WO2004072639A1 - Verfahren zur identifizierung von verbindungen zur unterdrückung metastasierender tumorzellen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Entstehung von invasiven oder metastasierenden Tumorzellen des Colons, der Bauchspeicheldrüse, der Ovarien oder der Schilddrüse unterdrücken und/oder verzögern. Wobei die Ausbildung eines trimeren Komplexes, enthaltend eine Rezeptor-Thyrosin kinase c-Met kodiert durch das Gen c-Met, eine Isoform des Zelloberflächenproteins CD44 enthaltend die Exonsequenz v6 und den c-Met Liganden HGF/SF, durch die Wechselwirkung der mutmasslichen Verbindungen mit wenigstens einer der genannten drei Komponenten verhindert und/oder verzögert wird.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Unterdrückung metastasierender Tumorzellen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Entstehung von invasiven oder metastasierenden Tumorzellen des Colons, der Bauchspeicheldrüse, der Ovarien oder der Schilddrüse unterdrücken und/oder verzögern.

Eine wichtige Eigenschaft von Zellen des mehrzelligen Organismus ist ihre Fähigkeit, mit der Proliferation aufzuhören, wenn der ihnen zugeordnete Raum ausgefüllt ist. Dieser Vorgang, der als Kontaktinhibierung bezeichnet wird, ist bereits seit langem bekannt. Das Zeichen, auf das die Zellen während des Vorgangs der Kontaktinhibierung ansprechen, könnte der Kontakt der Zellen untereinander bzw. der Kontakt zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix sein. Der Vorgang der Kontaktinhibierung erfordert, daß ein oder mehrere Oberflächensensoren vorhanden sind, die mit dem Zellkern kommunizieren, den Zellzyklus zum Stillstand in der G1 -Phase bringen und auf diese Weise eine Hemmung des Wachstums bewirken. In vitro, in der Zellkultur, vermehren sich normale Zellen so lange, bis sie die Oberfläche des Kulturgefäßes aus, bleiben dann in der G1/G0-Phase stehen, wenn sich eine dichte Einzelzellschicht gebildet hat (Kontakt-Inhibition). Ein weiteres Erscheinungsbild des Wachstumsstopps besteht in ihrer Unfähigkeit zur Kolonienbildung, wenn sie in einer Matrix ausreichender Dichte (Weichagar) eingebettet sind.

Die vollständigen Mechanismen, aufgrund derer die Zelle das Wachstum einstellt, sind noch weitgehend unbekannt. Der Verlust der Kontaktinhibierung und Kolonienbildung in Weichagar sind Eigenschaften, die für Krebszellen charakteristisch sind. Die Rezeptor-Thyrosin-Kinase c-Met und ihr Ligand HGF/SF kontrollieren verschiedene zelluläre Prozesse, die für das Überleben essentiell sind. Die Zerstörung der Gene der Rezeptor-Thyrosin-Kinase in Mäusen führt zu einem Absterben von Embyonen aufgrund einer fehlenden Entwicklung der Plazenta (HGF/SF) und einer reduzierten Entwicklung von verschiedenen epithelialen Organen. Analysen dieser genetisch veränderten Mäuse und Studien mit Organ- und Zellkulturen ergaben, daß die Rezeptor-Thyrosin-Kinase an einem invasiven Wachstum und der zellulären Migration, der Proliferation und Differentiation, an der mesenchymal-epithelialen Kommunikation und tubular endothelialen Organisation und Morphogenese beteiligt. Die Rezeptor-Thyrosin-Kinase c-Met wird vor allen Dingen in epithelialen Zellen exprimiert, während ihr Ligand HGF/SF in mesenchymalen Zellen sekretiert wird. Das Protein c- Met trägt zwei essentielle Tyrosinreste, Y1349 und Y1356, die durch Phosphorylierung als sogenannte Docking Sites für verschiedene Signalkomponenten dienen. In tierischen Systemen katalysiert c-Met invasive und metastatische Eigenschaften von. Die Amplifikation des Gens c-Met und die Überexpression von c-Met wurde in menschlichen Krebszellen des Colons, der Bauchspeicheldrüse, der Ovarien und der Schilddrüse beobachtet. Vererbbare Nierencarcinome ebenso wie Carcinome im Kopf und Nacken werden mit dem Gen Locus c-Met in Verbindung gebracht.

