAN618 (Fig. 11). And was cloned according to the usual method. As a result of decoding the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment by the method described above, it was confirmed that the DNA fragment had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30.
  • the mammalian cell expression vector containing the DNA encoding the human ZAQ ligand precursor peptide was named pCANZ AQLg2.
  • COS 7 cells used were purchased from ATCC and subcultured using DMEM medium (supplemented with 10% FBS). Using DMEM medium were plated COS 7 cells in 10 cm petri dish so as to be 1.5 Xl0 6 cells / dish, 37 ° C, 5% C0 2 incubator base - evening and cultured overnight in one.
  • DMEM medium supplied with 10% FBS.
  • Using DMEM medium were plated COS 7 cells in 10 cm petri dish so as to be 1.5 Xl0 6 cells / dish, 37 ° C, 5% C0 2 incubator base - evening and cultured overnight in one.
  • Buffer EC Effect
  • Eifectene Transfection Reagent 60 was added, mixed for 10 seconds, and left at room temperature for 10 minutes. Remove the cell supernatant from the previous day and add D After washing once with 10 ml of MEM medium, 9 ml of DMEM medium was added. Adding DMEM medium lml dropwise to mix after cell plasmid solvent solution, incubated overnight in 37 ° C, 5% C0 2 incubator one was mixed whole. Washed twice with DMEM medium 10 m 1, was added DMEM medium 10 m 1, and over ⁇ cultured in 37 ° C, 5% C0 2 incubator scratch. Two days later, the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant of the COS 7 cell expressing human ZAQ ligand precursor peptide was collected, and the following operation was performed to prepare an extract.
  • 1. 1 ml of acetic acid was added dropwise to the cell culture supernatant (about 18.5 ml) so that the final concentration was 1, and the mixture was stirred for 1 hour.
  • Add twice the volume of acetone stir at 4 ° C for 30 minutes, and centrifuge at 15,000 rpm for 30 minutes using a high-speed centrifuge (CR26H, type 23 rotor: Hitachi, Ltd.). I got Qing.
  • the obtained supernatant was subjected to evaporating overnight to remove acetone, and then lyophilized with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • the lyophilized powder obtained in the above (5-3-1) is dissolved in 2 ml of 1 M acetic acid, and absorbed to a Sephadex G15 (3 cm diameter, 35 ml, Pharmacia Biotech) column equilibrated with 1 M acetic acid. After that, 1M acetic acid was passed through the column, and the eluate was fractionated in 5 ml increments with a fraction No., and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • the SepPak C18-5g column (10 ml) was swollen with methanol, and then equilibrated by flowing 0.1% trifluoroacetic acid / distilled water.
  • the lyophilized fraction No. 16 of the Sephadex G50 gel filtration chromatography fractions was combined, dissolved in 0.1% trifluoroacetic acid / distilled water (3 ml), and applied to a SepPak C18-5 g column. After washing with 24 ml of acetic acid / distilled water, elution was carried out with 20 ml of 0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile. The obtained eluate was applied to a servant.
  • the eluate was fractionated with a 1 ml fraction number, and the whole fraction was freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • 1501 of 2.5 mM Probenecid and 0.2% BSA to H / HBSS and dissolve it.
  • ZAQC-B 1 cells and h0T7T175-16 cells that had been subcultured in DMEM supplemented with 10% dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as dFBS) were used.
  • ZAQC—B1 cells and T7T175-16 cells are suspended in a medium (10% dFBS-DMEM) at a concentration of 15 ⁇ 10 4 cells / ml, respectively, and a 96-well plate for FLIPR (Black plate clear bottom, Coster) seeded by 200 il each Ueru with the dispensing vessel (3.0Xl0 4 cells / 200 l / Ueru), 5% C0 2 was culture incubator overnight at 37 ° C for one medium, used was (hereafter cell plates And).
  • H / HBSS (HANKS '9.8g, sodium hydrogen carbonate 0.35g, HEPES 4.77g, adjusted to PH7.4 with sodium hydroxide, filter sterilized) 21ml, 250mM Probenecid 2101, fetal serum (FBS ) 210 1 was mixed. Also, dissolve Fluo3-AM 2 vial (50 ig) in dimethyl sulfoxide 421, 20% Pluronic acid 42 / il, add it to the above H / HBSS-Probenecid-FBS, mix and mix, 8 pipettes Remove the culture solution using Each well was dispensed into the cell plate and incubated at 37 ° C for 1 hour in a 5% CO 2 incubator (dye opening).
  • each fraction was dissolved by adding 150 parts of H / HBSS to which 2.5inM Probenecid and 0.2% BSA were added, and 96 wells for FLIPR
  • the plate was transferred to a plate (V-Bottom plate, Coster) (hereinafter referred to as a sample plate).
  • a plate V-Bottom plate, Coster
  • the cell plate and the sample plate were set on the FLIPR and subjected to assay (FLIPR transfers 0.05 ml of the sample from the sample plate to the cell plate).
  • FLIPR transfers 0.05 ml of the sample from the sample plate to the cell plate.
  • the human ZAQ ligand precursor peptide expression plasmid (pCANZAQLg2) was introduced into COS 7 cells by the method described in Example 5. That, CO S 7 were seeded in 15cm Petri dish so that the cell becomes a 3 ⁇ 0xl0 6 cells / disli the using DMEM medium and incubated overnight in 37 ° C, 5% C0 2 I Nkyube evening one.
  • the plasmid solution was added to DMEM medium lm 1 was added dropwise to mix after cell, 37 ° after mixing the whole (:., In 5% C0 2 incubator one was one ⁇ culture was washed once with DMEM medium 10 ml, DMEM medium 2 Om 1 was added, 37 ° (:., after 5% C0 and cultured overnight at 2 incubator one all day, the culture supernatant was collected, the more DMEM medium 2 OML pressurizing For example, 37 ° (:., After culturing overnight in 5% C0 2 incubator one culture supernatant was recovered (6-2) Purification of human type ZAQ ligand peptide from the culture supernatant
  • culture supernatants for 80 15 cm Petri dishes were collected, and acetic acid was added thereto to a final concentration of 1M. After stirring for 1 hour, 2 volumes of acetone was added to precipitate the protein. The mixture was stirred at 4 ° C for 30 minutes, and then centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes using a high-speed centrifuge (CR26H, RR10A rotor: Hitachi, Ltd.) to obtain a supernatant. The resulting supernatant was evaporated overnight to remove acetone, and then applied to a reversed-phase column (Waters C18, 100 g) previously equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid / distilled water.
  • a reversed-phase column Waters C18, 100 g
  • the peptide was eluted with 1000 ml of 0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile.
  • the eluate obtained was applied to an evaporator and then freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • Solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) using TSKgel ODS80TM reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi, 21.5 mm x 30 cm) at 40 at a flow rate of 4 m1 / min And allowed to equilibrate.
  • solution A After dissolving the obtained lyophilized powder in solution A, it is applied to the 0DS80TM column, and the solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) at a flow rate of 4 ml / min for 120 minutes, volume 60% / solution B ( The peptide was eluted with a linear gradient from 40% volume of 0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) to 100% volume of A solution and 100% volume of ZB solution.
  • the eluate was fractionated with a fraction number of 8 ml each, and 50 ⁇ 1 was collected from the fractionated fraction and freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis). H / HBSS and 2.5 Probenecid, 0.2% BSA were added to the dried product, and 2001 was added to dissolve the solution.
  • ZAQC-B was determined by the test method described in (5-3-4) above. The receptor activating effect on one cell was measured. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fraction No. 32.
  • Solution A (10 mM ammonium formate / 10 mM ammonium formate / liquid) was applied to a TSKgel CM-2SW ion exchange high-performance liquid chromatography column (Tosoichi, 4.6 thigh x 25 cm) at a flow rate of 1 m1 / min at 25 ° C. 10% acetonitrile) and allowed to equilibrate.
  • TSKgel CM-2SW ion exchange high-performance liquid chromatography column (Tosoichi, 4.6 thigh x 25 cm) at a flow rate of 1 m1 / min at 25 ° C. 10% acetonitrile) and allowed to equilibrate.
  • solution A (10 mM ammonium formate / 10% acetonitrile) volume 100% ZB solution (1000 ammonium formate / 10% acetonitrile) volume 0% for 60 minutes at a flow rate of lml / min Then, the peptide was eluted with a linear gradient from 0% solution volume to 0% solution volume / 100% solution B volume.
  • the eluate was fractionated by adding a fraction No. to each lm, and 1.5 l was taken from the fraction, and diluted with H / HBSS to 2.5 mM Probenecid, 0.% BSA.
  • the receptor activating effect on ZAQC-B1 cells was measured by the test method described in (5-3-4) above. As a result, it was found that the target component having a receptor activating action on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fractions Nos. 56 and 57.
  • Solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) was applied to a TSKgel Super phenyl reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Tosoichi Co., Ltd., 4.6 tcm ⁇ 10 cm) at a flow rate of lm1 / min at 40 ° C. ) And allowed to equilibrate.
  • the above fractions Nos. 56 and 57 were applied to the Super phenyl column, and solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) at a flow rate of lm 1 / min for 60 minutes.
  • Volume 70% / solution B (0.1% trifluoroacetic acid /
  • the peptide was eluted with a linear gradient from 30% volume (30% acetonitrile) volume to 50% night volume / 50% solution B volume.
  • the eluate was fractionated by assigning a fraction No. to each lm, and 1.51 was taken from the fractionated fraction, and this was diluted with H / HBSS in 2.5 mM Probenecid, 0.% BSA 200 xl, and this solution was diluted.
  • the receptor activating effect on ZAQC-B1 cells was measured by the test method described in (5-3-4) above. As a result, it was found that the target component having a receptor activating effect on ZAQC-B1 cells, that is, the ZAQ activating component, was eluted in fractions No. 54, 55 and 56. This activity coincided with a single ultraviolet absorption peak, and it was judged that the active ingredient had been purified to a single level.
  • the solvent in the purified product of the ZAQ-activating component was removed by freeze-drying, and the obtained freeze-dried product was dissolved in the solvent DMSO (dimethylsulfoxide).
  • a part (about 7.5 pmol) of this solution was subjected to N-terminal amino acid sequence analysis using a protein sequencer (Perkin Elmer, PE Biosystems Procise 391cLC).
  • a protein sequencer Perkin Elmer, PE Biosystems Procise 391cLC.
  • nine of the ten amino acid residues from the N-terminal amino acid residue could be identified (Ala Val I le T r Gly Ala Xaa Glu Arg Asp (SEQ ID NO: 31; Xaa is an unidentified residue)).
  • the obtained amino acid sequence was consistent with the predicted N-terminal amino acid sequence of the human mature ZAQ ligand mature peptide.
  • mass spectrometry of the purified sample of the ZAQ-activating component was performed by electrospray ionization using a Finnigan LCQ LC / MS device (Thernioduest, San Jose, CA), and it was confirmed that the molecular weight was 9657.6. This is in good agreement with the theoretical value of 9657.3 of the 86-peptide human ZAQ ligand mature peptide (SEQ ID NO: 21) in which all 10 cysteine residues formed a disulfide bond. It was confirmed to have a human ZAQ ligand mature peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • JRH BIOSCIENCES dialyzed fetal serum
  • 1 mM MEM non-essential amino acid solution 100 units / ml Penicillin, 100 g / ml Streptomycin ZAQL-1 expressing CHO cell clone No. 4 cultured to 4 Single Tray (Nunc) confluent in Pharmaceutical Co., Ltd.) was treated with triscine, dispersed, and then collected by centrifugation.
  • One Single Tray cell was suspended in 1.5 L of the above culture medium, then inoculated into Cell Factories 10 (Nunc), and four Cell Factories 10 were cultured at 37 ° C in 5% CO 2 for 3 days. .
  • the cells of one Cell Factories 10 were washed with 1 L of H / HBSS described above. After removing H / HBSS, 2 L of serum-free medium per 1 Cdl Factories (1 ⁇ MEM non-essential amino acid solution, 100 units / ml Penicillin, 100 Dulbecco's Modified Eagle Medium containing Streptomycin) was added, and the cells were further cultured for 2 days. The collected culture supernatant was centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes using a Hitachi high-speed centrifuge, followed by filtration using gauze to obtain a clear supernatant. To this was added acetic acid to a final concentration of 1 M, and the following operation was performed.
  • PrepC18 (Waters) packed with silica gel having octadodecyl groups immobilized thereon was swollen with methanol, and then packed in a glass column (50 MIX 100 mm). Then, the extract prepared in (6-2) was applied to the column equilibrated with 1 M acetic acid. The column was then washed with 80 Om 1 of 1 M acetic acid. Next, 1,000 ml of 60% acetonitrile Z0.1% trifluoroacetic acid was passed through the column to elute the crude peptide component of interest. The obtained eluate was concentrated using an evaporator, and then freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • the lyophilized product was dissolved by adding 36 ml of 1 M acetic acid, centrifuged, and 1Z3 of the solution was applied to the column.At a flow rate of 5 ml / ml, the volume of solution A was 66.7% and the volume of ZB was 1 minute. The solution B concentration was increased to 33.3%, and then the solution B concentration was increased in a linear gradient to 16.7% solution A volume and 83.3% solution B volume over 120 minutes. The eluate was fractionated with 5 ml fraction numbers. Each 3 l of each fraction was mixed with 150 l of 0.2% BSA and lyophilized with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • Atsushi buffer H / HBSS (Nissy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g), sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, and adjust the pH to 7.4 with sodium hydroxide solution. , Filter sterilized), and 2.5 Probenecid and 0.1% CHAPS added thereto.
  • H / HBSS Nasy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g
  • sodium hydrogen carbonate 0.35 g
  • HEPES 4.77 g sodium hydrogen carbonate
  • Adjust the pH to 7.4 with sodium hydroxide solution. Filter sterilized
  • 2.5 Probenecid and 0.1% CHAPS added thereto the activity of activating ZAQ- ⁇ 1 receptor was measured.
  • the component having the desired ZAQ- ⁇ 1 receptor activating action was mainly eluted in fraction Nos. 73-75.
  • TSKgel 0DS-80TS Reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Toso-Ichi, 4.6 x 100 mm) was applied at 40 at a flow rate of 1 ml Zmin and solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water). % / B solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) Equilibrated by flowing 8.3% by volume. Chromatography was performed on the lyophilized fraction No. 95-100 obtained in (7-5) above.
  • the lyophilized product was dissolved by adding 4 ml of 1 M acetic acid and applied to the column.Then, at a flow rate of 1 m1 / min, the volume of solution A was increased to 75% / volume of solution B over 25 minutes to 25%. Then, the eluate was recovered by increasing the concentration of solution B with a linear gradient to a volume of solution A of 25% and a volume of solution B of 75% over 60 minutes. The eluate was fractionated by assigning a fraction number to each lml. ZAQ ligand activity was measured according to the method described in (3-5), and it was confirmed that the activity was eluted in a fraction that coincided with a single ultraviolet absorption peak. From this, it was determined that the ZAQ ligand was purified singly.
  • the structure of the ZAQ ligand peptide obtained in (7-6) was determined by the following method. It was freeze-dried in a freeze dryer (12EL; VirTis) in a purified sample of ZAQ-activated main component. The obtained lyophilized product was dissolved in the solvent DMS0 (dimethyl sulfoxide). A part of this solution was subjected to amino acid sequence analysis from the N-terminus using Protein Sequencer (Perkin Elmer, Inc., PE Biosterns Procise 491cLC). As a result, an N-terminal amino acid sequence corresponding to the expected mature human ZAQ ligand peptide (SEQ ID NO: 21) was obtained.
  • Wakos i 1-11 5C18HG Prep Reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Wako Pure Chemical Industries, 20 martial arts X250 marauder) at 40 ° C at a flow rate of 5 ml / min.
  • Solution A (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water)
  • a volume of 91.7% / B solution (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) Equilibrated by flowing 8.3% of the volume.
  • Black Mamba venom (Sigma) 50 mg of the freeze-dried product was dissolved by adding 4 ml of 1 M AcOH and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was chromatographed.
  • Solution A (4 M ammonium formate: distilled water: acetate nitrile) at 25 ° C and a flow rate of 1 ml / min using a TSKgel CM-2SW ion-exchange high-performance liquid chromatography column (Tosoichi, 4.6X2 50 column) at 25 ° C 1: 299: 100) 100% volume
  • the Wako sil-II 5C18HG Prep reverse-phase high-performance liquid chromatography obtained from (7-1) was fractionated from fractionation fraction No.2 23 in 4 ml of Solution A and dissolved in 4 ml of TSKgel CM. -After being attached to the 2SW ion exchange column, the volume of solution A is reduced to 0% / the volume of solution B to 100% over 90 minutes at a flow rate of 1 ml / min The eluate was recovered by raising the linear gradient with. The eluate was fractionated with a 1 ml fraction number. 11 was collected from each fraction, diluted 10,000-fold with the Assay buffer described above, and the activation of ZAQ-B1 receptor was measured according to the test method described in (3-5) above. As a result, it was found that the component having the desired ZAQ-B1 receptor activation activity was mainly eluted in fractions No. 50-51.
  • Vydac238TP3410 Reversed-phase high-performance liquid chromatography column (Vydac, 4.6 mmxl00 nun) at 40 ° C and 1 ml / min flow rate with A solution (0.1% trifluoroacetic acid / distilled water) Capacity 91.7% / B solution ( (0.1% trifluoroacetic acid / 60% acetonitrile) Equilibrated by flowing 8.3% volume. After directly applying fraction No. 50-51 of the TSKgel CM-2SW ion-exchange high-performance liquid chromatographic liquid fractionation fraction obtained in (8-1-2) to the column, the flow rate was 1 ml / min.
  • Solution A volume was increased to 75% / solution B volume over 25 minutes, and then solution B concentration was increased in a linear gradient to 41.7% solution A volume and 58.3% solution B volume over 75 minutes.
  • the eluate was fractionated with a 0.5 ml fraction number. 11 was collected from each fraction, diluted 10,000-fold with the Assay buffer described above, and then the ZAQ-B1 receptor activating effect was measured by the test method described in (3-5) above. As a result, it was found that the component having the desired ZAQ-B1 receptor activating action was mainly eluted in fraction N 0.108-115.
  • the structure of the snake venom MIT1 obtained in (8-1-3) above was determined by the following method.
  • the purified MI T1 was freeze-dried with a freeze dryer (12EL; VirTis).
  • the obtained peptide freeze-dried product was dissolved in the solvent DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • a part of this solution was subjected to amino acid sequence analysis from the N-terminus using Protein Sequencer (Perkin Elmer, PE Biosystems Procise 491cLC).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the human type I5E receptor cDNA (SEQ ID NO: 35) was cloned by a known PCR method and inserted into a pAKKOl.11H expression vector.
  • the expression vector was transformed into CHO / dtiFr-cells (American Type Culture Collection) according to the method described in (3-5). Approximately 20 colonies of transformed CHO cells that had grown 10-14 days after the start of culture were selected. The selected cells were inoculated in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 4 cells / well, and the reactivity to MIT1 was examined according to the test method described in (3-5).
  • the 4th clone of CHO cell expressing I5E with good reactivity (abbreviated as I5E-4 cell) was selected.
  • the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35 is shown in SEQ ID NO: 36.
  • PCR was performed using two types of primers (SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was 1/10 volume of the above-mentioned cDNA and 1/50 volume of Advantag e-2 cDNA Polymerase Mix (CLONTECH), 0.2 mL of each primer, 200 mL of dNTPs 200
  • the attached buffer was added to ⁇ and the enzyme to make a liquid volume of 251.
  • the PCR reaction is 1 After 94 ° C'2 minutes, 2 3 cycles of 94 ° C'20 seconds, 72 ° C ⁇ 1 minute 30 seconds, 3 3 cycles of 94 ° ⁇ 20 seconds, 68 ° C ⁇ 1 minute 30 seconds A cycle of 94 ° C for 20 seconds, 62 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 36 times, and an extension reaction at 68 ° C for 7 minutes was finally performed.
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector pCR2.1-T0P0 (Invitrogen) according to the prescription of T0P0-TA Cloning Kit (Invitrogen). This was introduced into E.
  • cDNA (SEQ ID NO: 39) encoding a novel G protein-coupled receptor protein was obtained.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 40) derived from the nucleotide sequence of the cDNA showed 83.7% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the novel G protein-coupled receptor protein containing this amino acid sequence was named rZAQl.
  • a transformant (Escherichia coli) containing a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39 was named Escherichia coli DH5a / pCR2.1-rZAQl.
  • Example 10 Cloning of cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein (rZAQ2) derived from rat brain cDNA and determination of its nucleotide sequence
  • a clone encoding rZAQ2 was obtained by the genetrapper method. That is, the probe (SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42) was biotinylated, and then hybridized with a rat whole brain cDNA library (GIBC0-BRL) that had been made into a single strand. The strand gene was repaired into a double strand using primers (SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44). This gene was electroporated into Escherichia coli DH10B, and a transformant was obtained using ampicillin resistance as an index.
  • the probe SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42
  • GIBC0-BRL rat whole brain cDNA library
  • a clone encoding the target nucleotide sequence was selected by colony PCR using a probe (SEQ ID NO: 41) and a primer (SEQ ID NO: 45).
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 47) derived from the ORF (open reading frame) nucleotide sequence (SEQ ID NO: 46) predicted from this clone nucleotide sequence has 80.6% homology with rZAQl.
  • the novel G protein-coupled receptor protein containing this amino acid sequence was named rZAQ2.
  • the transformant (Escherichia coli) obtained by the genetrapper method was named Escherichia coli Escherichia coli DHIOB / PCMV-rZAQ2.
  • the carotid artery of a guinea pig (std: Hartley, 7 to 8 weeks old, male, weighing about 450 g) was cut with scissors to cause blood loss and death, and laparotomy was performed to remove the ileum.
  • Ileum, 95% 0 2 -5% C0 2 gas Tyrode solution elaborate can blow a (composition: 138 mM NaCK 2.7 mM KC1, 1.8 mM CaCl 2, 0.5 mM MgCl 2, 1.1 niM NaH 2 P0 4, 11.9 mM NaHC0 (3 , 5.6 mM glucose) in a glass Petri dish, surgical scissors and tweezers are used to remove fat fragments and connective tissue attached to the ileum. Used as The specimen was suspended in an organ bath (20 ml) filled with the above Tyrode solution warmed to 37 ° C., and stabilized by applying a load of 0.5 g for 30 minutes or more.
  • the contractile response of the ileum specimen was measured using AMPLIFIER CASE 7747 of NEC Sanei. After administration of 1 M acetylcholine and measurement of the maximal contractile response, the human ZAQ ligand peptide (ZAQL-1) obtained according to the method of Reference Example 1 or the protein obtained by (8-11-3) above The contraction response was measured by cumulatively administering the biotoxin MIT1. Physiological saline containing 0.05% bovine serum albumin was used for dilution of ZAQL_1 and MIT1.
  • TSKgel was equilibrated by flowing 0% solution A (10% acetonitrile Z0.1% trifluoroacetic acid) volume 100% ZB solution (0.1% trifluoroacetic acid / 40% acetonitrile) at room temperature at a flow rate of 1 ml / min.
  • solution A 10% acetonitrile Z0.1% trifluoroacetic acid
  • ZB solution 0.1% trifluoroacetic acid / 40% acetonitrile
  • the eluted [ 125 I] -Bol ton-Hunter Reagent-introduced MIT 1 was manually collected and buffered (composition: 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.2% BSA, 0.1% CHAPS, 0.03% NaN 3 , PH 7.4) and stored at _80 ° C.
  • the Itoda sac membrane fraction was prepared according to the method described in Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 279, pp. 675-685, 1996.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • JRH BIOSCIENCES dialyzed fetal serum
  • 1 MEM non-essential amino acid solution 100 units / ml Penicillin
  • 100 / xg / ml Streptomycin Receptor-expressing CHO cells that is, ZAQC-B1 cells or I
  • the supernatant was discarded and the precipitated cells were stored at 180.
  • the precipitate fur back for crushed (Singletray 1 sheets) (composition; 10 mM NaHC0 3, 5 mM EDTA, 0.5 mM phenylmethylsulfonylf luoride (PMSF), 10 / xg / ml peps tat in-A, 20 g / ml leupeptin, 10 ⁇ g / ml E-64) 4 ml was added, the precipitate was suspended by pipetting, and then crushed using a Polytron (blade type PTA7) for three times at a scale setting of 4, for 20 seconds. Next, Hitachi high speed cooling centrifuge Using a No.
  • a binding assay buffer (composition; 20 inM Tris, 1 ⁇ EDTA, 0.5 mM PMSF, 10 g / ml pepstatin-A, 40 g / ml leupepiin, lOng / l E-64, 0.03% NaN 3 , pH 7.4), add 5 ml, suspend, filter through Cell Strainer (FALCON 2350), and filter the ZAQC—B1 cell membrane fraction (ie, ZAQ membrane fraction) or the I5E—4 cell membrane fraction (ie, , I5E membrane fraction).
  • the protein concentration of each of the obtained membrane fractions was measured using Coomassie Protein Assay Reagent (PIERCE), and then dispensed in 100 lil portions and stored at 180 ° C.
  • the ZAQ membrane fraction was diluted to 10 ig / ml, and the I5E membrane fraction was diluted to 20 g / ml, and 200 ⁇ Each one was dispensed into a tube (FMXON 2053).
  • 2 nl of the test compound and 2 l of 10 nM 125 I-MIT1 were added and incubated at 25 ° C for 1 hour.
  • the human ZAQ ligand peptide (ZAQL-1) obtained according to the method of Reference Example 1 or the snake venom MIT 1 (unlabeled MI) obtained by (8-13) described above was used. T 1) was used.
  • a filtration buffer composition: 20 mM Tris, EDTA, 0.1% BSA, 0.05% C HAPS, 0.03% NaN 3 pH 7.4
  • buffer 1 composition: 20 mM Tris, 0.3%
  • the mixture was immediately filtered through a glass fiber filter paper GF / F (Whatman) previously treated with polyethyleneiniine (pH 7.4), and 1.5 ml of a filter buffer was added again to the reaction tube, followed by filtration in the same manner.
  • the radioactivity of the glass fiber filter was measured using a counter (C0BRA, Packard), and the amount of 125 I-MIT1 bound was measured.
  • Non-specific binding amount is 1 I_MIT1 binding amount when unlabeled MI T1 (final concentration 1) is used as the test compound, and 125 I-MIT1 binding amount when no test compound is added is the total binding amount (TB), and the maximum specific binding amount (TB-NSB) was calculated.
  • Each of the four DNA oligomers (# 2 to # 5) excluding # 1 and # 6 above, which should be on the 5 'side, was added to 25 phosphorylation reaction solutions [DNA oligomer 10 ig, 5 OmM Tris-HCl, pH7 .6, 1 OmM MgCl 2 , lmM spermidine, 1 OmM dithiothreitol (hereinafter abbreviated as DTT), 0.1 mg / ml ⁇ serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), IfflM ATP, 10 units T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo)] at 37 ° C for 1 hour to phosphorylate the 5 'end of each oligomer. After phenol treatment, 2 volumes of ethanol was added, and the mixture was cooled to -70 ° C, and DNA was precipitated by centrifugation.
  • the DNA fragment obtained in (b) above was combined with # 1 and # 6 above to give 1201.
  • the mixture was kept at 90 ° C for 10 minutes, cooled slowly to room temperature, annealed, and then subjected to ligation reaction using TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo).
  • the I solution 601 included in the kit was added and allowed to react for 37 '1 hour to perform ligation.
  • phenol treatment was performed, the aqueous layer was collected, twice the amount of ethanol was added, the mixture was cooled to 170 ° C, and the DNA was precipitated by centrifugation.
  • the DNA fragment thus obtained was phosphorylated by T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) and then subjected to the following step (d).
  • PTC II (described in JP-A-2000-178297) was digested with Ndel and BamHI (Takara Shuzo) at 37 ⁇ 2 hours, and then a 4.3 kb DNA fragment was digested with 1% agarose gel. Extraction was performed using QIAduick Gel Extraction Kit (Qiagen) and dissolved in 25 ⁇ 1 TE buffer. The ligation reaction was carried out using the NdeI and BamHI fragments of pTCII and the ZAQ ligand structural gene (SEQ ID NO: 58) prepared as described above using TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo). Using 10 l of this reaction solution, E.
  • coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed, seeded on an LB agar medium containing 1 O ⁇ gZml of tetracycline, cultured at 37 ° C for 1 ⁇ , and the resulting tetracycline-resistant colonies I chose.
  • This transformant After culturing overnight in LB medium, plasmid pTCh1ZAQ was prepared using QIAprep8 Miniprep Kit (Qiagen). The nucleotide sequence of this ZAQ ligand DNA was confirmed using an Applied Biosystems model 377 DNA sequencer. Plasmid p TChl ZAQ was transformed into E. coli (Escherichia coli) MM294 (DE3) to obtain a ZAQ ligand-expressing strain Escherichia coli marauder 294 ⁇ 3) / pTChlZAQ.
