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WO2004065419A1 - 抗体およびその用途 - Google Patents

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WO2004065419A1
WO2004065419A1 PCT/JP2004/000498 JP2004000498W WO2004065419A1 WO 2004065419 A1 WO2004065419 A1 WO 2004065419A1 JP 2004000498 W JP2004000498 W JP 2004000498W WO 2004065419 A1 WO2004065419 A1 WO 2004065419A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
monoclonal antibody
antibody according
amino acid
zaql
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/000498
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hirokazu Matsumoto
Yasuko Horikoshi
Yasushi Masuda
Tetsuya Ohtaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd, Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Priority to CA002514153A priority patent/CA2514153A1/en
Priority to US10/542,664 priority patent/US7662380B2/en
Publication of WO2004065419A1 publication Critical patent/WO2004065419A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibody having binding specificity for a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof. More specifically, the present invention is useful for a method for quantifying the polypeptide or its salt based on an antigen-antibody reaction, and for diagnosing and preventing / treating a disease involving the polypeptide or its salt using neutralizing activity.
  • the present invention is useful for a method for quantifying the polypeptide or its salt based on an antigen-antibody reaction, and for diagnosing and preventing / treating a disease involving the polypeptide or its salt using neutralizing activity.
  • Human ZAQ ligand-1 (a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) (hereinafter sometimes abbreviated as human ZAQL-1) is a ligand for the ZAQ receptor. It is a peptide having an ileal contraction effect (WO 02/06483).
  • a mature human Bv8 peptide (hereinafter sometimes abbreviated as human ZAQL-2), which is a mammalian peptide of force Bv8 having a similar structure to human ZAQ ligand-1, is composed of MAP kinase and PI. It activates -3-kinase and has a neuroprotective effect (Eur. J. Neuroscience 13, 1694, 2001).
  • Human ZAQL-1 is an endothelial cell growth factor (EG-VEGF) specific for endocrine tissue, and is involved in the formation of a highly permeable endothelial structure (fenestrate) that characterizes endocrine tissue, and
  • the transcriptional regulatory region of the human ZAQL-1 gene has a recognition site for hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), which is involved in the induction of expression under hypoxia, and gene induction may be induced under hypoxia. (Nature. 412, 877, 2001).
  • HIF-1 hypoxia-inducible factor-1
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, produced a plurality of monoclonal antibodies using human ZAQL-1 as an immunogen, and combined these to increase human ZAQL-1.
  • a monoclonal antibody which specifically reacts with a polypeptide or a salt thereof, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2;
  • the diagnostic agent according to (11) above which is a diagnostic agent for endometrial cancer, endometriosis or ovulation disorder.
  • the hybridoma cell according to (19) is cultured in vivo or in vitro, and the monoclonal antibody according to (6) or (7) is collected from the body fluid or culture.
  • (22) A method for preventing and treating endometrial cancer, endometriosis or ovulation disorder, comprising administering to a mammal an effective amount of the monoclonal antibody according to (1).
  • FIG. 1 shows the results of measuring the antibody titer in antisera of mice immunized with the human ZAQL-1-BTG complex.
  • one bite is mouse No.2
  • FIG. 2 shows a state in which a hybridoma derived from a mouse immunized with the human ZAQL-BTG complex is producing an antibody (result of absorption analysis).
  • FIG. 3 shows a state in which a hybridoma derived from a mouse immunized with the human ZAQL-BTG complex is producing an antibody (result of absorption analysis).
  • FIG. 4 shows a state in which a hybridoma derived from a mouse immunized with the human ZAQL-BTG complex is producing an antibody (result of absorption analysis).
  • FIG. 5 shows a state in which a hybridoma derived from a mouse immunized with the human ZAQL-BTG complex is producing an antibody (result of absorption analysis).
  • FIG. 6 shows the results of the competition method-EIA of ZL107a and ZL1-234a.
  • -Hin- is the reactivity between ZU-107a and ZAQL-1
  • 1- is the reactivity between ZL107a and ZAQL-2
  • Ichiichi is the reactivity between ZL1-234a and ZAQL-1.
  • reaction indicates the reactivity between ZL-234a and ZAQL-2.
  • FIG. 7 shows the results of the sandwich method-EIA using ZL 107a and ZL 234a.
  • —10 represents the reactivity of ZAQL-1
  • 1 ⁇ represents the reactivity of ZAQL-2.
  • Figure 8 shows ZAQL-1 ZAQ expression in the presence of ZL1-107, ZU-234a, or P2L-I Ta. Neutralizing effect on intracellular Ca 2+ ion concentration increasing activity using CH0 cells (ZAQC-B1). Represents In the figure, the black bars indicate the percentage of the activity of increasing the intracellular Ca 2+ ion concentration in ZAQC-B1 cells when ZL1-107a coexists with ZAQL-1 compared to the control (when no antibody was added).
  • FIG. 9 shows the elution position of human ZAQL-1 immunoreactivity in human plasma fractionated using reverse-phase HPLC.
  • FIG. 10 shows the elution position of human ZAQL-1 immunoreactivity in the plasma of a pregnant woman fractionated using reversed-phase HPLC.
  • FIG. 11 shows the elution positions of human ZAQL-1 immunoreactivity in follicular fluid fractionated using reverse-phase HPLC.
  • the protein has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (caprolactyl terminus) at the right end according to the “IS” example of peptide description.
  • the C-terminal may be any of a hydroxyl group, a carboxylate, an amide or an ester.
  • polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 examples include (1 to 5) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • An amino acid sequence obtained by adding several (1 to 5) amino acids to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: A polypeptide having an amino acid sequence in which the number (1 to 5) of amino acids in the amino acid sequence represented by 2 is replaced with another amino acid is used.
  • salts of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) And the like, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like are used.
  • Examples of a monoclonal antibody that specifically reacts with the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof include, for example, Monoclonal antibody specifically reacting with the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof, and the like.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a monoclonal antibody that specifically reacts with a polypeptide having the above or a salt thereof.
  • the antibody of the present invention is preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of the amino acids 8 to 9, 11, 15, 17, 21, 23, 25 to 28, 30, 34, At least one selected from the amino acids at positions 36 to 37, 39 to 40, 44 to 46, 48, 52 to 53, 55, 64, 66, 68, 70 to 73, 75 to 76 and 78 to 86 (preferably about 3 to 6) containing Reacts specifically. In addition, it does not recognize the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • an antibody that neutralizes the activity of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof.
  • Specific examples include a monoclonal antibody represented by ZL1-107a or ZL1_234a.
  • the antigen used for preparing the antibody of the present invention includes, for example, the same antigenic determinant as the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof. Any one of these, such as a (synthetic) peptide having one or more of these (synthetic) peptides can be used (hereinafter, these may be simply referred to as human ZAQL-1 antigen).
  • the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof can be produced according to a known method, for example, the method described in WO 02/06483, and a) Prepared from known tissues or cells of mammals such as humans, monkeys, rats, mice, etc. using known methods or modifications thereof. (b) Chemically prepared by known peptide synthesis methods using peptide synthesizers, etc. (C) also produced by culturing a transformant containing a DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof. You.
  • tissue or cells are homogenized, and then extracted with an acid or alcohol, and the extract is subjected to salting out and dialysis. Purification and isolation can be achieved by a combination of chromatography such as gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • examples of the synthetic peptide include those having the same structure as the above-described natural purified human ZAQL-1 antigen;
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 contains one or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at any position consisting of 3 or more, preferably 6 or more amino acids A peptide or the like is used.
  • the DNA is obtained by a known cloning method. It can be prepared according to a method [for example, a method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)].
  • the cloning method includes: (1) a DNA probe or DNA designed based on the amino acid sequence of a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof.
  • Examples include a method for obtaining a transformant containing a DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof by a PCR method.
  • the peptide as the human ZAQL-1 antigen can be obtained by (1) a known peptide synthesis method, or (2) a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. It can also be produced by cutting with an appropriate peptidase.
  • the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the peptide with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described below.
  • the peptide can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.
  • a free form it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when the peptide is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. it can.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenylmethyl Fmo c Aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to the sequence of the target peptide according to various known condensation methods.
  • the peptide is cleaved from the resin and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired peptide.
  • a partially protected peptide may be taken out using a chlorotrityl resin, an oxime resin, a 4-hydroxybenzoic acid-based resin, or the like, and the protecting group may be removed by a conventional means to obtain a desired peptide.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt, etc.) or as a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added to resin after activation of pre-protected amino acids.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; tertiary amines such as pyridine; ethers such as dioxane and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; An appropriate mixture or the like is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C. to about 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in about 1.5 to about 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, Boc, Yushari pentyloxycarbonyl, isopornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, B r- Z, ⁇ Damman chill O carboxymethyl mosquito Ruponiru, Bok Riffle O b acetyl, phthaloyl, formyl, 2 twelve Bok port phenylene Rusurufueniru, diphenyl phosphine Back Then oil, as a protecting group for c carboxyl groups such as Fm oc and the like is an alkyl group, C 3 _ s a cycloalkyl group, C 7 - 14 Ararukiru group, 2-Adamanchiru, 4 _ nitro base Njiru -.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and the like.
  • Groups derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are exemplified.
  • groups suitable for etherification include benzyl, tetrahydropyranyl, and t-butyl groups.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, C 1 -Bz 1, 2-nitrobenzyl, Br—Z, t-butyl and the like.
  • imidazole protecting group for histidine examples include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like. .
  • the activated form of the carboxylic acid group of the raw material includes, for example, the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4 —Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, HOB t)].
  • the activated amino group of the raw material includes, for example, the corresponding phosphoramide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon in a stream of hydrogen, hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, and trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon
  • Can be The elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of -20 to 40 ° C.
  • anisolphenol, thioanisole, methacrylol paracresol, dimethylsulfide, 1,1,2 It is effective to add a cation scavenger such as 4_butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • a cation scavenger such as 4_butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol,
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Another method for obtaining the amide form of the peptide is as follows: first, amidating the strong lipoxyl group of the sulfonic acid terminal amino acid, extending the peptide chain to a desired chain length on the amino group side, and then A peptide in which only the ⁇ -amino group protecting group at the N-terminal of the chain was removed and a peptide (or amino acid) in which only the protecting group of the C-terminal lipoxyl group were removed were prepared. In a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude peptide. The crude peptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired peptide.
  • the ⁇ -carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired peptide ester is obtained in the same manner as the peptide amide. be able to.
  • the human ZAQL-1 antigen can be directly immunized with the insolubilized one. Further, a complex obtained by binding or adsorbing a human ZAQL-1 antigen to a suitable carrier may be immunized.
  • the mixing ratio of the carrier (carrier 1) and the human ZAQL-1 antigen (hapten) depends on what kind of antibody can be efficiently produced against the human ZAQL-1 antigen bound or adsorbed to the carrier.
  • the hapten may be bound or adsorbed at an appropriate ratio.
  • a natural or synthetic polymer carrier commonly used in the production of antibodies to hapten antigens is used in a weight ratio of 0.1 to L: 0.0 with respect to 1 of hapten.
  • a bonded or adsorbed material can be used.
  • Natural polymer carriers include, for example, serum albumin of mammals such as sea lions, egrets, and humans, and thyroglobulins of mammals such as sea lions, egrets, and mammals such as sea lions, egrets, humans, and hidge Hemoglobin, keyhole limpet and mocyanine are used.
  • Synthetic polymer carriers include, for example, polyamino acids, polystyrenes, polyacrylics , Polymers such as polyvinyls and polypropylenes, and various latexes such as copolymers can be used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • diazonium compounds such as bisdiazobenzidine that crosslink tyrosine, histidine, and tributofan; dialdehyde compounds such as glutaraldite that crosslink amino groups; diisocyanate compounds such as toluene 1,2,4 diisocyanate; N, N'-o-Phenylene dimaleimide and other dimaleimide compounds bridging thiol groups, maleimide active ester compounds bridging amino groups and thiol groups, and carpoimide compounds bridging amino groups with carbonyl groups And the like are conveniently used.