Das invasive und methasthatische Wachstum von Tumoren wird jedoch nicht nur durch das HGF/SF/MET System und seine intrazellulären Transduktionswege beeinflußt, sondern auch andere Wachstumsfaktoren, die extrazelluläre Matrix, Adhäsionsmoleküle und ihre intrazellulären Komplexe sind verantwortliche Determinanten für das Wachstum der Tumoren. Zahlreiche Untersuchungen zur Identifizierung und Selektion relevanter Komponenten wurden durchgeführt. Durch die differenzielle Expression von Epitopen in metastatischen und nicht-metastatischen Krebszellen der Bauchspeicheldrüse konnte eine Metastase-assoziierte Isoform von CD44 identifiziert werden. Die Bezeichnung CD44 steht für eine Familie von Klasse I Transmembranproteinen, produziert durch stark ausgeprägtes alternatives splicing der Exons v1 bis v10.

Ein kausaler Zusammenhang zwischen CD44 Isoformen und der Ausbildung von metastatischen Tumorzellen wurde durch die Übertragung von CD44 Isoformen in verschiedene nicht-metastatische Zelllinien dokumentiert. Isoformen, welche die Sequenzen kodiert durch die Exons v4 bis v7 oder nur v6 und v7 aufwiesen, reichten zur Ausbildung eines metastatischen Potentials aus. Antikörper gerichtet gegen ein v6 kodiertes Epitop oder CD44v6 antisense RNA unterdrückten das Tumorwachstum in vivo und eine metastatische Verbreitung der Krebszellen.

Die Aufklärung des molekularen Zusammenspiels der einzelnen Faktoren bei der Entstehung von invasiven oder metastasierenden Tumorzellen, bevorzugt des Colons, der Bauspeicheldrüse, der Ovarien oder der Schilddrüse, sind daher von hoher medizinischer Relevanz. Ebenso ist die Identifizierung von Verbindungen, welche die Entstehung von invasiven oder metastasierenden Tumorzellen verhindern und/oder verzögern können, von enormer Relevanz.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Entstehung von invasiven oder metastasierenden Tumorzellen des Colons, der Bauchspeicheldrüse, der Ovarien oder der Schilddrüse unterdrücken und/oder verzögern, wobei die Ausbildung eines trimeren Komplexes, enthaltend eine Rezeptor- Thyrosinkinase c-Met kodiert durch das Gen c-Met, eine Isoform des Zeiloberflächenproteins CD44 enthaltend die Exonsequenz v6 und den c- Met Liganden HGF/SF, durch die Wechselwirkung der mutmaßlichen Verbindungen mit wenigstens einer der genannten drei Komponenten verhindert und/oder verzögert wird.

Hierbei ist es denkbar, daß die mutmaßlichen Verbindungen in dem erfindungsgemäßen Verfahren extrazellulär zugesetzt und/oder infrazellulär bereitgestellt werden.

Es konnte gezeigt werden, daß für die c-Met-Aktivierung und Signalübertragung die Anwesenheit e ner CD44 Isoform enthaltend eine v6 Sequenz absolut erforderlich ist. D e Rezeptor-Thyrosin-Kinase c-Met, der Ligand HGF und eine CD44-Vari ante enthaltend eine v6 Sequenz bilden einen trimeren Komplex. D ese Komplexbildung wird durch

Antikörper, die spezifisch die v6 Epitope erkennen, unterbunden.

Eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich dadurch

a) eine Zellkultur einer Tumorzellinie von Zellen des Colons, der Bauchspeicheldrüse, der Ovarien oder der Schilddrüse bereitgestellt wird, wobei diese Tumorzellinien-Kultur zur

Ausprägung der Rezeptor-Thyrosinkinase c-Met, einer Isoform des Zelloberflächenproteins CD44 enthaltend die Exonsequenz v6 und des c-Met Liganden HGF/SF fähig ist, b) dieser Zellkultur extrazellulär mit einer Verbindung versehen wird, die mit wenigstens einer Komponente des trimeren Komplexes spezifisch interagiert, c) die so behandelte Zellkultur zur Vermehrung der Zellen mit einem entsprechenden Kulturmedium versehen wird und d) eine Verbindung aus b) als eine solche identifiziert wird, die die Ausbildung des trimeren Komplexes verhindert und/oder unterdrückt, so daß die Zellen der Tumorzellinie sich nicht mehr vermehren.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt b) eine Verbindung intrazellulär bereitgestellt, wobei diese Verbindung aktiv durch Membrantransportproteine oder passiv durch Diffusion in die Zellen eingebracht oder direkt von den Zellen selbst synthetisiert wird.