  • Escherichia coli marauder 294 (DE3) / pTCMZAQ was added to LB medium containing 5.OmgZL tetracycline2 L using 1 L (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) The culture was shake-cultured in a flask at 37 ° (: 8 hours.
  • the obtained culture was diluted with 19 L of the main fermentation medium (1% 68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% 1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% antifoam, 0.00025% ferrous sulfate, 0.0005% thiamine hydrochloride, 1.5% glucose, 1 (5% high case amino) was transferred to a 50 L fermenter, and aeration and stirring were started at 30 ° C. When the turbidity of the culture broth reached 500 klet units, isopropyl mono-D-thiogalacto was added. Pyranoside was added to a final concentration of I SmgZL, and the cells were cultured for another 4 hours. About 200 g of wet cells were obtained and stored at 80 ° C.
  • the main fermentation medium 1% 68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% 1% ammonium chloride, 0.05% sodium chlor
  • This fraction was further passed through C4P-50 (21.5 V1 DX300 thigh L, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid, and adsorbed and washed.
  • the ZAQ ligand obtained in Reference Example (1-1-4) was suspended in Samp 1 e buffer (Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)) to which 10 OmM DTT was added, and heated at 95 ° C for 1 minute. Thereafter, electrophoresis was carried out using Multigel 15 Z25 (Daiichi Pure Chemicals). As a result of staining the gel after electrophoresis with Coomassie brilliant blue (Coomassie brilliant blue), a single spot was placed at the same position as the recombinant ZAQ ligand sample derived from COS 7 cells obtained in Example 5. A protein band was observed. Therefore, the recombinant ZAQ ligand preparation derived from E. coli obtained in Reference Example (1-4) is extremely high in purity, and has a molecular weight similar to that of the recombinant ZAQ ligand prepared from C0S7 cells. It turned out to be the same.
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-850 OA Amino Acid Analyzer). The results were consistent with the amino acid composition estimated from the DNA base sequence of the ZAQ ligand (a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21) (Table 2). Table 2
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 492). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence of the ZAQ ligand deduced from the DNA base sequence of the obtained ZAQ ligand (Table 3). Table 3
  • the C-terminal amino acid was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-850 OA Amino Acid Analyzer).
  • the resulting ZAQ ligand was identical to the C-terminal amino acid deduced from the DNA sequence (Table 4). Table 4
  • Mass spectrometry was performed using an LCQ ion trap mass spectrometer (manufactured by ThermoQuest) equipped with a nanoESI ion source. As a result, a molecular weight of 9657.55 ⁇ 0.89 was obtained, and the theoretical molecular weight (9657.3) of the ZAQ ligand of SEQ ID NO: 21, in which 10 residues of Cys contained in SEQ ID NO: 21 formed 5 pairs of disulfide bonds, was obtained. Well matched.
  • Example (1-1-4) Activity of the purified recombinant E. coli-derived ZAQ ligand sample obtained in Reference Example (1-1-4) was measured using the method of Example 5 (intracellular Ca ion concentration using FLIPR). (Measurement of degree-increasing activity). As a result, it had activity equivalent to that of the recombinant sample derived from COS 7 cells obtained in Example 5 (purified product of ZAQ ligand). Industrial applicability
  • the peptide of the present invention, the DNA encoding the peptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention) and the antibody against the peptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) are (1) a therapeutic or prophylactic agent for various diseases involving the peptide of the present invention; (2) screening for a compound or a salt thereof that alters the binding property of the peptide of the present invention to the protein of the present invention; Quantitation, 4Gene diagnostic agent, ⁇ ⁇ Drug containing antisense DNA, ⁇ ⁇ Drug containing antibody of the present invention, ⁇ Creation of non-human animal containing DNA of the present invention, 8Structurally similar ligand -Useful for drug design based on comparison with the receptor.

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Description

明細書
新規生理活性べプチドおよびその用途 技術分野
本発明は、 ①配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチドまた はその塩、 および②ォーファン受容体タンパク質である配列番号： 1または配列番 号：で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質またはその塩と、 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを 徴とす るペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 消化器疾患の予防'治療 とし て有用な化合物またはその塩などのスクリーニング方法などに関する。 背景技術
生体のホメォスタシスの維持、 生殖、 個体の発達、 代謝、 成長、 神経系、 循蕖器 系、 免疫系、 消化器系、 代謝系の調節、 感覚受容などの重要な機能調節は、 様々な ホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこ れらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的な受容体を介して細胞が受 容し、 それに応じた反応をすることによって行われている。 このような機能調節に 与るホルモンや神経伝達物質の受容体の多くは guanine nucleot ide- binding prote in (以下、 Gタンパク質と略称する場合がある） と共役しており、 この Gタンパク 質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特 徵とする。 また、 これらの受容体タンパク質は共通して 7個の膜貫通領域を有する 。 これらのことからこうした受容体は Gタンパク質共役型受容体あるいは 7回膜貫 通型受容体と総称される。 このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝 達物質およびそれに対する受容体夕ンパク質が存在して相互作用し、 重要な役割を 果たしていることがわかっているが、 未知の作用物質 （ホルモンや神経伝達物質な ど） およびそれに対する受容体が存在するかどうかについてはいまだ不明なことが 多い。 近年、 ヒ卜ゲノム D NAあるいは各種ヒト組織由来の c D N Aのランダムな配列 決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によつてヒ卜の遺伝 子が加速度的に解明されてきている。 それにともない、 機能未知のタンパク質をコ ードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになつている。 Gタンパク質共 役型受容体は、 7個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に 多くの共通配列が存在するためそのようなタンパク質の中から明確に Gタンパク質 共役型受容体として区分することができる。 一方でこうした構造の類似性を利用し たポリメラ一ゼ ·チェーン ·リアクション （Polymerase Chain React ion：以下、 P C Rと略称する） 法によってもこうした Gタンパク質共役型受容体遺伝子が得られ ている （Nature Cel l Biology, Vol. 2、 703-708 (2000) ) 。 このようにしてこれま でに得られた Gタンパク質共役型受容体のうちには既知の受容体との構造の相同性 が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もある が、 ほとんどの場合その内因性リガンドは予測不能であり、 これらの受容体は対応 するリガンドが見いだされていない。 このことからこれらの受容体はォーファン受 容体と呼ばれている。 このようなォーファン受容体の未同定の内因性リガンドは、 リガンドが知られていなかつたために十分な解析がなされていなかった生物現象に 関与している可能性がある。 そして、 このようなリガンドが重要な生理作用や病態 と関連している場合には、 その受容体作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬 品の創製に結びつくことが期待される (Stadel, J. et al.、 TiPS、 18巻、 430-437 頁、 1997年、 Marchese, A. et al.、 TiPS、 20巻、 370 - 375頁、 1999年、 Civell i, 0. et al.、 Brain Res.、 848巻、 63- 65頁、 1999年） 。 しかし、 これまで実際にォ一フ アン Gタンパク質共役型受容体のリガンドを同定した例はそれほど多くない。
最近、 幾つかのグループによってこうしたォーファン受容体のリガンド探索の試 みがなされ、 新たな生理活性べプチドであるリガンドの単離 ·構造決定が報告され ている。 Reinsheidらおよぴ eunierらは独立に、 動物細胞にォーファン Gタンパク 質共役型受容体 L C 1 3 2あるいは O R L 1をコードする c D NAを導入して受容 体を発現させ、 その応答を指標として orplianin FQあるいは nocicept inと名付けられ た新規ペプチドをプ夕脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、 配列を決 した （R einsheid, . K. et al.、 Science, 270巻、 792 - 794頁、 1995年、 Meunier, J. -C. e t al.、 Nature, 377巻、 532- 535頁、 1995年） 。 このペプチドは痛覚に関与している ことが報告されたが、 さらに、 受容体のノックアウトマウスの研究により記憶に関 与していることが明らかにされた (Manabe, T. et al.、 Nature, 394巻、 577- 581頁 、 1998年） 。
その後これまでに上記と同様な方法により P r RP (prolactin releasing pepti de) 、 o r e x i n、 p e 1 i n, g h r e 1 i nおよび GAL P (galanin-lik e peptide) などの新規ペプチドがォーファン Gタンパク質共役型受容体のリガンド として単離された (Hi醒 a, S. et al.、 Nature, 393巻、 272- 276頁、 1998年、 Saku rai, T. et al.、 CelK 92巻、 573- 585頁、 1998年、 Tatemoto, K. et al.、 Bichem. Biophys. Res. Co腿 un.、 251巻、 47卜 476頁、 1998年、 Kojima, M. et al.、 Nature 、 402巻、 656- 660頁、 1999年、 Ohtaki, T. et al.、 J. Biol. Chem.、 274巻、 3704 ト 37045頁、 1999年） 。
一方、 これまで明らかでなかった生理活性ペプチドの受容体が同様な方法によつ て解明される場合もある。 腸管収縮に関与する mo t i l l nの受容体が GPR3 8であることが明らかにされた （Feighner, S. D. et al.、 Science, 284巻、 2184- 2188頁、 1999年） ほか、 S L C— 1がメラニン凝集ホルモン （MCH) の受容体と して同定され (Chambers, J. et al.、 Nature, 400巻、 261- 265頁、 1999年、 Saito, Y. et aし Nature, 400巻、 265- 269頁、 1999年、 Shimomura, Y. et al.、 Biochem . Biophys. Res. Commun. , 261巻、 622- 626頁、 1999年、 Lembo, P. M. C. et al.、 Nature Cell Biol.、 1巻、 267- 27頃、 1999年、 Bactmer, D. et al.、 FEBS Lett. , 457卷、 522- 524頁、 1999年） 、 また GPR14 (SENR) が urotensin II の受容体 であることが報告された （Ames, R. S. et al.、 Nature, 401巻、 282-286頁、 1999 年、 Mori, M. et al.、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 265巻、 123- 129頁、 1999 年、 Nothacker, H. -P. et al.、 Nature Cell Biol.、 1巻、 383- 385頁、 1999年、 Liu , Q. et al.、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 266巻、 174- 178頁、 1999年） 。 M CHはそのノックアウトマウスが羸痩の phenotype を示すことから肥満に関与する ことが示されていたが (Shimada, M. et al.、 Nature, 396巻、 670- 674頁、 1998年 ) 、 その受容体が明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有する受容 体拮抗薬の探索が可能となった。 また、 urotensin IIはサルに静脈内投与すること によって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されて いる (Ames, R. S. et al.、 Nature, 401巻、 282- 286頁、 1999年) 。
このように、 ォーフ 7ン受容体およびそのリガンドは新たな生理作用に関与する 場合が多く、 その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。 しかし、 ォ一ファン受容体のリガンド探索においては多くの困難さが伴い、 これまでに数多 くのォーファン受容体の存在が明らかにされながらそのリガンドが明らカ こされた 受容体はごく一部に過ぎない。
本発明者らは、 ォーファン Gタンパク質共役型受容体である新規受容体 Z A Q ( 本願明細書の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質：以下、 本明細書において、 単に Z AQと称する 場合がある） を見出したが、 そのリガンドが何であるのかはこれまで不明であった ォーファン受容体夕ンパク質である Z A Qに対するリガンドの探索と、 Z A Qお よびそのリガンドを用いることを特徴とする化合物などのスクリ一二ング方法の確 立が課題とされていた。 発明の開示
本発明者らは、 牛乳抽出液中に Z A Q特異的なリガンド活性を有する物質が存在 することを見出し、 当該物質を分離し、 構造決定をおこなった。 さらに、 本活性成 分のヒト型ペプチドをコードする遺伝子を見出し、 これを動物細胞に発現させたど ころ、 培養上清中に Z AQ発現細胞を活性化するべプチド性物質が分泌されている ことを確認した。
本発明者らは、 かかる知見に基づいて、 Z AQおよび Z AQリガンドペプチドを 用いたスクリーニング系を用いて、 Z AQの介在する疾患の治療薬 （Z AQ拮抗薬 あるいは作動薬など、 具体的には消化器疾患の予防 ·治療薬など） のスクリーニン グができることを見出した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、 (2) 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドである前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩、
(3) 配列番号： 20で表わされるアミノ酸配列を含有する前記 （1) 記載のぺプ チドまたはその塩、
(4) 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列を含有する前記 （1) 記載のぺプ チドまたはその塩、
(5) 配列番号： 22または配列番号： 23で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする前記 （1) 記載のぺプ チドまたはその塩、
(6) 前記 （1) 記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌ クレオチド、
(7) DNAである前記 （6) 記載のポリヌクレオチド、
(8) 配列番号： 26または配列番号： 27で表される塩基配列を含有する前記 （ 7) 記載の DNA、
(9) 配列番号： 28または配列番号： 29で表される塩基配列を含有する前記 （ 7) 記載の DNA、
(10) 前記 （6) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(11) 前記 （10) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(12) 前記 （11) 記載の形質転換体を培養し、 前記 （1) 記載のペプチドを生 成'蓄積せしめることを特徴とする前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩の製造 法、
(13) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩に対する抗体、
(14) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 前記 （1) 記載の ペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(15) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 36で表わされ るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 前記 （1) 記載 のペプチドまたはその塩と配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(16) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 前記 （1) 記載 のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(17) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 36で表わされ るアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 前記 （1) 記 載のペプチドまたはその塩と配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(18) 前記 （14) 記載のスクリーニング方法または前記 （16) 記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られうる、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(19) 前記 （15) 記載のスクリーニング方法または前記 （17) 記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られうる、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と 配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩
(20) 前記 （18) または （19) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医 薬、
(21) 消化器疾患の予防'治療剤である前記 （20) 記載の医薬、 (22) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
(23) 消化器疾患の予防'治療剤である前記 （22) 記載の医薬、
(24) 哺乳動物に対して、 前記 （14) 記載のスクリーニング方法または前記 （
16) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 前記 （1) 記載のぺプ チドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする消化器疾患の予防 ·治療方 法、
(25) 哺乳動物に対して、 前記 （15) 記載のスクリーニング方法または前記 （ 17) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 前記 （1) 記載のぺプ チドまたはその塩と配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる 化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする消化器疾患の予防 ·治療 方法、
(26) 消化器疾患の予防 ·治療剤を製造するための前記 （14) 記載のスクリー ニング方法または前記 （16) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる 、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩の使用、
(27) 消化器疾患の予防 ·治療剤を製造するための前記 （15) 記載のスクリ一 ニング方法または前記 （17) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる 、 前記 (1) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 36で表わされるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩の使用などを提供するものである。 さらには、 本発明は、
(28) 配列番号： 20または配列番号： 21で表されるアミノ酸配列と実質的に 同一のアミノ酸配列が、 配列番号： 20または配列番号： 21で表されるアミノ酸 配列と約 60%以上 （好ましくは約 70%以上、 さらに好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 85%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上） の相同性を有するアミノ酸配列である前記 （1 ) 記載のペプチドまたは その塩、
( 2 9 ) 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列と実質的に 同一のアミノ酸配列が、 ①配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表されるァミノ 酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜 2 0個程度） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 2 0または配列番 号： 2 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜4 0個程 度、 より好ましくは 1〜3 0個程度、 なかでも好ましくは 1〜2 0個程度） のアミ ノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表される アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましく は 1〜2 0個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または ④それらを組み合わせたアミノ酸配列である前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその 塩、
( 3 0 ) (i) 前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩とを接触させた場合と、 （i i) 前記 （1 ) 記載 のペプチドまたはその塩および試験化合物と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする前 記 （1 4 ) 記載のスクリーニング方法、
( 3 1 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、 （i i) 標識した 前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩および試験化合物を配列番号： 1で表わさ れるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質 もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合における、 標識した前記 ( 1 ) 記載のペプチドまたはその塩の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同 一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 3 2 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質を含有する細胞に接触させた場合と、 （i i) 標識した前記 （1 ) 記載のぺプチ ドまたはその塩および試験化合物を配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞に接触さ せた場合における、 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩の当該細胞に 対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする前記 （1 ) 記載のペプチドまた はその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング方法、
( 3 3 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質を含有する細胞の膜画分に接蝕させた場合と、 （i i) 標識した前記 （1 ) 記載 のペプチドまたはその塩および試験化合物を配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞 の膜画分に接触させた場合における、 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはそ の塩の当該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする前記 ( 1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同 一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 3 4 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を、 配列番号： 1で 表わされるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ン パク質をコードする D NAを含有する D NAを含有する組換えベクターで形質転換 された形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現した夕ン パク質に接触させた場合と、 （i i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその 塩および試験化合物を、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D NAを含有する D N Aを含有する組換えべクタ一で形質転換された形質転換体を培養することによって 当該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質に接触させた場合における、 標識し た前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩の当該タンパク質に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とする、 前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法、
( 3 5 ) (i) 前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 3 6で表わされ るァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩とを接触させた場合と、 （i i) 前記 （1 ) 記 載のペプチドまたはその塩および試験化合物と配列番号： 3 6で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはそ の部分ペプチドまたはその塩とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす る前記 （1 5 ) 記載のスクリ一ニング方法、
( 3 6 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を配列番号： 3 6で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、 （i i) 標識し た前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩および試験化合物を配列番号： 3 6で表 わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、 標識した 前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩の配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分べプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする前記 ( 1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結 合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 3 7 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を配列番号： 3 6で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン パク質を含有する細胞に接触させた場合と、 （i i) 標識した前記 （1 ) 記載のぺプ チドまたはその塩および試験化合物を配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞に接 触させた場合における、 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩の当該細 胞に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする前記 （1 ) 記載のペプチド またはその塩と配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリ一二ング方法、
( 3 8 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を配列番号： 3 6で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン パク質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、 （i i) 標識した前記 （1 ) 記 載のペプチドまたはその塩および試験化合物を配列番号： 3 6で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する 細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまた はその塩の当該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする 前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配 列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
( 3 9 ) (i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩を、 配列番号： 3 6 で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質をコードする D N Aを含有する D N Aを含有する組換えベクターで形質転 換された形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したタ ンパク質に接触させた場合と、 （i i) 標識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはそ の塩および試験化合物を、 配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D N Aを含有する D NAを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養することによ つて当該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質に接触させた場合における、 標 識した前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩の当該タンパク質に対する結合量を 測定し、 比較することを特徴とする、 前記 （1 ) 記載のペプチドまたはその塩と配 列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング方法、
(40) 前記 （30) 〜 （34) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 （i) 前 記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結 合性を変化させる化合物またはその塩、
(41) 前記 （35) 〜 （39) 記載のスクリーニング方法で得られうる、 （i) 前 記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩、
(42) 前記 （40) または （41) 記載の化合物またはその塩を含有する医薬、 (43) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞を含有することを特徴とする前記 （ 16) 記載のスクリーニング用キット、
(44) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴とす ' る前記 （16) 記載のスクリーニング用キット、
(45) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAを含有する D N Aを含有する組 換えベクターで形質転換された形質転換体を培養することによって当該形質転換体 の細胞膜に発現したタンパク質を含有することを特徴とする前記 （16) 記載のス クリーニング用キッ卜、
(46) 配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞を含有することを特徴とする前記 (17) 記載のスクリーニング用キット、
(47) 配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴と する前記 （17) 記載のスクリーニング用キット、 (48) 配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAを含有する DNAを含有する 組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養することによって当該形質転換 体の細胞膜に発現したタンパク質を含有することを特徴とする前記 （17) 記載の スクリーニング用キット、
(49) 前記 （43) 〜 （45) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られう る、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(50) 前記 （46) 〜 （48) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られう る、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 36で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその 塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(51) 前記 （49) または （50) 記載の化合物またはその塩を含有する医薬、 (52) 消化器疾患の予防 '治療剤である前記 （42) または （51) 記載の医薬、
(53) 前記 （13) 記載の抗体と、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩とを 接触させることを特徴とする、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩の定量法、
(54) 前記 （13) 記載の抗体と、 被検液および標識化された前記 （1) 記載の ペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 当該抗体に結合した標識化された前 記 （1) 記載のペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中 の前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩の定量法、
(54) 被検液と担体上に不溶化した前記 （11) 記載の抗体および標識化された 前記 （11) 項記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体 上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の前記 （1) 記載のぺプチ ドまたはその塩の定量法、
(55) 前記 （7) 記載の DNAとハイストリンジェン卜な条件でハイブリダィズ するポリヌクレオチド、
(56) 前記 （7) 記載の DN Aの塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を 含有するポリヌクレオチド、 (57) 配列番号： 28または配列番号： 29で表される塩基配列と相補的な塩基 配列またはその一部を含有する前記 （56) 記載のポリヌクレオチド、
(58) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 40、 配列番号 ： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で表わされるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩を用いることを特徴とする、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその 塩と配列番号： 40、 配列番号： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で 表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 方法、
(59) 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 40、 配列番号 : 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で表わされるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩を含有することを特徴とする、 前記 （1) 記載のペプチドまたはそ の塩と配列番号： 40、 配列番号： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49 で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ用キッ卜、
(60) 前記 （58) 記載のスクリーニング方法または前記 （59) 記載のスクリ —ニング用キットを用いて得られうる、 前記 （1) 記載のペプチドまたはその塩と 配列番号： 40、 配列番号： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で表わ されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク 質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(61) 前記 （60) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(62) 消化器疾患の予防'治療剤である前記 （61) 記載の医薬、
(63) 配列番号： 34で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩および配列番号： 1、 配列番号： 36、 配列番号： 40、 配列番号： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で表わ されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク 質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 配列番号： 34で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する ペプチドまたはその塩と配列番号： 1、 配列番号： 36、 配列番号： 40、 配列番 号： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で表わされるアミノ酸配列と同 —または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(64) 配列番号： 34で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩および配列番号： 1、 配列番号： 36、 配列番号： 40、 配列番号： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で表わ されるァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク 質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 配列番号 ： 34で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るペプチドまたはその塩と配列番号： 1、 配列番号： 36、 配列番号： 40、 配列 番号： 47、 配列番号： 48もしくは配列番号： 49で表わされるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結 合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(65) 前記 （63) 記載のスクリーニング方法または前記 （64) 記載のスクリ 一二ング用キットを用いて得られうる、 配列番号： 34で表されるアミノ酸配列と 同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩と配列番 号： 1、 配列番号： 36、 配列番号： 40、 配列番号： 47、 配列番号： 48もし くは配列番号： 49で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはそ の塩、
(66) 前記 （65) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(67) 消化器疾患の予防'治療剤である前記 （66) 記載の医薬などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来タンパク質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQC) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 2に続 <) 。
図 2は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来タンパク質をコ一ドする DNAの 塩基配列 （ZAQC) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 1の続 き、 図 3に続く） 。
図 3は実施例 1で得られた本発明のヒ卜脳由来タンパク質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQC) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 2の続 ぎ） 。
図 4は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来タンパク質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQT) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 5に続 く） 。
図 5は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来タンパク質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQT) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 4の続 き、 図 6に続く） 。
図 6は実施例 1で得られた本発明のヒト脳由来タンパク質をコードする DNAの 塩基配列 （ZAQT) 、 およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す （図 5の続 さ） 。
図 7は本発明のヒ卜脳由来タンパク質の疎水性プロッ卜を示す。
図 8は実施例 2で行われた Z AQの発現分布の解析結果を示す。
図 9は MI T 1、 ヒ卜型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （Aタイプ） およびヒト 型 ZAQリガンド前駆体ペプチド （Gタイプ） のアミノ酸配列を示す。 図中、 「M I T1」 は M I Τ 1のアミノ酸配列を、 「Human (A t yp e) 」 はヒト型 Z AQリガンド成熟体ペプチド （Aタイプ） のアミノ酸配列を、 「Human (G t y P e) 」 はヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド （Gタイプ） のアミノ酸配列を 、 それぞれ示す。
図 10は実施例 6 (6— 3) で行われた、 精製 ZAQリガンドペプチドの ZAQ 活性化作用の測定結果を示す。
図 11は実施例 5 (5-1) で用いたプラスミド pCAN618の制限酵素地図 を示す。
図 12は実施例 8 (8-3) で行われたヒト型 ZAQリガンドペプチドおよび M I Tlの ZAQ受容体活性化作用の測定結果を示す。 図中、 一〇一はヒト型 ZAQ リガンドペプチドを、 一拿—は MI T1を示す。
図 13は実施例 8 (8-3) で行われたヒト型 ZAQリガンドペプチドおよび M I T1の I 5E受容体活性化作用の測定結果を示す。 図中、 一〇一はヒト型 ZAQ リガンドペプチドを、 一 ·一は MI T 1を示す。
図 14は実施例 11で行われた収縮作用の測定結果を示す。 図中、 一画一はヒト 型 ZAQリガンドペプチドを、 —秦—は MI Tlを示す。
図 15は実施例 12で行われた ZAQ膜画分を用いたバインディングアツセィの 測定結果を示す。 図中、 —園一は可変濃度 （横軸記載） のヒト型 ZAQリガンドぺ プチドを試験化合物として加えた場合の125I- MIT1 特異的結合量を、 — ·—は同様に M I T 1を試験化合物として加えた場合の125I- MIT1 特異的結合量を示す。
図 16は実施例 12で行われた I 5 E膜画分を用いたバインディングアツセィの 測定結果を示す。 図中、 一口一は可変濃度 （横軸記載） のヒト型 ZAQリガンドぺ プチドを試験化合物として加えた場合の125I- MIT1 特異的結合量を、 一〇一は可変濃 度 （横軸記載） の MI T 1を試験化合物として加えた場合の125I_MIT1 特異的結合量 を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明のペプチドまたはその塩は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同 一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩 （以下、 本発明のタンパク質と略記することがある） と結合する能力を有するペプチドまた はその塩であり、 本発明のタンパク質と結合し、 活性化する能力を有するペプチド またはその塩である。
さらに、 本発明のペプチドまたはその塩は、 配列番号： 36、 配列番号： 40、 配列番号： 47、 配列番号： 48または配列番号： 49で表わされるアミノ酸配列 と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩と結 合する能力を有するペプチドまたはその塩であり、 当該タンパク質と結合し、 活性 化する能力も有するペプチドまたはその塩である。
なかでも好ましくは、 本発明のペプチドまたはその塩は、 配列番号： 20または 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有し、 本発明のタンパク質と結合し、 活性化する能力を有することを特徴と するペプチドまたはその塩である。
本発明のペプチドまたはその塩の本発明のタンパク質と結合する能力および本発 明のタンパク質を活性化する能力は後述の方法により測定することができる。 以下、 本発明のぺプチドまたはその塩を本発明のぺプチドと略記する場合がある 本発明のタンパク質 （Gタンパク質共役型受容体タンパク質） は、 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列 （図 1〜図 3または図 4〜図 6中のアミノ酸配列） と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体タンパク質である （以下
、 本発明のタンパク質またはその塩を本発明のタンパク質と略記する場合がある） 本発明のペプチドおよび本発明のタンパク質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例え ば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあ らゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 勝臓 iS細胞、 骨髄細胞、 メ サンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細 胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細 胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核 球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしく は間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球 系の細胞 （例えば、 MEL， Ml, CTLL- 2, HT— 2, WEHI— 3， HL -60, J OSK- 1, K 562, ML— 1, MOLT— 3， MOLT— 4， MO LT— 10， CCRF-CEM, TALL- 1, J u r k a t , CCRT-HS B —2， KE- 37, SKW- 3, HUT— 78， HUT— 102, H9, U937 ， THP- 1, HEL, JK一 1, CMK, KO- 8 1 2, MEG— 01など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球 、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳 、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝 臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 (例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立 腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部 位） に由来するペプチド ·タンパク質であってもよく、 また合成ペプチド ·合成夕 ンパク質であってもよい。
本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質がシグナル配列を有している場合は 当該ペプチドまたはタンパク質を効率良く細胞外に分泌させることができる。 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表され るアミノ酸配列と約 6 0 %以上 （好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 8 5 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ま しくは約 9 5 %以上） の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 2 0または配列 番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配 列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド と実質的に同質の性質を有するペプチドなどが好ましい。
以下、 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を含有す るペプチドをヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドと記載することがある。
配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 2 0 または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配 列を含有するべプチドと実質的に同質の活性を有するぺプチドなどが好ましく、 具 体的には配列番号： 2 0、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 2または配列番号： 2 3 で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド等が挙げられる。
以下、 配列番号： 2 2または配列番号： 2 3で表わされるアミノ酸配列を含有す るべプチドをヒト型 Z AQリガンド前駆体べプチドと記載することがある。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明のタンパク質に対する結合活性、 本発明のタンパク質を介するシグナル情報伝達作用、 消化管 （例、 腸管） 収縮活性 などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質であることを 示す。 したがって、 本発明のタンパク質に対する結合活性、 本発明のタンパク質を 介するシグナル情報伝達作用、 消化管収縮活性などの活性が同等 （例、 約 0 . 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やペプチドの分子量などの量 的要素は異なっていてもよい。
これらの活性の測定は、 公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後 述するスクリーニング方法などに従っても測定することができる。
また、 本発明のペプチドとしては、 ①配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表 されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好 ましくは 1〜2 0個程度） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 2 0 または配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜4 0個程度、 より好ましくは 1〜3 0個程度、 なかでも好ましくは 1〜2 0個 程度） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜2 0個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸 配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなども用い られる。
本発明のぺプチドとして好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物、 さらに好ま しくはヒト由来のペプチドである。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 例えば、'配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙 げられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有す るタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパ ク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作 用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質であること を示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等 (例、 約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に準 じて行なうことができるが、 例えば、 後述の決定方法やスクリーニング方法に従つ ても測定することができる。
以下、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質を Z AQと 記載することがある。
また、 本発明のタンパク質としては、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個 程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1また は 2個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1 ~ 3 0個程度、 より好ましくは 1 〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ 酸で置換されたァミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァミノ酸配列を含有 するタンパク質なども用いられる。
配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と約 9 0 %以上、 好ましく は約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列など 力 ί挙げられる。
配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 3 6で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 6で表わ されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク 質などが好ましく、 具体的には WO 9 8 / 4 6 6 2 0に記載のタンパク質などが挙 げられる。
配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列と約 9 7 %以上、 好ましく は約 9 8 %以上、 より好ましくは約 9 9 %以上、 最も好ましくは約 9 9 . 5 %以上 の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 0で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 0で表わ されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク 質などが好ましい。
