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WO2001088131A1 - Regulation of mt1-mmp activity - Google Patents

Regulation of mt1-mmp activity Download PDF

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WO2001088131A1
WO2001088131A1 PCT/JP2001/004166 JP0104166W WO0188131A1 WO 2001088131 A1 WO2001088131 A1 WO 2001088131A1 JP 0104166 W JP0104166 W JP 0104166W WO 0188131 A1 WO0188131 A1 WO 0188131A1
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WO
WIPO (PCT)
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mmp
cells
complex
formation
cell
Prior art date
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PCT/JP2001/004166
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English (en)
French (fr)
Inventor
Motoharu Seiki
Ken-Ichi Obata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FUJICHEMICO Ltd
Original Assignee
FUJICHEMICO Ltd
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Publication date
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Priority to AU2001256773A priority patent/AU2001256773A1/en
Priority to US10/276,272 priority patent/US20040120954A1/en
Publication of WO2001088131A1 publication Critical patent/WO2001088131A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a substance that inhibits the formation of a complex of membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP), such as MT1-MMP, It relates to substances that inhibit dimer formation.
  • MT1-MMP membrane-type 1 matrix metalloproteinase
  • the present invention inhibits the simple dimer formation of the MT1-MMP, thereby inhibiting the activation of pro-MMP-2, and thereby preventing various physiological and biological processes attributable to the activation of the pro-DMP-2. And a drug therefor.
  • the present invention further provides a medicament and a therapeutic method for inhibiting the invasion 'metastasis of cancer based on the regulatory mechanism of ⁇ -band P activity via the hemodoxycin-like domain (PEX) of MT1-MMP'.
  • the present invention relates to the inhibition of MT1-MMP complex formation, the inhibition of the activation of pro-MMP-2, related to the simple dimerization of MT1-MMP.Cell migration, invasion and / or metastasis iaih3 ⁇ 4, Furthermore, a method for inhibiting simple dimer formation of MT1-MMP and related methods, a substance having an activity of inhibiting simple dimer formation of MT1-MMP present on the cell surface, such as MT1-PEX, The present invention relates to an encoding nucleic acid and a use of the nucleic acid.
  • the present invention relates to an antibody against a PEX protein of MT1-MMP or a fragment thereof, or a polypeptide having an activity substantially equivalent thereto, and uses thereof.
  • the present invention relates to a method for screening a simple dimer formation inhibitor of MT1-MMP and a reagent therefor. Yes
  • Matrix metalloproteinases H ⁇ matrix metalloproteinases: MMPs are a family of dependent endopeptidases that degrade the extracellular matrix (ECM) and various constituent proteins of the basic plays. It is. These hidden groups are involved in the reorganization of connective tissues, such as normal embryo development, bone growth or wound healing (Woessner, JF, FASEB J., 5, 2145-2154 (1991); : Matrisian, LM, BioEssays, 14, 455-463 (1992); Birkeda Hansen, H., Moore WGI, Bodden, MK, Windsor, LJ, Birkeda Hansen, B., DeCarlo, A., and Engler, JA Oral Biol.
  • MMPs MMP-1 (collagenase); MMP-2 (gelatinase A); concealed-3 (stromelysin-1); MMP-7 ⁇ matrilysin ;; MMP-8 ( neu trophil collagenase); MMP-9 gelatinase B); MMP-10 (stromelysin-2); MMP-11 (stromelysin-3); MMP-12 (macrophage elastase); MP-13 (collagenase-3); MMP-14 (MT1-MMP); MMP-15 (MT2-MMP); MMP-16 (MT3-MMP); MMP-17 (MT4-MMP); MMP-18 (collagenase-4); MMP-19; MMP-20 ( enamelysin); MT5-MMP etc.) known (Woessner, JF, FASEB J., 5, 2145-2154 (1991); Matrisian, LM, BioEssays, 14, 455-463 (1992); Birkeda Hansen, H., Moore WGI,
  • Soluble ttMMPs can cause ECM destruction in tissue board areas It is thought to be a substitute.
  • MT & MMPs which are connected to the plasma membrane, are thought to be involved in the destruction of ECM around cells (Seiki, M., Apmis, 107, 137-143 (1999)). Is composed of a conserved region of the pre / propeptide, the corner region, the hinge region and the hemoxin-like region (Nagase, H. et al., J. Bio 1. Chem., 274, 21491-21494). (1999)).
  • the MT-MMPs subfamily is the most recently reported subclass of MMPs, and so far five members (MT1-MMP, MT2-titles P, MT3-MMP, MT4-MMP and UT5-MMP) Force isolation and identification (Sato, H., Takino, T., Okada, Y., Cao, J., Shinaga wa, A , Yamamoto, E., and Seiki, M., Nature, 370, 61-65 (1994); Will, H., and Hinzmann, B., Eur. J. Biochem., 231, 602-608 (1995). Takino, T., Sato, H., Shinagawa, A., and Seiki, M., J. Biol.
  • MT-MMPs are type I membrane proteins with a single transmembrane domain and a short intracellular tail in the hemopoxin domain, which is dendritic to many MMPs. In addition, they have a basic amino acid insertion between the propeptide and the active domain in common, and cleavage of the protein by furin or fibrin-like medulla activates these membrane proteins.
  • ECM fine J matrix
  • MT1-MMP is a key that is also called matrix-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) or MAP-14 (MEROPS ID:
  • MT1-MMP is also used in dogs, goats, magpies, wild boars and rats in addition to humans.
  • the human MT1-MMP cDNA encodes 582 amino swelling groups (EMBL accession No. D26512, E09720 &
  • MT1-MMP has a transmembrane (TM) domain in C and is thought to exert its biological activity by reversal.
  • MMP-2 gelatinase A
  • pro MMP-2 activates (pro MMP-2) with 3 ⁇ 1 ⁇ in addition to MT1- Thigh P itself is also strongly known to degrade various ECM proteins such as type I, II and III collagen, fibronectin, laminin, vitronectin and aggrecan.
  • MT1-MMP has also been shown to promote the process of hearing invasion and translocation (Seiki, M., Apmis, 107, 137-143 (1999); Sato, H.
  • MT1-MMP also includes pro-MMP-2 (Sato, H. et al., Ature, 370, 61-65 (1994)) and procollagenase-3 (pro-MM P-13) (Knauper, V. et al. Activates other MMPs, such as J. Biol. Chera., 271, 17124-17131 (1996)).
  • pro-MMP-2 Session, H. et al., Ature, 370, 61-65 (1994)
  • pro-MM P-13 procollagenase-3
  • MT1-MMP is thought to initiate various protein degradations and cascades on the cell surface.
  • MT1-MMP is not only a cancer cell invasion and metastasis (Seiki, M., Apmis, 107, 137-143 (1999); Sato, H.
  • MT1-MMP appears to be a necessary tool for writing physiological and facial cell infiltration in tissues. Therefore, it is important to elucidate the effects of MT1-MMP on the cell surface.
  • MT1-MMP has been shown to activate pro-MMP-2 and promote cancer cell invasion by shaking the fine 3 ⁇ matrix.
  • the development of active ttMMP-2 also correlates well with invasiveness (Tokuraku, M. et al., Int. J. Cancer, 64, 355-359 (1995); Nomura, H. et al., Cancer Res.
  • the activation step involves a trimolecular complex of MT1-MMP, TIMP-2 and peptide MMP-2 (Strongin, AY et al., J. Biol. Chem., 270, 5331-5338 ( 1995)).
  • the power of shin power, shin power, and the activity of MT1-yeast in Hodgkin ⁇ , have been elucidated in detail. Therefore, it was unknown how to precisely control the activity of MT1-MMP. Therefore, there was a problem that a method for controlling the migration of cells such as cancer and 'invasion' metastasis could not be clarified. Disclosure of the invention
  • the present inventors have made difficult researches to elucidate the mechanism of MT1-MMP activity expression. As a result, allogeneic fibrous complexes are formed via MT1-MMP The formation of the complex and its complex formation were found to be essential for activating pro-position- 2 on the cell surface. Furthermore, we found that expression of PEX without the MT1-MMP fiber site on the cell surface directly interferes with secret association and inhibits pro-MP-2 activation in a dose-dependent manner. In addition, the present inventors have found that expression of PEX having no angular medium site of the MT1-MMP suppresses cell invasion 'metastasis, and has led to the present invention.
  • the present invention is a.
  • MT1-MMP complex characterized by inhibiting the formation of a complex consisting of the membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) Inhibition of body formation
  • a lh agent for cell migration, invasion and / or metastasis which inhibits the formation of a complex comprising MT1-MMP and inhibits the activation of pro-MMP-2;
  • Cys 3 1 9 force Met plus MT1- problem [rho, et Gly 5 3 5 or substance according to [14], wherein to Toku ⁇ that it is substantially the protein having the equivalent activity;
  • nucleic acid having substantially the same activity as the nucleic acid of any one of the above (i) to (iii);
  • TM transmembrane domain
  • CP intracytoplasmic domain
  • NGFR god ⁇ long factor ⁇ receptor
  • the term "and Z or” means that both (1) the selective connection and (2) the selective connection are related, such as "infiltration and / or metastasis". In the case of (i), it is shelf in a sense to include both (i) invasion and metastasis and (2) both invasion and metastasis. In other cases, the term “and / or” is similarly ffl-fl, meaning to include both (1) the fiber relationship and (2) the selective connection relationship. ⁇ brief description
  • Fig. 1 The structure of the MT1-MMP mutant used is drawn experimentally.
  • Figure 2 ' For testing of activation of pro-MMP-2 by MT1-F on the cell surface, C0S1 cells contained MT1-MMP mutant; MT1-F, MTlCat-F expression vector or vector These cells were cultured for 18 hours at 37 ° C in serum-free culture medium in the presence of purified pro-MMP-2 (0.25 // g / ral) and obtained. Cell lysates were examined for mutant expression, and cultures were examined for pro-MMP-2 activation.
  • the upper panel shows Western blot analysis of cell lysates obtained from transduced cells using the 1 ⁇ M2 monoclonal antibody, and the lower panel shows gelatin zymographic analysis in culture.
  • Figure 3 Schematic representation of ⁇ 1 ⁇ ⁇ expressed in ⁇ li. E / A shows that are mutated to Glu 2 4 ° to A1 a.
  • Figure 4 The results of gel filtration analysis of ⁇ 1 ⁇ ⁇ at three different times for testing for the formation of homofilamentous complexes in the outer region of MT1-MMP. The inset shows reduction and SDS-PAGE analysis of MT1EA ⁇ under different conditions.
  • SDS-PAGE analysis shows the results of cross-linking of MT1 EATM with DSG, which is a test for the formation of a homogeneous fibrous complex in the outer region of MT1-MMP.
  • Figure 6 MT1-MMP PEX homodimer-complex formation treated with ⁇ 1 ⁇ (50 ⁇ g / ml) with trypsin, cut off the ⁇ region and PEX, and sampunale was applied to a Superdex 75 gel filtration column. Is shown. The inset shows the SDS- PAGE analysis of seminal X and angular certain area in the reduction and refrain 1 ⁇ matter under (Cat).
  • Figure 7 The results of MT1-MMP PEX and mouse MT4-MMP PEX applied to a Superdex 75 gel filtration column for the homodimer complex formation of MT1-MMP PEX.
  • Inset shows SDS-PAGE analysis of mouse MT4-MMP PEX under reducing and non-reducing conditions.
  • Figure 8 Schematic diagram of the constructed mutant MT1-MMP.
  • Figure 9 MT1-F / NGFR, MT1PEX-F / NGFR, MTlCat-F / NGFR, MTlPat-F / NGFR, MT4PEX-F / NGFR expression vectors in COS 1 cells for the dimer formation test using the MT1-MMP external region on the cell surface. Alternatively, the results are shown for those transfected with vector only (Mock). Cell lysates were analyzed by Western blot using anti-FLAGAG2 monoclonal antibody (Anti-FLAG, upper panel) or anti-phosphotyrosine PY20 monoclonal antibody (Anti-PY, lower panel).
  • FIGS 1 For dimer studies with MT1-MMP external regions on the cell surface, COS 1 cells were co-introduced with MT1-F / NGFR and MT1PEX-F at the indicated DNA ratios. Cell lysates were analyzed by Western blot using anti-FLAG M2 (Anti-FLAG) or anti-phosphotyrosine PY20 (An Hat-PY). Improper relative bands detected by PY20.
  • Figure 11 Effect of MT1PEX-F on activation of pro-MMP-2 by MT1-F on the cell surface. C0S1 cells were co-directed with MT1-F and MT1PEX-F at the indicated ratio of DNA content.
  • FIG. 12 MT1PEX-F view of MT1 -F expressed on the cell surface in terms of protein degradation activity and TIMP-2 binding ability. As shown in Figures 12 to 14, only one expression vector or vector (Mock) of MT-F, MT1PEX-F, and MTICat-F was introduced into CHO-K1 cells.
  • Figure 13 Similar to Figure 12, shows the MT1PEX-F scenic spots for MT1 -F proteolytic activity and TIMP-2 binding ability generated on the cell surface. DQ TM -gelatin-coated cells on a cover glass ⁇ Transfected cells are incubated in culture at 37 ° C for 18 hours. Generated fluorescence was analyzed by confocal microscopy.
  • Figure 14 Similar to Figure 12, shows the ⁇ -F view of the protein degradation activity and TIMP-2 binding ability of MT1-F expressed on the envelope surface. The transfected cells in a 24-well plate were reacted with purified pro-MMP-2 at 37 ° C for 18 hours in a bloodless medium.
  • the cells and medium were analyzed by Western blot analysis (upper panel) and gelatin zymography (lower panel) using anti-FLAG M2 monoclonal antibody, respectively.
  • the packets were then subjected to matrigel infiltration analysis by the modified Boiden-chamber method described in the Examples section of the specification.
  • 0.5 Add g / ml TIMP-2 to upper and lower chambers. GFP-positive cells on the surface of the lower chamber were counted using a fluorescence microscope.
  • FIG. 16 Shows a diagram of the MT1-MMP variants used for homophilic complex formation through the PEX domain of MT1-MMP. Each symbol in the figure indicates the following.
  • FIG. 17 As in FIG. 16, C0S1 cells were transduced with MT-F and / or ⁇ -Myc. The cells were solubilized and subjected to sink precipitation using i3 ⁇ 4! AG M2 antibody-bound beads. Whole cell lysate (Whole Cell) and sediment (Anti-FLAGIP) Analysis was performed by Western blot using M2 antibody (Anti-FLAG) or anti-c-Myc antibody (Anti-Myc).
  • FIG. 18 As in FIG.
  • C0S1 cells were transduced with an expression plasmid for MT1-F, MTlCat and / or MT1PEX.
  • the cells were solubilized and subjected to sedimentation using iFLAG beads as in FIG.
  • Samples were analyzed by Western blot using micro 1 ⁇ M2 antibody (Anti-FLAG), Tl-MMP PEX (Anti-PEX) or XTlCat (Anti-Cat).
  • FIG. 19 For a study of MT1-MT4PEX on proMMP-2 activation on the cell surface, a schematic diagram of MT1-MT4PEX is shown. MT4-PEX The PEX domain is derived from MT4-MMP.
  • FIG. 20 As in FIG. 19, activation of praMMP-2 by MT1-MMP is shown. Expression plasmids of ⁇ -MMP, MT1-MT4PEX or vector alone (Mock) were introduced into C0S1 cells and reacted with proMMP-2 in a bloodless medium. ProMMP using zymography -2 Analyzed for processing ( ⁇ column panel).
  • MT1-F was added to C0S1 cells.
  • the cells were subjected to western blotting using iFLAG M2 (Anti-FLAG) or PY20 (Anti-PY).
  • Relative medulla of the band detected by Figure 24 MT1-F / NGFR for a view of the constitutively active form of Racl (RaclDA) and the potential for proMMP-2 activation during T1-MMP dimer formation.
  • FIG. 2 shows the transition of KaclM in dimer formation of MT1F / NGFK, MT1PEX-F and Z or RaclDA-expressing plasmid into C0S1 cells.
  • PY20 Anti-PY
  • Western blot using anti-FLAG M2 antibody Anti-FLAG
  • the relative bands of the bands detected by PY20 were analyzed and shown by NIH Image Figure 25: As in Figure 24 The feline transfected C0S1 cells were stained with PY20 (Anti-PY), and F-actin was also stained with Alexa488-conjugated phalloidin (Alexa488 phalloidin). This indicates the site where it existed.
  • Nokuichi ⁇ ⁇ ⁇ Figure 26: Similar to Figure 24, MT1-MMP and RaclM expression plasmids were introduced into C0S1 cells, and these cells were reacted with purified proMP-2. The culture was analyzed for proMMP-2 processing by zymography (upper panel). Cell lysates were analyzed by Western blot using T1PEX antibody (lower panel). The relative activation of ProMMP-2 to awakening was calculated and shown by measuring the body of the proMMP-2 band using NIH Image.
  • Figure 27 As in Figure 24, the transfected C0S1 cells were stained with i3 ⁇ 4G Ml antibody. F-actin was also stained with Alexa488-conjugated phalloidin (Alexa488 phalloidin). White arrows indicate sites where both F-actin and TLAG signals were localized.
  • FIG. 1 10.
  • Figure 28 ⁇ 1 ⁇ -F view of pro-MMP-2 activation by MT1-MMP on the cell surface. -Reacted with 2.
  • MMP-2 in culture medium was analyzed by gelatin zymography (_Hippanel), and cell lysates were analyzed by Western blot analysis using an anti-MT1-PEX antibody (middle panel, Whole cell).
  • the introduced cells are subjected to surface biotinylation, and! Analysis by Western blot using CMTl-PEX (lower panel, surface biotinylation) 0
  • Figure 29 Similar to Figure 28, the binding of proMMP-2 to the transfected cells was examined. The samples were analyzed by gelatin zymography.
  • Figure 30 As in Figure 28, the in situ gelatinolytic activity of the transfected cells was determined by culturing the cells on glass slides coated with Alexa488-labeled gelatin. Gelatin degrading activity was visualized as dark, non-fluorescent. Bar: 50 m .
  • Figure 31 MT1PEX-F view of Matrigel invasive activity of HT1080 cells. 80 cells were transfected with a stable expression plasmid for MT1PEX-F and empty vector (Mock). No, igromycin-resistant cells were collected and collected again. The culture solution was replaced with serum-free DMM in the presence or absence of BB94, and the cells were further cultured.
  • FIG. 32 As in Figure 31, MT1PEX-F or an expression plasmid for an empty vector was introduced into HT1080 cells. Cells were stained ⁇ 5 with endogenous MTl-MMP and ⁇ -F using ⁇ sagi i3 ⁇ 4ITlCat antibody and 3 ⁇ 43 ⁇ 4PLAG M1 antibody, respectively. White arrows indicate sites where endogenous MT 1-MMP (Anti-MTlCat) and 1T1PEX-F (Anti-FLAG Ml) signals co-localize. Bar: 50. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the PEX region of MT1-MMP plays an important role in the formation of a simple dimer of MT1-MMP.
  • Ml-MMP horn butterfly: ⁇ ⁇ impaired PEX is in vivo and in vitro.
  • it has demonstrated inhibitory activity on the formation of MT1-MMP simple dimer, and is an inhibitor or medicament.Based on this fact, we will develop a simple dimer formation inhibitor for various MT1-MMPs. enable.
  • the present invention provides a method for monitoring the formation of a simple dimer of MT1-MMP. In addition, it provides a way to treat feces.
  • the present invention relates to an antibody that specifically recognizes the PEX region of MT1-MMP, for example, a monoclonal antibody.
  • PEX or “PEX protein” refers to the PEX region of MT1-MMP (for example, the amino acid sequence of MT1-MMP (SWISS-PEOT accession number: P50281), 31 (Amino acid sequence region at positions 6 to 508, and in some cases, amino acid sequence region at positions 319 to 535) or a fragment thereof.
  • mutants, analogs and derivatives derived or constructed as described below may be used. It is not particularly restricted as long as it has the activity of binding to the PEX region of MT1-MMP.However, MT1-MMP has the activity of inhibiting the formation of a complex consisting of fiber, and preferably exists on the cell surface.
  • MT1-secreted are those that have the activity of inhibiting simple dimer formation.
  • the PEX protein has a desired biological activity (for example, an activity of inhibiting simple dimerization of MT1-MMP, or an activity of inhibiting pro-MMP-2 activation by simple dimerization of MT1-MMP; MT1-MMP as long as it has the activity to suppress or inhibit the resulting cell migration, invasion and / or metastasis caused by simple dimerization of MT1-MMP).
  • the obtained protein can be used to modify the amino swelling group contained therein by a chemical method, or a peptidase such as pepsin, chymotrypsin, ⁇ , ⁇ , ⁇ ⁇ , or bromelain. It can be modified by using, such as endopeptidase, exo-peptidase, or partially decomposed, and used as an invitation.
  • the protein can be subjected to in vivo or in vitro darcosylation or dedarcosylation, or the position to be glucosinolated can be changed (TO87 / 0 5330; Apin and Wriston, CEC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 (1981); Haki muddin et al., Arch.
  • the force C which is usually a carboxyl group (-C00H) or a carboxylate (-C00-) may be an amide (-C0NE) or an ester (-C00R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, .eta. propyl, d-6 alkyl group such as isopropyl or .eta. butyl, for example, C 3 cyclopentyl, cyclohexylene, etc.
  • cyclohexyl - 8 cycloalkyl group for example, Hue nil, 0: - 1 2 Ariru group, such as benzyl, which phenyl which Fuwenechiru - - C 6, such as naphthyl d - 2 alkyl or - naphthylmethyl etc. ⁇ - naphthyl
  • Viva Roy Ruo carboxymethyl group commonly is used as a 4 Ho forces , oral ester Ararukiru group --d-2 C 7 such as an alkyl group.
  • the protein of the present invention is C-terminal When the carboxyl group (or carboxylate) has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the terminal, the carboxyl group having an amide or ester is also included in the protein of the present invention.
  • the ester of this: ⁇ for example, the ester of C described above is used.
  • the protein of the present invention may be any of the above-mentioned proteins having a methionine residue in the above protein, and the amino group of the methionine ⁇ may be a protecting group (for example, a formyl group, acetyl, etc.).
  • a d- 6 acyl group such as a 5- alkyl-carbonyl group
  • a glutaminole group cleaved within the N-terminal side of the viscoelastic body, subjected to pyroglutamylation, and an amino acid in the l:
  • Substituent for example, -OH, -C00H, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.
  • Suitable protecting group for example, d- 6 alkoxy group such as formyl group, acetyl group, etc.
  • complex proteins such as so-called glycoproteins, which are bound to a protein.
  • fusion protein when it is produced by a genetic and recombinant method, and is converted and processed in vivo or in vitro into a substance having a biological activity substantially equivalent to that of a naturally occurring substance. Is also good.
  • the fusion technology which is commonly used in engineering, is powerful because it can be used.
  • the fusion protein can also be purified by affinity chromatography using the insects. Such fusion proteins include those fused to a histidine tag and those fused to the amino acid sequence of maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST) or thioredoxin (TRX).
  • the polypeptide may be tagged with a heterogeneous epitope so that it can be isolated and purified by immunoaffinity chromatography using an antibody that specifically binds to the epitope.
  • You can also.
  • Typical examples are polyhistidine (poly-His) or polyhistidine-glycine (poly-His-Gly) tag, flu HA tag and its antibody 12CA5, c-Myc tag and its antibody 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 or 9E10, Herpes Simplex vir Us glycoprotein D (gD) tag and its antibody, FLAG-peptide, KT3 peptide peptide, a-tubulin peptide peptide, T7 gene 10 protein peptide tag (Field et al., Molecular and Cellular Biology, 8: pp.
  • the biological activity may also include that it has an activity; Among the modifications, deamidation, hydroxylation, phosphorylation, methylation, acetylation, ring opening, ring closing, changing the content of 3 ⁇ 41 to a different one, and increasing or decreasing the number of sugar chains contained Or substitution to D-amino amino acid.
  • the protein may be one in which one amino group is different from the natural one in terms of the raw material, and one in which the position of the amino group of Ri: is different from the natural one.
  • the protein has 1 amino acid peculiar to PEX J ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (for example, 1 to 190, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, especially 1 to 10, 1 ⁇ 5) Missing ⁇ !
  • amino swelling group 1 or more substituted by another residue
  • One or more (for example, 1 to 100, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, especially 1 to 5, etc.)
  • Amino group is ⁇ ! ] Mouth analogs.
  • the domain structure which is a characteristic of natural PEX, is characterized by the fact that it is active and has resistance to the dimer formation of ⁇ - ⁇ present on the cell surface as described above. If so, all of the variants as described above are included in the present invention.
  • the protein may include a protein having a primary structural conformation substantially equivalent to that of natural ⁇ , and may further form a dimer of MT1-MMP existing on the cell surface. It is conceivable that those having biological activity substantially equivalent to that of natural ⁇ except that they are resistant to i may be included. It can also be one of the naturally occurring variants.
  • the protein is, for example, an amino acid sequence ranging from the amino acid sequence at position 316 to the amino acid sequence at position 508 in the amino acid sequence of MT1-MMP (and an amino acid sequence ranging from Z to position 319 to 535).
  • a fragment derived from the protein is a peptide of " ⁇ " of the PEX protein (that is, a partial peptide of the PEX protein), which has substantially the same activity as the above-mentioned protein.
  • the partial peptide of the protein of the present invention may have a range from the amino acid sequence of the 316th amino group to the 508th amino group in the amino acid sequence of MT1-MMP.
  • homology to a region corresponding to the amino acid sequence of MT1PEX has the same homology as described above. Feat It is.
  • substantially equivalent refers to the activity of a protein, such as resistance to activation of proband P-2 by simple dimerization of MT1-MMP, the corresponding physiological activity, and biological activity. Are substantially the same.
  • the meaning of the term may include ⁇ having substantially the same activity, and the substantially same activity includes, for example, a property of inhibiting the dimer formation. And the activity of suppressing and / or inhibiting cell migration, invasion and / or metastasis associated with activation of pro-thigh P-.
  • substantially the same activity means that the activities are the same, for example, that they are the same physiologically, pharmacologically, or biologically.
  • the activity such as inhibiting the dimer formation is equivalent (for example, about 0.001 to 1000 times, preferably about 0.01 to 100 times, more preferably about 0.1 to 20 times, more preferably Is about 0.5 to 2 times stronger)
  • the strength of these activities may vary, and the quantitative factors such as the amount of protein and the amount of protein may be different.
  • amino acid substitutions, deletions, or insertions often do not result in significant changes in the physiological or chemical properties of the polypeptide, and are not subject to such substitutions, substitutions, deletions, or insertions.
  • the resulting polypeptide will be substantially identical to one without such substitutions, deletions, or insertions.
  • Substantially identical substituents of the amino acid in the amino acid sequence may be selected from other amino acids of the class to which the amino acid belongs. For example, non-polar
  • amino acids examples include alanine, phenylalanine, leucine, isocyanate, palin, proline, tributofan, and methionine.
  • Examples of (medium-f raw) include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and dal-yumin.
  • Examples of positively charged amino acids include arginine, lysine, and histidine.
  • Examples of the negatively charged amino acid include aspartic acid and guanolemic acid.
  • Chemical synthesis methods such as liquid-phase synthesis and solid-phase synthesis can be used (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, CA).
  • the protein of the present invention and some of its peptides may be converted into salt by the method of itself / ⁇ or a method analogous to i3 ⁇ 4 obtained as J! I type.
  • the 3 ⁇ 4 ⁇ obtained as a salt can be converted into a fiber type or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • a protein of the present invention (a protein fragment having an arbitrary continuous region in the amino acid sequence present in MT1-MMP or a fragment derived therefrom, a signal peptide domain, a propeptide domain, a core domain of MT1-MMP, Human MT1-MMP II (5?
  • the nucleic acid having the nucleotide sequence of the human MTH1P for example, NA3 ⁇ , can be obtained by applying a genetic operation based on the nucleotide sequence of D26512). Design and synthesize an appropriate primer based on the above, preferably using an animal-derived mRNA that is the origin of the human MT1-MMP nucleotide sequence, using cDNA prepared from the mRNA, using a desired primer.
  • PCR amplification and Riga - is constructed from scratch chain obtained by reaction (LCB) amplified by a variety of human tissues or cultured cells obtained DNA fragment as a probe or the like. It can also be obtained by screening one of the obtained human digenomic DNA libraries or a human-derived cDNA library.
  • a sense primer and an antisense primer are synthesized based on the MT1-MMP base sequence.
  • the primer used in the PCE method is not particularly limited as long as it can amplify a DNA fragment containing a desired site.
  • the sense primer can be preferably synthesized by selecting from the exon site of the 5 'rule of the gene, and the antisense primer is preferably selected from the exon site at the 3' end of the gene.
  • the primer at the 5 'end contains at least a start codon, or is selected so as to be capable of amplifying including the start codon, and the primer at the 3' end contains at least a stop codon, Alternatively, selection is made so as to enable amplification including the stop codon.
  • the primer is (a) an oligonucleotide having a nucleotide sequence corresponding to an arbitrary region at the 5 'end of the human MT1-MMP nucleotide sequence of GenBank TM / EMBL accession number: D26512 and ( b) It is possible to use an oligonucleotide having a complementary nucleotide sequence to an arbitrary region at the 3 ′ end of the human MT1-MMP nucleotide sequence. Although it may be aimed to obtain the full length of the cDNA of the Si at once, the primers in (1) are designed and synthesized using a predetermined exon site (nexon site in Ne), and the PCR is performed.
  • the primer is preferably an oligonucleotide consisting of 5 or more bases, for example, an oligonucleotide consisting of 10 to 50, more preferably 15 to 35, and more preferably 18 to 25 bases.
  • the primer can be prepared by a method known in the art.For example, using an automatic DNA synthesizer such as a model 381A DNA synthesizer, Applied Biosystems, etc., the phosphodiester method, the phosphophotoester method, and the phosphodiester method can be used. It can be synthesized by the foramidite method or the like.
  • mRNA can be performed by the oral method or a method substantially similar to or modified in the art. J. Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2nd ed., Chapter 7, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); DM Glover et al. Ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (19 95) L. Grossman et al.
  • Kits used for mRNA isolation include, for example, those commercially available from Pharmacia, Stratagene, Gibco-BRL, etc. Is lower if required, total RNA obtained oligo (dT) -.
  • oligo (dT) primer can be used.
  • a primer having 12 to 18 T residues can be used.
  • One example of such a primer is an Xba I oligo (dT) primer adapter.
  • random hexamer primers also increases the potential for obtaining the 5 'side of the mRNA.
  • This random hexamer primer can be a single worm or mixed with an oligo (dT) primer.
  • dT oligo
  • the human MT1 - MMP heritage fe it is also preferable to use a Origonuku Reochidopuraima one synthesized based on the nucleotide sequence of (Gen Bank T 7EMBL accession number D26512 )?.
  • RN for reverse transcription ⁇ ⁇ , RN as needed It can be powerful to add S ⁇ .
  • PCR polymerase chain reaction
  • the term "polymerase 'chain'reaction” or “PCR” generally refers to a method as described in U.S. Pat. No. 4,683,195. It refers to a method for amplifying the target by mouth. " ⁇ In addition, the PCR method involves repeating the cycle of primer extension using two oligonucleotide nucleotide primers that can hybridize with type I nucleic acid in a unique manner.
  • the primer used in the PCR method can be a primer that is complementary to the internal nucleotide sequence to be amplified, for example, the nucleotide sequence to be amplified. And those which are complementary at both ends thereof or which are confounded by the nucleotide sequence to be amplified can be preferably used.
  • the primers designed based on this are combined with 10X reaction buffer (attached to Taq DNA polymerase), dNTPs (mixture of doxy TP, dGTP, dCTP, dTTP.
  • the PCR cycle conditions include, for example, denaturation 90 to 95 ° C for 5 to 100 seconds, annealing 40 ⁇ A cycle of 60 ° C for 5 to 150 seconds, extension of 65 to 75 ° C for 30 to 300 seconds, preferably a cycle of denaturation at 94 ° C for 15 seconds, annealing at 58 ° C for 15 seconds, and extension at 72 ° C for 45 seconds, Appropriate values for the length and time of the cleaning can be selected by the illC experiment, and the time of the rebound and elongation changes can be selected appropriately depending on the expected chain length of the PCE product.
  • the annealing temperature is preferably changed according to the hybrid Tm value of the primer and the NA.
  • the elongation time is usually a rough estimate of 1 min IS per 1000 bp of chain length, but shorter times can be selected if necessary.
  • the resulting PCR product is usually subjected to 1 to 2% agarose gel electrophoresis, cut out from the gel as a specific band, and the DNA is extracted using a commercially available extraction kit such as a gene clean kit (Bio 101).
  • the extracted DNA is digested with an appropriate restriction enzyme, refined if necessary, and further, if necessary, phosphorylated at the 5 ′ end with T4 polynucleotide kinase or the like, and then appropriately digested with a pUC vector such as pUC18. Ligation is performed with the appropriate plasmid vector, and appropriate competent cells are transformed into RI. Based on the prepared DNA fragment, a cDNA library can be constructed by subjecting a phage vector and a plasmid vector to ⁇ ffl. For example, calcium method, rubidium / calcium method, calcium Z manganese method, TFB high efficiency method, FSB?
  • the method can be carried out by a method known in the art, such as the Tohoku Concomitant Cell Method, rapid colony method, electroporation, or a method substantially similar thereto (D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 55 7, 1983).
  • a nucleic acid having all or a part of the nucleotide sequence of the family can also be obtained by DNA synthesis. It may be by chemically synthesizing the fragments and linking them by rattan. It is also possible to obtain a desired sequence by using the synthetic fragment as a primer or a probe.
  • PCR is a technique that can be performed in the art by the oral method or a method substantially similar to or a modification thereof.
  • PCR Quirke and GR Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); MA Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-
  • the method can be performed according to a method described in, for example, 9002 (1988) or a method modified or modified.
  • the PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR method, and can be difficult according to the following protocol, which is clearly described by a kit manufacturer or a kit supplier.
  • oligonucleotide refers to a relatively short, single-stranded polynucleotide, preferably a polydeoxynucleotide, and Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734 (1989), which can be chemically synthesized by methods such as the triester method, the phosphite method, the phosphoramidite method, and the phosphonate method. it can. It is generally known that synthesis can be conveniently performed on a modified solid support, for example, using an automated synthesizer, which is commercially available.
  • the oligonucleotide may contain one or more modified bases, and may contain, for example, a base that is not naturally ⁇ !, such as inosine, or a tritylated base. .
  • the obtained PCB product is cloned, the obtained PCR product is identified, and a DNA fragment encoding the desired human MT1-MMP can also be obtained. Similarly, the DNA fragment can be used as a probe to screen various cDNA libraries to isolate the target DNA.
  • PCE products for example, p-Direct
  • plasmid vectors such as (Clontech), pCR-Script TM SK (+) (Stratagene), pGEM-T (Promega) and pAmp TM: Gibco-BRL can be used.
  • the DNA fragment obtained as described above can be used as a probe, if necessary, as described above.
  • RNA fragments that are Of course, if necessary, the inserted sequence of the cDNA in the clone can be subcloned.
  • the labeling of the probe or the like with a dimensional isotope or the like can be performed using a commercially available labeling kit or kit, such as a random primed DNA labeling kit (Boehringer Mannheim).
  • RT-PCR polymerase chain reaction coupled reverse transcription
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • a method for isolating and purifying mRNA from ⁇ 3 ⁇ 4 * cells or tissues for example, using a commercially available kit such as EEX kit, United States Biochemical; Glass MAX TM RNA spin cartridge system, Gibco-BRL, for ij MRNA is reverse transcribed using an oligo (dT) primer to synthesize 1st strand DNA, and then a homopolymer tail (for example, G residue) is added to the 3 ′ of 1st strand DNA, or After adding the adapter, the cDNA can also be PCE amplified using oligo (dT) and oligo (dC) primers or an adapter primer.
  • a commercially available kit such as EEX kit, United States Biochemical; Glass MAX TM RNA spin cartridge system, Gibco-BRL, for ij MRNA is reverse transcribed using an oligo (dT) primer to synthesize 1st strand DNA, and then a homopolymer tail (for example, G residue)
  • driers suitable for this include ⁇ Superscript TM pre-amplification system (Gibco-BRL); cDN A Cycle TM kit (Invitrogen) and the like.
  • Hybridization is carried out in sampnore (eg, a library prepared from human tissue cells, typically; phage such as igtio) A plaque was formed by infecting bacteria such as ASISC600hfl strain, etc.) and transferred to a membrane such as a nylon filter, and subjected to treatment, fixation, and washing as necessary. Subsequently, the DNA transferred to the membrane is cored in a hybridization buffer with a labeled probe DNA fragment as required.
  • sampnore eg, a library prepared from human tissue cells, typically; phage such as igtio
  • a plaque was formed by infecting bacteria such as ASISC600hfl strain, etc.
  • the hybridization process is usually performed at about 35 ° C. to about 80 ° C., more preferably about 50 ° C. to about 65 ° C., for about 15 minutes to about 36 hours, more preferably for about 1 hour to Power that can be performed for about 24 hours.
  • the hybridization process is performed at about 55 ° C for about 18 hours.
  • the buffer for hybridization can be selected from those commonly used in the art, and for example, Rapid hybridization buffer (Amersham) or the like can be used.
  • Examples of the treatment of the transferred membrane include a method in which an alkali denaturing solution is used. After the treatment, a treatment with a neutralizing solution or a buffer solution is preferable.
  • a process for fixing the membrane as a process for fixing the membrane.
  • the transferred membrane may be washed with a washing solution commonly used in the field, for example, 50 mM Tris-HC1 buffer containing 1 M NaCl, ImM EDTA and 0.1% Sodium Dodecyl sulfate (SDS), and H8.0. You can do it by washing.
  • a washing solution commonly used in the field, for example, 50 mM Tris-HC1 buffer containing 1 M NaCl, ImM EDTA and 0.1% Sodium Dodecyl sulfate (SDS), and H8.0. You can do it by washing.
