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WO2001068639A1 - Dihydropyrimidin-5-carbonsäureester und ihre verwendung als arzneimittel gegen virale erkrankungen - Google Patents

Dihydropyrimidin-5-carbonsäureester und ihre verwendung als arzneimittel gegen virale erkrankungen Download PDF

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Publication number
WO2001068639A1
WO2001068639A1 PCT/EP2001/002441 EP0102441W WO0168639A1 WO 2001068639 A1 WO2001068639 A1 WO 2001068639A1 EP 0102441 W EP0102441 W EP 0102441W WO 0168639 A1 WO0168639 A1 WO 0168639A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
compounds
zero
salts
methyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2001/002441
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Siegfried Goldmann
Jürgen Stoltefuss
Ulrich Niewöhner
Karl-Heinz Schlemmer
Thomas Krämer
Arnold Paessens
Erwin Graef
Olaf Weber
Karl Deres
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Priority to AU2001240674A priority Critical patent/AU2001240674A1/en
Publication of WO2001068639A1 publication Critical patent/WO2001068639A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond

Definitions

  • the present invention relates to new dihydropyrimidines, processes for their preparation and medicaments containing these dihydropyrimidines, in particular for the treatment and prophylaxis of hepatitis B virus infections.
  • the invention also relates to combinations of these dihydropyrimidines with other antiviral agents and, if appropriate, immunomodulators and medicaments containing these combinations, in particular for the treatment and prophylaxis of HBN infections such as hepatitis B.
  • the hepatitis B virus belongs to the Hepadna family. It causes an acute and / or a persistent-progressive, chronic illness. A variety of other clinical manifestations in the clinical picture are also caused by the hepatitis B virus - in particular chronic inflammation of the liver, cirrhosis of the liver and hepatocellular carcinoma. Furthermore, coinfection with the hepatitis delta virus can have a negative effect on the course of the disease.
  • interferon The only agents approved for the treatment of chronic hepatitis are interferon and lamivudine.
  • interferon is only moderately effective and has undesirable side effects;
  • lamivudine works well, resistance develops quickly during treatment, and rebound occurs in most cases after therapy is discontinued.
  • EP-PS 103 796 dihydropyrimidines are known, to which an effect influencing the circulation is attributed.
  • EP-A 169 712 describes substituted dihydropyrimidines as intermediates which can be oxidized to the corresponding pyrimidines.
  • WO 99/1438 relates to dihydropyrimidines which are said to be suitable for the treatment of cerebrovascular ischemia and pain.
  • WO 99/54312, 99/54326 and 99/54329 relate to dihydropyrimidines which are suitable for the treatment and prophylaxis of hepatitis.
  • the present invention relates to dihydropyrimidines of the formula
  • R 2 is methyl or ethyl
  • R 3 is a group of the formula -CH 2 -R 8 m -X n -R 9 ,
  • R 8 the group -CR 10 R n -
  • R 9 optionally branched C ! -C 4 alkyl, which may be substituted by azido,
  • R 10 is hydrogen, hydroxyl or methyl
  • R 11 is hydrogen or methyl
  • R 4 is hydrogen
  • R 5 pyridyl, which is substituted up to twice identical or different by halogen, or thiazolyl,
  • n zero or 1
  • Preferred compounds of the formulas (I) or (I a) according to the invention are those in which
  • R 2 is methyl or ethyl
  • R is a group of the formula -CH 2 -R m-Xn-R, wherein
  • R 9 is methyl, ethyl, n- or i-propyl, which can each be substituted by azido,
  • R 4 is hydrogen
  • R 5 pyrid-2-yl which is substituted in the 2-position by halogen or in the 2,4-position is identical or differently substituted by halogen, or thiazolyl,
  • n zero or 1
  • R 1 is phenyl which is disubstituted by fluorine, chlorine or bromine in the 2.4 or 3.4 position, identically or differently,
  • R 2 is methyl or ethyl
  • R 3 is a group of the formula -CH 2 -R 8 m -X n -R 9 , embedded image in which
  • R 9 is methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl or -C 2 H -azido,
  • R 5 pyrid-2-yl which is monosubstituted by fluorine or chlorine in the 2-position or is identical or different in the 2.4-position, or thiazolyl,
  • n zero or 1
  • R 3 contains at least one oxygen atom
  • R 1 is phenyl which is identical or different in the 2.4 position by fluorine, chlorine or
  • Bromine or in the 3.4 position is disubstituted by fluorine, R 2 is methyl or ethyl,
  • R 4 is hydrogen
  • R 5 is pyrid-2-yl which is monosubstituted by fluorine or chlorine in the 2-position or is disubstituted by fluorine in the 2.4-position, or thiazolyl, and
  • n zero or 1
  • the compounds of the invention can be in stereoisomeric forms, which are either like image and mirror image (enantiomers), or which are not like image and
  • the invention relates to both the enantiomers or diastereomers and their respective mixtures. Like the diastereomers, the racemic forms can be separated into the stereoisomerically uniform constituents in a manner known per se.