配列番号： 4 7で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 4 7で表わされるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ましく は約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以上の相 同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 7で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 7で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 7で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 4 7で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 7で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 7で表わ されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク 質などが好ましい。
配列番号： 4 8で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 4 8で表わされるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ましく は約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以上の相 同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 8で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 8で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 8で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 4 8で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 8で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 8で表わ されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク 質などが好ましく、 具体的には、 Biochem. Biophys. Acta, 1491巻、 369- 375頁、 20 00年に記載の夕ンパク質などが挙げられる。
配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と約 9 5 %以上、 好ましく は約 9 6 %以上、 より好ましくは約 9 7 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以上の相 同性を有するァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 4 9で表わされるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4 9で表わ されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク 質などが好ましく、 具体的には WO 9 8 / 4 6 6 2 0に記載のタンパク質などが挙 げられる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作 用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質であること を示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等 (例、 約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に準 じて行なうことができる。
配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 配列番号： 3 4で表わされるアミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 % 以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 最も好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有す るァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 3 4で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 3 4で表わされるアミノ酸 配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 3 4で表わさ れるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性 （例、 回腸収縮作用、 遠位大腸収縮作用、 近位大腸弛緩作用など） を有するペプチドなどが好ましく、 具 体的には後述の M I T 1などが挙げられる。
本明細書におけるペプチドおよびタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左 端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号 ： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする本発明のタン パク質は、 C末端が力ルポキシル基 （― C O OH) 、 カルポキシレート（一 C O O— ) 、 アミド （—C ONH2) またはエステル （—C O O R) の何れであってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの ( 。_ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ一ナフ チルなどの C 6 ^ 2ァリ一ル基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C i _ 2ァルキル基もしくは Q!—ナフチルメチルなどのひ一ナフチル— Cェ _ 2アルキル基 などの C 7— 1 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォ キシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチド ·タンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキ シレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されて いるものも本発明のペプチド ·タンパク質に含まれる。 この場合のエステルとして は、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のペプチド ·タンパク質には、 上記したペプチド ·タンパク質に おいて、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセ チル基などの C 2_ 6アルカノィル基などの Cェ— 6ァシル基など） で保護されているも の、 N端側が生体内で切断され生成したダル夕ミル基がピ口ダル夕ミン酸化したも の、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 — OH、 — S H、 アミノ基、 ィ ミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホル ミル基、 ァセチル基などの C 2_ 6アルカノィル基などの — 6ァシル基など） で保護 されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド ·糖タンパク質など の複合ペプチド ·複合タンパク質なども含まれる。
本発明のペプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 2 0で表わされるアミ ノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト脳由来） のペプチド、 または配 列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト 脳由来） のペプチドなどがあげられる。 さらに好ましくは、 配列番号： 2 1で表わ されるァミノ酸配列を含有するヒト由来のぺプチドなどがあげられる。
本発明のタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列を含有するヒト由来 （より好ましくはヒト脳由来） のタンパク質などがあ げられる。
本発明のタンパク質の部分ペプチド （以下、 本発明の部分ペプチドと略記する場 合がある） としては、 上記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであれば何れの ものであってもよいが、 例えば、 本発明のタンパク質分子のうち、 細胞膜の外に露 出している部位であって、 実質的に同質のリガンド結合活性を有するものなどが用 いられる。
具 ： '的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質の部 分ペプチドとしては、 図 7で示される疎水性プロット解析において細胞外領域 （親 水性 （Hydrophi l ic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。 個 々のドメインを個別に含むぺプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部 分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明のタンパク質の構成ァ ミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好まし くは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上 、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質のリガンド結合活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実 質的に同質のリガンド結合活性」 の測定は公知の方法に準じて行なうことができる また、 本発明の部分ペプチドは、 前記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ま しくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個 程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個程度、 さらに好ましくは数個 （1ま たは 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （一 C O OH) 、 力ルポ キシレート （一 C〇〇_) 、 アミド （一 C ONH2) またはエステル （—C O O R) の何れであってもよい。 本発明の部分ペプチドが C末端以外に力ルポキシル基 （ま たはカルボキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエス テル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルと しては、 例えば前記した C末端のエステルなどが用いられる。 さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のタンパク質と同様に、 N 末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内 で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側 鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわ ゆる糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
配列番号： 3 6、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8または配列 番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した配列番号： 3 6、 配列番号 : 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8または配列番号： 4 9で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分べ プチドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 タンパク質分子のうち、 細 胞膜の外に露出している部位であって、 実質的に同質のリガンド結合活性を有する ものなどが用いられる。 当該部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記タンパク質の構 成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好まし くは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい。 実質的に同 一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 7 0 % 以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好まし くは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
本発明のぺプチドまたは本発明のタンパク質もしくはその部分べプチド等の塩と しては、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては 、 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有 機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒 石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホ ン酸） との塩などが用いられる。
本発明のペプチドもしくはタンパク質またはその塩、 および配列番号： 3 6、 配 列番号： 4 0もしくは配列番号： 4 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の細胞または組織から公知のペプチド •タンパク質の精製方法によって製造することもできるし、 後述する本発明のぺプ チド、 本発明のタンパク質、 配列番号： 3 6、 配列番号： 4 0または配列番号： 4 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D NAを含有する形 質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド
•タンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。 さらに、 配列番号 ： 4 8で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩は、 Biochem. Bi ophys. Acta, 1491巻、 369- 375頁、 2000年に記載の方法に準じて製造できる。 配列 番号： 4 9で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩は、 WO 9 8 / 4 6 6 2 0に記載の方法に準じて製造できる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織また は細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 当該抽出液を逆相クロマト グラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わ せることにより精製単離することができる。
本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ れらのアミド体またはそれらの塩の合成には、 通常市販のペプチド ·タンパク質合 成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル 樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 —ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂 、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポ リアクリルアミド樹脂、 4 _ ( 2， , 4， 一ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチ ル） フエノキシ樹脂、 4一 （2， ， 4， 一ジメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエ チル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ一ァ ミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチド ·タンパク 質の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に 樹脂からペプチド ·タンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高 希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のペプチド ·タンパ ク質またはそれらのアミド体を取得する。
前記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド ·タンパク質合成に使用でき る各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カル ポジイミド類としては、 D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N— ェチルー N ' ― ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる 。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HO B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ペプチド ·夕 ンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例 えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチ ルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭 化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テ卜ラヒドロフランなどのエーテル 類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチ ルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は タンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され 、 通常約一 2 0 ：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導 体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことによ り十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られない ときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチ ル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 夕ーシャリーペンチル ォキシカルボニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシ 力ルポニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロ ァセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニル ホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プ 口ピル、 ブチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロ ヘプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状 アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口ベンジルェ ステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシカ ルポニルヒドラジド化、 夕一シャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチル ヒドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護すること ができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低級ァ ルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 ェ トキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテ ル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル基、 t -プチ ル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz し C 12-B z し 2—二トロベンジル、 B r— Z、 ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキシー 2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 B um、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水物 、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4 ， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4ージニトロフエノール、 シァノメチルアルコ ール、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N—ヒドロ キシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のアミノ基 の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素など の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混 合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺ リジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによる 還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 20°C〜40°C の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チ オアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフイド、 1， 4_ ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加 が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2， 4一 ジニト口フエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのイン ドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナト リウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護、 保護基の脱離、 および反応に関与 する官能基の活性化などは公知の手段から、 官能基の保護に用いる保護基は公知の 基からそれぞれ適宜選択され、 適用される。
ペプチド ·タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カル ポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側 にべプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 当該べプチド鎖の Ν末端の 0!—ァミノ 基の保護基のみを除いたペプチド ·タンパク質と C末端の力ルポキシル基の保護基 のみを除去したペプチド ·タンパク質とを製造し、 この両ペプチド '両タンパク質 を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様 である。 縮合により得られた保護ペプチド ·保護タンパク質を精製した後、 上記方 法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ペプチド ·粗タンパク質を得ることが できる。 この粗ペプチド ·粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチド ·タンパク質のアミド体を得ること ができる。
ペプチド ·タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ 酸の 0!—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後 、 ペプチド ·タンパク質のアミド体と同様にして、 所望のペプチド ·タンパク質の エステル体を得ることができる。
本発明のペプチドは、 公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。 また、 本発明のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のペプチドの合成 法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダ一ゼで切断することに よって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによって も良い。 すなわち、 本発明のペプチドもしくは本発明のタンパク質を構成し得る部 分ペプチドまたはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合 は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮 合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が挙げら れる。
( M. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t i, ペプチド シンセシス （Pept ide Synthes is) , Intersc ience Publ ishers, New York (1966年）
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (197 7年）
⑤矢島洽明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドま たは本発明の部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるぺプ チドまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変 換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変 換することができる。
本発明のペプチド ·タンパク質をコードする D NAとしては、 前述した本発明の ペプチド ·タンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるもの であってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリ一、 前記した細胞 •組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライプラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ 、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記し た細胞 ·組織より total RNAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reve rse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する ) によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明のペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号 ： 2 6または配列番号： 2 7で表わされる塩基配列を含有する D NA、 または配列 番号： 26または配列番号： 27で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DN Aを含有し、 本発明のペプチド と実質的に同質の活性 （例、 本発明のタンパク質に対する結合活性、 本発明のタン パク質を介するシグナル情報伝達作用、 消化管 （例、 腸管） 収縮活性など） を有す るペプチドをコードする DNAであれば何れのものでもよい。
配列番号： 26で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 2 8で表わされる塩基配列を含有する D N A等が挙げられる。
配列番号： 26で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイス卜リンジェン卜 な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 26で表わさ れる塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80% 以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 27で表わされる塩基配列を含有する DNAとしては、 配列番号： 2 9で表わされる塩基配列を含有する D N A等が挙げられる。
配列番号： 27で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 27で表わさ れる塩基配列と約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80% 以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
また、 本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2 または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2 または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする DN Aを含有し、 本発明のタンパク質と実質的に 同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するタンパ ク質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイ ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aとしては、 例えば、 配列番 号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列と約 90%以上、 好ましくは約 9 5%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モ レキユラ一 ·クローニング （Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる 。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従 つて行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な条件に従って 行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 O mM 、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6◦〜 6 5 の条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が 最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 2 0で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド をコードする D NAとしては、 配列番号： 2 6で表わされる塩基配列を含有する D NAがあげられ、 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドを コードする D NAとしては、 配列番号： 2 7で表わされる塩基配列を含有する D N Aがあげられ、 配列番号： 2 2で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ ードする DNAとしては、 配列番号： 2 8で表わされる塩基配列を含有する D N A があげられ、 配列番号： 2 3で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドをコ一 ドする D NAとしては、 配列番号： 2 9で表わされる塩基配列を含有する D NAが あげられる。
また、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る D NAとしては、 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有 する D N Aがあげられる。
本発明のペプチドをコードする D NAの塩基配列と相補的な塩基配列またはその 一部を含有してなるヌクレオチド （オリゴヌクレオチド） とは、 本発明のペプチド をコードする D NAを包含するだけではなく、 R NAをも包含する意味で用いられ る。
本発明に従えば、 本発明のぺプチドの遺伝子の複製又は発現を阻害することので きるアンチセンス， （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） を、 クローン化したあるいは 決定されたペプチドをコードする D N Aの塩基配列の塩基配列情報に基づき設計し 、 合成しうる。 そうした （オリゴ） ヌクレオチド （核酸） は、 本発明のペプチドの 遺伝子の R NAとハイブリダィズすることができ、 当該 R N Aの合成又は機能を阻 害することができるか、 あるいは本発明のぺプチド関連 R N Aとの相互作用を介し て本発明のぺプチドの遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のぺプ チド関連 R NAの選択された配列に相補的な （オリゴ） ヌクレオチド、 及び本発明 のペプチド関連 R NAと特異的にハイブリダィズすることができる （オリゴ） ヌク レオチドは、 生体内及び生体外で本発明のぺプチドの遺伝子の発現を調節 ·制御す るのに有用であり、 また病気などの治療又は診断に有用である。
用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核酸の特定 の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩 基配列又は核酸とペプチドとの間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配 列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチドのアミノ酸を通常指している 。 本発明のペプチドの遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6—べ一スペア · リ ピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域 、 O R F翻訳開始コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 及び 3 ' 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 本発明のペプチドの 遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と対象領域の少なくとも一部に相補的な （オリゴ） ヌクレオチドとの関 係、 すなわち対象物とハイブリダィズすることができる （オリゴ） ヌクレオチドと の関係は、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス · （オリゴ ) ヌクレオチドは、 2—デォキシ一 D—リポースを含有しているポリデォキシヌク レオチド、 D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 プリン又はピリミジン 塩基の N—ダリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌク レオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販のタンパク質核酸及び合成 配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 当該ポリマーは D NAや R N A中に見出されるような塩基のペアリナグゃ塩基の付 着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA : R N Aハイプリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリ ゴヌクレオチド、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られ た標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然 のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホル アミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合又は硫黄含有結合 (例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォェ一卜など） を持つもの、 例えば タンパク質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレアーゼ ·インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグ ナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） な どの側鎖基を有しているもの、 インタ一カレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プ ソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属 、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修 飾された結合を持つもの （例えば、 ひァノマー型の核酸など） であってもよい。 こ こで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核酸」 とは、 プリン及びピリミジ ン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなもの を含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリン及びピリミジン、 ァ シル化されたプリン及びピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであって よい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾さ れていてよく、 例えば 1個以上の水酸基がハロゲンと力 脂肪族基などで置換され ていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス核酸は、 R NA、 D NA、 あるいは修飾された核酸である 。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のもの が挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次 のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸を より安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とする センス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアン チセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Ka akami et al. , Ph arm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8， pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al. ed. , Ant isense Research and Appl icat ions, CRC Press, 1993 などに開示が ある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合 を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与され たり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることができう る。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を中和する ように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピッド、 コレステロ一 ルなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメート、 コール酸 など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させる ことができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができう る。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキヤ ップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 RN a s eなどのヌクレアーゼによる分解を 阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレ ングリコール、 テトラエチレングリコ一ルなどのグリコールをはじめとした当該分 野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。 アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体外 の遺伝子発現系、 あるいはタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べるこ とができる。 当該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする D NAとしては、 前述した本発明の部分ぺプ チドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D N Aのいずれでも よい。 ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chai n React ion (以下、 R T— P C R法と略称する） によって増幅することもできる。 具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列 番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNAの部分塩基配 列を含有する D NA、 または②配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基 配列を含有する D NAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aを含有し、 本発明のタンパク質ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド結 合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するタンパク質をコードする D NAの部 分塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する D NAとハイ ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D NAとしては、 例えば、 配列番 号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列と約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上、 より好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明のペプチドを完全にコードする D NAのクローニングの手段としては、 本 発明のペプチドをコードする D NAの塩基配列の部分塩基配列を含有する合成 D N Aプライマーを用いて P C R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み 込んだ D NAを本発明のペプチドの一部あるいは全領域をコードする D N A断片も しくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシヨンによつて選別 することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー *ク ローニング (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販の ライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこと ができる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のタンパク質と略記 する） を完全にコードする D NAのクローニングも本発明のペプチドを完全にコ一 ドする D NAのクロ一ニングと同様にして行うことができる。
D NAの塩基配列の変換は、 P C Rや公知のキット、 例えば、 Mutan™-super Expr ess Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA- LA PCR法や G apped dup lex法や Kunke 1法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従つて行 なうことができる。
クローン化されたペプチド ·タンパク質をコードする D NAは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用する ことができる。 当該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有 し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有 していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNA アダプターを用いて付加することもできる。
本発明のペプチド ·タンパク質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のぺプ チド ·タンパク質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口 ) 当該 DNA断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することに より製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322, pBR 325 ， pUC 12， pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110， pT Ρ 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH15) 、 入フ ァージなどのバクテリオファ一ジ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュ ロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 pXTl、 pRcZCM V、 pRcZRSV、 p cDNAI/Ne o、 p c DNA3. 1、 pRc/CMV 2、 pRc/RSV (Invitrogen社） などが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応し て適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿主と して用いる場合は、 SRcuプロモ一夕一、 SV40プロモーター、 HI V- LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモータ一などが挙げられる。 これらのうち、 CMVプロモーター、 SR c¾プロモーターなどを用いるのが好ま しい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l acプロモ 一ター、 r e cAプロモータ一、 λΡ^プロモーター、 1 ρ ρプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモータ一、 SPO 2プロモーター 、 p e nPプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモー夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターな どが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシグ ナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以下、 SV4 0 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることができる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称す る場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺 伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 N e orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 CHO (dh f r-) 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝 子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端 末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 P h o A ·シグナル配列 、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひーァミラ —ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合 は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である 場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 —イン夕一フエロン 'シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチド ·タンパク質をコードする DNAを 含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆 虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia col i) K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ.ォブ ·ザ ·ナショナル.アカデミー ·ォブ · サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. . Sci. USA) ， 6 0巻， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック 'ァシッズ'リサーチ， （N ucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 ， J Α221 〔ジャーナル · ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology) , 120巻 , 517 (1978)〕 ， ΗΒ 101 〔ジャーナル.ォブ ·モレキュラー 'バイオ口 ジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジェネティックス （Genetics) , 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サチルス （Bacillus subtilis) MI 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナル ·ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1984)〕 な どが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレビシェ （Saccliaromyces cerevis iae) AH 22， AH22R -， NA 87— 11 A, DKD - 5D， 20B_12、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ （Schizosaccharomyces ponbe) NCYC 1913， NCYC2036、 ピキア ·パストリス （Pichia pastoris) などが用いられる。 昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが AcNPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由来 株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S ί細胞) 、 Tric oplusia niの中腸由来 の MGl細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由 来の細胞または Estiginena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） などが用いられる。 当 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （A C CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上 、 Vaughn, J.L.ら、 イン 'ヴィポ (In Vivo) ， 13， 213-217, (1977)) などが用いら れる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー （N ature) ， 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Ve r o, チャイニーズハム スター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20, マウスミエローマ細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などが 用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ · ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Pro Natl. Acad. . Sci. USA) ， 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) ， 17 巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジェネラル •ジエネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 111 (19 79)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ ·イン ·ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology) , 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシ一ジングズ · ォプ ·ザ ·ナショナル .アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 ( 1978 )などに記載の 方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー （Bio/T echnology) 、 6、 47 -55 (1988) ) などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実験プロ トコ一ル. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー （Virology ) ， 52巻， 456 (1973) に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 Gタンパク質共役型タンパク質をコードする DNAを含有する 発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に 使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には当該形質転換体の生育 に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例 えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例 えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチ一プ'リカー、 ペプトン、 カゼィ ン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物とし ては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなど が挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよ レ^ 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) ， ジャーナル *ォブ ·ェクスペリメンッ ·ィ ン ·モレキュラー ·ジエネティックス （Journal of Experiments in Molecular Gen etics) , 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモ一ターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 /3—インドリルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43でで約 3〜 24時間行 ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。 宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行ない 、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホー ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 「プロシージングズ.ォブ- ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォプ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （P roc. Natl. Acad. . Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5%カザミ ノ酸を含有する SD培地 〔BiUer， G. A. ら、 「プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ .ザ ·ユーエスエー （Proc. N atl. Acad. . Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20 °C〜 35 °Cで約 24〜 72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace ' s Insect Medium (Grace, T. C.，ネイチヤー (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動 化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pH は約 6 · 2〜 6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日間 行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻， 396 (1959 )〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン .メディカル . アソシエーション （The Journal of the American Medical Association) 199巻 ， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング.ォブ.ザ.ソサイエティ - フォー ·ザ ·バイオロジカル'メディスン （Proceeding of the Society for the B iological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30° (：〜 40°Cで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のぺプチ ド ·タンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のペプチド ·タンパク質を分離精製するには、 例えば、 下 記の方法により行なうことができる。
本発明のペプチド ·タンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては 、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊 したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い られる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X— 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にペプチド ·タン パク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と上清 とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるペプチド ·タン パク質の精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル 電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフ ィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの特 異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を 利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ る。