  • SDS Sodium Dodecyl sulfate
  • alkali denaturing solution As the above-mentioned alkali denaturing solution, neutralizing solution, and buffer solution, those selected from those described in the art can be used.
  • alkali denaturing solution include 0.5M NaOH and 1.5M NaCl.
  • the neutralizing solution may be, for example, a 1.5 M NaCl-containing 0.5 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, or the like.
  • XSSPE (0. 36M NaCl, 20mM NaH 2 P0 4 and 2m M EDTA) and the like.
  • the transferred membrane Prior to the hybridization process In order to prevent non-specific hybridization reaction, it is strongly preferred that the transferred membrane is subjected to a pre-hybridization treatment if necessary.
  • This pre-hybridization treatment is performed, for example, using a pre-hybridization solution (50% formamide, 5 x Denhardt's solution (0.2% ⁇ serum albumin, 0.2% polyvinyl pyrro lidone), 5XSSPE , 0.1% SDS, 100 / g / ml heat 'denatured salmon sperm DNA], etc., about 35 ° C; ⁇ 50 °
  • a pre-hybridization solution 50% formamide, 5 x Denhardt's solution (0.2% ⁇ serum albumin, 0.2% polyvinyl pyrro lidone
  • 5XSSPE 0.1% SDS
  • 100 / g / ml heat 'denatured salmon sperm DNA] etc.
  • the length of one fragment can be, for example, about 70 C to 100 C, preferably about 100 ° C., for about 1 minute to about 60 minutes, preferably about 5 minutes.
  • the hybridization may be performed by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the stringent conditions herein are, for example, about 50 mM, preferably about 19-4 (more preferably about 19-20 mM, for a sodium key, and about 35-85 ° for C, preferably about 50 to 70 ° C., and more preferably about 60 to 65 ° C.
  • the finole letter After completion of hybridization, the finole letter is thoroughly washed and treated, and a specific hybrid
  • the labeled probe other than the labeled probe DNA fragment that has undergone the quenching reaction is removed, and the finoletter can be washed and selected from those used for ⁇ ! In the relevant field.
  • % SDS-containing 0.5XSSC (0.15M NaCl-containing 15 mM citrate buffer, H 7.0) can be difficult to wash by washing etc.
  • Hybridized plaques are typically detected by autoradiography Can be used in the field Suitably selected from methods need can also be used to blur click detection.
  • a suitable buffer for example, SM solution (lOOmM NaCl and 10 mM MgSO 4 containing 50 mM Tris-HCl buffer Solution, pH 7.5), then dilute this phage suspension to: M, infect bacteria, cultivate the resulting ⁇ S bacteria, and cultivate the cultured ⁇ M bacteria.
  • SM solution laoxyribonucleic acid
  • use the above-mentioned program A to perform the remaining 13 ⁇ 4 : ? Objective group from library and cDNA library The process of screening the recombinant phage can be performed repeatedly. Further, the target recombinant phage can be obtained by subjecting the cultured bacteria to extraction treatment, centrifugation, and the like.
  • the resulting phage particles can be separated by methods commonly used in the art, such as, for example, glycerol-gradient centrifugation (Molecular clonin g, a laboratory manual, ed.T. Maniatis , Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989). From phage particles, the DNA in a way that is commonly divided in this the art can fine ⁇ , for example, the resulting et phage TM solution (LOMM MgSO 4 containing 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.
  • the target DNA can also be obtained by subcloning or the like.
  • subcloning can be carried out using a plasmid as a host, using a free bacterium as a host.
  • DNA obtained by such subcloning can be purified and separated by methods such as centrifugation, phenol extraction, and ethanol / S in the same manner as described above.
  • human MT1-MMP DNA, TIMP-2 DNA, MMP-2 DNA, god ⁇ long factor ⁇ concept (NGFR) DNA, chimeric DNA containing them, and the like can be obtained. Others If necessary, a nucleic acid such as DNA encoding a desired polypeptide can be obtained.
  • human MT1-MMP DNA with FLAG epitope for example, human MT1-MMP DNA with FLAG epitope, PAG-deficient human MT1-MMP DNA with FLAG epitope, and human MT1-MMP DNA with FLAG epitope, Chimeric mutant with NGFR DNA, horn #a certain loss of FLAG human epitope ⁇ -chimeric mutant of MMP DNA and NGFR DNA, PEX-deficient human FLAG epitope chimeric variants of MMP DNA and NGFE DNA, such as DNA coding for the Cys 3 3 6 of Me t plus MT1- MMP to Gly 5 5 ° is obtained.
  • the nucleic acids obtained in the present invention include single-stranded DNA, Z ⁇ il DNA, ENA, DNA: RNA hybrid, and synthetic DNA, and human genomic DNA, human genomic DNA library, cDNA derived from human tissues and cells, Any of A and A may be used.
  • the nucleic acids may also hybridize under stringent conditions to those having the characteristic sequences specifically disclosed herein.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid is modified by a method known to those skilled in the art, such as recombinant technology, as described above (for example, open mouth, removal, Replacement).
  • the nucleotide sequence can be determined using the Didoxy method, for example, the M13 Didoxy method, the Maxam-, Gilbert method, or the like.
  • a commercially available sequencing kit for example, a Taq dye primer cycle sequencing kit, Sequenase v It can be performed using a 2.0 kit or the like, or by using a self-determining sequencing method, for example, a fluorescent DNA sequencer.
  • Examples of the polymerase used in the dideoxy method include Klenow fragment of DNA polymerase I, AMV reverse transcription, Taq DNA polymerase, T7 DNA polymerase, and modified T7 DNA polymerase.
  • the DNA fragment obtained by the present invention is incorporated into a suitable vector as described in detail below, for example, a vector such as plasmid pEX, pMAMneo, pKG5, pET3a (Stratagene), and the like. Can be expressed in various host cells, for example, E. coli, yeast, CH0 cells, COS cells, and the like.
  • the DNA fragment can be introduced as it is or as a DNA fragment containing appropriate control sequences, or incorporated into a suitable vector, and introduced into cells such as animals.
  • Transgenic animals that express a given fei can also be created. Animals include mammals, for example, mice, rats, egrets, guinea pigs, and sea lions.
  • a transgenic animal can be prepared by introducing the DNA fragment into a fertilized egg of an animal such as a mouse.
  • the method can be performed according to a method known to those skilled in the art, for example, the methods described in US Pat. Nos. 4,736,866 and 487,0009. Confirmation of a certain residual product can be carried out using COS-1 cells obtained by transfection of the relevant fetu, animal cells containing ⁇ ⁇ cells, etc., which are suitable for it, such as ⁇ 080 cells.
  • a method for introducing this exogenous residue into animal cells such as a baby L® product, a method known in the art or a method substantially similar thereto can be used. For example, calcium phosphate method (for example, F.
  • Host cells that can express the DNA in host cells such as Bacillus subtilis, etc., yeast cells, CH0 cells, eosinophil host cells such as COS package, and insect cell hosts such as Sf21
  • Any kind of plasmid is acceptable.
  • These sequences can be modified, for example, into codons that are unique for expression in the selected host cell, can be provided with a restriction self-site, and can express the desired fei Control sequences, facilitator sequences, etc. to facilitate the binding of the target residues, such as linkers, apta, etc., and ⁇ control substance resistance and metabolism. , Including useful sequences, etc.
  • a suitable promoter such as a plasmid harboring E. coli,
  • Tributyl DOO fan promoter one (trp), lactose promoter (lac), triple Tofuan lactose promoter one (tac), lipoprotein promoter (lpp), the Sufa temporary P L promoter
  • trp Tributyl DOO fan promoter one
  • lac lactose promoter
  • tac triple Tofuan lactose promoter one
  • lpp lipoprotein promoter
  • the Sufa temporary P L promoter First, an animal cell as the host plasmid
  • the SV40 late promoter, the MMTV LTR promoter, the RSV LTR promoter, the CMV promoter, the SRa promoter, etc. and in the plasmid using yeast as the host, the GAL1, GAL10 promoters, etc. obtain.
  • control systems such as CYC1, HIS3, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TP1, and A0
  • Enhances transcription of DNA encoding the desired polypeptide Enhancers can be inserted into vectors, and such enhancers act on the motor to promote transcription, usually roughly
  • Enhancer 10 ⁇ Elements with LOO bp cis action are strongly mentioned. Many enhancers are known from liquor Lid artifacts such as globin, elastase, albumin, huetoprotein, and insulin. Typically, it can be used for Enhanksa virus # 1 obtained from raw virus. For example, SV40 Enhancer (100-270 bp) in the Rate page area of Replication origin, early in Cytomegalovirus Examples include the promoter enhancer, the polioma replication origin rate, and the adenovirus enhancer in the ⁇ I region, and, if necessary, the signal sequence that was present in the host.
  • Plasmids using Escherichia coli as a host include, for example, pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, and pTZ-18E. / -18U, pTZ-19B / -19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf (-), pBluescript IS TM (Stratagene), etc. Suitable for plastic PAS
  • Plasmids that use animal cells as hosts include SV40 vectors, polymorphisms, virus vectors, vaccinia virus, retrovirus vectors, etc., such as pcD, pcDSR, CDM8, pCEV4, pME18S, pBC12B I and PSG5 (Stratagene).
  • yeast Examples of plasmids using yeast as a host include Yip-type vectors, YEp-type vectors, YKp-type vectors, and YCp-type vectors, such as pGPD-2.
  • the host cell is an Escherichia coli, for example, those derived from the Escherichia coli K12 strain, such as 1533 XL1-B1ue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5, DH10B, and HB101 , MC1061, JM109, STBL2, BL21 (DE3) / pLysS and the like.
  • the host cell may be a yeast, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichia pastoris, Kluy veromyces strain, Candida, Trichoderma reesia, and other yeast strains.
  • the host cell is an animal cell, for example, CO from African green monkey line cells S-7 cells, COS-1 and CV-1 cells, human kidney cell-derived 293 cells, human 3 ⁇ 4 ⁇ -cell derived A431 cells, human colon-derived 205 cells, mouse Itoizumi Kikuchi vesicle-derived COP cells, MOP cells, W0P Cells, CH0 cells derived from Chinese hamster cells, CHO DHFR-cells, human HeLa cells, mouse cells 127 cells, mouse cells * NIH 3T3 cells, mouse L cells, 9Bffi, HL-60, U937, Ha, Jurkat cells And other cell lines obtained by exchanging the carpet, ordinary double cells, cell lines derived from primary cultured tissues in vitro, and the like.
  • an animal cell for example, CO from African green monkey line cells S-7 cells, COS-1 and CV-1 cells, human kidney cell-derived 293 cells, human 3 ⁇ 4 ⁇ -cell derived A431 cells, human colon-derived 205 cells, mouse Ito
  • Insect cells include Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus), its derivatives or other suitable ones, and Spodopt'era frugiperda (caterpillar), Aedes a egypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster (frui ⁇ ly), force larvae or silkworm larvae, such as -N cells, etc. (eg Luckow et al., Bio / Technology , 6, 47-55 (1988); Setlow, JK et al. (Eds), Genetic Engineering, Vol. 8, pp.
  • plant cells as host cells by utilizing Agrobacterium tumefaciens and the like, and these are widely known in the art together with one suitable vector.
  • the techniques of the present invention include modifications or conversions that are known or commonly used in the art, reverse transcription, or structures suitable for cloning DNA fragments. For this purpose, it is possible to use, for example, DM modification, angle division, DNA polymerase, ⁇ nucleotidyltransferase, and DNA ligase.
  • Reverse transcription ⁇ ⁇ includes, for example, reverse transcriptase derived from mouse Moloney leukemia virus (MMLV) and reverse transcriptase avi derived from avian myeloblastosis virus (AMV). La It is.
  • an RNase H-deficient body or the like can be preferably used, and particularly, a modified MMLV RT lacking ENase H activity can be preferably used, and more preferably, one having high heat stability.
  • Suitable reverse transcripts include MMLV RT (Gibco-BRL), Superscript RT plus (Life Technologies), and others.
  • DNA polymerase examples include a bacterium DNA polymerase, a derivative thereof (Klenow 'fragment as a book, a bacterium phage T4 DNA polymerase, a bacterium phage T7 DNA polymerase, a thermostable bacterium DNA polymerase, and the like. Nucleotidyltransferase is described, for example, in Wu et al. Ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 96, Academic Press, New York (1983). -OH includes deoxynucleotide (dNMP) ⁇ TdTase, etc.
  • dNMP deoxynucleotide
  • DNA modification and eccentricity examples include exonuclease and endonuclease, such as snake venom phosphodiesterase and spleen.
  • Phosphodiesterases m bacterium DNA exonuclease I, bacterium DNA exonuclease III, bacterium DNA exonuclease VII, exonuclease, DNase I, nuclease Sl, The Kurokokkasu '(Micrococcus) such as nuclease one peptidase and the like DNA ligase, for example:. ⁇ ⁇ DNA ligase, and the like T4 DNA ligase.
  • Vectors suitable for cloning DNA fragments to construct a DNA library include plasmid, sphage, cosmid, P1 phage, factor F, YAC, and the like.
  • One of them is Charon, for example, Charon
  • the transformant transformed with the expression vector containing the nucleic acid encoding the protein of the present invention can be raised by repeatedly cloning using an appropriate selection marker according to ⁇ , It is possible to obtain a cell line having stable expression ability. For example, in a transformant using an animal cell as a host cell, j # ⁇ , MTX 'wisteria using dhfr as a selective marker are gradually raised and cultured to select a resistant strain. Amplify DNA that encodes more proteins The ability to obtain the fine S fiber that gives the present.
  • the revealant of the present invention can be cultured under conditions in which the nucleic acid encoding the protein of the present invention can be expressed, and the target substance can be fired.
  • the dysmorphic transformant can be cultured in a medium commonly used in the art. For example, -m, a source of Bacillus subtilis, etc .; a form-MI recombinant using a cell host, yeast, or the like as a host, can be readily identified.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances and the like necessary for the growth of the transformant.
  • Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble ⁇ !, sucrose, etc.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonia, m, cornchea liqueur, peptone, casein, (3 ⁇ 4 extract, ⁇ extract, soybean meal, ⁇ Inorganic or ⁇ -potassium such as potato extract, etc.
  • non-noodles for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, calcium carbonate, etc.
  • yeast, vitamins, casamino Acids, growth promoting factors, etc. may be added.
  • a drug such as 3 ⁇ -indolylacrylic acid can be used.
  • the ⁇ ⁇ of the medium is preferably about 5-8.
  • culturing is usually performed at about -45 ° C for about 3 to 75 hours for bacteria, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • a transformant in which the host is an animal cell
  • a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum, a PRMI1640 medium, a MEM medium, or the like is used as a medium.
  • the strength of ⁇ ⁇ is about 6-8. Cultivation is carried out at 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the obtained culture solution can be used as it is.
  • the cells or cells When extracting a substance from the above cultured cells, the cells or cells are collected by a well-known method, and the cells or cells are suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, lysozyme and Z or frozen. Therefore, a method of obtaining a crude extract by centrifugation or filtration after disrupting the cells or cells can be used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surface active agent such as Triton X-100 (trade name) or Zwyn-80 (trade name). . If the target product is secreted into the culture solution, the cells or cells may be secreted by a method known per se after completion of the culture.
  • the target pirate contained in the culture obtained in this manner or in the extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods, for example, ammonium sulfate precipitation.
  • known separation and purification methods for example, ammonium sulfate precipitation.
  • salting-out gel filtration using Sephadex, etc. ⁇ ⁇ phenyl group, etc. 3 ⁇ 4 7 W biogroup-based carrier, etc., ⁇ ⁇ hydrophobic f clotting chromatography, dye gel clotting chromatography, electrophoresis
  • an antibody that specifically reacts with polyacrylamide gel electrophoresis, a monoclonal antibody, or the like is treated with an immobilized affinity chromatography to purify the purified fraction.
  • an immobilized affinity chromatography for example, gelatin-agarose 'affinity chromatography, heparin-agarose chromatography, and the like can be mentioned.
  • a system comprising MT1-MMP such as a substance that inhibits simple dimer formation of MT1-MMP, is obtained by ffffling a system in which MT1-MMP and pro-MMP-2 coexist.
  • Garlic a 'method is provided.
  • the MT1-MMPOTM / CP was replaced with a NGFR TM / CP chimeric molecule (including the K type that expresses its goodness, including rigid hulls or cultivation thereof), and the MT1-MMP was simplified. It is possible to screen for a substance that inhibits the dimer formation effect.
  • a transformed cell expressing chimerism which is obtained by substituting TM / CP of 3 ⁇ 4! -MMP with TM / CP of NGFE or a culture thereof is used.
  • the test sample was dewormed: a comparison is made between ⁇ and the phosphorylation in the chimera.
  • the biological activity for example, protease activity, activation of pro-MMP-2 caused by simple dimer formation of MT1-MMP, or cell migration, invasion and Z Or vehicle shifts
  • the biological activity for example, protease activity, activation of pro-MMP-2 caused by simple dimer formation of MT1-MMP, or cell migration, invasion and Z Or vehicle shifts
  • Chimera ⁇ ⁇ can be used as it is ⁇ ⁇ fluorescence such as fluorescein, ⁇
  • Suitable using DNA recombination technology It is also possible to suitably use a tag that has been worked or a tag that has been worked by a chemical method. Phosphorylation can be measured by a method known in the art, for example, a method for detecting phosphorylation of a tyrosine residue generated in the TM / CP portion of NGFR using an anti-phosphotyrosine antibody or the like. Test samples include, for example, proteins, peptides, non-beptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, plant extracts, plant extracts such as animals, and cell extracts.
  • test compound used in the test sample may preferably include an antibody against I » a compound having inhibitory activity against the MMP II family, particularly a synthetic compound. Particularly preferred are a tnP X antibody, a pseudo-PEX conjugate, and the like. These compounds may be novel compounds or known conjugates.
  • the screening can be performed according to a measurement method known in the art.
  • various labels, buffer systems, and other appropriate reagents, etc., described in the measurement method using the antibody below can be used, and the measurement can be performed according to the operations described there.
  • the measurement is usually performed in a buffer such as Tris-HCl buffer or phosphate buffer which does not adversely affect the reaction, for example, at pH 4 to 10 (preferably pH about 6 to 8). You can be powerful.
  • antibody may be used in a broad sense, and may be a single monoclonal antibody against a desired PEX region protein fragment or an antibody having specificity for each type of epitope. And may include monovalent or multivalent antibodies, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. It also represents intact ⁇ and their fragments and excerpts, including fragments such as F (ab ') 2, Fab' and b, and at least two more! ⁇ Or chimeric antibodies or hybrid S-proteins having an epitope binding site, or bispecific recombinant antibodies such as quadromes, triomes, etc.
  • Idiotypic antibodies or those that may be chemically modified or processed to elicit these, may be obtained by applying oral cell fusion or hybridoma technology or anti-book technology, or by synthetic or semi-synthetic technology.
  • Applied antibodies conventional techniques known from the standpoint of anti-
  • L T Monoclonal antibodies directed against ⁇ substances are produced using any method that can provide the ⁇ antibody through a series of cell lines in culture.
  • Shutaigo "monoclonal" refers to the character of an antibody that is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and requires that the antibody be produced by any specific method. Do not assume that there is.
  • Each monoclonal antibody includes a population of antibodies that are identical except that there may be small amounts of variants that may occur naturally.
  • Monoclonal antibodies have high specificity, and are directed against sites with a single specificity.
  • Each monoclonal antibody when compared to a conventional (polyclonal) antibody, which typically contains various antibodies directed against different (epitopes), has a single i ⁇ ⁇ _h It is aimed at one.
  • monoclonal antibodies are also synthesized by hybridoma culture and are excellent in that they lack or reduce the 5-1 of other immunoglobulins.
  • Monoclonal antibodies include hybrid antibodies and recombinant antibodies. They replace the variable H region domain with a constant region domain (eg, a humanized antibody) or have a high molecular weight, as long as they exhibit the desired biological activity, regardless of their origin or species gij of the immunoglobulin class or subclass.
  • Examples of the preferred methods for producing monoclonal antibodies include the hybridoma method (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 495-497 (1975)); the human B cell hybridoma method (Kozbor et al. al., Immunology Today, 4, pp. 72-79 (1983); Kozbor,
  • the monoclonal antibody according to the present invention has the same biological sequence as that of an antibody derived from a specific species or belonging to a specific antibody class or subclass as long as it exhibits the desired biological activity. Or the remainder of the chain is identical to or homologous to the corresponding sequence of an antibody derived from another species or belonging to another antibody class or subclass.
  • Globulin U.S. Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-6855 (1984)).
  • the monoclonal antibody of the present invention may be a monoclonal antibody obtained by using a cell fusion technique using myeloma cells, and can be described in, for example, the following steps.
  • an isolated protein fragment of the PEX region of MT1-MMP or a fragment derived therefrom can be used.
  • information of the amino acid sequence of PEX domain (GenBank T EMBL ,, acce ssion number : D26512) on the basis of, and I b ⁇ synthesize suitable oligopeptides can make use of it as a I3 ⁇ 4.
  • ⁇ ⁇ may be mixed with an appropriate adjuvant as it is to make it a power, sex conjugate, etc.
  • ⁇ ⁇ ⁇ used as a carrier is at least three consecutive 1 regions of MT1-((for example, the amino acid sequence region of positions 316 to 508 in the amino acid sequence of MT1-MMP, or the amino acid sequence region of positions 319 to 535 in some cases).
  • the amino swelling may be selected.
  • a fragment of MT1-MMP fragment or a sequence region that is conservative based on the amino acid sequence is selected, and the polypeptide is designed and chemically synthesized. It may be a synthetic polypeptide fragment obtained.
  • the fragment can be bound to various carrier proteins via an appropriate condensing agent to form a ⁇ ⁇ conjugate such as a hapten-protein, which can be used to obtain only a specific sequence (or a specific bulge).
  • a condensing agent such as a hapten-protein, which can be used to obtain only a specific sequence (or a specific bulge).
  • a cysteine residue or the like is used in advance in the polypeptide to be designed, so that it is possible to easily prepare an insoluble conjugate.
  • the carrier proteins can first be activated. For such activation, the introduction of an activating bonding group can be cited.
  • activated linking group examples include (1) an activated ester or an activated carboxyl group, for example, a nitrophenyl ester group, a pentafluorophenyl ester group, a 1-benzotriazole ester group, an N-succinimid ester group, and the like.
  • Activated dithio groups such as 2-pyridyldithio group.
  • Carrier proteins include keyhole's lindet hemocyanin (KLH), bovine blue albumin (BSA), ovalbumin, glopurine, polypeptides such as polylysine, and bacterial cell components such as G. Can be
  • Textiles can be produced by methods known to those skilled in the art. For example, Shigeru Muramatsu, et al., Practical Physics Course 14, ⁇ Physics, Maruzen Co., Ltd., 1985, Ed. Lecture 5, ⁇ Chemistry Research Methods, Tsuchikadojin, 1986, edited by The Japanese Biochemical Society, New Chemistry Experiment Lecture 12, Medulin III, ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ 4Antibody.Capture, Tsuchikadojin, 1992, etc. It can be performed according to it. It is delivered by injecting the disinfectant once or several times (with an adjuvant, if necessary) into the mammal. Typically, the injection is carried out by subcutaneously or intraperitoneally injecting the antioxidant and / or adivant into a mammal.
  • IJ examples include those containing the above-described peptide or recombinant MT1-MMP obtained by DNA cloning, the recombinant MT1--II protein, or a fragment obtained by digesting the same.
  • the agent is ⁇ in the Lfj material to be treated. It may be used after forming a conjugate with a protein known to be soluble (for example, the above-mentioned carrier proteins).
  • adjuvants include Freund ⁇ : adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, ribosome, hydroxylated aluminum, silica, lipid eight, and synthetic trehalose dicorynomycolate (TM) adjuvant.
  • a mouse, hamster, or other suitable animal such as BALB is used.
  • the dose of the antigen is, for example, about 1 to 400 zg / animal for a mouse, and is injected into the air or subcutaneously if necessary, and thereafter every 1 to 4 weeks, preferably 1 to 2 Repeat the intraperitoneal, subcutaneous, intravenous, or intramuscular injection every 2 to 10 times every week.
  • the mouse for immunization in addition to BALB / c mouse, F1 mouse of BALB / c mouse and mouse can also be used.
  • an antibody titer can be prepared, and the antibody titer can be measured to control the animals' animals.
  • the antibody of the present invention may be obtained from the animal thus obtained, and includes, for example, purified and polyclonal antibodies.
  • the infinitely proliferative cell line ( ⁇ cell line) used for cell fusion can be selected from cell lines that do not play globulin.
  • ⁇ cell line 3-NS-1-Ag4-1 (NS-1, Eur. J. Immunol. , 6: 511-519, 1976), SP-2/0-Agl4 (SP-2, Nature, 276: 269 -270, 1978), P3-X63-Ag8 derived from M0PC-21 cell line -Ul (P3U1, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81: 1-7, 1978), P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256: 495-497, 1975), P3-X63- Ag8-653 (653 , J.
  • 8-azaguanine Jimurao's mouse mie cell line is used in small mediums such as Dulbecco's MEM medium (DMEM medium) and RPMI-1640 medium, such as penicillin and amikacin, bovine fetal serum ( FCS), etc., and further subcultured in a medium supplemented with 8-azaguanine (for example, 5-45 g / ml). It can be prepared.
  • the cell strain used should be thawed completely at 37 ° C, washed three times with a normal medium such as EPM G 1640 medium for 3 h, and cultured in positive A stock prepared may be used.
  • An animal for example, a mouse, which has been subjected to the above-mentioned step 2, is spleen removed 2 to 5 days after the final treatment, and then a spleen cell suspension is obtained.
  • lymph node cells from various parts of the body can be obtained and used for cell fusion.
  • the thus obtained spleen cell suspension and the myeloma cell line obtained according to the above step 3 are placed in a medium such as a minimum essential medium (MEM medium), DMEM medium, RPMI 1640 medium, and the like, and cell fusion is performed.
  • MEM medium minimum essential medium
  • DMEM medium DMEM medium
  • RPMI 1640 medium RPMI 1640 medium
  • an agent such as polyethylene glycol is added.
  • the cell fusion agent various other known agents in the relevant field can be used.
  • cell fusion agent examples include inactivated Sendai virus (HVJ: Hemagglutinating Virus of Japan).
  • HVJ Hemagglutinating Virus of Japan
  • polyethylene glycol having an amount of 1,000 to 8,000 can be used, and the amount of A polyethylene glycol of 000-4,000 is more preferable.
  • the as of polyethylene glycol in the fusion medium is, for example,
  • Splenocytes (lymphocytes) to be fused The ratio of myeloma cell lines is, for example, 1: 1 to 20: 1, but is more preferably 4: 1 to 7: 1. I can do it.
  • the fusion reaction is performed for! -10 minutes, and then a cell culture medium such as RPMI-1640 medium is added.
  • the fusion reaction electrode can also be used as a fiber. After the fusion reaction, the cells are separated by centrifugation or the like, and then transferred to a selection medium.
  • the selection medium examples include a so-called medium, such as an FCS-containing MEM medium and RPMI-1640 medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the method for replacing the selective medium is to add an equal volume to the culture plate and add the same volume the next day, and then replace half the volume with the HAT medium every 1 to 3 days. It can be done by adding 3 ⁇ 4M to. Also after fusion 8 On the 16th day, in a so-called HTi area except for aminopterin:!
  • mouse thymocytes can be inverted, for example, which is the preferred age.
  • the ability of the hybridoma to grow and the culture of the culture medium can be measured using, for example, a radiometric analysis (RIA), a bulk analysis (ELISA), a fluorescence analysis (FIA), etc. Screening is performed using a cell fragment separator (FACS) or the like, or using a fragmented fragment peptide as a target, or measuring a target antibody using a labeled anti-mouse antibody.
  • RIA radiometric analysis
  • ELISA bulk analysis
  • FFA fluorescence analysis
  • Cloning the hybridoma producing the desired antibody can be accomplished by the ability to pick up colonies in an agar medium, or by limiting dilution. It can be performed more preferably by the limiting dilution method. Cloning should be performed multiple times.
  • the obtained hybridoma strain is cultured in an appropriate growth medium such as an FCS-containing MEM medium or RPMI-1640 medium, and a desired monoclonal antibody can be obtained from the culture medium.
  • an appropriate growth medium such as an FCS-containing MEM medium or RPMI-1640 medium
  • a desired monoclonal antibody can be obtained from the culture medium.
  • the hybridoma be ascites.
  • Each hybridoma is transplanted and expanded in the abdominal cavity of a histocompatible animal of the same origin as the animal derived from the myeloid cells, or each hybridoma is transplanted and grown in, for example, a nude mouse.
  • Monoclonal antibody raised in the ascites of Ml product can be recovered and obtained.
  • the animals are able to intraperitoneally administer a mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentyldecane) after transplantation of the hybridoma, and after the treatment, the hybridoma is allowed to grow, Ascites can also be removed.
  • the ascites fluid can be used as is, or by the oral method, for example, salting out using ammonium sulfate, gel filtration using Sephadex, ion exchange chromatography, or the like. It can be purified and used as a monoclonal antibody by electrophoresis, dialysis, filtration, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, etc. Preferably, ascites containing the monoclonal antibody is used.
  • Ammonium sulfate fractionation, and anion exchange gel such as DEAE-Sepharose It can be processed and purified by affinity columns such as Protein A column. Particularly preferred is affinity chromatography in which ⁇ or catalytic fragments (eg, synthetic peptides, recombinant proteins or peptides, sites specifically recognized by antibodies, etc.) are immobilized, and protein ⁇ is immobilized.
  • affinity chromatography in which ⁇ or catalytic fragments (eg, synthetic peptides, recombinant proteins or peptides, sites specifically recognized by antibodies, etc.) are immobilized, and protein ⁇ is immobilized.
  • transgenic mice or other organisms such as other mammals, are used to express humanized anti-binding antibodies expressed in the ⁇ original polypeptide product of the present invention. I can do it.
  • nucleic acid encoding the monoclonal antibody is isolated and sequenced by a conventional method, for example, by using an oligonucleotide probe that can specifically bind to the heavy chain of mouse antibody or to the residue encoding. be able to.
  • the DNA once isolated can be put into an expression vector as described above and put into host cells such as CH0 and COS.
  • the DNA is modified by, for example, replacing the sequence of a homogenous mouse with a sequence coding for the constant region domain of the human heavy chain or light odor (Morrison et al. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6581, 1984). It is also possible to prepare a chimeric antibody hybrid antibody having the desired binding specificity. Antibodies can also be modified, such as by preparing chimeric or hybrid antibodies, by applying chemical protein synthesis techniques including the use of the following condensing agents.
  • Humanized antibodies can be performed by techniques known in the art (eg, ⁇ Jones et al., Nature, 321: pp. 522-525 (1986); Eiechmann et al., Nature, 332: pp. 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: pp. 1534-1536 (1988)).
  • Human monoclonal antibodies can also be produced by techniques known in the art.
  • Human myeloma cells for producing human monoclonal antibodies—human / mouse heteromyeloma cells are known in the art (Kozbor, J. Immunol., 133, pp. 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technologies and Applications, pp.
  • Antibody fragment such as Fab, Fab ', F (ab') 2 obtained by treating with, pepsin or the like, and reducing with i ⁇ .
  • the activity of the present invention for example, (a) a PEX protein of MT1-MMP (MT1PEX), a part of the peptide or a salt thereof, or a mutant, analog or derivative thereof; (C) the antibody of the present invention, a " ⁇ fragment thereof (including a monoclonal antibody) or a trigger thereof, and (d) simple dimerization of MT1-MMP, such as a nucleic acid such as DNA encoding a PEX region.
  • a compound that inhibits and / or inhibits biological activity or a salt thereof) as a medicine ⁇ , for example, 3 ⁇ 4T1PEX or a salt thereof is usually used alone or in admixture with a Fujisato-acceptable adjuvant.
  • ⁇ for example, 3 ⁇ 4T1PEX or a salt thereof is usually used alone or in admixture with a Fujisato-acceptable adjuvant.
  • it is administered in the form of an IJ preparation suitable for oral administration, topical administration, parenteral administration and the like.
  • the activity of the present invention can be used in combination with a ⁇ 3 ⁇ 4® inhibitor and / or a transfer inhibitor.
  • parenteral administration forms include topical, strict, intravenous and intramuscular. Forces that can include internal, subcutaneous, intradermal, or intraperitoneal administration can be applied directly to the affected area, and in some cases are controversial. Or parenterally (eg, intracellular, tissue, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, Intrathecal, intrathecal, intravenous, 3 ⁇ 4M,, ear, eye and nose, teeth, ⁇ and mucous membranes).
  • sword-like swords include solution mu ⁇ ⁇ , semi-solid 3 ⁇ 4, mtitm m leaching m 3 ⁇ 4, etc., for example, tablets, flame retardants, sugar-coated agents, M troches, hard capsules Agent, soft capsule, microcapsule, agent, powdery mixture, mu, mmi m ⁇ , size, M elixir, emulsion, syrup, solution, fu ij, suspension, liniment, lotion Preparations, aerosols, sprays, 3 ⁇ 4 ⁇ preparations, ⁇ smu ointment textiles Im patches, pasta preparations, cataplasms, creams, oils, ⁇ IJ (eg, garden suppositories), tinctures, liquid preparations, Ophthalmic preparations, nasal drops, ear drops, transdermal ij, powders for injections, frozen gel preparations, etc.
  • extinguished products can be used according to the usual method. It can be converted into IJ. For example, if necessary, it can be used with a physiologically acceptable carrier or drug.
  • Adhesives Adhesives, adhesives, elasticizers, plasticizers, disintegrants, propellants, preservatives, antioxidants, humectants, emollients, antistatic agents, soothing agents, etc.
  • Adhesives Adhesives, adhesives, elasticizers, plasticizers, disintegrants, propellants, preservatives, antioxidants, humectants, emollients, antistatic agents, soothing agents, etc.
  • suitable parenteral shelves include sterile solutions or suspensions of active and water or other pharmaceutically acceptable vehicles, such as, for example, microscopic agents.
  • water e.g., water,: ⁇ ⁇ , dextrose aqueous solution, other related sugar solutions, and glycols such as ethanol, propylene glycol, and polyethylene glycol are preferred as liquid baskets for injections.
  • solutions, suspensions, emma It is prepared into an injectable form such as a lujon.
  • Aqueous liquids for injection include, for example, menstrual baths, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Acceptable suitable dissolution aids such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants IJ (eg, Polysorbate 80 TM, HCO -50).
  • suitable dissolution aids such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants IJ (eg, Polysorbate 80 TM, HCO -50).
  • examples of the oily liquid include sesame oil and oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a dissolution aid.
  • buffer U eg, phosphorus buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a reagent for adjusting osmotic pressure soothing agent (eg, benzalkonium chloride, proforcein hydrochloride, etc.)
  • soothing agent eg, benzalkonium chloride, proforcein hydrochloride, etc.
  • serum albumin polyethylene glycol, etc.
  • protective ij for example, benzylalconole, phenol, etc.
  • antioxidant it ⁇ J such as ascorbic acid, absorption promoter and the like.
  • the adjusted injection solution is usually filled into a suitable ampoule.
  • solutions in sterile pharmaceutically acceptable liquids such as water, ethanol or oil, with or without surfactants and other pharmaceutically acceptable auxiliaries are converted into a suspension form.
  • oilsy vegetative or 'mixed U' used in the fiber IJ examples include natural or synthetic or semi-synthetic mono- or di- or triglycerides, natural, semi-synthetic or synthetic oils and fats, and, for example, peanuts. Vegetable oils such as oil, corn oil, soybean oil and sesame oil.
  • the sizing agent can be prepared so as to contain 0.1 to 10% by weight of the compound of the present invention.
  • Suitable for topical, e.g., oral, or escalating use include, for example, mouth washes, dentifrices, oral preparations, ointments, ointments, potato fillers, dental coatings ij, dental pastes Agents, ⁇ 3 ⁇ 4 and the like. Mouthwashes and other rice cake preparations are prepared by a conventional method using a pharmacologically acceptable carrier.
  • the compound of the present invention may be used together with the compound of the present invention itself or an inert carrier which is Fujisato acceptable. It can be dissolved in a solution for squeezing or nebulizing, or it can be administered as fine powder for ⁇ to teeth.
  • An ointment is prepared by a conventional method by adding a base which is usually subjected to ffl, for example, an ointment base (white serine, paraffin, olive oil, macrogol 400, macrogol ointment, etc.).
  • Topical dentition agents can be formulated into suitably sterilized water or non-water swelling solutions or suspensions.
  • Additives include preservatives and antiproliferative agents, including antibacterial and antifungal agents, for example, mild 1J such as sodium bisulfite or sodium sodium edetate; mercury acetate or phenyl nitrate, benzalkonium chloride or black hexidine. Thickeners such as melrose are mentioned.
  • a carrier well known in the art preferably a suitable non-irritating excipient, such as polyethylene glycols, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglycerides, etc., preferably liquid in a force field tube which is solid at room temperature.
  • a suitable non-irritating excipient such as polyethylene glycols, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglycerides, etc.
  • It is prepared by a conventional method using a substance that releases a drug in the rectum, but is usually prepared to contain 0.1 to 95% by weight of the present compound.
  • the drug can be suspended or dissolved in the K agent.
  • Adjuvants such as local anaesthetics, preservatives and buffering agents can be dissolved in the shellfish.
  • Suitable for oral use include solid compositions such as tablets, capsules, powders, granules and lozenges, and liquid pirates such as solutions, syrups and suspensions. ⁇ .
  • a weaving aid known in the field is used.
  • Keys 1] and j can also be manufactured by enteric coating.
  • a liquid like oily luster ⁇ ! Can contain a dog carrier.
  • the nucleic acid such as the DNA of the present invention is used as a therapy and Z or prophylaxis as described above, and the nucleic acid can be used as an insect, or as described above.
  • nucleic acid such as the DNA of the present invention can be administered by a commonly known method, and Alternatively, it can be used in the form of a humidified IJ together with a suitable auxiliary agent or a physiologically acceptable carrier so as to promote intracellular biotransfer. It can be administered as a product or an adjunct preparation. Also, a method known as gene therapy can be applied.
