JP4780365B2

JP4780365B2 - Ｍｃｈ受容体アンタゴニスト・アゴニストのスクリーニング方法

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Publication number: JP4780365B2
Application number: JP2001203705A
Authority: JP
Inventors: 正明森; 行生下村; 美穂子原田; 司周郷; 靖新谷
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2001-07-04
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2021-07-04
Also published as: JP2002296277A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オーファンレセプター蛋白質である配列番号：３で表されるタンパク質（WO 00/49046（ＰＣＴ／ＪＰ００／００９２７号））またはその塩とＭＣＨ（メラニン凝集ホルモン；Melanin Concentrating Hormone（Endocrinology, vol.125, 1660-1665 (1989)など）もしくはその誘導体またはその塩を用いることを特徴とする抗肥満薬または食欲調整薬などのスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的な受容体を介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節に与るホルモンや神経伝達物質の受容体の多くはguanine nucleotide-binding protein（以下、G蛋白質と略称する場合がある）と共役しており、このG蛋白質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらの受容体タンパク質は共通して7個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうした受容体はG蛋白質共役型受容体あるいは7回膜貫通型受容体と総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対する受容体蛋白質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対する受容体が存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
近年、ヒトゲノムDNAあるいは各種ヒト組織由来のcDNAのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知の蛋白をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。G蛋白質共役型受容体は、7個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのような蛋白の中から明確にG蛋白質共役型受容体として区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Polymerase Chain Reaction：以下、PCRと略称する）法によってもこうしたG蛋白質共役型受容体遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたG蛋白共役型受容体のうちには既知の受容体との構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、これらの受容体は対応するリガンドが見いだされていない。このことからこれらの受容体はオーファン受容体と呼ばれている。このようなオーファン受容体の未同定の内因性リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、その受容体作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Stadel, J. et al.、TiPS、18巻、430-437頁、1997年、Marchese, A. et al.、TiPS、20巻、370-375頁、1999年、Civelli, O. et al.、Brain Res.、848巻、63-65頁、1999年）。しかし、これまで実際にオーファンG蛋白質共役型受容体のリガンドを同定した例はそれほど多くない。
最近、幾つかのグループによってこうしたオーファン受容体のリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ReinsheidらおよびMeunierらは独立に、動物細胞にオーファンG蛋白質共役型受容体LC132あるいはORL1をコードするcDNAを導入して受容体を発現させ、その応答を指標としてorphanin FQあるいはnociceptinと名付けられた新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Reinsheid, R. K. et al.、Science、270巻、792-794頁、1995年、Meunier, J.-C. et al.、Nature、377巻、532-535頁、1995年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、受容体のノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Manabe, T. et al.、Nature、394巻、577-581頁、1998年）。
その後これまでに上記と同様な方法によりPrRP（prolactin releasing peptide）、orexin、apelin、ghrelinおよびGALP（galanin-like peptide）などの新規ペプチドがオーファンG蛋白質共役型受容体のリガンドとして単離された（Hinuma, S. et al.、Nature、393巻、272-276頁、1998年、Sakurai, T. et al.、Cell、92巻、573-585頁、1998年、Tatemoto, K. et al.、Bichem. Biophys. Res. Commun.、251巻、471-476頁、1998年、Kojima, M. et al.、Nature、402巻、656-660頁、1999年、Ohtaki, T. et al.、J. Biol. Chem.、274巻、37041-37045頁、1999年）。
一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドの受容体が同様な方法によって解明される場合もある。腸管収縮に関与するmotilinの受容体がGPR38であることが明らかにされた（Feighner, S. D. et al.、Science、284巻、2184-2188頁、1999年）ほか、SLC-1がメラニン凝集ホルモン（MCH）の受容体として同定され（Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年）、またGPR14（SENR）がurotensin IIの受容体であることが報告された（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年、Mori, M. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、265巻、123-129頁、1999年、Nothacker, H.-P. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、383-385頁、1999年、Liu, Q. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、266巻、174-178頁、1999年）。MCHはそのノックアウトマウスが羸痩のphenotypeを示すことから肥満に関与することが示されていたが（Shimada, M. et al.、Nature、396巻、670-674頁、1998年）、その受容体が明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有する受容体拮抗薬の探索が可能となった。また、urotensin IIはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年）。
このように、オーファン受容体およびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。しかし、オーファン受容体のリガンド探索においては多くの困難さが伴い、これまでに数多くのオーファン受容体の存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされた受容体はごく一部に過ぎない。
オーファンG蛋白質共役型受容体として渡辺らは新規受容体ＳＬＴ（本願明細書の配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質：以下、本明細書において、単にＳＬＴと称する場合がある）を見出した（WO 00/49046（ＰＣＴ／ＪＰ／００９２７号））が、そのリガンドが何であるのかはこれまで不明であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
オーファンレセプター蛋白質であるＳＬＴに対するリガンドの探索と、ＳＬＴおよびそのリガンドを用いることを特徴とする化合物などのスクリーニング方法の確立が課題とされている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＳＬＴ受容体蛋白を高発現するCHO細胞を作製し、種々の動物組織抽出物あるいは既知ペプチドを投与して受容体発現細胞の応答を検討した。その結果、予想外にも、MCHがＳＬＴ受容体発現CHO細胞に対して細胞内cAMP産生抑制活性を示すことを見出した。このことは、ＭＣＨがＳＬＴの内因性リガンドであることを示すものである。
本発明者らは、かかる知見に基づいて、ＭＣＨおよびＳＬＴを用いたスクリーニング系を用いて、より好ましくは、更にＭＣＨおよびＳＬＣ−１を用いたスクリーニング系と組み合わせることによって、ＭＣＨの介在する疾患の治療薬（ＭＣＨ拮抗薬あるいは作動薬など、具体的には抗肥満薬など）のスクリーニングができることを初めて見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）メラニン凝集ホルモン(ＭＣＨ）もしくはその誘導体またはその塩および配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とするＭＣＨまたはその塩と配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）さらにＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上記（１）記載のスクリーニング方法、
（３）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とするＭＣＨまたはその塩と配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（４）さらにＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする上記（３）記載のスクリーニング用キット、
（５）上記（１）記載のスクリーニング方法または上記（３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、ＭＣＨまたはその塩と配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（６）上記（５）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（７）抗肥満薬である上記（６）記載の医薬、
（８）ＭＣＨが配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである上記（１）記載のスクリーニング方法、
（９）ＭＣＨが配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである上記（３）記載のスクリーニング用キット、
（１０）誘導体が配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである上記（１）記載のスクリーニング方法、
（１１）誘導体が配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである上記（３）記載のスクリーニング用キット、
（１２）誘導体がボルトンハンター試薬により誘導されたＭＣＨまたはボルトンハンター試薬により誘導された配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである上記（１）記載のスクリーニング方法、
（１３）誘導体がボルトンハンター試薬により誘導されたＭＣＨまたはボルトンハンター試薬により誘導された配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである上記（３）記載のスクリーニング用キット、
（１４）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩が［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)またはその塩である上記（１）記載のスクリーニング方法、
（１５）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩が［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)またはその塩である上記（３）記載のスクリーニング用キット、
（１６）▲１▼ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩；▲２▼ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および▲３▼配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、
１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、
２）（ｉ）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および／または
（ii）配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１７）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることを特徴とする上記（１６）記載のスクリーニング方法、
（１８）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることを特徴とする上記（１６）記載のスクリーニング方法、
（１９）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、（ｉ）配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および（ii）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることを特徴とする上記（１６）記載のスクリーニング方法、
（２０）▲１▼ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩；▲２▼ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および▲３▼配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、
１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、
２）（ｉ）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および／または
（ii）配列番号：３で表されるタンパク質もしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、などを提供するものである。
【０００６】
本明細書において、「実質的に同一」とはポリペプチドなどの活性、例えば、リガンド（ＭＣＨ）と受容体（ＳＬＴ）の結合活性、生理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。
本発明で用いられるＳＬＴまたはその塩（以下、単にＳＬＴと略称する場合がある）およびＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩（以下、単にＭＣＨと略称する場合がある）の製造法を以下にさらに詳細に説明する。
また、本発明のＳＬＴとＭＣＨを用いることを特徴とするスクリーニング方法などと組み合せて用いることができるＭＣＨの受容体ＳＬＣ−１またはその塩（以下、単にＳＬＣ−１と略称する場合がある）は、例えば、Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年、およびWO 00/40725（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０７３３６号）に記載の製造法によって得ることができるが、ＳＬＣ−１の製造法についても、以下に合わせて説明する。