このようにして得られるペプチド ·タンパク質が遊離体で得られた場合には、 公 知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得 られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩 に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するペプチド ·タンパク質を、 精製前または精製後に適当 なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ペプチド ·ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモ卜リプシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロティ ンキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のペプチドの活性は、 標識した本発明のペプチド と本発明のタンパク質との結合実験および特異抗体を J セィなどにより測定することができる。
また、 生成する本発明のタンパク質の活性は、 標識した本発明のペプチドとの結 合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定すること ができる。
本発明のぺプチドまたは本発明のタンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ れらの塩に対する抗体は、 本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質もしくはそ の部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体 、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ れらの塩 （以下、 本発明のペプチド ·タンパク質等と略記する場合がある） に対す る抗体は、 本発明のペプチド ·タンパク質等を抗原として用い、 公知の抗体または 抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のペプチド ·タンパク質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可 能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体 産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行なわ れる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラッ卜が好ましく用 いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例 えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓ま たはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる ことにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。 抗 血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化した本発明のペプチド ·タンパク 質等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することに より行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタイ ンの方法 〔ネイチヤー （Nature) , 2 5 6巻、 4 9 5頁 （1 9 7 5年） 〕 に従い実施 することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PE G) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP2/0などが挙げられ るが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と 骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましく は、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間ィンキュベ一卜するこ とにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使用 できるが、 例えば、 本発明のペプチド，タンパク質等抗原を直接あるいは担体とと もに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し 、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用いら れる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロ ブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加 し、 放射性物質や酵素などで標識した本発明のペプチド ·タンパク質等を加え、 固 相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうこ とができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添 加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培地としては 、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば 、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む； RPMI 1640培地 、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） またはハイブ リドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ） などを用いること ができる。 培養温度は、 通常 20〜40で、 好ましくは約 37°Cである。 培養時間 は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸 ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清 中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様 に免疫グロプリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過 法、 抗原結合固相またはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤によ り抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なう ことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製 造することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のペプチド ·タンパク質等の抗原 ) とキャリアータンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造 法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 当該免疫動物から本発明のペプチド ·タンパ ク質等に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造で さる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合 体に関し、 キャリア一タンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は 、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 ど の様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ·リンぺッ卜 ·へモシァニン等を重量比でハプ テン 1に対し、 約 0. 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力プルさせる方法が用 いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることがで きるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チォ一 ル基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担 体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロ ィントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好 ましくは血液から採取することができる。 抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同様 にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル抗体 の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。 本発明のペプチド、 本発明のペプチドをコードする D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） および本発明のペプチドに対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） は、 ①本発明のペプチドが関与する各種疾病の予防 · 治療剤、 ②本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング、 ③本発明のペプチドまたはその塩の定量、 ④遺伝 子診断剤、 ⑤アンチセンス D NAを含有する医薬、 ⑥本発明の抗体を含有する医薬 、 ⑦本発明の D NAを含有する非ヒト動物の作出、 ⑧構造的に類似したリガンド - 受容体との比較にもとづいたドラッグデザィン、 などの実施のために有用である。 特に、 本発明の組換えタンパク質の発現系を用いた受容体結合アツセィ系を用い ることによって、 ヒ卜や哺乳動物に特異的な本発明のタンパク質に対するリガンド の結合性を変化させる化合物 （例、 Z AQァゴニスト、 Z AQアンタゴニストなど ) をスクリーニングすることができ、 当該ァゴニストまたはアン夕ゴニストを各種 疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
本発明のペプチド、 本発明の D N Aおよび本発明の抗体の用途について、 以下に 具体的に説明する。
( 1 ) 本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療 ·予防剤
後述の実施例に記載したように、 本発明のペプチドは、 生体内で液性因子として 存在し、 本発明のタンパク質を活性化し、 本発明のタンパク質を発現した細胞の細 胞内 C a 2 +イオン濃度を上昇させることから、 本発明のタンパク質 （Gタンパク質 共役型受容体） のリガンドであることが明らかとなった。
また、 本発明のペプチドは、 へビ毒 Mamba Intest inal Toxin 1 (M I T 1と略称 することもある；配列番号： 3 4 ; Toxicon、 28巻、 847-856頁、 1990年； FEBS Let t ers、 461卷、 183 - 188頁、 1999年） とアミノ酸レベルで約 5 6 %の相同性が認めら れる。
M I T 1は回腸や遠位大腸の収縮、 あるいは近位大腸の弛緩を引き起こし、 その 程度は 40 塩化カリウムに匹敵するほど強いことが報告されている （FEBS Let ters 、 461巻、 183-188頁、 1999年） が、 その作用点や作用メカニズムは解明されていな かった。 本発明者らは M I T 1の作用も本発明のタンパク質を介して発現されてい ることを明らかにした。
以上のことから、 本発明のペプチドは、 腸管全体の収縮あるいは弛緩を引き起こ し、 腸管の運動 （消化活動） などを制御する活性を有する （例、 後述の実施例 1 1 ) 。 したがって、 本発明の D NA等が欠損している場合あるいは発現量が異常に減 少している場合、 例えば、 消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候 群など） 等、 種々の疾病が発症する。
したがって、 本発明のペプチドおよび本発明の D NAは例.えば、 消化器疾患 （例 えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） 等、 種々の疾病の治療 ·予防剤等 の医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明のぺプチドが減少あるいは欠損しているために、 本発明のタンパク質が発現している細胞における情報伝達が十分に、 あるいは正常 に発揮されない患者がいる場合に、 （ィ） 本発明の D NAを当該患者に投与し、 生 体内で本発明のペプチドを発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D N A を挿入し、 本発明のペプチドを発現させた後に、 当該細胞を患者に移植することに よって、 または （八） 本発明のペプチドを当該患者に投与すること等によって、 当 該患者における本発明のぺプチドの役割を十分に、 あるいは正常に発揮させること ができる。
本発明の D NAを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 当該 D NAを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソ シエーテツドウィルスベクタ一等の適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従つ て、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D NAは、 そのままで 、 あるいは摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化 し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 本発明のペプチドを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 少なくとも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましくは 9 9 % 以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のペプチドは、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 ェ リキシル剤、 マイクロカプセル剤等として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外 の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口 的に使用できる。 例えば、 本発明のペプチドを生理学的に認められる担体、 香味剤 、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤等とともに一般に認められた製剤実 施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これ ら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするも のである。
錠剤、 カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチン 、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セルロース のような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸等のような膨化剤、 ステ アリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘 味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤等が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂のような 液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用水のようなベ ヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油等のような天然産出植物油等を溶解または懸 濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウム等） 等 が挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノール等） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール等） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0™、 H C O— 5 0等） 等と併用 してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が挙げられ、 溶解補助剤 として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等と併用してもよい。 また、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液等） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化 ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力イン等） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコール等） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノール 等） 、 酸化防止剤等と配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプ ルに充填される。
本発明の D NAが挿入されたべクタ一も上記と同様に製剤化され、 通常、 非経口 的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 （ 例えばヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して投与することができる。
本発明のペプチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルート等により差異は あるが、 例えば、 消化器疾患の治療目的で本発明のペプチドを経口投与する場合、 一般的に成人 （60 kgとして） においては、 一日につき本発明のペプチドを約 1 mg〜1000mg、 好ましくは約 10〜500mg、 より好ましくは約 10〜 2 O Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 本発明のペプチドの 1回投与量は 投与対象、 対象疾患等によっても異なるが、 例えば、 消化器疾患の治療目的で本発 明のペプチドを注射剤の形で成人 （体重 6 O kgとして） に投与する場合、 一日に つき当該ペプチドを約 1〜100 Omg程度、 好ましくは約 1〜20 Omg程度、 より好ましくは約 10〜10 Omg程度を患部に注射することにより投与するのが 好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することが できる。
( 2 ) 本発明のぺプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング
本発明のぺプチドおよび本発明のタンパク質ならびに部分べプチドを用いること を特徴とする、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化 合物またはその塩のスクリーニング方法、 または本発明のペプチドおよび本発明の タンパク質を用いることを特徴とする本発明のペプチドと本発明のタンパク質との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット （以下、 本発明 のスクリーニング方法、 本発明のスクリーニング用キットと略記する） について以 下に詳述する。
本発明のタンパク質を用いるか、 または組換え型本発明のタンパク質の発現系を 構築し、 当該発現系を用いた本発明のペプチドとの結合アツセィ系 （リガンド -受 容体アツセィ系） を用いることによって、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質 との結合性を変化させる化合物、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合 性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物など） またはその塩をスクリーニングすることができる。 このような化合物には、 本発明のタンパク質を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァ ラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク 質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制す る活性など） を有する化合物 （Z AQァゴニスト） と当該細胞刺激活性を有しない 化合物 （Z AQアンタゴニスト） などが含まれる。 「本発明のペプチドと本発明の タンパク質との結合性を変化させる」 とは、 本発明のペプチドと本発明のタンパク 質との結合を阻害する場合と促進する場合の両方を包含するものである。
すなわち、 本発明は、 （i) 本発明のタンパク質に、 本発明のペプチドを接触させ た場合と （i i) 上記した本発明のタンパク質に、 本発明のペプチドおよび試験化合 物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチドと本発明 のタンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を 提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i) 上記した本発明のタンパク質に本 発明のペプチドを接触させた場合と （i i) 上記した本発明のタンパク質に本発明の ペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、 例えば当該本発明のタンパ ク質に対する本発明のペプチドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して比較する。 本発明のスクリーニング方法は具体的には、
①標識した本発明のペプチドを、 上記した本発明のタンパク質に接触させた場合と 、 標識した本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明のタンパク質に接触させた 場合における、 標識した本発明のペプチドの本発明のタンパク質に対する結合量を 測定し、 比較することを特徴とする本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結 合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②標識した本発明のペプチドを本発明のタンパク質を含有する細胞または当該細胞 の膜画分に接触させた場合と、 標識した本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発 明のタンパク質を含有する細胞または当該細胞の膜画分に接触させた場合における 、 標識した本発明のぺプチドの当該細胞または当該膜画分に対する結合量を測定し 比較することを特徴とする、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識した本発明のペプチドを、 本発明のタンパク質をコードする D NAを含有す る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のタンパク質に接 触させた場合と、 標識した本発明のぺプチドおよび試験化合物を本発明のタンパク 質をコードする D NAを含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発 現した本発明のタンパク質に接触させた場合における、 標識した本発明のペプチド の本発明のタンパク質に対する結合量を測定し比較することを特徴とする、 本発明 のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
④本発明のペプチドを本発明のタンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、 本 発明のペプチドおよび試験化合物を本発明のタンパク質を含有する細胞に接触させ た場合における、 本発明のタンパク質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン 酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン 酸化、 c— ί o sの活性化、 ρ Ηの低下などを促進する活性または抑制する活性な ど） を測定し、 比較することを特徴とする本発明のペプチドと本発明のタンパク質 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および ⑤本発明のペプチドを、 本発明のタンパク質をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のタンパク質に接触させた 場合と、 本発明のペプチドおよび試験化合物を、 本発明のタンパク質をコードする D NAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の タンパク質に接触させた場合における、 本発明のタンパク質を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性 または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする本発明のペプチド と本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法などである。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。 まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のタンパク質としては、 上記 の本発明のタンパク質を含有するものであれば何れのものであってもよい。 しかし 、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用いられ るものとしては、 組換え体を用いて大量発現させた本発明のタンパク質などが適し ている。
本発明のタンパク質を製造するには、 前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質を含有する細胞ある いは当該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
本発明のタンパク質を含有する細胞を用いる場合、 当該細胞をダルタルアルデヒ ド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行うこ とができる。
本発明のタンパク質を含有する細胞としては、 本発明のタンパク質を発現した宿 主細胞をいうが、 当該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞 、 動物細胞などがあげられる。
膜画分としては、 細胞を破碎した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれ る画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモジナイザ 一で細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン （Kinemat ica社製） による破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノ ズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠 心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m~ 3 0 0 0 0 r p m ) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 当該膜画分中には 、 発現した本発明のタンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分 が多く含まれる。
当該本発明のタンパク質を含有する細胞や膜画分中の本発明のタンパク質の量は 、 1細胞当たり 1 0 3〜1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜1 0 7分子であるの が好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性 ) が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一 ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物をスクリ —ニングする前記の①〜③を実施するためには、 適当な本発明のタンパク質画分と 、 標識した本発明のペプチドが用いられる。 本発明のタンパク質を含む画分として は、 天然型の本発明のタンパク質を含む画分か、 またはそれと同等の活性を有する 組換え型の本発明のタンパク質を含む画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性と は、 同等のリガンド結合活性などを示す。 標識した本発明のペプチドとしては、 例 えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識された本発明のぺプチ ドなどを利用することができる。 特に、 ポルトン一ハンター試薬を用いて公知の方 法で調製した本発明のペプチドの標識体を利用することもできる。
具体的には、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化 合物のスクリーニングを行うには、 まず本発明のタンパク質を含有する細胞または 細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより受容体 標品を調製する。 バッファ一には、 ； pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン 酸バッファー、 トリス—塩酸バッファ一などのリガンドと受容体との結合を阻害し ないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で 、 CHAPS、 Twe e n- 80™ (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシ コレートなどの界面活性剤をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロテア ーゼによる本発明のタンパク質や本発明のペプチドの分解を抑える目的で PMSF 、 ロイぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一 ゼ阻害剤を添加することもできる。 0.0 lm 1〜： L Om 1の当該受容体溶液に、 一 定量 （5000 c pm〜500000 c m) の標識した本発明のペプチドを添加 し、 同時に 10_4〜10—ェ の試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NS B) を知るために大過剰の未標識の本発明のペプチドを加えた反応チューブも用意 する。 反応は 0°Cから 50°C、 望ましくは 4°Cから 37 で 20分から 24時間、 望ましくは 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同 バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシ ヨンカウンターまたはァーカウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウ ント（BQ) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B。一 NSB) を 1 0 0 %とした時、 特異的結合量 (B - N S B ) が例えば 5 0 %以下になる試験化合 物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、 本発明のタンパク質と本発明のペプチドとの結合を測定する方法として、 B I A c o r e (アマシャムフアルマシアバイオテク社製） を用いることもできる 。 この方法では、 本発明のペプチドを装置に添付のプロトコールに従ったアミノカ ップリング法によってセンサーチップに固定し、 本発明のタンパク質を含有する細 胞または本発明のタンパク質をコードする D NAを含有する形質変換体から精製し た本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を含む膜画分、 あるいは精製した 本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を含む膜画分および試験化合物を含 むリン酸バッファーまたは卜リスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎 分 2 — 2 0 2 1の流量で通過させる。 センサーチップ上の本発明のペプチドと本発 明のタンパク質とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存 する試験化合物が変化させることを観察することによって本発明のタンパク質と本 発明のぺプチドとの結合を変化させる化合物のスクリ一二ングを行なうことができ る。 この方法は、 本発明のタンパク質をセンサーチップに固定し、 本発明のぺプチ ドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたは卜リス バッファ一などの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測 定することができる。 試験化合物としては、 上記と同様のものなどがあげられる。 本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物をスクリ —ニングする前記の④〜⑤の方法を実施するためには、 本発明のタンパク質を介す る細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 + 遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下など を促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キット を用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 本発明のタンパク質を含有す る細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 スクリーニングを行うにあたっては 前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試 験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清 液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の 指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素 によって検定困難な場合は、 当該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行 なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出 することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な本発明のタンパク 質を発現した細胞が用いられる。 本発明のタンパク質を発現した細胞としては、 前 述の組換え型本発明のタンパク質発現細胞株などが望ましい。 形質転換体である本 発明のタンパク質発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。 また、 動 物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげられる 上記のリガンド ·レセプ夕一アツセィ系について、 さらに具体的に記載すると以 下のような （1 ) 〜 （1 2 ) のアツセィ系が用いられる。
( 1 ) 受容体発現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の Gタン パクが活性化されて G T Pが結合する。 この現象は受容体発現細胞の膜画分におい ても観察される。 通常、 G T Pは加水分解されて GD Pへと変化するが、 このとき 反応液中に G T Pァ Sを添加しておくと G T Pァ Sは G T Pと同様に Gタンパクに 結合するが、 加水分解されずに Gタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持され る。 標識した G T Pァ Sを用いると細胞膜に残存した放射活性を測定することによ つて受容体ァゴニス卜の受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。 この反 応を利用して本発明のペプチドの本発明のタンパク質発現細胞に対する刺激活性を 測定することができる。 この方法は、 前記④〜⑤のように本発明のタンパク質を含 む細胞を用いるものではなく、 ①〜③のように本発明のタンパク質を含む膜画分を 用いるアツセィ法であるが、 ④〜⑤のように細胞刺激活性を測定するものであり、 本測定法において本発明のタンパク質を含む膜画分への G T Pァ S結合促進活性を 示す物質はァゴニストである。 ここにおいて、 本発明のペプチドあるいは本発明の ペプチドおよび試験化合物を添加し、 本発明のペプチドの単独投与に比べて本発明 のタンパク質を含む細胞膜画分への G T Pァ S結合促進活性に変化が生じることを 観察することによって本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化さ せる化合物をスクリーニングすることができる。 このとき、 本発明のペプチドによ る本発明のタンパク質を含む細胞膜画分への GTP r S結合促進活性を抑制する活 性を示す化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方
、 試験化合物のみを投与し、 本発明のタンパク質を含む細胞膜画分への GTPrS 結合促進活性を観察することによりァゴニス卜のスクリ一二ングを行なうこともで さる。
スクリ一二ング法の一例についてより具体的に以下に述べる。 本発明のタンパク 質を含む細胞膜画分を、 膜希釈緩衝液 （50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 M GDP, 0.1% BSA pH 7.4) で希釈する。 希釈率は、 本発明のタンパク質の発現量 により異なる。 これを Falcon2053に 0.2mlずつ分注し、 本発明のペプチドあるいは本 発明のペプチドおよび試験化合物を加え、 さらに終濃度 200 pMとなるように [35S]GTP ァ Sを加える。 で 1時間保温した後、 氷冷した洗浄用緩衝液 （50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.1% BSA , 0.05% CHAPS pH 7.4 1.5ml) を加えて、 ガラ ス繊維ろ紙 GFZFでろ過する。 65°C、 30分保温して乾燥後、 液体シンチレ一 シヨンカウン夕一でろ紙上に残つた膜画分に結合した [35S] GTP r Sの放射活性を測定 する。 本発明のペプチドのみを加えた実験区の放射活性を 100%、 本発明のぺプ チドを加えなかった実験区の放射活性を 0 %とし、 本発明のぺプチドによる G T P ァ S結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。 GTPァ S結合促進活性 が例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択す ることができる。
(2) 本発明のタンパク質の発現細胞は本発明のペプチドの刺激によって細胞内 c AMP量が減少する。 この反応を利用して本発明のペプチドの本発明のタンパク 質の発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。
本発明のタンパク質を発現させた種々の動物細胞の c AMP産生量はマウス、 ラ ット、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 c AMP抗体と125 I標識 c AMP (ともに市販品） を使用することによって R I Aあるいは抗 c AMP抗体と 標識 cAM Pとを組み合わせた他の E I A系でも測定することができる。 また抗 c AMP抗体をプロテイン Aあるいは抗 c AMP抗体産生に用いた動物の I gGなど に対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと125 I標識 c A MPとを使用する S PA法による定量も可能である （アマシャムフアルマシアバイ ォテク製のキットを使用する） 。
c AMP産生抑制のアツセィにおいて、 フオルスコリンまたは calcitoninなど細 胞内 c AMP量を増加させるようなリガンドなどによって細胞内 c AMP量を上昇 させ、 本発明のぺプチドまたは本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加すること によって本発明のぺプチドの単独投与による細胞内 c AMP量の抑制が変化するこ とを観察し、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合物の スクリーニングを行なうことができる。 このとき、 本発明のペプチドによる本発明 のタンパク質の発現細胞の c AMP産生抑制活性を阻害する活性を示す化合物を拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを 添加して c AMP産生抑制活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物の スクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。 本発明のタンパク質発現 CH O細胞 （ZAQC— B 1細胞；後述の実施例 3 (3-5) ) を 24穴プレートに 5x1 04 cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0.2mM 3—イソプチルーメチル キサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一 (pH7.4)で洗浄する (以下、 0.2mM 3一イソプチルーメチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含 むハンクスバッファー（pH7.4)を、 反応用バッファーと呼ぶ） 。 その後 0.5mlの反応 用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファーを除き、 新た に 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 2 Mフォルスコリンを含む 0.25ml の反応用バッファーに 1 nMの本発明のペプチドあるいは 1 nMの本発明のペプチドお よび試験化合物を添加したものを細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。 10 0 1の 20 %過塩素酸を加えて反応を停止させ、 次に氷上で 1時間置くことにより 細胞内 c AMPを抽出する。 抽出液中の cAMP量は、 cAMP E I Aキット （ァ マシャムフアルマシアバイオテク） を用いて測定する。 フオルスコリン刺激によつ て産生された cAM P量を 100%とし、 1 nMの本発明のペプチドの添加によって 抑制された c AMP量を 0%として、 本発明のペプチドによる c AMP産生抑制活 性に対する試験化合物の影響を算出する。 本発明のペプチドの活性を阻害して c A MP産生活性が例えば 50 %以上になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質 として選択することができる。
c AMP産生促進活性を測定するには、 フオルスコリンを添加せずに本発明の夕 ンパク質発現 CHO細胞に試験化合物を添加して産生された c AMPを上記の方法 で定量する。
(3) CRE (cAMP response element) を含む DNAを、 ピツカジーン ·ベイシ ックベクターまたはピツカジーン .ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株）
) のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクロ一ニングサイトに挿入し、 これを CR E—レポーター遺伝子べクタ一とする。 CRE—レポーター遺伝子ベクターをトラ ンスフエクシヨンした細胞において、 c AMP上昇を伴う剌激は、 CREを介した ルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘 導する。 つまり、 ルシフェラ一ゼ活性を測定することにより、 CRE—レポーター 遺伝子ベクター導入細胞内の c AMP量の変動を検出することができる。 C R E— レポ一夕一遺伝子べクタ一を本発明のタンパク質発現細胞にトランスフエクシヨン した細胞を利用して本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化 合物のスクリ一二ングを行なうことができる。 具体的なスクリ一ニング法を以下に 記す。
CRE-レポーター遺伝子を導入した本発明のタンパク質発現細胞を 24穴プレ ートに 5xl03 cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0.2 3_イソプチ ルーメチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4) で洗浄する （以下、 0.2mM 3—イソブチル—メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20 HEPESを含むハンクスバッファー（PH7.4)を、 反応用バッファーと呼ぶ） 。 その後 0. 5mlの反応用バッファ一を加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファーを除 き、 新たに 0.25mlの反応用バッファ一を細胞に加えた後、 1 nMの本発明のペプチド あるいは 1 nMの本発明のペプチドおよび試験化合物と 2 Mフォルスコリンを含む 0.2 5mlの反応用バッファ一を細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。 細胞をピツカ ジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋 インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフェラーゼによる発光は、 ルミノメーター、 ？夜体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンタ一により測定する。 本発明 のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合物の影響はルシフェラー ゼによる発光量を本発明のペプチドを単独で投与した場合と比較することによって 測定することができる。 このとき、 本発明のペプチドの投与によりフォルスコリン 刺激による発光量の増加が抑制されるが、 この抑制を回復させる化合物を拮抗阻害 能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し 、 フオルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明のペプチドと同様な抑制を 観察することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファタ一 ゼ、 クロラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラーゼあるいは )3 _ガラクトシ ダーゼを用いることもできる。 これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性 は以下のように市販の測定キッ卜を用いて容易に測定することができる。 アルカリ フォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530によって、 クロラムフエ ニコーレ ·ァセチノレトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyl transferase) 活 性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolainphenicol Acetyl transferase Assay Ki t によって、 ]3—ガラクトシダ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEによって 測定することができる。
( 4 ) 本発明のタンパク質発現細胞は、 本発明のペプチドによる刺激の結果、 ァ ラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。 あらかじめ、 放射活性を有するァラキドン 酸を細胞に取り込ませておくことによって、 この活性を細胞外に放出された放射活 性を測定することによって測定することができる。 このとき、 本発明のペプチドあ るいは本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加して、 本発明のペプチドのァラキ ドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、 本発明のぺプチドと本発 明のタンパク質の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができ る。 このとき、 本発明のペプチドによるァラキドン酸代謝物放出活性を阻害する化 合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 また、 試験化合 物のみを添加し、 本発明のタンパク質発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を調 ベることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともでき る。 本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結合に影響を与える化合物のスクリ —ニング法より具体的に以下に述べる。
本発明のタンパク質発現 CHO細胞を 24穴プレートに 5xl04 cell/wellで播種し 、 24時間培養後、 [¾]ァラキドン酸を 0.25 Ci/wellとなるよう添加する。 [¾]ァ ラキドン酸添加 16時間後、 細胞を 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ 一（PH7.4)で洗浄し、 各 wellに 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー (p H7.4)に溶解した終濃度 10 nMの本発明のペプチドあるいは 10 nMの本発明のペプチド および試験化合物を含むバッファ一 500 / lを添加する。 以降、 0.05% BSAと 20mM H EPESを含むハンクスバッファ一 (pH7.4)を反応用バッファーと呼ぶ。 37°Cで 60分 間インキュベートした後に、 反応液 400 lをシンチレ一夕一に加え、 反応液中に遊 離した [¾]ァラキドン酸代謝'物の量をシンチレーシヨンカウンタ一により測定する
。 本発明のぺプチドの非添加反応バッファーによる培地中の [¾]ァラキドン酸代謝 物の量を 0%とし、 10 nMの本発明のペプチドを添加したときの培地中の [¾]ァラキ ドン酸代謝物の量を 100 %として試験化合物の本発明のぺプチドと本発明のタン パク質の結合に対する影響を算出する。 ァラキドン酸代謝物産生活性が例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ る。
(5) 本発明のタンパク質発現細胞を、 本発明のペプチドにより刺激することに よって細胞内の C a2+イオン濃度が上昇する。 これを利用することによって本発明 のべプチドと本発明のタンパク質の結合に対する試験化合物の影響を調べることが できる。 具体的には、 後述の実施例 3 (3-5) および実施例 5 (5— 3— 4) に 準じた方法で調べることができる。
本発明のタンパク質発現細胞を、 滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、 2日 後、 培養液を 4 mM Fura-2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HB S Sに置換し、 室 温で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュベットにカバーグラスをセッ トし、 蛍光測定器で、 本発明のペプチドあるいは本発明のペプチドおよび試験化合 物を加えたときの励起波長 340 nm及び 380 nmでの 505 nmの蛍光強度の 比の上昇を測定する。 このとき、 本発明のペプチドを単独で投与したときに比べて 試験化合物の添加によって生じる蛍光強度の変化を測定することにより本発明のぺ プチドと本発明のタンパク質の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニング を行なうことができる。
また、 以下のように F L I P R (モレキュラーデバイス社製） を使うこともでき る。 すなわち、 細胞縣濁液に Fluo- 3 AM (同仁化学研究所製） を添加し、 細胞に取り 込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 9 6穴プレートに細胞を播く。 F L I P R装置にセットし、 Fura-2の場合と同様に本発明のペプチドあるいは本発明のぺ プチドおよび試験化合物を加え、 本発明のペプチドを単独で投与したときに比べて 試験化合物の添加によって観測される蛍光強度が変化することを測定することによ り、 本発明のぺプチドと本発明のタンパク質の結合に対して影響を与える化合物の スクリーニングを行なうことができる。
これらにおいて、 本発明のペプチドによる蛍光強度の上昇を抑制する化合物を拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみの 添加による蛍光強度の上昇を観察することによってァゴニス卜のスクリーニングを 行なうこともできる。
本発明のタンパク質発現細胞に、 細胞内 C a 2 +イオンの上昇によって発光するよ うなタンパク質の遺伝子 （例、 aeduorinなど） を共発現させておき、 細胞内 C a 2 + イオン濃度の上昇によって、 当該遺伝子 （例、 aeduorinなど） が C a 2 +結合型とな り発光することを利用して、 本発明のペプチドあるいは本発明のぺプチドおよび試 験化合物を加え、 本発明のペプチドを単独で投与したときに比べて試験化合物の添 加によって観測される発光強度が変化することを測定することにより、 本発明のぺ プチドと本発明のタンパク質の結合に対して影響を与える化合物のスクリ一二ング を行なうことができる。 方法は、 蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様 である。
( 6 ) 受容体を発現する細胞に受容体ァゴニストを添加すると、 細胞内イノシト —ル三リン酸濃度が上昇することが知られている。 本発明のペプチドによって生じ る本発明のタンパク質細胞におけるこの反応を観察することにより本発明のぺプチ ドと本発明のタンパク質の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうこ とができる。 2 4穴プレートに播いて 1日目の細胞に myo- [2- ¾] inositol (2. 5マ イク口 Ci/wel l) を添加した培地中で 1日培養した細胞を、 よく洗浄後、 本発明のぺ プチドあるいは本発明のぺプチドおよび試験化合物を添加した後、 1 0 %過塩素酸 を加え反応を止める。 1. 5 M K0H、 60mM HEPES溶液で中和し、 0. 5mlの AGlx8樹脂 （Bi o- ad) を詰めたカラムに通し、 5πιΜ Na2B03 60 HCOONH 洗浄した後、 1 M HC00NH
4、 0. 1M HC00Hで溶出した放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。 本発明のぺプチドの非添加反応バッファ一による培地中の放射活性を 0 %とし、 本 発明のペプチドを添加したときの培地中の放射活性を 1 0 0 %として試験化合物の 本発明のぺプチドと本発明の夕ンパク質の結合に対する影響を算出する。 イノシ卜 一ル三リン酸産生活性が例えば 5 0 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある 候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみの添加によるイノシ トール Ξリン酸産生上昇を観察することによってァゴニス卜のスクリ一ニングを行 なうこともできる。
( 7 ) T R E (TPA response element) を含む D NAを、 ピツカジーン ·ベイシ ックベクターまたはピツカジーン ·ェンハンサ—ベクター （東洋インキ製造 （株）
' ) のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、 これを T R E—レポーター遺伝子ベクターとする。 T R E—レポーター遺伝子ベクターをトラ ンスフエクシヨンした細胞において、 細胞内 C a 2 +イオン濃度上昇を伴う刺激は、 T R Eを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパ ク質の産生を誘導する。 つまり、 ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 T R E一レポ一夕一遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウムイオン量の変動を検出する ことができる。 T R E—レポ一夕一遺伝子ベクターを本発明のタンパク質発現細胞 にトランスフエク卜した細胞を利用した本発明のペプチドと本発明のタンパク質の 結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
T R E—レポーター遺伝子を導入した本発明のタンパク質発現細胞を 2 4穴プレ 一卜に 5xl03 cel l/wel lで播種し、 4 8時間培養する。 細胞を 0. 05% BSAと 20mM HEP ESを含むハンクスバッファ一（pH7. 4)で洗浄した後、 10 nMの本発明のペプチドある いは 10 nMの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、 3 7 °Cで 6 0分間反応さ せる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶解 液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ) を添加する。 ルシフェラーゼによる発光は 、 ルミノメーター、 夜体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンタ一によ り測定する。 本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合物の 影響は、 ルシフェラーゼによる発光量を本発明のペプチドを単独で投与した場合と 比較することによって測定することができる。 このとき、 本発明のペプチドの投与 により細胞内 C a 2 +イオン濃度の上昇によって発光量が増加するが、 この増加を抑 制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のペプチドと同様な発光量の増加を観察すること によりァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラ一ゼ以外に例えばアルカリフォスファタ一 ゼ、 クロラムフエ二コール ·ァセチル卜ランスフェラーゼあるいは) 3—ガラクトシ ダ一ゼを用いることもできる。 これらのレポ一夕一遺伝子の遺伝子産物の酵素活性 は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。 アルカリ フォスファターゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530によって、 クロラムフエ ニコ一レ ·ァセチルトランスフェラ一ゼ (chloramphenicol acetyl transferase) 活 性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay Ki t によって、 i3—ガラクトシダ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEによって 測定することができる。
( 8 ) 本発明のペプチドに応答した本発明のタンパク質発現細胞は MA Pキナー ゼ活性化によって増殖が観察される。 この増殖を MA Pキナーゼ活性、 チミジン取 り込み、 細胞数測定 （MT Tなど） によって測定することができる。 これを利用し て本発明のぺプチドと本発明の夕ンパク質の結合を変化させる化合物のスクリ一二 ングを行なうことができる。
M A Pキナーゼ活性は、 本発明のぺプチドあるいは本発明のぺプチドおよび試験 化合物を細胞に添加した後、 細胞溶解液から抗 MA Pキナーゼ抗体を用いた免疫沈 降によって MA Pキナーゼ分画を得た後、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Ki t とァ- [32P] -ATPを使用して容易に測定できる。 チミジン取り込み活性は、 本発明の夕 ンパク質発現細胞を播き、 本発明のペプチドあるいは本発明のペプチドおよび試験 化合物を添加した後、 [methy卜3 H] -チミジンを加え、 その後、 細胞内に取り込まれ た標識チミジンの放射活性を細胞を溶解して液体シンチレーシヨンカウンターで計 数することによつて測定することができる。
本発明のタンパク質発現細胞の増殖は、 発現細胞を播き、 本発明のペプチドある いは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した後に MTT (3- (4， 5-dimethyl-2-th iazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-tet razol ium bromide) を添加し、 細胞内に取り込まれ て M T Tが変化した M T Tホルマザンを塩酸酸性としたィソプ口パノールで細胞を 溶解した後、 5 7 0 n mの吸収を測定することによつても測定できる。
本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合物の、 標識チミ ジン取り込み活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
本発明のタンパク質発現細胞を 2 4穴プレートにゥエル当たり 5 0 0 0個まき一 日間培養する。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にする。 本発明のぺプチドあるいは本発明のぺプチドおよび試験化合物を細胞に添加して 2 4時間培養した後、 [methy卜3 H] -チミジンをゥエル当たり 0 . 0 1 5 M B Q添加し 6時間培養する。 細胞を P B Sで洗った後、 メタノールを添加して 1 0分間放置す る。 次に 5 %トリクロ口酢酸を添加して 1 5分間放置後、 固定された細胞を蒸留水 で 4回洗う。 0 . 3 N水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、 溶解液中の放射活性 を液体シンチレ一ションカウンターで測定する。 本発明のペプチドと本発明のタン パク質の結合を変化させる化合物の影響は、 チミジン取り込みによる放射活性の上 昇を本発明のぺプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定すること ができる。 このとき、 本発明のペプチドの投与による放射活性の増加を抑制する化 合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合 物のみを投与し、 本発明のぺプチドと同様な放射活性の増加を観察することにより ァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
( 9 ) 本発明のタンパク質発現細胞に本発明のペプチドを添加すると、 Kチャン ネルが活性化し、 細胞内にある K+イオンが、 細胞外に流出する。 K+イオンと同族 元素である R b +イオンは、 K+イオンと区別無く Kチヤンネルを通つて細胞外に流 出するので、 細胞に標識 Rb ( [ )] )を添加して取り込ませておいた後、 本発明のぺ プチドの刺激によって流出する [8¾b]の流れを測定することで本発明のペプチドの作 用を測定できる。 本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合 物の、 [8¾b]流出活性を利用した具体的なスクリ一ニング法を以下に記す。 .