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group on one of the amino groups for example, N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • the thiol group can be introduced by post-reduction, and a maleimide group can be introduced into the other amino group with a maleimide active ester reagent, and then both can be reacted.
  • Human ZAQL-1 antigen is administered to warm-blooded animals alone or in combination with a carrier or diluent to a site where antibody production is possible, for example, by intraperitoneal injection, intravenous injection, or subcutaneous injection. Is done. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration of c is usually performed once every 2 to 6 weeks, a total of about 2 to 10 times. Examples of warm-blooded animals include monkeys, egrets, canine guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice are preferably used for monoclonal antibody production.
  • a warm-blooded animal immunized with human ZAQL-1 antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization
  • the antibody-producing hybridoma of the present invention can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells.
  • Measurement of anti-human ZAQL-1 antibody titer in serum can be performed, for example, using the labeled human After reacting ZAQL-1 with antiserum, the activity of the labeling agent bound to the antibody is measured.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like, and P3U1 and the like are preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells used is usually about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at usually 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, usually 1 to 10 minutes.
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which the peptide is directly or adsorbed together with a carrier, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (used for cell fusion).
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme used for cell fusion
  • mice an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or a method for detecting the antibody of the present invention bound to a solid phase by adding protein A,
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 labeled with a radioactive substance, an enzyme, etc., after adding a hybridoma culture supernatant A method for detecting the antibody of the present invention bound to a solid phase by adding a polypeptide containing an acid sequence is exemplified.
  • Screening and breeding of the antibody of the present invention are usually performed in an animal cell culture medium (eg, RPMI 1640) containing 10 to 20% fetal calf serum with the addition of HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer of the antibody of the present invention in the antiserum described above.
  • the antibody of the present invention can be separated and purified in the same manner as in the separation and purification of a general polyclonal antibody.Immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange method) Adsorption / desorption method by body (eg DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G Specific purification method of collecting antibodies only, and dissociating the bonds to obtain antibodies).
  • a general polyclonal antibody eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange method
  • Adsorption / desorption method by body eg DEAE
  • ultracentrifugation method eg., ultracentrifugation method
  • gel filtration method e.g., antigen-binding solid phase or active adsorb
  • the antibody of the present invention can be produced by culturing the hybridoma cells in vivo or in vitro of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture.
  • Screening for a hybridoma producing the antibody of the present invention that does not react with a partial region thereof can be carried out, for example, by binding the peptide corresponding to the partial region to the antibody produced by the hybridoma. This can be done by measuring
  • a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 can be measured or detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as it is detected by chemical or physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • a sandwich method, a competition method, an immunometric method, a nephrometry method, and the like are used. From the standpoint of sensitivity and specificity, a sandwich method and a competitive method described later are preferable, and a sandwich method is particularly preferable.
  • the labeled antibody of the present invention (an antibody different from the antibody of the present invention insolubilized on a carrier) and a test solution
  • the activity of the labeling agent is measured.
  • it is represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the test solution.
  • the amount of the polypeptide containing the amino acid sequence or its salt is determined.
  • a method for quantifying a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 ′ or a salt thereof in a test solution which comprises:
  • a test wave is reacted with an insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), and further a labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction).
  • primary reaction an insolubilized antibody of the present invention
  • secondary reaction a labeled antibody of the present invention
  • the amount of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or the salt thereof (preferably human ZAQL-1) in the test wave can be determined. it can.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed at the same time or at different times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the antibody used in the primary reaction is the monoclonal antibody indicated by ZL1-234a
  • the antibody used in the secondary reaction is indicated by ZU-107a.
  • Monoclonal antibody used is preferred. If the antibody used in the primary reaction is the monoclonal antibody shown in ZL107a, the antibody used in the secondary reaction is shown in ZLl-234a.
  • Monoclonal antibodies are used. These antibodies are preferably used after being labeled with, for example, horseradish peroxidase (HRP).
  • the antibody of the present invention, the test solution, and the labeled polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof were competitively reacted and bound to the antibody.
  • SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof By measuring the ratio of the labeled amino acid sequence-containing polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO:
  • the polypeptide containing the amino acid sequence represented by 2 or a salt thereof is quantified.
  • This reaction method is performed using, for example, a solid phase method.
  • an anti-mouse IgG antibody (manufactured by ICN / CAPPEL) is used as an immobilized antibody.
  • a plate on which the immobilized antibody is present is provided with (i) an antibody of the present invention (eg, ZU-107a or ZLl-234a), (ii) a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 labeled with HRP or a salt thereof, and (iii) a test solution; Thereafter, the HRP activity adsorbed on the solid phase is measured, and the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof is quantified.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of the labeled antibody of the present invention, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen in the test solution with an excessive amount of the labeled antibody of the present invention, then adding a solid-phased antigen and binding the unreacted labeled antibody of the present invention to the solid phase, Separate the solid and liquid phases.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • Nephrometry measures the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in solution. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing laser-scattering is preferably used.
  • the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance includes a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a lanthanide element and the like. Is used.
  • a radioisotope e.g., [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], [ "c], etc.
  • the enzyme large preferably stable and specific activity, e.g., / 3-galactosidase,] 3-Darcosidase, alkaline phosphatase, rhodamine, malt oxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • fluorescent substances include cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience), fluorescamine, fluorescein isothiosineate, and the like
  • luminescent substances include, for example, luminol, luminol derivatives, reresiferin, lucigenin, and the like.
  • a piotin-avidin system can also be used for binding the antibody and the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • the measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • the measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • review and compendiums See “Hiroshi Irie, edited by “Radio Noatssey” (Kodansha, published in 1949), Hiroshi Irie, edited by Hiroshi Irie “Continuing Radio Imnoatssey” (Kodansha, published in 1954), "Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al.
  • the antibody of the present invention can quantify the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof with high sensitivity. It is useful for further elucidation of the physiological function of the protein and for diagnosis of diseases involving the polypeptide.
  • gastrointestinal diseases eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome
  • diseases associated with angiogenesis eg, cancer (eg, thyroid cancer, testicular cancer, adrenal tumor) , Kidney cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, endometrial cancer, etc.
  • diseases related to pregnancy eg, preeclampsia, placental growth retardation, imminent miscarriage, endometriosis, infertility, ovulation disorders, etc.
  • eating disorders Eg, an
  • the above polypeptide in a body fluid is quantified, and when the amount of the polypeptide is larger than that of a healthy person, for example, the blood concentration is about 3 fmol / ml or more, preferably about 3 fmol / ml or more. If it is 10 fmol / ml or more, diagnose as polycystic ovary syndrome.
  • the antibody of the present invention may be a disease involving a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof, for example, Diseases (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.), diseases involving angiogenesis
  • Diseases eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • diseases involving angiogenesis e.g, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome, etc.
  • cancer e.g., thyroid cancer, testicular cancer, adrenal gland cancer, kidney cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer , Colon cancer, rectal cancer, endometrial cancer, etc.
  • diseases related to pregnancy e.g, preeclampsia, placental growth retardation, imminent miscarriage, endometriosis
  • Infertility, ovulation disorders, etc. eating disorders (eg, anorexia nervosa, bulimia, etc.), sleep disorders
  • it is a prophylactic-therapeutic agent for a disease associated with angiogenesis or a disease related to pregnancy, and more preferably, a prophylactic-therapeutic agent for an endometrial cancer, endometriosis, ovulation disorder and the like.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, porcupine, sheep, pig, Oral or parenteral administration to mice, cats, dogs, and monkeys.
  • the dose varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for the treatment of polycystic ovary syndrome in adults, the antibody of the present invention is administered once.
  • the amount is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 5 times. It is convenient to administer parenterally about once to three times a day. In the case of oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-mentioned antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used, and suitable dissolution aids, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated catalyst)] and the like.
  • suitable dissolution aids for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated catalyst)] and the like.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit forms to be compatible with the dosage of active ingredient.
  • dosage unit examples include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., usually about 5 to 500 nig per dosage unit, especially about 5 to 500 nig for injections. l OOrag, other dosage forms preferably contain about 10-250 mg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • amino acids and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the relevant field.
  • amino acids may have optical isomers, L-form shall be indicated unless otherwise specified.
  • a 1 a Alanine
  • Th r Threonine
  • GMB S ⁇ - (4-maleimidobutyryloxy) succinimide: noimide BSA serum albumin
  • SEQ ID NOs used herein represent the amino acid sequences of the following peptides.
  • Example 2 shows the amino acid sequence of human ZAQL-2.
  • the hybridoma cells ZL1-107 obtained in Example 1 described below were obtained from December 9, 2002, at 1-1-1 Tsukuba East Higashi, Ibaraki Prefecture, Japan, in the central No. 6 (zip code 305-8566). Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, the Patent Organism Depositary, under the deposit number FERM BP-8256.
  • Example 1 The hybridoma cells ZL1-234 obtained in Example 1 described below were obtained from December 9, 2002, at 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japan, under the independence of Chuo No. 6 (zip code 305-8566). Deposited at the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, under the deposit number FERM BP-8257.
  • Human ZAQL-1 (SEQ ID NO: 1) used in the examples was obtained according to the method described in Reference Example 1 of m02 / 06483.
  • a complex of human ZAQL-1 and ⁇ thyroglobulin (BTG) was prepared and used as an immunogen. Dissolve 10 mg of BTG in 1 ml of 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) containing 0.1 M sodium chloride, mix with 1) 100% solution of SPDP 1.861, and react at room temperature for 60 minutes I let it. In addition, 160 imol dithiosley!
  • the solution was dispensed into a 96-well microphone plate at a ratio of 100 1 and left at 4 ° C for 24 hours.
  • the plate is washed with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4), and 25% Block Ace is used to block excess binding sites in the wells.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Buffer C [1% BSA, 0.4M NaCK 0.05% 2mM EDTA-Na [ethylenediamine] was added to each well of the obtained anti-mouse immunoglobulin antibody-binding microplate.
  • -N, N, N ', N'-Ethylenediamine-N, N, ⁇ ', ⁇ '-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate, DOJINDO Acid buffer, pH 7.0] and antiserum to the complex diluted with 1 C of buffer were added and reacted at 4 ° C. for 16 hours.
  • mice showing a relatively high antibody titer were immunized intravenously with 50 to 100 g of an immunogen dissolved in 0.2 ml of physiological saline intravenously.
  • the spleen was removed from the mouse, pressed with a stainless mesh, filtered, and suspended in Eagles' Minimum Essential Medium (MEM) to obtain a spleen cell suspension.
  • MEM Eagles' Minimum Essential Medium
  • P3U1 myeloma cell P3_X63.Ag8.Ul (P3U1) derived from a BALB / C mouse was used (Current Topics in Microbiology and Imnology, Vol. 81, p. 1, 1978).
  • the spleen cells and P3U1 were each washed three times with serum-free MEM, mixed with spleen cells and P3U1 at a ratio of 5: 1, and centrifuged at 800 rpm for 15 minutes to precipitate cells.
  • the precipitate is loosened gently, and 0.3 ml of 45% polyethylene glycol (PEG) 6000 (manufactured by Kochlite) is added.
  • PEG polyethylene glycol
  • MEM was added to the cells at a rate of 2 ml / min, and a total of 15 ml of MEM was added, followed by centrifugation at 600 rpm for 15 minutes to remove the supernatant.
  • This cell The precipitate is suspended in GIT medium (Wako Pure Chemical) containing 10% fetal bovine serum (GIT-10% FCS) so that 2 ⁇ 10 5 P3U1 per 1 ml, 24-well multi-dish (manufactured by Linpro Corporation) ) Were seeded in 1 ⁇ 1 ml of 1 ⁇ 1 ml. After seeding, cells were cultured overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide incubator.
  • HAT hypoxanthine lxl (T 4 M, aminopterin 4xl (T 7 M, thymidine 1. 6 ⁇ 10 "3 ⁇ ) be added in GIT_10% FCS medium (HAT medium) 1 Ueru per lml containing
  • the HAT selective culture was started by the following procedure: After 3 days, 6 and 9 days from the start of the culture, 1 ml of the old solution was discarded, and the HAT selective culture was continued by adding 1 ml of HAT medium. 9 to 14 days after the fusion, when the culture broth turned yellow (about lxlO 6 cells / ml), the supernatant was collected and the antibody titer was measured according to the method described in Example 1 (4).