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨとしては、ヒト、温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）および魚類などのあらゆる組織（たとえば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来するポリペプチドであって、ＳＬＴとしては、配列番号：３、ＳＬＣ−１としては、配列番号：１６または配列番号：１７、ＭＣＨとしては配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドであれば如何なるものであってもよい。例えば、ＳＬＴとしては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの他に、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどがあげられる。実質的に同質の活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナル伝達活性などがあげられる。実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ＳＬＣ−１としては、配列番号：１６または配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの他に、配列番号：１６または配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどがあげられる。実質的に同質の活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナル伝達活性などがあげられる。実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ＭＣＨとしては、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの他に、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどがあげられる。実質的に同質の活性としては、例えばレセプター結合活性などがあげられる。実質的に同質とは、レセプター結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、レセプター結合活性の強さなどの強弱、ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【０００７】
本明細書におけるＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。例えば、配列番号：３、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：６で表されるアミノ酸配列などを含有するポリペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（-COOH)またはカルボキシレート(-COO^-)であるが、Ｃ末端がアミド（-CONH₂)またはエステル(-COOR)であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_6-12アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などがあげられる。
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨの塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨは、公知の方法（例、FEBS Letters 398 (1996) 253-258、WO 96/18651号記載の方法）に準じた方法、即ち、ヒトや温血動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する方法によって製造することもできるし、後述のタンパク質（ペプチド）合成法に準じて製造することもできる。また、後述するタンパク質（ペプチド）をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
【０００８】
ヒト、温血動物、魚類などの組織または細胞から製造する場合、ヒト、温血動物、魚類などの組織または細胞をホモジナイズした後、酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨは、自体公知のタンパク質（ペプチド）の合成法に従って、あるいはＳＬＴ、ＳＬＣ−１および／またはＭＣＨを含有するタンパク質（ペプチド）を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。タンパク質（ペプチド）の合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ＳＬＴ、ＳＬＣ−１および／またはＭＣＨを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のタンパク質（ペプチド）を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法があげられる。
▲１▼ M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチドシンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼ SchroederおよびLuebke、ザペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼ 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株) （1975年）
▲４▼ 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼ 矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせてタンパク質（ペプチド）を精製単離することができる。上記方法で得られるタンパク質（ペプチド）が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【０００９】
ＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質（ペプチド）を切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質（ペプチド）を取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、タンパク質（ペプチド）合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどがあげられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBT、HOOBTなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBTエステルあるいはHOOBTエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質（ペプチド）縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５ないし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００１０】
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどがあげられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上記したＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl₂-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBT）とのエステル］などがあげられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドがあげられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元などもあげられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質（ペプチド）を得ることができる。この粗タンパク質（ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質（ペプチド）のアミド体を得ることができる。
【００１１】
ＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質（ペプチド）のアミド体と同様にして所望のタンパク質（ペプチド）のエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるＭＣＨの誘導体としては、▲１▼ＭＣＨの部分ペプチド、▲２▼ＭＣＨの構成アミノ酸が欠失したペプチド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプチド、構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチド、または▲３▼ＭＣＨ、上記▲１▼記載の部分ペプチドまたは▲２▼に記載のペプチドが標識化されたものなど、好ましくは、ＳＬＴおよびＳＬＣ−１との結合能を有するものであれば何れのものであってもよい。
ＭＣＨの部分ペプチドとして具体的には、配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の部分配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。より具体的には、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。
さらに、ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１を用いて後述のスクリーニングを行う場合に、特に好ましくは配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩が好ましく用いられる。
また、ＭＣＨの構成アミノ酸が欠失したペプチド、構成アミノ酸に他のアミノ酸が付加したペプチド、構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチドとしては、配列番号：６中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたペプチドなどがあげられる。
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができうる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
但し、上記する他のアミノ酸が欠失、置換する位置としては、ＭＣＨの構成アミノ酸中、Ｃｙｓ以外の位置であることが好ましい。
ＭＣＨ、上記▲１▼記載のペプチドまたは▲２▼に記載のペプチドが標識化されたものとしては、自体公知の方法で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなどがあげられる。
【００１２】
具体的には、例えば公知の方法によって、〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたＭＣＨなどを利用することができる。また、ボルトン−ハンター試薬を用いて公知の方法で調製したＭＣＨまたはその誘導体の標識体を利用することもできる。
該ＭＣＨまたはその誘導体の標識体の具体例としては、例えば、
（１）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Asp¹]-MCH
【化１】

（２）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Phe²]-MCH(2-19)
【化２】

（３）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Asp³]-MCH(3-19)
【化３】

（４）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)
【化４】

（５）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Leu⁵]-MCH(5-19)
【化５】

（６）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Arg⁶]-MCH(6-19)
【化６】

（７）［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Cys⁷]-MCH(7-19)
【化７】

などがあげられる。
なかでも、特に［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)が好ましく用いられる。
ＭＣＨもしくはその誘導体の塩としては、上記のＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨの塩と同様のものなどがあげられる。
本発明で用いられるＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記したＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１を構成する部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、レセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の部分ペプチドのアミノ酸の数は、前記したＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上である。
【００１３】
また、ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１の部分ペプチドとしては、上記ＳＬＴおよび／またはＳＬＣ−１を表わすアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたペプチドなどもあげられる。
以下、ＳＬＴおよびＳＬＴの部分ペプチドを単にＳＬＴと、ＳＬＣ−１およびＳＬＣ−１の部分ペプチドを単にＳＬＣ−１と略称する場合がある。
本発明で用いられるＳＬＴをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、本発明で用いられるＳＬＣ−１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１６または配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、本発明で用いられるＭＣＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡ、前記した組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する)によって増幅することもできる。
より具体的には、 (1)ストリンジェントな条件下で、配列番号：３、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡの有する配列とハイブリダイズするＤＮＡ、(2)遺伝コードの縮重のため、配列番号：３、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡの有する配列および(1)に定められている配列とハイブリッド形成しないが、同一アミノ酸配列をもつタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば４２℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝150mM NaCl, 10mM NaH₂PO₄・H₂O, 1mM EDTA pH7.4)、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳである。
本発明で用いられるＳＬＴをコードするＤＮＡ、即ち、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡとしてより具体的には、配列番号：９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
本発明で用いられるＳＬＣ−１をコードするＤＮＡ、即ち、配列番号：１６または配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡとしてより具体的には、配列番号：１８または配列番号：１９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
本発明で用いられるＭＣＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１およびＭＣＨをコードするＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって前記ＤＮＡライブラリー等から目的とするＤＮＡを増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを例えばＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードする塩基配列の一部あるいは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molecular Cloning（２nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。
クローン化された本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００１４】
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Tｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞，Ｖero細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６巻, ４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et al. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等があげられる。
このようにして、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを生成、蓄積せしめることによって、本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００１５】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of The American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of The Society for The Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（dhfr^-）細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。