In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Verbindung ein Peptid verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung wird ein spezifischer Antikörper gegen die Exonsequenz v6 des CD44-lsomers verwendet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens der zuvor erläuterten Art identifiziert werden.

Dabei zeichnen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen dadurch aus, daß sie spezifisch an die Exonsequenz vδ des Zeiloberflächenproteins CD44 binden. Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Peptide.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Krebserkrankungen. Ebenso ist erfindungsgemäß eine Verwendung der Verbindungen zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen umfaßt.

Durch die nachfolgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung näher erläutert, die jedoch nicht limitierend wirken. C-Met Aktivierung

Es wurden zwei metastatische Zelllinien, BSp73ASML und HT29, die CD44 Proteine mit einer v6 Sequenz und c-Met exprimieren, eingesetzt. Die genannten Zelllinien wurden ausgehungert, und dann mit HGF in Anwesenheit oder Abwesenheit eines CD44v6 spezifischen Antikörpers behandelt und 5 Minuten später geerntet. C-Met wurde anschließend

- immunpräzipitiert, über eine SDS-PAGE Elektrophorese aufgetrennt und einer Westem-Blot Analyse unter Verwendung von Phosphotyrosine- spezifischen oder c-Met spezifischen Antikörpern eingesetzt (Fig. A1). Während HGF zu einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung von c-Met führte, verhinderte der CD44v6 spezifische Antikörper dieser Aktivierung vollkommen. Antikörper, welche die N-terminale Domäne von CD44 erkennen (IM7 und J173) zeigten diesen Effekt nicht. Auch Antikörper, die die kleinste Einheit von CD44 (CD44s) oder eine CD44-Variante enthaltend die v6-Sequenz aber nicht die Exon15-Sequenz (Epitop 5G8) erkennen, sind ineffektiv. Aufgrund dessen ist CD44v6 für die c-Met- Aktivierung absolut erforderlich.

Vergleichbare Ergebnisse zeigen Fig. 1B und 1C. HGF-abhängige metastatische Eigenschaften von Tumorzellen wurden bei Anwesenheit von Anti-v6-Antikörpern unterdrückt (Fig. 1B und C). Der Anti-v3- Antikörper BBA11 unterdrückte die Metastasierung nicht, so daß das Exon v3 vermutlich nicht an diesem Prozeß beteiligt ist.

CD44 Isoformen enthaltend Exon v6 sind notwendig und ausreichend für die Kooperation mit c-Met.

Kooperation von CD44 und c-Met

Zur Untersuchung, welche CD44 Varianten zur Kooperation mit c-Met erforderlich sind, wurde in zwei verschiedenen Tumorzelllinien eine Exon- spezifische RT-PCR durchgeführt (Fig. 2). Die Zelllinie HT29 exprimiert vor allen Dingen 4 Isoformen von CD44, nämlich CD44v4-10, CD44v2,3,8- 10, CD44v2,9,10 und CD44s. Das stärkste Signal (in Fig. 2; Spur C) ergab die Isoform C44v4-10.

Die dominanten Isoformen von CD44 in der Zelllinie BSp73ASML sind CD44v4-7, CD44v6,7 und CD44s.

Zur Überprüfung, welche der CD44 Isoformen mit c-Met wechselwirken, wurden c-DNA Expressionsklone, die individuelle Isoformen von CD44 kodieren, in die Tumorzelllinie BSp73AS transfiziert. Die Zellinie BSp73AS exprimiert ausschließlich CD44s (Fig. 2) sowie vergleichbare Gehalte von c-Met im Vergleich zu der metastatischen Zelllinie BSp73ASML (Fig. 3C). Die transfizierte Rezipientenzelle aktiviert eine c-Met-Signalübertragung gemessen an der Phosphorylierung von ERK (Fig. 3B, Spur 1). Eine zusätzliche Überexpression von CD44s verstärkt diese Signalantwort nicht (Fig. 3B, Spur 2). Die Transfektionsexperimente zeigen deutlich, daß die HGF/SF-abhängige c-Met Phosphorylierung und ERK Aktivierung (Fig. 3B) durch alle CD44 Varianten, die eine Exon v6 Sequenz enthielten, oder ein Protein, das nur die v6 Region enthielt (CD44v6) erreicht wurde. Die Struktur der CD44 Varianten, die in die ∑elllinien eingebracht wurden, ist in Fig. 3A gezeigt. Beispiele für die , Expression von CD44v4-7 Transfektanten sind in Fig. 2 dargestellt. Diese Analyse enthält auch Exonvβ-enthaltende cDNA-Klone, denen die Exon15-Sequenz fehlt (Epitop 5G8; Δ15) und die zu einem metastatischen Verhalten der Zellen BSp73AS führen. Die An- oder Abwesenheit von Exon15 hat keinen Einfluß auf die Kooperation von CD44 mit c-Met.