2 4穴にまいて 2日後の本発明のタンパク質発現細胞を l mCi/mlの86 RbClを含む培 地中で 2時間保温する。 培地をよく洗浄し、 外液中の86 R 1を完全に除く.。 本発明の ぺプチドあるいは本発明のぺプチドおよび試験化合物を細胞に添加して 30分後の 外液を回収し、 ァカウンタ一で放射活性を測定する。 本発明のペプチドと本発明の タンパク質の結合を変化させる化合物の影響は、 [8¾b]流出による放射活性の上昇を 本発明のペプチドを単独で投与した場合と比較することによって測定することがで きる。 このとき、 本発明のペプチドの投与による放射活性の上昇を抑制する化合物 を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物の みを投与し、 本発明のペプチドと同様な放射活性の上昇を観察することによりァゴ ニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
(10) 本発明のタンパク質発現細胞が本発明のペプチドに反応して変化する細 胞外の pH (acidification rate) を Cytosensor装置 （モレキュラーデバイス社） を使用して測定することによって、 本発明のぺプチドの活性を測定することができ る。 Cytosensor装置を利用した、 細胞外 pH変化の測定をすることによる本発明の ペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合物の具体的なスクリ一ニン グ法を以下に記す。
本発明のタンパク質発現細胞を Cytosensor装置用のカプセル内で終夜培養し、 装 置のチャンバ一にセッ卜して細胞外 pHが安定するまで約 2時間 0.1% BSAを含む RPM I 1640培地 （モレキュラーデバイス社製） を灌流させる。 pHが安定した後、 本発 明のぺプチドあるいは本発明のぺプチドおよび試験化合物を含む培地を細胞上に灌 流させることによって生じる培地の pH変化を測定する。 本発明のペプチドと本発 明のタンパク質の結合を変化させる化合物の影響は、 本発明のタンパク質発現細胞 の細胞外 P H変化を本発明のペプチドを単独で投与した場合と比較することによつ て測定することができる。 このとき、 本発明のペプチドの投与による細胞外 pH変 化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のペプチドと同様な細胞外 PH変化を観察 することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
(11) 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) CDhaploid α-mating Type (MAT ) の性フェロモン受容体 S t e 2は Gタンパク質 Gp a 1とカップルしており、 性 フェロモン a— mating factorに応答して MAPキナ一ゼを活性化し、 以下、 F a r 1 (cell-cvcle arrest) および転写活性化因子 S t e 12が活性化される。 S t e 1 2は接合に関与する F U S 1を含む種々のタンパク質の発現を誘導する。 一方、 制御因子 S s t 2は以上の過程に抑制的に機能する。 この系において、 受容体遺伝 子を導入した酵母を作製し、 受容体ァゴニスト刺激によって酵母細胞内のシグナル 伝達系を活性化し、 その結果生じる増殖などの指標を用いた、 受容体ァゴニストと 受容体との反応の測定系の試みが行なわれている （Pausch, M. H. , Trends in Bio t echnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997) ) 。 このような受容体遺伝子導入酵母の 系を利用して本発明のペプチドおよび本発明のタンパク質の結合を変化させる化合 物のスクリーニングを行なうことができる。
MAT α酵母の S t e 2および G p a 1をコードする遺伝子を除去し、 代わりに 本発明のタンパク質の遺伝子および G p a 1— G a i 2融合タンパク質をコードす る遺伝子を導入する。 F a rをコードする遺伝子を除去して cel l- cycle arrestが生 じないようにし、 また、 S s tをコードする遺伝子を除去することによって本発明 のペプチドに対する応答の感度を向上させておく。 さらに、 F U S 1にヒスチジン 生合成遺伝子 H I S 3をつなげた F U S 1— H I S 3遺伝子を導入する。 以上の遺 伝子組換え操作は例えば、 Priceら (Price, L. A. et al. , Molecular and Cel lula r Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995) ) の報告に記載の方法において、 ソマ トス夕チン受容体タイプ 2 ( S S T R 2 ) 遺伝子を本発明のタンパク質の遺伝子に 置き換えて実施することによって容易に行なうことができる。 こうして構築された 形質変換酵母は本発明のタンパク質のリガンドである本発明のペプチドに高感度で 反応し、 その結果 MA Pキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成酵素が合成さ れるようになって、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。 これを利用して、 ヒス チジン欠乏培地での酵母の生育を指標として本発明のペプチドによる本発明のタン パク質発現酵母の応答を観察することができる。
上記のようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養 し、 2xl04 cel l/mlの濃度でヒスチジンを除去した溶解寒天培地に加え、 9x9 cmの角 形シャーレに播く。 寒天が固化した後、 本発明のペプチドあるいは本発明のぺプチ ドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、 3 0 °Cで 3日間培 養する。 本発明のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合物の影響 は、 濾紙の周囲の酵母の生育を本発明のぺプチドを単独で投与した場合と比較する ことによって測定することができる。 このとき、 本発明のペプチドの投与による酵 母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することがで きる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 本発明のペプチドと同様な酵母の生育を観 察することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。 また、 あら かじめ、 寒天培地に本発明のペプチドを添加しておいて滅菌濾紙に試験化合物のみ をしみこませて培養し、 シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受ける ことを観察することによつても本発明のぺプチドと本発明のタンパク質の結合を変 化させる化合物の影響を調べることができる。
( 1 2 ) 本発明のタンパク質の遺伝子 R NAをアフリカッメガエル卵母細胞に注 入し、 本発明のペプチドによって刺激すると細胞内 C a 2 +イオン濃度が上昇して、 calc ium-act ivated chloride currentが生じる。 これを膜電位の変化としてとらえ ることが出来る （K+イオン濃度勾配に変化がある場合も同様） 。 本発明のペプチド によって生じる本発明のタンパク質導入アフリカッメガエル卵母細胞におけるこの 反応を観察することにより本発明のぺプチドと本発明のタンパク質の結合に影響を 与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。
氷冷して動けなくなつた雌のァフリカッメガエルから取り出した、 卵母細胞塊を 、 M B S液 （88mM NaCl， ImM KC1, 0. 4 CaCl2, 0. 33mM Ca (N03) 2, 0. 82mM MgS04 、 2. 4mM NaHC03, 匪 HEPES、 pH7. 4) に溶かしたコラーゲナーゼ (0. 5mg/ml) で卵 塊がほぐれるまで 1 9 °C、 1一 6時間、 1 5 0 r p mで処理する。 外液を M B S液 に置換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュレーターで poly (A) + SLT cRNA (5 0ng/50nl)をマイクロインジェクションする。 本発明のタンパク質 mRNAは、 組織や 細胞から調製しても、 プラスミドから in vi troで転写してもよい。 これを M B S液 中で 2 0 °Cで 3日培養する。 これを Ringer液を流している vol tage damp装置のくぼ みに置き、 電位固定用ガラス微小電極、 電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入 し、 （一）極は、 細胞外に置く。 電位が安定したら、 本発明のペプチドまたは本発明 のべプチドおよび試験化合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。 本発明 のペプチドと本発明のタンパク質の結合を変化させる化合物の影響は、 本発明の夕 ンパク質導入アフリカッメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を本発明のペプチドを 単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。 このとき、 本 発明のペプチドの投与による細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し本発明の ペプチドと同様な細胞膜電位変化を観察することによりァゴニストのスクリーニン グを行なうこともできる。
この系において、 反応を変化量を増大して測定しやすいように各種の Gタンパク 質遺伝子の poly (A)+ RNAを導入することもできる。 また aeciuoriiiのような C a 2+ィ オン存在下で発光を生じるような夕ンパクの遺伝子の poly (A) + RNAを共ィンジェク ションすることにより膜電位変化ではなく発光を観察してこの反応を測定すること もできる。
本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質、 本発明のタンパク質を含 有する細胞、 あるいは本発明のタンパク質を含有する細胞の膜画分、 および本発明 のぺプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものがあげられる。
1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アルブ ミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調 製しても良い。
②本発明のタンパク質の標品
本発明のタンパク質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 XI 05個ノ 穴で継代し、 37°C、 5%C〇2、 95 %a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド '
〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した本発明のペプチド。 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4 あるいは— 20°Cにて保存し、 用 時に測定用緩衝液にて 1 //Mに希釈する。
④リガンド標準液
本発明のペプチドを 0.1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで 1 mMとなるように溶解し、 一 20°Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のタンパク質を発現させた細胞を 、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 ^ 1の測定用緩衝液を各穴に加え る。
② 10_3〜10_1βΜの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本発明のぺプ チドを 加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試 験化合物のかわりに 10_3Mの本発明のペプチドを 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識し た本発明のペプチドを 0.2N NaOH— 1%SDSで溶解し、 4mlの液体シン チレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定し 、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [ (B-NS B) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B 0 ：最大結合量 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる 化合物またはその塩は、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合を変化さ せる （結合を阻害あるいは促進する） 化合物であり、 具体的には本発明のタンパク 質を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩 （いわゆる本発明のタンパク 質のァゴニス卜 （ZAQァゴニスト） ） 、 あるいは当該刺激活性を有しない化合物 (いわゆる本発明のタンパク質のアン夕ゴニスト （ZAQアン夕ゴニスト） ） であ る。 当該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公 知の化合物であってもよい。 上記本発明のタンパク質のァゴニス卜であるかアン夕ゴニス卜であるかの具体的 な評価方法は以下の （i) または （i i) に従えばよい。
(i) 前記①〜③のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツセィを行い 、 本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる （特に、 結合を 阻害する） 化合物を得た後、 当該化合物が上記した本発明のタンパク質を介する細 胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはそ の塩は本発明のタンパク質のァゴニス卜であり、 当該活性を有しない化合物または その塩は本発明のタンパク質のアン夕ゴニストである。
(i i) (a) 試験化合物を本発明のタンパク質を含有する細胞に接触させ、 上記本発 明のタンパク質を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物ま たはその塩は、 本発明のタンパク質のァゴニストである。
(b) 本発明のタンパク質を活性化する化合物 （例えば、 本発明のペプチドまたは本 発明のタンパク質のァゴニス卜など） を本発明のタンパク質を含有する細胞に接触 させた場合と、 本発明のタンパク質を活性化する化合物および試験化合物を本発明 のタンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、 本発明のタンパク質を介 した細胞刺激活性を測定し、 比較する。 本発明のタンパク質を活性化する化合物に よる細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明のタンパク質のアン タゴニス卜である。
当該本発明のタンパク質のァゴニストは、 本発明のタンパク質に対する本発明の ペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 本発明のペプチドと同 様に安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のタンパク質アン夕ゴニストは、 本発明のタンパク質に対する本発明のぺ プチドが有する生理活性を抑制することができるので、 当該受容体活性を抑制する 安全で低毒性な医薬として有用である。
上述のように、 本発明のぺプチドは腸管の収縮などを制御する活性を有すること から、 消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） などの疾病 の治療 ·予防剤等の医薬として使用することができるため、 上記のスクリーニング 方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物のうち、 本発明のタン パク質のァゴニスト （Z AQァゴニスト） は消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘 、 吸収不良性症候群など） などの疾病の治療 ·予防剤などとして用いることができ る。 また、 本発明のタンパク質のアン夕ゴニスト （Z AQアンタゴニスト） は消化 器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） などの疾病の治療 -予 防剤などとして用いることができる。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化 合物の塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例えば、 無 機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性 アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのァ ルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 ならび にアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピリジン、 ピコリン、 2 , 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノールァ ミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N, N ' —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩などがあげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸など との塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル酸 、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホ ン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オルチ ニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えばァスパラ ギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化 合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 上記の本発明のペプチドを医 薬として実施する場合と同様にして実施することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化 合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができる。 例えば、 必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ 以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で 非経口的に使用できる。 例えば、 当該化合物またはその塩を生理学的に認められる 担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認 められた単位用量形態で混和することによつて製造することができる。 これら製剤 における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ る。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン 、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤 、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのよ うな甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用い られる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂 のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用水の ようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出植物油などを 溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがつて処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の捕助薬を含 む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニ] ル、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばエタノール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併 用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として 安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （ 例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血 清アルブミン、 ポリエチレングリコ一ルなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコ ール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は 通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば哺乳動物 （例え ば、 ヒト、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィ ヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリ一二ング用キットを用いて得られる化 合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一 般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1から 1000m g、 好ましくは約 1. 0から 300mg、 より好ましくは約 3. 0から 50mgで ある。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の消化器疾患患者 (体重 6 O kgとして） への投与においては、 ZAQアン夕ゴニストを一日につき 約 0. 01から 3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好まし くは約 0. 1から 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3) 本発明のペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、 本発明のペプチドを特異的に認識することができるので、 被検 液中の本発明のペプチドの定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量等に使用 することができる。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のペプチドとを競合的に反 応させ、 当該抗体に結合した標識化された本発明のぺプチドの割合を測定すること を特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測 定することを特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法を提供する。
また、 本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクロ ーナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のペプチドの定量を行なえるほか 、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子その ものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F (a b')2 、 Fab'、 あるいは Fab画 分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のペプチドの定量法は、 特に制限されるべきもので はなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 本発明のペプチド量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを 既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば 、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメト リック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述 するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素 、 酵素、 蛍光物質、 発光物質等が用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 等が用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ；8—ガラクトシダーゼ、 β -ダル コシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダ一ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素 等が用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセン イソチオシァネート等が用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ル ミノ一ル誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン等が用いられる。 さらに、 抗体あるい は抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常べ プチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法 でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロース等の不溶性多糖 類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス 等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反 応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクロ一ナル抗体を反応さ せ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液 中の本発明のぺプチド量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序 に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識 化剤おょぴ不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイツ チ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体 は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上 の抗体の混合物を用いてもよい。 本発明のサンドィツチ法による本発明のぺプチドの測定法においては、 1次反応 と 2次反応に用いられる本発明のモノク口一ナル抗体は、 本発明のぺプチドの結合 する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反 応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のペプチド の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競 合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリー等に用いることができる。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B / F 分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応 法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポリエチレングリコール、 前 記抗体に対する第 2抗体等を用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を 用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗体を 用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体 に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗原と 過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固 相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定 し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた 不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物し か得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリ一等が好適 に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別 の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操 作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築すれば よい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書等を参照すること ができる。 例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入 江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定 法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Metliods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 dm munocheniical Techniaues (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniaues (Pa rt B) )、 同書 Vol. 74 (1匪 imoclieiiiical Techniaues (Part 0 )、 同書 Vol. 84 (I unoc emical Techniaues (Part D: Selected Immunoassays) ) ^ 同書 Vol. 92 (I画 no chemical Techniaues (Part E: Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Me thods) )、 同書 Vol. 121 (Ifflmunochemical Techniques (Part I :Hybridoma Technolo gy and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行)等を参照する ことができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のペプチドを感 度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のペプチドの濃度を定量することによつ て、 （1 ) 本発明のペプチドの濃度の増多が検出された場合、 例えば、 消化器疾患 (例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） に罹患している、 または将来 罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 （2 ) 本発明のペプチドの 濃度の減少が検出された場合、 例えば、 消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸 収不良性症候群など） に罹患している、 または将来罹患する可能性が高いと診断す ることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織等の被検体中に存在する本発明のペプチドを 検出するために使用することができる。 また、 本発明のペプチドを精製するために 使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のペプチドの検出、 被検細 胞内における本発明のペプチドの挙動の分析等のために使用することができる。
( 4 ) 遺伝子診断剤
本発明の D N Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは温 血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） における本発明のペプチドをコードする D NAま たは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 当該 D NAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 当該 DNAまたは mR N Aの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイプリ ダイゼーシヨンや PCR— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5巻， 87 4〜879頁 （1989年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデ ミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスエー （Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA) ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1989 年） ） 、 DNAマイクロアレイ等により実施することができる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼーシヨンや DN Aマイクロアレイにより発現低 下が検出された場合や PC R_S S CP法や DNAマイクロアレイにより DN Aの 突然変異が検出された場合は、 例えば、 消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸 収不良性症候群など） に罹患している可能性が高いと診断することができる。
(5) アンチセンス DNAを含有する医薬
本発明の DN Aに相補的に結合し、 当該 DN Aの発現を抑制することができるァ ンチセンス DNAは、 生体内における本発明のペプチドまたは本発明の DNAの機 能を抑制することができるので、 例えば、 本発明のペプチドの発現過多に起因する 疾患 （例えば、 消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） ） の治療 ·予防剤として使用することができる。
上記アンチセンス DNAを上記の治療 ·予防剤として、 前記した本発明の DNA を含有する各種疾病の治療 ·予防剤と同様に使用することができる。
例えば、 当該アンチセンス DNAを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデ ノウィルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクター等の適当 なべクタ一に挿入した後、 常套手段に従って投与することができる。 当該アンチセ ンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認め られる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテー テルによって投与できる。
さらに、 当該アンチセンス DNAは、 組織や細胞における本発明の DNAの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用する こともできる。
( 6 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のペプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば、 本発 明のペプチドの発現過多に起因する疾患 （例えば、 消化器疾患 （例えば腸炎、 下痢 、 便秘、 吸収不良性症候群など） ） の治療 ·予防剤等の医薬として使用することが できる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療 ·予防剤は、 そのまま液剤として、 また は適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラッ卜、 ゥサギ、 ヒ ッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して経口的または非経口的に投与す ることができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルート等によっても 異なるが、 例えば、 消化器疾患治療の目的で本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 0 1〜2 O m g Z k g体重程度、 好ましくは 0. 1〜1 O m g / k g体重程度、 さら に好ましくは 0. l〜5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および 経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合に は、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる 。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容され得 る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または 非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤 、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等があげら れる。 かかる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いら れる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウム等が用いられ る。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注射 剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の剤形を包 含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはその塩を 通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化するこ とによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖や その他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコ一 ル （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O—5 0 (p olyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oi l) 〕 等と併用しても よい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤として 安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用してもよい。 調製された注射液は 、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体ま たはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するような 投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形としては 、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤等が例示され、 それぞれの 投薬単位剤形当たり通常 5 ~ 5 0 O m g程度、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g 程度、 その他の剤形では 1 0〜2 5 O m g程度の上記抗体が含有されていることが 好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じ ない限り他の活性成分を含有してもよい。
( 7 ) 本発明の D NAを含有する非ヒト動物の作出
本発明の D NAを用いて、 本発明のタンパク質等を発現するトランスジエニック 非ヒト動物を作出することができる。 非ヒト動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラ ット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下 、 動物と略記する） が挙げられるが、 特に、 マウス、 ゥサギなどが好適である。 本発明の D NAを対象動物に導入させるにあたっては、 当該 D NAを動物細胞で 発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるの が一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D NAを導入させる場合、 こ れと相同性が高い動物由来の本発明の D NAを動物細胞で発現させうる各種プロモ —ターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵へマイク 口インジェクションすることによって本発明のタンパク質等を高産生する D N A導 入動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス由来プロモー 夕一、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、 好ま しくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモーターやエノラ一ゼ遺伝子プロモ 一夕一などが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの導入は、 対象動物の胚芽細胞および体 細胞の全てに存在するように確保される。 D N A導入後の作出動物の胚芽細胞にお いて本発明のタンパク質等が存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞 及び体細胞の全てに本発明のタンパク質等を含有することを意味する。 遺伝子を受 け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のタンパ ク質等を含有する。
本発明の D NA導入動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認して 、 当該 D NA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さら に、 目的 D NAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相同染 色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することに よりすベての子孫が当該 D N Aを含有するように繁殖継代することができる。 本発明の D N Aが導入された動物は、 本発明のタンパク質等が高発現させられて いるので、 本発明のタンパク質等に対するァゴニストまたはアン夕ゴニス卜のスク リーニング用の動物などとして有用である。
本発明の D N A導入動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもでき る。 例えば、 本発明の D NA導入マウスの組織中の D NAもしくは R NAを直接分 析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のタンパク質が存在する組織を 分析することにより、 本発明のタンパク質等について分析することができる。 本発 明のタンパク質等を含有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これら を使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞 の機能を研究することができる。 また、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各 種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれ ば、 そこから、 本発明のタンパク質等を単離精製することも可能である。
( 8 ) 本発明のペプチドの用途など 本発明のペプチドおよび配列番号： 3 6、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配 列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩を用いることを特徴とする、 本発明のペプチドと配列番号： 3 6、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法は、 前記 （ 2 ) 記載の本発明のスクリーニング方法と同様に実施することができる。
本発明のペプチドおよび配列番号： 3 6、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配 列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩を含有することを特徴とする、 本発明のペプチドと配列番号： 3 6、 配列番号 ： 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、 前記 （2 ) 記載の本発明のスクリーニング用キットと同様に実施することができる 配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するペプチドまたはその塩および配列番号： 1、 配列番号： 3 6、 配列番 号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされる アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 配列番号： 3 4で 表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチ ドまたはその塩と配列番号： 1、 配列番号： 3 6、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と同一また は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法は、 前記 （2 ) 記載の本発明の スクリーニング方法と同様に実施することができる。