  • the compounds according to the invention include the isomers of the formulas (I) and (Ia) and mixtures thereof. If R 4 is hydrogen, the isomers (I) and (la) are in tautomeric equilibrium:
  • the compounds according to the invention can also be present as salts.
  • Physiologically acceptable salts are preferred in the context of the invention.
  • Physiologically acceptable salts can be salts of inorganic or organic
  • Salts of inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid or sulfuric acid, or salts of organic carboxylic or sulfonic acids such as acetic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, benzoic acid or methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, phenylsulfonic acid, toluenesulfonic acid or toluenesulfonic acid or toluenesulfonic acid or toluenesulfonic acid
  • Physiologically acceptable salts can also be metal or ammonium salts of the compounds according to the invention.
  • Z are particularly preferred.
  • the compounds of formula (I) according to the invention can be prepared by: [A] aldehydes of the formula
  • R 1 has the meaning given above
  • R 1 has the meaning given above
  • R »2 and ⁇ , ⁇ R, 3 have the meanings given above, and amidines of the formula (III) or with their salts (such as hydrochlorides or acetates)
  • R ) 5 has the meaning given above and
  • R. 1 1 3 J represents CrC 4 alkyl
  • a strong base preferably at temperatures of 20 to 150 ° C, optionally in the presence of inert organic solvents.
  • solvents are suitable as solvents.
  • solvents preferably include alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, ethers such as dioxane, diethyl ether, tetrahydrofuran, glycol monomethyl ether, glycol dimethyl ether, carboxylic acids such as glacial acetic acid, or Dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, pyridine and hexamethylphosphoric triamide.
  • reaction temperatures can be varied over a wide range. In general, temperatures from 20 to 150 ° C, but preferably at the boiling point of the solvent.
  • the reaction can be carried out at normal pressure, but also at elevated pressure. Generally one works under normal pressure.
  • the reaction can be carried out with or without addition of base or acid; however, it is advisable to carry out the reaction in the presence of weaker acids, e.g. Acetic acid or formic acid.
  • weaker acids e.g. Acetic acid or formic acid.
  • aldehydes (II) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [cf. T. D. Harris and G.P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 2 165 260, 2 401 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, 13 929 c (1963), E. Adler and H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), E.P. Papadopoulos, M. Mardin and Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78, 2543 (1956)].
  • the ylidene- ⁇ -keto esters (V) used as starting materials can be prepared by methods known from the literature [cf. G. Jones, "The Knoevenagel Condition” in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
  • enaminocarboxylic acid esters (VI) and the imino ethers (VII) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [cf. S.A. Glickman and A.C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
  • ß-ketocarboxylic acid esters (TV) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [e.g. BD Borrmann, "Implementation of Diketene with Alcohols, Phenols and Mercaptans” in “Methods of Organic Chemistry” (Houben-Weyl), Vol. VII / 4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano and O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
  • BD Borrmann "Implementation of Diketene with Alcohols, Phenols and Mercaptans” in “Methods of Organic Chemistry” (Houben-Weyl), Vol. VII / 4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano and O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
  • the compounds (VIII) are new; the invention therefore also relates to compounds of the formula (VIII).
  • the compounds according to the invention show a valuable, unforeseeable activity against viruses. Surprisingly, they are antiviral against hepatitis BV viruses (HBV) by causing an extremely strong reduction in the DNA of intra- and extracellular hepatitis B viruses.
  • the compounds according to the invention are therefore suitable for the treatment of virus-induced diseases, in particular acute and chronic persistent viral infections of HBV.