Somit konnte gezeigt werden, daß die Anwesenheit der vδ Sequenz von einer CD44 Isoform ausreichend und obligat für eine c-Met Signalübertragung ist. Untersuchungen mit c-DNA Klonen, die CD44v1-10 Isoformen kodieren, aber eine Deletion von v6 aufweisen, haben gezeigt, daß diese Zellen keine c-Met vermittelte ERK Aktivierung bewirken (Fig. 3B).

Heparansulfat-Modifikation von CD44

Eine Heparansulfat-Modifikation von CD44 ist für die Aktivierung von c- Met durch HGF/SF nicht erforderlich, wie in Figur 4 gezeigt ist.

Aktivierung von Pro-HGF in die aktive Form von HGF HGF/SF wird als Einzelstrang-Vorstufe sekretiert, die durch Serum- Proteinasen (Shimomura, 1995) oder Plasminogenaktivatoren des Urokinase-Typs (Maldini, 1995) in eine aktive α-Form und ß- Untereinheiten prozessiert wird. Untersuchungen, ob CD44 an der Aktivierung von HGF beteiligt ist, wurde gekaufte und aus Drosophila Schneider Zellen (S2) isolierte HGF-Vorstufe zur Aktivierung von c-Met eingesetzt (Figur 5). Die Pro-Form von HGF ist trotz vorliegender kompetenter CD44-lsoformen jedoch nicht in der Lage c-Met zu aktivieren.

CD44vβ Isoformen, c-Met und HGF/SF assoziieren in einem trimeren Komplex

Zum Nachweis einer engen Assoziation der genannten 3 Komponenten in einer zellularen Membran wurden Co-Imunopräzipitationsstudien durchgeführt. Die Co-Präzipitation wurde ohne vorherige Vernetzung (cross linking) und nach Stabilisierung durch cross-linking mit Dithiobis(Sulfosuccinimidylpropionate); DTSSP durchgeführt. Ferner erfolgte eine paarweise Präzipitation und Detektion in Western-Blots sowie eine Imunopräzipitation in einem nicht-denaturierenden Gel und die Detektion der Komponenten durch Western-Blot. Die Ergebnisse sind in Figur 6 A dargestellt, und zeigen die Existenz eines induzierten trimeren Komplexes. Durch eine 2-dimensionale Auflösung unter nicht reduzierenden Bedingungen in der ersten Dimension konnte gezeigt werden, daß der vernetze Komplex alle 3 Komponenten enthält (Fig. 6A).

Die induzierte Bildung des immunpräzipitieren Komplex konnte durch vorherige Zugabe eines Antikörpers, der gegen das Exonvθ-Epitop von CD44 gerichtet ist, verhindert werden; nicht jedoch durch Antikörper, die spezifisch für den N-terminalen Bereich von CD44 sind (Fig. 6B).

Legende zu den Figuren

Figur 1 :

(A) Western-Blot Analyse der Tumorzelllinien HT29 und BSp73ASML ohne bzw. mit Phophotyrosin-spezifischen oder c-MET -spezifischen

Antikörpern.

(B) Mikroskopische Aufnahmen der Tumorzelllinie HT29 unter normalen Bedingungen, nach Behandlung mit HGF und nach einer Vorbehandlung mit einem vδ-spezifischen Antikörper und anschließender Behandlung mit HGF. Zellen die mit dem Liganden

HGF behandelt wurden, haben sich von einander getrennt, sind verstreut und gewandert. Durch die Vorbehandlung mit dem vδ- spezifischen Antikörper ist eine Zelltrennung und Wanderung verhindert worden. Die Zellen verbleiben eng miteinander assoziiert. (C) Schematische Darstellung der Chemotaxis von metastasierenden Zellen der Zelllinie BSp73ASML unter Zusatz von HGF in einem Matrigel. 50 ng/ml HGF wurden auf den Boden einer Transwell- Reaktionskammer plaziert. Die ASML-Zellen wurden in die obere Reaktionskammer gegeben, die durch einen Filter beschichtet mit Matrigel getrennt ist. Ohne den Zusatz von HGF wandern die Zellen nicht; eine Migration der Zellen ist jedoch deutlich durch die Zugabe von HGF zu erkennen. Diese Zellwanderung wird durch die Zugabe des CD44 Antikörpers vollkommen inhibiert.