  • the activity of the present invention is based on the ability to select and administer the dose over a wide range.
  • the administration and the number of administrations depend on the treatment patient's age, age, target status, diet, administration time, administration method, excretion.
  • the speed, combination of drugs, tang, and treatment of the individual at the time may be determined according to the condition of the disease, taking into account these and other factors.
  • its additives and preparation methods are described in, for example, the Japanese Pharmacopoeia's Commentary on the Senate, edited by the thirteenth revised edition of the Japanese View, published on July 10, 1996, by Hirokawa Corporation. Bookstore; Takashi Ichigase et al. Development of Pharmaceuticals, Vol.
  • the activity of the present invention is not particularly limited as long as it has an action of suppressing and / or inhibiting a biological activity such as MT1-MMP simple dimer formation.
  • the activity of the present invention includes, for example, (a) a PEX protein of MT1-MMP, a peptide thereof or a salt thereof, a mutant, an analog thereof, an induced ⁇ , (b) a PEX of the MT1-MMP. (C) an antibody of the present invention, a partial fragment thereof (including a monoclonal antibody) or its name, (d) a simple dimer formation effect of MT1-MMP, etc. Compounds that inhibit and / or inhibit biological activity or salts thereof are included.
  • the activity of the present invention can be achieved by the processing of the complex formed by the complex consisting of MT1-MMP. It is expected to be useful for suppressing or inhibiting the process of conversion into. Also, the activity is caused by excessive activation of PRO II! ⁇ And / or Useful for dysfunction or recovery of losing function, processing of pro-MMP-2 caused by the formation of a complex consisting of MT1-MMP, such as activation of pro-MMP-2 by at least simple dimerization of MT1-MMP Is useful for the prevention or treatment of disorders, abnormalities and Z or direct related diseases. It is also useful for suppressing or inhibiting pro-MMP-2 processing by MT1-MMP.
  • the activity of the present invention including the MT1 PEX protein and an antibody against PEX, is useful for controlling, for example, suppressing the migration, invasion, and Z or metastasis of cells expressing the MT1-MMP gene 5 ?.
  • abnormalities and Z or diseases caused by cell migration, invasion and Z or metastasis 3 ⁇ 41 associated with activation of open MMP-2 by simple dimerization of the MT1-MMP are useful.
  • it is useful for inhibiting the movement, invasion, and Z or metastasis of esophagus, such as cancer, and can be expected as an agent and an inhibitor of Z or cancer metastasis.
  • the present invention further relates to a »field-acceptable pack and kit comprising one or a container or a container filled with the aforementioned composition of the present invention.
  • Such containers may be provided with a form of injection fibre, as specified by a competent authority that regulates the manufacture, shelving or sale of pharmaceuticals or biological products, A note indicating the institution's approval for the manufacture, use, or! ⁇ Of the product for administration may be attached.
  • the present invention it is possible to select, from among the amino-stretching groups constituting the PEX region of T1-MMP, a group consisting of at least two consecutive amino groups, and (Ii) the ability to replace at least one of the constituent amino swells with a D-amino swell, or (iii) the ability to modify the side chain of the amino sulphate, (iv) the sequence Amino acid different from S
  • the technologies adopted in the field such as arranging and connecting wisteria or (v) designing a mimic body by sharpening Ritsuzo (for example, Hiroshi Shuto) -Ed., Pharmaceutical Development Volume 7, Design), published June 25, 1990, Hirokawa Shoten Co., Ltd., and references and articles cited therein. Some of these technologies include those described above.
  • terms are based on the power of the IUPAC- IUB Commission on Biochemical No menclature or on the meanings of terms that are commonly used
  • BB-94 [4- (N-hydroxyamino) -2R-isobuty 1-3S- (thiophen-2-ylthiometyl) -succinyl] -L-phenylalanine-N-methylamide or batimastat TIMP-2: tissue inhibitor of metal loproteinases- Two
  • IPTG isopropyl-1 -thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • G glycine residue (Gly)
  • S serine residue (Ser)
  • the reagents are as follows: Dulbecco's modified Eagle's medium (DEME) is manufactured by Nissui Fiber Co., Ltd. (Tsubishi, Japan). FuGENE 6 TM is from Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland. Mouse
  • DSG is a product of Pierce Chemical Co. (IL, USA).
  • DQ TM gelatin is from Molecular Probes, Inc. (OR, USA).
  • Matrigel Matrix is from Becton Dickinson Labware (MA, USA).
  • Peptidyl hydroxamate MMP Inhibitor BB-94 was provided by Dr. Peter D. Brown of British Biotech Pharmaceuticals Ltd. (Oxford, UK). So-called column 1.
  • a chimeric mutant of the thin ⁇ region of MTl-F, MTlCat-F, MTIPEX-F or MT4PEX-F and the transmembrane region (TM) / intracytoplasmic region (CP) of NGFR was also prepared by PCR. And subcloned into pSG5.
  • MT1-MMP sequences from is Asp 5 1 5 from Met 1
  • sequences from NGFR is Gly 7 9 ° from Glu 3 8 4.
  • Other chimeric variants have corresponding sequences. All PCR ⁇ fragments were confirmed by D-sequencing.
  • MTIEA ATM, MTl-PEX and ⁇ 4- ⁇ expressed in E. coli were purified and folded as follows. ,
  • the Met plus Glu240 were point mutated to Ala MT1- MMP Tyr 1 1 2 from Gly 5 3 5 or in the (MtlEAATM), from Cys 3 1 9 of Met plus MT1- MMP up Gly 5 3 5 (MT1PEX) Oyo fine Met plus mice MT4 - cDNA Furagume cement to co one de from Cys 3 3 6 until Gly 5 5 ° of MMP was prepared by PCR, it was subcloned-learning the pET3a expression vector.
  • BL21 (DE3) pLysS was transformed with these pEt3a constructs and protein expression was also induced with 0.4 mM IPTG.
  • the expressed protein product was purified and folded according to the method of Huang et al. (Huang, W. et al., FEBS Lett, 384, 155-161 (1996)). did
  • Recombinant human pro-MMP-2 and TIMP-2 were expressed in HighFiveMil cells (In vitrogen, CA, USA) each infected with a recombinant baculovirus for expressing human pro-MMP-2 and TIMP-2.
  • Recombinant virus was prepared using the BAC-TO-BAC TM Baculovirus Expression System (Life Technologies, M, USA).
  • MT1PEX and MT4PEX were obtained after gel filtration column chromatography using Superdex 200 or Superdex 75 purified with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.02% NaN 3.
  • AKTA explorer 10S system (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.).
  • the membrane was further exposed to Alfa rifosphatase labeled goat anti-mouse IgG antibody.
  • the anti-phosphotyrosine monoclonal antibody PY20 (1 ⁇ / ml) was used.
  • SDS-polyacrylamide gel (PAGE) containing gelatin (O.ang / ml) was evaluated (Itoh, Y. et al., J. Biol. Chem., 273, 24360-24367). (1998)).
  • the SDS-PAGE containing buffer was not added to Sampnolet, and the electric thigh was applied at room temperature. Wisteria activity was visualized as a staining site with Kumashi Brilliant Care R-250.
  • C0S1, HT1080 and CHO-K1 cells were seeded in DMEM or Ham F-12 medium supplemented with 10% calf Ml in a humid incubator at 37 ° C. Sixteen hours before transduction, the cells were placed in a 6-well plate at 1.5 ⁇ 10 V / well.
  • the expression vectors of each protein were introduced according to the method of FuGENE6 TM (Roche Molecular Biochemicals). After 48 hours, cells were collected and used for experiments.
  • MTlCat ⁇ -deficient MT1-MMP
  • MT1PEX active domain-deficient MT1-MMP
  • MT1-T4PEX MT1-F / NGFR
  • MT1PEX-F / NGFR MT1PEX-F / NGFR
  • MTlCat-F / NGFR MTlCat-F / NGFR
  • MTl-CMP (Ile 3 18 -Gly 5 3 5 ) and ⁇ TlPEX (Tyr 1 1 2 -Pro) by the PCR extension method (Ho et al., Gene, 77, 51-59 (1989)) It was used as type III for the DNA fragment of 312).
  • the MT1- ⁇ ( ⁇ -F) expression vector mediated by the FLAG epitope was described by Itoh et al., Biochem.
  • FLAG-raMTlCat (MTlCat-F: ⁇ MTlPEX (MT1PEX-F)) was used as a type II cDNA.
  • MT1PEX-F was subcloned into pCEP4 (Invitrogen, Groningen, Netherlands) having an expression cassette of EBNA-1 and hygromycinif3 ⁇ 43 ⁇ 4i5 ?.
  • C0S1 and ⁇ 1080 cells were incubated in a 37 ° C incubator humidified with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Sigma Chemical Co., Ltd., MO, USA) containing 10% Pseudo-D blue and kanamycin. It was one. Cells were seeded in 6-well plates at 1X10V wells 16 hours before transfection. Each protein expression plasmid was guided according to the instructions for use of FuGENE6 TM (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the stake-MT-MMP-active domain antibody (Anti-Cat) expressed and purified the ⁇ -MMP active domain in Escherichia coli. Since this antibody did not recognize other MT-MMPs consisting of MT2-, MT3-, MT4-, MT5-, and ⁇ 6- ⁇ ⁇ , it was reminded that it specifically recognized MT1-MMP.
  • the mouse stake-human ⁇ - ⁇ ⁇ domain monoclonal antibody (anti_PEX, 222-1D8) was used to mobilize human MT1-MMP PEX domain expressed in purified ⁇ coli in mice. This antibody is specific for MTl-MMP That power ⁇ ti
  • the introduced C0S1 cells are incubated at room temperature for 1 hour in RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1% Triton-XlOO; 1% sodium deoxycolate; 0.1% SDS; 1 mM EDTA ; 1 mM PMSF; ⁇ ⁇ ⁇ E-64; 0.02% NaN3).
  • RIPA buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1% Triton-XlOO; 1% sodium deoxycolate; 0.1% SDS; 1 mM EDTA ; 1 mM PMSF; ⁇ ⁇ ⁇ E-64; 0.02% NaN3
  • the cell lysate was centrifuged (15,000 ipm) in an Eppendorf tube, and the supernatant was reacted with anti-FLAG M2 antibody-conjugated beads (Sigma) at 4 ° C for 1 hour.
  • Bound protein was eluted with FLAG peptide (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (200 / g / ml) (Sigma) dissolved in TBS, and mouse anti-FLAG M2 monoclonal antibody (Sigma), mouse anti-cMyc monoclonal antibody (Ab-1) (Oncogene, MA, USA; l / g / ml), egret anti-human MT ICat antibody (1: 2000) or mouse pile -Western plot with human MT1PEX monoclonal antibody (222-1D8) (0.5 ⁇ g / ⁇ ).
  • MTl-MMP, MTlCat, MT1-MT4 PEX and MT1-F / NGFR are anti-CAT polyclonal antibodies (1: 2,000) .
  • MTl-MMP, MT1PE X and MT1-F / NGFR are anti-CAT polyclonal antibodies.
  • PEX antibody (222-1D8, 0.5 zg / ml) was used for detection.
  • FLAG-mouth MT1-MMP and its mutants were detected with anti-FLAG antibody M2 (3 // g / ml).
  • Chimeric proteins with phosphotyrosine residues were detected with the mouse stake-phosphotyrosine monoclonal antibody PY20 (ICN Biochemicals, Inc., OH, USA; 1 zg / ml).
  • the fiber & sex compounds were visualized with goat anti-mouse IgG or anti-magpie IgG (Sigma) labeled with Alfa lipophosphatase.
  • the transfected C0S1 cells were washed three times with cold PBS containing 1 mM MgCl 2 and 0.1 mM CaCl 2 .
  • Cells were dissolved in sulfo-NHS-biotin (Pierce) dissolved in the same buffer (2 m g / ml) at 4 ° C for 30 minutes.
  • the reaction was stopped by further incubating with 25 mM lysine dissolved in PBS.
  • the cells were lysed with MPA buffer, and the biotinylated protein was precipitated together with streptavidin-Sepharose beads (Amersham-Pharmacia).
  • the samples were analyzed by ⁇ stan blotting using anti-MTlCat or anti-PEX antibody.
  • DQ gelatin is a fluorescent quenching gelatin substrate that produces fluorescence upon proteolytic cleavage.
  • Coverslips were coated with 53 ⁇ 4DQ TM gelatin in 10 mg / ml sampled gelatin and dried.
  • the cells transfected with the cells were cultured on a glass for 16 hours in a humidified chamber.
  • the o-cells were fixed with 3% para-formaldehyde, and the degradation region was visualized by fluorescence generated from the region.
  • Alexa488-labeled gelatin made with the Alexa488-labeling kit (Molecular Probes).
  • the bottom of a 4-well chamber-one slide (Nunc) was coated with Alexa488-labeled gelatin according to the method of Yana, I. and Weiss, S.J., Mol. Biol. Cell, 11, 2387-2401 (2000).
  • the C0S1 cells introduced into the humidified culture incubator were cultured on one slide of this chamber for 16 hours. Cells were fixed with 3% para-formaldehyde in PBS, and the degradation area was analyzed under a fluorescent microscope. Decomposed areas were visualized as dark areas of light. Fluorescence images were analyzed using a confocal microscope (BioRad).
  • BB94 peptidyl hydroxamate MMP laWJ: BB94, and the activity is controlled by Ishizuru.
  • BB94 was a kind gift of Dr. Peter D. Brown of British Biotech Phar maceu Hatscals Ltd. (Oxford, UK).
  • the transfected C0S1 cells or ⁇ 080 cells were replated on gelatin-coated birch glass and cultured for 24 hours.
  • Cells were grown in PB containing 75 mM lysine Fixed with 3% paraformaldehyde in S. After blocking for 1 hour at room temperature using 5% goat serum and 3% bovine serum albumin in TBS, cells were cultured with anti-FLAG antibody Ml (5 / ig / ml), PY20 (2 g / ml) or -Reacted with Cat Peach (1: 1,000) at room temperature for 2 hours.
  • To detect the signal for phosphotyrosine cells were treated with 0.1% Triton-XlOO in TBS after fixation.
  • the introduced C0S1 cells were cultured in 24-well plates (0.2 ⁇ 10 / well). 48 hours after transfection, cells were washed three times with serum-free DMEM and incubated with purified proMMP-2 (2 / g / ml) in serum-free DMEM for 1 hour at 25 ° C. The cells were then washed three times with serum-free DMEM containing 5% dimethylsulfoxide (MS0) to remove the corresponding proMMP-2 and lysed with 501 non-reducing SDS-loading buffers. MMP-2 adsorbed on the cells was analyzed by gelatin zymography.
  • MS0 dimethylsulfoxide
  • the Matrigel infiltration chamber was coated according to the instructions for use with a 24-hole cultivated membrane (Falcon), coated with 10 ⁇ g of Matrige KBecton Dickinson Labware, MA, USA). Produced. 0.5 ml of HT1080 fine suspension (xlOVml) into which the fei had been introduced was seeded in the upper chamber and incubated with a humidified chamber at 37 ° C. Hepatocyte growth factor (Toyobo; 10 ng / ml) was added as a chemical to the lower chamber. Fourteen hours later, cells remaining on the upper surface of the membrane were removed, and cells on the lower surface were fixed with 3% para-formaldehyde in PBS. Green fluorescent scent protein (GFP) -positive cells infiltrating the lower surface were counted using a fluorescence microscope (X40).
  • FFP Green fluorescent scent protein
  • CD corner area
  • PEX hemopoxin-like region
  • FLAG Epitope (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 3 ⁇ 4HMTl-MMP (MTl-F) is an ISlf construct, which is described in Itoh, Y. et al., J. Biol Chem., 274, 34260-34 266 (1999), i0g was used as a template, and the PCR extension method of Ho et al. (Ho, SN et al., Gene, 77, 51-59 ( 1989)) by acquires MTlCat-F ( ⁇ 116 3 1 8 -01 5 3 5) 0 Flip of was subcloned into pSG5 (Stratagene, CA, USA) .
  • C0S1 cells were transduced with MT1-MMP mutant; MT1-F, MT1-Cat-F expression vector or vector alone (Mock).
  • a protein expression vector was introduced according to the method of FuGENE6 TM (Roche Molecular Biochemicals3 ⁇ 4t3 ⁇ 4).
  • C0S1 cells awakened at 1.5 ⁇ 10 5 / well in a 6-well plate 16 hours before transduction.
  • the C0S1 cells were ligated in DMEM or Nome F-12 medium supplemented with 10% bovine serum at 37 ° C. in a wet incubator overnight. 48 hours after transduction, cells were collected and subjected to the experiment.
  • the upper panel in Fig. 2 shows a Western blot analysis of cell lysates obtained from transduced cells using the titFLAG M2 monoclonal antibody, and the lower panel in Fig. 2 shows the gelatin size in the culture medium. 3 shows a morphographic analysis.
  • MTlCat-F is expressed on the cell surface and has the same gelatinolytic activity as T1-F (FIG. 13, TS flII).
  • the purity of the purified protein is more than 98% as shown in FIG.
  • the active site is mutated to prevent autolysis.This mutation does not cause global structural changes as seen in other MMPs (Atkinson, SJ et al., J. Biol. Chem. , 270, 30479-30485 (1995)).
  • three kinds of ⁇ 1 ⁇ ⁇ were subjected to Superdex 200 gel filtration ram.
  • the inset in FIG. 4 shows the SDS-PAGE analysis of ⁇ under reducing and non-reducing conditions. Bands were visualized with Coomassie Blue R-250.
  • MT1EA ⁇ shows different mobilities under reduction and non-reduction of SDS-PAGE, suggesting that the SS bond is formed correctly. In addition, it was confirmed that it had the ability to form a complex with TIMP-2. It was strongly suggested that they were rare. In addition, in the gel permeation column, MT 1EA ⁇ ⁇ ⁇ is eluted as a larger amount (600 kDa JiLh and 100 kDa) instead of the expected molecular mass of 53 kDa. It was noticed.
  • the purified I coli-derived ⁇ 1 ⁇ ⁇ was treated with 0.2 mM DSG at 0 ° C in 50 mM HEPES containing 150 mM NaCl, 10 mM CaCl 2, and 0.02% NaN 3 .
  • the KJS was stopped by adding Tris-HC1 buffer (pH 7.5) to the final ⁇ ⁇ .
  • Angular ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ was trypsinized in order to know whether a certain area or a misaligned area of ⁇ was involved in the formation of the complex. Trypsin cleaves the center of the hinge region of MT1EA ⁇ containing several Arg and Lys, so that the corner butterfly region and PEX can be separated.o The sample is analyzed by gel permeation column chromatography with Superdex 75. did. That is, MT1EA ⁇ (50 ⁇ g / ml) was treated with trypsin (0.2 // g / ml) at 37 ° C at IB temperature to cut off the PEX and the Kaku! 3 ⁇ 4 page area.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS was replaced with Ml in the pEt3a construct, and protein expression was induced with 0.4 mM IPTG.
  • the expressed protein product was purified and folded according to the method of Huang et al. (Huang, W. et al., FEBS Lett, 384, 155-161 (1996)).
  • the apparent amount of PEX of MT4-MMP (MT4_PEX) in SDS-PGE under reduction and non-reduction conditions is that of MT1-PEX (MT1-PEX). It was almost the same as Fig. 6). However, in gel permeation column chromatography, PEX of MT4-MMP eluted around 24 kDa, whereas PEX of MT1-MMP eluted near 40 kDa. This suggests that the PEX of MT1-MMP specifically forms a dimeric complex. These results indicate that, at least in solution, the outer region of MT1-MMP forms a homophilic complex via PEX.
  • the MT1-MMP external region forms an isotropic complex via its PEX.
  • NGFR trk proto-oncogene
  • NGFE forms a dimer by binding to a ligand, and as a result, its tyrosine kinase transphosphorylates tyrosine residues in the cytoplasmic region (Jing, S. et al., Neuron, 9, 1067-1079 (1992); Lemmon, MA et al., Trends Biochem. Sci., 19, 459-463 (1994)).
  • the fusion protein between (a) the cytoplasmic domain of NGFR and (b) the BCR of the UK protein BCR-ABL that forms a tetramer showed structural phosphorylation of tyrosine residues ( Mam, Y, et al., Oncogene, 16, 2585-2595 (1998)).
  • a kinura protein consisting of the outer region of MT1-MMP, the transmembrane region (TM) of NGFR, and the cytoplasmic region (CP) to test direct complex formation. (Figure 8). If the outer region of this chimeric protein forms a homophilic complex in a similar manner, tyrosine dysfunction in the cytoplasmic region should be phosphorylated.
  • the protein expression vector was introduced into C0S1 cells according to the method of using FuGENE6 TM (Roche Molecular Biochemicals ⁇ ). Sixteen hours before transduction, C0S1 cells were leaked into 6-well plates at 1.5 ⁇ 10 5 / well. C0S1 cells should be incubated at 37 ° C — During the evening, effif was performed in 10% fetal bovine serum vomerose DMEM or Ham F-12 medium. Forty-eight hours, we gathered it!
  • these proteins expressed by transfection of these constructs were recognized by the anti-FLAG M2 antibody ( ⁇ panel, Anti-FLAG).
  • MT-F / NGFR tyrosine bacteria are phosphorylated (bottom panel, Anti-PY, lane 1), and MT1-MMP expressed in animal cells also forms at least a dimer as analyzed by (PY) The power to do was suggested.
  • MT1PEX F / NGFR is also phosphorylated (lane 2).
  • MT1-F was introduced into C0S1 cells along with MT1PEX-F.
  • the transfected cells were reacted with exogenously added pro-MMP-2.
  • C0S1 cells were co-gene-directed with MT1-F and MT1PEX-F at a DNA content ratio, and then purified pro-MMP-2 (0.25 // g / ml) in a bloodless and static environment was obtained.
  • the cultured cells were reacted at 37 ° C for 18 hours, and the MMP-2 in the culture was analyzed by gelatin zymography, and cell lysates were subjected to Western blot using an anti-FLAG M2 monoclonal antibody.
  • the cells were transiently transfected with a vector expressing MT1PEX-F together with a vector expressing green fluorescent protein (GFP), and the infiltrating cells of GFP-positive cells were counted using a fluorescence microscope.
  • GFP green fluorescent protein
  • HT1080 cells were co-induced with MT1PEX-F and GFP or GFP-infested expression vectors. Cells were matrigel-infiltrated as follows. Difficult due to the 3 ⁇ 4T3 ⁇ 4Boiden-chamber method.
  • the Matrigel's infiltration chamber was coated with 10 g of Matrigel per chamber according to the instructions of the kit's original product (Becton Dickinson) and set on a force insert membrane (FALCON) with a pore size of 8 rn.
  • Leakage of HT1080 cells suspension 0. 5 ml of 1 x l0 5 / ml in the chamber one upper, 37 ° C, and 14 hours Inkyubeto in wet chambers within one.
  • HGF (5 ng / ml) was added to the bottom of the chamber as a chemical inducer.
  • Activation of pro-2 by MT1-MMP on the cell surface requires the formation of a ternary complex of pro-2, ⁇ -2 and ⁇ ⁇ ⁇ 1- Requires the presence of ⁇ -2 free MTl- ⁇ in the vicinity. If ⁇ -free MTl- ⁇ and ternary complex are present, activation does not occur.
  • the MT1-MMP might form a homophilic complex on the cell surface in order to efficiently activate the complex of MMP-2.
  • FLAG-labeled MT1-MMP MT1-F
  • MT1-Myc c-Myc-labeled MT1-MMP
  • MT1-MT4PEX can form a ternary complex of MT1-MT4PEX / TIMP-2 / proMMP-2 on the cell surface as profflP-2 bound to MT1-MT4PEX-expressing cells (Fig. 21, lanes 2 and 3). ).
  • DQ TM gelatin substrate DQ TM -gelatin is fluorescence-quenched gelatin and shows fluorescence due to protein degradation. As shown in FIG.
  • the cells expressing ⁇ -secret and MT1-MT4PEX exhibited proteolytic activity. ⁇ , control (Mock) was not shown. This activity was also completely inhibited by BB94. Like MT1-MT4PEX, it has a proteolytic activity and MTlCat / TIMP-2 / pro-hidden-2 complex system performance on the cell surface. Mouth MT1-MMP (MTlCat) power 3 ⁇ 4roMMP-2 was not activated. Taken together, these data indicate that dimerization of MT1-MMP via the PEX domain on the cell surface is required to activate porMMP-2.
  • a fusion protein of the NGFR cytoplasmic region and the BCR-ABL fusion protein, which forms a tetramer, showed structural phosphorylation of tyrosine residues.
  • a kinura protein consisting of the outer region of MT1-MMP and the transmembrane and intracytoplasmic regions of NGFR was constructed (FIG. 8, MT1-F / NGFR).
  • MT1PEX-F As shown in Figure 29, binding to the cell surface, pro-secret-2, also did not give any view to MT1PEX-F expression. MT1PEX-F co-expression did not reduce the amount of proMMP-2 bound on the cell surface and no active form was detected. MT1PEX-F also did not affect the proteolytic activity of MT1-MMP on the cell surface, as shown in FIG. 30, and showed a similar gelatin pattern and region. Therefore, it inhibits the dimerization of MT1PEX-F or ⁇ 1- ⁇ , indicating that it acts in a dominant negative manner of MT1-MMP in proMMP-2 activation on the cell surface.
  • HT1080 cells are intrinsic 4MT1-MMP and! Strongly known to express MP-2 .
  • MT1PEX-F expression was examined.
  • Cells were transduced with MT1PEX-F plasmid or an empty vector that produces hygromycin tolerance.
  • MMP-2 in the culture broth from the hygromycin resistant cells was analyzed by zymography.
  • control cells are BB94-sensitive; ⁇ 3 ⁇ 4 activates endogenous 'SMMP-2' in the lower panel, lanes 1 and 2) offc3 ⁇ 4 ", MT1PEX-F expressing cells express proMMP-2.
  • MT1-secreted (MTlCat-F) without PEX can no longer activate pro-MMP-2.
  • MTlCat-F-expressing cells showed gelatinase activity and TIMP-2 binding ability on their cell surface, the drawback that MTlCat-F could not activate pro- It is clear that TIMP-2 is not due to loss. Activation appears to be due to random distribution of MTlCat-F at the cell surface. Force, and thus, dimerization of MT1-MMP through PEX at the cell surface, allows for closer molecular alignment between, 2 ⁇ and one of the MTs in the dimer composite.
  • TIMP-2 binds to TIMP-2 to serve as a professional MMP-2 receptor and another MT 1-MP appears to cleave the propeptide of prodragon P-2 bound to the receptor, while ⁇ ⁇ -F binds the MT1-MMP / TIMP-2 complex with a constant It creates a distance, and Pih reacts with the professional MMP-2 for liveness.
  • HT1080 cells using MT1-MMP have been reported to have a corner butterfly loss form (Stanton, H. et al., J. Cell Sci., 111, 2789-2798 (1998); Lehti, K. et al., Biochem. J., 334, 345-353 (1998)) found that this was activated by ⁇ -MMP itself or activated by ⁇ -MMP. It is attributed to the specific cleavage of Ala 2 5 5 -Lie in Suendan, Japan.
  • This M-member retains PEX and may have the same effect as MT1PEX-F.
  • this treatment may not only eliminate MT1-MMP activity, but also inhibit adjacent MT1-MMP activity.
  • PEX plays an important role in the formation of MT1-MMP dimer, and further, facilitates the effective activation of pro-MMP-2 on the cell surface.
  • PEX is a unique region of Matrixin that has been implicated in its reactivity with molecules that determine the fate of enzymes in biological systems. Considered a device.
  • MT1PEX-F can be used to test the role of 2-2 activation or the dimerization of MT1- ⁇ in certain biological systems.
  • HT1080 cells that produce MT1- ⁇ and ⁇ -2 (Strongin, AY et al., J. Biol.
  • the mechanism of activation of pro-MMP-2 by MT1-MMP present on the cell surface has been elucidated, thereby enabling the research and development of substances having an activity that affects the activation of pro-MMP-2.
  • the activation of pro-MMP-2 by MT1-MMP present on the cell surface can cause various physiological and biological phenomena in the living body, such as injuries, abnormalities such as invasion and metastasis of cancer cells, Suspected involvement of Z or ⁇ provides a way to prevent and / or treat these.