【００１６】
培養液中に本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、タンパク質（ペプチド）を部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。またＮ末端アミノ酸を欠失させるためには、エドマン(Edman)試薬（フェニルイソチオシアネート）を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
かくして生成する本発明で用いられるＳＬＴ、ＳＬＣ−１またはＭＣＨの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩およびＳＬＴまたはその塩を用いることを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法またはＭＣＨもしくはその標識体またはその塩およびＳＬＴまたはその塩を含有することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット（以下、本発明のスクリーニング方法、本発明のスクリーニング用キットと略記する）について以下に詳述する。
【００１７】
ＳＬＴまたはその塩を用いるか、または組換え型ＳＬＴの発現系を構築し、該発現系を用いたＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩との結合アッセイ系（リガンド・レセプターアッセイ系）を用いることによって、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、ＳＬＴを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（即ちＳＬＴ（ＭＣＨ受容体）アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちＳＬＴ（ＭＣＨ受容体）アンタゴニスト）などが含まれる。「ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる」とは、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
すなわち、本発明は、（ｉ）ＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を接触させた場合と（ii）上記したＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上記したＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を接触させた場合と（ii）上記したＳＬＴまたはその塩に、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物を接触させた場合における、例えば該ＳＬＴまたはその塩に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩（「ＭＣＨの誘導体またはその塩」として、上記の「ＭＣＨ等が標識化されたものまたはその塩」を用いる場合には、更に標識する必要はない。以下同じ。）を、上記したＳＬＴまたはその塩に接触させた場合と、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物をＳＬＴまたはその塩に接触させた場合における、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩の該ＳＬＴまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を、ＳＬＴを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物をＳＬＴを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を、ＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合と、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物をＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合における、標識したＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩のＳＬＴに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
▲４▼ＳＬＴを活性化する化合物（例えば、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩）をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合と、ＳＬＴを活性化する化合物および試験化合物をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合における、ＳＬＴを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼ＳＬＴを活性化する化合物（例えば、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩など）をＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合と、ＳＬＴを活性化する化合物および試験化合物を、ＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＳＬＴに接触させた場合における、ＳＬＴを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などである。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＳＬＴとしては、上記のＳＬＴを含有するものであれば何れのものであってもよい。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＳＬＴなどが適している。
ＳＬＴを製造するには、前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、ＳＬＴを含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
ＳＬＴを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
ＳＬＴを含有する細胞としては、ＳＬＴを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＳＬＴと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＳＬＴを含有する細胞や膜画分中のＳＬＴの量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ましく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当なＳＬＴ画分と、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（ＭＣＨもしくはその誘導体）が用いられる。ＳＬＴ画分としては、天然型のＳＬＴ画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＳＬＴ画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物としては、標識したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物（ＭＣＨまたはその誘導体）などが用いられる。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識されたリガンド（ＭＣＨまたはその誘導体）などを利用することができる。特に、ボルトン−ハンター試薬を用いて公知の方法で調製したＭＣＨの誘導体の標識体を利用することもできる。
ＭＣＨ誘導体の標識体の具体例としては、例えば、上記の（１）〜（７）で表される化合物などがあげられる。
具体的には、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴとの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずＳＬＴを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーは、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＳＬＴやＭＣＨもしくはその誘導体の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したＭＣＨもしくはその誘導体を添加し、同時に１０^-4〜１０^-1μＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のＭＣＨもしくはその誘導体を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、反応液をガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、ＳＬＴとＭＣＨもしくはその誘導体との結合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いることもできる。この方法では、ＭＣＨもしくはその誘導体を装置に添付のプロトコルに従ったアミノカップリング法によってセンサーチップに固定し、ＳＬＴを含有する細胞またはＳＬＴをコードするＤＮＡを含有する形質変換体から精製したＳＬＴまたはＳＬＴを含む膜画分、あるいは精製したＳＬＴまたはＳＬＴを含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分２−２０μｌの流量で通過させる。センサーチップ上のＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴとが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する試験化合物が変化させることを観察することによってＳＬＴとＭＣＨとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。この方法は、ＳＬＴをセンサーチップに固定し、ＭＣＨもしくはその誘導体またはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定することができる。試験化合物としては、上記と同様のものなどがあげられる。
ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、ＳＬＴを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＳＬＴを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００２０】
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＳＬＴを発現した細胞が用いられる。ＳＬＴを発現した細胞としては、前述の組換え型ＳＬＴ発現細胞株などが望ましい。形質転換体であるＳＬＴ発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００２１】
上記のリガンド・レセプターアッセイ系について、さらに具体的に記載すると以下のようなアッセイ系が用いられる。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧタンパクが活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくとＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結合するが、加水分解されずにＧタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した放射活性を測定することによって受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。この反応を利用してＭＣＨもしくはその誘導体のＳＬＴ発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。この方法は、前記▲４▼〜▲５▼のようにＳＬＴを含む細胞を用いるものではなく、▲１▼〜▲３▼のようにＳＬＴを含む膜画分を用いるアッセイ法であるが、▲４▼〜▲５▼のように細胞刺激活性を測定するものであり、本測定法においてＳＬＴ膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。ここにおいて、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加し、ＭＣＨもしくはその誘導体の単独投与に比べてＳＬＴ細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性に変化が生じることを観察することによってＭＣＨとＳＬＴとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体によるＳＬＴ細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＳＬＴ細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。ＳＬＴを含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0.1% BSA pH 7.4）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをFalcon2053に0.2mlずつ分注し、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加え、さらに終濃度200 pMとなるように[³⁵S]GTPγSを加える。25℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0.1% BSA , 0.05% CHAPS pH 7.4 1.5ml）を加えて、ガラス繊維ろ紙GF/Fでろ過する。65℃、30分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した[³⁵S]GTPγSの放射活性を測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体のみを加えた実験区の放射活性を100％、ＭＣＨもしくはその誘導体を加えなかった実験区の放射活性を0％とし、ＭＣＨもしくはその誘導体によるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００２２】
（２）ＳＬＴ発現細胞はＭＣＨ刺激によって細胞内cAMP量が減少する。この反応を利用してＭＣＨのＳＬＴ発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。
ＳＬＴを発現させた種々の動物細胞のcAMP産生量はマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗cAMP抗体と¹²⁵I標識cAMP（ともに市販品）を使用することによってRIAあるいは抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合わせた他のEIA系でも測定することができる。また抗cAMP抗体をprotein Aあるいは抗cAMP抗体産生に用いた動物のIgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと¹²⁵I標識cAMPとを使用するSPA法による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク製のキットを使用する）。
cAMP産生抑制のアッセイは、具体的には後述の実施例５またはそれに準じた方法により行われる。この系において、フォルスコリンまたはcalcitoninなど細胞内cAMP量を増加させるようなリガンドなどによって細胞内cAMP量を上昇させ、ＭＣＨもしくはその誘導体またはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加することによってＭＣＨもしくはその誘導体の単独投与による細胞内cAMP量の抑制が変化することを観察し、ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体によるＳＬＴ発現細胞のcAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを添加してcAMP産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。CHO/SLT細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーに1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加したものを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。100μlの20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内cAMPを抽出する。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリン刺激によって産生されたcAMP量を100%とし、1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体の添加によって抑制されたcAMP量を0%として、ＭＣＨもしくはその誘導体によるcAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＭＣＨもしくはその誘導体の活性を阻害してcAMP産生活性が例えば５０％以上になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
cAMP産生促進活性を測定するには、フォルスコリンを添加せずにCHO/SLT細胞に試験化合物を添加して産生されたcAMPを上記の方法で定量する。
【００２３】