  • the monoclonal antibody was purified from the ascites fluid obtained using a protein-A column. Recombinant solution of 6 to 20 ml of ascites diluted with an equal volume of binding buffer [3.5 M NaCK 0.05% NaN 3 in 1.5 M daricin (pH 9.0)], and then equilibrated with binding buffer in advance protein - A- Agarosu (Repl igen Co.) was subjected to a column and eluted with solvent away buffer specific antibodies [0. 1M Kuen acid buffer containing 0. 05% NaN 3 (pH3 0 .) ]. The eluate was dialyzed against PBS at 4 ° C for 2 days, filtered through a 0.22 22 filter (manufactured by Millipore), and stored at 4 or _80 ° C.
  • an enzymatic link immunosorbent assay (ELISA) method using a purified monoclonal antibody-bound solid phase was performed. That is, a 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) solution containing 2 g / ml of the antibody was dispensed at a rate of 100 ⁇ 1 into a 96-well microphone opening plate, and left at 4 ° C for 24 hours. According to the above method, the excess binding site of the gel is covered with a block ace, and the class of the immobilized antibody is determined by ELISA using an isotype typing kit (Mouse-Typer TM Sub-Iso typing Kit, Bio-Rad). , c ZL bets 222a of examining the subclass, H chain IgG2b, an L chain /, even the H chain any remaining three IgGl, L chain was kappa.
  • the antibody titers of the obtained four kinds of monoclonal antibody solutions were examined by the method described in Example 11- (5) above, and the binding amount of the labeled product was determined to be saturated binding as the antibody concentration used in the competition method-EIA.
  • the antibody concentration was determined to be about 50% of the volume (about 30-50 ng / ml).
  • the HRP-labeled human ZAQL-1 (diluted 400-fold with buffer C) obtained in (3) was added to the anti-mouse immunoglobulin antibody-conjugated microplate, and reacted at 4 ° C for 16 hours. . After the reaction, the plate was washed with PBS, and the enzyme activity on the anti-mouse immunoglobulin antibody-bound microplate was measured by the method described in Example 11- (4) above. Table 1 shows the results.
  • Example 2 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6 solution) containing 15 g / ml of the purified monoclonal antibody ZL 107a obtained in Example 1 was dispensed 100 1 at a time into a 96-well microphone opening plate at 4 ° C. Left for 24 hours. The excess binding site of the gel was inactivated by adding 400 l of blockage diluted 4-fold with PBS.
  • Fig. 7 shows the results.
  • the neutralizing activity of human ZAQL-1 by ZL107a and ZL234a was determined by using ZAQ-expressing CH0 cells (ZAQC-B1 cells) and TFLIPR described in Example 3 (5) of WO02 / 06483.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • dFBS dialysis-treated fetal serum
  • FLIPR FLIPR for 96-well plate (Black plate clear bottom, seeded by 200 1 each Ueru with dispenser to Coster, Inc.) (4xl0 4 cells / 200 l / Ueru ), were used after overnight culture at 37 ° C for at 5% C0 2 incubator (hereinafter referred to as the cell plate).
  • FLIPR Acetase buffer [Nissy Hanks 2 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 9.8 g, sodium hydrogen carbonate 0.35 g, HEPES 4.77 g, pH 7.4 with 6M sodium hydroxide solution, fill up to 1L, filter Sterilized] 20 ml, 250 mM Probenecid (SIGMA) 2001, and fetal calf serum (FBS) 2101 were mixed.
  • Fig. 8 shows the results.
  • ZL1- 234a is human ZAQL- 1 activity (3.3X10- I0 M), about 87% at equimolar concentrations 3.3x 10- 1Q M, high 10-fold molar 3.3X10- 3 ⁇ 4 But about 98% inhibition You can see that On the other hand, in the control antibody P2L-ITa, suppression of human ZAQL-1 activity was not observed even at 3.3 ⁇ 10 ′′ 9 M, which was 10 times higher in molar concentration than human ZAQL-1.
  • Human plasma was diluted 2-fold with the same volume of buffer C, and human ZAQL-1 was quantified by the sandwich method-EIA described in Example 4 above. Table 2 shows the results.
  • Solution B (0.05% trifluoroacetic acid in 60% acetonitrile) Elution method: Increase the acetonitrile concentration from 5% to 30% in the first 5 minutes, then increase linearly to 30-40% in 30 minutes.
  • Elution method Increase the acetonitrile concentration from 5% to 30% in the first 5 minutes, then increase linearly to 30-40% in 30 minutes.
  • human ZAQL- 1 is c it can be seen that the production or secretion is increased during pregnancy Therefore, since the blood human ZAQL-1 levels may be indicative of pregnancy, the antibody of the present invention is useful as a clinical diagnostic agent It is.
  • Example 9 the antibody of the present invention is useful as a clinical diagnostic agent It is.
  • the patient's follicular fluid was diluted 2-fold with the same amount of buffer 1C, and human ZAQL-1 was quantified by the sandwich method-EIA described in Example 4 above.
  • the follicular fluid was provided by a joint research project with the University of Tsukuba Clinical and Obstetrics and Gynecology Associate Professor Usuki, and was informed consent.
  • the University of Tsukuba and Takeda Pharmaceutical Company Limited 3 ⁇ 41 has been approved by the Ethics Committee ⁇
  • the antibody of the present invention has an extremely high ability to bind to a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof, and has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • polypeptides or salts thereof such as gastrointestinal disorders (eg, enteritis, diarrhea, constipation, malabsorption syndrome), diseases associated with angiogenesis [eg, cancer (eg, thyroid cancer, Testicular cancer, adrenal gland tumor, kidney cancer, lung cancer, kidney cancer, liver cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, uterus Intimal carcinoma, etc.), polycystic eggs Syndrome, ovarian hyperstimulation syndrome, etc.), pregnancy-related diseases (eg, preeclampsia, placental growth retardation, imminent abortion, endometriosis, infertility, ovulation disorders, etc.), eating disorders (eg, anorexia,
  • an agent is a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with angiogenesis or a disease related to pregnancy, and more preferably, a prophylactic / therapeutic agent for an endometrial cancer, endometriosis, ovulation disorder or the like.
  • a cancer expressing the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof was found, and anticancer therapy by missile therapy using the antibody of the present invention was conducted. Treatment is also possible.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof can be detected with high sensitivity and specificity by an immunoassay by the sandwich method using the two types of monoclonal animals of the present invention. Therefore, it is useful for elucidating the physiological function and disease state of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a salt thereof. Furthermore, by measuring the concentration of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or its salt in blood, for example, the above-mentioned diseases and the like can be diagnosed. Further, the antibody of the present invention can also be used for immunohistochemical staining of the polypeptide.

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Abstract

　　本発明の抗体は、ヒトZAQL-1への極めて高い結合能を有し、かつヒトZAQL-1の活性を中和することができ、ヒトZAQL-1の作用を抑制することにより、例えば、消化器疾患、血管新生を伴う疾患、妊娠に関連する疾患、摂食障害、睡眠障害、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤、診断薬として有用である。

Description

明 細書 抗体およびその用途 技術分野
本発明は、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチドまたはその塩に結合特異性を有する新規な抗体に関する。 更 に詳しくは、 抗原抗体反応に基づく該ポリペプチドまたはその塩の定量法、 中 和活性を利用する該ポリべプチドまたはその塩体が関与する疾患の診断および 予防 ·治療剤の開発に有用な抗体などに関する。 背景技術
ヒト ZAQリガンド- 1 (配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列を有するポリペプチド） （以下、 ヒト ZAQL-1と略記することもある） は、 ZAQ 受容体のリガンドであり、 回腸収縮作用を有するペプチドである （W0 02/06483 号公報） 。 また、 ヒト ZAQリガンド- 1に類似の構造を有する力エル Bv8の哺乳類 型べプチドであるヒト型 Bv8ぺプチド成熟体 （以下、 ヒト ZAQL-2と略記すること もある） は、 MAPキナーゼと PI- 3キナ一ゼを活性化し神経保護作用を有する (Eur. J. Neuroscience 13巻， 1694頁， 2001年） 。 その後、 これらのペプチド は、 DNA databaseより見出された新規ペプチド prokineticin-1 (PK-1) および prokineticin-1 (PK-2) としても報告された (Mol. Pharamacol. 59巻, 692頁, 2001年） 。
ヒト ZAQL-1は 内分泌性組織に特異的な内皮細胞細胞増殖因子 （EG-VEGF) と して、 内分泌組織を特徵づける透過性の高い内皮構造 （fenestrate) の形成に 関与していること、 およびヒト ZAQL-1遺伝子の転写制御領域には低酸素下での 発現誘導に関わる hypoxia-inducible factor- 1 (HIF-1) の認識部位が存在し、 低酸素下での遺伝子発現誘導が起こることが報告された （Nature. 412巻， 877 頁， 2001年) 。
ヒト ZAQL-1の生理機能をさらに明らかにするために、 ヒト ZAQL- 1を簡便かつ 高感度に検出 ·定量する測定系が切望されていた。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 ヒト ZAQL- 1を免疫原として、 モノクローナル抗体を複数作製し、 これらを組み合わせるこ とにより、 ヒ卜 ZAQL-1を高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発し た。 これより、 血液、 脳脊髄液、 尿などの生体成分中のヒト ZAQL-1の変動を簡 便にかつ高感度に測定することが可能となる。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する ポリぺプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクローナル抗体、
(2) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそ の塩に特異的に反応する上記 （1) 記載のモノクローナル抗体、
(3) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の、 第 8〜 9、 1 1、 1 5、 17、 21、 23、 25〜28、 30、 34、 36〜37、
39〜40、 44〜46、 48、 52〜53、 55、 64、 66、 68、 70 〜73、 75〜76および 78〜86番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも ひとつを含有するペプチドに特異的に反応する上記 （1) 記載のモノクローナ ル抗体、
(4) 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを認識し ない上記 （1) 記載のモノクローナル抗体、
(5) 標識化された上記 (1) 記載のモノクローナル抗体、
(6) Z L 1 - 107 (FERM B P- 8256) で標示されるハイプリ ドーマ細胞から産生され得る ZL 1 - 1 07 aで標示される上記 (1) 記載の モノクローナル抗体、
(7) ZL 1 - 234 (FERM B P— 8257 ) で標示されるハイブリ ドーマ細胞から産生され得る ZL 1—234 aで標示される上記 （1) 記載の モノクローナル抗体、
(8) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するぺ プチドに対して中和活性を有する上記 （1) 記載のモノクローナル抗体、
(9) 上記 （1) 記載のモノクローナル抗体を含有してなる医薬、
(10) 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の予防 ·治療剤である上記 (9) 記載の医薬、
(11) 上記 （1) 記載のモノクローナル抗体を含有してなる診断薬、
(12) 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の診断薬である上記 （1 1) 記載の診断薬、
(13) 上記 （1) 記載のモノクローナル抗体を含有してなる診断薬、
(14) 上記 （1) 記載のモノクロ一ナル抗体を用いることを特徴とする配 列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドまたはその塩の定量法、
(15) 上記 （1) 記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする配 列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