  • the present invention can also be implemented with J described specifically in the above description and the packaging examples. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and so are within the scope of the appended claims. ⁇

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Description

MT1-MMPの活性調節
技術分野
本発明は、膜型マトリックスメタ口プロテアーゼ- 1 (membrane-type 1 matrix metalloproteinase: MT1- MMP)のネ纖カヽらなる複合体形成を阻害する物質、特に は細胞表面に ¾する MT1- MMPの単純二量体形成を阻害する物質に関する。
本発明は、該 MT1- MMPの単純二量体形成を阻害し、 よってプロ MMP - 2の活性化 を阻害して、該プロ難 - 2の活性化に起因する様々な生理的、生物的過程を制御 する方法並びにそのための薬物に関する。 本発明は、 さらに MT1- MMP 'のへモぺキ シン様ドメイン (PEX) を介した ΜΠ -匪 P活性調節機構に基づく癌の浸潤'転移の 阻害に関する医薬や治療法を提供する。 より具体的には、本発明は、 MT1-MMPの 単純二量体形成に関連した、 MT1-MMP複合体形成阻 プロ MMP-2の活性化阻. 細胞の移動、浸潤及び/又は転移 iaih¾、 さらには MT1 - MMPの単純二量体 形成阻^^法及びそれに関連した方法、 MT1-PEXなどの細胞表面に存在する MT1 - MMPの単純二量体形成を阻害する活性を有する物質、 それをコードする核酸、該 核酸の用途に関する。 また、本発明は、 MT1-MMPの PEXタンパク質又はその断片 あるいはそれらと実質的に同等の活 f生を有するポリぺプチドに対する抗体及びそ の用途に関する。本発明は、 MT1 - MMPの単純二量体形成阻害物質のスクリ一ニン グ方法及びそのための試薬に関する。 有
マトリックスメタ口プロテア一ゼ H ^matrix metalloproteinases： MMPs)は、 細麟マ卜リックス （extracellular matrix: ECM)と基劇 のさまざまな構 成夕ンパク質を分解する»依存性のェンドぺプチダーゼのファミリ一である。 これらの隱群は、正常な胚の発生、骨の成長あるいは創傷の治癒など、結合組 織の再構成に関連している (Woessner, J. F. , FASEB J. , 5, 2145-2154 (1991)； ： Matrisian, L. M. , BioEssays, 14, 455-463 (1992)； Birkedaト Hansen, H. , Mo ore W. G. I.， Bodden, M. K. , Windsor, L. J. , Birkedaト Hansen, B. , DeCarlo, A .， and Engler, J. A. , Crit. Rev. Oral Biol. Med. , 4， 197-250 (1993)) 。 ま た、 ァテローム '隱脈硬化症 (Henney, A. M. , Wakeley, P. R. , Davies, Μ· J. , Fo ster, K.， Hembry, R.， Murphy, G. , and Humphries, S. , Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 88， 8154-8158 (1991))、肺^ (Hautamaki, R. D. , Kobayashi, D. K. , Senior, R. M. , and Shapiro, S. D.， Science, 277, 2002-2004 (1997·)) 、 リゥ マチ性関節炎 (Murphy, G. , and Hembry, R. M. , J. Rheumatol. , 19， 61-64 (199 2)) および癌の浸潤'転移 （Stetler- Stevenson, W. G. , Aznavoorian, S. , and Liotta, L. A.， Anna Rev. Cell Biol. , 9， 541-573 (1993)) などさなざまな病 的な過程における関与が知られるようになってきた。 今日までに、 アミノ酸レべノレまで角浙された MMPs (MMP-1 (collagenase)； MMP -2 (gelatinase A)； 匿 - 3 (stromelysin-1)； MMP-7 ^matrilysin;； MMP - 8 (neu trophil collagenase)； MMP-9 gelatinase B)； MMP-10 (stromelysin-2)； MMP - 11 (stromelysin-3)； MMP - 12 (macrophage elastase)； MP - 13 (collagenase- 3) ； MMP- 14 (MT1-MMP)； MMP- 15 (MT2-MMP)； MMP- 16 (MT3-MMP)； MMP- 17 (MT4-MMP) ； MMP- 18 (collagenase - 4) ; MMP-19; MMP- 20 (enamelysin)； MT5- MMP等） 力知ら れている（Woessner, J. F. , FASEB J. , 5, 2145-2154 (1991)； Matrisian, L. M. , BioEssays, 14, 455-463 (1992)； Birkedaト Hansen, H. , Moore W. G. I. , Bodd en, M. K.， Windsor, L. J.， Birkedal-Hansen, B.， DeCarlo, A. , and Engler, J . A.， Crit. Rev. Oral Biol. Med.， 4, 197-250 (1993)； Gururajan, R.， Grene t, J.， Lahti, J. M.， and Kidd, V. J.， Genomics, 52, 101-106 (1998)； Velasc o， G. , Pendas, A. M.， Fueyo, A. , Knauper, V.， Murphy, G.， and Lopez-Otin, C,， J. Biol. Chem. , 274, 4570-4576 (1999))。 1次構造、基質特異性および 細月包分布により、 これらの丽 Psは少なくとも 4種のサブフアミリー：コラゲナー ゼ、 ゼラチナーゼ、 ストロメライシンおよび膜龍 MPs(MT - MMPs) に分類されてい るカ^大きくは可溶 ttMMPsと膜に埋没した MMPs (莫薩 MPs、 MT - MMPs)にサブグル —プ化されること力できる。可溶 ttMMPsは組織の board areasでの ECM破壊にか かわるものと考えられる。ィ &¾"、 MT-MMPs は形質膜につながれているので、細胞 周囲の ECM破壊に関与していると考えられている （Seiki, M. , Apmis, 107, 137 -143 (1999))。 MMPsはプレ / プロペプチド、角 領域、 ヒンジ領域およびへモぺ キシン様領域の保存された領域から構成されている（Nagase, H. et al. , J. Bio 1. Chem. , 274, 21491-21494 (1999))。
MT-MMPsサブフアミリーは、最も新しく MMPsのサブクラスとして報告されたも ので、 MMPsに保存された領域に対するディジヱネレートプライマーと RT-PCRによ つてこれまで 5種のメンバ一 (MT1 - MMP， MT2-題 P， MT3-MMP, MT4- MMP及び UT5 - MM P)力単離同定されている（Sato, H.， Takino, T.， Okada, Y. , Cao, J. , Shinaga wa, A. , Yamamoto, E.， and Seiki, M. , Nature, 370, 61-65 (1994)； Will, H. ， and Hinzmann, B. , Eur. J. Biochem. , 231, 602-608 (1995)； Takino, T. , S ato, H.， Shinagawa, A. , and Seiki, M.， J. Biol. Chem.， 270, 23013 - 23020 (1995)； Puente X. S. , Pendas, A. M. , ' Llano, E.， Velasco G. , and Lopez - Otin ， C , Cancer Res, 56, 944-949 (1996)； 特開 2000-270874号； Pei， D. , J, Bi ol. Chem. , 274, 8925-8932， 1999; Kajita, M. et al. , FEBS Letters: 457, 3 53-356， 1999)。
MT-MMPs は、多くの MMPsに樹敫的なへモぺキシンドメインの に、単一の膜 貫通領域と短い細胞内テールを持つ I型の膜タンパク質である。 さらに、 これら はプロべプチドと活性ドメィンの間に塩基性ァミノ酸の挿入が共通して存在し、 フィゥリン (furin) あるいはフィゥリン様髓による切断で、 これらの膜夕ンパ ク質の活性化がおきる（Pei， D.， and Weiss, S. J. , J. Biol. Chem. , 271, 913 5-9140 (1996)； Sato, H.， Kinoshita, T.， Takino, T.， Nakayama, K.， and Se iki, M.， FEBS Lett. , 393, 101 104 (1996)； Cao, J.， Rehemtulla, A:, Bahou , W. , and Zucker, S. , J. Biol. Chem. , 271, 30174-30180 (1996))。
細胞が組織内を移動 ·浸潤 ·転移する際には、 その周りを取り囲む細 J 基質 (ECM) の分解が必須のステツプである。 そのステップに中心的な役割を担つてレ、 るが MMPと呼ばれる聽群であり、中でも細翻莫表面に発現する ΙΠ- M Pは癌の 移動 ·浸潤 ·転移及び血管新生においてその役割が重要視されている。
MT1-MMP は、 マトリックスメタ口プロテア一ゼ'- 1 (membrane-type 1 matr ix metalloproteinase: MT1- MMP)あるいは置- 14とも呼ばれる鍵 (MEROPS ID:
M10. 014) で、 ヒトにおいてはその染色体遺 fei座 14qll-ql2を占める遺 ^ ( C. Mignon et al. , Genomics, 28: pp. 360-361 (1995))の産物であると報告され ているものであり、 DNA クローニング並びに組換えタンパク質の発現に成功して 、 その存在が石鶴忍されるとともに詳細な構 it¾び特性が明らかにされたものであ る (H. Sato et al. , Nature, 370: pp. 61-65 (1994)； T. Takino et al. , Gene ， 155: pp. 293-298 (1995) ; 特開平 7- 203961号公報； 特開平 7- 303482号公報； Ge nBank™ accession number: D26512)Q MT1-MMP は、 ヒ卜の他、 ィヌ、 ャギ、 ゥ サギ、 イノシシ、 ネズミなどでもその が石鶴忍されている。 ヒト MT1- MMPの cD NAは、 582個のアミノ膨基をコードし (EMBL accession No. D26512, E09720 &
E 10297; SWISS- PROT: P50281) 、 その構造はシグナルペプチドに続くプロぺプ チドドメイン、 ストロメライシン - 3 (stromelysin-3)に類似した特異な 10個のァ ミノ膨雄からなる挿入配列（フィゥリン (furin)-様薩認識部位の可能 f生のあ る配列） 、 «吉合サイ卜の可倉 生を持つ部位を有するコア ドメイン、 ヒン ジドメイン、 そしてトランスメンブレンドメィンを抱えるへモぺキシン様ドメィ ンからなつている。
このように、 MT1 - MMP は C に膜貫通 (transmembrane: TM)ドメインを持ち 、細翻 でその生物活性を発揮すると考えられている。 これまでに、同じ置 メンバーであり、基劇莫分解^ ¾であるゼラチナーゼ A (MMP-2).© ¾ (プロ MMP - 2)を細 )3刨1±で活性化すること、 さらに MT1-腿 P 自身も、 I, II及び III型 コラーゲン、 フイブロネクチン、 ラミニン、 ビトロネクチンおよび aggrecanなど 様々な ECM好を分解すること力くわかっている。 また、 MT1-MMPは、聽浸潤や 車云移の過程を促進することも示された (Seiki, M.， Apmis, 107, 137-143 (1999) ； Sato, H. et al. , Nature, 370, 61-65 (1994)) 。 MT1- MMPはまたプロ MMP- 2 (Sato, H. et al. , ature, 370, 61-65 (1994))やプロコラゲナ一ゼ -3 (プロ MM P-13) (Knauper, V. et al. , J. Biol. Chera. , 271, 17124-17131 (1996))のよう な他の MMPsを活性化する。 このように MT1-MMPの発現は細胞表面での多様なたん白分解,カスケ一ドを 開始すること力考えられる。 そして、 MT1-MMP は癌細胞浸潤や転移 (Seiki, M.， Apmis, 107, 137-143 (1999)； Sato, H. et al,， Nature, 370, 61-65 (1994)) だけでなく脈管形成 (Hiraoka, N. et al.， Cell 95, 365-77 (1998)； Zhou, Z. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4052-4057 (2000)) や骨格発育 (Zho u， Z. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4052-4057 (2000)； Holmbeck ， K. et al. , Cell, 99， 81-92 (1999))のような他の生理的プロセスにも関与し ていること力示された。
このように MT1-MMPは組織における生理的， 顏学的細胞浸潤に文付る必要な 道具であるらしい。 それゆえ、細胞表面での MT1- MMPの作用^ を解明すること は重要である。
MT1-MMP はプロ MMP-2を活性化し、細 3 ^マトリックスを直 壌することに より、癌細胞浸潤を促進すること力示されている。 MT1 - ΜΜΡによるプロ ΜΜΡ-2の 細胞表面での活性化は 浸潤における重要なステップであると考えられる。 な ぜなら、 ΜΜΡ - 2 は基翻莫の主要構^^である IV型コラーゲンやラミニンを分解 する（Stetler- Stevenson, W. G. et al. , Annu. Rev. Cell Biol. , 9， 541-73 ( 1993))。活 tt MMP- 2 の発生はまた,浸潤性とよく相関する（Tokuraku, M. et al.， Int. J. Cancer, 64, 355-359 (1995)； Nomura, H. et al.， Cancer Res. , 55, 3263-3266 (1995)) 。 その活†生化ステップは、 MT1- MMP, TIMP-2およびプ 口 MMP - 2の 3分子複合体を含んでいる（Strongin, A. Y. et al. , J. Biol. Chem .， 270, 5331-5338 (1995)) 。 し力、しな力くら、 MT1 -酵の細月刨肚での活性発現 ,は詳しくは解明されて 、なかつた。 したがつて、 MT1-MMPの活性を厳密に制 御するには如何にすべき力不明であった。 よって、癌などの細胞の移動 '浸潤' 転移を制御する方策が明らかにできないという問題があつた。 発明の開示
本発明者等は、 MT1- MMPの活性発現機構を解明すべく、 I ^意研究を難した。 その結果、 MT1-MMP力くへモぺキシン様領域 （PEX)を介して同種繊ロ性の複合体を 形成すること並びにその複合体形成が細胞表面でプロ置-2を活性化するのに必 須でぁること見出すことに成功した。 さらに、細胞表面での MT1- MMPの纖部位 を持たない PEXの発現は 2っ隱の会合を直接妨害し、用量依存的にプロ MP-2 の活性化を阻害することを見出した。 また、該 MT1-MMPの角媒部位を持たない PE Xの発現は、 細胞の浸潤'転移を抑制することを見出して、本発明に至った
本発明は、
〔 1〕 fl莫型マトリックスメ夕口プロテア一ゼ- 1 (membrane-type 1 matrix m etalloproteinase： MT1-MMP)の複数力、らなる複合体形成を阻害することを特徴と する、 MT1-MMP複合体形成阻
〔2〕 MT1- MMPの嫌からなる複合体形成を阻害する,ことを特徵とする、 プ 口 MMP - 2の活隨且害剤；
〔3〕 MT1-MMPの複数からなる複合体形成を阻害してプロ MMP-2の活性化阻 害をなすことを樹敫とする、細胞の移動、浸潤及び/又は転移 lh剤；
〔4〕 細胞が、癌細胞であることを特徴とする上記 〔3〕 記載の剤；
〔 5〕 謹からなる複合体が、 MT1-MMPの単純二量体であることを樹敷とす る上記 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれか一記載の剤；
〔 6〕 複合体形成が、少なくとも細胞表面に存在する MT1-MMP との間でなさ れているものであることを特徴とする上記 〔1〕 〜 〔5〕 のいずれか一記載の剤
〔 7〕 MT1-MMPの謹からなる複合体形成を阻害することを榭敷とする、 MT 1-MMP複合体形成を阻害する方法；
〔8〕 MT1-MMPの »からなる複合体形成を阻害することを特徴とする、 プ 口 MMP-2の活性ィ匕を阻害する方法；
〔9〕 MT1-MMPの嫌からなる複合体形成を阻害してプロ MMP- 2の活性化阻 害をなすことを iiとする、細胞の移動、浸潤及び Z又は転移を Kitする方法；
〔10〕 細胞が、癌細胞であることを特徴とする上記 〔9〕 記載の方法；
〔11〕 ネ纖からなる複合体が、 MT1-MMPの単純二量体であることを樹敫とす る上記 〔7〕 〜 〔10〕 のいずれか一記載の方法；
〔12〕 複合体形成が、少なくとも細胞表面に存在する Ml- MMP との間でなさ れているものであることを特徴とする上記 〔7〕 〜 〔11〕 のいずれか一記載の方 法；
〔13〕 細胞表面に存在する MT1-匿の単純二量体形成を阻害する活性を有す る物質；
〔14〕 MT1-MMPのへモぺキシン様ドメィン (PEX) 夕ンパク質又はその断片あ るいはそれらと実質的に同等の活性を有するものであることを ί敷とする上言己 〔 13〕 言己載の物質；
〔15〕 Metプラス MT1-題 Ρの Cys3 1 9 力、ら Gly5 3 5 あるいはそれと実質的に 同等の活性を有するタンパク質であることを特徵とする上記 〔14〕 記載の物質；
〔16〕 (i) MT1-MMPの PEXをコ一ドする核酸、
(ii) MT1- MMPの PEXの断片をコ一ドする核酸、
(iii)上記 （i)の核酸とハイブリダィズすることができる核酸、 及び
(iv) 上記（i)〜(iii) のいずれか一の核酸と実質的に同等の活性を有する核酸 力、ら成る群から還ま'れたものであることを樹敫とする核酸；
〔17〕 MT1-MMPの膜貫通ドメィン (TM)/細胞質内ドメィン (CP)を神^^長因 ^容体 (NGFR)の TM/CPに置換してあるキメラ あるいはそれと実質的に同等 の活性を有する であることを樹敫とする上記 〔16〕 記載の核酸；
〔18〕 Metプラス MT1- MMPの Cys3 1 9 から Gly5 3 5 をコードする核酸あるい はそれと実質的に同等の活性を有する核酸であることを 1敷とする上記 〔16〕 記 載の核酸；
〔19〕 上記 〔16〕 〜 〔18〕 のいずれか一記載の核酸を含有することを特徴と するベクター；
〔20〕 上記，〔16〕 〜 〔18〕 のいずれか一記載の核 は上記 〔18〕 記載のベ クタ一を含有することを糊敷とする形質車云換体；
〔21〕 MT1-MMPの TM/CPを NGFRの TM/CPに置換してあるキメラ分子あるいは それと実質的に同等の活性を有する分子を発現していることを ί敷とする上記 〔 20〕 記載の形質転換体； 〔22〕 上記 〔16〕 又は 〔18〕 のいずれか一記載の核 Xは上記 〔19〕 記載の べク夕一を含有することを特徴とする遺^治療用剤；
〔23〕 MT1-MMPの PEXタンパク質又はその断片あるいはそれらと実質的に同 等の活性を有するポリぺプチドに対する抗体；
〔24〕 MT1-MMPの PEXに結合することができる活生を有することを |敷とす
. 〔25〕 ΜΠΡΕΧあるいはそれと実質的に同等の活性を有するものであることを ί数とする上言己〔22〕 言己載の物質；
〔26〕 上記 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれか一記載のものあるいは上記 〔13〕 〜 〔 16〕 、 〔18〕 〜 〔20〕 、及び 〔22〕 〜 〔25〕 のいずれか一記載のものを含有する ことを [とする医 ¾Χは獣,；
〔27〕， 細胞の移動、浸潤及び Ζ又は転移を抑制及び/又は阻止するためのも のであることを とする上記 〔2 6〕 記載の画又は獣隨；
(28) 細胞が、癌細胞であることを特徵とする上記 〔26〕 記載の医 ¾Χは獣
〔29〕 MT1-MMPの謹からなる複合体形成を指標に、 ΜΠ - MMPのネ鐵からな る複合体形成を阻害する物質をスクリ一ニングすることを 1敷とするスクリ一二 ング方法；
〔30〕 繊からなる複合体が、 MT1-MMPの単純二量体であることを稱敷とす る上記 〔29〕 記載の方法；
〔31〕 MT1-MMPの膜貫通ドメィン (TM)/細胞質内ドメィン (CP)を神 ^^長因 容体 (NGFR)の TM/CPに置換してあるキメラ を することを特徴とする 上記 〔29〕 又は 〔30〕 記載の方法； 及び
〔32〕 上記 〔29〕 〜 〔31〕 のいずれか一記載の方法で取得した MT1- MMPの複 数からなる複合体形成を阻害する物質を提供する。 本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観 は、以下の記載より 当業者にとっては明白であろう。 し力、しな力くら、以下の記 び具体的な実施例 等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、 説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示 した本発明の意図及び範囲内で、種々の変ィ び/又は改変 （あるいは修飾） を なすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、 当業者 には容易に明ら力、であろう。本明細書で弓 I用されている全ての特許文 1¾び参考 文献は、説明の目的で引用されているもので、 それらは本明細書の としてそ の内容はここに含めて解釈されるべきものである。
本明細書において、用語「及び Z又は」 とは、 （1)ί 的接続関係と （2)選択 的接続関係の両方が^ £することを意味しており、例えば「浸潤及び/又は転移 」の場合では ひ)浸潤及び転移並びに （2)浸潤又は転移の両方を包含する意味で 棚されている。 その他においても用語「及び/又は」 は同様に （1) 的纖 関係と （2)選択的接続関係の両方を包含する意味で^ fflされて L、る。 麵の簡単な説明
図 1： 使用した MT1- MMP変異体の構造をネ試的に描いたものである。 図 2'： 細胞表面での MT1-Fによるプロ MMP - 2の活性化についての試験に関し、 C0S1細胞に MT1- MMP変異体； MT1-F, MTlCat-F発現べクタ一あるいはベクタ一 職 (Mock)を形質導入し、 .これらの細胞を血清不含培養液中で精製プロ MMP - 2 (0 . 25 //g/ral) の存在下、 37°Cで 18時間培養し、 そして得られた細胞可溶化物につ いて、変異体発現を調べ、培 ¾i清についてはプロ MMP- 2の活性化を調べた。上 段のパネルは 1^ M2 モノクローナル抗体を用いた形質導入細胞から得られた 細胞可溶化物のウェスタンブロット分析を示し、下段パネルは培養液中のゼラチ ンザィモグラフ分析を示す。 図 3 : ^liで発現させた ΜΤ1ΕΑΔΤΜの模式図を示す。 E/Aは， Glu2 4 °を A1 aに変異してあることを示している。 図 4 : MT1-MMP外部領域の同種繊ロ性複合体形成についての試験に関し、 3つ の異なった での ΜΤ1ΕΑΔΤΜのゲルろ過分析の結果を示す。 挿入図は還元およ び非; ίϋ件下で MT1EA ΔΤΜの SDS- PAGE分析を示す。 図 5 : MT1 - MMP外部領域の同種繊ロ性複合体形成についての試験に関し、 MT1 EA厶 TMをィ ^橋剤 DSGにより架橋した結果を SDS- PAGE分析して示す。 図 6： MT1-MMP PEXのホモダイマ一複合体形成に関し、 ΜΤ1ΕΑΔΤΜ(50 ^g/ml ) をトリプシンで処理レ、角鹏領域と PEXを切断し、 サンプノレを Superdex 75ゲ ルろ過カラムに供した結果を示す。挿入図は還元および非還1 ^件下での精 Xおよび角 某領域（Cat)の SDS- PAGE分析を示す。 図 7： MT1-MMP PEXのホモダイマー複合体形成に関し、 MT1- MMP PEXおよびマ ウス MT4-MMP PEXを Superdex 75ゲルろ過カラムに供した結果を示す。挿入図は 還元および非還 件下でのマウス MT4-MMP PEXの SDS- PAGE分析を示す。
'図 8 : 構築した各種変異 MT1- MMPの模式図。 図 9 : 細胞表面における MT1-MMP外部領域による二量体形成試験に関し、 COS 1細胞に MT1 - F/NGFR, MT1PEX- F/NGFR, MTlCat-F/NGFR, MT4PEX-F/NGFR発現べク ターあるいはベクターのみ （Mock) で遺 導入したものの結果を示す。細胞溶 解物は抗- FLAG Μ2モノクローナル抗体（Anti- FLAG,上パネル） あるいは抗ホスホ チロシン PY20モノクローナル抗体 (Anti - PY， 下パネル） を用いたウェス夕ンブロ ット分析をした。 図 10： 細胞表面における MT1-MMP外部領域による二量体形 験に関し、 COS 1細胞に、示した DNA量比で MT1-F/NGFRと MT1PEX- Fで共遺 導入した。細胞可 溶化物は抗- FLAG M2 (Anti- FLAG)あるいは抗ホスホチロシン PY20 (An廿- PY)を用 いたウエスタンブロット分析した。 PY20により検出されたバンドの相対的 を 不す。 図 11: 細胞表面における MT1- Fによるプロ MMP- 2活性化に対する MT1PEX- Fの影 響を示す。 C0S1細胞は DNA量の表示比率で MT1- F と MT1PEX- Fで共遺 導 A 理 した。 次に無血扉咅地中の精製プロ丽 P-2 (0. 25 / g/ml) を上言 S細胞と 37°C、 18 時間反応させた。培 ¾!:清中の MMP- 2 はゼラチンザィモグラフィ一 Chパネル) で分析し、細胞可溶化物は抗 -FLAG M2モノクローナル抗体を用いたウェスタンブ ロット分析 （下パネル） した。 図 12: 細胞表面で発現した MT1 - Fのたん白質分解活性と TIMP-2結合能に対する MT1PEX- Fの景 を示す。 図 12〜14に示されているように MT - F， MT1PEX-F, MTICa t - Fの発現べクタ一あるいはベクタ一のみ （Mock) を CHO- K1細胞に導入。 次にそ の細胞を卜リプシン処理し、 夕ンパク質分解活性の試験のための DQ™-ゼラチン コートカバ一グラス （図 13)、 TIMP-2結合測定（図 12) およびプロ MMP-2活性化 (図 14) 用に 24-穴プレー卜に分割蒔種。結果はすべて同遺^導入実験による 本図は以下の TIMP- 2結合測定を示す： 24-穴プレー卜の遺 導入細胞は BB -94 (50 〃M)の共存、非共存下 25 nM 1 2 51標識 TIMP- 2と 0 °C、 1時間、 インキュ ベ一ト。 MT1-MMP特異的結合は、 それぞれの実験から BB-94 (50 〃M)共存下のデ —夕を差し引いて算出。 図 13: 図 12と同様、細胞表面で発 した MT1 - Fのたん白質分解活性と TIMP- 2結 合能に対する MT1PEX- Fの景灣を示す。 DQ™ -ゼラチンコートカバ一グラス上の遺 ^導入細胞は培養液中で 37°C、 18時間インキュベート。発生蛍光は共焦 顕微 鏡で分析 図 14: 図 12と同様、細包表面で発現した MT1 - Fのたん白質分解活性と TIMP- 2結 合能に対する Μ ΡΕΧ- Fの景 を示す。 24-穴プレー卜の同 導入細胞は無 血 ¾i音地中で 37°C、 18時間、精製プロ MMP-2 と反応。 その細胞と培 ¾t清はそれ ぞれ抗 -FLAG M2モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析（上パネル ) およびゼラチンザィモグラフィ一 （下ノ ネル)，で分析。 図 ： HT1080細胞のマトリゲル浸潤活性に対する MT1PEX-Fの！^を示す。 HT1080細]]包は、 MT1PEX - Fと GFPあるいは GFP戰の発現ベクターで共遺 導 入。 次に細包は、 明細書の実施例の項で述べた改変 Boiden- chamber法によるマト リゲル浸潤分析にかけた。 0. 5 //g/ml TIMP-2を上下のチャンバ一に添加。下チ ャンバ一表面の GFP-陽 細胞は蛍光顕 を用いて数えた。 Mockおよび HT1PEX - F 導入細胞の GFP-陽性細胞数は各々 1. 31 X 104 および 1. 12 X 104 /1 X l05個。 図 16: MT1-MMPの PEX ドメインを介した homophilic複合体形成に関し、使用し た MT1- MMP変異体の 図を示す。 図中の各記号は、次のものを示す。
Pro:プロべプチド； FLAG: フラッグェピトープ； Myc:c- Mycェピト一プ； CD: ffi領域； H:ヒンジ部位； PEX:へモぺキシン様領域； TM: 膜貫通領域。 図 17: 図 16と同様、 C0S1細胞に MT -Fおよび/又は Μ - Mycを形質導入した。 細胞を可溶化し、 i¾!AG M2抗体結合ビーズを用い嫩沈降に供した。全細胞可 溶化物 (Whole Cell) および 沈降物 (Anti-FLAGIP)
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M2抗体 (Anti -FLAG)或いは抗 c- Myc抗体（Anti - Myc) を用いてウエスタンブロットにより分析 した。 図 18: 図 16と同様、 C0S1細胞に MT1 - F、 MTlCatおよび/又は MT1PEXに対する発 現プラスミ ドを形質導入した。細胞を可溶化し、図 17と同様に ί iFLAGビーズを用 いた 沈降に供した。 サンプルは微1^ M2抗体 (Anti- FLAG) ,、御 Tl- MMP PE X (Anti- PEX)或いはお XTlCat(Anti-Cat)を用いたウエスタンブロットにより分析 した。
図 19: 細胞表面上での proMMP-2活性化に対する MT1-MT4PEXの検討に関し、 MT1 - MT4PEXの模式図を示す。 MT4-PEX PEX ドメインは MT4-MMP由来のものである。 図 20: 図 19と同様、 MT1-MMPによる praMMP- 2の活性化を示す。 C0S1細胞に ΜΊ - MMP、 MT1 - MT4PEX或いはべクタ一単独 (Mock) の発現プラスミ ドを遺 ^導入し 、無血 ¾ί咅地で proMMP- 2と反応させた。培養液をザィモグラフィ一により proMMP - 2 プロセシングに関し分析した （±段パネル） 。 細胞可溶化物は i¾TlCatを用 いたウェスタンブロットにより分析した （中段パネル） 。形質導入細胞は表面ビ ォチン化に供し、 l¾TlCatを用いたウエスタンブロットにより分析した （T段パ 不ヅレヽ Surface Biotinylation 0 図 21: 図 19と同様、 ΜΊΊ- MT4PEX発現細胞への proMMP_2の結合を調べた。 サンプ ルはゼラチンザィモグラフィ一により分析した。 図 22: 図 19と同様、 ΜΠ-ΜΤ4ΡΕΧ発現钿胞の In situ ゼラチン分解活性は DQゼラ チンコートカバ一グラス上で細胞を培養し、調べた。 ゼラチン分解活性は蛍麵 域として可視化した。 明視野イメージも示した。 バ一：50//m 図 23: 細胞表面における ΜΠ-ΜΜΡ外部領域による二量体形成試験に関し、 C0S1 細胞に MT1 - F/NGFR及びノ又は MT1PEX-F、 fTlCat - F又は MT1-Fを遺^導入した 。細胞を i¾LAG M2(Anti-FLAG)或いは PY20 (Anti-PY) を用いたウエスタンプロ ッ卜に供した。 PY20により検出されたバンドの相対的髓は NIH Imageにより分 析して示した。 図 24: T1-MMPの二量体形成における Raclの構成的活性型 (RaclDA) の景 お よび proMMP-2活性化の可能性に関し、 MT1- F/NGFRの二量体形成における KaclMの 景遷を示す。 C0S1細胞に MT1-F/NGFK、 MT1PEX- F及び Z又は RaclDA発現プラスミ ド を遺 fe?導入した。 細胞可溶化物は PY20 (Anti-PY) および anti- FLAG M2抗体 ( Anti- FLAG)を用いたウエスタンブロッ卜に供した。 PY20により検出されたバンド の相対的?^は NIH Imageにより分析して示した。 図 25: 図 24と同様、遺 fe?導入 C0S1細胞を PY20 (Anti- PY)を用い染色した。 F - actin もまた Alexa488- conjugated phalloidin (Alexa488 phalloidin)を用い染 色した。 白矢印は F- actinおよび "PYシグナルが共に局在した部位を示す。
ノく一： ΙΟ β ΤΆ 図 26: 図 24と同様、 C0S1細胞に MT1-MMPおよび RaclM発現プラスミドを遺 導入し、 これらの細胞を精製 proM P-2と反応させた。 その培養液を proMMP- 2プロ セシングに関しザィモグラフィ一により分析した （上段パネル） 。細胞可溶化物 は撫 T1PEX抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した （下段パネル） 。 Pr oMMP- 2の活'醒への相対的活性化は NIH Imageを用い proMMP- 2のバンドの體を 測定することにより計算し示した。 図 27: 図 24と同様、遺 ^導入された C0S1細胞を i¾ G Ml抗体で染色した。 F-actin もまた Alexa488- conjugated phalloidin (Alexa488 phalloidin)で染色 した。 白矢印は F-actinおよび TLAGシグナルが共に局在した部位を示す。
ノヾ一： 10 。 図 28: 細胞表面における MT1- MMPによるプロ MMP- 2活性化に対する ΙΓ1ΡΕΧ- Fの 景 に関し、 C0S1細胞は DNA量の表示比率で MT1- MMP と MT1PEX - Fで共遺^導入 し、精製プロ MMP- 2 と反応させた。培^ h清中の MMP- 2 はゼラチンザィモグラフ ィー （_ヒパネル） で分析、細胞可溶化物は抗- MT1-PEX抗体を用いたウエスタンブ ロット分析 （中 パネル、 Whole cell) 。遺 fe?導入された細胞は表面ピオチン 化に供し、！CMTl- PEXを用いたウェスタンブロットにより分析した （下段パネル 、 surface biotinylation)0 図 29: 図 28と同様、遺 導入細胞への proMMP-2の結合を調べた。サンプルは ゼラチンザィモグラフィ一により分析した。 図 30: 図 28と同様、遺 ίέί導入細胞の In situゼラチン分解活性は、 Alexa488 標識ゼラチンをコートしたスライドガラス上で細胞を培養して調べた。 ゼラチン 分解活性は暗い、非蛍 位として可視化した。 バー： 50 m。 図 31: HT1080細胞のマトリゲル浸潤活性に対する MT1PEX-Fの景 に関し、 HT10 80細胞を MT1PEX- Fおよび空のべク夕― (Mock)に対する安定な発現ブラスミ ドを遺 導入した。 ノ、ィグロマイシン耐性細胞を集め再度羅した。培養液を BB94の 存在化或いは非存在下に無血清 DMMに交換し、 さらに細胞を培養した。培養液お よび細胞可溶化物をそれぞれゼラチンザィモグラフィ一および ^MTIPEXを用いた ウェスタンブロットにより分析した。 図 32： 図 31と同様、 HT1080細胞に MT1PEX-F或 、は空のベクタ一に対する発現プ ラスミ ドを遺 fei導入した。細胞はそれぞれゥサギ i¾ITlCat抗体および ¾¾PLAG M 1抗体を用い内因性 MTl-MMPおよび ΪΤΙΡΕΧ-Fを^ 5染色した。 白矢印は内因性 MT 1— MMP(Anti— MTlCat)および 1T1PEX-F (Anti-FLAG Ml) のシグナルが共局在してい る部位を示す。 バー： 50 。 発明を実施するための最良の形態
本発明にした力えば、 MT1-MMPの複数からなる複合体、例えば細胞表面に存在 する Μ - MMPの単純二量体の形成を阻害することにより、 プロ MMP- 2活性化を阻 害する方法及びそのための活性を持つた物質が 共できるし、 さらにそうした活 性物質のスクリ一二ング方法及びそれに用いる薬剤力く提供される。
特に、 MT1 - MMPの PEX領域は、 MTl- MMPの単純二量体の形成に重要な働きをし ており、例えば Ml- MMPの角蝶領： ¾^損した PEXは、 in vivo及び in vitroで MTl-MMPの単純二量体の形成に阻害的な活性を示し、阻害剤あるいは医薬として であり、 またこの事実を基礎に各種 MT1 - MMPの単純二量体形成阻害剤開発を 行うことを可能にする。本発明は、一方では、 MT1-MMPの単純二量体の形成をモ 二夕一するための手法を ϋ{共するものである。 さらに、遺 fe?治療の途も提供す る。
本発明は、 MTl- MMPの PEX領域を特異的に認識する抗体、例えばモノクロ一ナ ル抗体に関し、該抗体を翻した搬学的測 ¾1式薬ゃ隨、 さらには各種測定法 も灘する。
本明細書中、 「PEX」又は「PEXタンパク質」 とは、 MTl- MMPの PEX領域（例 えば、 MT1-MMP のアミノ酸配列 (SWISS- PEOT accession number: P50281) 中、 31 6-508位のアミノ酸配列領域、場合によっては 319- 535位のアミノ酸配列領域） のタンパク質あるいはその断片を含んでいてよい。 また、以下に記載するように して誘導あるいは構築された変異体、類縁体、誘導体であってよい。 MT1-MMP の PEX領域と結合する活性を有するものであれば特に IS¾されないが、 MT1-MMPの ネ纖からなる複合体形成を阻害する活性をもつもの、 また好ましいものとしては 細胞表面に存在する MT1-匿の単純二量体形成を阻害する活性をもつもの力く挙げ られる。代表的なものとしては、 MT1 - MMPのアミノ酸酉 ij: Met：1〜 Gly5 3 5のうち 、 Ser2〜Ile3 1 8を欠損しているもの、すなわち MT1PEXが挙げられるが、 これに限 定されない。該 PEX タンパク質は、所望の生物活性（例えば、 MT1-MMPの単純二 量体形成を阻害する活性、 あるいは MT1- MMPの単純二量体形成によるプロ MMP - 2 活性化を阻害する活性、 さらには、 MT1- MMPの単純二量体形成が引き起こし、結 果として生ずる細胞の移動、浸潤及び/又は転移を、抑制あるいは阻害する活性 など） を有している限り、 MT1- MMPの PEX領域に相当するアミノ酸配列を有する タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列中に、適宜、 1個ないし謹個以上の アミノ酸の置換、 、挿入、転移あるいはィ (J口をなしたごとき変異を導入した 相当するタンパク質であってよい。 こうした変異 ·変換 ·修飾法としては、ィ匕学的な手法、 あるいは MT1- MMP遺伝 子 (GenBankTM/EMBL accession number: D26512) の塩基配列を基に遺伝子工学的 に常用される方法を適用したもの力挙げられ、例えば日本生化学会編、 「1 ^化 学実験講座 1、遺 fei研究法 II 」、 Pl05 OS瀬進） 、 化学同人 (1986) ; 曰 本生化学会編、 「新生化学実隱座 2、核酸 III (組換え DNA技術） 」、 P233 ( 広瀬進） 、 棘化学同人 (1992)； R. Wu, L. Grossman, ed.， "Methods in Enzym ology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987)； R. W u, L. Grossman, ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468,
Academic Press, New York (1983)； J. A. Wells et al. , Gene, 34: 315, 19 85; T. Grundstroem et al. , Nucleic Acids Res.， 13: 3305, 1985; J. Taylor et al. , Nucleic Acids Res. , 13: 8765, 1985; R. Wu ed. , "Methods in Enzy mology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987)； A. . Oliph ant et al. , Gene, 44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げられる。例えば合成 ォリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変 入法（部位特異的変^ »入法 ) (Zoller et al. , Nucl. Acids Res. , 10: 6487, 1987; Carter et al. , Nucl. Acids Res. , 13: 4331, 1986), カセット変^ ¾入法 (cassette mutagenesis: Wells et al. ， Gene, 34: 315, 1985), 制限部 feil択変鶴入法 (restriction selection mutagenesis： Wells et al. , Philos. Trans. R. Soc. London Ser A , 317: 415, 1986),ァラニン ·スキヤンニンク、'法 (Cunningham & Wells, Scienc e， 244: 1081-1085, 1989), PCR変難入法， Kunkel法， d TP[aS]法（Eckste in)，亜硫酸や亜硝酸などを用いる領繊旨定変 入 ¾ ^の方法が挙げられる。 さらに得られた該夕ンパク質は、 化学的な手法でその含有されるアミノ膨基 を修飾することもできるし、 ぺプチダ一ゼ、例えばぺプシン、 キモトリプシン、 ノ、 °ノ、°イン、 ブロメライン、 エンドべプチダーゼ、 ェキソぺプチダ一ゼなどの を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘 本などにすること力《できる。 該タンパク質は、 in vivo あるいは in vitro ダルコシレ一シヨン又は脱ダルコ シレーシヨンをしたり、 グルコシノレ化される位置を変えることもできる （TO87/0 5330; Apin and Wriston, CEC Crit. Rev. Biochem. , pp. 259-306 (1981) ； Haki muddin et al. , Arch. Biochem. Biophys. , 259: pp. 52 (1987)； Edge et al. , Anal. Biochem. , 118: pp. 131 (1981) ； "Methods in Enzymology", Vol. 138, p p. 350, Academic Press, New York (1987) 等） 。
本発明のタンパク質は、 C が通常カルボキシル基 (-C00H) またはカルボキ シレート （- C00— ) である力 C 耑がアミ ド (- C0NE )またはエステル (- C00R) であってもよい。 ここでエステルにおける R としては、例えば、 メチル、 ェチル 、 η-プロピル、 イソプロピルもしくは η-ブチルなどの d-6アルキル基、例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3-8 シクロアルキル基、 例えば、 フエ ニル、 0：—ナフチルなどの C6— 1 2 ァリール基、例えば、 ベンジル、 フヱネチルな どのフェニル— d - 2アルキル基もしくは —ナフチルメチルなどの α—ナフチル
-d- 2 アルキル基などの C7-1 4 ァラルキル基のほ力、、経口用エステルとして汎用 されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。 本発明のタンパク質が C末 端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 カルボ キシル基がァミ ドィ匕またはエステル化されているものも本発明の夕ンパク質に含 まれる。 この:^のエステルとしては、例えば上記した C のエステルなどが 用いられる。 さらに、 本発明のタンパク質には、 上記したタンパク質において、 ¾にメ チォニン残基を持つものであつてよく、 さらに該メチォニン¾¾のァミノ基が保 護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの d一 5 アルキル一カルボニル基など の d— 6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側力性体内で切断され ^^し たグルタミノレ基がピログルタミルイ匕したもの、 内のァミノ酸の佴 l:の置換 基 （例えば、 -OH、 -C00H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニ ジノ基など） 力適当なィ呆護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの d— 6ァシ ル基など） で保護されているもの、 あるいは議が結合したいわゆる糖タンパク 質などの複合タンパク質なども含まれる。 また遺伝 且換え法で製造する時に融 合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で、 天然に存在するものと 実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換 ·加工してもよい。 遺 fe^ 工学的に常用される融合；^法を用いることができる力く、 こうした融合夕ンパク 質はその Ϊ虫^を利用してァフィ二テイクロマトグラフィ一などで精製すること も可能である。 こうした融合タンパク質としては、 ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、 あるいはマルト一ス結合タンパク （MBP)， グルタチオン- S- トランスフェラーゼ (GST)又はチォレドキシン （TRX)のアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが 挙げられる。 同様に、 ポリペプチドは、 ヘテロジーニアスなェピ卜一プのタグを 口され、 該ェピトープに特異的に結合する抗体を用いてのィムノァフィ二ティ 'クロマトグラフィ一による単離 ·精製をなし得るようにすることもできる。 代 表的なものとしては、 ポリヒスチジン (poly- His)又はポリヒスチジン- グリシン (poly-His- Gly)タグ、 flu HAタグ及びそれに対する抗体 12CA5、 c-Myc タグ及び それに対する抗体 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 あるいは 9E10、 Herpes Simplex vir us glycoprotein D (gD)タグ及びそれに対する抗体、 FLAG-ぺプチド、 KT3ェピ トープ ペプチド、 a- tubulin ェピト一プ ペプチド、 T7 gene 10 protein ぺプチド タグなどが挙げられる （Field et al.， Molecular and Cellular Bio logy, 8: pp. 2159- 2165 (1988)； Evan et al. , Molecular and Cellular Biolog y, 5: pp. 3610-3616 (1985)； Paborsky et al.， Protein Engineering, 3(6)： p p. 547-553 (1990)； Hopp et al. , BioTechnology, 6: pp. 1204-1210 (1988)； Ma rtin et al. , Science, 255: pp. 192-194 (1992)； Skinner et al.， J. Biol. C hem. , 266: pp. 15163-15166 (1991)； Lutz-Freyermuth et al. , Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 87: pp. 6393-6397 (1990))。 こうした融合タンパク質の発 び 精製は、 それに適した巿,販のキットを用いて行うことができ、 キット製造業者あ るいはキット 業者により明らかにされているプロトコルに従って ¾ί缶するこ ともできる。