Figur 2:

Elektrophoretische Auftrennung von RT-PCR Analysen der Tumorzellinien HT29, BSp73ASML, BSp73AS und BSp73Asv4-7Δ15. In den einzelnen Zelllinien sind die unterschiedlichen Isoformen von CD44 zu erkennen. Die mit M bezeichnete Spur zeigt einen Molekulargewichtsstandard, die Spuren v2 bis v10 stellen die CD44 Isoformen mit den unterschiedlichen Exon-Sequenzen dar. Zur Abschätzung der Intensität und Größe der einzelnen RT-PCR Produkte wurde in Spur C ein RT-PCR-Produkt mit primern aus einer konstanten Region von CD44 aufgetragen.

Figur 3: (A) Schematische Darstellung der unterschiedlichen CD44-lsoformen enthaltend entsprechende Exon-Sequenzen, die mit v identifiziert sind.

(B) Western-Blot Analyse der Zelllinie BSp73AS sowie transfizierte Zellen dieser Zelllinie, die unterschiedliche Isoformen von CD44 exprimieren. Die Aktivierung von c-Met ist durch die Phosphorylierung von ERK dargestellt. Der Zusatz von HGF zu den einzelnen Zellen ist durch - und + gekennzeichnet. Ebenso wurden den mit HGF behandelten Zellen spezifische Antikörper gegen die vδ Sequenz ( V6) oder gegen das Exon15-Epitop (5G8) zugesetzt.

(C) Western-Blot Analyse zur Darstellung von c-Met (Precurser und ß- Kette) in den Zellinien BSp73ASML, BSp73AS und BSp73Asv4-7Δ15.

Figur 4:

(A) Darstellung der ERK Phosporylierung mit und ohne Zusatz von HGF in einer Western-Blot Analyse der Zellinien HT29, BSp73Asv4-7Δ15 und BSp73Asv1-10, wobei die Zellen zusätzlich ohne oder mit Heparinase

(1 , 4 bzw. 6 U/ml) behandelt wurden, um den Einfluß einer Heparansulfat-Modifikation zu untersuchen. Eine Heparansulfat- Modifikation von CD44 hat keinen Einfluß auf die Aktivierung von c- Met durch HGF. (B) Western-Blot Analyse der Zellinien HT29, BSp73Asv4-7 und BSp73Asv1-10 ohne und mit Heparinase-Behandlung mit einem CD44-spezifischen Antikörper, der die Erkennung einer Heparansulfat- Modifikation an CD44 durch Bindung an Heparan-Reste aufgrund von Heparinaseverdau ermöglicht. Die CD44-lsoformen der genannten Zellinien unterlagen keiner Heparansulfat-Modifikation. Als

Positivkontrolle diente ein Lysate von CD44v1-10 transfizierten BSp73AS-Zellen. In Lysaten von HT29-Zellen konnte die Haupt-Cd44- Isoform nicht präzipitiert werden. HT29-Zellen tragen modifizierte und nicht-modifizierte CD44-Proteine.

Figur 5:

(A) Western-Blot zur Darstellung der Spaltung der HGF-Vorstufe HGFp, angereichert aus Drosophila Schneider Zellen (S2) bzw. kommerziell erworbenem HGFp, in die aktive Form HGFa durch Zusatz von Serum- Proteinasen. (B) Western-Blot Analysen zur Untersuchung der Spaltung der Vorstufe Pro-HGF (HGFp; angereichert aus Drosophila Schneider Zellen (S2)) in die aktive Form HGFa mittels CD44 in den Zellinien HT29 und BSp73Asv4-7Δ15. Die Proform ist trotz der Anwesenheit kompetenter CD44-lsoformen nicht in der Lage eine ERK-Phosphorylierung durch c-Met-Aktivierung zu vermitteln. Im Gegensatz dazu ist prozessiertes, aktives HGF mit Unterstützung von kompetenten CD44-lsoformen zur c-Met-Aktivierung fähig. Dies zeigt, daß eine CD44-c-Met-Kooperation nicht über die Spaltung der HGF-Proform in die aktive HGF-Form erfolgt. (C) Western-Blot Analysen zur Untersuchung der Spaltung der Vorstufe Pro-HGF (HGFp; kommerziell) in die aktive Form HGFa mittel CD44 in den Zellinien HT29 und BSp73Asv4-7Δ15. Die Proform ist trotz der Anwesenheit kompetenter CD44-lsoformen nicht in der Lage eine ERK-Phosphorylierung durch c-Met-Aktivierung zu vermitteln. Im Gegensatz dazu ist prozessiertes, aktives HGF mit Unterstützung von kompetenten CD44-lsoformen zur c-Met-Aktivierung fähig. Dies zeigt, daß eine CD44-c-Met-Kooperation nicht über die Spaltung der HGF- Proform in die aktive HGF-Form erfolgt. Figur 6:

(A) Zur Untersuchung der Assoziation eines trimeren Komplexes aus CD44v6-lsoformen, c-Met und HGF/SF wurden Co-Immun- Präzipitationsversuche durchgeführt. Die Co-Präzipitation wurde ohne und mit cross-linking (nach Stabilisierung mit

Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat); DTSSP) durchgeführt. Es erfolgte eine paarweise Präzipitation sowie Immuopräzipitation in einem nicht-denaturierenden Gel und Detektion in Western-Blots. In Lysaten der Zellinie BSp73AS konnte CD44s nicht präzipitiert werden. In Lysaten transfizierter Zellen, die zusätzlich Isoformen von CD44vδ enthielten, konnte ein trimerer Komplex ausgebildet werden. In Abwesenheit von HGF konnte c-Met und CD44 nicht co-präzipitiert werden. Von Lysaten der Zellinie HT29 konnte eine einzelne CD44- Bande einer Größe von 140 kDa zusammen mit den trimeren Partner präzipitiert werden. Das 140 kDa Protein entspricht der Hauptisoform von CD44 in HT29 Zellen. Durch eine zweidimensionale Auflösung, unter nicht-redu∑ierenden Bedingungen in der ersten Auftrennung, konnnten alle drei Komponenten des Komplexes nachgewiesen werden. (B) Western-Blot Analyse, die belegt, daß die Zugabe von Antikörpern spezifisch gegen das Exon-v6-Epitop von CD44 die Bildung des immunpräzipitierten trimeren Komplexes verhindert. Anitkörper gegen die N-terminale Domäne von CD44 zeigen diesen Effekt nicht.

Claims

Ansprüche:

1. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Entstehung von invasiven oder metastasierenden Tumorzellen des Colons, der Bauchspeicheldrüse, der Ovarien oder der Schilddrüse unterdrücken und/oder verzögern, wobei die Ausbildung eines trimeren Komplexes, enthaltend eine Rezeptor-Thyrosinkinase c-Met kodiert durch das Gen c-Met, eine Isoform des Zelloberflächenproteins CD44 enthaltend die Exonsequenz vδ und den c-Met Liganden HGF/SF, durch die Wechselwirkung der mutmaßlichen Verbindungen mit wenigstens einer der genannten drei

Komponenten verhindert und/oder verzögert wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen extrazellulär zugesetzt und/oder intrazellulär bereitgestellt werden.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet, daß e) eine Zellkultur einer Tumorzellinie von Zellen des Colons, der Bauchspeicheldrüse, der Ovarien oder der Schilddrüse bereitgestellt wird, wobei diese Tumorzellinien-Kultur zur Ausprägung der Rezeptor-Thyrosinkinase c-Met, einer Isoform des Zelloberflächenproteins CD44 enthaltend die Exonsequenz vδ und des c-Met Liganden HGF/SF fähig ist, f) dieser Zellkultur extrazellulär mit einer Verbindung versehen wird, die mit wenigstens einer Komponente des trimeren Komplexes spezifisch interagiert, g) die so behandelte Zellkultur zur Vermehrung der Zellen mit einem entsprechenden Kulturmedium versehen wird und h) eine Verbindung aus b) als eine solche identifiziert wird, die die

Ausbildung des trimeren Komplexes verhindert und/oder unterdrückt, so daß die Zellen der Tumorzellinie sich nicht mehr vermehren.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) eine Verbindung intrazellulär bereitgestellt wird, wobei diese Verbindung aktiv durch

Membrantransportproteine oder passiv durch Diffusion in die Zellen eingebracht oder direkt von den Zellen selbst synthetisiert wird.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung ein Peptid verwendet wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein spezifischer Antikörper gegen die Exonsequenz v6 des CD44-lsomers verwendet wird.

7. Verbindungen identifiziert gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Verbindungen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch an die Exonsequenz vδ des Zelloberflächenproteins CD44 binden.

9. Verbindungen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie Peptide sind.

10. Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Behandlung von Krebserkrankungen.

11. Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.