  • a chronic viral disease caused by HBV can lead to different severity of the clinical picture; As is well known, chronic hepatitis B virus infection in many cases leads to cirrhosis of the liver and / or hepatocellular carcinoma.
  • the treatment of acute and chronic viral infections that can lead to infectious hepatitis for example infections with hepatitis B viruses.
  • the compounds according to the invention are particularly suitable for the treatment of chronic hepatitis B infections and the treatment of acute and chronic hepatitis B virus infections.
  • the present invention includes pharmaceutical preparations which, in addition to non-toxic, inert pharmaceutically suitable excipients, contain one or more compounds of the formulas (I), (I a) or the example table or which consist of a or several active ingredients of the formulas (I) and (I a), and processes for the preparation of these preparations.
  • the active compounds of the formulas (I) and (I a) should be present in the pharmaceutical preparations listed above in a concentration of about 0.1 to 99.5, preferably of about 0.5 to 95,% by weight of the preparations his.
  • the pharmaceutical preparations listed above can also contain other active pharmaceutical ingredients.
  • One embodiment of the invention relates to combinations of A) at least one of the dihydropyrimidines defined above, B) at least one other antiviral agent other than A.
  • a particular embodiment of the invention relates to combinations A) above
  • Dihydropyrimidines B) HBV polymerase inhibitors and optionally C) immunomodulators.
  • Preferred immunomodulators C) include, for example, all interferons such as ⁇ , ⁇ and ⁇ interferons, in particular also ⁇ -2a and ⁇ -2b interferons, interleukins such as interleukin-2, polypeptides such as thymosin- ⁇ -1 and thymoctonan, imidazoquinoline, derivatives such as ®Levamisole, immunoglobulins and therapeutic vaccines.
  • interferons such as ⁇ , ⁇ and ⁇ interferons, in particular also ⁇ -2a and ⁇ -2b interferons, interleukins such as interleukin-2, polypeptides such as thymosin- ⁇ -1 and thymoctonan, imidazoquinoline, derivatives such as ®Levamisole, immunoglobulins and therapeutic vaccines.
  • the invention therefore also relates to these combinations for the treatment and prophylaxis of HBV infections and their use for the treatment of HBV-induced
  • HBV-induced diseases have valuable advantages compared to monotherapy with the individual compounds, namely mainly a synergistic antiviral
  • HBV polymerase inhibitors B for the purposes of the invention are substances which are described in the endogenous polymerase assay described below, which was described by Ph. A. Furman et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 36 (No. 12), 2688 (1992) lead to an inhibition of the formation of an HBV-DNA double strand in such a way that a maximum of 50% of the activity of the zero value results:
  • HBV virions from culture supernatants incorporate nucleoside 5'-triphosphates into the plus strand of HBV DNA in vitro.
  • nucleoside 5'-triphosphates into the plus strand of HBV DNA in vitro.
  • agarose gel electrophoresis the incorporation of [ ⁇ - 32 P] deoxynucleoside 5'-triphosphate into the 3.2 kb viral DNA product is observed in the presence and absence of a substance with potentially HBV polymerase-inhibiting properties , HBV virions are derived from the
  • Cell culture supernatant from HepG2.2.15 cells obtained by precipitation with polyethylene glycol and concentrated. 1 volume of clarified cell culture supernatant is mixed with V mit volume of an aqueous solution containing 50% by weight of 8000 polyethylene glycol and 0.6 M sodium chloride. The virions are sedimented by centrifugation at 2,500 x g / 15 minutes. The sediments are contained in 2 ml of buffer
  • Tris-HCl H 7.5
  • the samples can be frozen at -80 ° C.
  • Each reaction mixture 100 ⁇ l contains at least 10 5 HBV virions; 50 rnM Tris-HCl (p H 7.5); 300mM potassium chloride; 50mM magnesium chloride; 0.1% ®Nonident P-40 (non-ionic detergent from Boehringer Mannheim); 10 ⁇ M each of dATP, dGTP and dTTP; 10 ⁇ Ci [ 32 P] dCTP (3000 Ci / mmol; final concentration 33 nM) and 1 ⁇ M of the potential polymerase inhibitor in its triphosphorylated form.
  • samples are incubated at 37 ° C for one hour, and then the reaction is stopped by adding 50 nmM EDTA.
  • a 10% weight volume SDS solution (containing 10 g SDS per 90 ml water) is added to a final concentration of 1% by volume (based on total volume) and Proteinase K is added to added to a final concentration of 1 mg / ml.