配列番号： 3 4で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するペプチドまたはその塩および配列番号： 1、 配列番号： 3 6、 配列番 号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされる ァミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 配列番号： 3 4 で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するぺプ チドまたはその塩と配列番号： 1、 配列番号： 3 6、 配列番号： 4 0、 配列番号： 4 7、 配列番号： 4 8もしくは配列番号： 4 9で表わされるアミノ酸配列と同一ま たは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、 前記 （2 ) 記載の本 発明のスクリーニング用キットと同様に実施することができる。
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合 物またはその塩は、 前記 （2 ) 記載の本発明のスクリーニング方法または本発明の スクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩と同様に使用する ことができる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P A C - I U B Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当 該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に 関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
D NA デォキシリポ核酸
c D NA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
Y チミンまた
N チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R アデニンまたはグァニン
M シトシンまたはアデニン W チミンまたはアデニン s シ卜シンまたはグァニン
RNA リポ核酸
mRNA ーリポ核酸 dATP 三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 dCTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
G 1 yまたは G
A 1 aまたは A ァラニン
Va 1または V バリン
L e uまたは L
I 1 eまたは I
S e rまたは S セリン
Th rまたは T スレオニン
Cy sまたは C
Me tまたは M メチォニン
G 1 uまたは E グルタミン酸
As pまたは D ァスパラギン酸
Ly sまたは K リジン
A r gまたは R アルギニン
H i sまたは H ヒスチジン
Ph eまたは F フエ二ルァラニン
Ty rまたは Y チロシン
T r pまたは W トリプトファン
P r oまたは P プロリン
As nまたは N ァスパラギン
G 1 nまたは Q ダル夕ミン p G 1 u ： ピログルタミン酸
X a a ：未同定アミノ酸残基 また、 本明細 ΐ ：中で繁用される置換基、 保護基および試薬等を下記の記号で表記 する。
Me メチル基
Et ェチル基
Bu ブチル基
Ph フエニル基
Ac ァセチル基
TC チアゾリジン一 4 (R) —カルポキサミド基
Bom ベンジルォキシメチル
B z 1 ベンジル
Z ベンジルォキシカルポニル
B r - Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
C 1一 Z 2一クロルべンジルォキシカルポニル
Cl2Bzl 2, 6—ジクロ口べンジル
B o c t一プチルォキシカルポニル
HOBt 1ーヒドロキシベンズトリァゾ一ル
HOOB t 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4ーォキソ一
1, 2, 3—べンゾ卜リアジン
PAM フエニルァセトアミドメチル
To s P -トルエンスルフォニル
Fmo c N— 9一フルォレニルメトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル
B um 夕一シャリーブトキシメチル
Trt 卜 Uチル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル Me B z 1 4一メチルベンジル
DCC
HONB 卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン _2， 3 -ジカルポキシィミド
NMP N—メチルピロリドン
HONB N—ヒドロキシー 5—ノルポルネンー 2, 3ージカルポ キシィミド
NMP ： N—メチルピロリドン
TFA ： トリフルォロ酢酸
CHAP S ： 3— [ (3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ]一
1—プロパンスルホナ一ト
PMS F ： フエ二ルメチルスルホニルフルオリド
GDP ：グアノシン一 5'—二リン酸
F u r a - 2 AM ： 1 - [6—ァミノ— 2— (5—力ルポキシ— 2—ォキサ ゾリル） 一 5—ベンゾフラ二口キシ] —2— （2—アミ ノー 5メチルフエノキシ） 一ェタン一 N, N, N'， N' 一四酢酸ペン夕ァセトキシメチルエステル
F 1 u o- 3 AM ： 1 - [2—アミノー 5— （2, 7—ジクロロー 6—ヒド 口キシ— 3—ォキシ一 9ーキサンテニル） フエノキシ] —2— (2—アミノー 5—メチルフエノキシ） ェタン一 N, N, N'， N'—四酢酸ペン夕ァセトキシメチルエス テル
HEPES ： 2 - [4- (2—ヒドロキシェチル） 一 1ーピペラジニ
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
B S A ゥシ血清アルブミン
HB S S ハンクス平衡塩液
E I A 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒト脳由来タンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する本発明のヒト脳由来タンパク 質をコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQC) 。
〔配列番号： 3〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する本発明のヒト脳由来タンパク 質をコードする DNAの塩基配列を示す （ZAQT) 。
〔配列番号： 4〕
後述の実施例 1で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
後述の実施例 1で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
後述の実施例 2で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
後述の実施例 2で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
後述の実施例 2で用いられた ZAQp r o b eの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
後述の実施例 2で用いられたプライマー ZAQC Salの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
後述の実施例 2で用いられたプライマ一 ZAQC Speの塩基配列を示す。
〔配列番号： 11〕
後述の実施例 3 (3-8) で精製された ZAQ活性化ペプチドの N末端のァミノ 酸配列を示す。
〔配列番号： 12〕
後述の実施例 4で用いられたプライマー Z F 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕 後述の実施例 4で用いられたプライマ一 Z F 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
後述の実施例 4で用いられたプライマ一 Z F 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
後述の実施例 4で得られたヒ卜型 ZAQリガンドペプチドをコードする DN Aの 3' 端塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
後述の実施例 4で用いられたプライマー Z AQ L— C Fの塩基配列を示す。 〔配列番号： 17〕
後述の実施例 4で用いられたプライマー ZAQL— XR 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 18〕
後述の実施例 4で得られた D N A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
後述の実施例 4で得られた D N A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
ヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 21〕
ヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ヒト型 Z A Qリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 23〕
ヒ卜型 Z A Qリガンド前駆体べプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕
配列番号： 28で表わされるヒ卜型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードする DNAを含有する DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
配列番号： 29で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードする D N Aを含有する D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕 配列番号： 20で表わされるヒ卜型 ZAQリガンド成熟体ペプチドをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
配列番号： 21で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟ペプチドをコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
配列番号： 22で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ぺプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
配列番号： 23で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
後述の実施例 5 (5-1) で用いられた DN A断片の塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
後述の実施例 6 (6-2) で分析された、 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの N末 端アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 32〕
後述の実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 33〕
後述の実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
後述の実施例 8で精製されたへビ毒 M I T 1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 35〕
ヒト型 I 5 E受容体タンパク質をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 36〕
ヒト型 I 5 E受容体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 37〕
後述の実施例 9で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 38〕 後述の実施例 9で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 39〕
新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （r ZAQl) をコードする cDNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 40〕
新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （r ZAQl) のアミノ酸配列を示す 〔配列番号： 41〕
後述の実施例 10で用いられたプロ一ブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 42〕
後述の実施例 10で用いられたプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 43〕
後述の実施例 10で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 44〕
後述の実施例 10で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 45〕
後述の実施例 10で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 46〕
新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （r ZAQ2) をコードする cDNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 47〕
新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （r ZAQ2) のアミノ酸配列を示す 〔配列番号： 48〕
マウス由来 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （GPR73) のアミノ酸配列 を示す。
〔配列番号： 49〕
マウス由来 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （ml 5E) のアミノ酸配列を 示す。 〔配列番号： 50〕
マウス由来 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （GPR73) をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 51〕
マウス由来 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （ml 5E) コードする cDN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 52〕
参考例 1で用いられた DN A断片 # 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 53〕
参考例 1で用いられた DN A断片 # 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 54〕
参考例 1で用いられた DNA断片 # 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 55〕
参考例 1で用いられた DNA断片 #4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 56〕
参考例 1で用いられた DN A断片 # 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 57〕
参考例 1で用いられた DN A断片 # 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 58〕
配列番号： 21で表わされるヒト型 ZAQリガンドをコードする合成 DNAの塩 基配列を示す。 後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) DH5 α/ CR 2. 1— Z AQ Cば、 平成 11年 8月 23日から、 日本国茨城県 つくば市東 1一 1一 1 中央第 6 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄 託センター （旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) ) に 寄託番号 FERM BP— 6855として、 平成 11年 8月 4日から、 日本国大阪 府大阪市淀川区十三本町 2— 17— 85 財団法人 ·発酵研究所 （ I F〇） に寄託 番号 I FO 16301として寄託されている。 後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) DH5 a/pCR2. 1一 ZAQTは、 平成 11年 8月 23日から独立行政法人産 業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所 （NIBH) ) に寄託番号 FERM BP— 6856として、 平成 1 1年 8月.4日から財団法人 ·発酵研究所 （I FO) に寄託番号 I FO 16302 として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) T OPlO/pHMITAは、 平成 12年 7月 13日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センター （旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （NI BH ：) ) に寄託番号 FERM BP— 7219として、 平成 12年 5月 26日から財団 法人 ·発酵研究所 （ I FO) に寄託番号 I FO 16440として寄託されている 後述の実施例 4で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) T OPlO/pHMITGは、 平成 12年 7月 13日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センター （旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH ) ) に寄託番号 FERM BP— 7220として、 平成 12年 5月 26日から財団 法人 ·発酵研究所 （ I FO) に寄託番号 I FO 16441として寄託されている 後述の実施例 9で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) DH5 α/ CR 2. 1 - r Z AQ 1は、 平成 12年 8月 21日から独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業省工業技術院生命工学 工業技術研究所 （NI BH) ) に寄託番号 FERM BP— 7275として、 平成 12年 8月 1日から財団法人 *発酵研究所 （I F〇） に寄託番号 I FO 1645 9として寄託されている。
後述の実施例 10で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) DH10 B/pCMV- r ZAQ2は、 平成 12年 8月 21日から独立行政法人産 業技術総合研究所 特許生物寄託センター （旧 通商産業省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所 （NIBH) ) に寄託番号 FERM BP— 7276として、 平成 1 2年 8月 1日から財団法人 ·発酵研究所 （I FO) に寄託番号 I FO 16460 として寄託されている。
後述の参考例 1で取得されたェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) MM 29 4 (DE 3) /pTCh 1 ZAQは、 平成 13 ( 2001 ) 年 4月 27日から、 独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一に寄託番号 FERM BP 一 7571として、 平成 13年 1月 16日から受託番号 I F〇 16527として 財団法人発酵研究所 （I FO) に寄託されている。 実施例
以下に実施例および参考例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは 本発明の範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュラー ·クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った
実施例 1 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 ZAQをコードする cDNAのク ローニングと塩基配列の決定
ヒト脳下垂体 cDNA (CL0NTECH社） を铸型とし、 2個のプライマー、 プライマ — 1 (5'-GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG-3' ；配列番号： 4) 及びプライマ一 2 (5'-ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3' ；配列番号： 5) を用いて PC R 反応を行った。 当該反応における反応液の組成は上記 cDNAの 10分の 1量を鍀 型として使用し、 Advantage2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） 1Z50量、 プライ マー 1及びプライマ一 2を各 0.2 _iM， dNTPs 200 M、 及び酵素に添付のバッファ —を加え、 25 xlの液量とした。 PCR反応は、 94°C ' 2分の後、 94°C ' 20秒 、 72 °C · 100秒のサイクルを 3回、 94°C · 20秒、 68°C · 100秒のサイ クルを 3回、 94T 20秒、 64°C ' 20秒、 68 °C · 100秒のサイクルを 3 8回繰り返し、 最後に 68°C * 7分の伸長反応を行った。 当該 PCR反応後の反応 産物を TAクローニングキット （Invitrogen社） の処方に従いプラスミドベクタ一 p CR2.1 (Invitrogen社） へサブクロ一ニングした。 これを大腸菌 DH 5 に導入し、 cDNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した後、 個々 のクローンの配列を解析した結果、 新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質をコ ードする 2種類の cDNA配列 ZAQC (配列番号： 2) 及び ZAQT (配列番号 ： 3) を得た。 この cDNAより導き出されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 はいずれも同一配列 （配列番号： 1) を有したため ZAQと命名し、 配列番号： 2 で表される DN Aを含有する形質転換体を大腸菌 （Escherichia coli) DH5 / pCR2. 1一 ZAQCと、 配列番号： 3で表される DNAを含有する形質転換体 を大腸菌 DH5 a/pCR 2. 1— ZAQTと命名した。 実施例 2 T a qman P C Rによる Z AQの発現分布の解析
T a qma n P CRに用いるプライマー及びプローブは、 Primer Express ver. 1.0 (PEバイオシステムスジャパン） を用いて検索し、 プライマー 3 (5'- TCATGTTGCT CCACTGGAAGG-3' (配列番号： 6) )、 プライマー 4 (5' -CCAATTGTCTTGAGGTCCAGG-3' ( 配列番号： 7) ) 、 ZAQprobe (5' -TTCTTACAATGGCGGTAAGTCCAGTGCAG-3' (配列番号： 8 ) ) を選択した。 プローブのリポーター色素として、 FAM ( 6-carboxyfluoresceiE ) を付加した。
スタンダード DNAとして、 後述の実施例 3で得られた pAK— ZAQCを踌型に、 ブラ イマ一 ZAQC Sal (5'-GTCGACATGGAGACCACCATGGGGTTCATGG-3' (配列番号： 9) ) およ び ZAQC Spe (5' -ACTAGTTTATTTTAGTCTGATGCAGTCCACCTCTTC-3' (配列番号： 1 0) )を用 いて増幅した PC R断片を、 CHROMA SPIN200 (CLONTECH Laboratories, Inc. (CA ， USA) ) を用いて精製し、 10Q— 106コピー// xlに調整して使用した。 各組識の c DNAソ一スとして、 Human Multiple Tissue cDNA Panel Iおよび Panel II (CLONT ECH Laboratories, Inc. ) を使用した。 プライマー、 プローブ、 铸型に、 TaQman Universal PCR Master Mix (PEバイオシステムスジャパン） を添付書類記載の規定 量加え、 ABI PRISM 7700 Seauence Detection System (PEバイオシステムズジャパ ン） で PCR反応および解析をおこなった。
結果を図 8および表 1に示した。 主に精巣、 ついで肺、 脳等の部位で ZAQの発 現がみられた。
Figure imgf000098_0001
実施例 3 ZAQを活性化するぺプチドの単離
(3- 1) 牛乳抽出液の調製
市販の低温殺菌牛乳を用いて、 以下の操作を行い抽出液を調製した。 牛乳 2 liter を高速遠心機 （CR26H、 R10A型ローター： 日立株式会社） を用いて、 10,000 rpm、 1 5分間、 4°Cで遠心し、 得られた上清をガーゼでろ過し、 脂質片を取り除いた。 上 ' 清に最終濃度 1 Mになるように酢酸を加え、 4°Cにて 30分間攪拌し、 次いで高速遠 心機 （CR26H、 R10A型ロー夕一： 日立株式会社） を用いて 10， 000 rpm、 1 5分間遠心 し上清をガーゼでろ過し不溶物を除去した。 上清に撹拌しながら 2倍容のアセトン を加え 4°Cにて 3時間攪拌した。 次いで高速遠心機 （CR26H、 R10A型ローター： 日立 株式会社） を用いて 10, 000 rpm、 15分間遠心後、 得られた上清をガーゼでろ過し 不溶物を除去した。 得られた上清をロータリーエバポレーターにかけ、 アセトンを 除去し、 最終的に 1350mlまで濃縮した。 得られた濃縮液を、 675m 1ごと に 338m 1のジェチルエーテルと混合し、 分液ロート中にて激しく混和し、 2相 分離後、 水相を得た。 得られた水相について同じ操作をさらに 1回繰り返し、 清澄 な水相を得た。 得られた水相を、 ロータリーエバポレー夕一を用いて 80 Om 1ま で濃縮し、 最終的な抽出液を得た。
(3-2) 牛乳抽出液の C18逆相クロマトグラフィーによる粗分画
ォクタデシル基を固定したシリカゲルを充填したカラム Sep- Pak C18 (Waters社） 10 gをメタノールで膨潤後、 1 M酢酸で平衡化した。 このカラムに、 （3— 1) で調製した抽出液 （牛乳 2 liter分） を添着した。 続いて、 このカラムに、 100m 1の 1 M酢酸を流しゲルを洗浄した。 次に、 このカラムに 20 Om 1の 60 %ァセ トニトリリレ /0. 1%トリフルォロ酢酸を流し、 目的とする粗ペプチド成分を溶出し た。 得られた溶出液を、 エバポレー夕一を用いて濃縮した後、 凍結乾燥機 （12EL; VirTis社） にて凍結乾燥した。
(3-3) 牛乳抽出液のスルホプロピルイオン交換ク口マトグラフィ一による粗分 画
ポリプロピレン製のカラムに 100 mM塩酸中で膨潤させた SP Sephadex C-25 (Amers ham Pharmacia Biotech社） を、 容量が 2mlになるよう充填し、 蒸留水及び 2 M ギ酸アンモニゥム（pH 4.0)で洗浄した後、 I液 （2 Mギ酸アンモニゥム：ァセトニ トリル：水 =1:25:74) で平衡化した。 上記 （3— 2) で得られた凍結乾燥物を I液 2 Omlに溶解し、 SP Sephadex C-25 2 ndにロードした。 I液 10 m 1で洗浄後、 I I液 （2 Mギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1:2.5:6.5) 、 I I I液 （2 Mギ酸アンモニゥム：ァセトニトリル：水 =1:1:2) 、 I V液 （2 Mギ酸アンモニゥ ム：ァセトニトリル：水 =1:0.5:0.5) 各 1 Om 1で順次溶出した。 得られた I液か ら IV液を、 それぞれ凍結乾燥機 （12EL; VirTis社） にて凍結乾燥した。
(3-4) 牛乳抽出液の TSKge l ODS 8 OT s逆相高速液体クロマトグラフ ィ一による分画
TSKgel ODS- 80Ts逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 4. 6 mm X 25 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 m 1 Zm i nで A液 （0.1% トリフルォロ 酢酸/蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0· 1%トリフルォロ酢酸 /60%ァセトニトリル） 容 量 8.3%を流し、 平衡化した。 上記 （3— 3) で得られた I液から I V液の凍結乾燥 物を、 それぞれ 1 M酢酸 4m 1に溶解しクロマトグラフィー操作に処した。 即ち、 凍結乾燥物の溶液 4m 1を当該カラムに添着した後、 流速 lm 1 /m i nで、 1分間 かけて A液容量 67%/B液容量 33%まで上昇させ、 次いで 40分間かけて A液 容量 67%ZB液容量 33%から A液容量 0%/B液容量 100%まで、 B液濃度 を直線的グラジェントで上昇させた。
溶出液を、 1mlずつフラクション番号をつけて分取し、 各フラクション 2 lを 150 ill の 0.2% Bovine Serum Albumin (BSA) /蒸留水と混合し凍結乾燥した。 こ の乾'燥物を後述の （3— 5) に記した細胞内 Ca2+イオン濃度上昇活性測定用のァ ッセィ用サンプルとした。
(3-5) FL I PRを用いた細胞内 Ca2+イオン濃度上昇活性の測定
ZAQ安定発現細胞株は以下のようにして調製した。 すなわち、 実施例 1で得た D H5a/pC 2.1一 ZAQCの 1クローンを、 アンピシリンを含む L B培地で振とう培養し 、 プラスミド pCR2.1— ZAQCを得た。 これを制限酵素 S a 1 Iおよび S p e Iで処理 し、 ZAQCをコードするインサート部分を切り出した。 同様に制限酵素 S a l I および S p e Iで処理した pAKKO— 1.11H (Biochemica et Biophysica Acta 1219 (1 994) 251-259) と、 当該インサート部分を Ligation Express Kit (CLONTECH Labo ratories, Inc. (CA, USA ) ) を用いて連結し、 大腸菌 DH 10 Bにエレクト口 ポーレーシヨン法にて導入した。 得られたクローンの有するプラスミドの構造を、 制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、 正しい構築のものを C H O細胞発現用プ ラスミド pAK— ZAQCとして使用した。
このプラスミド pAK— ZAQCを CHO/dtiir—細胞 （American Type Culture Collection ) に CellPhect Trans feet ion kit (Amersham Pharmacia Biotech社） を用いて形質 導入することにより取得した。 まず、 蒸留水 120 lに溶解したプラスミド DNA 4 tigに対して Buffer A (CellPhect Trans feet ion Kitに添付） 120 1を添加し、 撹 拌し、 10分間静置後、 Buffer B (CellPhect Transfection Kitに添付) 240 lを 添加し、 激しく撹拌し当該 DNAを含有する DNA—リン酸カルシウム複合体を形 成させた。 5 X 105個の CH0/ dhfr細胞を 6 Ommシャーレに播き、 10%のゥシ 胎児血清 （BIO WHITTAKER社） を含む Ham' s F- 12培地 （日水製薬株式会社） 中で 3 Ί。 、 5%炭酸ガス中で 1日間培養した後、 当該 DNA—リン酸カルシウム複合体 の懸濁液 480 n\ をシャーレの当該細胞上に滴下させた。 これを、 37°C、 5%炭 酸ガス中にて 6時間培養した後、 血清を含まない Ham's F-12培地で 2回細胞を洗浄 し、 シャーレの当該細胞上に 15%グリセロールを含む緩衝液（140 mM NaCl, 25 mM HEPES, 1.4 mM Na2HP04, pH7.1) 1.2mlを添加し 2分間処理した。 これを、 再度、 血 清を含まない Ham' s F- 12培地で 2回洗浄した後、 10 %のゥシ胎児血清を含む Ham' s F - 12培地中で 37°C、 5%炭酸ガス中で一晩培養した。 当該細胞を卜リブシン処理 により分散させてシャーレから回収し、 2 X 104個ずつ 6- well plateに植え込み、 透析済み 10%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸溶 液 (大日本製薬株式会社) 、 100 units/ml Penicillin, 100 g/ml Stre tomycin を含む Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) 培地 （日水製薬株式会社） 中にて 37° (：、 5%炭酸ガス中にて培養を開始した。 プラスミドの導入された形質 転換 CHO細胞は当該培地中で生育するが、 非導入細胞は次第に死滅していくので 、 培養開始後 2日毎に培地を交換して死滅細胞を除去した。 培養開始 8— 10日後 に生育してきた形質転換 CHO細胞のコロニーを約 21個選んだ。 それぞれ選択さ れた細胞から RNAを市販の RNA単離用キットを用いて回収し、 以降公知の RT 一 PCR法により ZAQを高発現する ZAQ発現 CHO細胞 B— 1番クローン （以 後、 ZAQC— B 1細胞と略称する） を選別した。
また、 対照として ETA (エンドセリン A受容体） 発現 CHO細胞 24番クロー ン （以後 ETA 24細胞と略称する。 Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279巻、 675- 685頁、 1996年参照） を用いた。
上記 （3— 4) で得られたアツセィ用サンプルについて、 ZAQC— B 1細胞及 び ETA24細胞における細胞内 C a2+イオン濃度上昇活性の測定を FL I P R (M olecular Devices社）を用いて行った。 ZAQC— B 1細胞、 ETA24細胞共に 1 0%透析処理済ゥシ胎児血清 (以後 d FBSとする）を加えた DMEMで継代培養してい るものを用いた。 ZAQC— B 1細胞、 ETA24細胞をそれぞれ 15xl04cells/ml となるように培地（10% d FBS- DMEM)に懸濁し、 FL I P R用 96穴プレート（Black p late clear bottom, Coster社）に分注器を用いて各ゥエルに 200 1ずつ植え込み（3 . OXl04cells/200 l/ゥエル）、 5 % C02インキュベータ一中にて 37 °Cで一晩培養 した後用いた（以後細胞プレートとする）。 H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製薬 株式会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリゥム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリゥム 溶液で PH7.4に合わせた後、 フィルタ一滅菌処理） 20 ml、 250 mM Probenecid 200 l、 ゥシ胎児血清 (FBS) 200 lを混合した。 また、 Fluo 3-AM (同仁化学研究所 ) 2バイアル（50 g)をジメチルスルフオキサイド 40 1、 20% Pluronic acid ( Molecular Probes社） 40 1に溶解し、 これを上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加 え、 混和後、 8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥエル 100 IX 1ずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中にて 37°Cで 1時間インキュベートした (色素ローデイング)。 上記 （3— 4) で得られたアツセィ用サンプルについて、 各 フラクションに、 2.5 mM Probenecid, 0.1% CHAPSを含む H/HBSS 150 1を加えて 希釈し、 FL I PR用 96穴プレート（V- Bottomプレート、 Coster社)へ移した（以後 、 サンプルプレートとする）。 細胞プレートの色素ローデイング終了後、 H/HBSSに 2. 5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Molecular Devic es社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 xlの洗浄バッファーを残し た。 この細胞プレートとサンプルプレートを FL I PRにセットしアツセィを行つ た（FL I PRにより、 サンプルプレートから 50 ilのサンプルが細胞プレートへと 移される）。
その結果、 上記 （3— 3) IV液を上記 （3— 4) 逆相高速液体クロマトグラフィ —分離して得られたフラクション No.53に ZAQC— B 1細胞に特異的な細胞内 C a
2 +ィォン濃度上昇活性が見られた。
(3-6) TSKge 1 Sup, e r-Phe ny 1逆相高速液体クロマトグラフィ 一による精製
TSKge 1 Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社 、 0.46 cm X 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 m 1 Zm i nで A液 （0.1% トリフ ルォロ酢酸/蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニト リル） 容量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （3— 4) で得られたフラクション No.53 についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 フラクション No.53の溶液 lml を当該カラムに添着した後、 流速 lml/m i nで、 1分間かけて A液容量 75 % /B液容量 25%まで上昇させ、 次いで 75分間かけて A液容量 67 %/B液容量
33%まで、 B液濃度を直線的グラジェントで上昇させた。
溶出液を、 500 lずつフラクション No.をつけて分取した。 分取フラクションよ り各 25 lづっ 0.2% BSA 150 / と混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結 乾燥させた。 この乾燥物に、 2.5 Probenecid, 0.1% CHAPSを含む H/HBSS 150 j l を加えて溶解し、 この溶液 50 lを用いて上記 （3— 5) の試験法により、 細 胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性を測定することにより、 ZAQC— B 1細胞に対す る受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細胞に対す る受容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 主としてフラ クシヨン No.103-105に溶出されていることが判明した。
(3-7) RPC C2/C 18 ST 4. 6 / 100逆相高速液体クロマトダラ フィ一による精製
RPC C2/C18 ST 4.6/100逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （Amerstiam P harmacia Biotech社、 0.46 cm x 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 lm 1 /m i nで A液 （ヘプ夕フルォロ酪酸/蒸留水） 容量 95%/B液 (0.1%ヘプ夕フルォロ酪酸 /1 00% ァセトニトリル） 容量 5%を流し平衡化した。
上記 （3— 6) で得られた TSKgel Super- Phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー 分取フラクションのうちフラクション No.103-105をそのまま^ RPC C2/C18 ST 4.6/1 00逆相カラムに添着した後、 流速 lm 1 /m i nで 1分間で A液 （0.1% ヘプタフ ルォロ酪酸/蒸留水） 容量 95%ZB液 (0.1% ヘプタフルォロ酪酸/ 100% ァセト 二トリル） 容量 5%から A液容量 65 %ZB液容量 35%まで急速に上昇させ、 こ れを次に、 流速 1 m 1 Zm i nで、 60分間かけて A液容量 50 %ZB液容量 50 %まで直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出液は、 21 O nmの 紫外吸収では単一なピークとして検出された。
溶出液を、 500 lずつフラクション番号をつけて分取し、 分取フラクションより 各 10 1づっを 0.2% BSA 150 1と混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾 燥させた。 この乾燥物に、 2.5 niM Probenecid, 0.1% CHAPSを含む H/HBSS 75 \ を加えて溶解し、 この溶液 50 1を用いて上記 （3— 5) の試験法により、 ZAQ C一 B 1細胞に対する受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ C— B 1細胞に対する受容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成 分は、 フラクション No.82-84に溶出されていることが判明した。 この活性ピークは 、 2 10 nmの紫外吸収ピークに完全に一致し、 単一ペプチドにまで精製されたも のと判断した。
(3-8) 精製された Z AQ活性化べプチドの構造解析 上記 （3— 7) で得られた ZAQ活性化成分について以下の方法で構造決定を実 施した。 ZAQ活性化成分精製標品を凍結乾燥し、 得られた凍結乾燥物を溶媒 DM SO (ジメチルサルフォキシド） に溶解した。 この溶液の一部をプロテインシーク ェンサ一（パ一キンエルマ一社、 PE Biosystems Procise 491cLC)を用いた N末端か らのアミノ酸配列解析に供した。 その結果、 N末端のアミノ酸残基から 16番目のァ ミノ酸残基のうち、 14残基を同定することができた （Ala Val lie Thr Gly Ala X aa Glu Arg Asp Val Gin Xaa Arg Ala Gly (配列番号： 1 1 ; Xaaは未同定残基）
実施例 4 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの c DNAのクローニング
実施例 3で得られた牛乳から精製された Z A Qを活性化するべプチドの N末端ァ ミノ酸配列 （配列番号： 1 1) をクエリーとしてデータべ一スを B 1 a s t検索した ところ、 配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする DNAの塩基配列と同等な配列を含むヒト EST (X40467) を見出した。 本 配列は完全長のオープンリーディング 'フレームを有していなかつたので、 以下に RACE法により未確定部分の配列を明らかにし、 引き続いて完全長のオープンリ 一ディング ·フレームを有す c DNAクローンを取得した。
EST (X 40467) の情報よりプライマー Z F 1 (配列番号： 12) 、 Z F 2 (配列番号： 13) と ZF 3 (配列番号： 14) を作成し、 ヒト精巣 Marathon-Re ady cDNA (CL0NTECH社） を鍀型として以下に記した 3' RACE実験を実施した。
ZF1: 5'-GGTGCCACGCGAGTCTCAATCATGCTCC-3' (配列番号： 12)
ZF2: 5'-GGGGCCTGTGAGCGGGATGTCCAGTGTG-3' (配列番号： 13)
ZF3: 5' -CTTCTTCAGGAAACGCAAGCACCACACC-3' (配列番号： 14)
3' RACEの PC R反応液は 50 x Advantage 2 Polymerase Mix (CLONTECH社) を 1 l、 添付の 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 ni KOAc, 35 mM Mg(0Ac)2 , 37.5/ g/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 \, dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 10 プライマー ZF1を 1 μΛ、 10 Mプライマー API (プライマー APIは CLONTECH社の Marathon- Ready cDNA KiUこ添付 のもの） を 1 l、 铸型 c DNA (CLONTECH社、 ヒト精巣 Marathon- Ready cDNA) を 5 l、 及び蒸留水を 33 1を混合して作製した。 反応条件は 94°C' 60秒の初期変性後 、 94°Ο30秒- 72°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 70で '4分のサイクル反応を 5回、 94°C'30秒- 68°C'44分のサイクル反応を 25回行った。
続いて、 当該 PC R反応の反応液を錶型として nested PCRを実施した。 反応液は 5 0 X Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） を 1 l、 添付の 10 x Advantage
2 PCR buffer (400 niM Tricine-KOH, 150 niM KOAc, 35 mM Mg (OAc) 2, 37.5 g/ml B SA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet- P40)を 5 ΐ, dNTP mixture (2.5 mM each, 宝酒造）を 4 n 10 Mプライマー ZF2を 1 /il、 10 プライマー AP2 (プライマ 一 AP2は CL0NTECH社の Marathon- Ready cDNA KiUこ添付のもの) を 1 n 铸型 DNA (当該 PC R反応液 50倍希釈液） を 5 βΙ、 及び蒸留水を 33 を混合して作製し た。 反応条件は 94 > 60秒の初期変性後、 94°C'30秒 _72°C'4分のサイクル反応を 5 回、 94°C'30秒- 70°C'4分のサイクル反応を 5回、 94°C ·30秒- 68 ·44分のサイクル 反応を 25回行った。 .