(16) 疾患が、 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害である上記 （1 5) 記載の診断法、
(17) 上記 （1) 記載のモノクローナル抗体と、 被検波および標識化され た配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結合した上記標識化さ れたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、 被検液中 の配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドまたはその塩の定量法-,
(17 a) 担体上に不溶化した上記 (1) 記載のモノクローナル抗体、 標識 化された上記 （1) 記載のモノクローナル抗体 （前記担体上に不溶化したモノ クローナル抗体とは異なる抗体） および被検波を反応させた後、 標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1または配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法、
(18) (a) 担体上に不溶化した上記 （6) 記載のモノクローナル抗体、 標 識化された上記 （7) 記載のモノクローナル抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定する、 または、
(b) 担体上に不溶化した上記 （7) 記載のモノクローナル抗体、 標識化された 上記 （6) 記載のモノクローナル抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1または配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
(19) 上記 （1) 記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリド一マ細 胞、
(20) Z L 1 - 107 (FERM BP— 8256) または ZL 1— 23 4 (FERM BP— 8257) で標示される上記 （19) 記載のハイブリド —マ細胞、
(21) 上記 （19) 記載のハイプリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養 し、 その体液または培養物から上記 （6) または （7) 記載のモノクロ一ナル 抗体を採取することを特徴とする上記 （6) または （7) 記載のモノクロ一ナ ル抗体の製造法、
(22) 哺乳動物に対して、 上記 （1) 記載のモノクローナル抗体の有効量 を投与することを特徴とする、 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の予 防 ·治療法、
(23) 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の予防 ·治療剤を製造する ための上記 （1) 記載のモノクローナル抗体の使用などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト ZAQL- 1-BTG複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 結果を表す。 図中、 一◊一はマウス No.1、 一口—はマウス No.2、 一△—はマウ ス No.3、 _〇—はマウス No.4、 一'. 一はマウス No.5、 —ローはマウス No.6、 - —はマウス No.7、 —〇—はマウス No.8を表す。
図 2は、 ヒト ZAQL-卜 BTG複合体を免疫したマウス由来のハイプリドーマが、 抗体を産生している状態 (吸光分析の結果) を表す。
図 3は、 ヒト ZAQL-卜 BTG複合体を免疫したマウス由来のハイブリド一マが、 抗体を産生している状態 （吸光分析の結果） を表す。 図 4は、 ヒト ZAQL-卜 BTG複合体を免疫したマウス由来のハイプリド一マが、 抗体を産生している状態 （吸光分析の結果） を表す。
図 5は、 ヒト ZAQL-卜 BTG複合体を免疫したマウス由来のハイプリドーマが、 抗体を産生している状態 （吸光分析の結果） を表す。
図 6は、 ZL卜 107aおよび ZL 1 - 234aの競合法- E IAの結果を表す。 図中、 ー秦ー は ZU - 107aと ZAQL- 1との反応性を、 一〇—は ZL卜 107aと ZAQL- 2との反応性を、 一議一は ZL 1 - 234aと ZAQL-1との反応性を、 一口—は ZL卜 234aと ZAQL- 2との反応 性を表す。
図 7は、 ZL卜 107aおよび ZL卜 234aを用いたサンドィツチ法- E IAの結果を表す。 図中、 —⑩一は ZAQL- 1の反応性を、 一〇一は ZAQL-2の反応性を表す。
図 8は、 ZL 1 - 107または ZU - 234aまたは P2L- I Ta共存時における ZAQL-1の ZAQ発 現 CH0細胞 （ZAQC- B1 ) を用いた細胞内 Ca2+イオン濃度上昇活性に対する中和作 用を表す。 図中、 黒棒は ZL1 - 107aを ZAQL- 1と共存させた時の ZAQC- B1細胞におけ る細胞内 Ca2+イオン濃度上昇活性のコントロール (抗体非添加時) に対する割 合を、 斜線棒は ZL1- 234aを ZAQL- 1と共存させた時の ZAQC- B1細胞における細胞内 Ca2+イオン濃度上昇活性のコントロール （抗体非添加時） に対する割合を、 白 棒は P2L-l Taを ZAQL- 1と共存させた時の ZAQC- B1細胞における細胞内 Ca2+イオン 濃度上昇活性のコントロール （抗体非添加時） に対する割合を示す。
図 9は、 逆相 HPLCを用いて分画したヒト血漿中のヒト ZAQL- 1免疫活性の溶出 位置を表す。
図 1 0は、 逆相 HPLCを用いて分画した妊婦血漿中のヒト ZAQL- 1免疫活性の溶 出位置を表す。
図 1 1は、 逆相 HPLCを用いて分画した卵胞液中のヒト ZAQL- 1免疫活性の溶出 位置を表す。 発明を実施するための最良の形態
本明細書におけるタンパク質 （ポリペプチド） は、 ペプチド標記の' IS例に従 つて左端が N末端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 (力ルポキシル末端) である。 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとす る、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基、 カルポキシ レート、 アミドまたはエステルの何れであってもよい。
配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドとしては、 例えば、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるァミノ 酸配列に数 （1〜5) 個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 配列番号： 1ま たは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に数 （1〜5) 個のアミノ酸が挿入 されたアミノ酸配列、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列中の数 （1〜5) 個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を 有するポリペプチドなどが用いられる。
配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドの塩としては、 生理学的に許容される酸 (例、 無機酸、 有機酸） や塩基 (例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容され る酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが 用いられる。
配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドまたはその塩に特異的に反応するモノクローナル抗体 （以下、 本発明の 抗体と称することもある） としては、 例えば、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその塩に特異的に反応 するモノク口一ナル抗体などが挙げられ、 好ましくは配列番号： 1で表される アミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクロ —ナル抗体などが挙げられる。
本発明の抗体は、 好ましくは、 配列番号： 1または配列番号： 2で表される アミノ酸配列の、 第 8〜9、 11、 15、 17、 21、 23、 25〜28、 3 0、 34、 36〜37、 39〜40、 44〜46、 48、 52〜53、 55、 64、 66、 68、 70〜73、 75〜 76および 78〜 86番目のアミノ酸 から選ばれる少なくとも一つ （好ましくは約 3〜6個） を含有するペプチドに 特異的に反応する。 また、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチドを認識しない。
さらに好ましくは、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列を有するポリペプチドまたはその塩の活性を中和する抗体である。
具体例としては、 Z L 1— 1 0 7 aまたは Z L 1 _ 2 3 4 aで標示されるモ ノクローナル抗体などが挙げられる。
以下に、 本発明の抗体の坊原の調製法、 および該抗体の製造法について説明 する。
( 1 ) 抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、 例えば、 配列番 号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドま たはその塩と同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する （合成） ぺプチ ドなど何れのものも使用することができる （以下、 これらを単にヒト ZAQL - 1抗 原と称することもある） 。
配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドまたはその塩は、 公知の方法、 例えば W0 02/06483号公報に記載の方法に 準じて製造でき、 さらに、 （a) 例えばヒト、 サル、 ラット、 マウスなどの哺乳 動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、 (b) ペプチド ·シンセサイザ一等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的 に合成、 （c) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチドまたはその塩をコードする DNAを含有する形質転換体を培養す ることによつても製造される。
(a) 該哺乳動物の組織または細胞からヒト ZAQL- 1抗原を調製する場合、 その組 織または細胞をホモジナイズした後、 酸、 またはアルコールなどで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換ク ロマ卜グラフィー、 ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一などのクロマ卜グラフ ィ一を組み合わせることにより精製単離することができる。
(b) 化学的にヒト ZAQL- 1抗原を調製する場合、 該合成ペプチドとしては、 例え ば上述した天然より精製したヒト ZAQL- 1抗原と同一の構造を有するもの、 配列 番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において 3個以上、 好ま しくは 6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のァミノ 酸配列を 1種あるいは 2種以上含有するべプチドなどが用いられる。
(c) DNAを含有する形質転換体を用いて配列番号： 1または配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を製造する場合、 該 DNAは、 公知のクロ一ニング方法 〔例えば、 Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法な ど〕 に従って作製することができる。 該クローニング方法とは、 （1) 配列番 号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドま たはその塩のァミノ酸配列に基づきデザィンした DNAプ口一ブまたは DNAプラィ マ一を用い、 cDNAライプラリーからハイブリダィゼ一ション法により配列番 号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドま たはその塩をコードする DNAを含有する形質転換体を得る方法、 または (2) 配 列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドまたはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインした DNAプライマ一を用い、
PCR法により配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有す るポリペプチドまたはその塩をコードする DNAを含有する形質転換体を得る方法 などが挙げられる。
ヒト ZAQL-1抗原としてのペプチドは、 （1) 公知のペプチドの合成法に従つ て、 または （2) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を 含有するポリぺプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによって製造する こともできる。
該ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによ つても良い。 すなわち、 該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはァミノ 酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離する ことにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基 の脱離としてはたとえば、 以下に記載された方法等が挙げられる。
(i) M. Bodanszky および M.A. Ondetti、 ペプチド シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年) (ii) Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグ ラフィ一、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて該ペプチドを 精製単離することができる。 上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合 は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用 いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒド ロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一ベン ジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— (2', 4'-ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメ チル） フエノキシ樹脂、 4- (2'， 4'-ジメトキシフエ二ルー Fmo cァミノ ェチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチド の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後 に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 目的のペプチド を取得する。 あるいはクロロトリチル樹脂、 ォキシム樹脂、 4ーヒドロキシ安 息香酸系樹脂等を用い、 部分的に保護したペプチドを取り出し、 更に常套手段 で保護基を除去し目的のぺプチドを得ることもできる。
上記した保護されたァミノ酸の縮合に関しては., ぺプチド合成に使用できる 各種活性化試薬を用いることができるが 特に、 カルポジイミド類がよい。 力 ルポジイミド類としては DCC、 N, N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N 一ェチル— N' _ (3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが挙げら れる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HOB t、 HO OB tなど） とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または HOB tエステルあるいは HOOB tエステルとしてあら かじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができ る。 保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ぺプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 たとえば N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N —メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハ ロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチル スルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサ ン、 テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリ ルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれ らの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用 され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 °C〜約 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常約 1 . 5 ないし約 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮 合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことに より十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られ ないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸 をァセチル化して、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 B o c、 夕一シ ャリーペンチルォキシカルポニル、 ィソポルニルォキシカルポニル、 4ーメト キシベンジルォキシカルポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカ ルポニル、 卜リフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2一二卜口フエ二 ルスルフエニル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが挙げられる c カルボキシル基の保護基としては たとえば アルキル基、 C3_sシクロアル キル基、 C7— 14ァラルキル基、 2—ァダマンチル、 4 _ニトロべンジル-. 4ーメ トキシベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシルおよびべンジルォキシカル ポニルヒドラジド、 タ一シャリ一ブトキシカルボニルヒドラジド、 トリチルヒ ドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化 によって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァ セチル基などの低級 （C ) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボ二ル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導され る基などが挙げられる。 また、 ェ一テル化に適する基としては、 たとえばベン ジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば Bz l、 C 1 - B z 1 , 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t-ブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 To s、 4ーメトキシー 2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 Bom、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが挙げられる。 .