  • samples are extracted with the same volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (volume ratio 25: 24: 1) and the DNA is precipitated from the aqueous phase with ethanol.
  • An HBV polymerase inhibitor is present when a maximum of 50% of the activity of the negative control is present.
  • Preferred HBV polymerase inhibitors B) include, for example
  • L-FMAU 1 - (2-deoxy-2-fluoro-ß-L-arabinofuranosyl) -5-methyl-pyrimidine-2.4 (1H, 3H) -dione, cf. WO 99/05157, WO 99/05158 and US Pat. No. 5,753,789.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to combinations of A) above dihydropyrimidines (I) or (Ia) and B) lamivudine.
  • HBV antiviral agents B include, for example, phenylpropenamides of the formula
  • R 1 and R 2 independently of one another are C 1 -C 4 -alkyl or, together with the nitrogen atom on which they are located, form a ring having 5 to 6 ring atoms which comprise carbon and / or oxygen,
  • R 3 to R 12 independently of one another are hydrogen, halogen, -CC 4 -alkyl, optionally substituted Cr -alkoxy, nitro, cyano or trifluoromethyl,
  • R 13 is hydrogen, CC 4 alkyl, -CC 7 -acyl or aralkyl and
  • AT-61 is the compound of the above formula wherein X is chlorine, A 1-piperidinyl and Y and Z are each phenyl.
  • Preferred immunomodulators C) include, for example, all interferons such as ⁇ , ⁇ and ⁇ interferons, in particular also ⁇ -2a and ⁇ -2b interferons, interleukins such as interleukin-2, polypeptides such as thymosin- ⁇ -1 and thymoctonan, imidazoquinoline, derivatives such as ®Levamisole, immunoglobulins and therapeutic vaccines.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to combinations of A) above dihydropyrimidines (I) or (Ia), B) lamivudine and optionally C) interferon.
  • the antiviral activity of the compounds according to the invention against the hepatitis B virus was based on that of M.A. Seils et al., Proc. Natl. Acad. Be. 84, 1005-1009 (1987) and B.E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55-70 (1992).
  • the antiviral tests were carried out in 96-well microtiter plates.
  • the first vertical row of the plate received only growth medium and HepG2.2.15 cells. It served as a virus control.
  • test compounds 50 mM were first dissolved in DMSO, further dilutions were made in the growth medium of HepG2.2.15.
  • the compounds according to the invention were generally pipetted into the second vertical test series of the microtiter plate in a test concentration of 100 ⁇ M (1st test concentration) and then diluted 2 ⁇ 10 -fold in wax medium plus 2% by weight fetal calf serum (volume 25 ⁇ l ).
  • Each well of the microtiter plate then received 225 ⁇ l of a HepG2.2.15 cell suspension (5 ⁇ 10 4 cells / ml) in growth medium plus 2% by weight of fetal calf serum.
  • the test mixture was incubated for 4 days at 37 ° C. and 5% CO 2 (v / v).
  • the supernatant was then aspirated and discarded, and the wells received 225 ⁇ l of freshly prepared growth medium.
  • the compounds according to the invention were each added again as a 10-fold concentrated solution in a volume of 25 ⁇ l. The batches were incubated for a further 4 days.
  • the HepG2.2.15 cells were examined for cytotoxic changes by light microscopy or by means of biochemical detection methods (e.g. Alamar blue staining or trypan blue staining).
  • the supernatants and / or cells were then harvested and sucked by means of a vacuum onto 96-well dot-blot chamber covered with nylon membrane (according to the manufacturer's instructions).
  • Substance-induced cytotoxic or cytostatic changes in the HepG2.2.15 cells were e.g. determined as changes in cell morphology by light microscopy. Such substance-induced changes in the HepG2.2.15 cells compared to untreated cells were e.g. visible as cell lysis, vacuolization or changed cell morphology. 50% cytotoxicity (Tox.-50) means that 50% of the cells have a morphology comparable to the corresponding cell control.
  • the tolerance of some of the compounds according to the invention was additionally tested on other host cells such as e.g. HeLa cells, primary peripheral blood cells of the
  • Human or transformed cell lines such as H-9 cells.