（３）CRE（cAMP response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーンベイシックベクターまたはピッカジーンエンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをCRE−レポーター遺伝子ベクターとする。 CRE−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、 cAMP上昇を伴う刺激は、 CREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 CRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のcAMP量の変動を検出することができる。CRE−レポーター遺伝子ベクターをＳＬＴ発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用してＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。具体的なスクリーニング法を以下に記す。
CRE−レポーター遺伝子導入ＳＬＴ発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは1 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物と2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響はルシフェラーゼによる発光量をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与によりフォルスコリン刺激による発光量の増加が抑制されるが、この抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量のＭＣＨもしくはその誘導体と同様な抑制を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiTによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができる。
【００２４】
（４）ＳＬＴ発現細胞はＭＣＨ刺激の結果アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を細胞に取り込ませておくことによって、この活性を細胞外に放出された放射活性を測定することによって測定することができる。測定は、後述の実施例９またはそれに準じた方法により行われる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加して、ＭＣＨもしくはその誘導体のアラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、ＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体によるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。また、試験化合物のみを添加し、ＳＬＴ発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を後述の実施例９に準じた方法で調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。ＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニング法より具体的に以下に述べる。
CHO/SLT細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、24時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25 μCi/wellとなるよう添加する。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)に溶解した終濃度10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含むバッファー500 μlを添加する。以降、0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を反応用バッファーと呼ぶ。37℃で60分間インキュベートした後に、反応液400 μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[³H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体の非添加反応バッファーによる培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を0%とし、10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体を添加したときの培地中の[³H]アラキドン酸代謝物の量を100%として試験化合物のＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合に対する影響を算出する。アラキドン酸代謝物産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００２５】
（５）ＳＬＴ発現細胞をＭＣＨによって刺激することによって細胞内のCaイオン濃度が上昇する。これを利用することによってＭＣＨとＳＬＴの結合に対する試験化合物の影響を調べることができる。具体的には、後述の実施例８またはそれに準じた方法で調べることができる。
ＳＬＴ発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を4 mM Fura-2 AM（同仁化学研究所）を縣濁したHBSSに置換し、室温で2時間30分おく。HBSSで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、蛍光測定器で、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加えたときの励起波長340nm及び380nmでの505nmの蛍光強度の比の上昇を測定する。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって生じる蛍光強度の変化を測定することによりＭＣＨとＳＬＴの結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。また、以下のようにFLIPR（モレキュラーデバイス社製）を使うこともできる。すなわち、細胞縣濁液にFluo-3 AM（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。FLIPR装置にセットし、Fura-2の場合と同様にＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加え、ＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される蛍光強度が変化することを測定することにより、ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。これらにおいて、ＭＣＨもしくはその誘導体による蛍光強度の上昇を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
ＳＬＴ発現細胞にaequorinなどのように細胞内Caイオンの上昇によって発光するようなタンパク質の遺伝子を共発現させておき、細胞内Caイオン濃度の上昇によってaequorinがCa結合型となり発光することを利用して、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を加え、ＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加によって観測される発光強度が変化することを測定することにより、ＭＣＨとＳＬＴの結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。方法は、蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様である。
【００２６】
（６）受容体を発現する細胞に受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度が上昇することが知られている。ＭＣＨによって生じるＳＬＴ細胞におけるこの反応を観察することによりＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。２４穴プレートに播いて１日目の細胞にmyo-[2-³H]inositol (2.5マイクロCi/well)を添加した培地中で１日培養した細胞を、よく洗浄後、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後、10%過塩素酸を加え反応を止める。1.5 M KOH, 60mM HEPES溶液で中和し、0.5ml のAG1x8樹脂 (Bio-Rad)を詰めたカラムに通し、5mM Na₂BO₃ 60mM HCOONH₄で洗浄した後、１M HCOONH₄ 0.1M HCOOHで溶出した放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体の非添加反応バッファーによる培地中の放射活性を0%とし、ＭＣＨもしくはその誘導体を添加したときの培地中の放射活性を100%として試験化合物のＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合に対する影響を算出する。イノシトール三リン酸産生活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみの添加によるイノシトール三リン酸産生上昇を観察することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００２７】
（７）TRE（TPA response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーンベイシックベクターまたはピッカジーンエンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをTRE−レポーター遺伝子ベクターとする。 TRE−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、細胞内Caイオン上昇を伴う刺激は、 TREを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、 TRE−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。 TRE−レポーター遺伝子ベクターをＳＬＴ発現細胞にトランスフェクションした細胞を利用したＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
TRE−レポーター遺伝子導入ＳＬＴ発現細胞を24穴プレートに5 x 10³ cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した後、10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体あるいは10 nMのＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、ルシフェラーゼによる発光量をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与により細胞内Caイオンの上昇によって発光量が増加するが、この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な発光量の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができる。
【００２８】
（８）ＭＣＨに応答したＳＬＴ発現細胞はMAP kinase活性化によって増殖が観察される。この増殖をMAP kinase活性、チミジン取り込み、細胞数測定（MTTなど）によって測定することができる。これを利用してＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
MAP kinase活性は、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を細胞に添加した後、細胞溶解液から抗MAP kinase抗体を用いた免疫沈降によってMAP kinase分画を得た後、例えば和光純薬製MAP Kinase Assay Kitとγ-[³²P]-ATPを使用して容易に測定できる。チミジン取り込み活性は、ＳＬＴ発現細胞を播き、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後、[methyl-³H]-チミジンを加え、その後、細胞内に取り込まれた標識チミジンの放射活性を細胞を溶解して液体シンチレーションカウンターで計数することによって測定することができる。
ＳＬＴ発現細胞の増殖は、発現細胞を播き、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後にMTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) を添加し、細胞内に取り込まれてMTTが変化したMTTホルマザンを塩酸酸性としたイソプロパノールで細胞を溶解した後、570 nmの吸収を測定することによっても測定できる。
ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の、標識チミジン取り込み活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＳＬＴ発現細胞を２４穴プレートにウェル当たり５０００個まき一日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を細胞に添加して２４時間培養した後、[methyl-³H]-チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し６時間培養する。細胞をＰＢＳで洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、チミジン取り込みによる放射活性の上昇をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による放射活性の増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な放射活性の増加を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００２９】
（９）ＳＬＴ発現細胞にＭＣＨを添加すると、K channelが活性化し、細胞内にあるKイオンが、細胞外に流出する。 Kイオンと同族元素であるRbイオンは、Kイオンと区別無くK channelを通って細胞外に流出するので、細胞に標識Rb ([⁸⁶Rb])を添加して取り込ませておいた後、ＭＣＨの刺激によって流出する[⁸⁶Rb]の流れを測定することでＭＣＨの作用を測定できる。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の、[⁸⁶Rb]流出活性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
２４穴にまいて２日後のＳＬＴ発現細胞を１mCi/ml の⁸⁶RbClを含む培地中で２時間保温する。培地をよく洗浄し、外液中の⁸⁶RbClを完全に除く。ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を細胞に添加して３０分後の外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定する。ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、[⁸⁶Rb]流出による放射活性の上昇をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による放射活性の上昇を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な放射活性の上昇を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００３０】
（１０）ＳＬＴ発現細胞がMCHに反応して変化する細胞外のpH（acidification rate）をＣｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定することによって、ＭＣＨの活性を測定することができる。Ｃｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置を利用した、細胞外ｐＨ変化の測定をすることによるＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
ＳＬＴ発現細胞をＣｙtｏｓｅｎｓｏｒ装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約2時間0.1% BSAを含むRPMI1640培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させることによって生じる培地のpH変化を測定する。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、ＳＬＴ発現細胞の細胞外ｐＨ変化をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な細胞外ｐＨ変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００３１】
（１１）酵母（Saccharomyces cerevisiae）のhaploidα-mating Type (MATα) の性フェロモン受容体STe2はG蛋白Gpa1とカップルしており、性フェロモンα-mating factorに応答してMAP kinaseを活性化し、以下、Far1 (cell-cycle arrest) および転写活性化因子Ste12が活性化される。Ste12は接合に関与するFUS1を含む種々の蛋白の発現を誘導する。一方、制御因子Sst2は以上の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニスト刺激によって酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などの指標を用いた、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Pausch, M. H., Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)）。このような受容体遺伝子導入酵母の系を利用してＭＣＨおよびＳＬＴの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。