タンパク質の構造の修飾.改変などは、例えば日本生化学会編.、 「新生化学実 験講座 1、 タンパク質 VII、 タンパク質工学」、 ^：ィ 同人 (1993) を参考に し、 そこに記載の方法あるいはそこで弓 I用された文献記載の方法、 さらにはそれ らと実質的に同様な方法で行うこと力できる。 また下記するようにその生物学的 活性のうちには、； ^的に活性、例えば ί¾¾性を有するということも含まれてよ い。該修飾'改変のうちには、脱アミノィ匕、 ヒドロキシル化、 リン酸化、 メチル ィ匕、 ァセチル化、 開環、 閉環、含有 ¾1の ¾を違うものに変えること、含有糖 鎖の数を増減すること、 D-体アミノ膨錢への置換などであってもよい。 それら の方法は、 当該分野で知られている (例えば、 T. E. Creighton, Proteins: Str ucture and Molecular Properties, pp. 79 - 86 W. H. Freeman & Co. , San Franci sco, USA (1983)，等） 。 力、くして該タンパク質は、 1個 のァミノ職基が同 H"生の点で天然のもの と異なるもの、 1個 Ri:のアミノ勝基の位置が天然のものと異なるものであつ てもよい。該タンパク質は、 PEXに特有なアミノ膨錢が 1個 J¾± (例えば、 1 〜190個、好ましくは 1〜50個、 さらに好ましくは 1〜20個、 さらに好ましくは 1〜10個、特には 1〜5個など） 欠けている欠^!縁体、 のアミノ膨基の 1個以上 （例えば、 1〜100個、 好ましくは 1〜50個、 さらに好ましくは 1〜20 個、 さらに好ましくは 1〜10個、 特には 1〜5個など）カ他の残基で置換されて いる置麵縁体、 1個以上 （例えば、 1〜100個、好ましくは 1〜50個、 さらに 好ましくは 1〜20個、 さらに好ましくは 1〜10個、特には 1〜5個など） のァミ ノ 基が^！]されている 口類縁体も包含する。天然の PEXの特 ί敫であるドメ ィン構造ある 、は活性中 冓造が糸辦され且つ上記した細胞表面に存在する Μ - ΜΜΡの二量体形成に対しての抵抗性が,されていれば、上記のごとき変異体は 、全て本発明に包含される。 また該タンパク質は天然の ΡΕΧ と実質的に同等の一 次構造コンフオメーションの を有しているものも含まれてよいと考えられ、 さらに細胞表面に存在する MT1-MMPの二量体形成に対して抵抗性であること以外 は天然の ΡΕΧ と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと 考 iられる。 さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。該タンパク質は、例え ば、 MT1-MMPのアミノ酸配列中第 316番目のアミノ膨錢 P〜第 508番目のアミ ノ膨虞 SCの範囲のアミノ酸配列 （及び Z又は 319 - 535位の範囲のアミノ酸配列 ) に対し、 50%より高い相同性を有しているもの力く挙げられ、 より好ましくはそ れに対し、 70% hの、 あるいは 90% _tの相同アミノ酸配列を有するもの力挙 げられる。該タンパク質から誘導される断片とは、該 PEX タンパク質の "^のぺ プチド （すなわち、該 PEXタンパク質の部分ペプチド） であって、上言 ΞΡΕΧタン パク質と実質的に同等な活性を有するものであれば 、ずれのものであつてもよい o例えば、該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、 MT1-MMPのアミノ酸配列中 第 316番目のアミノ膨曳基〜第 508番目のアミノ膨曳基の範囲 （及び/又は 319 -535位の範囲） の構成ァミノ酸配列のうち少なくとも連続した 2個¾±、好まし くは 5個以上、 さらに好ましくは 10個 ¾±、 より好ましくは 20個以上、 もっと好 ましくは 50個以上、 ある には 100個以上のァミノ酸配列を有するぺプチドが 挙げられ、例えば、 MT1PEXのアミノ酸配列に対応する領域に対する相同性に関し て、上記と同様の相同性を有するもの力挙げられる。 本明細書において、 「実質的に同等」 とは蛋白質の活性、例えば、 MT1-MMPの 単純二量体形成によるプロ匪 P-2活性化に対する抵抗性、 それに対応する生理的 な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。 さらにまた、 そ の用語の意味の中には、 実質的に同質の活性を有する ^を包含していてよく、 該実質的に同質の活性としては、例えば、該ニ量体形成を阻害する性質、 プロ腿 P- の活性化に関連する細胞の移動、浸潤及び/ /又は転移を抑制及び/又は阻害 する活性などを挙げること力《できる。該実質的に同質の活性とは、 それらの活性 カ性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理学的に、 あるいは生 物学的に同質であることを示す。例えば、該ニ量体形成を阻害するなどの活性が 、 同等（例えば、約 0. 001〜1000倍、好ましくは約 0. 01-100倍、 より好ましく は約 0. 1〜20倍、 さらに好ましくは約 0. 5〜2倍） であること力く好ましい力^ こ れらの活性の禾號、 夕ンパク質の 量などの量的な要素は異なっていてもよい
次に、 アミノ酸の置換、欠失、 あるいは挿入は、 しばしばポリペプチドの生理 的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないし、 こうした ϋ^、 その置 換、欠失、 あるいは挿入を施されたポリペプチドは、 そうした置換、欠失、 ある いは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるであろう。該ァミノ 酸配列中のァミノ酸の実質的に同一な置換体としては、 そのァミノ酸が属すると ころのクラスのうちの他のァミノ lから選ぶこと力できうる。例えば、非極性
(¾7)性） アミノ酸としては、 ァラニン、 フエ二ルァラニン、 ロイシン、 イソ口 イシン、 パリン、 プロリン、 トリブトファン、 メチォニンなどが挙げられ、極性
(中' f生） としては、 グリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァ スパラギン、 ダル夕ミンなどが挙げられ、 陽電荷をもつァミノ酸（塩基性ァミノ 酸） としては、 アルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどが挙げられ、 陰電荷をもつ アミノ酸 （酸 f生アミノ酸） としては、 ァスパラギン酸、 グノレ夕ミン酸などが挙げ られる。 本発明の夕ンパク質及びその一部のぺプチドの合成には、 当該べプチド合成分 野で知られた方法、例えば液相合成法、 固相合成法などの化学合成法を麵する こと力できる (Stewart et al. , Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freem an Co. , San Francisco, CA, USA, 1969; Merrifeld, J. Am. Chem. Soc. , 85, 2149-2154, 1963; J. Org. Chem. , 37, 3404, 1972; G. B. Fields (ed. ), "Met hods in Enzymology" , Vol. 289 (Solid-Phase Peptide Synthesis), Academic Press, New York (1997)) 。 こうした方法では、例えばタンパク質あるいはぺプ チド合細樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、 それ自体公知の各画合方 法により所望のアミノ酸配列に順?：^樹脂上で結合させていく。縮合反応には、 好ましくはそれ自体^^の各種活性化難を用いるが、 そうした試薬としては、 例えばジシクロへキシルカルポジイミドなどカルポジイミ ド類を好ましく使用で きる。 物が保護基を有する場合には、驢保護基を除去することにより目的 のものを得ることができる。
本発明の夕ンパク質及びその一部のぺプチドは、 それが J!I佳型のものとして得 られた i¾には、 それ自体 / ^^の方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換する こと力でき、 またそれらは塩として得られた ¾^には、 それ自体公知の方法ある いはそれに準じた方法で纖佳型のものあるいは他の塩に変換することができる。 本発明のタンパク質 （MT1- MMPに存在しているアミノ酸配列のうちの任意の連 続した領域を有するタンパク質断片又はそれから誘導された断片、 MT1- MMP の シグナルペプチドドメイン、 プロペプチドドメイン、 コア ドメイン、 ヒンジ ドメイン、及びトランスメンプレンドメインから成る群から選ばれたものを欠失 せしめてあるタンパク質又はそれから誘導された断片を含む） は、 ヒト MT1-MMP ¾(5?(GenBank™ /EMBL accession number: D26512)の塩基配列を基に遺 ^ェ 学的操作を適用して得ることができる。該ヒ卜 MTH lP遺 の塩基配列を有す る核酸、例えば NA 3^は、該 MT1- MMP塩基配列に基づいて適切なプライマ一を 設計 ·合成し、好ましくは該ヒト MT1 - MMP塩基配列のォリジンである動物由来の mRNAあるレ、はその mRNAから調製された cDNAを用 、、所望の配列を PCR増幅やリガ —ゼチェインリアクション (LCB)増幅することにより得られる。 によっては 、得られた DNA断片をプローブに種々のヒト組織あるいは培養細胞等から構築さ れたヒトジヱノミック DNAライブラリ一あるいはヒト由来 cDNAライブラリーをス クリ一二ングして得ることもできる。 先ず該 MT1- MMP塩基配歹リを基にセンスプライマ一とアンチセンスプライマーを 合成する。 PCE法で用いるプライマ一としては、 所望の部位を含む DNA断片を増 幅できるものであれば、 特に^されない。 センスプライマ一は、 好ましくは該 遺 fe?の 5' ί 則のェクソン部位から選んで合成することができ、 アンチセンスプ ライマーは、 好ましくは該遺 fe?の 3'端側のェクソン部位から選んで合成するこ と力くでき、 より好ましくは該センスプライマー合成に禾 ij用したェクソン部位 から選ぶこと力できる。 5'端側のプライマ一としては、 少なくとも開始コドンを 含有するか、 あるいは該開始コドンを含めて増幅できるように選択し、 また 3'端 側のプライマーとしては、 少なくともストップコドンを含有するか、 あるいは該 ストップコドンを含めて増幅できるように選択することカ赞まい、。 代表的には 、 プライマ一は （a) GenBank™ /EMBL accession number: D26512 のヒト MT1 - MM Pの塩基配列のうちの 5'端側の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌ クレオチド及び （b)該ヒト MT1-MMPの塩基配列のうちの 3'端側の任意の領域に対 する相補塩基配列を有するォリゴヌクレオチドを使用すること力くできる。 遺ィ Siの cDNAは、 その全長を一度に入手することを目指してもよいが、所定の ェクソン部位 （ネ のェクソン部位) を利用して、 ■のプライマーをデザイン して合成し、 の PCRをデザインして行い、 こうして得られた DNA断片に基づ いてクロ一ニングした DNA断片から当該遺 fe?の cDNAを得ることもできる。 ブラ イマ一は、 好ましくは 5個以上の塩基からなるォリゴヌクレオチド、例えば、 10 〜50個、 さらに好ましくは 15〜35個、 より好ましくは 18〜25個の塩基からなるォ リゴヌクレオチドが挙げられる。 プライマーの は、 当該分野で知られた方法 で行うこと力くでき、 例えば自動 DNA合成装置、 例えば、 model 381A DNA synthes izer, Applied Biosystemsなどを用 、、 フォスフォジエステル法、 フォスフォト リエステル法、 フォスフォアミダイト法などにより合成できる。 ヒト MT1 - MMPを発現すること力く知られている種々のヒトの茅纖あるいは培養細 胞 （特には、 ヒト心臓、 脳、 胎盤、肺、肝臓、骨格筋、 腎臓、 勝臓などから得ら れたヒト細胞、 ヒト肺扁平上颇細胞株などの扁田胞株など） 力、ら mRNAを単離 する。 mRNAの単離は、 当該分野で 口の方法あるいはそれと実質的に同様な方法 や改変法により行うことができる力 J. Sambrook et al. , "Molecular Cloning" ， 2nd ed.， Chapter 7, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ； D. M. Glover et al. ed. , "DNA Cloning", 2nd ed. , Vol. 1， (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (19 95) ； L. Grossman et al. ed.， "Methods in Enzymology， Vol. 12, Part A & B, Academic Press, New York (1968)； S. L. Berger et al. ed.， "Methods i n Enzymology", Vol. 152， p. 33 & p. 215, Academic Press, New York (1987) ;B iochemistry, 18: 5294-5299, 1979などに記載の方法、 例えばグァニジン一塩化 セシゥム法、 チォシァン酸グァニジン法、 フエノ一ル法などの方法で行うこと力 出来る。 mRNAの単離に用いられるキットとしては、 例えば、 Pharmacia, Stratag ene, Gibco-BRLなどから市販されているもの力挙げられる。 必要に応じ、 得られ た全 RNA はオリゴ (dT)—セルロースカラム、 スピンカラム、 オリゴ (dT)結合磁性 ビーズなどを使用して精製してポリ （A)+ mR Aを得ることが出来る。 この mRNA及び逆転 ¾¾(RNA依存性 DNA ポリメラ一ゼ） を用いて、 cDNAを作製 する。 逆転写反応では、 オリゴ (dT)プライマ一を用いること力できる。 オリゴ (d T)プライマーは、 好適には 12〜18個の T残基を持つもの力使用できる。指向性ク ローニングを行う には、 12〜18個の T の 5'側に制限 部位を連結した 合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いることも好ましい。 こうしたプライマ 一の例としては、 Xba I オリゴ (dT)プライマーアダプターなどが挙げられる。 ま たランダムへキサマープライマ一を用いると、 mRNAの 5' ¾側力得られる可能 f生 力く増大し、 このランダムへキサマープライマーは単虫で、 あるいはオリゴ (dT)プ ライマーと混合して使用できる。 特に好ましくは、上記ヒト MT1 - MMP遺 fe?(Gen BankT7EMBL accession number: D26512) の塩基配列を基に合成したオリゴヌク レオチドプライマ一を用いることも好ましい。 逆転写^ βでは、必要に応じて RN ase阻 S¾を加えること力くできる。 mRNA及び逆車云写 を用いての cDNA合成は当 該分野で^口の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により亍ぅこと 力くできる力、 H. Land et al. , Nucleic Acids Res. , 9: 2251, 1981; U. Guble r et al. , Gene, 25: 263-269, 1983; S. L. Berger et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 152, p. 307, Academic Press, New York (1987) などに記載 の方法が挙げられる。
得られた cDNAと編己のセンスブラィマ一及びァンチセンスプラィマ一を用いて ポリメラ一" 1? ·チェイン · リアクション (polymerase chain reaction: PCR)をィ了 い、 所望の cDNA領域を増幅する。 本明細書中、 「ポリメ^—ゼ 'チェイン' リアクション」又は 「PCR」 とは、 一般的に、 米国特許第 4683195号明細書に記載されたような方法を指し、例えば 、所望のヌクレオチド配列をィンビト口で 的に増幅するための方法を指して いる。 "^に、 PCR法は、鍀型核酸とィ魏的にハイブリダィズすることのできる 2個のォリゴヌクレオチドプライマ一を使用して、 プライマ一伸^成を行うと ころのサイクルを繰り返し行うことを含むものである。 典型的には、 PCR法で用. いられるプライマーは、 内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相 捕的なプライマーを使用することができ、 例えば、該増幅されるべきヌクレオチ ド配列とその両端において相補的であるか、 あるいは該増幅されるべきヌクレオ チド配列に 妾しているものを好ましく使用され得る。 列えば、 mRNAを βにして合成された DNA)と該遺 fe?に基づいてデザィ ンされたプライマーとを、 10 X反応緩衝液 (Taq DNAポリメラ一ゼに添付されて いる） 、 dNTPs ( デォキシヌクレオシド三リン酸 dATP， dGTP, dCTP, dTTPの混合 物） 、 Taq DNA ポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。 混合物を、例えば 、 GeneAmp 2400 PCR system, Perkin-Elmer/Cetus などの自動サーマルサイクラ —を用いて一般的な PCKサイクル条件下にそのサイクルを 25〜60回繰り返すが、 増幅のためのサイクノ ま適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。 PC Rサイクル条件としては、 例えば、 変性 90〜95°C 5-100秒、 ァニ一リング 40〜 60°C 5〜150秒、伸長 65〜75°C 30 -300秒のサイクル、好ましくは変性 94 °C 15秒、 ァニーリング 58 °C 15秒、伸長 72 °C 45秒のサイクルが挙げられる が、ァニ一リングの 及び時間は illC実験によって適当な値を選択できる し、変す叛応及び伸飯応の時間も、予想される PCE産物の鎖長に応じて適当な 値を選択できる。 アニーリングの は、通常プライマーと鍩 NA とのハ イブリッドの Tm値に応じて変えることが好まいゝ。伸; ¾応の時間は、通常 1000 bpの鎖長当たり 1分禾 ISがおおよその目安であるが、 より短い時間を選択するこ とも場合により可能である。 得られた PCR産物は、通常 1~2% ァガロースゲル電気泳動にかけて、特異な バンドとしてゲルから切り出し、例えば、 gene clean kit (Bio 101)などの市販 の抽出キットを用いて DNAを抽出する。抽出された DNAは適当な制限酵素で切断 し、必要に応じ精 »理したり、 さらには必要に応じ 5'末端を T4ポリヌクレオチ ドキナーゼなどによりリン酸化した後、 pUC18などの pUC系ベクターといった適 当なプラスミ ドベクタ一にライゲーシヨンし、適当なコンビテント細胞を形 RI云 換する。 作製された DNA断片を基に、 ファージベクタ一、 プラスミ ドベクターを ^fflするなどして cDNAラィブラリ一を構築することもできる。 昜菌などの宿主 細胞の形質車云換をするには、例えばカルシウム法、 ルビジウム/カルシウム法、 カルシウム Zマンガン法、 TFB高効率法、 FSB？東锆コンビテント細胞法、迅速コ ロニ一法、 エレクトロポレーシヨンなど当該分野で知られた方法あるいはそれと 実質的に同様な方法で行うことができる （D. Hanahan, J. Mol. Biol.， 166: 55 7, 1983 など） 。
当該遺^の塩基配列の全部あるいは一部を有する核酸は、ィ匕学合成によって 得ることも可能である。 その 断片を化学合成し、 それらを藤により結合す ることによつてもよい。 また、ィ匕学合成断片をプライマ一あるいはプローブとし て用いて所望の配列を得ることも可倉である。
PCR は、 当該分野で 口の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変 法により行うことができる力 例えば B. Saiki, et al.， Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al. , Science, 239: 487, 1988 ； H. A. Erlich ed. , PCR Technology, Stockton Press, 1989 ； D. M. Glover et al. ed. , "DNA Clonin g"， 2nd ed. , Vol. 1， (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ； M. A. Innis et al. ed. , "PCR Protocols： a guid e to methods and applications" , Academic Press, New York (1990)) ; M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed. ), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991)； M. A. Frohman et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 85， 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改 変した方法に従って行うこと力できる。 また、 PCR法は、 それに適した市販のキ ットを用いて行うこと力でき、 キット製造業者あるいはキット 業者により明 らカ、にされて 、るプロトコルに従って難することもできる。 本明細書中、 「ォリゴヌクレオチド」 とは、比較的短 、一本 は 鎖のポ リヌクレオチドで、好ましくはポリデォキシヌクレオチドが挙げられ、 Angew. C hem. Int. Ed. Engl. , Vol. 28, p. 716-734 (1989) に記載されているような嫩ロ の方法、例えば、 トリエステル法、 ホスフアイト法、 ホスホアミダイト法、 ホス ホネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾さ れた固体支^上で合成を便利に行うことができること力知られており、例えば 、 自動化された合成装置を用いて行うこと力でき、該装置は市販されている。該 ォリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ の修飾された塩基を含有していてよく 、例えば、 ィノシンなどの无然においては^!でない塩基あるいはトリチル化さ れた塩基などを含有して ヽてよい。
得られた PCB産物をクロ一ニングし、得られた PCR産物を同定し、所望のヒト MT1-MMPをコードする DNA断片を取得することもできる。 また、 この DNA断片を プローブに同様にして種々の cDNAライブラリ一をスクリーニングし、 目的とする DNAを単離することもできる。 PCE産物のクローニングには、例えば、 p - Direct
(Clontech), pCR- Script™ SK(+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp™ ： Gibco- BRL)などの市販のプラスミドベクターを用いることが出来る。 ¾ ^なオープン ·リ一ディング ·フレ一ムを含む全長の遺^配列を取得する には、必要に応じて、上記の様にして得られた DNA断片をプローブに用いて、上 記したような種々のヒト組織あるいは培養細胞から構築された cDNAライブラリ一 をスクリーニングし、 プローブにハイブリダィズするクローンを選択し、該クロ ーン中の cDNAの挿入配列の塩基配列を し、該遺 を構成している DNA断片 を同定し取得する。 もちろん、必 に応じて該ク口―ン中の cDNAの挿入配列はサ ブクローニングすること力できる。 なお、 プローブなどを ¾寸性同位体などによ つて標識するには、市販の標識キ、ソト、例えばランダムプライムド DNA ラベリン グキット （Boehringer Mannheim)などを使用して行うことが出来る。 目的とする DNAを単離するためには、逆転^ PCR (polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR) ヽ RACE rapid amplification of c DNA ends) を;！用することが出来る。 RACEは、例えば、 M. A. Innis et al. ed. ， 'PCR Protocols (M. A. Frohman, a guide to methods and applications ， pp. 28-38,： Academic Press, New York (1990) などに記載された方法に従って 行うことができる。 RT - PCR産物はプラスミ ドベクターにクローニングすることが でき、 それを高効率のコンピテント細胞に導入できる。
更に、 ί¾*の細胞あるいは組織から mRNAを単離精製できる方法、例えば、 EEX kit, United States Biochemical ; Glass MAX™ RNA spin cartridge system, Gibco-BRLなどの市販のキットを禾 ij用し、得られた mRNAをオリゴ (dT)プライマ一 を用いて逆転写して、 1st strand DNAを合成し、 ついで 1st strand DNAの 3' にホモポリマーテール（例えば、 G残基） を付けた後、 あるいは該 DNAにァダプ 夕一を付けた後、 オリゴ (dT)プライマーとオリゴ (dC)プライマーあるいはァダプ 夕一プライマ一を用いて cDNAを PCE增幅することもできる。 これに適した市販の 干ッ卜としてはヽ Superscript™ pre - amplification system (Gibco-BRL)； cDN A Cycle™ kit (Invitrogen) などが挙げられる。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 サンプノレ （例えば、 ヒト組織'細胞から調製した 遺イ^ライブラリー、代表的には、 ；i gtioなどのファージ中に構築され、 それを ASISC600hfl株などの宿^昜菌に感染させ、 プラークを形成させて得たもの など） をナイロンフィルタ一などの膜に転写せしめ、必要に応じ^ »理、 固定 ィ 理、洗浄処理などを施した後、 その膜に転写せしめられたものを、必要に応 じ させた標識プローフ DNA断片と、ハイブリダィゼーシヨン用バッファ中で 芯させて行われる。
ハイブリダィゼーシヨン処理は、普通約 35°C〜約 80°C、 より好適には約 50°C〜 約 65°Cで、約 15分〜約 36時間、 より好適には約 1時間〜約 24時間行われる力 適 miiな条件を選択して行うこと力できる。例えば、ハイブリダィゼ一シヨン処 理は、約 55°Cで約 18時間行われる。 ハイプリダイゼ一ション用バッファとしては 、 当該分野で普通に されるものの中から選んで用いること力でき、例えば、 Rapid hybridization buffer (Amersham) などを用いることができる。転写した 膜の ¾«理としては、 アルカリ変性液を麵する方法が挙げられ、 その処理後 中和液や緩衝液で処理するのカ 子ましい。 また膜の固定ィ 理としては、普通約
40°C〜約 100°C、 より好適には約 70°C〜約 90°Cで、約 15分〜約 24時間、 より好適 には約 1時間〜約 4時間べ一キングすることにより行われる力 適宜好ましい条 件を選択して行うこと力できる。例えば、 フィルターを約 80°Cで約 2時間べーキ ングすることにより固定化が行われる。転写した膜の洗浄処理としては、当該分 野で普通に使用される洗浄液、例えば 1M NaCl 、 ImM EDTAおよび 0. 1% Sodium Dodecyl sulfate (SDS) 含有 50mM Tris— HC1緩衝液， H8. 0などで洗うことによ り行うこと力 きる。 ナイロンフィルタ一などの膜としては、 当該分野で普通に ■されるものの中から選んで用いることができ、例えば、 ナイロンフィルター
[ハイボンド （Hybond) - N、 Amersham] などを挙げること力できる。 上記アルカリ変性液、 中和液、緩衝液としては、 当該分野で に麵される ものの中から選んで用いることができ、 アルカリ変性液としては、例えば、 0. 5M NaOHおよび 1. 5M NaClを含有する液などを挙げること力くでき、中和液としては 、例えば、 1. 5M NaCl含有 0. 5M Tris-HCl緩衝液， pH8. 0などを挙げることが でき、緩衝液としては、例えば、 2 XSSPE (0. 36M NaCl、 20mM NaH2P04および 2m M EDTA) などを挙げることができる。 またハイブリダイゼーション処理に先立ち 、非特異的なハイブリダィゼ一シヨン反応を防ぐために、必要に応じて転写した 膜はプレハイブリダィゼーシヨン処理すること力く好ましい。 このプレハイブリダ ィゼ一シヨン処理は、例えば、 プレハイブリダィゼ一シヨン溶液 [50% formami de、 5 xDenhardt' s溶液 (0. 2 %ゥシ血清アルブミン、 0. 2 % polyvinyl pyrro lidone)、 5XSSPE、 0. 1 % SDS、 100 / g/ml 熱'変†生サケ精子 DNA ] などに浸 し、約 35°C；〜 50° (：、好ましくは約 42°Cで、約 4〜24時間、好ましくは約 6〜8時 間 iSさせることにより行うこと力できるカ^ こうした条件は当業者であれば適 宜実験を繰り返し、 より好ましい条件を決めること力くできる。ハイブリダィゼ一 シヨンに用いる標識プロ一プ ΜΑ断片の^は、例えば、約 70。C〜100。C、好ま しくは約 100 °Cで、約 1分間〜約 60分間、好ましくは約 5分間加熱するなどして 行うことができる。 なお、ハイブリダイゼ一ションは、 それ自体公知の方法ある いはそれに準じた方法で行うことができる力^本明細書でストリンジヱントな条 件とは、例えばナトリゥム鍵に関し、約 〜 50mM、好ましくは約 19〜4( 、 よ り好ましくは約 19〜20mMで、 ¾gについては約 35〜85°C、好ましくは約 50〜70°C 、 より好ましくは約 60〜65°Cの条件を示す。 ハイブリダィゼーシヨン完了後、 フイノレターを十分に洗'净処理し、特異的なハ イブリダィゼーシヨン反応をした標識プローブ DNA断片以外の標識プローブを取 り除く。 フイノレターの洗浄処理は、 当該分野で^!に使用されるものの中から選 んで用いて行うことができ、例えば、 0. 1 % SDS含有 0. 5XSSC (0. 15M NaCl含 有 15 mMクェン酸緩衝液， H 7. 0)溶液などで洗うことにより難できる。 ハイブリダィズしたプラークは、代表的にはオートラジオグラフィ一により検 出すること力できるカ^ 当該分野で用いられる方法の中から適宜選択してブラー ク検出に用いることもできる。検出したシグナルに相当するプラークを、適切な 緩衝液、例えば、 SM溶液 (lOOmM NaClおよび 10mM MgS04含有 50mM Tris-HCl緩衝 液、 pH7. 5 ) などに懸濁し、ついでこのファージ懸濁液を: Mに希釈して、 昜 菌に感染させ、得られた^ S昜菌を培養して、 その培養された^ M菌から目的組換 え体ファージを得る。 なお、必要に応じて上記プロ一プ Aを使用して、ハイプ リダイゼ一ション処理により遺 1¾:？ラィブラリ一や cDNAラィブラリ一から目的組 換え体ファージをスクリーニングする処理は、繰り返して行うこと力できる。 ま た目的組換え体ファージは、培養された^ 菌から抽出処理、遠心分離処理など を施して得ることができる。 得られたファージ粒子は、 当該分野で普通に使用される方法で精 ^離するこ と力でき、例えば、 グリセ口一ルグラジェント ¾心分離法 (Molecular clonin g, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989) などにより精製すること力できる。 ファージ粒子からは、 当 該分野で普通に割される方法で DNAを精觀離することができ、例えば、得ら れたファージを TM溶液 (lOmM MgS04含有 50mM Tris-HCl緩衝液、 pH7. 8 ) などに 懸濁し、 DNase Iおよび Ti ase Aなどで処理後、 20mM EDTA、 50 g/ml Protein ase K及び 0. 5 %SDS混合液などを加え、約 65°C、約 1時間保温した後、 これを フエノール抽出ジェチルェ一テル抽出後、 エタノール により DNAを¾¾させ 、 次に得られた DNAを 70%エタノーノレで洗浄後皐 喿し、 TE溶液 (lOmM EDTA含有 lOmM Tris-HCl緩衝液、 pH8. 0 ) に溶解するなどして得られる。 また、 目的とし ている DNAは、 サブクロ一ニングなどにより^ Λに得ることも可能であり、例え ばサブクローニングは、宿主として^昜菌を用いプラスミドベクターなどを用い て行うこと力くできる。 こうしたサブクロ一ニングにより得られた DNA も、上記と 同様にして遠心分離、 フエノール抽出、 エタノール ¾Sなどの方法により精製分 離でさる。
上記のようにして、 ヒ卜の MT1- MMP DNA, TIMP-2 DNA, MMP-2 DNA, 神 ^^長因 ^容体 (NGFR) DNA、 それらの を含むキメラ DNAなどが得られる。 その他 必要に応じて、所望のポリペプチドをコードしている DNAなどの核酸を得ること 力できる。本発明に従って、例えば角蝶領歐損 FLAGェピトープ働口されたヒト MT1-MMP DNA, PEX欠損 FLAGェピトープ働卩されたヒト MT1-MMP DNA, FLAGェピト 一プ ¾口されたヒト MT1 - MMP DNA と NGFR DNAとのキメラ変異体， 角 #某領歉損 FL AGェピトープ^ t口されたヒト ΜΠ- MMP DNA と NGFR DNAとのキメラ変異体， PEX欠 損 FLAGェピト一プ働口されたヒト MT1- MMP DNA と NGFE DNAとのキメラ変異体， Me t プラス MT1- MMPの Cys3 3 6から Gly5 5 °までをコードする DNAなどが得られる。 代 表的なキヌラ変異体としては、 ヒト MT1- MMPの TM/CPを NGFEの TM/CPで置換され ているもの力挙げられる。 本発明で得られた核酸は、一本鎖 DNA、 Z^ilDNA、 ENA、 DNA:RNAハイプリ ッド、合成 DNAなどであり、 またヒトゲノム DNA、 ヒトジヱノミック DNAライブ ラリー、 ヒト組織'細胞由来の cDNA、合細 Aのいずれであってもよい。該核酸 は、 また本明細書で具体的に開示された特徴的な配列を有するものにストリンジ ェントな条件下にハイブリダイズするものであつてよい。該核酸は、所望の夕ン パク質をコードするように、 その塩基配列は、上記したように、遺 ^組換え技 術など当業者に知られた方法で修飾（例えば、ィ 口、 除去、 置換など） される。 遺伝 且換え技術は、例えば J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, " Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition) , Cold Spring Harbo r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)； D. M. Glover et al. ed. , "DNA Cloning" , 2nd ed. , Vol. 1 to 4, (The Practical Approach S eries), IRL Press, Oxford University Press (1995)；日本生化学会編、 Γ¾ 化学実験講座 1、遺 fe^研究法 IIJ、棘化学同人（1986) ;日本生化学会編、 「 亲斤生化学実,験言奪座 2、核酸 III (組換え DNA技術） 」、 化学同人 (1992) ; R . Wu ed.， Methods in Enzymology， Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic P ress, New York (1980)； R. Wu et al. ed.， lethods in Enzymology , Vol. 1 00 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic P ress, New York (1983)； E. Wu et al. ed.， lethods in Enzymology" , Vol. 1 53 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recom binant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)； J. H. Miller ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991)； E. W u et al. ed.， "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New Yor k (1993)； S. Weissman (ed. )， "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999)； J. C. Glorioso et al. (ed. ), lethods in Enzymo logy", Vol. 306, Academic Press, New York (1999)などに言己載の方法あるいは そこで弓 ί用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法 により行うこと力できる （それらの中にある記載はそれを参照することにより本 明細書の開示に含められる） 。 塩基配列の決定は、 ダイデォキシ法、例えば M13ダイデォキシ法など、 Maxam- , Gilbert法などを用 、て行うことができるカ^市販のシークェンシングキット、 例えば Taqダイプライマーサイクルシークェンシングキット、 Sequenase v 2. 0 kitなどを用いたり、 自 基配列決趨置、例えば蛍 ¾DNA シーケンサ一装置 などを用いて行うことが出来る。 ダイデォキシ法に用いられるポリメラ一ゼとし ては、例えば、 DNAポリメラ一ゼ Iのクレノー ·フラグメント、 AMV逆転写 、 Taq DNA ポリメラ一ゼ、 T7 DNAポリメラーゼ、修飾 T7 DNAポリメラ一ゼなど 力挙げられる。 本発明で得られた DNA断片を、下記で詳しく説明するような適当なベクター、 例えば、 プラスミ ド pEX、 pMAMneo、 pKG5、 pET3a (Stratagene) などのベクタ —に組込み、下記で詳しく説明するような適当な宿主細胞、例えば、 昜菌、酵 母、 CH0細胞、 COS細胞などで発現させること力できる。 また、該 DNA断片は、 そのままあるいは適当な制御配列を カロした DNA断片として、 または適当なべク 夕一に組込み、 そして動物などの細胞に導入すること力できる。所定の遺 feiを 発現するトランスジエニック動物を作成することもできる。動物としては、哺乳 動物が挙げられ、例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 モルモット、 ゥシなどが挙 げられる。 好ましくは、 マウスなどの動物の受精卵に該 DNA断片を導入して、 ト ランスジェニック動物を作成することカできる。 その方法は当業者に知られた方 法、例えば、 米国特許明細書第 4736866号、 同第 4870009号等に記載された方法 に従い行うこと力できる。 定の遺 産物の確認を、 当該遺 fe^をトランスフエクシヨンした COS- 1細 胞、 Η 080細胞などのそれに適した、鹏由 田胞を含む動物細胞などを用いて 行うことができる。 この外来遺^を哺 L®物などの動物細胞に導入する方法と しては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことが でき、 例えばリン酸カルシウム法 （例えば、 F. L Graham et al. , Virology, 5 2: 456, 1973など） 、 DEAE- デキストラン法 （例えば、 D. Warden et al. , J. G en. Virol. , 3: 371, 1968など） 、 エレクト口ポレーシヨン法 （例えば、 E. Neu mann et al.， EMBO J, 1: 841, 1982 など） 、 マイクロインジェクション法、 リ ポソ一ム法、 ウィルス感染法、 ファージ粒子法などが挙げられる。 こうして所定 の遺^をトランスフエクシヨンされた動物細胞の^する遺 fe?産物は、 それ を角?！斤することもできる。 角晰には、 例えば、 モノクローナル抗体などの抗体を 用いた^^沈降実験あるいはウェスダンプ口ッティングなどを用いることができ る 戸定の遺ィ を組込むプラスミ ドとしては遺 fe?工学的に常用される宿主細胞 列えば、 枯草菌等の原 ¾1圆包宿主、 酵母、 CH0細胞、 COS細包等の真 揚田胞宿主、 Sf21等の昆虫細胞宿主） 中で該 DNA力く発現できるプラスミ ドであれ ばどのようなプラスミ ドでもよい。 こうした配列内には、 例えば選択した宿主細 胞で発現するのに ¾1なコドンに修飾されていること力できるし、 制限自部位 力設けられていることもできるし、 目的とする遺 feiの発現を容易にするための 制御配列、 促進配列など、 目的とする遺^ fを結合するのに役立つリンカ一、ァ グプタ一など、 さらには ί 物質耐性などを制御したり、代謝を制御したりし、 どに有用な配列等を含んでレ、ること力くできる。
好ましくは、 適当なプロモータ一、 例えば 昜菌を宿主とするプラスミ ドでは
、 トリブトファンプロモータ一 (trp) 、 ラクトースプロモーター（lac) 、 トリプ トフアン ·ラクトースプロモータ一 (tac) 、 リポプロテインプロモーター（lpp) 、 スファ一ジ PL プロモータ一等を、 動物細胞を宿主とするプラスミ ドでは、 SV 40レ一トプロモーター、 MMTV LTRプロモータ一、 RSV LTR プロモータ一、 CMV プ 口モータ一、 S R aプロモーター等を、酵母を宿主とするプラスミ ドでは、 GAL1 、 GAL10 プロモータ一等を麵し得る。 さらに CYC1, HIS3, ADH1, PGK, PH05, G APDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TP1, A0X1等の制御系を使用することもで きる。
所望ポリぺプチドをコ一ドする DNAのトランスクリプションを促進するためェ ンハンサ—をベクターに挿入すること力でき、 そうしたェンハンサ一としてはプ 口モーターに働いてトランスクリプションを促進する作用を持つ、通常おおよそ
10〜： LOO bpの cis作用を持つエレメントのもの力く挙げられる。 多くのェンハンサ —が、 グロビン、 エラスターゼ、 アルブミン、 フエトプロテイン、 インシュ リンなどの哺孚 Lid物遺 fe^から知られている。 代表的には、 真機田胞感染!"生ウイ ルスから得られるェンハンサーカ ¾1に使用でき、 例えばレプリケーシヨンオリ ジンのレート頁域にある SV40ェンハンサー （100-270 bp), サイトメガロウィル スの初期プロモーターのェンハンサー， ポリオ一マのレプリケーシヨンオリジン のレート^ I域にあるェンハンサ一， アデノウイルスのェンハンサーなどの例力挙 げられる。 また、必要に応じて、 宿主にあったシグナル配列を^ U口することもで き、 それらは当業者によく知られているものを翻できる。 昜菌を宿主とするプラスミ ドとしては、 例えば pBR322、 pUC18 、 pUC19 、 pUC118、 pUC119、 pSP64、 pSP65 、 pTZ- 18E/- 18U、 pTZ-19B/-19U、 pGEM - 3、 pGEM-4, pGEM-3Z、 pGEM-4Z、 pGEM- 5Zf (-) 、 pBluescript IS™ (Stratagene) などが挙げられる。 昜菌での発現に適したプラスミ ドベクタ一としては、 pAS
、 pKK223 (Pharmacia), pMC1403、 pMC931、 pKC30、 pRSET-B (Invitrogen)など も挙げられる。 動物細胞を宿主とするプラスミ ドとしては、 SV40ベクター、 ポリ ォーマ .ウィルスベクター、 ヮクシニア ·ゥィルスべク夕一、 レトロウィルスべ クタ一などが挙げられ、 例えば pcD、 pcD SR 、 CDM8、 pCEV4、 pME18S、 pBC12B I 、 PSG5 (Stratagene) などが挙げられる。 酵母を宿主とするプラスミ ドとして は、 Yip型ベクター、 YEp型べクタ一、 YKp型べクタ一、 YCp型ベクターなどが 挙げられ、 例えば pGPD-2などが挙げられる。 宿主細胞としては、宿主細胞が 昜 菌の場合、 例えば:^昜菌 K12株に由来するものが挙げられ、例えば 1533 XL1-B1 ue， C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5 , DH10B, HB101, MC1061, JM109, S TBL2, BL21(DE3)/pLysSなどが挙げられる。 宿主钿胞が酵母の 、例えば Sac charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichia pastoris, Kluy veromyces株， Candida, Trichoderma reesia, その他の酵母株など；^挙げられ る。 宿主細胞が動物細胞の場合、 例えばアフリカミ ドリザル線 細胞由来の CO S-7細胞、 COS-1 , CV— 1細胞、 ヒト腎細胞由来 293細胞、 ヒト¾ ^細胞由来 A431細胞、 ヒト結腸由来 205細胞、 マウス糸泉雉菊田胞由来の COP細胞、 MOP細胞 、 W0P細胞、 チャイニーズ ·ハムスター細胞由来の CH0細胞、 CHO DHFR-細胞、 ヒト HeLa細胞、 マウス細胞由 127細胞、 マウス細胞由 *NIH 3T3細胞、 マウス L細胞、 9Bffi、 HL-60、 U937 、 Ha 、 Jurkat細胞、 その他の开須車云換されて得 られたセルライン、通常の二倍 田胞、 インビトロの一次培養組織から誘導され た細胞株などが挙げられる。 昆虫細胞としては、 カイコ核多角体病ウィルス （Bo mbyx mori nuclear polyhedrosis virus) 、 それに由来するものあるいはその他 の適切なものをヘクターとし、 Spodopt'era frugiperda (caterpillar), Aedes a egypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster ( f ruiぱ ly) , 力ィコ幼虫あるいはカイコ培猶田胞、例えば - N細胞などを用 ヽる こと力く挙げられる （例えば、 Luckow et al.， Bio/Technology, 6, 47-55 (1988) ； Setlow, J. K. et al. (eds), Genetic Engineering, Vol. 8, pp. 277-279, P lenum Publishing, 1986; Maeda et al.， Nature, 315, pp. 592-594 (1985))。 Agrobacterium tumefaciensなどを利用して、植物細胞を宿主細胞として使用す ることも可能であり、 それに適するベクタ一と共に、 それらは当該分野で広く知 られている。 本発明の遺 fe?工学的手法にお ヽては、 当該分野で知られたあるいは汎用され ている制限 «、逆転写 ¾¾、 DNA断片をクローン化するのに適した構造に修飾 したりあるいは変換するための である DM修飾 ·分角?^、 DNAポリメラー ゼ、 耑ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、 DNA リガーゼなどを用いることが 出来る。制限醒 しては、例えば、 R. J. Roberts, Nucleic Acids Res. , 13: rl65, 1985; S. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor La b. , Cold Spring Harbor, New York, 1982； R. J. Roberts, D. Macelis, Nucle ic Acids Res. , 19: Suppl. 2077, 1991などに記載のもの力く挙げられる。逆転写 ¾としては、 例えばマウスモロネィ白 itofウィルス （mouse Moloney leukemia virus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse transcriptase)、 ニヮトリ骨髄芽球 症ウィルス （avian myeloblastosis virus; AMV)由来の逆転写 ¾など力挙げら れる。 逆転写鍵は、 RNase H欠損体などは好ましく用いること力くでき、 特には ENase H活性を欠いた修飾 MMLV RT力く好ましく棚でき、 さらには熱安定性の高 いものが好ましい。 適した逆転写薩としては、 MMLV RT (Gibco-BRL)、 Supers cript RT plus (Life Technologies) など力挙げられる。