  • the intra- or extracellular supernatants of the He ⁇ G2.2.15 cells were denatured (1.5 M NaCl 0.5 N NaOH), neutralized (3 M NaCl / 0.5 M Tris HC1, pH 7.5) and washed (2 x SSC). Then the
  • Hepatitis B-specific DNA probes carried out, which were labeled with digoxigenin, purified and used for hybridization according to the manufacturer's instructions.
  • the prehybridization and hybridization took place in 5 x SSC, 1 x blocking reagent, 0.1% by weight N-lauroylsarcosine, 0.02% by weight SDS and 100 ⁇ g sperm DNA of the herring.
  • the pre-hybridization took place at 60 ° C for 30 minutes, the specific hybridization with 20 to 40 ng / ml of the digoxigenized, denatured HBV-specific DNA (14 hours, 60 ° C). The filters were then washed.
  • the filters were washed and prehybridized in a blocking reagent (according to the manufacturer's instructions). The mixture was then hybridized for 30 minutes with an anti-DIG antibody which was coupled with alkaline phosphatase. After a washing step, the substrate of the alkaline phosphatase, CSPD, was added, incubated with the filters for 5 minutes, then wrapped in plastic wrap and incubated at 37 ° C. for a further 15 minutes. The chemiluminescence of hepatitis B-specific DNA signals were visualized by exposing the filters to an X-ray film (incubation depending on signal strength: 10 minutes to 2 hours).
  • IC 50 inhibitory concentration 50%
  • the compounds according to the invention show an unforeseeable activity against viruses. Surprisingly, they have antiviral activity against hepatitis B (HBV) and are therefore suitable for the treatment of virus-induced diseases, in particular acute and chronic persistent viral infections of HBV.
  • HBV hepatitis B
  • a chronic viral disease caused by HBV can lead to different severity of the clinical picture; As is well known, chronic hepatitis B virus infection in many cases leads to cirrhosis of the liver and / or hepatocellular carcinoma.
  • the present invention includes pharmaceutical preparations which, in addition to non-toxic, inert pharmaceutically suitable excipients, contain one or more compounds (I) or (Ia) or a combination according to the invention, or which consist of one or more active compounds (I) or (Ia) or consist of a combination according to the invention.
  • the active ingredients (I) or (Ia) should be present in the pharmaceutical preparations listed above in a concentration of about 0.1 to 99.5% by weight, preferably about 0.5 to 95% by weight, of the total mixture his.
  • the pharmaceutical preparations listed above can also contain further active pharmaceutical ingredients.
  • the quantitative ratio of components A, B and optionally C of the combinations according to the invention can vary within wide limits; preferably it is 5 to 500 mg A / 10 to 1000 mg B, in particular 10 to 200 mg A / 20 to 400 mg B.
  • Component C which is optionally to be used, can be used in amounts of preferably 1 to 10 million, in particular 2 to 7 million I.U. (international units), applied approximately three times a week over a period of up to one year.
  • the compounds or combinations according to the invention should generally be present in the pharmaceutical preparations listed above in a concentration of about 0.1 to 99.5, preferably about 0.5 to 95,% by weight of the total mixture.
  • the preparation of the pharmaceutical preparations listed above can be carried out in a conventional manner by known methods, e.g. by mixing the active substance or substances with the carrier substance or substances.
  • the active ingredient (s) in total amounts of from about 0.5 to about 500, preferably from 1 to 100 mg / kg of body weight per 24 hours, if appropriate in Form of multiple doses to be administered to achieve the desired results.
  • a single dose contains the active ingredient (s) preferably in amounts of about 1 to about 80, in particular 1 to 30 mg / kg body weight.
  • the invention therefore furthermore relates to the compounds and combinations defined above for combating diseases.
  • the invention further relates to medicaments containing at least one of the compounds or combinations defined above and optionally one or more further pharmaceutical active ingredient (s).
  • the invention further relates to the use of the compounds and combinations defined above in the manufacture of a medicament for the treatment and prophylaxis of the diseases described above, preferably viral diseases, in particular hepatitis B.
  • Analog Troschuetz, R. et al., J. Heterocycl. Chem. 33, 1815-1821 (1996) 150 ml of diethylene glycol dimethyl ether, 47.68 g (0.261 mol) of 2,3,5-trichloropyridine, 2.0 g (0.005 mol) of tetraphenylphosphonium bromide, 4.0 g (0.024 mol) are finely powdered Potassium iodide and 75.0 g (0.838 mol) of copper (I) cyanide combined under nitrogen and stirred at reflux for 24 hours.