MATα酵母のSte2およびGpa1をコードする遺伝子を除去し、代わりにＳＬＴ遺伝子およびGpa1-Gai2融合蛋白をコードする遺伝子を導入する。Farをコードする遺伝子を除去してcell-cycle arrestが生じないようにし、また、Sstをコードする遺伝子を除去することによってＭＣＨに対する応答の感度を向上させておく。さらに、FUS1にヒスチジン生合成遺伝子HIS3をつなげたFUS1-HIS3遺伝子を導入する。以上の遺伝子組換え操作は例えば、Priceら（Price, L. A. et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995)）の報告に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（SSTR2）遺伝子をＳＬＴに置き換えて実施することによって容易に行なうことができる。こうして構築された形質変換酵母はＳＬＴのリガンドであるＭＣＨに高感度で反応し、その結果MAPキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成酵素が合成されるようになって、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。これを利用して、ヒスチジン欠乏培地での酵母の生育を指標としてＭＣＨによるＳＬＴ発現酵母の応答を観察することができる。
上記のようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、2 x 10⁴ cell/mlの濃度でヒスチジンを除去した溶解寒天培地に加え、9 x 9 cmの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、ＭＣＨもしくはその誘導体あるいはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、30℃で３日間培養する。ＭＣＨもしくはその誘導体とＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な酵母の生育を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。また、あらかじめ、寒天培地にＭＣＨもしくはその誘導体を添加しておいて滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察することによってもＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響を調べることができる。
【００３２】
（１２）ＳＬＴ遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、ＭＣＨによって刺激すると細胞内Caイオン濃度が上昇して、calcium-activated chloride currentが生じる。これを膜電位の変化としてとらえることが出来る（Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。ＭＣＨによって生じるＳＬＴ導入アフリカツメガエル卵母細胞におけるこの反応を観察することによりＭＣＨとＳＬＴの結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊を,ＭＢＳ液（88mM NaCl, 1mM KCl, 0.41mM CaCl₂, 0.33mM Ca(NO₃)₂, 0.82mM MgSO₄, 2.4mM NaHCO₃, 10mM HEPES, pH7.4）に溶かしたコラーゲナーゼ(0.5mg/ml)で卵塊がほぐれるまで１９℃、１-６時間、 150rpmで処理する。外液をMBS液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターでpoly(A)⁺ SLT cRNA (50ng/50nl)をマイクロインジェクションする。ＳＬＴ mRNAは、組織や細胞から調製しても、プラスミドからin vitroで転写してもよい。これをMBS液中で２０℃で３日培養する。これをRinger液を流しているvoltage clamp装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極、電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、(-)極は、細胞外に置く。電位が安定したら、ＭＣＨもしくはその誘導体またはＭＣＨもしくはその誘導体および試験化合物を含むRinger液を流して電位変化を記録する。ＭＣＨとＳＬＴの結合を変化させる化合物の影響は、ＳＬＴ導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化をＭＣＨもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。このとき、ＭＣＨもしくはその誘導体の投与による細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。一方、試験化合物のみを投与し、ＭＣＨもしくはその誘導体と同様な細胞膜電位変化を観察することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
この系において、反応を変化量を増大して測定しやすいように各種のＧタンパク質遺伝子のpoly(A)⁺ RNAを導入することもできる。またaequorinのようなCa存在下で発光を生じるようなタンパクの遺伝子のpoly(A)⁺ RNAを共インジェクションすることにより膜電位変化ではなく発光を観察してこの反応を測定することもできる。
ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、ＳＬＴまたはその塩、ＳＬＴを含有する細胞、あるいはＳＬＴを含有する細胞の膜画分、およびＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩を含有するものである。
上記のとおり、本発明に用いられるＭＣＨは、ＳＬＣ−１に対してもリガンド活性を有することが知られているため、上述のＭＣＨとＳＬＴを用いるスクリーニング方法をＳＬＴの代わりにＳＬＣ−１を用いることによって実施し、ＭＣＨとＳＬＣ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩（ＳＬＣ−１アンタゴニスト、ＳＬＣ−１アゴニスト）をスクリーニングすることが可能である。
従って、本発明のスクリーニング方法によって得られる「ＭＣＨとＳＬＴとの結合性を変化させる化合物またはその塩（ＳＬＴアンタゴニスト、ＳＬＴアゴニスト）」の活性と、ＳＬＴの代わりにＳＬＣ−１を用いることにより、本発明のスクリーニング方法またはそれに準じた方法によって得られる「ＭＣＨとＳＬＣ−１との結合性を変化させる化合物またはその塩（ＳＬＣ−１アンタゴニスト、ＳＬＣ−１アゴニスト）」の活性とを比較することによって、「ＭＣＨとＳＬＣ−１との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩（ＳＬＣ−１により選択的な活性を有するアンタゴニストもしくはアゴニスト）」、または「ＭＣＨとＳＬＴとの結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩（ＳＬＴにより選択的な活性を有するアンタゴニストもしくはアゴニスト）」を得ることができる。
ここで、「結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩」とは、
（１）ＳＬＣ−１またはＳＬＴのいずれか一方に対する活性（受容体（ＳＬＣ−１またはＳＬＴ）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）が他方に対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、量的に異なる化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＣ−１またはＳＬＴのいずれか一方に対する結合力（例、ＩＣ₅₀値）が、他方に対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、異なる化合物またはその塩のことをいう。
すなわち、「ＳＬＣ−１により選択的な活性を有するアンタゴニスト」とは、
（１）ＳＬＣ−１に対する活性（受容体（ＳＬＣ−１）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＴに対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上弱い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＣ−１に対する結合力が、ＳＬＴに対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
「ＳＬＣ−１により選択的な活性を有するアゴニスト」とは、
（１）ＳＬＣ−１に対する活性（受容体（ＳＬＣ−１）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＴに対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上強い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＣ−１に対する結合力が、ＳＬＴに対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
「ＳＬＴにより選択的な活性を有するアンタゴニスト」とは、
（１）ＳＬＴに対する活性（受容体（ＳＬＴ）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＣ−１に対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上弱い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＴに対する結合力が、ＳＬＣ−１に対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
「ＳＬＴにより選択的な活性を有するアゴニスト」とは、
（１）ＳＬＴに対する活性（受容体（ＳＬＴ）を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの変化などを促進する活性など）など）がＳＬＣ−１に対する活性に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上強い化合物またはその塩、および（または）
（２）ＳＬＴに対する結合力が、ＳＬＣ−１に対する結合力に対して通常２倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上強い化合物またはその塩のことをいう。
【００３３】
このように、本発明は、さらに、
▲１▼ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩；▲２▼ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および▲３▼ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、
１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、
２）（ｉ）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および／または
（ii）ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング方法によれば、
（ａ）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩；
（ｂ）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩；および
（ｃ）（i）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性；および（ii）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
上記スクリーニング方法において、ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＴもしくはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることが好ましい。
【００３４】
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものがあげられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼ＳＬＴ標品およびＳＬＣ−１標品
ＳＬＴを発現させたＣＨＯ細胞またはＳＬＣ−１を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識したＭＣＨ。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
ＭＣＨを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＳＬＴまたはＳＬＣ−１を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識したＭＣＨを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０^-3Ｍのリガンド（ＭＣＨ）を５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンド（ＭＣＨ）を０.２ＮＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ₀−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ₀ ：最大結合量
【００３５】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＳＬＴを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＳＬＴアゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＳＬＴアンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記ＳＬＴアゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ii）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記したＳＬＴを介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＳＬＴアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＳＬＴアンタゴニストである。
（ii）(a)試験化合物をＳＬＴを含有する細胞に接触させ、上記ＳＬＴを介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＳＬＴアゴニストである。
(b) ＳＬＴを活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたはＳＬＴアゴニストなど）をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合と、ＳＬＴを活性化する化合物および試験化合物をＳＬＴを含有する細胞に接触させた場合における、ＳＬＴを介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＳＬＴを活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＳＬＴアンタゴニストである。
該ＳＬＴアゴニストは、ＳＬＴに対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性と同様の作用を有しているので、ＭＣＨまたはその塩と同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、ＳＬＴアンタゴニストは、ＳＬＴに対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
【００３６】
また、ＳＬＣ−１を用いる本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ＭＣＨまたはその塩とＳＬＣ−１またはその塩との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物であり、具体的にはＳＬＣ−１を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＳＬＣ−１アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＳＬＣ−１アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記ＳＬＣ−１アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は前記（ｉ）または（ii）に準じて行えばよい。
該ＳＬＣ−１アゴニストは、ＳＬＣ−１に対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性と同様の作用を有しているので、ＭＣＨまたはその塩と同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
逆に、ＳＬＣ−１アンタゴニストは、ＳＬＣ−１に対するＭＣＨまたはその塩が有する生理活性を抑制することができるので、該レセプター活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