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペンタクロロフエノ一 ル、 2, 4, 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァ ノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスク シミド、 N—ヒドロキシフ夕ルイミド、 HOB t) とのエステル] などが挙げ られる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン 酸アミドが挙げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd—黒あるいは Pd—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリウムによる還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一 般に _ 20 〜40°Cの温度で行われるが. 酸処理においてはァニソ一ル フ ェノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾ一ル パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイド、 1, 4_ブタンジチオール、 1, 2—エタンジチオールのようなカチ オン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基とし て用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチオフェノール処理により除去さ れ、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2—エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理 による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム、 希アンモニアなどによるアルカリ 処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手 段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 力ルポキシル末端アミ ノ酸のひ一力ルポキシル基をアミド化した後、 アミノ基側にペプチド鎖を所望 の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の α—ァミノ基の保護基のみを 除いたペプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除いたペプチド （ま たはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮 合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた 保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の 粗べプチドを得ることができる。 この粗べプチドは既知の各種精製手段を駆使 して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得る ことができる。
ぺプチドのエステル体を得るにはカルポキシ末端アミノ酸の α—カルボキシ ル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ペプチドのァ ミド体と同様にして所望のぺプチドのエステル体を得ることができる。
ヒト ZAQL- 1抗原は、 不溶化したものを直接免疫することもできる。 また、 ヒ ト ZAQL-1抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。 該担体 （キャリア一） とヒト ZAQL-1抗原 （ハプテン） との混合比は、 担体に結 合あるいは吸着させたヒト ZAQL-1抗原に対して抗体が効率よくできれば、 どの ようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、 通常ハプテン 抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担 体を重量比でハプテン 1に対し 0 . 1〜： L 0 0の割合で結合あるいは吸着させ たものを使用することができる。 天然の高分子担体としては、 例えばゥシ、 ゥ サギ、 ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばゥシ、 ゥサギなどの哺乳 動物のチログロブリン、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒト、 ヒッジなどの哺乳動物の ヘモグロビン、 キーホールリンペットへモシァニンなどが用いられる。 合成の 高分子担体としては、 例えばポリアミノ酸類、 ポリスチレン類、 ポリアクリル 類、 ポリビニル類、 ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種 ラテックスなどを用いることができる。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができる。 例えば、 チロシン、 ヒスチジン、 トリブトファンを架橋するビスジ ァゾ化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、 アミノ基同志を架橋するグルタ ルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、 トルエン一 2 , 4ージイソシァネ一 トなどのジイソシァネ一ト化合物、 チオール基同志を架橋する N, N'— o—フ ェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、 ァミノ基とチオール基を架 橋するマレイミド活性エステル化合物、 ァミノ基と力ルポキシル基とを架橋す るカルポジイミド化合物などが好都合に用いられる。 また、 アミノ基同志を架 橋する際にも、 一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬 (例えば、 3- (2-ピリジルジチォ）プロピオン酸 N-スクシンイミジル (SPDP) な ど） を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、 他方のアミノ基 にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、 両者を反応させ ることもできる。
( 2 ) モノクロ一ナルぉ体の作製
ヒト ZAQL- 1抗原は、 温血動物に対して、 例えば腹腔内注入、 静脈注入、 皮下 注射などの投与方法によって、 抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるい は担体、 希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完 全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい c 投与は、 通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 温血動物と しては、 例えばサル. ゥサギ、 ィヌ モルモッ卜、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ ニヮトリなどがあげられるが、 モノクローナル抗体作製にはマウスが好 ましく用いられる。
モノクロ一ナル抗体の作製に際しては、 ヒト ZAQL- 1抗原を免疫された温血動 物、 たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日 後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細 胞と融合させることにより、 本発明の抗体産生ハイプリドーマを調製すること ができる。 血清中の抗ヒト ZAQL- 1抗体価の測定は、 例えば後記の標識化ヒト ZAQL-1と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことによりなされる。 融合操作は既知の方法、 例えばケーラーとミルスタイン の方法 〔Nature、 256巻、 495頁 （1975年） 〕 に従い実施できる。 融合促進剤と しては、 ポリエチレングリコール (PEG) やセンダイゥィルスなどが挙げられる が、 好ましくは PEGなどが用いられる。 骨髄腫細胞としてはたとえば NS-1、 P3U1、 SP2/0, AP-1などがあげられ、 P3U1などが好ましく用いられる。 用いられる抗体 産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄細胞数との好ましい比率は、 通常 1： 1〜20： 1程 度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃度で添加さ れ、 通常 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°C、 通常 1〜10分間インキュベートするこ とにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明の抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用で きるが、 例えば配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含 有するポリぺプチドまたはその塩あるいはそれらの部分べプチドを直接あるい は担体とともに吸着させた固相 (例、 マイクロプレー卜) にハイプリドーマ培 養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 (細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が 用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合した本発明の抗体を検出 する方法、 抗免疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイ プリドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した配列番号： 1 または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを加え、 固相に結合した本発明の抗体を検出する方法などがあげられる。 本発明の抗体 のスクリーニング、 育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加して、 10〜20 %牛胎児血清を含む動物細胞用培地 （例 RPMI 1640) で行われる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の本発明の 抗体の抗体価の測定と同様にして測定できる。
本発明の抗体の分離精製は、 通常のポリクロ一ナル抗体の分離精製と同様に 免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過 法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aまたはプロテイン Gなどの活性吸着剤に より抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕 に従 つて行われる。
以上のようにして、 ハイプリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培 養し、 その体液または培養物から抗体を採取することによって、 本発明の抗体 を製造することができる。
なお、 （a) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチドの一部領域と反応する本発明の抗体を産生するハイプリドー マ、 および （b) 上記ポリペプチドとは反応するが、 その一部領域とは反応しな い本発明の抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングは、 例えば、 その 一部領域に相当するべプチドとハイプリドーマが産生する抗体との結合性を測 定することにより行うことができる。
以下に、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有す るポリペプチドまたはその塩の定量法 （免疫測定法） について、 より詳細に説 明する。
本発明の钪体を用いることにより、 配列番号： 1または配列番号： 2で表さ れるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドの測定または組織染色などによる検 出を行なうことができる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよ く、 また抗体分子の F (ab' ) 2、 Fab'または Fab画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定 液中の抗原量 （例えば、 ヒト ZAQL- 1量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一 抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原 を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれ の測定法を用いてもよい。 例えば、 サンドイッチ法 競合法 ィムノメトリツ ク法、 ネフロメトリ一などが用いられるが、 感度、 特異性の点で後述するサン ドイッチ法、 競合法が、 特にサンドィツチ法が好ましい。
( 1 ) サンドイッチ法
担体上に不溶化した本発明の抗体、 標識化された本発明の抗体 （担体上に不 溶化した本発明の抗体とは異なる抗体） および被検液を反応させた後、 標識剤 の活性を測定することにより被検液中の配列番号： 1または配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を定量する。 好まし くは、
( i ) 担体上に不溶化した ZL1- 107aで標示されるモノクローナル抗体、 標識化さ れた ZIJ- 234aで標示されるモノクローナル抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1または配列 番号： 2 'で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量 法、
( i i ) 担体上に不溶化した ZL卜 234aで標示されるモノクローナル抗体、 標識化 された ZL卜 107aで標示されるモノク口一ナル抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定することを特徴とする被検波中の配列番号： 1または配列 番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量 法などが挙げられる。
サンドイッチ法においては、 不溶化した本発明の抗体に被検波を反応 ( 1次 反応） させ、 さらに標識化された本発明の抗体を反応 （2次反応） させた後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検波中の配列番号： 1ま たは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその 塩 （好ましくはヒト ZAQL-1) の量を定量することができる。 1次反応と 2次反 応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識化剤および 不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法に よる免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は 必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以 上の抗体の混合物を用いてもよい。 サンドィツチ法による測定法においては、 例えば、 1次反応で用いられる抗体が ZL 1 - 234aで標示されるモノクロ一ナル抗 体である場合は、 2次反応で用いられる抗体は ZU -1 07aで標示されるモノク口 —ナル抗体が好ましく、 1次反応で用いられる抗体が ZL卜 107aで標示されるモ ノクロ一ナル抗体である場合は、 2次反応で用いられる抗体は、 ZLl-234aで標 示されるモノクローナル抗体が用いられる。 これらの抗体は、 例えば西洋ヮサ ビパ一ォキシダーゼ （horserad i sh perox i dase； HRP) で標識化されて用いられ るのが好ましい。 ( 2 ) 競合法
本発明の抗体、 被検液および標識化された配列番号： 1または配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化された配列番号： 1または配列番号： 2で表 されるァミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の割合を測定するこ とにより、 被検波中の配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列を含有するポリべプチドまたはその塩を定量する。
本反応法は、 例えば、 固相化法を用いて行う。