さらに続いて、 当該 PC R反応の反応液を铸型として 2回目の nested PCRを実施し た。 反応液は 50 Advantage 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） を 1 1、 添付の 10 x Advantage 2 PCR buffer (400 mM Tricine-KOH, 150 mM KOAc, 35 mM Mg (OAc) 2 , 37.5 xg/ml BSA, 0.05%Tween-20, 0.05% Nonidet-P40)を 5 1、 dNTP mixture ( 2.5 mM each, 宝酒造）を 4 1、 10 Mプライマー ZF3を 1 1、 10 Mプライマー A P2 (プライマー AP2は CL0NTECH社の Marathon-Ready cDNA KiUこ添付のものを用いた 。 ） を 1 l、 铸型 DNA (当該 PCR反応液 50倍希釈液） を 5 及び蒸留水を 3
3 を混合して作製した。 反応条件は 94°C' 60秒の初期変性後、 94 '30秒_72°04 分のサイクル反応を 5回、 94°C'30秒- 70°O4分のサイクル反応を 5回、 94°C'30秒 -68 °C-44分のサイクル反応を 25回行った。 得られた DNA断片を T0P0 TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニング した。 クローニングされた DNAの塩基配列を ABI377DNA seQuencerを用いて解読し 、 3'端配列 （配列番号： 1 5) を得た。
配列番号： 15で表わされる塩基配列及び E ST (X 40467) の情報によりプ ライマー ZAQL- CF (配列番号： 16) 及び ZAQL- XR1 (配列番号： 17) を作成した。 ヒト精巣 Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社） を铸型としてプライマー ZAQL- CF と Z AQL- XR1を用いて P C Rを実施した。
ZAQL-CF: 5'-CCACCATGAGAGGTGCCACG-3' (配列番号： 16)
ZAQL-XR1: 5' -CTCGAGCTCAGGAAAAGGATGGTG-3' (配列番号： 17)
PCR反応液は PfuTurbo DNA polymerase (Stratagene社）を 1 L 添付の 10 x PC R bufferを 5 uA、 2.5 mM dNTP mixtureを 4 JL 10 プライマー ZAQL- CF及び ZAQ L-XR1を各 2.5 μΛ、 銬型 DNAを 5 1、 及び蒸留水を 30 1を混合して作製した。 反応条件は 95°C · 1分の初期変性後、 95°C · 1分 - 60°C · 1分- 72°C · 1分のサイクル反応を 4 0回、 および 72°C' 10分の最終伸長反応とした。 得られた DNA断片を TOPO TA Cloni ng Kit (Invitrogen社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクロー ニングした。 クローニングされた DNA断片の塩基配列を ABI 377 DNA sequencer を用いて解読した結果、 371 b pの、 それぞれ配列番号： 18および配列番号： 19で表わされる塩基配列を有していることが明らかとなった。 配列番号： 18で 表わされる塩基配列を含有する DNA断片を有するプラスミドを pHMITAと、 配列番 号： 19で表わされる塩基配列を含有する DNA断片を有するプラスミドを pHMITG と命名した。
プラスミド PHMITA及び pHMITGにより大腸菌 (Escherichia coli) を形質転換し、 それぞれェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) ΤΟΡΙΟ/ρΗΜΙΤΑおよびェシエリヒ ァ -コリ (Escherichia coli) TOPlO/pHMITGと命名した。
これらの DNA断片の塩基配列を解析した結果、 配列番号： 18で表わされる D NA断片は、 配列番号： 22で表わされるヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド（A タイプ、 105アミノ酸残基）をコードする DNA (配列番号： 28) を含んでおり、 配列番号： 19で表わされる DNA断片は、 配列番号： 23で表わされるヒト型 Z AQリガンド前駆体ペプチド（Gタイプ、 105アミノ酸残基）をコードする DNA (配列番号： 29) を含んでいることが明らかとなった。
また、 配列番号： 28および配列番号： 29で表わされる塩基配列は典型的なシ グナル配列を有しており、 配列番号： 28で表わされる塩基配列を含有する DNA は、 配列番号： 20で表わされるヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチド（Aタイプ、 86アミノ酸残基）をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 26) を 含んでおり、 配列番号： 29で表わされる塩基配列を含有する DNAは、 配列番号 ： 21で表わされるヒ卜型 ZAQリガンド成熟体ペプチド（Gタイプ、 86アミノ酸 残基）をコードする 258塩基対からなる DNA (配列番号： 27) を含んでいるこ とが明らかとなった。 実施例 5 ヒ卜型 ZAQリガンドペプチドの哺乳動物細胞での産生 （1)
(5- 1) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド哺乳動物細胞発現べクタ一の構築 実施例 4において取得したプラスミド pHMITGから Ec oR I、 Xh o I制限酵素 消化によってヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチドをコードする cDNAを含む 3 82 bpの DN A断片 （配列番号： 30) を切出した。
すなわち、 プラスミド pHMITGを Ec oR Iおよび Xho Iで酵素消化し、 得られ た DNAを 1. 5 %ァガロースゲルを用いて電気泳動し、 サイバーグリーン染色さ れる約 382 b pのバンドを含むゲル片を剃刀で切り取つた。 当該ゲル片ょり Gene Clean spin DNA抽出キット （BIO 101社） を用いて DNA断片を回収した。 得られた DNA断片を CMV-IEェンハンサーおよび chicken beta-act in promoterを発現プロモ 一ターとする哺乳動物細胞発現ベクター PCAN618 (図 1 1) に対して E c oR I、 X ho I制限酵素切断部位に定法に従ってクロ一ニングした。 クローニングされた D N A断片の塩基配列を前述の方法により解読した結果、 配列番号： 30で表わされ る塩基配列を有していることが確認された。 このヒト型 ZAQリガンド前駆体べプ チドをコードする DNAを含有する哺乳動物細胞発現ベクターを pCANZ AQLg2と命名 レた。
(5-2) COS 7細胞への発現ベクターの導入
COS 7細胞は ATCCより購入し、 DMEM培地 （10% FBSを加えたもの） を用いて継代培養しているものを用いた。 DMEM培地を用いて COS 7細胞を 1.5 Xl06cells/dishとなるよう 10 cmシャーレにまき、 37°C、 5% C02インキュべ —夕一中で一晩培養した。 ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現プラスミド （p CANZAQLg2) 2 g (2 1の TEバッファ一に溶解） にバッファー EC (Effectene iran sfection reagent, QIAGEN) 298 1を加え、 さらに Enhancer 16 1を加え、 1秒間 混和後室温で 3分間放置した。 さらに Eifectene Transfection Reagent 60 を加 え、 10秒間混和後室温で 10分間放置した。 前日にまいた細胞の上清を除き、 D MEM培地 10mlで 1回洗浄し、 DMEM培地を 9 m 1を加えた。 プラスミド溶 液に DMEM培地 lmlを加えて混和後細胞に滴下し、 全体を混ぜた後 37 °C、 5 % C02インキュベータ一中で一晩培養した。 DMEM培地 10m 1で 2回洗浄し、 DMEM培地 10m 1を加え、 37°C、 5 % C02インキュベータ一中でー晚培養し た。 2日後、 培養上清を回収した。
(5-3) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C O S 7細胞培養上清からの ZAQを活性化するぺプチドの部分精製
(5-3-1) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C O S 7細胞培養上清抽 出液の調製
ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現 COS 7細胞培養上清を回収し、 以下 の操作を行い抽出液を調製した。 先ず、 細胞培養上清 （約 18.5ml) に終濃度が 1 に なるように酢酸 1. lmlを滴下し、 一時間攪拌した。 さらにその 2倍容量のァセ トンを加え、 4°Cにて 30分間攪拌し、 次いで高速遠心機 （CR26H、 23型ローター： 日立株式会社） を用いて 15， 000 rpm、 30分間遠心し上清を得た。 得られた上清を エバポレー夕一にかけ、 アセトンを除去した後、 凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社 ) にて凍結乾燥した。
(5-3-2) ヒト型 ZAQリガンド前駆体べプチド発現 C 0 S 7細胞培養上清の Sephadex G 50ゲルろ過クロマトグラフィー及び S e p P a kカラムク ロマ卜グラフィー
上記 （ 5 _ 3— 1 ) で得られた凍結乾燥粉末を 1 M酢酸 2 m 1に溶解後、 1 M酢 酸で平衡化した Sephadex G15 (直径 3cm、 35ml、 Pharmacia Biotech社)カラムに吸 着させた後、 1M酢酸をカラムに流し、 溶出液を 5m 1づっフラクション No.をつけ て分取し、 凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥させた。
SepPak C18 - 5gカラム （10ml) を、 メタノールにて膨潤後、 0.1% トリフルォロ酢 酸/蒸留水を流し、 平衡化した。 Sephadex G50ゲルろ過クロマトグラフィー分取フラ クシヨンのうちフラクション No.卜 16の凍結乾燥品をまとめて 0.1%トリフルォロ酢 酸/蒸留水 3mlに溶解し、 SepPak C18- 5gカラムに添着した後、 0.1% トリフルォロ 酢酸/蒸留水 24mlで洗浄後、 0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル 20mlで 溶出した。 得られた溶出液をサーバントにかけた。 (5-3-3) Sup e r OD S逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製 TSKgel Super 0DS逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 0.46 cm X 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 蒸留水） を流し、 平衡化した。 （5— 3— 2) で得られた SepPak C18- 5gカラムフラ クシヨンをサーバントにかけた後、 Super 0DS逆相高速液体クロマトグラフィーに添 着し、 流速 1 ml/minで 60分間で A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留水） 容量 100 %/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸/ 60% ァセトニトリル） 容量 0%から A液容量 0 %ZB液容量 100%まで直線的グラジェントで上昇させ、 溶出液を回収した。
溶出液を、 1 mlずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクション全量を凍 結乾燥機 （12EL ; VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に H/HBSSに 2.5mM Probenecid、 0.2% BSAを加えたもの 150 1を加えて溶解し、 この溶液を用いて下 記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC— B 1細胞に対する受容体活性化作用 を測定した。
(5-3-4) FL I PRを用いた細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性の測定 上記 （5— 3— 3) で得られたサンプルについて、 実施例 3 (3-5) で得られ た Z AQ発現細胞 （ Z AQ C— B 1 ) における細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性の 測定を FL I PRを用いて行った。 また、 対照として h0T7T175発現細胞 (h0T7T175 - 1 6； WO O 0/24890に記載）を用いた。
ZAQC-B 1細胞、 h0T7T175- 16細胞共に 10 %透析処理済ゥシ胎児血清 (以後 d FBSとする）を加えた DMEMで継代培養しているものを用いた。 ZAQC— B 1細 胞、 T7T175- 16細胞をそれぞれ 15X104cells/mlとなるように培地（10%dFBS- DMEM) に懸濁し、 FL I PR用 96穴プレート（Black plate clear bottom, Coster社）に分 注器を用いて各ゥエルに 200 ilずつ播き（3.0Xl04cells/200 l/ゥエル）、 5% C02 インキュベータ一中で 37°Cで一晩培養した後、 用いた（以後細胞プレートとする） 。 H/HBSS (HANKS' 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリ ゥムで PH7.4に合わせた後、 フィルター滅菌処理）21ml、 250mM Probenecid 210 1 、 ゥシ胎児血清 （FBS) 210 1を混合した。 また、 Fluo3-AM 2バイアル（50 ig) をジメチルスルフォキサイド 42 1、 20% Pluronic acid 42/ilに溶解し、 これを 上記 H/HBSS— Probenecid— FBS に加え、 混和後、 8連ピペットを用いて培養液を除い た細胞プレートに各ゥエル ずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中で 37 °Cで 1時間インキュベートした (色素口一ディング)。 上記 （5— 3— 3) で得られ たアツセィ用サンプルについて、 各フラクションに H/HBSSに 2.5inM Probenecid 、 0. 2% BSAを加えたもの 150 を加えて溶解し、 FL I PR用 96穴プレート（V- Bottom プレート、 Coster社)へ移した（以後、 サンプルプレートとする）。 細胞プレートの色 素ローディング終了後、 H/HBSSに 2.5inM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレ ートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄 後 100 1の洗浄バッファーを残した。 この細胞プレートとサンプルプレートを F L I PRにセットし、 アツセィを行った（FL I PRにより、 サンプルプレートから 0. 05mlのサンプルが細胞プレートへと移される）。 フラクション No.48- 68に ZAQC— B 1細胞特異的な細胞内 C a 2+イオン濃度上昇活性が見られた。 このことから、 目 的とする ZAQC— B 1細胞に対する受容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 Z AQ活性化成分は、 フラクション No.48- 68に溶出されていることが判明した。 実施例 6 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの哺乳動物細胞での産生 （2)
(6-1) 培養上清の調製
実施例 5に記載した方法で C O S 7細胞にヒト型 Z A Qリガンド前駆体べプチド 発現プラスミド （pCANZAQLg2) を導入した。 すなわち、 DMEM培地を用いて CO S 7細胞を 3· 0xl06cells/disliとなるよう 15cmシャーレにまき、 37°C、 5 % C02ィ ンキュベー夕一中で一晩培養した。 ヒト型 ZAQリガンド前駆体ペプチド発現ブラ スミド （pCANZAQLg2) 4/ g (4 1の TEバッファーに溶解） にバッファ一 EC (E ffectene trans feet ion reagent, QIAGEN) 600 1を加え、 さらに Enhancer 32 1を 加え、 1秒間混和後室温で 3分間放置した。 さらに Eifectene Transfection Reagen t 120^1を加え、 10秒間混和後室温で 10分間放置した。 前日にまいた細胞の上 清を除き、 DMEM培地 1 Om 1で 1回洗浄し、 DMEM培地を 30 m 1を加えた 。 プラスミド溶液に DMEM培地 lm 1を加えて混和後細胞に滴下し、 全体を混ぜ た後 37° (：、 5% C02インキュベータ一中で一晚培養した。 DMEM培地 10ml で 1回洗浄し、 DMEM培地 2 Om 1を加え、 37° (：、 5 % C02インキュベータ一 中で一晩培養した。 1日後、 培養上清を回収し、 さらに DMEM培地 2 Omlを加 え、 37° (：、 5% C02インキュベータ一中で一晩培養した後培養上清を回収した。 (6-2) 培養上清からのヒト型 Z A Qリガンドペプチドの精製
(6— 1) に記載した方法で 15 cmシャーレ 80枚分の培養上清を回収し、 こ れに酢酸を終濃度 1Mになるように添加した。 1時間攪拌した後、 2倍容のァセト ンを添加しタンパク質を析出させた。 4°Cにて 30分間攪拌し、 次いで高速遠心機 (CR26H、 RR10A型ローター： 日立株式会社） を用いて 10， 000 rpm、 30分間遠心し 上清を得た。 得られた上清をエバポレー夕一にかけアセトンを除去し、 あらかじめ 0 .1%トリフルォロ酢酸/蒸留水で平衡化した逆相カラム （Waters社 C18、 100 g) に流 した。 0.1%トリフルォロ酢酸/蒸留水 1000ml、 次いで 0.1%トリフルォロ酢酸 /20% ァセトニトリル lOOOmlでカラムを洗浄した後、 0.1%トリフルォロ酢酸/ 60%ァセト 二トリル 1000mlでペプチドを溶出した。 得られた溶出液をエバポレータ一にかけた 後、 凍結乾燥器 （12EL ； VirTis社） にて凍結乾燥した。
TSKgel ODS80TM逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 21. 5 mm X 30 cm) を、 40でにて、 流速 4m 1 /m i nで A液 （0.1%トリフルォロ酢 酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 得られた凍結乾燥粉末を A液に溶解した後、 当該 0DS80TMカラムに添着し、 流速 4m 1 /m i nで 120分間に A液 （0.1%トリフル ォロ酢酸/蒸留水） 容量 60%/B液 （0.1%トリフルォロ酢酸/ 60%ァセトニトリル ) 容量 40%から A液容量 0%ZB液容量 100%まで直線的グラジェントで上昇 させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 8m 1ずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションから 50 ^1を取り凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥物に H/ HBSSに 2· 5 Probenecid、 0.2% BSAを加えたもの 200 1を加えて溶解し、 この溶 液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC— B 1細胞に対する受容 体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細胞に対する受容 体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラクション No. 32 に溶出されていることが判つた。
TSKgel CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社 、 4.6腿 X 25 cm) を、 25°Cにて、 流速 1 m 1 /m i nで A液 （10 mMぎ酸アンモ ニゥム /10%ァセトニトリル） を流し、 平衡化した。 上記フラクション No.32を当該 C M-2SWカラムに添着し、 流速 lml /mi nで 60分間に A液 （10 mMぎ酸アンモニゥ ム /10% ァセトニトリル） 容量 100%ZB液 （1000 ぎ酸アンモニゥム /10% ァ セトニトリル） 容量 0%から A液容量 0%/B液容量 100%まで直線的グラジェ ントで上昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 lm 1ずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションから 1. 5 lを取り、 これを H/HBSSに 2.5mM Probenecid、 0. % BSA 希釈し、 この 溶液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC— B 1細胞に対する受 容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細胞に対する受 容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラクション No. 5 6および 57に溶出されていることが判つた。
TSKgel Super phenyl逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社 、 4.6腿 X 10 cm) を、 40°Cにて、 流速 lm 1 /m i nで A液 （0.1% トリフル ォロ酢酸/蒸留水） を流し、 平衡化した。 上記フラクション No.56および 57を当該 S uper phenylカラムに添着し、 流速 lm 1 /m i nで 60分間に A液 （0.1% トリフ ルォロ酢酸/蒸留水） 容量 70%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニト リル） 容量 30%から Α夜容量 50%/B液容量 50 %まで直線的グラジェントで 上昇させて、 ペプチドを溶出させた。
溶出液を、 lm 1ずつフラクション No.をつけて分取し、 分取フラクションから 1. 5 1を取り、 これを H/HBSSに 2.5mM Probenecid、 0. % BSA 200 xl希釈し、 この 溶液を用いて上記 （5— 3— 4) の試験法により、 ZAQC— B 1細胞に対する受 容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQC— B 1細胞に対する受 容体活性化作用を有する成分、 すなわち、 ZAQ活性化成分は、 フラクション No. 5 4、 55および 56に溶出されていることが判った。 本活性は単一な紫外吸収ピークと 一致し、 活性成分が単一にまで精製されたものと判断した。
Z AQ活性化成分精製標品中の溶媒を凍結乾燥して除去し、 得られた凍結乾燥物 を溶媒 DMSO (ジメチルサルフォキシド） に溶解した。 この溶液の一部 （約 7.5 p mol) をプロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosystems Procise 4 91cLC)を用いた N末端アミノ酸配列解析に供した。 その結果、 N末端のアミノ酸残 基から 10番目のアミノ酸残基のうち、 9残基を同定することができた （Ala Val I le T r Gly Ala Xaa Glu Arg Asp (配列番号： 31 ; Xaaは未同定残基） ） 。 得ら れたァミノ酸配列は、 予想されるヒト型 Z A Qリガンド成熟体べプチドの N端アミ ノ酸配列と一致した。 また、 ZAQ活性化成分精製標品の質量分析を Finnigan LCQ LC/MS装置 (Thernioduest, San Jose, CA)を用いて、 エレクトロスプレーイオン化法 により実施し、 分子量が 9657.6であることを確認した。 これは 10個のシスティン 残基がすべてジスルフィド結合を形成した 86残基のヒト型 ZAQリガンド成熟体 ペプチド （配列番号： 21) の理論値 9657.3に良く一致し、 ZAQ活性化成分精製 標品が、 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列を有するヒ卜型 ZAQリガンド 成熟体ぺプチドを有していることが確認された。
(6-3) 精製ヒト型 ZAQリガンドペプチドの ZAQ活性化作用の測定
上記 （6— 2) で精製したヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドの ZAQC— B 1細胞に対する受容体活性化作用を上記 （5— 3— 4) の試験法により測定した。 その結果、 ZAQ発現 CHO細胞 （ZAQC— B 1細胞） においてヒト型 ZAQリ ガンド成熟体ペプチドは濃度依存的に細胞内カルシウム濃度の上昇を惹起した。 E C5。値は 96 pMで、 ヒト型 ZAQリガンド成熟体ペプチドは非常に強いァゴニスト 活性を示すことが明らかとなった。 結果を図 10に示す。 実施例 7 ヒト型 ZAQリガンドペプチドの哺乳動物細胞での産生 （3)
(7-1) ヒト型 Z A Qリガンドぺプチド安定発現 C H〇細胞株の樹立
実施例 4に記載したプラスミド pHMITGを錶型として下記のプライマー
5' GTCGACCACCATGAGAGGTGCCACGC 3' (配列番号： 32)
5' ACTAGTCGCAGAACTGGTAGGTATGG 3' (配列番号： 33)
を用いてヒト型 ZAQリガンド cDNAを PCR増幅し、 pCR Blunt IIベクター （I nvitrogen社） にクロ一ニングした。 得られた正しい配列を有するクローンからイン サート cDNAを S a l I及び S p e I制限酵素を用いて切り出し、 pAKKOl.11H発 現ベクターに組み込んだ。 当該プラスミドを CHO/dhFr—細胞 （American Type Cultur e Collection) に、 上記 (3-5) に記載した CellPhect Transfection kit (Amers ham Pharmacia Biotech社） を用いた方法に従って形質導入した。 形質導入株数クロ ーンから培養上清を回収し、 （3— 5) に記載した試験方法により、 ZAQC— B 1細胞の細胞内 C a 2+イオン濃度を上昇させる Z AQリガンド活性を測定した。 こ れにより Z A Qリガンドを高発現する Z A Q L— 1発現 C H O細胞クローン No.4を 選別した。
(7-2) ヒト型 ZAQリガンド （ZAQL— 1) 発現 C HO細胞無血清培養上清 の調製
透析済み 10%ゥシ胎児血清 （JRH BIOSCIENCES社） 、 1 mM MEM非必須アミノ酸溶 液、 100 units/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycinを含む Dulbecco' s Modi fied Eagle Medium (DMEM) 培地 (日水製薬株式会社) で Single Tray (Nunc社) 4枚コンフルェントまで培養した ZAQL— 1発現 CHO細胞クローン No.4を、 ト リブシン処理して分散後、 遠心して回収した。 上記 Single Tray 1枚分の細胞を上記 培地 1.5 Lに懸濁後 Cell Factories 10 (Nunc社） に植え込み、 4基の Cell Factorie s 10について 37°Cで 5%炭酸ガス中にて 3日間培養した。 培養上清を除いた後、 前述 の H/HBSS 1 Lで 1基の Cell Factories 10の細胞を洗浄した。 H/HBSSを除いた後、 1 基の Cdl Factories 10あたり 2 Lの無血清培地 （1 πιΜ MEM非必須アミノ酸溶液、 100 units/ml Penicillin, 100
Figure imgf000114_0001
Streptomycinを含む Dulbecco' s Modified Ea gle Medium培地） を加えさらに 2日間培養した。 回収した培養上清を日立高速遠心機 で 1, 000 rpmで 10分間遠心後、 ガーゼを用いてろ過し清澄な上清を得た。 これに酢 酸を最終濃度 1 Mになるように添加し以下の操作を行った。
(7-3) ZAQL— 1発現 C HO細胞無血清培養上清のォクタドデシル逆相ク口 マトグラフィ一による粗分画
ォクタドデシル基を固定したシリカゲルを充填した PrepC18 (Waters社） をメタノ 一ルで膨潤後、 ガラス製カラムに充填した （50 MIX 100 mm) 。 その後、 1 M酢酸で 平衡化したカラムに、 （6— 2) で調製した抽出液を添着した。 次にこのカラムを 80 Om 1の 1 M酢酸で洗浄した。 次に、 このカラムに 1 000mlの 60 %ァセ トニトリル Z0. 1%トリフルォロ酢酸を流し、 目的とする粗ペプチド成分を溶出 した。 得られた溶出液を、 エバポレーターを用いて濃縮した後、 凍結乾燥機 （12EL ； VirTis社） にて凍結乾燥した。
(7-4) Wa k o s i 1— 1 I 5 C 18HG P r e 逆相高速液体クロマトグ ラフィ一による分離 Wakosil-II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （和光純薬、 2 0匪 X 250mm) を、 40°Cにて、 流速 5 m 1 Zm i nで A液 （0.1%トリフルォロ酢酸 /蒸留水） 容量 91.7%/B液 （0.1%トリフルォロ酢酸 Z60%ァセトニトリル） 容 量 8.3%を流し平衡化した。 上記 （7— 3) で得られた凍結乾燥物についてクロマト グラフィ一操作を行った。 即ち、 凍結乾燥物を 1 M酢酸 36mlを加えて溶解し遠 心後、 その内の 1Z3を当該カラムに添着した後、 流速 5ml/mlで、 1分間か けて A液容量 66.7%ZB液容量 33.3% まで上昇させ、 次いで 120分間かけて A液 容量 16.7%B液容量 83.3%まで、 B液濃度を直線的グラジェントで上昇させた。 溶 出液を 5 m 1ずつフラクション番号をつけて分取した。 分取フラクションより各 3 lづっ 0.2% BSA 150 l と混合し凍結乾燥機 （12EL； VirTis社） で凍結乾燥さ せた。 この乾燥物に、 アツセィバッファー 〔H/HBSS (二ッスィハンクス 2 (日水製 薬株式会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリゥム 0.35g、 HEPES 4.77 g、 水酸化ナトリゥ ム溶液で PH7.4に合わせた後、 フィルター滅菌処理） に、 2.5 Probenecidおよ び 0.1% CHAPS を添加したもの〕 150 lを加えて溶解し、 この溶液 50
Figure imgf000115_0001
を用い て上記 （3— 5) の試験法に従い、 ZAQ— Β 1受容体活性化作用を測定した。 そ の結果、 目的とする ZAQ— Β 1受容体活性化作用を有する成分は、 主としてフラ クシヨン No.73- 75に溶出されていることが判明した。
(7-5) TSKge l CM— 2 SWイオン交換高速液体クロマトグラフィーによ る分離
TSKgel CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 7.8X3 00mm) を 25°Cにて、 流速 2 ml/minで A液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留水：ァセトニ トリル = 1 ： 299 ： 100) 容量 100%、 B液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留水：ァセ トニトリル = 1 : 2 : 1) 容量 0%を流し平衡化した。 （7— 4) で得られた Wakosi 卜 II 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー分取フラクションのうちフラク シヨン No.73- 75を凍結乾燥したものを A液 4 mlに溶解し TSKgel CM- 2SWイオン交換力 ラムに添着した後、 流速 1 m 1 Zm i nで 120分間かけて A液容量 25 %ZB液 容量 75% まで直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出液を 2ml ずつフラクション番号をつけて分取し、 分取フラクションより各 10 lづっを 0.2% BSA 100 l 混合し凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） で凍結乾燥させた。 この乾燥 物に上記アツセィバッファ一 100 \ を加えて溶解しこれをさらに同バッファーで 100倍希釈し上記 （3— 5) の試験法に従い、 Z A Q受容体活性化作用を測定し た。 その結果、 目的とする ZAQ受容体活性化作用を有する成分はフラクション No. 95 - 100に溶出されていることが判明した。
(7-6) TSKge l ODS— 8 OTs逆相高速液体クロマトグラフィーによる
TSKgel 0DS-80TS 逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 4.6識 x 100 mm) を、 40でにて、 流速 lml Zm i nで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸 留水） 容量.91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニトリル） 容量 8.3 %を流し平衡化した。 上記 （7— 5) で得られたフラクション No.95-100の凍結乾燥 物についてクロマトグラフィー操作を行った。 即ち、 凍結乾燥物を 1 M酢酸 4 mlを加 えて溶解し当該カラムに添着した後、 流速 1 m 1 /m i nで、 1分間かけて A液容 量 75%/B液容量 25%まで上昇させ、 次いで 60分間かけて A液容量 25%B液 容量 75%まで B液濃度を直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出 液を lmlずつフラクション番号をつけて分取した。 （3— 5) に記載した方法に 従い Z AQリガンド活性を測定し、 当該活性が単一な紫外吸収ピークと一致するフ ラクシヨンに溶出されていることを確認した。 これより Z A Qリガンドが単一に精 製されたものと判断した。
(7-7) 精製された ZAQリガンドペプチドの構造解析
上記 （7— 6) で得られた ZAQリガンドペプチドについて以下の方法で構造決 定を実施した。 ZAQ活性化主成分精製標品中の凍結乾燥機 （12EL ; VirTis社） に て凍結乾燥した。 得られた凍結乾燥物を溶媒 DMS0 (ジメチルサルフォキシド）に溶解 した。 この溶液の一部をプロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosy s terns Procise 491cLC)を用いた N末端からのアミノ酸配列解析に供した。 その結果 、 予想されるヒト方 ZAQリガンドペプチド成熟体 (配列番号： 21)と一致する N 端アミノ酸配列を得た。 また、 Finnigan LCQ LC/MS装置を用いて、 エレクトロンス プレーイオン化法により質量分析を行い、 分子量が 9658.0であると算定した。 本測 定値はヒ卜型 ZAQリガンド成熟体ペプチド（配列番号： 21)の理論値 9657.3にと 良く一致し、 目的とする配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列を含有するぺプ チドが取得できたことが確認された。 実施例 8 へビ毒 M I T 1およびヒト型 ZAQリガンドと ZAQおよび I 5 Eとの 反応性
(8— 1) へビ毒 M I T 1の単離
(8-1-1) Wako s i 1— I I 5C 18HG P r e p逆相高速液体クロマ 卜グラフィ一による分離
Wakos i 1-11 5C18HG Prep逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （和光純薬、 20匪 X250匪） を、 40°Cにて、 流速 5 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留 水） 容量 91.7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニトリル） 容量 8.3% を流し平衡化した。 Black Mamba毒液 （Sigma社） 凍結乾燥品 50 mgに 1 M AcOH 4 ml を加え溶解し、 15,000 rpmで 10分間遠心して得られた上清についてクロマトグラフ ィー操作を行った。 サンプルを当該カラムに添着した後、 流速 5 ml/minで、 1分間か けて A液容量 91.7%/B液容量 8.3% まで上昇させ、 次いで 120分間かけて A液容量 3 3.4% B液容量 66.6%まで、 B液濃度を直線的グラジェントで上昇させた。 溶出液を 20分後から 10 mlずつフラクション番号をつけて分取した。 各フラクションから 1 a 1を採取し、 前述のアツセィバッファーで 10， 000倍希釈後、 上記 （3— 5) の試験法 に従い、 ZAQ— B 1受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ - B1 受容体活性化作用を有する成分は、 主としてフラクション No.2卜 23に溶出されてい ることが判明した。
(8-1-2) TSKge l CM— 2 SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー による分離