  • Potassium fluoride and 10 g of polyethylene glycol 8000 are mixed with 125 ml of DMSO and heated to 160 ° C. for 30 minutes. After cooling, the product is distilled off together with the DMSO under high vacuum, the distillate is added to water, extracted with toluene and dried over sodium sulfate. The product is further implemented as a toluene solution.
  • This compound was prepared in analogy to Example VII starting from 2-bromo-4-fluorobenzaldehyde and methyl acetoacetate.
  • Example 1 4- (2-chloro-4-fluorophene) -2- (3,5-difluoro-2-pyridinyl) -6- (isopropoxy-methyl) - 1,4-dihy dropyrimidine-5-carboxylic acid methyl ester

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Abstract

Neue Dihydropyrimidine der Formel (I) bzw. deren isomerer Form (Ia) worin R<1> Dihalogenphenyl, R<2> Methyl oder Ethyl, R<3> eine Gruppe der Formel -CH2-R<8>m-Xn-R<9>, R<4> Wasserstoff, R<5> Pyridyl, das bis zu zweifach gleich oder verschieden durch Halogen substituiert ist, oder Thiazolyl, und ihre Kombinationen mit anderen antiviralen Mitteln eignen sich zur Bekämpfung von HBV-Infektionen.

Description

DIHYDROPYRIMIDIN-5-CARBONSÄUREESTER UND IHRE VERWENDUNG ALS ARZNEIMITTEL GEGEN VIRALE ERKRANKUNGEN
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Dihydropyrimidine, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Arzneimittel enthaltend diese Dihydropyrimidine, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis-B-Virus-Infektionen. Die Erfindung betrifft auch Kombinationen dieser Dihydropyrimidine mit anderen antiviralen Mitteln und gegebenenfalls Immunmodulatoren sowie Arzneimittel enthaltend diese Kombinationen, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe von HBN-Infektionen wie Hepatitis B.
Das Hepatitis-B-Virus gehört zur Familie der Hepadna-Niren. Es verursacht eine akute und/oder eine peristent-progrediente, chronische Erkrankung. Vielfältige andere klinische Manifestationen im Krankheitsbild werden durch das Hepatitis-B-Virus mitverursacht - insbesondere chronische Leberentzündung, Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom. Weiterhin kann eine Koinfektion mit dem Hepatitis-Delta- Virus den Krankheitsverlaufnegativ beeinflussen.
Die einzigen für die Behandlung chronischer Hepatitis zugelassenen Mittel sind Interferon und Lamivudin. Allerdings ist Interferon nur mäßig wirksam und hat uner- wünschte Nebenwirkungen; Lamivudin ist zwar gut wirksam, aber unter Behandlung kommt es rasch zu einer Resistenzentwicklung, und nach Absetzen der Therapie erfolgt in den meisten Fällen ein Rebound-Effekt.
Aus der EP-PS 103 796 sind Dihydropyrimidine bekannt, denen eine den Kreislauf beeinflussende Wirkung zugeschrieben wird. In der EP-A 169 712 werden substituierte Dihydropyrimidine als Zwischenprodukte beschrieben, die zu den entsprechenden Pyrimidinen oxidiert werden können. Die WO 99/1438 betrifft Dihydropyrimidine, die sich für die Behandlung von cerebrovasculärer Ischämie und von Schmerz eignen sollen. Die WO 99/54312, 99/54326 und 99/54329 betreffen Dihydropyrimidine, die sich zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis eignen. Die vorliegende Erfindung betrifft Dihydropyrimidine der Formel
Figure imgf000004_0001
bzw. deren isomerer Form
Figure imgf000004_0002
worin
R1 Dihalogenphenyl,
R2 Methyl oder Ethyl,
R3 eine Gruppe der Formel -CH2-R8 m-Xn-R9,
woπn