【００３７】
ＭＣＨまたはその塩は食欲（摂食）増進作用およびオキシトシン分泌促進作用などに関与していることから、食欲（摂食）増進剤またはオキシトシン分泌促進剤などとして用いることができるため、上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物のうち、ＳＬＴアゴニストおよびＳＬＣ−１アゴニストは食欲（摂食）増進剤として用いることができる他、微弱陣痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、帝王切開術、人工妊娠中絶、乳汁うっ滞、神経性食欲不振症などの食欲不振およびそれに伴う貧血、低蛋白症などの予防・治療薬などとして用いることができ、ＳＬＴアンタゴニストおよびＳＬＣ−１アンタゴニストは肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、情動障害、性機能障害などの予防・治療薬などとして用いることができる他、過強陣痛、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、Prader-Willi症候群、糖尿病およびその合併症（糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）、高血圧、高脂血症、冠状動脈硬化症、痛風、呼吸器疾患（Pickwick症候群、睡眠時無呼吸症候群）、脂肪肝、不妊症、変形性骨関節症など（特に抗肥満剤（薬）、食欲（摂食）調節剤など）の予防・治療薬などとして用いることができる。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩などがあげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、該医薬は、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。本発明の医薬は、例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（^TM）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【００３９】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から３００ｍｇ、より好ましくは約３．０から５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の肥満症患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、ＳＬＣアンタゴニストを一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４０】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
Ｙ：チミンまたはシトシン
Ｎ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
Ｒ：アデニンまたはグアニン
Ｍ：シトシンまたはアデニン
Ｗ：チミンまたはアデニン
Ｓ：シトシンまたはグアニン
ＲＮＡ：リボ核酸
ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＥＩＡ：エンザイムイムノアッセイ
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＶａｌまたはＶ：バリン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＭｅtまたはＭ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
ｐＧｌｕ：ピログルタミン酸
Ｍｅ：メチル基
Ｅt ：エチル基
Ｂｕ：ブチル基
Ｐｈ：フェニル基
ＴＣ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＰＡＭ：フェニルアセトアミドメチル
【００４１】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
Ｂｚｌ：ベンジル
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ：２−クロルベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：t−ブチルオキシカルボニル
ＨＯＢt ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒt ：トリチル
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド
Ｅ６４：（Ｌ−３−trans−カルボキオキシラン−２−カルボニル）Ｌ−ロイシル−アグマチン
ＧＤＰ：グアノシン−５’−二リン酸
ＭＥＭα ：ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ
Ｆｕｒａ−２ＡＭ：1-[6-アミノ-2-(5-カルボキシ-2-オキサゾリル)-5-ベンゾフラニロキシ]-2-(2-アミノ-5メチルフェノキシ)-エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＢＳＳ：ハンクス平衡塩液
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ：1-[2-アミノ-5-(2,7-ジクロロ-6-ヒドロキシ-3-オキシ-9-キサンテニル)フェノキシ]-2-(2-アミノ-5-メチルフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＥＰＥＳ：２−[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸
ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
【００４２】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトSLTをコードするcDNAのクローニングに使用した合成DNAを示す。
〔配列番号：２〕
ヒトSLTをコードするcDNAのクローニングに使用した合成DNAを示す。
〔配列番号：３〕
ヒトSLTの全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
5’側にSal I認識配列が付加され、また3’側にSpe I認識配列が付加されたヒトSLT cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ヒトSLT発現CHO細胞の各クローンにおけるSLT mRNAの発現量を測定するために使用したリボプローブ（riboprobe）を示す。
〔配列番号：６〕
メラニン凝集ホルモン（melanin-concentrating hormone, MCH）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒトSLTをコードするcDNAをクローニングするために使用した合成DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒトSLTをコードするcDNAをクローニングするために使用した合成DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するヒトSLTをコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
Des-Asp¹-MCH (MCH(2-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
Des-[Asp¹, Phe²]-MCH (MCH(3-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³]-MCH (MCH(4-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴]-MCH (MCH(5-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴, Leu⁵]-MCH (MCH(6-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴, Leu⁵, Arg⁶]-MCH (MCH(7-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ラットSLC-1の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ヒトSLC-1の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００４３】
後述の参考例１で得られたEscherichia coli ＤＨ５α／ｐＣＲ３．１−ｈＳＬＴは、平成１１年（１９９９年）４月２８日から日本国茨城県つくば市東１−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−６７１０として、平成１１年（１９９９年）４月２０日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ１６２８４として寄託されている。
【００４４】
【発明の実施の形態】
以下に実施例および参考例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
【実施例】
参考例１ヒト海馬cDNAからのヒトSLT受容体タンパクをコードするcDNAのクローニング
ヒト海馬cDNA（クロンテック社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成は上記cDNAの10分の1量を鋳型として使用し、Advantage 2 Polymerase Mix（クロンテック社）1/50量、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を各0.2 μM、dNTPs 200 μM、および酵素に添付のバッファーを加え、25 μlの液量とした。PCR反応は、▲１▼94℃・1分の後、▲２▼94℃・20秒、72℃・2分のサイクルを3回、▲３▼94℃・20秒、65℃・20秒、68℃・2分のサイクルを3回、▲４▼94℃・20秒、58℃・20秒、68℃・2分のサイクルを36回繰り返し、▲３▼ 最後に68℃・7分の伸長反応を行った。該PCR反応後の反応産物をTAクローニングキット（インビトロジェン社）の処方に従いプラスミドベクターpCR3.1（インビトロジェン社）へサブクローニングした。これを大腸菌DH5αに導入し、cDNAをもつクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した後、個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするcDNA配列（配列番号：９）を得た。このcDNAより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：３）を含有する新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をhSLTと命名し、この形質転換体を大腸菌（Escherichia coli）DH5α/pCR3.1-hSLTと命名した。
【００４６】
参考例２ Des-[Asp¹, Phe², Asp³]-MCH (MCH(4-19), Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。この樹脂0.6 gをp-クレゾール2 g、1,4-ブタンジチオール1.2 mlと共に無水弗化水素10 ml中、0℃・60分撹袢した後、弗化水素を減圧留去し、残留物へジエチルエーテルを加え沈殿を濾過する。この沈殿に50%酢酸水を加え抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、50%酢酸水で充填したセファデックス（商品名）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集めLiChroprep（商品名） RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm)に付け0.1% TFA水200 mlで洗浄、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有40%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め濃縮する。此れを約4 mlの酢酸に溶解し、蒸留水で240 mlに希釈の後、アンモニア水を用いpH 7.5に調整し、緩やかに空気を吹込み攪拌する。反応をHPLCで追跡し、SH体ペプチドのピークがすべてSS体に変化した事を確認後、酢酸を加え溶液のpHを3に調整し、上記LiChroprep（商品名） RP-18カラムに吸着する。カラムを0.1% TFA水200 mlで洗浄後、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有50%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め、凍結乾燥し目的とするペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2009.9 (理論値 2010.0)
HPLC溶出時間：17.9分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００４７】
参考例３ラジオアイソトープ標識MCH(4-19)の作製
参考例２で調製したMCHのN末端アミノ酸3残基欠失体であるMCH(4-19)を、ボルトン−ハンター法でラジオアイソトープ標識した。チューブの中でベンゼンに溶解している[¹²⁵I]-ボルトン−ハンター試薬（3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオン酸N-スクシンイミジル）9.25 MBq (0.11 nmol)（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社、81.4 TBq/mmol）に乾燥窒素ガスを吹き付けて、ベンゼンを溜去した。このチューブに、18μlの50 mMリン酸緩衝液（pH 7.5）と1.5μlのジメチルスルフオキシドに溶解した2.3 nmolのMCH(4-19)と0.5μlのジメチルスルフオキシドを添加し、よく混合した。混合液を37℃で2時間保温した後、ボルトン−ハンター試薬によるMCH(4-19)の放射化誘導体である[¹²⁵I]-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)を逆相HPLCにより分取した。[¹²⁵I]-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)は、ODSカラム（トーソー、ODS-80TM (4.6 mm x 150 mm)）からアセトニトリル濃度43.6%付近に溶出した。
【００４８】
参考例４手動エドマン分解によるMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)（配列番号：１０−１５）の調製
MCH 0.1 mg（シグマ社）を30μlの50％ピリジンに溶解し、1μlのフェニルイソチオシアネート（和光純薬）を加えて窒素置換した後、45℃に保温した。10分おきに攪拌して1時間を経過したところで保温を止め、窒素気流下で乾固した。20μlのエタノールに再度溶解し、窒素気流下、次いで減圧下で溶媒を溜去して乾固した。反応生成物であるフェニルチオカルバモイル誘導体を20μlのトリフルオロ酢酸（和光純薬）によって溶解し、窒素置換して45℃で20分間保温することによりペプチドのアミノ末端アミノ酸をアニリノチアゾリノン誘導体として切断した。窒素気流でトリフルオロ酢酸を除いた後、30μlの水および100μlの酢酸n-ブチルを加え、酢酸n-ブチルにより過剰な試薬およびアニリノチアゾリノン誘導体を抽出して除去した。酢酸n-ブチルによる抽出は3回繰り返した。アミノ末端が１残基短縮されたMCH(2-19)を含む水相を窒素気流下、次いで減圧下で乾固した。
この分解過程を１回のみ行なうことにより、アミノ末端の１残基のみが欠失したMCH(2-19)を得た。同様な分解過程を2回、3回、4回、5回あるいは6回繰り返すことにより、1残基ずつN末端のアミノ基が短縮されたMCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)を得た。
上記の分解反応によって得られたMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)を次のように精製した後、質量分析およびアミノ酸分析によって構造の確認を行なった。以下にMCH(4-19)について詳細に述べるが、他の誘導体についてもほぼ同様の操作を行なった。得られたMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の分析値を表１に示す。
【００４９】
［表１］MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の質量分析値およびアミノ酸分析値
【表１】

【００５０】
MCH(4-19)を以下のようにHPLCで精製した。Spheri-5 RP-18逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム（ブラウンリー社、2.1 mm x 30 mm）にあらかじめA液（0.1%トリフルオロ酢酸）を流速300μl/minで流し、25℃にて平衡化した。反応産物は270μlの0.1%トリフルオロ酢酸に溶解し、1回50μlをカラムに打ち込んだ後、流速300μl/minを保ちながら、30分間かけてB液（0.1%トリフルオロ酢酸/70%アセトニトリル）濃度を70%まで上昇させた。溶出液を210 nmの吸光度でモニターし、ピークを手動で分取した。MCH(4-19)は17.1分に溶出した。１つの試験管に集めたMCH(4-19)を濃縮乾固し、100μlのDMSOに溶解した。
質量分析は日本電子JMS-HX110でLSIMS法にて行なった。即ち、プローブチップ上で1μlの3-ニトロベンジルアルコールとグリセロールが3:2からなるマトリクスと、1μlのサンプルとを混合し、イオン源に導入した。15 kVに加速されたセシウムイオンを照射し、生成した正二次イオンを10 kVに加速して検出器に導いた。