TSKgel CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一、 4.6X2 50讓） を 25°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留水：ァセト 二トリル = 1 ： 299 ： 100) 容量 100%、 B液 （4 Mギ酸アンモニゥム：蒸留水：ァ セトニトリル = 1 : 2 : 1) 容量 0%を流し平衡化した。 （7— 1) で得られた Wako sil-II 5C18HG Prep逆相高速液体ク口マトグラフィ一分取フラクシヨンのうちフラ クシヨン No.2卜 23を凍結乾燥したものを A液 4 mlに溶解し TSKgel CM- 2SWイオン交換 カラムに添着した後、 流速 1 ml/minで 90分間かけて A液容量 0%/B液容量 100%ま で直線的グラジェントで上昇させ溶出液を回収した。 溶出液を 1 mlずつフラクショ ン番号をつけて分取した。 各フラクションから 1 1を採取し、 前述のアツセィバッ ファーで 10, 000倍希釈後、 上記 （3— 5) の試験法に従い、 ZAQ- B1受容体活性化作 用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ-B1受容体活性化作用を有する成分は、 主 としてフラクション No.50-51に溶出されていることが判明した。
(8-1-3) Vyd a c 238TP 3410逆相高速液体クロマトグラフィーに よる分離
Vydac238TP3410逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （Vydac、 4.6mmxl00 nun) を、 40°Cにて、 流速 1 ml/minで A液 （0.1% トリフルォロ酢酸/蒸留水） 容量 91 .7%/B液 （0.1% トリフルォロ酢酸 /60% ァセトニトリル） 容量 8.3%を流し平衡 化した。 （8— 1— 2) で得られた TSKgel CM- 2SWイオン交換高速液体クロマトダラ フィ一分取フラクシヨンのうちフラクション No.50-51を直接当該カラムに添着した 後、 流速 1 ml/minで、 1分間かけて A液容量 75%/B液容量 25% まで上昇させ、 次い で 75分間かけて A液容量 41.7% B液容量 58.3%まで、 B液濃度を直線的グラジェン トで上昇させた。 溶出液を 0.5 mlずつフラクション番号をつけて分取した。 各フラ クシヨンから 1 1を採取し、 前述のアツセィバッファーで 10， 000倍希釈後、 上記 （ 3-5) の試験法により、 ZAQ— B 1受容体活性化作用を測定した。 その結果、 目的とする ZAQ— B 1受容体活性化作用を有する成分は、 主としてフラクション N 0.108- 115に溶出されていることが判明した。
(8- 1-4) 精製されたへビ毒 M I T 1の構造解析
上記 （8— 1— 3) で得られたへビ毒 MI T1について以下の方法で構造決定を 実施した。 精製した MI T 1を凍結乾燥機 （12EL ;VirTis社） にて凍結乾燥した。 得られたペプチド凍結乾燥物を溶媒 DMSO (ジメチルサルフォキシド） に溶解し た。 この溶液の一部をプロテインシークェンサ一（パーキンエルマ一社、 PE Biosyst ems Procise 491cLC)を用いた N末端からのアミノ酸配列解析に供した。 その結果、 予想されるへビ毒 MI T 1 (配列番号： 34) と一致する N端アミノ酸配列を得た 。 また、 Finnigan LCQ LC/MS装置を用いて、 エレクトロンスプレーイオン化法によ り質量分析を行い、 分子量が 8506.8であると算定した。 本測定値はへビ毒 MI T1 の理論値 8506.4に良く一致し、 目的とする配列番号： 34で表わされるアミノ酸配 列を含有するべプチドが取得できたことが確認された。
(8-2) 1 5 E安定発現細胞株の樹立
ヒト型 I 5E受容体 cDNA (配列番号： 35) を公知の P C R法によりクロー ニングし、 pAKKOl.11H発現ベクターに組み込んだ。 当該発現ベクターを （3— 5) に記載した方法に従い、 CHO/dtiFr—細胞 (American Type Culture Collection) に形 質導入した。 培養開始 10-14日後に生育してきた形質転換 CHO細胞のコロニーを約 20個選んだ。 選択した細胞を 3X104個/ wellで 96穴プレートに植え込み、 （3— 5 ) に記載した試験法に従い、 MI T 1に対する反応性を検討した。 反応性の良い I 5E発現 CHO細胞 4番クローン （I 5 E— 4細胞と略称する） を選別した。 配列番 号： 35で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号： 36に示す。
(8-3) ヒト型 ZAQリガンドペプチドおよび M I T 1の Z AQ受容体および I 5 E受容体活性化作用の測定
実施例 7に記載した方法で精製したヒト型 ZAQリガンドペプチド、 及び上記 （ 8— 1) に記載した方法で精製したへビ毒 M I T 1について、 それらの ZAQ受容 体活性化作用、 及び I 5E受容体活性化作用を （3— 5) に記載した方法に従い測 定した。 結果を 〔図 1 2〕 および 〔図 13〕 に示す。
その結果、 ヒト型 Z A Qリガンドペプチドおよびへビ毒 M I T 1は濃度依存的に 細胞内カルシウム濃度の上昇を惹起した。 へビ毒 M I T 1の ZAQ受容体活性化作 用はヒト型 ZAQリガンドペプチドのそれに比べて 10倍強かった。 また、 へビ毒 MI T 1のヒ卜型 I 5 E受容体活性化作用はヒト型 ZAQリガンドペプチドのそれ に比べて 100倍程度強いものであった。 実施例 9 ラット脳 cDNA由来新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （r Z AQ 1) をコードする cDNAのクローニングと塩基配列の決定
ラット全脳 c DNAライブラリー （CL0NTECH社） を铸型とし、 2種類のプライマ 一 （配列番号： 37および配列番号： 38) を用いて PCR反応を行った。 当該反 応における反応液の組成は上記 c DN Aを 10分の 1量銬型として使用し、 Advantag e-2 cDNApolymerase Mix (CLONTECH社） 1/50量、 プライマ一各 0·2 Μ、 dNTPs 200 βΜ および酵素に添付のバッファーを加え、 25 1の液量とした。 PCR反応は、 ① 94°C'2分の後、 ② 94°C'20秒、 72°C · 1分 30秒のサイクルを 3回、 ③ 94°Ο20秒、 68 °C · 1分 30秒のサイクルを 3回、 ④ 94°C'20秒、 62°C'20秒、 68°C 1分のサイクルを 36 回繰り返し、 最後に 68°C · 7分の伸長反応を行った。 当該 PC R反応後の反応産物を T0P0— TAクロ一ニングキット （Invitrogen社） の処方に従いプラスミドベクター p CR2.1 - T0P0 (Invitrogen社） へサブクローニングした。 これを大腸菌 DH5ひに導入 し、 cDNAを持つクローンを， アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した。 個 々のクローンの配列を解析した結果、 新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質を コードする cDNA (配列番号： 39) を得た。 当該 cDNAの塩基配列から導き 出されるアミノ酸配列 （配列番号： 40) には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列と 83.7%の相同性がみられた。 このアミノ酸配列を含有する新規 Gタンパク質 共役型受容体タンパク質を rZAQlと命名した。 また配列番号： 39で表わされる塩基 配列を含有する DNAを含有する形質転換体 （大腸菌） については、 ェシヱリヒア •コリ (Escherichia coli) DH5a/pCR2.1 - rZAQlと命名した。 実施例 10 ラット脳 cDNA由来 新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質 （ r ZAQ 2) をコードする c DNAのクローニングと塩基配列の決定
rZAQ2をコードするクローンは、 genetrapper法で取得した。 すなわち、 プローブ (配列番号： 41および配列番号： 42) をピオチン化したのち、 一本鎖にしたラ ット全脳 cDNAライブラリー （GIBC0— BRL社） とハイブリダィゼ一シヨンし、 得 られた一本鎖遺伝子をプライマー （配列番号： 43および配列番号： 44) を用い て二本鎖に修復した。 この遺伝子を大腸菌 DH10Bにエレクト口ポーレーシヨンし、 ァ ンピシリン耐性を指標として形質転換体を得た。 さらに、 プローブ （配列番号： 4 1) とプライマー （配列番号： 45) を用いたコロニー PCRで、 目的とする塩基 配列をコードするクローンを選択した。 このクロ一ンの塩基配列から予測される O RF (open reading frame) の塩基配列 （配列番号： 46) より導き出されるアミ ノ酸配列 （配列番号： 47) は、 rZAQlと 80.6%の相同性がみられた。 このアミノ酸 配列を含有する新規 Gタンパク質共役型受容体タンパク質を rZAQ2と命名した。 また 、 この genetrapper法で取得した形質転換体 （大腸菌） を、 ェシエリヒア 'コリ （Es cherichia coli) DHIOB/PCMV- rZAQ2と命名した。 実施例 11 モルモット回腸摘出標本を用いた収縮実験
モルモット （std:Hartley、 7- 8週令、 雄性、 体重 450 g程度） の頸動脈をはさみで 切断し失血死させた後、 開腹し回腸を摘出した。 回腸を、 95% 02-5% C02ガスを吹 き込んだ Tyrode液 （組成： 138 mM NaCK 2.7 mM KC1、 1.8 mM CaCl2、 0.5 mM MgCl2 、 1.1 niM NaH2P04、 11.9 mM NaHC03、 5.6 mM glucose) を入れたガラスシャーレに入 れ、 手術用はさみとピンセッ卜を用いて回腸に付着している脂肪片ゃ結合組織を除 去した後に、 約 1.5 cmの長さに切り標本として用いた。 この標本を 37°Cに暖めた 上記 Tyrode液を満たしたオーガンバス （20ml) 中に懸垂し、 0. 5 gの負荷を かけて 30分以上かけて安定させた。
回腸標本の収縮反応は、 NEC三栄の AMPLIFIER CASE 7747を用いて測定した。 アセチルコリン 1 Mを投与し最大収縮反応を測定した後に、 参考例 1の方法に準 じて得られたヒト型 ZAQリガンドペプチド （ZAQL - 1) または上記 （8— 1一 3) で得られたへビ毒 M I T 1を累積投与して収縮反応を測定した。 Z AQL_ 1と M I T 1の希釈には 0.05% bovine serum albuminを含む生理食塩水を用いた。
結果を 〔図 14〕 に示す。 ZAQL— 1および M I T 1により惹起される収縮反 応は、 アセチルコリン 1 xMにより惹起される収縮反応を 100 %としてパーセン 卜で示した。
その結果、 ZAQL— 1と M I T 1は容量依存的に強力な収縮反応を惹起した。 容量反応曲線から算出した ZAQL— 1および M I T 1の EC 5。値は、 それぞれ 1. 79 nMおよび 0.40 nMであった。 実施例 12 ZAQおよび I 5 E発現 CHO細胞膜画分を用いたバインディングァ ッセィ
(12— 1) 125 I— M I T 1の調製
[125I] -Bo 1 ton-Hunter Reagent (monoiodinated, 37 MBQ、 NEN社 NEX120)に含まれ るベンゼンを窒素ガスで留去後、 DMSO20 1を添加し、 ピペッティングして乾 固物を溶解した。 ここに Borateバッファ一 （組成； 100 mM H3B03、 H 8.5) で希 釈した 4 nmol の M I T 1を含む溶液 80 1を添加し、 直ちに混合後、 室温で 2時間 インキュベーションした。 その後、 10%ァセトニトリル- 0.1%トリフルォロ酢酸 200 lを添加し、 HP LC分離用サンプルとした。 これを室温にて流速 1 ml/minで A 液 （10%ァセトニトリル Z0.1%トリフルォロ酢酸） 容量 100%ZB液 （0.1% 卜 リフルォロ酢酸/ 40% ァセトニトリル） 容量 0%を流し、 平衡化した TSKgel Super - 0DS逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム （東ソ一株式会社、 0.46 cm x 10 cm ) に添着した後、 流速 lmlZmlで、 1分間かけて A液容量 60%ZB液容量 40% まで上昇させ、 次いで 60分間かけて A液容量 40%/B液容量 60%まで、 B液濃度を 直線的グラジェントで上昇させた。 溶出される [125I]-Bol ton-Hunter Reagentが導入 された M I T 1を手動で分取し、 バッファー （組成； 20 mM Tris、 1 mM EDTA、 0.2 % BSA、 0.1% CHAPS, 0.03% NaN3、 pH 7.4) で希釈し分注後、 _80°Cで保存した
(12-2) 細胞膜画分の調製
糸田胞膜画分は、 Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279 巻、 675-685頁、 1996年記載の方法に従い調製した。 10%透析済みゥシ胎児血清 （JR H BIOSCIENCES社） 、 1 MEM非必須アミノ酸溶液、 100 units/ml Penicillin, お よび 100 /xg/ml Streptomycinを含む Dulbecco s modified Eagle medium (DME M) 培地 （日水製薬株式会社） 中、 37t：、 5%炭酸ガス中にて受容体発現 CHO細胞 、 すなわち、 ZAQC-B1細胞または I 5 E— 4細胞を Singletray (Nunc) にて培養した 。 80-90%の細胞密度になったところで培養上清を捨て、 トレイに 1 g/1 EDTAを含む PBS (宝酒造） を 30 ml加え、 細胞を洗浄後、 上清を捨て上記 PBS- EDTAを 30 ml添加し 、 室温で放置した。 卜レイをしんとうし、 細胞を卜レイからはがし、 細胞懸濁液を 回収した。 さらに卜レイに上記 PBS- EDTA 10 mlを再度加えて洗浄し、 トレイに残つ た細胞をはがし、 最初に得られた細胞懸濁液細胞と混合した。 混合した細胞懸濁液 を、 高速遠心機 （T0MY RL601) を用いて 1,000 rpmで 5分間遠心した。 上清を捨て、 沈殿した細胞を一 80 で保存した。 この沈殿 （Singletray 1枚分） に破砕用バッ ファー （組成； 10 mM NaHC03、 5 mM EDTA, 0.5 mM phenylmethylsulfonylf luoride (PMSF)、 10 /xg/ml peps tat in-A, 20 g/ml leupeptin、 10 ^g/ml E-64) 4ml を添加し、 ピペッティングして沈殿を懸濁し、 次いでポリトロン （刃型 PTA7) を用 いて、 目盛り設定 4、 20秒間、 3回の条件で破砕した。 次に、 日立高速冷却遠心 機 CR26Hで No.26ローターを用い、 2, 500 rpmで 10分間遠心した。 得られた上清をさら に超遠心機 （日立ェ機 SCP70H) で SRP70AT口一ターを用いて、 35,000 rpmで 1時間遠 心した。 得られた沈殿にバインディングアツセィバッファー （組成； 20 inM Tris、 1 πιΜ EDTA、 0.5 mM PMSF、 10 g/ml pepstatin - A、 40 g/ml leupepiin, lOng/ l E - 64、 0.03% NaN3、 pH 7.4) 5 mlを添加し、 懸濁後、 Cell Strainer (FALCON 235 0) でろ過し、 ZAQC— B l細胞膜画分 （すなわち、 ZAQ膜画分） あるいは I 5 E— 4細胞膜画分 (すなわち、 I 5 E膜画分）を得た。 得られたそれぞれの膜画分の タンパク濃度を Coomassie Protein Assay Reagent (PIERCE) を用いて測定後、 100 ^ilずつ分注し、 一 80°Cで保存した。
0.1% BSAを含む上記 （12— 2) 記載のバインディングアツセィバッファ一にて 、 ZAQ膜画分は 10 ig/mlに、 I 5 E膜画分は 20 g/mlにそれぞれ希釈し、 200 ^1ずつチューブ （FMXON 2053) に分注した。 この希釈した各膜画分に、 試験化合 物 2 nl および 10 nM 125I-MIT1 2 lを添加し、 25°Cで 1時間インキュベーショ ンした。 試験化合物としては、 参考例 1の方法に準じて得られたヒト型 ZAQリガ ンドペプチド （ZAQL— 1) または上記 （8— 1一 3) で得られたへビ毒 MI T 1 (非標識 MI T 1) を用いた。
次に、 反応液にろ過バッファ一 （組成； 20 mM Tris、 EDTA、 0.1% BSA, 0.05% C HAPS, 0.03% NaN3 pH 7.4) 1.5 mlを加え、 バッファ一 （組成； 20 mM Tris、 0.3 % polyethyleneiniine, pH 7.4) で予め処理したガラス繊維ろ紙 GF/F (Whatman) で 直ちにろ過し、 反応チューブに再度ろ過バッファ一 1.5 mlを添加し同様にろ過した 。 ガラス繊維ろ紙の放射活性を、 ァカウンター （C0BRA、 Packard) を用いて測定し 、 125I-MIT1 結合量を測定した。 試験化合物として非標識 MI T1 (終濃度 1 ) を用いた場合の 1 I_MIT1結合量を非特異的結合量 (NSB)、 試験化合物を全く添加し ない場合の125I- MIT1結合量を総結合量 (TB)と定め、 最大特異的結合量 (TB- NSB)を算 出した。 また、 試験化合物を添加した際に得られた結合量めについても、 特異的結 合量 (B- NSB)を算出し、 最大特異的結合量に対するパーセント { %SPB=(B-NSB)/(T B - NSB) X 100 } を以つて試験化合物存在下の結合量を表わした。
ZAQ膜画分を用いた結果を 〔図 15〕 に、 I 5E膜画分を用いた結果を 〔図 1 6〕 に示す。
このバインディングアツセィ系で算出した非標識 MIT1の ICM値は、 38 pM (ZAQ 膜画分） 、 32 pM (I 5E膜画分） であった。 ZAQL- 1の ICM値は、 35 nM (ZAQ膜画分 ) 、 93 nM (I 5E膜画分） であった。 参考例 1 大腸菌でのヒ卜 ZAQリガンド （配列番号： 21) の製造
(参考例 1一 1 ) 大腸菌でのヒト Z AQリガンド発現プラスミドの構築
(a) 以下に示す 6種の DNA断片 # 1〜#6を用いて、 ZAQリガンドの構造 DN
Aを調製した。
#1 ：
5'-TATGGCGGTGATTACCGGTGCGTGCGAACGTGATGTGCAGTGCGGTGCGGGTACCTGCTGCGCGATTAGCCT
GTGGCTGCGTGGTCTG-3' (配列番号： 52) 、
#2:
5'-CGTATGTGCACCCCGCTGGGTCGTGAAGGTGAAGAATGCCATCCGGGTAGCCATAAAGTGCCGTTCTTCCGT AAACGTAAACATCATACCTG-3' (配列番号： 53) 、
#3:
5'-CCCGTGCCTGCCGAACCTGCTGTGCAGCCGTTTCCCGGATGGTCGTTATCGTTGCAGCATGGATCTGAAAAA CATTAACTTTTAGG-3' (配列番号： 54) 、
#4:
5'-CACATACGCAGACCACGCAGCCACAGGCTAATCGCGCAGCAGGTACCCGCACCGCACTGCACATCACGTTCG
CACGCACCGGTAATCACCGCCA-3' (配列番号： 55) 、
#5:
5'-AGGCACGGGCAGGTATGATGTTTACGTTTACGGAAGAACGGCACTTTATGGCTACCCGGATGGCATTCTTCA CCTTCACGACCCAGCGGGGTG-3' (配列番号： 56) 、
#6:
5'-GATCCCTAAAAGTTAATGTTTTTCAGATCCATGCTGCAACGATAACGACCATCCGGGAAACGGCTGCACAGC AGGTTCGGC-3' (配列番号： 57) 。 (b) DNAオリゴマーのリン酸化
5 ' 側になるべき上記 # 1および # 6を除いた 4種の DNAオリゴマー (# 2〜 #5) 各々を、 25 のリン酸化反応液 〔DNAオリゴマー 10 ig， 5 OmM Tri s-HCl, pH7.6, 1 OmM MgCl2, lmMスペルミジン， 1 OmM ジチオスレ イト一ル （以後 DTTと略記） ， 0. lmg/mlゥシ血清アルブミン （以後 BSAと略 記） ， IfflM ATP, 10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ （宝酒造） 〕 中 で 37°C * 1時間反応させ、 各オリゴマーの 5' 末端をリン酸化した。 フエノール 処理を行った後、 2倍量のエタノールを加え、 — 70°Cに冷却した後、 遠心で DN Aを沈殿させた。
(c) DNAフラグメントの連結
上記 （b) で得られた DNAフラグメントと上記 #1および #6を合わせ、 120 1とした。 この混合液を 90°Cで 10分間保持した後、 室温まで徐冷しァニーリ ングを行った後、 TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲ一ショ ン反応を行った。 ァニーリング夜 30 a 1にキッ卜に付属の I I液 30 1を加え 、 よく混合した後、 キットに付属の I液 60 1を加え、 37 ' 1時間反応させ 、 ライゲーシヨンを行った。 その後、 フエノール処理を行ない、 水層を回収して 2 倍量のエタノールを加え、 一 70°Cに冷却した後、 遠心で DNAを沈殿させた。 こ の様にして得られた DN Aフラグメントを T 4ポリヌクレオチドキナーゼ （宝酒造 ) によるリン酸化を行った後、 以下の工程（d)に供した。
(d) ZAQリガンド発現べクタ一の構築
発現用ベクターとしては PTC I I (特開 2000- 178297号に記載） を Nde lおよ び BamHI (宝酒造） で 37で · 2時間消化した後、 1%ァガロースゲル電気泳 動により 4.3kbの DNA断片を QIAduick Gel Extraction Kit (キアゲン社） を用 いて抽出し、 25 ^ 1の TE緩衝液に溶解した。 この pTC I Iの Nd e I、 B a mH I断片と上記により調製した ZAQリガンドの構造遺伝子 （配列番号： 58) を TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (宝酒造） を用いてライゲーシヨン反応を行つ た。 この反応液を 10 l用いて大腸菌 JM109コンビテントセル （東洋紡） を形 質転換し、 1 O^gZmlのテトラサイクリンを含む LB寒天培地上に播き、 37 でで 1晚培養し、 生じたテトラサイクリン耐性コロニー選んだ。 この形質転換体を LB培地で一晩培養し、 QIAprep8 Miniprep Kit (キアゲン社） を用いてプラスミド pTCh 1 ZAQを調製した。 この ZAQリガンド DNAの塩基配列をアプライドバ ィォシステムズ社モデル 377 DN Aシーケンサーを用いて確認した。 プラスミ p TChl ZAQを大腸菌 （Escherichia col i) MM294 (DE 3) に形質転換し 、 ZAQリガンド発現株 Escherichia coli匪 294ΦΕ3)/ pTChlZAQを得た。
(参考例 1一 2) ZAQリガンドの製造
上記の Escherichia coli匪 294 (DE3)/ pTCMZAQを 5. OmgZLのテトラサイク リンを含む LB培地 · 1L (1%ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%塩化ナ トリウム） を用いて 2 L容フラスコ中で 37° (：、 8時間振とう培養した。 得られた 培養液を 19 Lの主発酵培地 （1. 68%リン酸 1水素ナトリウム、 0. 3 %リン 酸 2水素カリウム、 0. 1%塩化アンモニゥム、 0. 05%塩化ナトリウム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 02%消泡剤、 0. 00025 %硫酸第 1鉄、 0. 0005%塩酸チアミン、 1. 5%ブドウ糖、 1. 5%ハイケースァミノ） を仕込 んだ 50L容発酵槽へ移植して、 30°Cで通気攪拌を開始した。 培養液の濁度が 5 00クレット単位になったところで、 イソプロピル一 —D—チォガラクトピラノ シドの最終濃度が I SmgZLになるように添加し、 さらに 4時間培養を行つた。 培養終了後、 培養液を遠心分離し、 約 200 gの湿菌体を取得し、 一 80°Cで保存 した。
この形質転換大腸菌 MM294 (DE3) Zp TChlZAQは、 受託番号 I F O 16527として財団法人発酵研究所 （ I FO) に寄託されている。
(参考例 1一 3 ) Z A Qリガンドの活性化
参考例 （1一 2) で得られた菌体 200 gに、 20 OmMトリス ZHC 1、 7M グァニジン塩酸塩 （pH8. 0) 400mlを加えて菌体を溶解した後、 遠心分離 (10000 rpm、 1時間） を行った。 上澄液に 0. 4Mアルギニン、 5 OmM 卜リス/ HC 1、 0. 2mM GSSG、 ImM GSH (pH8. 0) 10リツ トルを加えて、 4 で一晩活性化を行った。
(参考例 1—4) ZAQリガンドの精製
参考例 （1— 3) で活性化の終了した再生液を pH 6. 0に調整し、 5 OmMリ ン酸緩衝液 (pH6. α) で平衡化した S P—セファロ一スカラム （11. 3 cm X 15 c m) に吸着させた後、 600 mM N a C 1 / 50 mM Uン酸緩衝液 （ p H 6. 0) で溶出し、 ZAQリガンドを含むフラクションをプールした。 この画分を 5 OmM リン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化した CM— 5 PW (21. 5匪 X 1 5 OmmL) に通液し、 吸着、 洗浄した後、 0— 100%B (B=5 OmM リン酸緩 衝液 + 1M NaCl、 pH6. 05) の段階勾配 （60分） で溶出を行い ZAQリガ ンド画分 （溶出時間約 40分） を得た。 この画分を、 さらに 0. 1%トリフルォロ酢 酸で平衡化した C 4 P— 50 (21. 5膽1 DX 300腿 L、 昭和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 25— 50 % B (B ·· 80 %ァセトニトリル / 0. 1 %トリフル ォロ酢酸） の段階勾配 （60分） で溶出を行い、 ZAQリガンド画分 （溶出時間約 40分） をプールした後、 凍結乾燥を行い、 ZAQリガンド凍結乾燥粉末約 8 Omg を得た。
(参考例 1一 5) ZAQリガンドの特徴決定
(a) SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
参考例 （1一 4) で得られた ZAQリガンドを 10 OmM DTTを添加した S amp 1 e bu f f e r [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] に懸濁し、 95 °Cで 1分間加熱した後、 マルチゲル 15 Z 25 (第一化学薬品） で電気泳動を行つ た。 泳動後のゲルをクーマシ一 ·ブリリアント ·ブルー （Coomassie brilliant blu e) で染色した結果、 実施例 5で得られた COS 7細胞由来の組換え型 ZAQリガン ド標品と同じ位置に、 単一のタンパク質バンドが認められた。 このことから、 参考 例 （1—4) で得られた大腸菌由来の組換え型 ZAQリガンド標品は極めて高純度 であり、 C 0 S 7細胞から調製した組換え型 Z AQリガンドと分子量的に同一であ ることが分かった。
(b) アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L— 850 OA Amino Acid Analyzer) を 用いて決定した。 その結果、 ZAQリガンド （配列番号： 21で表されるアミノ酸 配列からなるペプチド） の D N Aの塩基配列から推定されるァミノ酸組成と一致し た （表 2) 。 表 2
1モル当たりの ZAQリガンドの塩基配列 アミノ酸 残 基 数 から予測される値
A s X 5 7 6
Th r 1} 3 3 4
S e r 3 4 4
G 1 x 5 0 5
P r o 5 6 6
Figure imgf000128_0001
T r p _ 0 9
酸加水分解 （6N HC 1 %フエノール、 110°C、 24及び 48時間加水分 解の平均値）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出 (c) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （PEアプライドバイオシス テムズ モデル 492) を用いて決定した。 その結果、 得られた ZAQリガンドの D N Aの塩基配列から推定された Z A Qリガンドの N末端アミノ酸配列と一致した (表 3) 。 表 3
検出された ZAQリガンドの塩基配列
残基 No PTH-アミノ酸1) から予測される
_ ipmol) _ アミノ酸
1 A 1 a (99) A 1 a
2 V a 1 (100) Va 1
3 I 1 e (91) I 1 e
4 Th r (57) Th r
5 G 1 y (70) G 1 y
6 A 1 a (89) A 1 a
7 N. D. Cy s
8 G 1 u (60) G 1 u
9 A r g (49) A r g
10 A s p (54) As p
1 1 V a 1 (79) Va 1
12 G 1 n (67) G 1 n
13 N. D. Cy s
14 G 1 y (54) G 1 y
15 A 1 a (65) A 1 a
16 G 1 y (47) G 1 y 17 Th r (32) Th r
18 N. D. Cy s
19 N. D. Cy s
20 A 1 a (36) A 1 a
1) フエ二一ルチオヒダン卜イン 150 pmo 1を用いて分析を行った。
N. D. は未検出を示す。
(d) C末端アミノ酸分析
C末端アミノ酸をアミノ酸分析計 （日立 L一 850 OA Amino Acid Analyzer) を用いて決定した。 得られた Z A Qリガンドは D N Aの塩基配列から推定された C 末端アミノ酸と一致した （表 4) 。 表 4
C末端アミノ酸 回収率 (%)
Ph e 49. 8
気相ヒドラジン分解法 （100°C， 3. 5時間）
(e) 質量分析
質量分析を nanoESIイオン源を装着した LCQイオントラップ質量分析計 （サーモク エス卜社製） を用いて行った。 その結果、 分子量 9657.55±0.89が得られ、 配列番号 ： 21の、 しかも配列番号： 21が含有する 10残基の Cy sが 5対のジスルフィ ド結合を形成した ZAQリガンドの理論分子量 (9657.3)と良く一致していた。
(参考例 1— 6) ZAQリガンドの活性測定 （FL I PRを用いた細胞内 C aィォ ン濃度上昇活性の測定）
参考例 （1一 4) で得られた純化された大腸菌由来の組換え型 ZAQリガンド標 品を実施例 5の方法を用いて、 活性測定 （FL I PRを用いた細胞内 C aイオン濃 度上昇活性の測定） を行った。 その結果、 実施例 5で得られた C O S 7細胞由来の 組換え型標品 （Z AQリガンドの精製品） と同等の活性を有していた。 産業上の利用可能性
本発明のペプチド、 本発明のペプチドをコードする D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） および本発明のペプチドに対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） は、 ①本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療 · 予防剤、 ②本発明のペプチドと本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング、 ③本発明のペプチドまたはその塩の定量、 ④遺伝 子診断剤、 ⑤アンチセンス D NAを含有する医薬、 ⑥本発明の抗体を含有する医薬 、 ⑦本発明の D NAを含有する非ヒト動物の作出、 ⑧構造的に類似したリガンド - 受容体との比較にもとづいたドラッグデザィン、 などの実施のために有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 2 0または配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩。
2 . 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するぺプチドである請求項 1記載のぺプチドまたはその塩。
3 . 配列番号： 2 0で表わされるアミノ酸配列を含有する請求項 1記載のペプチド またはその塩。
4 . 配列番号： 2 1で表わされるアミノ酸配列を含有する請求項 1記載のペプチド またはその塩。
5 . 配列番号： 2 2または配列番号： 2 3で表わされるアミノ酸配列と同一または 実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項 1記載のペプチド またはその塩。
6 . 請求項 1記載のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレ ォチド。
7 . D NAである請求項 6記載のポリヌクレオチド。
8 . 配列番号： 2 6または配列番号： 2 7で表される塩基配列を含有する請求項 7 記載の D NA。
9 . 配列番号： 2 8または配列番号： 2 9で表される塩基配列を含有する請求項 7 記載の D NA。
1 0 . 請求項 6記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
1 1 . 請求項 1 0記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
1 2 . 請求項 1 1記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のペプチドを生成 ·蓄 積せしめることを特徴とする請求項 1記載のぺプチドまたはその塩の製造法。
1 3 . 請求項 1記載のペプチドまたはその塩に対する抗体。
1 4. 請求項 1記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載のぺプチ ドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法。
1 5 . 請求項 1記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 3 6で表わされるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 請求項 1記載のぺプ チドまたはその塩と配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる 化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 6 . 請求項 1記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 請求項 1記載のぺプ チドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に 同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 7 . 請求項 1記載のペプチドまたはその塩および配列番号： 3 6で表わされるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 請求項 1記載のぺ プチドまたはその塩と配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同一または実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 8 . 請求項 1 4記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリーニン グ用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のペプチドまたはその塩と配列番号 ： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
1 9 . 請求項 1. 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 7記載のスクリーニン グ用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のペプチドまたはその塩と配列番号 ： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
2 0 . 請求項 1 8または 1 9記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
2 1 . 消化器疾患の予防 ·治療剤である請求項 2 0記載の医薬。
2 2 . 請求項 1記載のペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
2 3 . 消化器疾患の予防'治療剤である請求項 2 2記載の医薬。
2 4. 哺乳動物に対して、 請求項 1 4記載のスクリーニング方法または請求項 1 6 記載のスクリ一二ング用キッ卜を用いて得られうる、 請求項 1記載のぺプチドまた はその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また はその塩の有効量を投与することを特徴とする消化器疾患の予防 ·治療方法。
2 5 . 哺乳動物に対して、 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 7 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のペプチドまた はその塩と配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩の有効量を投与することを特徴とする消化器疾患の予防 ·治療方法。
2 6 . 消化器疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1 4記載のスクリ一ニン グ方法または請求項 1 6記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 請求 項 1記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一 または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合性 を変化させる化合物またはその塩の使用。
2 7 . 消化器疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1 5記載のスクリ一ニン グ方法または請求項 1 7記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 請求 項 1記載のペプチドまたはその塩と配列番号： 3 6で表わされるアミノ酸配列と同 一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩の使用。
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