具体例としては、 抗マウス IgG抗体 （ICN/CAPPEL社製） を固相化抗体として用 い、 この固相化抗体の存在するプレートに、 （i) 本発明の抗体 （例、 ZU-107a または ZLl-234a) 、 (i i) HRPで標識化された配列番号： 1または配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、 および （i i i ) 被検液を添加し、 反応後、 固相に吸着した HRP活性を測定し、 配列番号： 1また は配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩 を定量する。
( 3 ) ィムノメトリック法
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 ある いは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、 次に 固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原 量を定量する。
( 4 ) ネフロメトリ一
ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不 溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物 しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメトリ一な どが好適に用いられる。
上記 （1 ) 〜 （4 ) において、 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤 としては、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質、 ランタニド元素など が用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔"c〕 などが、 酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば /3—ガラクトシダーゼ、 ]3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 ノ、° 一才キシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが、 蛍光物質としては、 例えばシァ ニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス 社製) など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィソチオシァネ一トなどが、 発光物質としては、 例えばルミノール、 ルミノール誘導体、 リレシフェリン、 ル シゲニンなどがそれぞれ挙げられる。 さらに、 抗体と標識剤との結合にピオチ ン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 例えばァガロース、 デキストラン、 セル口 ースなどの不溶性多糖類、 例えばポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコ ンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、 特別の条 件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操 作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照すること ができる [例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9 年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 (講談社、 昭和 5 4年発 行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川 栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川 栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GY」 Vol . 70 ( Immunochemi cal Techniques (Part A) ) ¾ 同書 Vol . 73 (Immunochemical Techniques (Par t B) ) 、 同書 Vol . 74
(Immunochemical Techniques (Par t 0) 、 同書 Vol . 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol . 92
(Immunochemical Techniques (Pari E:Monocl onal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) ) 、 同書 Vol . 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoc lonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミック プレス社発行） など参照] 。 したがって、 本発明のサンドイッチ免疫測定法な どよる測定系を構築する場合、 その方法は後述する実施例に限定されない。 以上のように、 本発明の抗体は、 配列番号： 1または配列番号： 2で表され るァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩を感度良く定量すること ができるので、 上記ポリぺプチドの生理機能のさらなる解明および上記ポリぺ プチドの関与する疾患の診断に有用である。 具体的には、 本発明の抗体を用い て、 体液中 （血液、 血漿、 血清、 尿など） に含まれる配列番号： 1または配列 番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の量を 測定することにより、 例えば、 消化器疾患 （例、 腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良 性症候群など） 、 血管新生を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 甲状腺癌、 睾丸癌、 副腎 腫瘍、 塍臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃 癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 子宮内膜癌など） 、 多嚢胞 性卵巣症候群、 卵巣過剰刺激症候群など〕 、 妊娠に関連する疾患 （例、 妊娠中 毒症、 胎盤発育不全、 切迫流産、 子宮内膜症、 不妊症、 排卵障害など） 、 摂食 障害 （例、 拒食症、 過食症など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障 害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） な ど） 〕 、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルツハイマー 病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損 傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 精神分裂病、 アルコール依存症、 パーキ ンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 ェ ィズ、 糖尿病など （好ましくは血管新生を伴う疾患、 妊娠に関連する疾患など さらに好ましくは、 子宮内膜癌、 子宮内膜症 排卵障害など） を診断すること ができる。 例えば、 多囊胞性卵巣症候群の診断においては、 体液中の上記ポリ ペプチドを定量し、 該ポリペプチドの量が健常人より多い場合、 例えば、 血中 濃度として約 3 fmol/ml以上、 好ましくは約 10 fmol/ml以上の場合、 多囊胞性卵 巣症候群と診断する。
また、 本発明の抗体は、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるァミノ 酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患、 例えば、 消化器 疾患 （例、 腸炎、 下痢、 便秘、 吸収不良性症候群など） 、 血管新生を伴う疾患
〔例、 癌 （例、 甲状腺癌、 睾丸癌、 副腎腫瘍、 塍臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 子宮内膜癌など） 、 多嚢胞性卵巣症候群、 卵巣過剰刺激症候群など〕 、 妊娠に関連する疾患 （例、 妊娠中毒症、 胎盤発育不全、 切迫流産、 子宮内膜症、 不妊症、 排卵障害など） 、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） 、 睡眠障害
〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時 間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾 患、 老人性痴呆、 アルツハイマー病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 精神分 裂病、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月 経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防 ·治療剤として有用 である。 好ましくは、 血管新生を伴う疾患、 妊娠に関連する疾患などの予防 - 治療剤、 さらに好ましくは、 子宮内膜癌、 子宮内膜症、 排卵障害などの予防 - 治療剤などである。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま 液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口 的または非経口的に投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ル一トなどによっても異なるが、 例えば、 成人の多嚢胞性卵巣症候 群の治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01 〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. 1 〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程度 好ましくは 1日 1〜3回程度、 非経口投与 するのが好都合である。 経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することがで きる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成 物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。 すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤 形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁 剤等があげられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分 野において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン 酸マグネシウム等が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗 体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶 解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プ ロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O - 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコ一ル等を併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプル に充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の 坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 (アンプル) 、 坐剤等が例示され、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常約 5〜500nig、 とりわけ注射剤では約 5〜 l OOrag, その他の剤形では約 10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ま しい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。 本発明の明細書において、 アミノ酸等を略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 アミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
TFA ： トリフルォロ酢酸
DMF ： Ν,Ν—ジメチルフオルムアミド
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：バリン
Leu ：ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As ：ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
P h e ：フエ二 Jレアラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
S PDP ： 3-（2-ピリジルジチォ）プロピオン酸 ス ί シンィミジル
GMB S ： Ν -（4-マレイミドプチリルォキシ）スクシ:ノイミド B S A ゥシ血清アルブミン
BTG ゥシチログロブリン
E I A HPLC 逆相高速液体ク口マトグラフィ
HRP 西洋ヮサビパーォキシダ一ゼ
FB S ゥシ胎児血清
d-FB S 透析済みゥシ胎児血清
TMB 3,3', 5,5'-：
H/HB S S 一ァー 溶液 本明細書において用いられる配列番号は、 以下のペプチドのアミノ酸配列を 表す。
〔配列番号： 1〕
ヒト ZAQL-1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト ZAQL- 1のアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の 48 番目の Valが lieに置換されている。
〔配列番号： 3〕
ヒト ZAQL-2のアミノ酸配列を示す。 後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 ZL1- 107は、 平成 14 (2002) 年 12月 9日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ一に、 寄託番号 FERM BP- 8256として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 ZL1- 234は、 平成 14 (2002) 年 12月 9日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) の独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 寄託番号 FERM BP- 8257として寄託されている。
なお、 各ハイプリド一マ細胞から得られる抗体については、 細胞名の後に 「a」 を付けた形で表す。 以下に、 実施例を示し、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の 範囲を限定するものではない。
実施例で用いたヒト ZAQL-1 (配列番号： 1) は、 m 02/06483号公報の参考例 1に記載の方法に従って得た。
実施例で用いたヒト ZAQL- 2 (配列番号： 3) は、 W0 02/62944号公報の参考例 1に記載の方法に従って得た。 実施例 1
(1) ヒト ZAQL- 1を含む免疫原の作製
ヒト ZAQL-1とゥシチログロブリンン (BTG) との複合体を作製し、 免疫原とし た。 BTG 10mgを、 0.1M塩ィ匕ナトリウムを含む 0.02Mリン酸緩衝液 (pH6.8) 1mlに 溶解させ、 SPDP 1.861½を含む1)¾^溶液100^1と混合し、 室温で 60分間反応させ た。 さらに、 160 imolのジチオスレィ！ ルを含む 0.1M酢酸緩衝液 （pH4.5) 0.19mlを加え、 室温で 30分反応させた後、 13，000n)mで 1分遠心後、 その上清を セフアデックス G-25カラム （溶離液、 2mM EDTAを含む 0.1Mリン酸緩衝液、 pH6.0) で分離し、 SH基の導入された BTGを得た。 次に、 ヒト ZAQL- 1 2mg
(207nmol) を含む 0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.8) に、 GMBS 2· 07 ΠΙΟ1を含む DMF50 1を加え、 室温で 60分反応させた。 反応液をセフアデックス G- 25カラム （溶離 液、 0.1Mリン酸緩衝液、 ρΗ6.7) で分離し、 マレイミド基の導入されたヒ卜 ZAQL- 1を得た。 次に、 SH基の導入された BTG 6.5mgとマレイミド基の導入され た抗体画分 1.2mgとを混合し、 4°Cで 24時間反応した。 反応後、 生理食塩水に対 し 4 で 3日間透析した。