DNA ポリメラーゼとしては、例えば 昜菌 DNA ポリメラーゼ、 その誘 ¾ (本であ るクレノウ 'フラグメント、 ^菌ファージ T4 DNAポリメラーゼ、 昜菌ファー ジ T7 DNAポリメラ一ゼ、 耐熱菌 DNA ポリメラーゼなどが挙げられる。 末端ヌクレ ォチジルトランスフヱラ一ゼとしては、例えば . Wu et al. ed.， "Methods in Enzymology" , Vol. 100, p. 96, Academic Press, New York (1983) に言 3載の 3' -OH にデォキシヌクレオチド (dNMP) ^ J口する TdTaseなどが挙げられる。 DN A修飾 ·分角? としては、 ェキソヌクレアーゼ、 ェンドヌクレア一ゼなどが挙 げられ、例えばへビ毒ホスホジエステラーゼ、 脾臓ホスホジエステラーゼ、： m 菌 DNAェキソヌクレア一ゼ I、 昜菌 DNAェキソヌクレアーゼ III 、 昜菌 DNA ェキソヌクレアーゼ VII、 スェキソヌクレアーゼ、 DNase I、 ヌクレア一ゼ Sl、 ミクロコッカス' (Micrococcus) ヌクレア一ゼなどが挙げられる。 DNA リガーゼ としては、 例えば:^昜菌 DNA リガーゼ、 T4 DNAリガーゼなどが挙げられる。
DNA遺 fe^をクローニングして DNA ライブラリ一を構築するのに適したべクタ 一としては、 プラスミ ド、 スファージ、 コスミ ド、 P1ファージ、 F因子、 YACな どが挙げられ、 好ましくはスファージ由来のべク夕一力挙げられ、 例えば Charon
4A、 Charon 21A、 A gtlO, A gtl DASHII, ス FIXII、 A EMBL3、 A ZAPII ™ (Stratagene) などが挙げられる。 本発明の夕ンパク質をコ一ドする核酸を含有する発現ベクターで形質転換され た形質転換体は、 ^に応じて適当な選択マーカ一を用い、繰り返しクローニン グを行うことにより、 高し、発現能を安定して有する細胞株を得ること力くできる。 例えば、宿主钿胞として動物細胞を用いた形質転換体において、 dhfr遺 を選 択マーカ一として利用した j#^、 MTX '藤を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択 することにより、本発明のタンパク質をコードする DNAを増幅させ、 より高い発 現を得られる細 S繊を得ること力できる。本発明の形辯云換体は、本発明のタン パク質をコードする核酸が発現可能な条件下で培養し、 目的物を^^、薪貴せし めることができる。該形難云換体は、 当該分野で汎用されている培地中で培養す ること力くできる。 伊 jえば、 - m,枯草菌等の原; 細胞宿主、酵母などを宿主と している形 MI云換体は、謝 *ί咅地を ¾ に■することができる。 培地中には、 該形質転換体の生育に必 な炭素源、 窒素源、無機物その他が含有せしめられる 。 炭素源としては、 たとえばグルコース、 デキストリン、可溶性^!分、 ショ糖な ど、 窒素源としては、 たとえばアンモニゥム 、 m , コーンスチープ' リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 (¾エキス、 ^エキス、大豆粕、ノ《レイショ抽出 液などの無機または有 β質、.無嫩勿としては， 例えば、塩化カルシウム、 リン 酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。 ま た、酵母、 ビタミン類、 カザミノ酸、生長促進因子などを添加してもよい。 また
、」避によりプロモーターを効率よく働力、せるために、例えば、 3 ^—インドリ ル ァクリル酸のような薬剤をカロえることができる。培地の ρ Ηは約 5〜 8力く望 ましい。 培養は、例えば^ 菌では通常約 〜 45°Cで約 3〜75時間行い、必要により、 通気や攪拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する 際、培地としては、 たとえば約 5〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地、 PRMI1640 培地、 MEM培地などが用いられる。 ρΗ〖ま約 6〜8であるの力 子ましい。培養は通 30°C〜40°Cで約 15〜72時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
得られた纏 び培養液はそれをそのまま使用すること力できる。
上記培養細胞から所 物を抽出するに際しては、培獵、公知の方法で菌 体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、 リゾチームおよ び Zまたは凍結謹旱などによつて菌体ぁるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や ろ過により粗抽出液を得る方法などを; ¾g用いること力できる。緩衝液の中には 尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白変性剤や、 トリ トン X- 100 (商品名） 、 ッウイ —ン- 80 (商品名） などの界面活' |4¾を加えてあってもよい。培養液中に目的生 成物が分泌される場合には、培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細 胞と上清とを分離し、上清を集める。 このようにして得られた培 ¾_t清、 あるい は抽出液中に含まれる目的賊物は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わ せてその精製を行なうこと力でき、例えば硫酸ァンモニゥム沈殿法などの塩析、 セフアデックスなどによるゲルろ過法、例えばジェチルァミノェチル基あるいは 力ルボキシメチル基などを持つキ旦体などを用いたィォン交換ク口マトグラフィー 法、例えばプチル基、ォクチル基、 フエニル基など ¾7W生基を持つ担体などを用 、た疎水 f生ク口マトグラフィ一法、 色素ゲルク口マトグラフィ一法、電気泳動法
、 透析、 11^ろ過法、 ァフィ二ティ ·クロマトグラフィー法、高速液体クロマト グラフィ一法などにより精製して得ること力できる。好ましくは、 ポリアクリル アミドゲル電気永動、 モノクローナル抗体などの と特異的に反応する抗体な どを固定ィ匕したァフィ二ティ― ·ク口マトグラフィ一などで処理し精製分离隹処理 できる。例えば、 ゼラチンーァガロース'ァフィ二ティ一 'クロマトグラフィー 、 へパリンーァガロース ·クロマトグラフィ一などが挙げられる。 本発明に従い、 MT1 - MMP とプロ MMP-2 との共存する系を^ fflして MT1-MMPの複 数からなる複合体、例えば MT1- MMPの単純二量体形成を阻害する物質のスクリ一 ニンク、'方法が提供される。例えば MT1-MMPOTM/ CPを NGFRの TM/CPに置換してあ るキメラ分子 (その好を発現する形 K云換 #剛包あるいはその培難を含む） を翻して、 MT1 - MMPの単純二量体形成作用を阻害する物質のスクリーニングを 行うことができる。
該スクリーニングでは、例えば ¾!- MMPの TM/ CPを NGFEの TM/CPに置換してあ るキメラ好を発現する形質転換 細胞あるいはその培建を使用し、 （i)試験 試料の しない と、 （ii)試験試料を撤虫させた: ^との間で、 当該キメラ におけるリン酸化につきその比較を行う。 その他、上記スクリーニングでは 、 当該生物学的活性（例えば、 プロテアーゼ活性、 MT1-MMPの単純二量体形成が 弓 Iき起こすプロ MMP- 2の活性化、 あるいはそれに起因する細胞の移動、 浸潤及び Z又は車云移など） を測定して、比較することもできる。
キメラ^ ^は、 そのまま使用できるカ^ フルォレツセインなどの蛍光、 ^
¾寸性物質などで標識したものでも使用できる。 DNA組換え技術を使用して適当 なタグを働口したものあるいは化学的な手法で標識を働口したものも好適に删 できる。 リン酸化の測定は当該分野で知られた手法で行うこと力でき、例えば抗 ホスホチロシン抗体などで NGFRの TM/CP部分に生ずるチロシン残基のリン酸化を 検出する方法が挙げられる。試験試料としては、例えばタンパク質、 ペプチド、 非べプチド性ィヒ合物、合成化合物、発酵生産物、植辦由出物、動物などの組 ϋ抽 出物、細胞抽出物などが挙げられる。試験試料に使用される試験化合物の例には 、好ましくは I»抗体、 MMP ΜΜΡ ファミリ一に対するインヒビター活 性を有する化合物、特には合成化合物を含んでいてよい。特に好ましぐは、 tnP X抗体、擬 PEXィ匕合物などが挙げられる。 これら化合物は、新規な化合物であつ てもよいし、公知のィ匕合物であってもよい。該スクリーニングは、 当該分野で知 られた測定法に準じて実施すること力できる。 また、下記の抗体を^ fflしての測 定法において説明した、各種標識、緩衝液系その他適当な試薬等を したり、 そこで説明した操作等に準じて行うことができる。測定は通常トリス塩酸緩衝液 、 リン^ t緩衝液などの反応に悪 I灣を与えないような緩衝液等の中で、例えば 、 pH 4〜10 (好ましくは、 pH約 6〜 8 ) にお 、て行うこと力くできる。
これら個々のスクリーニングにあたっては、 それぞれの方法における通常の条 件、操作法に当業者の通常の技術的酉 atを加えて、本発明の n-MMPの複合体形 成に関連した測定系を構築すればよい。 これらの 的な技術手段の詳細につ ヽ ては、総説、成書などを参照すること力できる 〔例えば、 Methods in Enzymolog y, Vol. 1， 2, 5 & 6 (Preparation and Assay of Enzymes)； 同鲁， Vol. 3 (Pr eparation and Assay of Substrates)； |口層, Vol. 4 (Special Techniques for the Enzymologist)； 同書， Vol. 19 (Proteolytic Enzymes)；同書， Vol. 45 (P roteolytic Enzymes, Part B) ；同書， Vol. 80 (Proteolytic Enzymes, Part C ) (以上、 Academic Press社（USA)発行） など参照〕 。 本明細書中、 「抗体」 との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく 、所望の PEX領域タンパク質断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各 種ェピトープに対する特異性を持つ抗体糸誠物であってよく、 また 1価抗体また は多価抗体並びにポリク口一ナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり 、 さらに天然 (intact)^並びにそれらのフラグメント及び誘 ί本も表すもの であり、 F(ab' ) 2， Fab' 及び b といったフラグメントを包含し、 さらに少なく とも二つの！^又はェピト一プ（epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは 雑 S¾体、又は、例えば、 クヮドローム (quadrome) , トリオ一ム（triome)などの 二重特異 組換え抗体、種間雑難体、抗イディォタイプ抗体、 さらには化学的 に修飾あるいは加工などされてこれらの誘 と考えられるもの、 口の細胞融 合又はハイプリドーマ技術や抗本工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を mして得られた抗体、抗本«の観点から公知である従来技術を適用したり、
DNA組換え技術を用いて調製される抗体、.本明細書で記載し且つ定義する標的抗 原物質ある 、は標的ェピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特 性を有する抗体を包含して L、てよ ヽ。 ί¾ 物質に対して ^されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルライ ンにより抗体 子の^を提供することのできる任意の方法を用いて産生される 。修觸吾「モノクローナル」 とは、実質上均質な抗体の集団から得られていると ヽうその抗体の性格を示すものであつて、何ら力、の特定の方法によりその抗体が される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、 自 然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという 以外は、 同一であるような抗体の集団を含んで ヽるものである。 モノクローナル 抗体は、高い特異性を持ち、 それは単一の ί¾ 性をもつサイトに対して向けられ ているものである。異なった (ェピトープ） に対して向けられた種々 の抗体を典型的には含んでいる通常の （ポリクロ一ナル） 抗 製物と対比する と、 それぞれのモノクロ一ナル抗体は当該 i¾^_hの単一の に対して向 けられているものである。 その特異性に加えて、 モノクローナル抗体は、ハイブ リドーマ培養により合成され、他のィムノグロブリン類の 5¾1がないあるいは少 なレ、点でも優れて 、る。 モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビ ナント抗体を含むものである。 それらは、所望の生物活性を示す限り、 その由来 やィムノグロブリンクラスやサブクラスの種 gijに関わりなく、可変 H域ドメイン を定常領域ドメインで置き換えたり （例えば、 ヒト化抗体） 、 あるいは繊を重 鎖で置き換えたり、 ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、 あるいはへ テロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる （例えば、 米国特目午第 4816567号； onoclonal Antibody Production Techniques and Appl ications, pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987 など)。
モノクローナル抗体を製造する女¾1な方法の例には、ハイプリドーマ法（G. K ohler and C. Milstein, Nature, 256， pp. 495-497 (1975)) ; ヒト B細胞ハイブ リドーマ法（Kozbor et al.， Immunology Today, 4, pp. 72-79 (1983)； Kozbor,
J. Immunol. , 133, pp. 3001 (1984)； Brodeur et al.， Monoclonal Antibody P roduction Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. , Ne w York (1987)；トリオ一マ法； EBV-ハイプリドーマ法（Cole et al. , Monoclone 1 Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96 (1985)) (ヒ トモノクロ一ナル抗体を するための方法)；米国特許第 4946778号（単鎖抗体 の のための技術) が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる： S. Biocca et al.， EMBO J， 9， pp. 101-108 (1990)； . E. Bird et al. , . Scienc e, 242, pp. 423-426 (1988)； M. A. Boss et al.， ucl. Acids Res. , 12， pp. 37 91-3806 (1984)； J. Bukovsky et al.， Hybridoma, 6， pp. 219-228 (1987)； M. DAINO et al.， Anal. Biochem.， 166, pp. 223-229 (1987)； J. S. Huston et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883 (1988)； P. T. Jones et al. ， Nature, 321, pp. 522-525 (1986)； J. J. Langone et al. (ed. )， "Methods in
Enzymology" , Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Tec hnology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986)； S. Morrison et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-6855 (1984)； V. T. Oi et al.， BioTechniques, 4, pp. 214-221 (1986)； L Riechmann et al. , Nature, 332, pp. 323-327 (1988)； A. Tramontano et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 6736-6740 (1986)； C. Wood et al. , Nature, 314, pp. 446-4 49 (1985)； Nature, 314, pp. 452-454 (1985) あるいはそこで弓 I用された文献 ( それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる
) o 本発明に係るモノクローナル抗体は、それら力所望の生物活性を示す限り、重 舰び/又は纏の が特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しく はサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモ口ガスであるカ^一方、鎖 の残部は、 別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属す る抗体の対応配列と同一又はホモ口ガスである、 「キメラ」抗体 （ グロブリ ン） を特に包含する （米国特許第 4816567号明細書； Morrison et al.， Proc. N atl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-6855 (1984)) 。
以下、 モノクローナル抗体を例に挙げて、抗体の にっき詳しく説明する。 本発明のモノクロ一ナル抗体は、 ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利 用して得られたモノクロ一ナル抗体であってよく、例えば次のような工程で欄 できる。
1. ^^性腿の調製
2. ^^性 t¾ による動物の:^
3. ミエ口一マ細胞（骨髄鼸田胞） の調製
4. 抗体産生細胞とミエ口一マ細胞との細胞融合
5. ハイプリドーマ （雷虫 ^田月包） の選 びモノクローンィ匕
6. モノクローナル抗体の製造
1 · 鞭原性観の調製
iJ ^としては、上記で記載してあるように、 MT1-MMPの PEX領域のタンパク質 断片又はそれから誘導された断片を単離したものを用いることもできるカ^配列 ^されている MT1 - MMPの PEX領域のアミノ酸配列の情報 (GenBankT EMBL ,,acce ssion number: D26512) を基に、適当なオリゴペプチドをィ b ^合成しそれを i¾ として利用することができる。 ίίϊ ^は、 そのまま適当なアジュバントと混合して 動物を^ ¾するのに使用できる力、 性コンジユゲートなどにしてもよい。 搬原として用いる ¾¾¾は、 MT1 - ΜΜΡの ΡΕΧ領域（例えば、 MT1-MMPのアミノ酸 配列中、 316 - 508位のアミノ酸配列領域、 によっては 319- 535位のアミノ酸 配列領域） から連続した少なくとも 3個のアミノ膨 «を選択したものであって よい。例えば、 MT1-MMPの ΡΕΧを断片化したもの、 あるいはそのアミノ酸配列に 基づき衛敷的な配列領域を選び、 ポリぺプチドをデザィンして化学合成して得ら れた合成ポリペプチド断片であってもよい。 また、 その断片を適当な縮合剤を介 して種々の担体タンパク質類と結合させてハプテン一タンパク質の如き^ ^性 コンジュゲートとし、 これを用いて特定の配列のみと できる （あるいは特定 の膨リのみを認識できる） モノクローナル抗体をデザィンするのに用いることも できる。 デザインされるポリペプチドには予めシスティン残基などを働口し、免 麵性コンジユゲー卜の調製を容易にできるようにしておくこと力できる。担体 タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず活性化される ことができる。 こうした活性化にあたり活性化結合基を導入すること力挙げられ る。
活性化結合基としては、 （1) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、 例えばニトロフエニルエステノレ基、 ペンタフルオロフェニルエステル基、 1-ベン ゾトリアゾールエステル基、 N -スクシンイミ ドエステル基など、 （2)活性化ジチ ォ基、例えば 2-ピリジルジチォ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては 、 キーホール' リンぺット ·へモシァニン （KLH)、牛 青アルブミン （BSA)、卵 白アルブミン、 グロプリン、 ポリリジンなどのポリぺプタイド、細菌菌体成分、 例えば Gなどが挙げられる。
• 2. 原性 ¾ による動物の
繊は、 当業者に知られた方法により行うことができ、例えば村松繁、他編、 実胜物学講座 14、 ^^物学、丸善株式会社、 昭和 60年、 日本生化学会編、 化学実験講座 5、 ^^化学研究法、棘化学同人、 1986年、 日本生化学会 編、新生化学実験講座 12、 髓学 III、 ί¾¾ ·抗体.捕体、棘化学同人 、 1992年などに記載の方法に準じて行うことができる。滅化剤を （^要に応じ アジバントと共に） 一回又はそれ の回数哺¾1¾物に注射することにより搬 化される。 代表的には、該^ ¾化剤及び/又はアジバントを哺 力物にネ鐵回皮 下 ¾|ォあるいは腹腔内注射することによりなされる。 «ィ IJは、上記 ί¾Ιぺプ チド又は DNA クローニングして得られるリコンビナントの MT1-MMPやそのリコン ビナントの MT1 - ΜΜΡの ΡΕΧタンパク質あるいはそれを 消化して得られた断片 を含むもの力挙げられる。 化剤は、 処理される哺 Lfj物において^^ 性であることの知られているタンパク質（例えば上記担体タンパク質類など） と コンジュゲートを形成せしめて使用してもよい。 アジュバントとしては、例えば フロイント^:アジュバン卜、 リビ (Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、 BCG 、 リボソーム、水酸ィ匕アルミニウム、 シリカ、 リピッ ド八、合成トレハロース ' ジコリノミコレート（TM) アジュバントなどが挙げられる。 は、例えば BALB んなどのマウス、ハムスター、 その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の 投与量は、例えばマウスに対して約 1〜400 z g/動物で、 ~ には宿 if)物の 騸空内や皮下に注射し、以後 1 ~ 4週間おきに、好ましくは 1〜2週間ごとに腹 腔内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に渤ロ滅を 2〜10回離反復して行う。免 疫用のマウスとしては BALB/c系マウスの他、 BALB/c系マウスと マウスとの F1 マウスなどを用いることもできる。必 に応じ、抗体価測 を調製し、抗体価 を測定して動物 の禾! ¾を石鶴忍できる。 本発明の抗体は、 こうして得られ された動物から得られたものであってよく、例えば、 ί¾ίϋ清、 ポリクロ一ナル抗 # ^を包含する。
3. ミエローマ細胞 （骨髄翻包） の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株（β細胞株） としては グロブリン を戲しない細胞株から選ぶことができ、例えば Ρ3 - NS- 1- Ag4 - 1 (NS-1, Eur. J. Immunol. , 6: 511-519, 1976)、 SP - 2/0 - Agl4 (SP - 2, Nature, 276: 269 -27 0, 1978 )、 マウスミエ口一マ M0PC-21セルライン由来の P3- X63- Ag8- Ul (P3U1, Curr. topics Microbiol. Immunol. , 81: 1-7， 1978 ) 、 P3-X63-Ag8 (X63, Nature, 256: 495-497, 1975 )、 P3 - X63- Ag8 - 653 (653, J. Immunol. , 123: 1548-1550, 1979)などを用いることができる。 8-ァザグァニン而村生のマウスミェ 口一マ細胞株はダルベッコ MEM培地（DMEM培地） 、 RPMI-1640培地などの細 |S±咅 地に、例えばペニシリン、 アミカシンなどの ί姓物質、牛胎児血清 (FCS) などを 加え、 さらに 8—ァザグァニン （例えば 5〜45 g/ml) を加えた培地で継代され る力 細胞融合の 2〜 5日前に正常培地で継代して所 の細腿朱を用意するこ と力くできる。 また使用細胞株は、凍結保存株を約 37°Cで完全に解凍したのち EPM ト 1640培地などの正常培地で 3回 h洗浄後、正 ^±咅地で培養して所 の細胞 株を用意したものであってもよい。
4. 抗体^田胞とミエローマ細胞との細胞融合
上記 2. の工程に従い された動物、例えばマウスは最終 後、 2〜5日 後にその脾臓が摘出され、 それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所 のリンパ節細胞を得て、 それを細胞融合に i¾することもできる。 こうして得ら れた脾細胞懸濁液と上記 3. の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば 最小必須培地 (MEM培地） 、 DMEM培地、 RPMI 1640培地などの細 地中に置き、 細胞融合剤、例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、 この他各種当該分野で知られたものを用いること力くでき、 この様なものとしては 不活性化したセンダイウィルス (HVJ: Hemagglutinating Virus of Japan)なども 挙げられる。好ましくは、例えば 30〜60%のポリェチレングリコールを 0. 5〜 2 ml加えること力くでき、 量が 1, 000-8, 000のポリエチレングリコールを用い ること力でき、 さらに 量が 1， 000-4, 000のポリェチレングリコ一ノレがより 好ましく^ ^できる。 融合培地中でのポリエチレングリコールの' asは、例えば
30〜60%となるようにすること力 子ましい。必 に応じ、例えばジメチルスルホ キシドなどを少 口え、融合を促進することもできる。 融合に する脾細胞 ( リンパ球） ： ミエ口一マ細胞株の割合は、例えば 1: 1〜20:1とすること力く挙げら れるが、 より好ましくは 4: 1〜7: 1 とすること力できる。
融合反応を；!〜 10分間行い、次に RPMI- 1640培地などの細胞培地を加える。融 合反応極はネ纖回行うこともできる。融合反応 理後、遠心などにより細胞を 分離した後選択用培地に移す。
5. ハイプリ ドーマ （融合細胞） の選概びモノクロ一ンィ匕
選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、 アミノプテリン及びチミジンを 含む、 FCS含有 MEM培地、 RPMI-1640培地などの ί咅地、所謂 ΗΑΤί咅地が挙げられ る。選択培地交換の方法は、 Η¾的には培養プレートに分注した容量と等容量を 翌日加え、 その後 1〜3日ごとに HAT培地で半量ずつ交換するというように処理 すること力できる力 適宜これに ¾Mを加えて行うこともできる。 また融合後 8 〜16日目には、 アミノプテリンを除いた、所謂 HTi咅地で:!〜 4日ごとに培地交換 をすること力くできる。 フィ一夕"一として、.例えばマウス胸腺細胞を翻すること もでき、 それが好ましい齢がある。
ハイプリドーマの増殖のさ力、んな培養ゥエルの培^ h清を、例えば放射搬分 析 (RIA) 、纏搬分析 (ELISA) 、蛍 m¾分析 (FIA) などの測定系、 あるいは 蛍光惹起钿胞分離装置 (FACS)などで、戸定の断片べプチドを として用いたり 、 あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、 スクリ一二 ングしたりする。
目的抗体を産生しているハイプリドーマをクロ一ニングする。 クローニングは 、寒天培地中でコロニーをピック ·アップする力、、 あるいは限界希釈法によりな されうる。 限界希釈法でより好ましく行うこと力できる。 クロ一ニングは複数回 行うこと力 子ましい。
6. モノクローナル抗体の^
得られたハイプリドーマ株は、 FCS含有 MEM培地、 RPMI-1640培地などの適当 な増殖用培地中で培養し、 その培¾±清から所望のモノク口一ナル抗体を得るこ と力出来る。 の抗体を得るためには、ハイプリドーマを腹水化すること力く挙 げられる。 この ミエ口一マ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内 に各ハイプリドーマを移植し、増殖させるか、 あるいは例えばヌード ·マウスな どに各ハイプリド一マを移植し、増殖させ、 Ml物の腹水中に されたモノク 口一ナル抗体を回収して得ることが出来る。動物はハイプリ ドーマの移植に ち、 プリスタン （2, 6, 10, 14-テトラメチルペン夕デカン） などの鉱物油を腹腔内 投与しておくこと力でき、 その処理後、ハイプリドーマを増殖させ、腹水を ¾ "又 することもできる。腹水液はそのまま、 あるいは ^ 口の方法、例えは硫酸ァ ンモニゥム ί?«法などの塩析、 セフアデックスなどによるゲルろ過法、 イオン交 換クロマトグラフィー法、 電気泳動法、透析、 ろ過法、 ァフィ二ティ ·クロ マトグラフィ一法、高速液体ク口マトグラフィ一法などにより精製してモノクロ —ナル抗体として用いること力できる。好ましくは、 モノクローナル抗体を含有 する腹水は、硫安分画した後、 DEAE—セファロ一スの如き、 陰イオン交換ゲル及 びプロティン Aカラムの如きァフィ二ティ ·カラムなどで処理し精製分离拠理で きる。特に好ましくは ί 又は觸断片（例えば合成べプチド、組換え ί¾ 夕ン パク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など） を固定化したァフ ィニティ 'クロマトグラフィー、 プロテイン Αを固定ィ匕したァフィ二ティ 'クロ マトグラフィ一、 ヒドロキシァハ。タイト ·クロマトグラフィーなどが挙げられる
また、 トランスジエニックマウス又はその他の生物、伊 ijえば、 その他の哺孚 カ 物は、本発明の^^原ポリペプチド産物に文†Tるヒト化抗ィ縛の抗体を発現する のに用いること力できる。
またこうして^ *に得られた抗体の配列を-^したり、 ハイプリドーマ株から 得られた抗体をコードする核酸配列を禾翻して、遺 fe¾fi換え技術により抗体を ^Kすることも可能である。 当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、例え ばマウス抗体の重鎖や «をコードしている遺^?に特異的に結合できるオリゴ ヌクレオチドプローブを使用するなどの慣用の手法で単離し配列 '^することが できる。一旦単離された DNA は、上記したようにして発現べクタ一に入れ、 CH0, COSなどの宿主細胞に入れることカできる。該 DNAは、例えばホモジーニアスな マウスの配列に代えて、 ヒ卜の重鎖ゃ輕臭の定常領域ドメィンをコ一ドする配列 に置換するなどして修飾すること力河能である （Morrison et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6581, 1984)。 力、くして所望の結合特異性を有するキメラ 抗体ゃハイブリツド抗体も調製すること力可能である。 また、抗体は、下記する ような縮合剤を用いることを含めた化学的な夕ンパク合成技術を適用して、 キメ ラ抗体やハイプリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。
ヒト化抗体は、 当該分野で知られた技術により行うこと力河能である （例えば ヽ Jones et al. , Nature, 321: pp. 522-525 (1986)； Eiechmann et al. , Nature ， 332: pp. 323-327 (1988) ; Verhoeyen et al. , Science, 239: pp. 1534-1536 ( 1988))。 ヒトモノクローナル抗体も、 当該分野で知られた技術により行うことが 可能で、 ヒトモノクローナル抗体を するためのヒトミエローマ細胞ゃヒト · マウスへテロミエローマ細胞は当該分野で知られている （Kozbor, J. Immunol. , 133, pp. 3001 (1984)； Brodeur et al.， Monoclonal Antibody Production Tec hniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. , New York (1987) ) o バイスべシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている （Mill stein et al. , Nature, 305: pp. 537-539 (1983)； W093/08829'; Traunecker et al. , EMBO, 10: pp. 3655-3659 (1991)； Suresh et al. , "Methods in Enzymolog y", Vol. 121, pp. 210 (1986))。
さらにこれら抗体をトリプシン、 ノ N°/、。ィン、ぺプシンなどの により処理し て、 i ^により還元して得られる Fab、 Fab'、 F(ab' ) 2 といった抗体フラグメン トにして使用してもよい。 本発明の活性^ 〔例えば、 (a) MT1-MMPの PEXタンパク質 (MT1PEX)、 その一 部のペプチドまたはそれらの塩、 あるいはその変異体、類縁体、誘導体等、 (b) 該 MT1- MMPの PEX領域をコードする DNAなどの核酸等、 (c)本発明の抗体、 その "^断片 （モノクローナル抗体を包含する） またはその誘 本、 (d) MT1-MMPの 単純二量体形成と 、つた生物学的活性を抑制及び/又は阻害する化合物またはそ の塩など〕 を医薬として用いる;^、例えは ¾T1PEXまたはそれらの塩等は、通常 単独或いは藤里的に許容される各 補助剤と混合して、 医薬組成物又は医薬 調製物などとして投与すること力できる。好ましくは、経口投与、局所投与、 ま たは非経口投与等の麵に適した豁 IJ調製物の形態で投与され、 目的に応じて 、 ずれの投与形態 （¾λ法、 あるいは劃昜投与も包含される） によってもよい。 また、本発明の活'« ^は、 ί¾®«剤及び/又は,移転阻 ¾¾¾と配合して使 用することもできる。 ί Μ剤ゃ鹏移転阻害剤としては、有利な働きを持つも のであれば制限なく使用でき、例えば当該分野で知られたものの中から選択する ことができる。 そして、非経口的な投与形態としては、局所、厳、静脈内、筋肉内、皮下、 皮内もしくは腹腔内投与を包含し得る力^患部への直 ί ^与も可能であり、 また ある場合には議でもある。 好ましくはヒトを含む哺孚園物に経口的に、 あるい は非経口的 （例、細胞内、組織内、静脈内、,筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、 内、脊髄腔内、点滴法、 ¾M、 ,点耳、点眼や点鼻、歯、颇や粘膜への 塗布など） に投与することができる。具体的な菌劍調 の形態としては、溶液 mu分 ¾ ¾、半固形 ¾、 mtitm m 浸出 m¾などが挙げられ 、例えば、錠剤、被難剤、糖衣を施した剤、 M トローチ剤、硬カプセル剤 、軟カプセル剤、 マイクロカプセル剤、 剤、粉末斉 ι]、 mu、 mmi m\ 、 寸剤、 M エリキシル剤、 ェマルジヨン剤、 シロップ剤、水剤、 孚 ij、懸濁剤、 リニメント剤、 ローション剤、 エアゾール剤、 スプレー剤、 ¾Λ 剤、 ^smu軟膏繊 I m 貼付剤、パスタ剤、 パップ剤、 クリーム剤、 油剤、 ^IJ (例えば、 園昜坐剤）、チンキ剤、頗用水剤、点職 (]、点鼻剤、点 耳剤、 輸被 ij、注射用液剤などのための粉末剤、凍結^ ゲル調 整品等が挙げられる。 隨用の,ゃ滅物は通常の方法に従って嫌 IJ化すること力できる。例えば、適宜 必要に応じて、生理学的に認められる担体、医薬として許容される担体、 アジュ バント剤、歸剤、捕形剤、希糖 IJ、香味剤、香料、甘味剤、 べヒクル、 防腐剤 、安定化剤、結合剤、 p H調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充塡剤、 増纏、溶解補助剤、可溶化剤、等張側、乳化剤、懸濁化剤、分翻、増粘剤 、 ゲル化剤、硬化斉' J、吸糊、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、 噴射剤、保存 剤、抗酸化剤、 保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、 無痛化剤などを稱虫もし くは組合わせて用い、 それとともに本発明のタンパク質等を混和することによつ て、 H ^こ認められた ¾実施に要求される単 態にして製造することが でさる。
非経口的棚に適した ¾¾としては、活« ^と、水もしくはそれ以外の薬学 的に許容し得る媒体との無菌性溶液、 または懸濁液剤など、例えば细寸剤等が挙 げられる。 的には、水、 : ¾^τΚ、 デキストロース水溶液、 その他関連した糖 の溶液、 エタノール、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ルなどのグ リコール類が好ましい注射剤用液籠体として挙げられる。注射剤を調製する際 は、蒸留水、 リンゲル液、生理:^]のようなキ旦体、適当な分散化剤または湿化 剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、溶液、懸濁液、エマ ルジョンのごとき注射しうる形に調製する。 注射用の水性液としては、例えば生理偷 ]、 ブドウ糖やその他の捕助薬 （例 えば、 D -ソルビトール、 D -マンニトール、塩化ナトリウムなど） を含む等張液な どが挙げられ、難的に許容される適当な溶解捕助剤、 たとえばアルコール （た とえばエタノールなど） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポ リエチレングリコールなど） 、非イオン性界面活隨 IJ (たとえばポリソルべ一ト 80™, HCO-50など） などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、 ^油な どが挙げられ、溶解捕助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと 併用してもよい。 また、 緩衝斉 U (例えば、 リン 緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝 液など）又は浸透圧調節のための試薬、無痛化剤（例えば、塩化べンザルコニゥ ム、塩酸プロ力インなど） 、安 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレ ングリコールなど） 、保 ij (伊 Jえば、ベンジルアルコーノレ、 フエノールなど） 、 ァスコルビン酸などの酸化防 it^J、吸収促進剤などと配合してもよい。調整さ れた注射液は通常、適当なアンプルに充塡される。 非経口投与には、界面活性剤及びその他の薬学的に許容される助剤を加えるか 、 あるいは加えずに、水、 エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容される 液体中の溶液ある 、は懸濁液の形態に S^iJ化される。纖 IJに使用される油性べヒ クノレあるいは'溶斉 Uとしては、 天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジ あるいはトリグリセリド類、 天然、半合成あるいは合成の油脂類あるいは脂肪酸 類が挙げられ、例えばピーナッツ油、 トウモロコシ油、大豆油、 ゴマ油などの植 物油が挙げられる。例えば、 この细寸剤は、通^ φ:発明化合物を 0. 1〜10重量％ 禾 ¾含有するように調製されることができる。
局所的、例えば口腔、又は圆昜的使用に適した S¾¾¾としては、例えば洗口剤、 歯磨き剤、 口腔 0麵剤、 ¾Λ剤、 軟膏剤、餅斗充塡剤、歯科コーティング ij、歯 科ペースト剤、 ^¾等が挙げられる。洗口剤、 その他餅斗用剤としては、薬理的 に許容される担体を用いて慣用の方法により調製される。 口腔 0l»ij、 ¾Λ剤と しては、本発明化合物自体又は藤里的に許容される不活性担体とともにエアゾー ノレ又はネブライザ一用の溶液に溶解させるかあるいは、 ¾Λ用微粉末として歯な どへ投与できる。軟膏剤は、通常^ fflされる基剤、例えば、軟膏基剤（白色ヮセ リン、パラフィン、 ォリーブ油、 マクロゴール 400、 マクロゴール軟膏など）等 を添加し、慣用の方法により調製される。 歯、歸への局所飾用の薬品は、適切に殺菌した水または非水膨剤の溶液 または懸濁液に調剤すること力できる。添加剤としては、例えば亜硫酸水素ナト リゥムまたはェデト酸ニナトリゥムのような緩 i 斉 1J；酢酸または硝酸フエニル水 銀、塩化ベンザルコニゥムまたはクロ口へキシジンのような殺菌および抗真菌剤 を含む防腐剤およびヒプロメルローズのような濃厚剤が挙げられる。
n, 当該分野において周知の担体、好ましくは非刺激性の適当な捕形剤、 例えばポリエチレングリコール類、 ラノリン、 カカオ脂、脂肪酸トリグリセライ ド等の、好ましくは常温では固体である力場管の では液体で直腸内で醐军し 薬物を放出するものなどを使用して、慣用の方法により調製されるが、通常本発 明化合物を 0. 1〜95重量％禾1¾含有するように調製される。使用する ffi^剤およ び' によって薬品は、 K 剤に懸歸させるかまたは溶解させることができる。 局部麻酔剤、 防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、貝断剤に溶解可能である。 経口的使用に適した^ ¾としては、例えは錠剤、 k カプセル剤、粉末剤、 顆粒剤、 トローチのような固形組成物や、液剤、 シロップ剤、懸濁剤のような液 状糸賊 ¾ ^が挙げられる。 嫌鑭製する際は、 当該分野で知られた織纏助剤な どを用いる。鍵斉 1]及びカ jはさらにェンテリックコ一ティングされて製造される こともできる。調剤単位形態がカプセルである には、備己タイプの材料にさ らに-油月旨のような液^！犬担体を含有すること力できる。 さらに、本発明の DNAなどの核酸を上記したような治療及び Z又は予 |¾¾とし て用いる^、該核酸はそれを與虫で用いることもできるし、 あるいは上記した ような遺 fe¾且換え技術で ί麵される適当なべク夕一、例えばレトロウイルス由 来べクターなどゥィルス由来のべク夕一などに結合させるなどして用いることが できる。本発明の DNAなどの核酸は通常の知られた方法で投与でき、 そのままで 、 あるいは、例えば細胞内への ί赚が促進されるように、適当な補助剤あるいは 生理的に許容される担体などと共に、謙 IJ化されて用いること力でき、上記した ような、 医 ¾組成物又は隨調製物などとして投与すること力できる。 また遺伝 子治療として知られた方法を適用することもできる。
本発明の活性 は、 その投与量を広範囲にわたつて選択して投与できる力 その投与 び投与回数などは、処置患者の' &^、年齢、 的«状態 、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、唐、者のその時に治 療を行なつて 、る病状の に応じ、 それらあるいはその他の要因を考慮して決 められる。 品製造にあたっては、 その添加剤等や調製法などは、例えば日本薬局方解 説書扁 員会編、 第十三改正 日本観方解説書、平成 8年 7月 10日発行、株 式会社廣川書店；一番ケ瀬 尚 他編 医薬品の開発 12巻 «I康剤 〔I〕 ）、 平成 2年 10月 15日発行、 会擴川書店；同、 医薬品の開発 12卷 （難嗉材 〔 II〕 )平成 2年 10月 28日発行、株式会ネ谓川書店などの記載を にしてそれら のうちから必 に応じて適宜選択して適用することができる。
本発明の活性 は、 MT1-MMPの単純二量体形成といった生物学的活性を抑制 及び/又は阻害する作用をもつものであれば特に限定されないが、好ましくは有 禾 fjな作用を持つもの力く挙げられる。本発明の活¾)¾分は、例えば、 (a) MT1-MMP の PEXタンパク質、 その一 のペプチドまたはそれらの塩、 その変異体、類縁体 、誘導^、 (b)該 MT1-MMPの PEX領域をコードする DNAなどの核酸等、 (c) 本 発明の抗体、 その一部断片 （モノクロ一ナル抗体を包含する） またはその誘稱 、 (d) MT1-MMPの単純二量体形成作用といった生物学的活性を抑制及び/又は阻 害する化合物またはその塩などが包含される。 本発明の活'¾ ^は、 MT1- MMPの碰からなる複合体形成により生ずるプロ! ϋ Ρ-2のプロセッシング、例えば少なくとも MT1 - ΜΜΡの単純二量体形成によりプロ ΜΜΡ-2を活',に変換する過程を抑制あるいは阻害するのに有用と期待される。 また、該活 分は、 プロ ΜΜΡ-2の過度の活性化により！^される及び/又は消 失する機能の難あるいは回復に有用であり、 MT1-MMPの謙からなる複合体形 成により生ずるプロ MMP- 2のプロセッシング、例えば少なくとも MT1-MMPの単純 二量体形成によるプロ MMP-2の活性化が関連する障害、異常及び Z又は 直の予 防あるいは治療に有用である。 また、 MT1- MMPによるプロ MMP- 2のプロ ッシン グを抑制あるいは阻害するのに有用である。加えて、 MT1- MMP遺^? ¾|¾細胞の 移動、浸潤及び Z又は転移の制御、例えば抑制に有用であり、該発現钿胞におけ る MT1-MMP によるプロ MMP-2のプロセッシングに関連して細胞の移動、寝潤及び Z又は転移により生ずる障害、異常及び/又は疾塞の予防ある 、は治療に有用で あると期待される。 さらにまた、本発明の MT1PEXタンパク質や PEXに対する抗体 を含めた活 'ft ^は、 MT1-MMP遺ィ5?を発現している細胞の移動、浸潤及び Z又 は転移の制御、例えば抑制に有用であり、該 MT1- MMPの単純二量体形成によるプ 口 MMP-2活性化に関連して細胞の移動、浸潤及び Z又は転移の ¾1により生ずる 障害、異常及び Z又は 患の予防あるいは治療に有用である。特には、癌などの ,画包の移動、 浸潤及び Z又は転移の 1¾1¾び7又は抑制するのに有用で、抗 剤及び Z又は癌転移抑制剤として期待できる。 ャット
本発明はさらに、本発明の前述の組成物 を 1又はそれ を充填した 1又 はそれ の容器を含む »分野で許容されるパック及びキットにも関する。 こ のような （単一あるいは の）容器とー储に、 医薬又は生物学的産物の製造、 棚又は販売を規制する義機関により指示された形態の注纖 ) であつ て、 ヒ卜への投与用の製品の製造、使用又は!^に関する該 機関の承認を示 している注 (添付文書） 力添付されていてよいものである。 本発明にした力えば、 T1-MMPの PEX領域を構成するアミノ膨曳基のうち連続 した少なくとも 2個のアミノ«基からなるものを選択し、 （i) そのうちの藝里 作用団をイソスターで置き換えることによりなされる力、、 (ii) 構成アミノ膨 基の少なくとも 1個を D体のァミノ膨幾に置き換えるか、 (iii) ァミノ膨錢 の側鎖を修飾する力、、 (iv) 該配列に するァミノ膨^ Sとは異なるァミノ酸 藤を配置して連結するか、 (v)立 冓造を角晰して mimic体をデザインするこ となど、 当該分野で採用される技術を,駆使して うことができる （例えば、首藤 紘ー 編 医薬品の開発 7巻 設計） 、平成 2年 6月 25日発行、株式会社 廣川書店及びそこで引用している文献や論文など） 。 そうした技術の一部は、上 言己で説明したものを含んでいる。 明細書及び図面において、用語は、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical No menclatureによる力、、 あるいは当該分野にぉ 、て慣用的に翻される用語の意味 に基づくものである。代表的な用語の意味を以下に示す。
bp: base pair^s)；
BB-94： [4- (N-hydroxyamino) - 2R- isobuty 1- 3S- (thiophen-2-ylthiometyl) - succinyl]-L-phenylalanine-N-methylamide 又は batimastat TIMP-2： tissue inhibitor of metal loproteinases-2
IPTG： isopropyl- 1-thio— β -D-galactopyranoside；
PCR: polymerase chain reaction
SDS: sodium dodecyl sulfate； 夕ンノ、。ク質、 ぺプチドなどのァミノ翻 (Jに関しては：
A:ァラニン残基 (Ala) M:メチォニン歹 (Met)
C:システィン残基 (Cys) N:ァスパラギン残基 (Asn)
D:ァスパラギン^ (Asp) P:プロリン残基 (Pro)
E:グルタミン ¾S (Glu) Q:グルタミン残基 (Gin)
F:フエ二ルァラニン残基 (Phe) R:アルギニン歹錢 (Arg)
G:グリシン残基（Gly) S:セリン残基 (Ser)
H:ヒスチジン残基 (His) T:スレオニン残基 (Thr)
ェ：イソロイシン残基 (He) Vソくリン残基 (Val)
K:リジン残基 (Lys) ff:トリプトファン残基 (Trp)
L:ロイシン ¾S (Leu) Y:チロシン残基 (Tyr) .