アミノ酸分析のための加水分解は、サンプル5μlをガラス管にとって減圧乾固し反応バイアルに入れ、その底部に6 N共沸塩酸（ピアス社、Sequenal Grade）200μlを入れ、ウォーターズ社Pico-Tagワークステーションを用いてウォーターズ社の推奨する方法に従って脱気後、110℃、24時間保温して行なった。
反応バイアル中の塩酸を真空ポンプにより減圧下除去した後、150μlの20 mM塩酸で試料を希釈し、分析バイアルに注入してアミノ酸分析装置にセットし、100μlを分析に供した。アミノ酸分析は日立L-8500高速アミノ酸分析計を用いて、オルトフタルアルデヒド試薬（和光純薬）を誘導体化反応に用いた蛍光分析法にて分析した。蛍光分析用緩衝液の調製法、反応液の調製法、分析条件は、L-8500アミノ酸分析計取り扱い説明書の記載に従った。ロイシンを基準としたときの測定値のモル比は表１に示したとおりである。
なお、MCHあるいはMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)およびMCH(5-19)は参考例７から参考例１１に記載した固相合成法によっても調製することができる。
【００５１】
参考例５ MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)およびMCH(5-19)の非アイソトープボルトン−ハンター試薬による誘導体化
MCHおよびMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)およびMCH(6-19)の非アイソトープボルトン−ハンター試薬による誘導体化を行なった。MCH(4-19)の誘導体化を例にして以下に述べる。
ジメチルホルムアミド50μlに溶解したMCH(4-19) 1 nmolに非アイソトープボルトン−ハンター試薬である3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオン酸N-スクシンイミジル（和光純薬）100 nmolおよびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（和光純薬）100 nmolを加えて37℃で4時間反応させた。
反応混合物に0.1%トリフルオロ酢酸を含む10%アセトニトリル450μlを加えてHPLCにより精製した。クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。カラムはWakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)で流速は毎分1.0 mlとした。溶出は0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水を用い、アセトニトリル濃度を2分間10%に保持した後、5分間で20%まで上昇させ、その後20分間に50%まで上昇させて行なった。MCH(4-19)の非アイソトープボルトン−ハンター試薬による誘導体である[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)は22.9分に溶出され、手動によって分取した。MCHあるいはMCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)およびMCH(6-19)についてもほぼ同様の操作によってN末端アミノ酸のアミノ基に3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル基を導入して誘導体化し、HPLCによって分取した。これらの誘導体を酸加水分解した後、アミノ酸分析を行なった。結果を表２に示した。
【００５２】
［表２］誘導体化MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)およびMCH(6-19)のアミノ酸分析値
【表２】

【００５３】
参考例６放射ヨード標識MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の作製
アイソトープ標識MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)は以下のようにアミノ酸配列中のTyr¹³を放射ヨード化して作製することもできる。MCH(4-19)について例示するが、同様の方法によってMCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)およびMCH(7-19)の放射ヨード化体を作製することができる。
MCH(4-19) 5μgを25μlの0.4 M酢酸ナトリウム（pH 5.6）に溶解し、これに200 ngのラクトパーオキシダーゼ（和光純薬製）を加えた後、1 mCiの[¹²⁵I]-ヨウ化ナトリウム（アマシャムファルマシアバイオテク社）および200 ngの過酸化水素（10μl）を加える。室温で10分間静置した後、さらに200 ngの過酸化水素（10μl）を加えて10分間静置する。これをTSKgel ODS-80T_Sカラム（4.6 mm x 25 cm、トーソー）を用いたHPLCによって精製し、[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)を得る。
【００５４】
参考例７ MCH (Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Phe, Boc-Asp(OcHex)を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。この樹脂0.6 gをp-クレゾール2 g、1,4-ブタンジチオール1.2 mlと共に無水弗化水素10 ml中、0℃・60分撹袢した後、弗化水素を減圧留去し、残留物へジエチルエーテルを加え沈殿を濾過する。この沈殿に50%酢酸水を加え抽出し、不溶部分を除き、抽出液を十分に濃縮後、50%酢酸水で充填したセファデックス（商品名）G-25カラム（2.0 x 80 cm）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集めLiChroprep（商品名） RP-18を充填した逆相クロマトカラム（2.6 x 60 cm)に付け0.1% TFA水200 mlで洗浄、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有40%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め濃縮する。此れを約4 mlの酢酸に溶解し、蒸留水で240 mlに希釈の後、アンモニア水を用いpH 7.5に調整し、緩やかに空気を吹込み攪拌する。反応をHPLCで追跡し、SH体ペプチドのピークがすべてSS体に変化した事を確認後、酢酸を加え溶液のpHを3に調整し、上記LiChroprep（商品名） RP-18カラムに吸着する。カラムを0.1% TFA水200 mlで洗浄後、0.1% TFA水300 mlと0.1% TFA含有50%アセトニトリル水300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め、凍結乾燥し目的とするペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2387.3 (理論値 2387.9)
HPLC溶出時間：20.9分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５５】
参考例８ Des-Asp¹-MCH (MCH(2-19), Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Pheを順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。この樹脂を参考例７と同様に脱保護、環化、精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2272.3 (理論値 2272.1)
HPLC溶出時間：20.6分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５６】
参考例９ Des-[Asp¹, Phe²]-MCH (MCH(3-19), Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex)を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。この樹脂を参考例７と同様に脱保護、環化、精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 2124.8 (理論値 2125.0)
HPLC溶出時間：19.2分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５７】
参考例１０ Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴]-MCH (MCH(5-19), Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH)の製造
市販Boc-Val-OCH₂-PAM樹脂（0.77 mmol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成機ABI 430Aの反応曹に入れ、Boc-strategy (NMP-HOBt)ペプチド合成方法でBoc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leuを順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。この樹脂を参考例７と同様に脱保護、環化、精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による(M+H)⁺ 1878.9 (理論値 1878.9)
HPLC溶出時間：17.4分
カラム条件
カラム：Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液：A液−0.1% TFA含有10%アセトニトリル水、B液−0.1%TFA含有60%アセトニトリル水を用い、A/B : 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出（20分）
流速：1.0 ml/分
【００５８】
実施例１ヒトSLT受容体cDNAの増幅
参考例１記載のpCR3.1-hSLTを鋳型とし、配列番号：１および２の合成DNAプライマーを用いてPCR法による増幅を行なった。合成DNAプライマーは受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の5’側に制限酵素Sal Iの認識する塩基配列が付加され、また3’側に制限酵素Spe Iの認識する塩基配列が付加されるように、5’側および3’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、 pCR3.1-hSLT鋳型5 μl、合成DNAプライマー各0.4μM、0.2 mM dNTPs、pfu (ストラタジーン) DNAポリメラーゼ1μlおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は50 μlとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（PE Biosystems）を用い、94℃・60秒の加熱の後、94℃・60秒、57℃・60秒、72℃・150秒のサイクルを25回繰り返し、最後に72℃で10分間反応させた。増幅産物の確認は、0.8％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【００５９】
実施例２ PCR産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入cDNA部分の塩基配列の解読による増幅cDNA配列の確認
実施例１で行なったPCRの反応産物は0.8 ％の低融点アガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行なってDNAを回収した。PCR-Script^TM Amp SK(+)クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したDNAをプラスミドベクターpCR-Script Amp SK(+)へサブクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Escherichia coli）DH5αcompetent cell （トーヨーボー）に導入して形質転換した後、cDNA挿入断片を持つクローンをアンピシリン、IPTGおよびX-galを含むLB寒天培地中で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体E. coli DH5α/hSLTを得た。個々のクローンをアンピシリンを含むLB培地で一晩培養し、 QIAwell 8 Plasmid KIt （キアゲン）を用いてプラスミドDNAを調製した。調製したDNAの一部を用いて制限酵素Sal IおよびSpe Iによる切断を行ない、挿入されている受容体cDNA断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はDyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit（PE Biosystems）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。得られた2クローンの配列を解析し全ての配列が報告されているヒトSLTタンパク質（配列番号：３）をコードするcDNA配列の5’側にSal I認識配列が付加し、3’側にSpe I認識配列が付加した遺伝子配列と一致することを確認した（配列番号：４）。図１にヒトSLT受容体蛋白のアミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列を示した。
【００６０】
実施例３ヒトSLT発現CHO細胞の作製
実施例２で配列が確認されたヒトSLTの全長アミノ酸配列をコードし、5’側にSal I認識配列が付加し、また3’側にSpe I認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミドによって形質転換されたE. coliのクローンよりPlasmid Midi Kit（キアゲン）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素Sal IおよびSpe Iで切断してインサート部分を切り出した。インサートDNAは電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行なって回収した。このインサートDNAをSal IおよびSpe Iで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドpAKKO-111H（Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1219, pp. 251-259 (1994)記載のpAKKO1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加え、T4ライゲース（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、蛋白発現用プラスミドpAKKO-hSLTを構築した。
pAKKO-hSLTで形質転換したE. coli DH5αcompetent cell（トーヨーボー）を培養後、Plasmid Midi Kit（キアゲン）を用いてpAKKO-hSLTのプラスミドDNAを調製した。これをCellPhect Transfection Kit（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い添付のプロトコルに従ってCHO dhfr^-細胞に導入した。6 μgのDNAをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、24時間前に5 x 10⁵または1 x 10⁶個のCHO dhfr^-細胞を播種した6 cmシャーレに添加した。10％ウシ胎児血清を含むMEMα培地で1日間培養した後、継代し、選択培地である10％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含MEMα培地で培養した。選択培地中で増殖してくるヒトSLT発現CHO細胞である形質転換細胞のコロニー46クローンを選択した。
【００６１】
実施例４全長ヒトSLTレセプター蛋白質mRNAの発現量の高いCHO/hSLT細胞株の選択
実施例３で樹立されたCHO/hSLT株46クローンの全長ヒトSLTレセプター蛋白質mRNAの発現量をCytostar T Plate（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い、添付のプロトコルに従って以下のように測定した。CHO/ hSLT株の各クローンをCytostar T Plateの各wellに2.5 x 10⁴個ずつ播種して24時間培養した後、10％ホルマリンによって細胞を固定した。各wellに0.25％ Triton X-100を添加して細胞の透過性をあげた後、³⁵Sラベルした配列番号：５のriboprobeを加えてハイブリダイズさせた。20 mg/mlのRNaseAを各wellに加えて遊離のriboprobeを消化し、プレートをよく洗浄した後、ハイブリダイズしたriboprobeの放射活性をTopcounterで測定した。放射活性の高い株がmRNA発現量が高い。mRNA発現量の高い6クローン（#1,3,4,13,26および36）を以下の実験に用いたが、特にクローン番号1を主に用いた。
【００６２】
実施例５ MCHによるヒトSLT発現CHO細胞に対するcAMP合成抑制活性