R8 die Gruppe -CR10Rn-
X Sauerstoff,
R9 gegebenenfalls verzweigtes C!-C4-Alkyl, das durch Azido substituiert sein kann,
R10 Wasserstoff, Hydroxyl oder Methyl, R11 Wasserstoff oder Methyl,
R4 Wasserstoff,
R5 Pyridyl, das bis zu zweifach gleich oder verschieden durch Halogen substituiert ist, oder Thiazolyl,
m Null oder 1 und
n Null oder 1 bedeuten
mit den Maßgaben, daß
- R3 mindestens ein Sauerstoffatom enthält, n = 1 , wenn m = Null, und n = Null, wenn m = 1 und R10 = Hydroxyl,
und deren Salze.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Verbindungen der Formeln (I) bzw. (I a), worin
R1 2.4- oder 3.4-Dihalogenphenyl,
R2 Methyl oder Ethyl,
•5 S O
R eine Gruppe der Formel -CH2-R m-Xn-R , worin
R >88 -CH2-, -CH(OH)- oder -C(OH)(CH3)- , X Sauerstoff,
R9 Methyl, Ethyl, n-oder i-Propyl, das jeweils durch Azido substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff,
R5 Pyrid-2-yl, das in 2-Position durch Halogen substituiert oder in 2.4-Position gleich oder verschieden durch Halogen substituiert ist, oder Thiazolyl,
m Null oder 1 und
n Null oder 1 bedeuten
mit den Maßgaben, daß
R3 mindestens ein Sauerstoffatom enthält, - n = 1, wenn m = Null, und n = Null, wenn m = 1 und R10 = Hydroxyl,
und deren Salze.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Verbindungen der Formeln (I) bzw. (I a), worin
R1 Phenyl, das in 2.4- oder 3.4-Position gleich oder verschieden durch Fluor, Chlor oder Brom disubstituiert ist,
R2 Methyl oder Ethyl,
R3 eine Gruppe der Formel -CH2-R8 m-Xn-R9, woπn
R8 -CH2- , -CH(OH)- oder -C(OH)(CH3)- ,
X Sauerstoff,
R9 Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl oder -C2H -Azido,
>4* Wasserstoff,
R5 Pyrid-2-yl, das durch Fluor bzw. Chlor in 2-Position monosubstituiert oder in 2.4-Position gleich oder verschieden disubstituiert ist, oder Thiazolyl,
m Null oder 1 und
n Null oder 1 bedeuten
mit den Maßgaben, daß
- R3 mindestens ein Sauerstoffatom enthält,
- n = 1 , wenn m = Null, und
- n = Null, wenn m = 1 und R10 = Hydroxyl,
und deren Salze.
Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Verbindungen der Formeln (I) bzw. (I a), worin
R1 Phenyl, das in 2.4-Position gleich oder verschieden durch Fluor, Chlor bzw.
Brom oder in 3.4-Position durch Fluor disubstituiert ist, R2 Methyl oder Ethyl,
R3 einen Rest aus der Reihe
-CH2-(CH2)m-O-CH3, -CH2-(CH2)m-O-C2H5, -CH2-(CH2)m-O-n-C3H7, -CH2-(CH2)m-O-iso-C3H7, -CH2-(CH2)m-O-C2H4- Azido,
-CH2-CH(OH)-C2H5, -CH2-CH(OH)-iso-C3H7, -CH2-C(OH)(CH3)2,
R4 Wasserstoff,
R5 Pyrid-2-yl, das durch Fluor bzw. Chlor in 2-Position monosubstituiert oder durch Fluor in 2.4-Position disubstituiert ist, oder Thiazolyl, und
m Null oder 1 bedeuten
und deren Salze.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und
Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Erfindung betrifft sowohl die Enantiomeren oder Diastereomeren und deren jeweilige Mischungen. Die Racemfor- men lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in an sich bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen schließen die Isomeren der Formeln (I) und (la) sowie deren Mischungen ein. Sofern R4 Wasserstoff ist, liegen die Isomeren (I) und (la) im tautomeren Gleichgewicht vor:
Figure imgf000009_0001
(I) (l a)
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch als Salze vorliegen. Im Rahmen der Erfindung sind physiologisch unbedenkliche Salze bevorzugt.