ヌクレオチド配列に関しては： A:アデニン残基 G:グァニン残基
C:シトシン残基 T:チミン残基 実施例
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、 この実施例は単に本発明 の説明のため、 その具体的な態様の参考のために提供されているものである。 こ れらの例示は本発明の特定の具体的な,肯 J«を説明するためのものである力く、本願 で開示する発明の範囲を 11¾したり、 あるいは制限することを表すものではない
。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な難形態が可能であることは画罕 されるべきである。
全ての実施例は、他に言羊細に言己載するもの以外は、ネ!^的な技術を用いて実施 したもの、又は I®おすることのできるものであり、 これは当業者にとり周知で慣 用的なものである。 以下の実施例における通常慣用される 生物学的技術としては、標準的な実 験マニュアル、例えば J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual (2nd edition; , Cold Spring Harbor Laborato ry Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) に記載されるように 缶でき る。 以下の実施例で示す全ての "部" 又は量は、特に言及して隱していない限 り、重量で示す。
以下の実施例における断片のサイズ分離について、他に記載しない ϋ^、上記 Sambrookの文献及びその他の多くの参考文献、例えば Goeddel et al. , Nucleic Acids Res. , 8: 4057 (1980)に記載される手法、すなわち、寒^ ¾びポリアクリ ルアミ ドゲル電気泳動 ("PAGE") の標準の技法を用いて実施した。他に記載しな い 、 ライゲーシヨンは、標準的な緩衝液、 インキュベーション 及び時間 、 ライゲートすべき DNA断片に対し約等モノレ纖の量で、 DNA 0. 5 /z gあたり約 10単位の T4 DNAリガ一ゼ (「リガ一ゼ、」 ) を用いて行った。 なお、 以下の実施例において、特に指摘が無い には、具体的な操作並びに 処 ί 件などは、 DNA クロ一ニングでは J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Man iatis (ed. ), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition; , Col d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) 及 び ]). M. Glover et al. (ed. ), "DNA Cloning", 2nd ed. , Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) な ど， また特に PCR法では、 R. Saiki et al.， Science, 230: 1350, 1985; R. Sa iki et al.， Science, 239: 487, 1988; H. A. Erlich (ed. ), PCR Technology,
Stockton Press, 1989 ； D. M. Glover et al. (ed. ), "DNA Cloning", 2nd ed . , Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University
Press (1995)； M. A. Innis et al. (ed. ), "PCR Protocols： a guide to meth ods and applications", Academic Press, New York (1990))； M. J. McPherson ， P. Quirke and G. R. Taylor (ed. )， PCR: a practical approach, IRL Press , Oxford (1991)； M. A. Frohman et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85， 8 998-9002 (1988) など、 ペプチド合成では G. B. Fields (ed. )， "Methods in E nzymology" , Vol. 289 (Solid-Phase Peptide Synthesis), Academic Press, Ne w York (1997) などに記載の方法に準じて行っているし、 また市販の試薬あるい はキットを用いている: t はそれらに添付の指示書 (protocols) や添付の薬品等 を している。 また、 次のような操作は更に以下の などに準じている： mRNAの単離に関し ては、例えば、 L Grossman et al. (ed. )， "Methods in Enzymology", Vol. 12
(Part A & Part B: Nucleic Acids), Academic Press, New York (1968)； S. L . Berger et al. (ed. ), "Methods in Enzymology , Vol. 152 (Guide to Molec ular Cloning Techniques), Academic Press, New York (1987)； p. 33 & ρ· 215 などの記載、 DNA cloningに関しては、例えば、 R. Wu (ed. ), "Methods in Enz ymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980)； E.
Wu et al; (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Pa rt B) & Vol. 101 (Recombinant DNA, Part C)， Academic Press, New York (19 83) ; R. Wu et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D) & Vol. 154 (Recombinant DNA, Part E)， Academic Press, New Y ork (1987)； R. Wu (ed. )， "Methods in Enzymology", Vol. 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)； J. H. Miller (ed. ), "Meth ods in Enzymology， Vol. 204, Academic Press, New York (1991)； . Wu (ed . ), "Methods in Enzymology", Vol. 216 (Recombinant DNA, . Part G) , Vol. 21 7 (Recombinant DNA, Part H) & Vol. 218 (Recombinant DNA, Part I), Academ ic Press, New York (1993)； S. Weissman (ed. ), "Methods in Enzymology" , V ol. 303, Academic Press, New York (1999)； J. C. Glorioso et al. (ed. )， " Methods in Enzymology , Vol. 306, Academic Press, New York (1999)；日本生 ィ匕学会編、 「«化学実験講座 1、遺 fe?研究法 II」、 京化学同人 (1986)；日 本生化学会編、 「新生化学実験講座 2、核酸 III (組換え舰技術） 」、棘ィ匕 学同人 (1992) などの記載， hybridizationに関しては、例えば、 L. Grossman et al. (ed. ), Methods in Enzymology， Vol. 29 (Nucleic Acids and Protei n Synthesis, Part E), Academic Press, New York (1974) などに記載の方法あ るいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や 改変法により行うことができる （それらの中にある記載はそれを参照することに より本明細書の開示に含められる） 。 以下の実施例で使用された実験材料 ·試薬は次のようなものである： ダルベッコ変法イーグル培地 (DEME) は、 日水纖株式会社（棘、 日本） 製。 FuGENE 6™は、 Roche Molecular Biochemicals , Basel,スイス。 マウス |¾FL AG ェピトー I2 モノクローナル抗体およびアルカリフォスファタ一ゼネ票識ャ ギ抗マウス IgG抗体は、 Sigma Chemical Co. , Ltd. (M0、 USA)製。 抗ホスホチロ シン モノクローナル抗体 PY20 は、 ICN Biochemicals, Inc. (Ohio, USA)製。 ィ匕学架橋剤 DSGは、 Pierce Chemical Co. (IL, USA)製。 DQTMゼラチンは、 Mole cular Probes, Inc. (OR, USA)製。 Matrigel Matrix (マトリゲルマトリックス） は、 Becton Dickinson Labware (MA, USA)製。 Peptidyl hydroxamate MMPィンヒ ビター BB- 94は、 British Biotech Pharmaceuticals Ltd. (Oxford, UK) の Dr. Peter D. Brownより ^された。 謂列 1 .
A
(1) PEX欠損 FLA咖 MT1- MMP (MTlCat- F)、角螩領歉損 FLAGィ細 Ί1- MMP (MTIPEX-F), MT1-F/NGFR, MT1PEX- F/NGFR, MTlCat- F/NGFRおよび
MT4PEX-F/NGFRの構築
FLAGェピトープ （Asp- Tyr- Lys- Asp- Asp- Asp- Asp-LysM Tl- MMP (MTl-F) の 発現構築物は、 Itoh, Y. et al.， J. Biol. Chem. , 274, 34260-34266 (1999)に 記載されたとおりのものを使用した。 これをテンプレートとして MTlCat- F (ΔΙ1 e3 1 8— G1y5 3 5 )および ¾T1一 ρΕχ— F ( ATyr l l 2— Pro 3 1 2 )の cDNAを Ho らの pci?伸長法 （
Ho, S. N. et al.， Gene, 77, 51-59 (1989)) によって取得し、 pSG5 (Stratage ne， CA， USA)にサブクローニングした。
MTl-F, MTlCat- F， MTIPEX-F または MT4PEX- Fの細^^領域と NGFRの膜貫通領 域 (TM)/細胞質内領域 (CP)とのキメラ変異体も同様にして PCR法によって作成し 、 pSG5にサブクローニングした。
MT1-MMP に由来する配列は Met1から Asp5 1 5であり、 NGFRに由来する配列は Glu3 8 4から Gly7 9 °である。 他のキメラ変異体もこれに相応する配列から成っている。 すべての PCR ^^フラグメントは D シークェンシングによって確認した。
(2) 発 物の精製とフォ一ルディング
E. coliで発現させた MTIEA ATM, MTl-PEXおよび ΪΓ4-ΡΕΧ は次のようにして 精製及びフォールディングを行った。，
Met プラス Glu240を Alaに点変異させた MT1- MMPの Tyr1 1 2 から Gly5 3 5 ま で (MtlEAATM), Metプラス MT1- MMPの Cys3 1 9 から Gly5 3 5 まで （MT1PEX) およ び Metプラスマウス MT4 - MMPの Cys3 3 6から Gly5 5 °までをコ一ドする cDNAフラグメ ントは PCRによって調製し、 pET3a発現ベクターにサブクロ一ニングした。
すべての PCR ^j¾DNAは DNAシーク工ンシングによつて確認した。
BL21(DE3)pLys Sをこれらの pEt3a構築物で形質転換し、 タンパク質の発現も 0. 4mM IPTGで誘導した。 発現したタンパク質産物は Huangらの方法 (Huang, W. et al. , FEBS Lett, 384, 155-161 (1996)) に従って精製し、 フォールデイング した
(3) プロ MMP-2および TIMP- 2の精製
組換えヒトプロ MMP-2 および TIMP- 2は、 ヒトプロ MMP- 2 および TIMP- 2を発現さ せるための組換えバキュロウィルスをそれぞれ感染させた HighFiveMil細胞 (In vitrogen, CA， USA)で発現させた。 組換えウィルスは BAC-TO- BAC™バキュロウィ ルス発現システム （Life Technologies, M， USA) で調製した。
培養上清からのプロ MMP-2 の精製は、 Itoh， Y. et al.， Biochem. J.， 308, 6 45-651 (1995) の言己載にした力つて、 Gelatin Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. , Uppsala, Sweden)および S - 200 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. ) でのゲノレろ過によって行った。 培 ¾i清からの TIMP - 2の精製は、 Green A Dyematrex (Millipore, Co. , MA, USA)および S - 200でのゲノレろ過によって行つ た。
(4) ゲルろ過カラム
ΜΤ1ΕΑΔΤΜ, MT1PEXおよび MT4PEXは 150mM NaCl, 10mM CaCl2, 0. 02% NaN3 含 有 50mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7. 5) で ¾化した Superdex 200または Superdex 7 5 によるゲルろ過カラムクロマトグラフィの後、 AKTA explorer 10S システム （ Amersham Pharmacia Biotech, Inc.リで麟 ;τした。
(5) ウェスタンブロッテイング
細胞可溶化物サンプルを SDS- PAGEで分離し、 ゲル中のたん白をニトロセル口 —ス膜 （Hybond- ECL、 Amersham Pharmacia Biotech, Inc. )に転写した。 TBS (150 mM NaCl含有 20mM Tris-HCl緩衝液、 pH 7. 5) に溶解した 10% 襲旨粉乳でプロ ッキングした後、 FLAG ¾口 MT1 - MMP とその変異体を検出するための CFLAG M2 モ ノクローナル抗体 (3 g /ml)にメンブレンを曝した。 バンドを可視化するため
、 メンブレンをさらにアル力リフォスファタ一ゼ標識ャギ抗マゥス IgG抗体に曝 した。 キメラタンパク質中のホスホチロシン残基を検出するために、 抗ホスホチ 口シン モノクロ一ナル抗体 PY20 (1 β /ml) を使用した。 (6) ゼラチンザィモグラフィ一
ゼラチンザィモグラフィ一では、 ゼラチン （O. ang/ml) を含む SDS —ポリア クリルアミ ドゲル (PAGE)を価した (Itoh， Y. et al. , J. Biol. Chem. , 273, 2 4360-24367 (1998))。 サンプノレに還^^不含 SDS- PAGE口一ディング緩衝液を励口 し、室温で電気 '腿を行った。藤活性は、 クマシ一ブリリアントカレ一 R - 25 0で 染色部位として可視ィ匕した。
(7) 細胞培養およびトランスフエクシヨン
C0S1, HT1080および CHO- K1細胞は、 37°C, 湿潤インキュベーター内において 10%牛胎 Ml清添加 DMEMまたはハム F- 12培地中で麟した。形質導入の 16時間前 に細胞を 6穴プレー卜に 1. 5 X 10Vゥエルで ¾Sした。
FuGENE6™ (Roche Molecular Biochemicals社製） の ί¾¾方法に従って各タン パク質の発現べク夕一を導入した。 48時間後細胞を集め実験に使用した。
(8) ΡΕΧ -欠損 MT1-MMP (MTlCat), 活性ドメィン-欠損 MT1-MMP (MT1PEX), MT1- T4PEX, MT1-F/NGFR, MT1PEX-F/NGFR, MTlCat- F/NGFRおよび
MT4PEX-F/NGFRの構築
MT1-MMPの cDNAは、 PCR extension法 (Ho et al. , Gene, 77, 51-59 (1989) ) による MTlCat(Ile3 1 8-Gly5 3 5) および ¥TlPEX(Tyr1 1 2- Pro3 1 2) の DNA断片 のために鋅型として使用した。 FLAGェピトープ (Asp Tyr - Lys-Asp-Asp-Asp-Asp - L ys) を働口した MT1- ΜΜΡ(ΜΠ - F)発現べクタ一は、 Itoh et al.， Biochem. J. , 30 8， 645-651 (1999) の方法に従ってィ し、 FLAG- ^raMTlCat(MTlCat-F:^MTlP EX(MT1PEX- F)の cDNAi懷の铸型として使用した。 cDNAは、 pSG5(Stratagene， CA， USA) にサブクロ一ニングされた。安定発現のため、 MT1PEX- Fの cDNAは、 EBNA-1 と hygromycinif¾¾i5?の発現カセットを有する pCEP4 (Invitrogen, Groningen ， Netherlands)にサブクロ一ニングされた。
MT1-MMP と MT1PEX-Fの Cys3 1 9から Cys5 ° 8に対応する DNAは、 それぞれ MT1- MT4P EXと MT4PEX- Fを するため、 マウス MT4- MMPの Cys3 3 6から Cys5 2 7と置換された c-Mycェピト一プ (Glu-Gln- Lys- Leu- lie- Ser- Glu-Glu- Asp- Leu)-^¾MT1-MMP( MTl- Myc)発現べクタ一は、 Itoh et al. , Biochem. J.， 308, 645-651 (1999) の MTl-F と同様な方法で PCEにより した。 c- Mycタグは、 MTl-Fの FLAG-タグ 挿入部位と同じ Arg1 1 Tyrの間に挿入された。
MTl-F, MTlCat-F, MT1PEX-Fあるいは MT4PEX- Fの細^^ドメインと NGFRの膜貫 通/細胞内ドメインとのキメラ変異体（それぞれ、 MT1-F/NGFR, MTlCat- F/NGFR ， MT1PEX-F/NGFRあるいは MT4PEX-F/NGFR)は、 PCRによって され、 pSG5にサ ブクローニングされた。 変異体は、 Μ - MMPの Met1から 3 5 1 5ぉょぴ}«^1½)61113 8 4から Gly7 9 °に相当する配列に由来する。他のキメラ変異体は、 それぞれに相当 する部位から作製された。 すべての PCE産物の断片は、 DNA配列角?!斤により石鶴忍 した。
恒常的 ' ¾ Racl発現べクタ一 (V17, EaclDA) は、 Osaka Universityの Dr. Yo shimi Takai より、 ，恵与された。
(9) 細勝咅養及び遺 導入
C0S1および ΉΤ1080細胞は、 10% ゥシ胎 D青とカナマイシンを含む Dulbecco' s modified Eagle' s medium (DMEM; Sigma Chemical Co. , Ltd. , MO, USA)) で加 湿した 37°Cのィンキュベータ一で した。遺 fe?導入の 16時間前に細胞を 6 -穴 プレートに 1X10V穴で播き込んだ。 それぞれのタンパク質発現プラスミドは、 FuGENE6™ (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland) の使用書に 従って導人された。
(10) 抗体の
杭- MT -MMP活性ドメィン抗体 (Anti- Cat)は、 coliで発現、精製した ΙΠ - MM P活性ドメインをゥサギに^ 5しィ懷した。 この抗体は、 MT2-, MT3-, MT4-, MT 5-および ΪΓ6-ΜΜΡからなる他の MT-MMPsを認識しないことから、特異的に MT1-MM Pを認識することを廳忍した。 マウス杭- ヒト Μ -ΜΜΡ ΡΕΧ ドメインモノクロ一 ナル抗体 (anti_PEX, 222-1D8) は、精製した ^ coliで発現したヒト MT1 - MMP PE X ドメインをマウスに^ ¾して ^した。 この抗体は、 MTl- MMPに特異的である こと力 ^ti忍された。
(11) 繊沈降
遺イ^?導入された C0S1細胞は、室温で 1時間、 RIPA buffer(50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1% Triton-XlOO; 1% sodium deoxycolate; 0.1% SDS; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF; ΙΟ^Μ E-64; 0.02% NaN3) で溶角 された。細胞溶解物は、 エツペンドルフチューブで遠心 (15, 000 ipm)、上清を 4°Cで 1時間、抗- FLAG M2 抗 ¾合ビーズ (Sigma) と反応した。 ビーズを RIPiV bufferで 3回、 Tris_buffe red saline (pH 7.5) (TBS) で洗浄した。結合したタンパク質は、 TBSに溶解し た FLAGペプチド (Asp- Tyr-Lys- Asp- Asp- Asp- Asp- Lys) (200/ g/ml) (Sigma) で溶 出し、 マウス抗- FLAGェピト一プ M2モノクロ一ナノレ抗体 (Sigma),マウス抗- c-M ycモノクローナル抗体 (Ab - 1) (Oncogene, MA, USA; l /g/ml)，ゥサギ抗- ヒト MT ICat抗体 (1:2000)あるいはマウス杭- ヒト MT1PEXモノクローナル抗体 (222-1D8) (0.5 μg/τύ) によるウエスタンプロット角浙に供した。
(12) ウエスタンブロッテイング
細胞溶解物を SDS/PAGEに供し、 タンパク質をニトロセルロース膜（Hybond- ECL ， Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) に転写した。 MTl-MMP, MTlCat, MT1-MT4 PEX と MT1-F/NGFRは、抗- CATポリクロ一ナル抗体 (1:2， 000) で、 MTl-MMP, MT1PE Xおよび MT1- F/NGFRは、抗- PEX抗体 (222- 1D8, 0.5 zg/ml) て検出した。 FLAG- 口 MT1 - MMP とその'変異体は、抗 -FLAG抗体 M2(3 //g/ml) で検出した。 ホスホ チロシン残基を持つキメラタンパク質は、 マウス杭-ホスホチロシンモノクロ一 ナル抗体 PY20 (ICN Biochemicals, Inc., OH, USA; 1 zg/ml) で検出した。繊 ί&性ノくンドは、 アル力リフォスファターゼで標識されたャギ抗マゥス IgGある いは、抗ゥサギ IgG(Sigma)で観化した。
(13) 麵ビォチン化と赚沈降
遺^導入した C0S1細胞は、 1 mM MgCl2と 0.1 mM CaCl2を含む冷却した PBSで 3回洗浄した。細胞は、 同じ bufferに溶解した sulfo-NHS-biotin (Pierce) (2 m g/ml) と 4°Cで 30分間、 インキュベートした。反応は、 PBSに溶解した 25 mM ly sineと更にインキュべ一卜することで停止した。細胞は、 MPA bufferで溶解し 、 ピオチン化されたタンパク質は、 streptavidin- Sepharoseビーズ (Amersham-Ph armacia)と共に沈降させた。 検体は、抗- MTlCatあるいは抗 -PEX抗体を用いたゥ エスタンブロッティングで分析した。
(14) In situゼラチン分解ァッセィ '
2種の異なつた in situゼラチン分解ァッセィを行つた。 ひとつは、 One use d DQTMゼラチン （Molecular Probes, Inc. , OR, USA)を用いた。 DQゼラチンは、 蛍光消光ゼラチン基質で、 タンパク質分解性の切断により蛍光を生じる。 10 mg/ ml 票識ゼラチン中の 5¾DQ™ゼラチンでカバーグラスをコートし、 した。加 湿チヤンバ一中で 16時間、遺 fe?導入した細胞をこのかく一グラス上で培養した o細胞を 3% para- formaldehydeで固定し、分解領域を領域から生じる蛍光で視覚 化した。
他の方法は、 Alexa488-標識キット（Molecular Probes)で作製した Alexa488- 標識ゼラチンを用いた。 Yana， I.と Weiss, S. J.， Mol. Biol. Cell, 11, 2387-2 401 (2000)の方法にしたがって、 4-穴チャンバ一スライド (Nunc)の底を Alexa488 -標識ゼラチンでコー卜した。加湿した培養用インキュベータ一中で遺ィ 導入 した C0S1細胞をこのチャンバ一スライドで 16時間培養した。細胞を PBS中の 3% p ara-formaldehydeで固定し、 分解領域は、蛍光爾敷鏡下で分析した。分解領域は 、 «光の暗い領域として視覚化された。蛍光像は共焦 爾救鏡 (BioRad)を用い て分析した。
上記の方法によって検出された MT1 - MMPsの活性は、 peptidyl hydroxamate MMP laWJ: BB94で抑制されることで石鶴忍される。 BB94 は、 British Biotech Phar maceu廿 cals Ltd. (Oxford, UK)の Dr. Peter D. Brownより恵与された。
(15) ^
遺 ^導入された C0S1細胞あるいは Η 080細胞は、 ゼラチンコートしたカバ一 グラス上に再播き込みされ、 24時間培養された。細胞は、 75 mM lysineを含む PB S中の 3% para- formaldehydeで固定された。 TBS中の 5% goat serum と 3% bovin e serum albuminを用い、室温で 1時間ブロッキングした後、細胞は、抗- FLAG 抗体 Ml (5 /ig/ml), PY20 (2 g/ml) あるいは抗- Cat馳清 (1: 1， 000) と室温で 2時間反応した。 ホスホチロシンのシグナルを検出するため、細胞は、 固定の後 TBS中の 0. 1% Triton-XlOOで ィ 理された。抗 -FLAG抗体 Mlによる染色のた めの洗浄とインキュベーションには、 CaCl2 (1 mM)力く常に添加された。 Cy3-ある いは Alexa488-標識ャギ抗 -マウス IgGは、 シグナルの視覚化に用いられた o F-actinの視覚化のために、細胞は更に、 Alexa488_あるいは Alexa594-標識 phalloidin (Molecular Probes) とインキュベートした。 シグナルは、共焦点顕 編 (BioRad)で分析した。
(16) ProMMP- 2結合アツセィ
遺ィ 導入した C0S1細胞は、 24-穴プレート（0. 2 x l04/well) で培養した。遺 ィ¾^導入の 48時間後、細胞を血清不含 DMEMで 3回洗浄し、血清不含 DMEM中の精製 proMMP-2 (2 /g/ml) と 25°Cで 1時間、 インキュベートした。 その後、 応の proMMP-2除去するため、細胞を 5%ジメチルスルホキシド （MS0) を含む血清不含 DMEMで 3回洗浄し、 50 1の非還元 SDS- loading bu erで溶解した。細胞に吸着 した MMP - 2 は、 ゼラチンザィモグラフィ一分析した。
(17) マトリゲル浸潤アツセィ
マトリゲル浸潤チャンバ一は、使用書に従 L、24-穴 カルチヤーィンサ一ト（F alcon)の穴径 8- //inめ膜を 10〃 gの MatrigeKBecton Dickinson Labware, MA, U SA) でコートして作製した。遺 fei導入した HT1080細 懸濁液ひ xlOVml) 0. 5 mlを上部チヤンバ一に播き、 37 °Cの加湿チヤンバーでィンキュベ一トした。 He patocyte growth factor (Toyobo; 10 ng/ml) を化^^引物質として下部チャン バーに添加した。 14時間後、膜の上表面に残った細胞を取り除き、下表面の細 胞を PBS中の 3% para-formaldehydeで固定した。下表面に浸潤した Green fluore scent protein (GFP)-陽 f生の細胞を蛍光顕微鏡 (X40) で計数した。 B
以下に結果をまとめて記載する。
(1) へモぺキシン； ft 域 (PEX) の細胞表面の MT1-MMPによるプロ蘭 P- 2の活性 化における機能の解明
プロ MMP-2の活性化における MT1 -丽 Pの PEXの重要 '【生を試験して見てみるため に、 PEX-欠損 FLAG-働口 MTl-MMP(MTlCat-F) を発現するプラスミ ドを構築した ( 図 1 ) 。 図 1中の各記号は、次のものを示す：
Pro:プロべプチド；
FLAG: フラッグェピトープ；
CD: 角螩領域；
H:ヒンジ部位；
PEX：へモぺキシン様領域；
TM: 膜貫通領域
FLAGェピト一プ （Asp-Tyr-Lys- Asp-Asp- Asp-Asp- Lys) ¾HMTl-MMP (MTl-F) の 発 ISlf築物 （construct)は、 Itoh， Y. et al. , J. Biol. Chem. , 274, 34260-34 266 (1999)に記載されているので、 それをテンプレートとして i0gし、 Hoらの PC R伸長法 (Ho, S. N. et al. , Gene, 77, 51-59 (1989)) によって MTlCat-F (厶 1163 1 8-01 5 3 5 )のじ0 を取得し、 pSG5 (Stratagene, CA， USA)にサブクローニン グした。 PCR ^^フラグメントは DNAシークェンシングによって石鶴忍した。 C0S1 細胞に MT1 - MMP変異体； MTl-F, MTlCat-F発現べクタ一あるいはベクタ一単独 (M ock)を形質導入した。 FuGENE6 ™ (Roche Molecular Biochemicals¾t¾) のィ細 方法に従って夕ンパク質の発現べクタ一を導入した。 C0S1細胞は形質導入の 16時 間前に 6穴プレー卜に 1. 5 X105/ゥエルで醒した。 C0S1細胞を、 37°C, 湿潤ィ ンキュベ一夕一内にぉ 、て 10%牛胎] ¾ώ清添加 DMEMまたはノヽム F - 12培地中で糸 tl した。 形質導入して 48時間後細胞を集め実験に麵した。 これらの細胞を血清不 咅養液中で精製プロ MMP-2 (0. 25 g/ l) の存在下、 37°Cで 18時間培養した。 細胞可溶化物は変異体発現を培 «1:清はプロ MMP- 2の'活 f生ィヒを調べた。
FLAG- ¾口全長 MT1 - MMPを導入した C0S1細胞は、培 fti:清に添加した外来のプ 口 MMP - 2を活性ィ匕した。 しかしながら、 MTlCat - Fは、全く活性化しなかった （図 2 ) o 図 2の上段のパネルは titFLAG M2モノクローナル抗体を用いた形質導入細 胞から得られた細胞可溶化物のウェスタンブロット分析を示し、 図 2の下段パネ ルは培養液中のゼラチンザィモグラフ分析を示す。
MTlCat - Fは、細胞表面に発現じ、 T1-F と同様なゼラチン分解活性を示す （図 13、 TS fl¾) 。従って、 プロ MMP-2活性化における差は、細胞表面への出難 式あるいはたん白質分解活性によるものであることは明らカ、である。 PEXはおそ らく複合体形成による細胞表面での MT1- MMP配列を-^しているものと思われる
(2) MT1-MMP外部領域の機能の有無の石鶴忍
MT1-MMPの外部領域が複合体を形成する力、否かを試専 るために、 プロぺプチ ドを除去した角蝶的に不活性な可溶性変異体 (ΜΤΙΕΑΔΤΜ) Ά_ coliで発現させ た （図 3 ) 。 すなわち、 Met プラス Glu240を Alaに点変異させた MT1- MMPの Tyr
2 から Gly5 3 5 まで (MtlEA厶 TM) をコードする cDNAフラグメントを PCRによ て調製し、 pET3a発現べクタ一にサブクローニングした。得られた PCR «D A は DNAシークェンシングによって石鶴忍した。 こうして得られた pEt3a構築物で ^ coli BL21(DE3)pLys Sを形質転換し、 タンパク質の発現を 0. 4mM IPTGで誘導し た。発現したタンパク質産物は Huangらの方法 (Huang, W. et al. , FEBS Lett,
384, 155-161 (1996)) に従って精製し、 フォールデイングした。 精製したこの たん白質の «は図 4中で示したように 98%以上である。
活性部位は自己消化が起きないよう変異させてある力 この変異は他の MMPsで 見られるような全体にわたる構造的な変化の原因にはならない (Atkinson, S. J. et al. , J. Biol. Chem. , 270, 30479-30485 (1995)) ものである。 また、 3種 の の ΜΤ1ΕΑΔΤΜを Superdex 200ゲルろ過力ラムに供した。 図 4の中の挿入図 は還元および非還¾件下での Μ ΕΑΔΤΜの SDS - PAGE分析を示す。 バンドはクマ シ一ブルー R-250により可視化した。
MT1EA ΔΤΜは、 SDS- PAGEの還元、非還 件下で異なる移動度を示すことから S-S結合が正しく形成されていること力示唆された。 また、 TIMP-2との複合体形 成能を有することが確かめられ、 このことカヽらもこの角 領域が正しく折りたた まれていること力く示唆された。 なお、 ゲルパ一ミエーシヨンカラムにおいて、 MT 1EA ΔΤΜが、 53 kDaと予測される分子量質量容積ではなく、 より大きな 量 (6 00 kDaJiLhと 100 kDa)として溶出されるということ力^精製の過程において注目 された。
したがって、 MT1 - MMP 、同種親和性複合体を形成すること力示唆された。 こ の形成、特には高分子量複合体の形成は、 ΜΊΊΕΑΔΤΜの濃度に依存的である （図 4 )。 0. 33〃Mでは 50 kDa単量体ピークと 600 kDa J¾±のピーク力く!^された。 0. 66 / Mあるいは 1. 4 Mの検体を添口したときには、 130 ld)a近辺の二量体ピ ークの高さ力 曽加する一方、 より高分子量のピークのそれも更に増加した （図 4 ) o化学架橋剤の DSGで処理した MT1EA厶 TMは、二量体、 四量体およびさらなる 重合体の出現をも明らかに示した （図 5 ) 。 なお、 MT1EA ΔΤΜの交 合は次の ようにして行った。精製した I coli 由来 ΜΤ1ΕΑΔΤΜを 150mM NaCl, 10mM CaCl 2 , 0. 02 % NaN3含有 50mM HEPES中で 0. 2mM DSG とともに 0 °Cで処理した。 この KJSは Tris- HC1緩衝液 (pH 7. 5) を最終 ^ΙΟηιΜとなるように添加することで停 止した。
(3) 複合体の形成に関わる領域の確認 '
角 某領域あるいは ΡΕΧの 、ずれの領域が複合体の形成に関わつて 、るかを知る ために、 ΜΤ1ΕΑΔΤΜをトリプシン処理した。 トリプシンは、数個の Arg と Lysを 含む MT1EA ΔΤΜのヒンジ領域の中央を切断するので角蝶領域と PEXを分離できる o そして、検体は Superdex 75 によるゲルパ一ミエ一シヨンカラムクロマトダラ フィ一で分析した。つまり、 MT1EA ΔΤΜ(50 μ g/ml) をトリプシン (0. 2 // g/ml) で 37°C、 I B寺間処理し、角! ¾頁域と PEXを切断した。 トリプシンはその ¾合物に 2mM PMSFを加え失活させた。 次に、 サンプノレを Superdex 75ゲルろ過カラムに供 した。 図 6に示したように、角蝶領域は 17 kDa容積近傍で溶出された力 PEXは 40 kDa容積近傍で溶出された。非還 件下での SDS- PAGEによる角蝶領域と PEX の移動度は、 それぞれ 21 kDaと 24 kDaであるので （図 6 ) 、 これより角蝶領域で はなく、 PEX力や溶液中で同種糠口性複合体を形成すること力く示唆された。
さらに、 この PEXによる複合体形成か 1T1-MMPに特異的であるカヽ否かを試馬 るために、 Metプラス MTl-fflPの Cys3 1 9 力、ら Gly5 3 5 まで （MT1PEX) および M T4-MMPの PEXを ^ coliで発現した。 MT1PEXおよび letプラスマウス MT4 - MMP の Cys 3 3 6から Gly5 5 ° (GenBank™ accession number AB021224) までをコ一ドする cDNAフラグメントは PCRによって調製し、 それぞれ pET3a発現べクタ一にサブク ローニングした。得られた PCR ^¾)NAは DNAシークェンシングによって確認し た。 次に、該 pEt3a構築物で coli BL21(DE3)pLys Sを形 Ml云換し、 タンパク 質の発現を 0. 4mM IPTGで誘導した。発現したタンパク質産物は Huangらの方法 ( Huang, W. et al. , FEBS Lett, 384, 155-161 (1996)) に従って精製し、 フォー ルディングした。
図 7で示したように、還元、非還¾件下の SDS- PGEで MT4-MMPの PEX(MT4_P EX) の見かけ上の ^量は、 MT1 -匿の PEX (MT1-PEX) のそれ （図 6 ) とほぼ同 一であった。 しかしながら、 ゲルパ一ミエーシヨンカラムクロマトグラフィーで は MT4-MMPの PEXは 24 kDa近傍に溶出されたのに対して、 MT1-MMPの PEXは 40 k Da近傍に溶出された。 このことは、 MT1- MMPの PEXが特異的に二量ィ複合体を形 成することを示唆してレ、る。 これらの結果は、少なくとも溶液中では MT1-MMPの 外部領域は PEXを介して同種親和性複合体を形成することを示している。
つまり、 in vitroで MT1-MMP外部領域は、 その PEXを介して同種 ΙΙΙΰ性複合体 を开成するのである。
(4) 同種親和性複合体形成の場所の觀
次に、動 田胞で発現した MT1- ΜΜΡ もまた同種親和性複合体を形成する力、否力、 調べる。 このためには、 trkプロトオンコジーン （神 長因 容体、 NGFR) を、細胞表面における二量体形成をモニターするのに利用して用いる。
その原理は、次のようなものである。 NGFEはリガンドと結合することにより二 量体を形成し、 その結果、 そのチロシンキナーゼによって、細胞質内領域のチロ シン残基がトランスリン酸化される（Jing， S. et al. , Neuron, 9, 1067-1079 ( 1992) ; Lemmon, M. A. et al. , Trends Biochem. Sci.， 19, 459-463 (1994))。 そして、 （a) NGFRの細胞質内領域と （b)四量体を形成する UK性たん白質 BCR - A BLの BCR との融合たん白質は、 チロシン残基の構造的なリン酸化を示した (Mam， Y, et al. , Oncogene, 16, 2585-2595 (1998)) 。