市販の合成ヒトMCH（配列番号：６、バッケム社）を種々の濃度に希釈し、ヒトSLT発現CHO細胞に対するcAMP合成抑制活性を以下に示す方法で測定した。実施例４で選択したCHO/hSLT細胞を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、48時間培養した。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05% BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて30分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに0.25 mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、種々の量のMCHと2μMフォルスコリンを含む0.25 mlの反応用バッファーを細胞に加え、37℃で30分間反応させた。100μlの20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内cAMPを抽出した。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。その結果、MCHは30 pMの濃度で明らかに細胞内cAMP量を低下させ、さらにペプチド濃度を増やすと用量依存的に細胞内cAMP量は減少した。（図２）。図中、 cAMP合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内cAMP量から反応用バッファーを添加したときの細胞内cAMP量を減じた量を100％として、MCHを加えたときの細胞内cAMP量から反応用バッファーを添加したときの細胞内cAMP量を減じた量を％として表わした。
【００６３】
実施例６ヒトSLT発現CHO細胞膜画分の調製
1 x 10⁸個のCHO/hSLT細胞に10mlのホモジネートバッファー（10 mM NaHCO₃, 5 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1μg/ml pepstatin, 4μg/ml E64, 20μg/ml leupeptin)添加し、ポリトロン（12,000 rpm、1分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（1,000 g, 15分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Beckman Type 30ローター、30,000 rpm, 1時間）し、得られた沈殿物をヒトSLT発現CHO細胞膜画分とした。
【００６４】
実施例７ボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)を用いた受容体結合実験
参考例３でボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)およびヒトSLT発現CHO細胞から調製した細胞膜画分を用いて受容体結合実験を行なった。
ヒトSLT発現CHO細胞から実施例６に従って調製した細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（50 mM Tris-HCl、5 mM EGTA（エチレングリコールビス（アミノエチルエーテル）四酢酸）、5 mM酢酸マグネシウム、0.05% CHAPS、0.1% BSA（ウシ血清アルブミン）、0.25 mM PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、1μg/ml ペプスタチン、20μg/ml ロイペプチン、pH 7.4）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（ファルコン社、2053）に200μlずつ分注した。最大結合量（TB）を測定するために、2μlのDMSOと、20 nMの[¹²⁵I]-標識MCH(4-19) 2μlを、また、非特異的結合（NSB）を測定するために、100μM MCHのDMSO溶液2μlと、20 nMの[¹²⁵I]-標識MCH(4-19) 2μlを、膜画分溶液に添加した。25 ℃で60分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したグラスフィルター（ワットマン社、GF-F）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ-カウンターを用いてろ紙上に残った[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)の放射活性を測定した。図３に示すように、膜画分の濃度に依存した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)の特異的な結合（SB）が認められた。
また、膜画分濃度を30μg/ｍｌに設定して、阻害率（％）からMCHの50％阻害濃度（IC₅₀値）を算出したところ、IC₅₀値は約20 nMであった（図４）。また、MCHのアミノ末端短縮体であるMCH(4-19)のIC₅₀値は3.3 nMであった（図４）。
【００６５】
実施例８ FLIPRを用いたMCHによるヒトSLT発現CHO細胞の細胞内Caイオン濃度上昇活性の測定
実施例４で得られたヒトSLT発現CHO細胞のMCH（配列番号：６）による細胞内Caイオン濃度上昇活性の測定をFLIPR(モレキュラーデバイス社)を用いて行った。CHO/hSLT細胞を15 x 10⁴ cells/mlとなるように10％透析ウシ胎児血清を含むDMEMに懸濁し、FLIPR用96穴プレート(Black plate clear bottom、コースター社)に分注器を用いて各ウェルに200μlずつ植え込み（3.0×10⁴ cells/200μl/ウェル）、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃で一晩培養した後、アッセイに用いた(以後このプレートを細胞プレートと言う)。HANKS’/HBSS（ニッスイハンクス２（日水製薬株式会社） 9.8 g、炭酸水素ナトリウム 0.35 g、HEPES 4.77 g 、6 M水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、フィルター滅菌処理）20 ml、250 mM Probenecid 200μl、ウシ胎児血清(FBS) 200μlを混合したものに、Fluo 3-AM（同仁化学研究所） 2バイアル(50μg)をジメチルスルフォキサイド40μlおよび20% Pluronic acid（モレキュラープローブ社）40μlに溶解して加えて混和後、8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル 100μlずつ分注した後、5％ CO₂インキュベーター中にて37℃で1時間インキュベートし、細胞に色素を印加した。FLIPR用96穴プレート(V-Bottomプレート、コースター社)の各ウェルに2.5 mM Probenecid、0.05％ BSAを含むHANKS’/HBSS 150μlを入れ、さらに種々の濃度のMCHを添加してサンプルプレートを調製した。細胞プレートの色素ローディング終了後、HANKS’/HBSSに2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー(モレキュラーデバイス社)を用いて細胞プレートを４回洗浄し、洗浄後100μlの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセットしアッセイを行なった（FLIPRにより、サンプルプレートから50μlのサンプルが細胞プレートへと移される)。その結果、MCHは濃度依存的にヒトSLT発現CHO細胞の細胞内Caイオン濃度を上昇させることが示された（図５）。
【００６６】
実施例９ MCHがヒトSLT発現CHO細胞に対して惹起するアラキドン酸代謝物放出活性
種々の濃度のMCHが示すヒトSLT発現CHO細胞に対するアラキドン酸代謝物放出活性を以下の方法により測定した。実施例４で得られたヒトSLT発現CHO細胞であるCHO/hSLT株を24穴プレートに5 x 10⁴ cell/wellで播種し、24時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25μCi/wellとなるよう添加した。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05% BSAと20 mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに種々の濃度のMCHを加えた0.05% BSAと20 mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4)500μlを添加した。37℃で60分間インキュベートした後に、反応液400μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[³H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定した。その結果、MCHが用量依存的にヒトSLT発現細胞に対してアラキドン酸代謝物放出活性を示すことが確認され、そのEC₅₀値は0.57nMであった。種々の濃度のMCHが示すヒトSLT発現CHO細胞に対するアラキドン酸代謝物放出活性を図６に示した。
【００６７】
(配列表フリーテキスト)
配列番号：６
配列に関する他の情報：第７番目および第１６番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１０
配列に関する他の情報：第６番目および第１５番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１１
配列に関する他の情報：第５番目および第１４番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１２
配列に関する他の情報：第４番目および第１３番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１３
配列に関する他の情報：第３番目および第１２番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１４
配列に関する他の情報：第２番目および第１１番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
配列番号：１５
配列に関する他の情報：第１番目および第１０番目の２つのCys残基は分子内ジスルフィド結合を形成している。
【００６８】
【発明の効果】
本発明のＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩およびＳＬＴまたはその塩を用いることを特徴とするＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩とＳＬＴまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法は、食欲（摂食）増進剤の他、微弱陣痛、弛緩出血、胎盤娩出前後、子宮復古不全、帝王切開術、人工妊娠中絶、乳汁うっ滞などの予防・治療薬などとして用いることができるＳＬＴアゴニスト、肥満症［例、悪性肥満細胞症(malignant mastocytosis)、外因性肥満 (exogenous obesity)、過インシュリン性肥満症(hyperinsulinar obesity)、過血漿性肥満(hyperplasmic obesity)、下垂体性肥満(hypophyseal adiposity)、減血漿性肥満症(hypoplasmic obesity)、甲状腺機能低下肥満症(hypothyroid obesity)、視床下部性肥満(hypothalamic obesity)、症候性肥満症(symptomatic obesity)、小児肥満 (infantile obesity)、上半身肥満(upper body obesity)、食事性肥満症 (alimentary obesity)、性機能低下性肥満(hypogonadal obesity)、全身性肥満細胞症(systemic mastocytosis)、単純性肥満(simple obesity)、中心性肥満(central obesity)など］、摂食亢進症(hyperphagia)、情動障害、性機能障害などの予防・治療薬などの他、過強陣痛、強直性子宮収縮、胎児仮死、子宮破裂、頚菅裂傷、早産、Prader-Willi症候群などの予防・治療薬などとして用いることができるＳＬＴアンタゴニストのスクリーニング方法として有用である。
【００６９】
【配列表】

【００７０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト海馬由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質hSLTをコードするDNAの塩基配列、およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２】種々の濃度のMCHのヒトSLT発現CHO細胞に対するcAMP合成抑制活性を示す図を示す。
【図３】ボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)のヒトSLT発現CHO細胞から調製した細胞膜画分に対する特異的結合を示す図を示す。３種類の発現細胞のクローン（#1, 26, 36）の膜画分について測定した。
【図４】ヒトSLT発現CHO細胞から調製した細胞膜画分を用いた、ボルトン−ハンター試薬を用いて作製した[¹²⁵I]-標識MCH(4-19)に対するMCHおよびそのアミノ末端短縮体であるMCH(4-19)の結合阻害活性を示す図を示す。
【図５】FLIPRを用いて測定した種々の濃度のMCHのヒトSLT発現CHO細胞に対する細胞内Caイオン上昇活性を示す図を示す。
【図６】種々の濃度のMCHが示すヒトSLT発現CHO細胞に対するアラキドン酸代謝物放出活性を示す図を示す。

Claims

メラニン凝集ホルモン(ＭＣＨ）もしくはその誘導体またはその塩および配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩を用いることを特徴とするＭＣＨまたはその塩と配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
さらにＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩および配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩を含有することを特徴とするＭＣＨまたはその塩と配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
さらにＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする請求項３記載のスクリーニング用キット。
ＭＣＨが配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項１記載のスクリーニング方法。
ＭＣＨが配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである請求項３記載のスクリーニング用キット。
誘導体が配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである請求項１記載のスクリーニング方法。
誘導体が配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである請求項３記載のスクリーニング用キット。
誘導体がボルトンハンター試薬により誘導されたＭＣＨまたはボルトンハンター試薬により誘導された配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである請求項１記載のスクリーニング方法。
誘導体がボルトンハンター試薬により誘導されたＭＣＨまたはボルトンハンター試薬により誘導された配列番号：６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５番目ないし第１９番目の配列を含有するペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルである請求項３記載のスクリーニング用キット。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩が［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)またはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩が［¹²⁵I］-[N-(3-(4-ヒドロキシ-3-ヨードフェニル)プロピオニル)-Met⁴]-MCH(4-19)またはその塩である請求項３記載のスクリーニング用キット。
（１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩；（２）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および（３）配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩を用いることを特徴とする、
１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、
２）（ｉ）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および／または
（ii）配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることを特徴とする請求項１３記載のスクリーニング方法。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることを特徴とする請求項１３記載のスクリーニング方法。
ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、（ｉ）配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩および（ii）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合性を選択的に変化させる化合物またはその塩をスクリーニングすることを特徴とする請求項１３記載のスクリーニング方法。
（１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩；（２）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および（３）配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩を含有することを特徴とする、
１）ＭＣＨもしくはその誘導体またはその塩と、
２）（ｉ）ＳＬＣ−１またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩；および／または
（ii）配列番号：３で表されるタンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。