(2) 免疫
6〜8週令の BALB/C雌マウスに、 上記 （1) で得られたヒト ZAQL- 1-BTG複合体 を、 それぞれ約 20 g/匹となるよう、 完全フロイントアジュバントとともに皮 下免疫した。 以後 3週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバン卜と ともに 2〜3回追加免疫した。 ( 3 ) 西洋ヮサビパ一ォキシダ一ゼ （HRP) 標識化ヒト ZAQL- 1の作製
ヒト ZAQL- 1と HRP (酵素免疫測定法用、 ベーリンガーマンハイム社製） .とを架 橋し、 酵素免疫測定法 （EIA) の標識体とした。
HRP 8. 5mg (213nmol) を 0. 95mlの 0. 1M塩化ナトリウムを含む 0. 02Mリン酸緩衝 液 （PH6. 8) に溶解させ、 SPDP 1. 99mgを含む DMF溶液 50 / 1と混合し、 室温で 60 分間反応させた。 さらに、 9. 25mgのジチオスレィトールを含む 0. 1M酢酸緩衝液 (pH4. 5) 0. 5mlを加え、 室温で 30分反応させた後、 セフアデックス G- 25カラム (溶離液、 2mM EDTAを含む 0. 1Mリン酸緩衝液、 H6. 0) で分離し、 SH基の導入さ れた HRPを得た。 ヒト ZAQL-l 2mgを 0. 1Mリン酸緩衝液 （pH6. 7) に溶解させ、 GMBS 0. 69mg (2. 5 ΙΟ1) を含む DMF溶液 50 1と混合し、 室温で 60分間反応させ たのち、 セフアデックス G- 25カラム （溶離液、 0. 1Mリン酸緩衝液、 PH6. 8) で分 離し、 マレイミド基の導入されたヒト ZAQL- 1を得た。 このようにして作製され た、 SH基の導入された HRP 1. 67mg (41. 4nmol) とマレイミド基の導入されたヒ ト ZAQL- 1 1. 2mg (124nmol) とを混合し、 4°Cで 1日反応させた。 反応後ウルトロ ゲル AcA44 (LKB-フアルマシア社製） カラムで分画し、 HRP標識化ヒト ZAQL-1を 得た。
( 4 ) ヒト ZAQL- 1-BTG複合体を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 ヒト ZAQL- 1-BTG複合体を 3週間間隔で 2回免疫を行い、 その 1週間後に眼底採血 を行い血液を採取した。 さらに血液を、 4°Cで 12，000ΠΜで 15分遠心した後、 上 清を回収し抗血清を得た。 抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。 抗 マウスィムノグロプリン抗体結合マイクロプレー卜を作製するため、 まず、 抗 マウスィムノグロブリン坊体 (IgG画分., 力ッペル社製) を 100 g/ml含む 0. 1M 炭酸緩衝液 （PH9. 6) 溶液を 96ウェルマイク口プレートに 100 1ずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。 次に、 プレートをリン酸緩衝生理食塩水 （PBS、 pH7. 4) で洗浄したのち、 ゥエルの余剰の結合部位をふさぐため 25%ブロックエース
(雪印乳業社製） を含む PBSを ずつ分注し、 4°Cで少なくとも 24時間処理 した。
得られた抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレ一卜の各ゥエルに バッファー C 〔1 % BSA、 0. 4M NaCK 0. 05% 2mM EDTA - Na 〔エチレンジアミ ン -N, N, N' , N' -四酢酸ニナトリゥム塩二水和物 (Ethylenediamine-N, N, Ν' ,Ν'- tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate) ， DOJINDO社〕 を含む 0.02Mリ ン酸緩衝液、 pH7.0〕 50 1、 およびバッファ一 Cで希釈した複合体に対する抗 血清 100 i 1を加え、 4°Cで 16時間反応させた。 次に、 該プレートを PBSで洗浄し たのち、 上記 （4) で作製した HRP標識化ヒト ZAQL- 1 (バッファ一 Cで 300倍希 釈） 100 lを加え、 室温で 1日反応させた。 次に、 該プレートを PBSで洗浄したの ち、 固相上の酵素活性を TMBマイクロウエルパ一ォキシダ一ゼ基質システム
(KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC, フナコシ薬品取り扱い） 100 1を加え室温で 10 分間反応させることにより測定した。 反応を 1Mリン酸 100^1を加え停止させた のち、 450M1の吸収をプレ一トリ一ダ一 （BICHR0MATI 大日本製薬社製） で測 定した。
結果を図 1に示す。
免疫した 8匹のマウス全ての、 ヒト ZAQL-1- BTG複合体に対する抗血清中に、 ヒ 卜 ZAQL-1に対する抗体価の上昇が認められた。
(5) 抗ヒト ZAQL-1モノクローナル抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して 50〜100 gの免疫原を生理食塩水 0.2mlに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。 最 終免疫 4日後のマウスから脾臓を摘出し、 ステンレスメッシュで圧迫、 ろ過し、 イーグルズ'ミニマム ·エッセンシャルメディウム （MEM) に浮遊させ、 脾臓細 胞浮遊液を得た。 細胞融合に用いる細胞として、 BALB/Cマウス由来ミエローマ 細胞 P3_X63.Ag8.Ul (P3U1) を用いた (Current Topics in Microbiology and Imnology, 81巻、 1頁、 1978年） 。
細胞融合は、 原法 （Nature、 256巻、 495頁 1975年） に準じて行なった。
脾臓細胞および P3U1をそれぞれ、 血清を含有しない MEMで 3度洗浄し、 脾臓細 胞と P3U1数の比率を 5:1になるよう混合して、 800回転で 15分間遠心を行ない細 胞を沈澱させた。 上清を充分に除去した後、 沈殿を軽くほぐし、 45%ポリェチ レングリコ一ル （PEG) 6000 (コッホライト社製） を 0.3ml加え、 37°C温水槽中 で 7分間静置して融合を行なった。 融合後、 細胞に毎分 2mlの割合で MEMを添加し、 合計 15mlの MEMを加えた後 600回転で 15分間遠心して上清を除去した。 この細胞 沈殿物を 10%牛胎児血清を含有する GITメディウム （和光純薬） （GIT-10% FCS) に、 P3U1が 1ml当り 2χ105個になるように浮遊し、 24穴マルチディッシュ （リン プロ社製） に 1ゥエル lmlずつ 192ゥエルに播種した。 播種後、 細胞を 37°Cで 5 % 炭酸ガスインキュべ一夕一中で培養した。 24時間後、 HAT (ヒポキサンチン lxl (T4M、 アミノプテリン 4xl (T7M、 チミジン 1. 6χ10"3Μ) を含んだ GIT_10 % FCS培地 （HAT培地） を 1ゥエル当り lmlずつ添加することにより、 HAT選択培養を 開始した。 HAT選択培養は、 培養開始 3、 6および 9日後に旧液を lml捨てた後、 lmlの HAT培地を添加することにより継続した。 ハイプリドーマの増殖は、 細胞 融合後 9〜14日で認められ、 培養液が黄変したとき （約 lxlO6セル /ml) 、 上清を 採取し、 実施例 1 ( 4 ) に記載の方法に従って抗体価を測定した。
ヒト ZAQL- 1- BTGを免疫したマウス由来のハイプリドーマの抗体産生細胞株を 選択した例として、 マウス No. 2と No. 3 (図 1参照） を用いて細胞融合を行い得 られたハイプリドーマの抗体産生状態を、 図 2〜図 5に示す。 得られた抗体産 生ハイプリドーマの中から下記の計 4種類のハイプリドーマを選択した 〔表 1〕 t 〔表 1〕
Figure imgf000028_0001
1) InMの抗原ヒト ZAQL-1が存在した時
+ ： (B B0) < 0. 50
土 : 0. 50≤ (Β Β0) < 0. 70
一 : 0. 70≤ (Β/Β0)
Β：抗原存在時の抗体に結合した HRP標識ヒト ZAQL- 1量
Β。：抗原非存在時の抗体に結合した HRP標識ヒト ZAQL- 1量 次に、 上記で得られた八イブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付 した。 クローニングに際しては、 フィーダ一細胞として BALB/Cマウスの胸腺細 胞を 5xl 05個 Zゥエルになるように加えた。 クロ一ニング後、 ハイプリドーマを、 あらかじめミネラルオイル 0. 5mlを腹腔内投与されたマウス （BALB/C) に 1〜 3xl 06セル/匹を腹腔内投与したのち、 6〜20日後に抗体含有腹水を採取した。 モノクローナル抗体は、 得られた腹水よりプロティン -Aカラムにより精製し た。 腹水 6〜20mlを等量の結合緩衝液 〔3. 5M NaCK 0. 05 % NaN3を含む 1. 5Mダリ シン （pH9. 0) 〕 で希釈したのち、 あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビ ナントプロテイン- A-ァガロース （Repl igen社製） カラムに供し、 特異抗体を溶 離緩衝液 〔0. 05 %NaN3を含む 0. 1Mクェン酸緩衝液 (pH3. 0) 〕 で溶出した。 溶出 液を PBSに対して 4°C、 2日間透析したのち、 0. 22 Π1のフィルター （ミリポア社 製） により除菌濾過し、 4 あるいは _80°Cで保存した。
モノクローナル抗体のクラス ·サブクラスの決定に際しては、 精製モノクロ ーナル抗体結合固相を用いるェンザィムーリンクトイムノソ一ベントアツセィ (ELISA) 法を行った。 すなわち、 抗体 2 g/mlを含む 0. 1M炭酸緩衝液 （pH9. 6) 溶液を 96ウェルマイク口プレートに 100 ^ 1ずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。 上記の方法に従って、 ゥェルの余剰の結合部位をブロックエースでふさいだの ち、 アイソタイプタイピングキット（Mouse- Typer™ Sub-I so typing Ki t バイオ ラッド社製）を用いる ELISAによって固相化抗体のクラス、 サブクラスを調べた c ZLト 222aは、 H鎖が IgG2b、 L鎖が/ であり、 残りの 3種はいずれも H鎖が IgGl、 L 鎖が κであった。 実施例 2
競合法酵素免疫測定法
ヒ卜 ZAQL-卜 BTGを免疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を 以下の方法により調べた。
まず、 得られた 4種類のモノク口一ナル抗体溶液の抗体価を上記実施例 1一 ( 5 ) 記載の方法により調べ、 競合法- EIAに用いる抗体濃度として、 標識体の 結合量が飽和結合量の約 50%となる抗体濃度を決定した （約 30〜50ng/ml) 。 次 に、 上記実施例 1一 （4 ) 記載の抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロ プレートに、 （i)各モノクローナル抗体を 50ng/mlとなるようバッファ一 Cで希 釈された抗ヒト ZAQL- 1抗体溶液 50 /1、 (ii) バッファ一 Cで希釈されたヒト ZAQL- 1溶液 50 1またはヒト2 レ2溶液50 1、 (iii) および上記実施例 1—
(3) で得られた HRP標識化ヒ卜 ZAQL- 1 (バッファ一 Cで 400倍希釈） 50^1を抗 マウスィムノグロプリン抗体結合マイクロプレートに加え、 4°Cで 16時間反応さ せた。 反応後、 PBSで洗浄したのち抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロ プレート上の酵素活性を、 上記実施例 1一 （4) 記載の方法により測定した。 結果を表 1に示す。
いずれの抗体も、 ヒト ZAQL- 1との反応性を有するが、 ヒト ZAQL-2に対しては 反応性を有していないことがわかる。
例として、 これらの中でヒト ZAQL- 1に対して最も高い反応性を示したモノク ローナル抗体 ZLl-107aおよび ZL卜 234aの競合法- EIAの結果を、 図 6および図 7 に示す。
ZL卜 107aおよび ZU- 234aのヒト ZAQL- 1の標準曲線から、 最大反応に対する割 合 (B/Bfl)=0.5を与えるヒト ZAQL- 1濃度は、 それぞれ 0.8nMおよび 1.2nMであるこ とが分かった。 これらの結果から、 ZL卜 107aおよび ZLl-234aは、 ヒト ZAQL- 1に 対して高い反応性を示しているものと考えられる。 実施例 3
HRP標識化抗ヒト ZAQL- 1モノクローナル抗体 (ZLl-234a-HRP) の作製
ZL1- 234a精製画分 8.51mg (56.7nmol) を含む 0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.8) に、 GMBS 0.68 . molを含む DMF 50μ1を加え、 室温で 40分反応させた。 反応液をセフ アデックス G- 25カラム (溶離液、 0.1Mリン酸緩衝液、 Η6.7) で分離し、 マレイ ミド基の導入された抗体画分 5.96nigを得た。 次に、 HRP 18.3mg (457nmol) を含 む 0.02Mリン酸緩衝液 （0.15M NaClも含む） (pH6.8) l. mlに、 SPDP 6.85M molを含む DMF 60 1を加え、 室温で 40分反応させた。 次に、 68.5 ΠΙΟ1のジチォ スレイト一ルを含む 0.1M酢酸緩衝液 （pH4.5) 0.4mlを加え、 室温で 20分反応さ せた後、 セフアデックス G-25カラム （溶離液、 2mM EDTAを含む 0.1Mリン酸緩衝 液、 PH6.0) で分離し、 SH基の導入された HRP 9.8mgを得た。 次に、 SH基の導入 された HRP 8mgとマレイミド基の導入された抗体画分 3mgとを混合し、 コロジォ ンバッグ （ザルトリウス社製） で約 0. 5mlにまで濃縮したのち、 4°Cで ί 6時間放 置した。 反応液を 0. 1Mリン酸緩衝液 (ρΗ6. 5) で平衡化した SephacrylS- 300HR力 ラム （Pharmac i a社製） に供し、 ZL卜 234a- HRP複合体画分を精製した。 実施例 4
サンドイッチ法- EIA
実施例 1で得られた精製したモノクローナル抗体 ZL卜 107aを 15 g/ml含む 0. 1M炭酸緩衝液 (pH9. 6溶液) を 96ウェルマイク口プレートに 100 1ずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。 ゥェルの余剰の結合部位を PBSで 4倍希釈したブロックェ ース 400 lを加え不活化した。
上記調製済みプレートに、 バッファ一 Cを含む 0. 0Mリン酸緩衝液 （pH7) で 希釈したヒ卜 ZAQL- 1またはヒト ZAQL- 2標準液を 1加え、 4°Cで 24時間反応さ せた。 PBSで洗浄したのち、 上記実施例 3で作製した ZLl- 234a-HRP (バッファー Cで 10, 000倍希釈） 100 i lを加え、 4°Cで 24時間反応させた。 PBSで洗浄したの ち、 実施例 1 ( 4 ) 記載の方法により TMBマイクロウェルパーォキシダーゼ基質 システムを用いて固相上の酵素活性を測定した （酵素反応 20分） 。
結果を図 7に示す。
このサンドィツチ法- EIAは、 ヒト ZAQL-1を 0. 1 fmo l/mLで検出することが可能 であり、 ヒト ZAQL- 2とは l OOOl fmol/mLまで反応しなかった。 したがって、 固相 抗体として ZLl- 107aを用い、 標識体として ZL卜 234a- HRPを用いるサンドイッチ 法 - EIMま、 ヒト ZAQL- 1を極めて高感度にかつ極めて選択的に検出することが可 能である。 実施例 5
ZL卜 107aおよび ZL卜 234aによるヒト ZAQL- 1の生物活性の中和作用
ZL卜 107aおよび ZL卜 234aによるヒト ZAQL- 1に対する中和活性を、 W0 02/06483 号公報の実施例 3 ( 5 ) 記載の ZAQ発現 CH0細胞 （ZAQC- B1細胞） および TFLIPR
(Mo lecul ar Devi ces社) を用いて、 細胞内 Ca2+イオン濃度上昇活性を指標に測 定した。 ZAQ発現 CHO細胞を、 1.2xl05cells/mlとなるように、 透析処理済ゥシ胎児血清 (dFBS) (JRH BIOSCIENCES社) を含む Dulbecco' s modified Eagle medium (DMEM) 培地 （日水製薬株式会社） （10% dFBS-DMEM) に懸濁し、 FLIPR用 96穴 プレート （Black plate clear bottom, Coster社） に分注器を用いて各ゥエル に 200 1ずつ播種し （4xl04cells/200 l/ゥエル） 、 5% C02インキュベーター 中にて 37°Cで一晩培養した後用いた （以後、 細胞プレートとする） 。 FLIPRアツ セィバッファー 〔二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9.8g、 炭酸水素ナ トリウム 0.35g、 HEPES 4.77g、 6M水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、 1Lにフィルアップし、 フィルター滅菌処理したもの〕 20ml、 250mM Probenecid (SIGMA社） 200 1、 ゥシ胎児血清 （FBS) 210 1を混合した。 また、 Fluo 3- AM (同人化学研究所) 2バイアル (50 g) を、 ジメチルスルフォキサイド 1、 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 1に溶解し、 これを H/HBSS 〔へ ぺスバッファ一ドハンクスバランス溶液 （二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式 会社） 9.8g、 炭酸水素ナトリウム 0.35g、 HEPES 4· 77 g、 水酸化ナトリウム 溶液で PH7.4に合わせた後、 フィルタ一滅菌処理） 〕 20 ml、 250 mM