この原理を利用し、先ず、直接的な複合体形成を試験するために、 MT1-MMP の外部領域と NGFRの膜貫通領域 (TM)と細胞質内領域 (CP)からなるキヌラたん白質 を構成した （図 8 ) 。 もしこのキメラたん白質の外部領域が同様なネ試で同種親 和性複合体を形成すると、細胞質内領域のチロシン難がリン酸化されるはずで ある。
力、くして、 MT1-MMPの領域特異的な相互作用を試财るため、以下のキメラが 構築された （図 8 ) ：
MT1-F/NGFR; MT1PEX- F/NGFR; MTlCat- F/NGFE; MT4PEX-F/NGFR 図 8中、各記号は上記した以外のものは次のとおりである：
謂 - TM/CP, NGGF由来膜貫通および細胞質内領域；
TK， チロシンキナーゼ領域；
Υ,リン酸ィ匕されるチロシン歹 。
FLAG-働口 MT1 - MMP (MT1-F) の発現構築物は、 Itoh, Y. et al.， J. Biol. Ch em. , 274, 34260-34266 (1999)に記載されたとおりのものを使用した。 また、 MT 1-Fをテンプレートとして MTlCat-F (Alle3 1 8 - Gly5 3 5)および ΪΤ1ΡΕΧ- F (ATyr1 "一 Pro "つの を Ho らの pCg伸長法（Ho, s. Ν· et al. , Gene, 77, 51-59
(1989)) によって取得し、 pSG5 (Stratagene, CA, USA)にサブクロ一ニングした o そして、 MT1- F, MTlCat-F, MT1PEX-Fまたは MT4PEX-Fの細^^領域と NGFRの 膜貫通領域 (¾)/細胞質内領域 (CP)とのキヌラ変異体も同様にして PCR法によつ て作成し、 PSG5にサブクロ一ニングした。 MT1- MMPに由来する配列は Met1から As p5 1 5であり、 NGFRに由来する配列は Glu3 8 4から Gly' 9 ° (GenBankTM accession num ber M23102) である。他のキメラ変異体もこれに相応する配列から成っている。 すべての PCR ^^フラグメン卜は MAシークェンシングによって確認した。
FuGENE6™ (Roche Molecular Biochemicals^) の使用方法に従ってタンパ ク質の発現ベクターを C0S1細胞に導入した。形質導入の 16時間前に C0S1細胞を 6 穴プレートに 1. 5 X105/ゥエルで漏した。 C0S1細胞は、 37°C, 湿潤インキュべ —夕一内にぉ 、て 10%牛胎児血清鋤口 DMEMまたはハム F- 12培地中で ffifした。形 質導人して 48時間 it!田胞を集め実験に した。
図 9で示したように、 これらの構築物の遺 fe^導入によって発現したこれらの たん白質は、抗 FLAG M2抗体によって認識された （±パネル、 Anti-FLAG)o 同一 検体を抗ホスホチロシン抗体 (Anti- PY) で分析した 、 MT1- F/NGFRのチロシン 菌がリン酸化されており （下パネル、 Anti- PY、 レーン 1)、動物細胞で発現し た MT1- MMP もまた少なくとも二量体を形成すること力示唆された。 さらに加えて 、 MT1PEX F/NGFR もまたリン酸化され (レーン 2)て 、る。
一方、 MTlCat-F/NGFRあるいは MT4PEX - F/NGFRを導入した細胞では十分なリン 酸化は!^されなかった （レーン 3および 4)。
これらの結果は、 in vitroで見られた PEXを介した複合体形成を強く支持する ものである。 つまり、 MT1- MMPは細胞表面で同薩和性複合体を形成することは 明らかである。
(5) MT1PEX - Fの共発現による二量体形成の阻害
MT1PEX-Fの共発現で二量体形成が競合できる力、否かという 題を明らかにす る。 これを試尾 るために、 MT1-F/NGFRの発現プラスミドカ «ΊΡΕΧ- Fのプラスミ ドと共に C0S1細胞に導入された。
図 10で示したように、 MT1-F/NGFR (レ一ン 1)のリン酸化は MT1PEX- Fの発現 レベル (レ一ン 2-5)に依存して抑制された。
(6) 細胞表面における MT1- MMPの複合 ί本形成の意義の解明
プロ ΜΜΡ-2活性化における二量体形成の役割を試 i るため、 MT1-Fを C0S1細 胞に MT1PEX- Fと共に導入した。 その 入された細胞は外来より添加されたプロ MMP-2 と反応させた。 C0S1細胞は DNA量の ¾¾¾匕率で MT1- F と MT1PEX- Fで共遺伝 子導 理され、次に無血靜咅地中の精製プロ MMP-2 (0. 25 //g/ml) を得られた 細胞と 37°C、 18時間反応させ、培 ¾ 清中の MMP- 2をゼラチンザィモグラフィー で分析し、細胞可溶化物については抗- FLAG M2モノクローナル抗体を用いたゥェ スタンブロット分析を； ί亍った。 図 11、 28で示したように、 MT1PEX-Fの発現は発現レベルに依存して MT1 - Fによ るプロ MMP - 2の活性化を阻害した。 これは、細胞表面におけるプロ MMP-2の活性 化に二量体の形成が必須であること、 MT1PEX - Fが MT1-MMPの機能をドミナントネ ガティブ的 で阻害することができることを示唆している。 次に、 MT1PEX - F力細胞表面において Mil-置の角 某活性に景 しないか否かを 石鶴忍するため、 ゼラチン分解活性と ΉΜΡ - 2結合能を、 同じ培養器で遺 fe^導入さ れた細胞を用いて試験した。 図 12〜14に示されているように MT F， MT1-F/MT1PE X-F, MTlCat-Fの発現べクタ一あるいはベクターのみ （Mock) を CH0-K1細胞に導 入した。 次にその細胞をトリプシン処理し、 タンパク質分解活性の試験のための DQ™-ゼラチンコートカバ一グラス （図 13)、 ΠΜΡ-2結合測定（図 12) およびプ 口置 - 2活性化 （図 14) 用に 24 -穴プレー卜に分割蒔種した。 図 13の DQTM -ゼラ チンコ一トカバーグラス上の遺^?導入細胞は培養液中で 37°C、 18時間インキュ ペートし、発生蛍光は共焦 微鏡で分析した。 図 12の 24 -穴プレートの遺 導入細胞は BB-94 (50 wM)の共存、非共存下 25 nM " ^標 ^^と。 °C、 1時 間、 ィンキュベ一トした。 MT1-MMP特異的糸吉合は、 それぞれの実験から BB- 94 (5 0 〃M)共存下のデ一夕を差し引いて算出した。 図 14の 24 -穴プレートの同一遺伝 子導入細胞は無血 ¾iき地中で 37°C、 18時間、精製プロ MMP- 2 と ^¾芯した。 その細 胞と培 ¾i:清はそれぞれ抗- FLAG M2モノクローナル抗体を用いたウェス夕ンブロ ット分析およびゼラチンザィモグラフィ一分析を行った。結果はすべて同遺 導入実験による。 DQTM-ゼラチンは蛍光消光したゼラチンで、 たん白質分解性の 消化により蛍光を示すもので、 これを利用して試験した。
図 13で示したように MT1-F, MT1-F/MT1PEX-Fおよぴ "MTlCat- Fを導入したすベて の細胞はゼラチン分解活性を示し、蛍光を発生し、 これらすべてがたん白質分解 活性を していること力く示唆された。 MT1PEX- Fの ¾¾λは、細胞表面における ΤΙΜΡ- 2の結合を MT1- Fのみに比べて 37%減らす原因となったが （図 12) 、 これら の細胞によるプロ ΜΜΡ-2活性化の完全な阻害を説明することはできなかった （図 14) o MTlCat - Fを発現する細胞は MT1-Fを持つ細胞と同等な TIMP-2結合能を示し た （図 12) o これらの結果は、 MT1-MMPの PEXを介した二量体形成が細胞表面でのプロ MP - 2の活性化に重要であること示している。 生物学的システムにおいても MT1PEX-F力機能しているの力、否かをみるために 、 MT1-MMPを発現する HT1080細胞によるマトリゲル浸潤を調べた。
細胞は緑色蛍光たん白質 (GFP)発現べクタ一とともに、 MT1PEX- F発現べクタ一 で一過的に遺伝子導入し、 GFP陽 f生の浸潤細胞を蛍光顕微鏡を用いて数えた。 HT 1080細胞は、 MT1PEX- Fと GFPあるいは GFP與虫の発現べクタ一で共遺好導 理された。細胞は、次のようにしてマトリゲル浸潤アツセィされた。 ¾T¾Boiden -chamber法によつて難した。
マトリゲル'浸潤チヤンバーをその製品の Kit元 (Becton Dickinson) の指示に 従ってチャンバ一あたり 10 gのマトリゲルでコーティングし、孔径 8 rnの力 ルチヤーインサートメンブレン （FALCON) 上にセッ卜した。 1 x l05/mlの HT1080 細胞懸濁液 0. 5mlをチャンバ一上部に漏し、 37°C， 湿潤チャンバ一内で 14時間 ィンキュベートした。 HGF (5 ng/ml) を化学的誘導因子としてチヤンバーの下部 に'添カロした。
0. 5 ug/ml TIMP-2を上下のチャンバ一に添加する。'下チャンバ一表面の GFP- 陽 細胞は蛍光显微鏡を用 、て数えた。偽および 1T1PEX - F導入細胞の GFP-陽 钿 月激は各々 1. 31 X 104 および 1. 12 X 104 /1 X 105 個である。
図 15で示したように偽遺 ^(Mock)導入細胞による浸潤は外来より添加した TI MP-2で 50% P且害された。 しカヽし、 MT1PEX-F発現プラスミドの導入によっては、浸 潤は 70%抑制された。発現細胞への TIMP - 2添加は、 さらなる浸潤を ¾Jさせなか つた。 これらの結果は、 MT1PEX- Fか Ί性発現した MT1-MMP活性だけでなく内因 †«1-MMPの活性もまた阻害できることを示唆している。 つまり、 HT1080細胞 での PEXの発現はマトリゲル浸潤活性を有意に させた。
言い換えれば、 これらの知見は細胞表面でプロ MMP - 2を活性化する MT1 - MMPの 作用機構を示して 、るのであつて、 この機構は糸纖における細胞の浸潤性を最終 的に促進することをも明らかにするものである。 ΜΠ- MMPの二量体形成はプロ MM P-2 の活性化に必須であり、 IIS細胞浸潤を促進することを示しているのである
(7) MTl- MMPの同種繊 0†生複合 ί本形成
細胞表面上での MT1-MMPによるプロ ΜΜΡ-2の活性化はプロ ΜΜΡ - 2、 ΤΙΜΡ-2およ ぴ ¥Γ1-置の三元複合体形成を必要とし、 また、 その三元複合体の近傍に ΤΙΜΡ - 2 フリー MTl- ΜΜΡの存在を必要とする。 もし、 ΤΙΜΡ- 2フリー MTl- ΜΜΡ と三元複合体 力 隹れて存在すると、活性化は起こらない。我々は、 このように、 MT1-MMP力く MM P-2 の複合体を効率的に活性化するために、細胞表面上で同種親和性複合体を形 成するという仮説を立てた。 この可能 f生を試験するために、 FLAG標識 MT1-MMP(MT 1-F)および c-Myc標識 MTl-MMP(MTl-Myc) (図 16) を C0S1細胞で共発現させ、 Μ - Fを微1^ M2抗体結合ビーズと共に;^沈降させた。 図 17に示すように、 MT1- Mycは MTl-Fを共発現させると MTl- F と共に: ^沈降した （レーン 6、 ^FLAGお よ ¾¾yc)。一方、 MTl-Myc稱虫では 沈降しなかった （レーン 7、 |¾Iyc)。 このことは、異なった tagを有する MTl- MMP分子がお互いに複合体を形成するこ とを示唆している。 次に、複合体形成に必要なドメインを調べるために、 MT1 - F を PEX ドメインを^！口した MTl- MMP(MTlCat)或いは角蝶ドメインを^!口した Μ - MMP(MTIPEX) を共発現させた （図 16) 。 そして次に i CFLAGビーズで 沈降した 。 MT1 - F と共に繊沈降する分子種を調べるため、 サンプルは次に微 LAG M2、 Τ1ΡΕΧおよび ¾¾TlCatを用いたウェスタンプロットに供した。 図 18に示すよう に、 MTlCatではなく MT1PEXが MTl- F と共に 沈降した （それぞれ 、 レー ン 9、抗 Cat、 レーン 8 ) 。 これは MT1 -丽 P力 ΕΧ ドメインを介して同種親和性 複合体を形成することを示している。
(8) 細胞表面上でめ MTl- MMPによる proMMP - 2活性化に対する PEXの必要性 proMMP - 2の活性化において MT1 - MMP PEX ドメインの重要十生を石鶴忍するために、 PEX ドメインを MT 4 -MMPからのものに変化させた （図 19、 MT1-MT4PEX) 。 図 20に 示すように、 MTl- MT4PEXを発現する C0S1細胞は proMMP-2を活性しなかった （上段 ノヽ。ネル） 、 im,発現レベルは野^ と類似していた （第二パネル、抗 Cat ) o MT: MT4PEXは細胞表面で発現されている。 なぜなら、 その^ ίは、表面ピオ チン化に感受 ftであったからである （下段パネル、 ピオチン化） 。 MT1- MT4PEXは MT1-MT4PEX発現細胞に結合した profflP - 2として、細胞表面に MT1- MT4PEX/TIMP-2/ proMMP- 2の三元複合体を形成することが出来る （図 21、 レーン 2および 3 )。 MT 1 - MT4PEXが細胞表面上でタンパク分解活性を有する力、否か調べるために、形質導 入細胞を DQ™ゼラチン基質上で培養した。 DQ™-ゼラチンは蛍光消光したゼラチ ンでたん白質分解性の消ィ匕で蛍光を示す。 図 22に示すように、 ΜΠ-匿並びに MT 1-MT4PEX発現細胞はタンパク分解活性を示した。脑、対照 (Mock)は示さなかつ た。 この活性はまた BB94により完全に阻害された。 MT1- MT4PEXのようにそのタン パク分解活 ' びに細胞表面上での MTlCat/TIMP- 2/pro匿- 2の三元複合体系性能 を有しているにも力、かわらず、 PEX ドメイン^!口 MT1- MMP(MTlCat) 力 ¾roMMP- 2を 活性化できないことを確認した。 まとめると、 これらのデ一夕は細胞表面上での PEX ドメィンを介した MT1 - MMPの二量体形成が porMMP- 2を活性化するのに必要で めることを した。
(9) 細胞表面での MT1- MMP同種親和性複合体形成 . ' 細胞における鍵の二量体形成をモニターするために、分子相互作用を検出す るための Sijのアプローチを取った。神経成長因子受容体 (NGFR) 含む成長因子受 容体は、 m iドメィンを介し二量体或いはォリゴマ一複合体を形成し特異的リ ガンドと結合する。 続いて、 チロシンキナーゼ（TK) を含む細胞内ドメインは近 傍にもたらされ、 このように、受容体^ ^とのキメラタンパクを作ることにより 夕ンパク質の特異的なホモダイマー相互作用を すること力河能となる。例え ば、 NGFRの細胞質内領域と四量体を形成する藤性たん白質 BCR-ABLの BCR との 融合たん白質は、 チロシン残基の構造的なリン酸化を示した。 このようにして、 MT1-MMPの外部領域と NGFRの膜貫通と細胞質内領域からなるキヌラたん白質を構 築した （図 8、 MT1-F/NGFR)。
このシステムにおける H域寺異的な相互ィ乍用を試,験するため、以下のキメラが 構築された： MT1PEX - F/NGFB ； MTlCat-F/NGFR； MT4PEX- F/NGFR (図 8)。 これら の構築物は C0S1細胞中で ΜΊ1 - F/NGFRと類似したレベルで発現され、微 LAG M2抗 体によって認識された （図 9、上パネル、 i¾UG、 レーン 2— 4 ) 。 同一検体を PYで分析した 、 MT1PEX-F/NGFRのみが強いリン酸化を示した （下パネル、 An ti-PY、 レーン 2 )。 MTlCat-F/NGFRおよび T4PEX - F/NGFRのリン酸化レベルは 非常に低かった（ レーン 3および 4)。 これらの結果は、細胞表面上で PEXを介し た同種親和性複合体を形成することを示し、初期データを支持するものである。 次に、 キメラのニ量体形成を破壊することが出来るか否かを試験するために、 MT1-F/NGFRおよび LAG-tagged MTIPEX(MTIPEX-F), MTlCat(MTlCat-F)或いほ ΜΊΊ- Fの発現プラスミドを共導入した。 図 23で示したように、 MT1PEX-Fおよび ΪΓΙ-F の共発現は MT1-F/NGFRの二量体形成を効率的に競合した （レーン 2および 4 )。 im, MTlCat-Fの発現はそのバンドの強度を減少させなかった （レーン 3 ) 。 さ らに、 リン酸化の 90%以上の阻害か ΪΗΡΕΧ-F発現レベルの増加により！^された (図 10、 レーン 1— 5 ) 。 このことはさらに MT1-匪 P ^か ?EX ドメィンを介し 相互作用することを示している。
(10) MT1-匿の二量体形成による proMMP - 2活性化の増カロ
キメラ構築物を用い、 次に細胞表面上での MT1 - MMP二量体形成を制御する因子 の を調べた。 felking破骨細胞において MT1-MMP力 劐犬仮足構造に局在する こと力報告されていることより、 GTP-結合 MRaclが、細胞の顧犬仮足の形成を促 進するので恒常的に活性を有する小型 GTPase Racl (V12Racl, RaclDA) の二量体 形成に る影響を調べた。 MT1-F/NGFRを C0S1細胞に RaclDAと共に発現させ、 リ ン酸化チ口シンシグナルをモニタ一した。 図 24に示すように、 RaclDAと MT1-F/NG FRの共形質導入は MT1 - F/NGFR戦虫に比べリン酸化チ口シンシグナルを増カロさせた
Q P , レーン 1および 3 )。 Μ ΡΕΧ - Fを共発現させるとき、 そのシグナルは 4 3 %まで 1した。 このことは、増加したリン酸化チロシンシグナルが増加した 二量体形成の結果である事が示唆される。 しかし、 MT1PEX- Fが二量体形成を阻害 するため、 Raclシグナルの下流に存在するかもしれない他のチロシンキナーゼに よることは考え難 、 (ίπΡΥ. レーン 2および 4さらに図 9、 10及び 23) 。 リン酸 化チロシンに対する MTl- F/NGFR発現細胞の;^染色は明確なシグチルが細胞にお いて検出され、特に F-ァクチンが濃縮された場所に検出される （図 25、 MT1-F/NG FR) o RaclMの発現は波立った膜 （ruffled membranes)を生じる （図 25、 MT1-F/ NGFR · EaclDAおよび！? aclDA) 。 驚いたことにリン酸化チ口シンシグナルは ruffle d membrane構造の縁に広範に局在した （MT1-F/NGFR · RaclDA) 。 これらのシグナ ノレは MT1-F/NGFRにより生じている事を石鶴忍した。 なぜなら、それらは titFLAG Ml 抗体を用いた染色パ夕一ンと共局在し、 そのようなシグナルが RaclM或いは対照 形 云換細胞（EaclMおよび lock) では検出されなかったからである。 これらの 結果は促進されたニ量体形成が ruff led membraneの縁で生じて 、ることを示唆し ている。次に、 MT1-MPによる proMMP - 2活性化における RaclDA発現の影響を検討 した。 図 26に示すように、 ΜΊ - MMP.と RaclDAの共発現は明ら力、に profflP-2を活性 型にするプロセシングを促進した。形 l云換した細胞における MT1-Fの^ ^在 は MT1- F力細胞表面に分布し、 F -ァクチン力や濃縮されている lamellipodium stru ctureに相対的に濃縮されていることを示した （図 27、 ¾¾1AG、 MT1-F )。
、 MT1-F との RaclMの共発現は ruff led membrane edgeにおける MT1-Fの局在を 強化した （I¾1AG、 MTl-F/RaclDA) 。 これらのデータは RaclDAの発現 MT1 - MMP 二量体形成および形質 ±での MT1-MPの増加した を生じる membrane ruffl esの形成により proMMP - 2の活性化を促進しすることを示唆して 、る。
(11) 細 g包表面における MT1-MMPの複合体形成の生物学的活性における重要性 次に、 proMMP - 2の活性ィ匕における MT1PEX-Fの景 を調べた。 なぜなら、 MT1PEX - Fは MT1- F/NGFRの二量体形成を効果的に阻害するからである。 C0S1細胞に ΜΠ-腿 Pおよび T1PEX - Fプラスミ ドを異なった比率で遺 fe?導入した。
図 29にしめすように、細胞表面に結合してレ、る pro匿 - 2もまた MT1PEX- Fの発現 に景 を与えなかつた。 MT1PEX - Fの共発現は細胞表面上に結合した proMMP - 2の量 を させず、 活性型は検出されなかった。 MT1PEX-Fはまた図 30に示すように、 細胞表面上での MT1-MMPのタンパク分解活性に影響を与えず、類似のゼラチン分 角? ターンおよび領域を示した。 それゆえ、 MT1PEX- Fか ΪΓ1-ΜΜΡの二量体形成を 阻害し、細胞表面上での proMMP- 2活性化における MT1 - MMPのドミナントネガティ ブ的様式で働くことを示している。
HT1080細胞は内因†4MT1-MMPおよび！ MP - 2を発現していること力く知られている 。 次に、 HT1080細胞における内因性 proMMP- 2の活性ィ匕における MT1PEX- F発現の影 響を調べた。 細胞に MT1PEX - Fブラスミ ド或 、はハイグロマイシン耐隨 ^を生 ずる空のベクタ一を形質導入した。ハイグロマイシン耐生钿胞からの培養液中に された MMP- 2をザィモグラフィ一により分析した。 図 31に示すように、対照 細胞は BB94感受性の; ϋ¾で内因 'SMMP- 2を活性化する しヒ段パネル、 レーン 1お よび 2 ) o ffc¾"、 MT1PEX - F発現細胞は proMMP- 2を効率的に活性化しなかった （上 段パネルレーン 3 ) 。細胞可溶化物のウエスタンブロット分析は、 HT1080細胞か' 自然に ΜΠ- MPを し、 それは以前に報告されているように"" ¾¾3kDa断片に プロセシングしていた。 MT1PEX- Fは内因性 MT1-MMPの発現およびプロセシングに 影響しなかった。 内因'陋 Tl- MMP と MT1PEX-Fの共発現は明ら力、に両^？の共局在 力 田胞の端であることを示している （図 32) 。 本発明により、 Μ -ΜΜΡ は、 MT1- PEXを通して単純二量体を形成し、 その複合 体形成は細胞表面でのプロゼラチナーゼ Ά (プロ匿- 2)活性化に必須であることが 明らかとなった。細 3包表面の MT1 - MMP はプロ MM P— 2の活性化に TIMP- 2が必要 なのと同様に、本発明で示したような二量体形成を必要とすることは明らかであ る。 MT1 - MMPに結合した TIMP- 2は、活性化が起こる細胞表面でのプロ MMP- 2の濃 縮に必要とされる。 ΉΜΡ-2で阻害されない MT1- MMPは、 ΉΜΡ- 2/MT1- MMP複合体に 結合したプロ MMP- 2の活性化用にその近くに位置すべきである。
本発明で示したように、 PEXを持たない MT1-匿 (MTlCat-F) はもはやプロ MMP- 2を活性化できない。 ところで、 MTlCat- F発現細胞はその細胞表面でゼラチナ一 ゼ活 ί生と TIMP- 2結合能を示したので、 MTlCat-Fがプロ ΜΜΡ - 2を活性化できないと いう欠点はたん白分解活性や TIMP-2結合倉^:損ということによるものではないこ とは明らカヽである。 した力つて、 活性化は細胞表面での MTlCat - Fのランダムな分 布に起因すると思われる。 力、くして、細胞表面での PEXを通しての MT1 - MMPの二量体形成は、 , 2 ^ 間のより接近した分子配列を可能とさせるもので、二量術复合体の内の 1つの MT 1-MMPがプロ MMP-2 レセプ夕一として働くために TIMP - 2に結合し、 もう 1つの MT 1- MP はレセプ夕一に結合したプロ龍 P-2のプロペプチドを切断すると思われる 一方、 Μ ΡΕΧ- Fは、 MT1- MMP/TIMP- 2複合体と角»01 - MMP間に一定の距離を つくり、 活'性ィ匕のためのプロ MMP-2 と の反応を P ihするのである。
、 HT1080細胞を用いての MT1- MMPの角蝶領¾ ^損型が報告されている (Sta nton, H. et al. , J. Cell Sci.， 111， 2789-2798 (1998)； Lehti, K. et al. , Biochem. J. , 334, 345-353 (1998)) が、 これは ΜΊΊ- MMPそのもの、 または ΜΊΊ- MMPによる活性化 MMP- 2の働きにより、 MT1-MMPの角媒領域の末湍にある Ala2 5 5 -Lieを特異的に切断した結果であると^される。
この M員型は PEXを保持しているので MT1PEX- Fと同様の効果を持つかもしれな い。 したがって、 この処理は、 MT1-MMP活性を除去するだけでなく、隣接 MT1 - MM P活性をも阻害するかもしれない。
本発明により、 PEXは、 MT1 - MMPの二量体形成に重要な役割を果たし、 さらに 細胞表面でのプロ MMP- 2の効果的活性化を容易なものとする働きをしているもの であること力明らかとなったことから、 PEXはマトリキシンでユニークに ί呆存さ れた領域で、 それは生物学的システム中での酵素の運命を決定する分子との反応 性に関与する ~¾的な装置と考えられる。 かくして、 MT1PEX- Fを用いてプ 丽 Ρ- 2活性化の役割、又はある生物学的シス テム中での MT1- ΜΜΡの二量体形成をテストすることができる。 また、 MT1- ΜΜΡや ΜΜΡ-2を産生する HT1080細胞 (Strongin, A. Y. et al. , J. Biol. Chem.， 270, 5331-5338 (1995)) のマトリゲル浸潤活性か ΪΓ1ΡΕΧ- Fにより効果的に阻害される こと力、ら、癌細胞の浸潤及び Z又は転移の抑制及び Z又は ISihも図る手段の開発 '研究に禾幌できる。 また、 MT1PEX - Fはタンパク質分解活性に景 を及ぼすこと なく MT1 - MMP機能を ISihすることも明らかにされた。 NGFR由来膜貫通領域 Z細胞 質領域を持つ MTl-F/tfkは二量 复合体を形成し、 この複合体形成は MT1PEX- Fに より ihされること力、ら、膜貫通領域/！田胞質領域のシ一クェンス特 1"生は二量体 开诚に重要ではないこと力示唆されて 、る。 また、 GPI-Jffi¾MTlPEX-Fはプロ MP- 2活性化を阻害した。 した力つて、 MT1PEX - Fの阻害効果は真に PEX相互作用によ る結果である。 産 ¾ lの利用可能性
本発明により、細胞表面に存在する MT1-MMPによるプロ MMP- 2 の活性化機構が 解明され、 それによりプロ MMP-2の活性化に影響を与える活性を持つ物質の研究 '開発か可能になった。 さらには、 プロ MMP- 2 の細胞表面に存在する MT1-MMPに よる活性化は、生体の様々な生理的 ·生物的現象、例えば癌細胞の浸潤 ·転移を はじめとした生体の障害、異常及び Z又は ^^に関与していることが疑われてい ること力ヽら、 これらの予防及び Z又は治療に役立つ途を提供するものである。 本発明は、前述の説明及び戴包例に特に記載した J»も、実行できることは明 らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形か可能であり、 従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。 ·

Claims

請 求 の 範 囲
1. 膜型マトリックスメタ口プロテアーゼ- 1 (membrane-type 1 matrix m etalloproteinase: Μ -ΜΜΡ)の複数からなる複合体形成を阻害することを特徴と する、 MT1-MMP複合体形成阻 *¾。
2. MT1-MMPの纖からなる複合体形成を阻害することを特徴とする、 プ 口 ΜΜΡ-2 の活性化阻
3. MT1-MMPの からなる複合体形成を阻害してプロ ΜΜΡ-2の活性化阻 害をなすことを とする、細胞の移動、浸潤及び/又は転移 ffiih剤。
4. 細胞が、癌細胞であることを樹教とする請求項 3記載の斉 (J。
5. からなる複合体が、 MT1-MMPの単純二量体であることを特徵とす る請求項 1〜 4の L、ずれか一記載の剤。
6. 複合体形成が、少なくとも細胞表面に存在する MT1-MMP との間でなさ れてレヽるものであることを 1 ^とする請求項 1〜 5のいずれか一記載の剤。
7. MT1-MMPの複数からなる複合体形成を阻害することを特徴とする、 MT 1-MMP複合体形成を阻害する方法。
8. MT1-MMPの纖からなる複合体形成を阻害することを特徴とする、 プ 口 MMP-2の活性化を阻害する方法。
9. MT1-MMPの複数からなる複合体形成を阻害してプロ MMP- 2 の活性化阻 害をなすことを樹敫とする、 細胞の移動、浸潤及び Z又は転移を ffiihする方法。
10. 細胞が、癌細胞であることを樹敷とする請求項 9記載の方法。
11. ネ纖力、らなる複合体が、 MT1-MMPの単純二量体であることを樹敫とす る請求項 7〜10のいずれか一記載の方法。
12. 複合体形成が、少なくとも細胞表面に存在する MT1- MP との間でなさ れているものであることを特徴とする請求項 7〜11のいずれか一記載の方法。
13. 細胞表面に する MT1- MMPの単純二量体形成を阻害する活性を有す る物質。
14. MT1-MMPのへモぺキシン様ドメィン (PEX) 夕ンパク質又はその断片あ るいはそれらと実質的に同等の活性を有するものであることを樹敫とする請求項 13記載の物質。
15. Met プラス MT1 - MMPの Cys3 1 9 力、ら Gly5 3 5 あるいはそれと実質的に 同等の活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項 14記載の物質。
16. (i) MTl-MMPの PEXをコードする核酸、
(ii) MT1- MMPの PEXの断片をコ一ドする核酸、
(iii)上記 α)の核酸とハイブリダィズすることができる核酸、及び
(iv) 上記（i)〜(iii) のいずれか一の核酸と実質的に同等の活性を有する核酸 から成る群から選ばれたものであることを樹敫とする核酸。
17. MT1-MMPの膜貫通ドメィン (TM)/細胞質内ドメィン (CP)を神 長因 容体 (NGFR)の TM/CP に置換してあるキヌラ あるいはそれと実質的に同等 の活性を有する であることを稱敫とする請求項 16記載の核酸。
18. Met プラス MT1- MMPの Cys3 1 9 力、ら Gly5 3 5 をコ一ドする核酸あるい はそれと実質的に同等の活性を有する核酸であることを特徴とする請求項 16記載 の核酸。
19. 請求項 16~18のいずれ力、一記載の核酸を含有することを樹敫とするベ クタ一。
20. 言青求項 16〜18の 、ずれか一記載の核^ Xは請求項 18記載のべクタ一を 含有することをキ 敫とする形質車云換体。
21. MT1-MMPの TM/CPを NGFRの TM/CPに置換してあるキメラ肝あるいは それと実質的に同等の活性を有する分子を発現していることを输敷とする請求項 20記載の形難換体。
22. 請求項 16又は 18のいずれか一記載の核酸又は請求項 19記載のベクタ一 を含有することを特徴とする遺 治療用剤。
23. MT1- MPの ΡΕΧタンパク質又はその断片あるいはそれらと実質的に同 等の活性を有するポリぺプチドに文†Tる抗体。
24. MT1-MMPの PEXに結合することができる活性を有することを |敷とす る物質。
25. MT1PEXあるいはそれと実質的に同等の活性を有するものであることを 樹敫とする請求項 22記載の物質。
26. 請求項 1〜 6の 、ずれか一記載のものあるいは請求項 13〜： 16、 18—20 、及び 22〜25のいずれか一記載のものを含有することを特徴とする醒又は獣医
27. 細胞の移動、浸潤及び Z又は転移を抑制及び Z又は P ihするためのも のであることを糊敷とする請求項 26記載の ¾Xは獣医薬。
28. 細胞が、癌細胞であることを特徴とする請求項 26記載の隨又は獣医
29. MT1-MMPの鐘からなる複合体形成を指標に、 MT1 - MMPのネ纖からな る複合体形成を阻害する物質をスクリ一ニングすることを ί敷とするスクリ一二 ング方法。
30. ネ纖からなる複合体が、 MT1-MMPの単純二量体であることを樹敫とす る請求項 29記載の方法。
31. MT1-MMP の膜貫通ドメィン 01)/細胞質内ドメィン (CP)を神! 長因 容体 (NGFR)の TM/CPに置換してあるキメラ分子を することを特徴とする 請求項 29又は 30記載の方法。
32. 請求項 29〜31のレ、ずれか一記載の方法で取得した i -匿の謙力、ら なる複合体形成を阻害する物質。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004047856A1 (ja) * 2002-11-25 2004-06-10 Kureha Chemical Industry Co., Ltd. 癌転移抑制剤
WO2004072639A1 (de) * 2002-05-29 2004-08-26 Helmut Ponta Verfahren zur identifizierung von verbindungen zur unterdrückung metastasierender tumorzellen
US7758483B2 (en) 2000-10-10 2010-07-20 Grapha-Holding Ag Method and device for producing folded printed products
CN102718840A (zh) * 2012-08-06 2012-10-10 中山大学 一种人mmp-14抗原、相应单克隆抗体及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8722102B2 (en) 2010-01-29 2014-05-13 Dechra Veterinary Products Llc Compositions for treatment of skin and ear infections
US9133239B2 (en) 2010-04-20 2015-09-15 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for inhibiting matrix metalloproteinase (MMP)-mediated cell migration

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT750672E (pt) * 1994-03-17 2002-05-31 Max Delbrueck Centrum Sequencias de adn para metaloproteases matriciais, sua preparacao e utilizacao.
GB9615976D0 (en) * 1996-07-30 1996-09-11 Center For Clinical & Basic Re The use of proteinase inhibitors for the prevention or reduction of bone resorption

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOSHIKAWA NAOHIKO ET AL.: "Role of cell surface metalloprotease MT1-MMP in epithelial cell migration over laminin-5", THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 148, no. 3, February 2000 (2000-02-01), pages 615 - 624, XP002945633 *
LICHTE ANDREA ET AL.: "The recombinant catalytic domain of membrane-type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) induces activation of progelatinase A and progelatinase A complexed with TIMP-2", FEBS LETTERS, vol. 397, 1996, pages 277 - 282, XP002945635 *
OVERALL CHIRISTOPHER M. ET AL.: "Domain interactions in the gelatinase A.TIMP-2.MT1-MMP activation complex", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 50, December 2000 (2000-12-01), pages 39497 - 39506, XP002945637 *
SEIKI MOTOHARU: "Membrane-type matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis", BIOTHERAPY, vol. 13, no. 6, June 1999 (1999-06-01), pages 658 - 666, XP002945634 *
STRONGIN ALEX Y. ET AL.: "Mechanism of cell surface activation of 72-kDa type IV collagenase", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 10, 1995, pages 5331 - 5338, XP002945636 *
TAKINO TAKAHISA ET AL.: "Cloning of human gene potentially encoding a novel matrix metalloproteinase having a C-terminal transmembrane domain", GENE, vol. 155, 1995, pages 293 - 298, XP002945632 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7758483B2 (en) 2000-10-10 2010-07-20 Grapha-Holding Ag Method and device for producing folded printed products
WO2004072639A1 (de) * 2002-05-29 2004-08-26 Helmut Ponta Verfahren zur identifizierung von verbindungen zur unterdrückung metastasierender tumorzellen
WO2004047856A1 (ja) * 2002-11-25 2004-06-10 Kureha Chemical Industry Co., Ltd. 癌転移抑制剤
CN102718840A (zh) * 2012-08-06 2012-10-10 中山大学 一种人mmp-14抗原、相应单克隆抗体及其应用
CN102718840B (zh) * 2012-08-06 2014-05-14 中山大学 一种人mmp-14抗原、相应单克隆抗体及其应用

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