Probenecid 200^K およびゥシ胎児血清 (FBS) 200^ 1からなる H/HBSS— Probenecid— FBS溶液に加え、 混和後、 8連ピペットを用いて培養液を除いた細 胞プレートに、 各ゥエル 100 1ずつ分注し、 5% C02インキュベータ一中で 37 1時間インキュベートした （色素ローデイング） 。 Z - 107aおよび ZU- 234aおよ びコントロール抗体として ZU- 107aおよび ZU- 234aと同じ IgGサブクラス構造
(IgGK κ) である抗 PrRPモノクロ一ナル抗体 (P2L-lTa) (Biochem. Biophys. Res. Conimun. , 257巻, 264-268頁 (1998年）) を、 2.5mM Probenecidと 0. % BSAを含む Hanks'/HBSS 120 1にて希釈し-. ヒト ZAQL-1 (1X10- ¾) と 37°Cで 1 時間インキュベーション後、 各フラクション 5 1を、 FLIPR用 96穴プレート （V - Bottomプレート、 Coster社） へ移した （以後、 サンプルプレートとする） 。 細 胞プレートの色素口一ディング終了後、 Hanks'/HBSSに 2.5mM Probenecidを加え た洗、净バッファーで、 プレ一卜ウォッシャー （Molecular Devices社） を用いて 細胞プレートを 4回洗浄し、 洗浄後 100 1の洗浄パッファーを残した。 この細胞 プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットし、 測定を行った （FLIPRにより、 サンプルプレートから 50/zlのサンプルが細胞プレートへと移される） 。
結果を図 8に示す。
これより、 ヒト ZAQL- 1 (3.3X10-'°M) の活性を、 ZL1- 107aは 3.3X 10_1()Mで約 97%、 10倍モル濃度の高い 3.3X10— ¾でも約 97%抑制したことがわかる。 ZL1- 234aは、 ヒト ZAQL- 1 (3.3X10-I0M) の活性を、 等モル濃度の 3.3X 10—1QMで約 87%、 10倍モル濃度の高い 3.3X10— ¾でも約 98%抑制したことがわかる。 一方、 コントロール抗体である P2L- ITaでは、 ヒト ZAQL- 1より 10倍モル濃度の高い 3.3 X 10"9Mにおいてもヒト ZAQL- 1活 t性の抑制は見られなかった。
CO
以上のことから、 ZL卜 107aおよび 00 CO ZL1- 234aは、 ヒト ZAQL- 1の細胞内 Ca2+上昇 活性を中和することが明らかとなり、 これら抗体は中和抗体として使用できる c 実施例 6
血漿中のヒ卜 ZAQL- 1の定量
ヒト血漿を、 同量のバッファー Cで 2倍希釈し、 上記実施例 4記載のサンド イッチ法- EI Aにより、 ヒト ZAQL- 1を定量した。 結果を表 2に示す。
〔表 2〕
ヒト血漿中 ZAQL— 1免疫活性
No. 男性 (fmol/ml) 女性（fmolZml)
1 0.84
2 1.39 0.90
3 1.43 2.03
4 2.06 4.46
5 1.52 1.20
6 4.10 1.02
7 1.92 1.65
8 1.35 0. 62
9 1.69 0.93
10 1.62
11 1.21
12 ヒト血漿（lml)中のヒト ZAQL-1量：
男性； 1. 84 + 0. 23 fmolZm mean土 SEM， n= 12)
女性； 1. 51 + 0. 35 fmolZml (mean土 SEM, n= 10)
実施例 7
ヒト血漿中のヒト ZAQL- 1の RP- HPLCによる検出
実施例 6に記載の、 ヒト血漿中に含まれるヒト ZAQL-1免疫活性を同定するた め、 ヒト血漿 10mlにァセトニトリル 20mlを添加して混和後、 遠心分離
(15， 000卬 m， 5分) を行い、 タンパク質の除去を行った。 上清を凍結乾燥後、 この画分を濃縮後、 カラム （0DS-80™) を用いる逆相 HPLCによって分画した。 カラム条件：
カラム： ODS-80™ (4. 6 X 250 mm)
溶離液： A液 （0. 05 %トリフルォロ酢酸含有 5 %ァセトニトリル）
B液 （0. 05 %トリフルォロ酢酸含有 60%ァセトニトリル） 溶出方法：ァセトニトリル濃度を最初の 5分間に 5 %から 30%まで上昇させ、 次に 30分間かけて 30- 40%に直線的に上昇させた。
流速： 1. 0 ml/分
分画： 0. 5ml/tube
溶出画分を凍結乾燥したのち、 250 ^ 1のバッファー Cに溶解させ、 上記実施 例 4記載のサンドイッチ法- EIAに供した。
結果を図 9に示す。
血漿中のヒト ZAQL-1の免疫活性は、 ほとんどヒト ZAQL- 1の溶出位置に検出さ れた （回収率 102 %) ことから、 該サンドイッチ法- EIAが、 ヒト ZAQL- 1を検出し ていることが確認された。
これより、 この測定系は、 血漿中のヒト ZAQL - 1の変動を研究する際の重要な 手段となる。 実施例 8
妊婦血漿中のヒト ZAQL- 1の定量 各週産期毎に得られた妊婦血漿を、 同量のバッファ一 Cで 2倍希釈し、 上記実 施例 4記載のサンドィツチ法- EIAによりヒト ZAQL- 1を定量した。 妊婦血漿は、 DCP社より購入したものであり、 インフォ一ムドコンセントの取られたものであ る。
結果を表 3に示す。
〔表 3〕
Figure imgf000035_0001
表 3から、 血中ヒト ZAQL-1濃度は、 妊娠初期 （妊娠 13週まで） に上昇し、 そ の後妊娠の経過とともに減少していき、 出産後正常レベルに戻ると考えられる 女性非妊時 (1. 51±0. 35 fmo l/ml)と比較すると、 妊娠初期 (4 - 13週) で約 4. 0 倍に上昇し、 妊娠後期 （28- 40週） でも約 2. 8倍に上昇していた。
これより、 ヒト ZAQL- 1は、 妊娠期に産生または分泌が上昇することがわかる c 従って、 血中ヒト ZAQL-1濃度は妊娠の指標となりうるため、 本発明の抗体は、 臨床診断薬として有用である。 実施例 9
妊婦血漿中のヒト ZAQL- 1の RP- HPLCによる検出
実施例 8に記載の、 妊婦血漿中に含まれるヒト ZAQL- 1免疫活性を同定するた め、 妊娠 11週の妊婦血漿 lmUこァセトニトリル 2mlを添加して混和後、 遠心分離 (15, 000rpm, 5分） を行い、 タンパク質の除去を行った。 上清を凍結乾燥後、 この画分を濃縮後、 カラム (ODS-80™) を用いる逆相 HPLCによって実施例 7と 同じ条件で分画した。
溶出画分を凍結乾燥したのち、 250 ^ 1のバッファー Cに溶解させ、 上記実施 例 4記載のサンドィツチ法- EIAに供した。
結果を図 1 0に示す。
妊婦血漿中のヒト ZAQL- 1の免疫活性は、 ほとんどヒト ZAQL- 1の溶出位置に検 出された （回収率 70%) ことから、 該サンドイッチ法- EIAが、 妊婦血漿中のヒ ト ZAQL- 1を検出していることが確認された。
これより、 妊娠期に、 血漿中のヒト ZAQL-1濃度が上昇していることがわかつ た。 実施例 1 0 .
卵胞液中のヒト ZAQL-1の定量
患者卵胞液を、 同量のバッファ一 Cで 2倍希釈し、 上記実施例 4記載のサンド イッチ法 -EIAによりヒト ZAQL-1を定量した。 卵胞液は、 筑波大学臨床医学系産 婦人科臼杵助教授との共同研究により供与されたものであり、 インフォ一ムド コンセントの取られたものである。 また、 筑波大学および武田薬品工業 （株） の¾1倫理委員会の承認を得られたものである <
結果を表 4に示す。
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
以上の結果から、 子宮内膜症および排卵障害を併発している患者の卵胞液中 において、 ヒト ZAQL- 1が高値を示したことより、 ヒト ZAQL-1の子宮内膜癌およ び子宮内膜症への関与が示唆された。 実施例 卵胞液中のヒト ZAQL- 1の RP- HPLCによる検出
実施例 1 0に記載の、 卵胞液中に含まれるヒト ZAQL-1免疫活性を同定するた め、 卵胞液 0. 45 mlにァセトニトリル 0. 9 mlを添加して混和後、 遠心分離
(15, 000rpm, 5分） を行い、 タンパク質の除去を行った。 上清を凍結乾燥後、 この画分を濃縮後、 カラム （0DS- 80™) を用いる逆相 HPLCによって実施例 7と 同じ条件で分画した。
溶出画分を凍結乾燥したのち、 1のバッファ一 Cに溶解させ、 上記実施 例 4記載のサンドィツチ法- EIAに供した。
結果を図 1 1に示す。
卵胞液中のヒト ZAQL- 1の免疫活性は、 ほとんどヒト ZAQL- 1の溶出位置に検出 されたこと （回収率 70%) から、 該サンドイッチ法- EIAが、 妊婦血漿中のヒト ZAQL-1を検出していることが確認された。 産業上の利用可能性
本発明の抗体は、 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列 を含有するポリペプチドまたはその塩への極めて高い結合能を有し、 かつ配列 番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド またはその塩の細胞内 [Ca2+]上昇活性を中和することができ、 配列番号： 1ま たは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその 塩の作用を抑制することにより、 例えば、 消化器疾患 （例、 腸炎、 下痢、 便秘， 吸収不良性症候群など） 、 血管新生を伴う疾患 〔例、 癌 （例、 甲状腺癌、 睾丸 癌、 副腎腫瘍、 塍臓癌、 肺癌、 腎臓癌、 肝臓癌、 非小細胞肺癌、 卵巣癌、 前立 腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌、 子宮内膜癌など） ， 多囊胞性卵巣症候群、 卵巣過剰刺激症候群など〕 、 妊娠に関連する疾患 （例、 妊娠中毒症、 胎盤発育不全、 切迫流産、 子宮内膜症、 不妊症、 排卵障害など） 、 摂食障害 （例、 拒食症、 過食症など） 、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズ ム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ポ ケ） など） 〕 、 季節鬱病、 生殖機能障害、 内分泌疾患、 老人性痴呆、 アルッハ イマ一病、 老化に伴う各種障害、 脳循環障害 （例、 脳卒中など） 、 頭部外傷、 脊髄損傷、 てんかん、 不安、 鬱病、 躁鬱病、 精神分裂病、 アルコール依存症、 パーキンソン病、 高血圧症、 動脈硬化、 不整脈、 月経前緊張症候群、 緑内症、 癌、 エイズ、 糖尿病などの予防 ·治療剤として有用である。 好ましくは、 血管 新生を伴う疾患、 妊娠に関連する疾患などの予防 ·治療剤、 さらに好ましくは、 子宮内膜癌、 子宮内膜症、 排卵障害などの予防 ·治療剤などである。 また、 配 列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドまたはその塩を発現している癌を見出し、 本発明の抗体を用いたミサイル療 法による抗癌治療も可能である。 本発明の 2種のモノクローナル坊体を用いるサ ンドイッチ法による免疫学的測定法により、 配列番号： 1または配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を感度よく特異 的に定量することができるため、 配列番号： 1または配列番号： 2で表される ァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の生理機能および病態との 解明に有用である。 さらに、 血液中の配列番号： 1または配列番号： 2で表さ れるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の濃度を測定すること により、 例えば、 上記疾患などの診断も可能である。 また、 本発明の抗体は、 上記ポリぺプチドの免疫組織染色にも使用可能である。

Claims

請求 の 範 囲
I . 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポ リペプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクロ一ナル抗体。
2. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその 塩に特異的に反応する請求項 1記載のモノクローナル抗体。
3. 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の、 第 8〜9、
I I、 15、 17、 21、 23、 25〜28、 30、 34、 36〜37、 39 〜40、 44〜46、 48、 52〜 53、 55、 64、 66、 68、 70〜 7 3、 75〜76および 78〜86番目のアミノ酸から選ばれる少なくともひと つを含有するべプチドに特異的に反応する請求項 1記載のモノク口一ナル抗体。
4. 配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチドを認識しな い請求項 1記載のモノク口一ナル抗体。
5. 標識化された請求項 1記載のモノク口一ナル抗体。
6. ZL 1 - 107 (FERM B P— 8256 ) で標示されるハイブリド —マ細胞から産生され得る ZL 1 - 107 aで標示される請求項 1記載のモノ クロ一ナル抗体。
7. ZL 1 - 234 (FERM B P— 8257 ) で標示されるハイブリド 一マ細胞から産生され得る ZL 1 - 234 aで標示される請求項 1記載のモノ クローナル抗体。
8. 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するぺプ チドに対して中和活性を有する請求項 1記載のモノクローナル抗体。
9. 請求項 1記載のモノク口一ナル抗体を含有してなる医薬。
10. 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の予防 ·治療剤である請求項 9記載の医薬。
11. 請求項 1記載のモノクローナル抗体を含有してなる診断薬。
12. 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の診断薬である請求項 1 1記 載の診断薬。
13. 請求項 1記載のモノクローナル抗体を含有してなる診断薬。
1 4. 請求項 1記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする配列番 号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドま たはその塩の定量法。
1 5 . 請求項 1記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする配列番 号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドま たはその塩が関与する疾患の診断法。
1 6 . 疾患が、 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害である請求項 1 5記 載の診断法。
1 7 . 請求項 1記載のモノクローナル抗体と、 被検液および標識化された配 列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結合した上記標識化された ポリぺプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、 被検液中の配 列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドまたはその塩の定量法。
1 8 . (a) 担体上に不溶化した請求項 6記載のモノクローナル抗体、 標識化 された請求項 7記載のモノク口一ナル抗体および被検液を反応させた後、 標識 剤の活性を測定する、 または、
(b) 担体上に不溶化した請求項 7記載のモノクローナル抗体、 標識化された請 求項 6記載のモノクローナル抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1または配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法。
1 9 . 請求項 1記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリド一マ細胞。
2 0 . Z L 1 - 1 0 7 ( F E RM B P— 8 2 5 6 ) または Z L 1 - 2 3 4 (F E RM B P - 8 2 5 7 ) で標示される請求項 1 9記載のハイブリド一マ 細胞。
2 1 . 請求項 1 9記載の八イブリド一マ細胞を生体内又は生体外で培養し、 その体液または培養物から請求項 6または請求項 7記載のモノク口一ナル抗体 を採取することを特徴とする請求項 6または請求項 7記載のモノクローナル抗 体の製造法。
2 2 . 哺乳動物に対して、 請求項 1記載のモノクローナル抗体の有効量を投 与することを特徴とする、 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の予防-治 療法。
2 3 . 子宮内膜癌、 子宮内膜症または排卵障害の予防 ·治療剤を製造するた めの請求項 1記載のモノクローナル抗体の使用。
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