Physiologisch unbedenkliche Salze können Salze anorganischer oder organischer
Säuren sein. Bevorzugt werden Salze anorganischer Säuren wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder Salze organischer Carbon- oder Sulfonsäuren wie beispielsweise Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Benzoesäure oder Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Phenylsulfonsäure, Toluolsulfonsäure oder
Naphthalindisulfonsäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze können auch Metall- oder Ammoniumsalze der erfindungsgemäßen Verbindungen sein. Besonders bevorzugt sind z. B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze sowie Ammomumsalze, die von Ammoniak oder organischen Aminen, wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw. Triethyl- amin, Di- bzw. Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylendiamin oder 2-Phenylethylamin abgeleitet sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden, indem man [A] Aldehyde der Formel
R'-CHO (LT),
worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Amidinen der Formel
,5 cx NH
R— Cr (HI),
\
NH
worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat,
oder mit deren Salzen (wie z.B. Hydrochloriden oder Acetaten)
und Verbindungen der Formel
R3-CO-CH2-COOR2 (IN),
worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel umsetzt,
oder
[B] Verbindungen der Formel
Figure imgf000011_0001
1 ^ worin R bis R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit Amidinen der Formel
Figure imgf000011_0002
worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat,
oder mit deren Salzen (wie z.B. Hydrochloriden oder Acetaten)
mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel umsetzt,
oder
[C] Aldehyde der Formel
RJ-CHO (II),
worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Verbindungen der Formel
R— C=C — COOR2
H (VI),
NH,
worin R »2 und ■, τ R,3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, und Amidinen der Formel (III) oder mit deren Salzen (wie z.B. Hydrochloriden oder Acetaten)
mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis
150°C, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel umsetzt oder
[D] Aldehyde der Formel (II) mit Verbindungen der Formel (IV) und Iminoethern der Formel (VII)
Figure imgf000012_0001
wonn
R ) 5 die oben angegebene Bedeutung hat und
R . 113J für CrC4-Alkyl steht,
in Gegenwart von Ammoniumsalzen mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel umsetzt oder auch
[E] sofern m in R3 in Formel (I) Null ist, Verbindungen der Formel
Figure imgf000012_0002
worin R , 1 , R τ 2 , R n4 u„n_d, R TΪ5 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, mit Verbindungen der Formel
H-X-Ry (IX),
worin X und R9 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
bevorzugt in Gegenwart einer starken Base, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel umsetzt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können durch das folgende Formelschema beispielhaft erläutert werden:
[A]
Figure imgf000013_0001
Für alle Verfahrensvarianten A, B, C, D und E kommen als Lösemittel alle inerten organischen Lösemittel in Frage. Hierzu gehören vorzugsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, Ether wie Dioxan, Diethylether, Tetrahydrofuran, Glykolmonomethylether, Glykoldimethylether, Carbonsäuren wie Eisessig, oder Dimethylforrnamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Pyridin und Hexamethyl- phosphorsäuretriamid.
Die Reaktionstemperaturen können in einem größeren Bereich variiert werden. Im allgemeinen arbeitet man bei Temperaturen von 20 bis 150°C, vorzugsweise jedoch bei der Siedetemperatur des jeweiligen Lösemittels.
Die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck durchgeführt werden. Im allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.
Die Umsetzung kann mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz durchgeführt werden; es empfiehlt sich jedoch, die Umsetzung in Gegenwart von schwächeren Säuren, wie z.B. Essigsäure oder Ameisensäure, durchzuführen.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aldehyde (II) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. T.D. Harris und G. P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 2 165 260, 2 401 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, 13 929 c (1963), E. Adler und H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), E. P. Papadopoulos, M. Mardin und Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78, 2543 (1956)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Yliden-ß-ketoester (V) können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. G. Jones, „The Knoevenagel Conden- sation" in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Enaminocarbonsäureester (VI) und die Imino- ether (VII) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. S. A. Glickman and A. C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten ß-Ketocarbonsäureester (TV) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [z. B. D. Borrmann, „Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen" in "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
Die Verbindungen (VIII) sind neu; die Erfindung betrifft deshalb auch Verbindungen der Formel (VIII).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen eine wertvolle, nicht vorhersehbare Wirkung gegen Viren. Sie sind überraschenderweise antiviral gegen Hepatitis-BViren (HBV) wirksam, indem sie eine außerordentlich starke Reduktion der DNA von intra- und extrazellulären Hepatitis-B-Viren verursachen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind somit zur Behandlung von virusinduzierten Erkrankungen, insbesondere von akut und chronisch persistenten Virusinfektionen des HBV geeignet. Eine chronische Viruserkrankung, hervorgerufen durch das HBV, kann zu unterschiedlich schweren Krankheitsbildern führen; bekanntermaßen führt die chronische Hepatitis B-Virusinfektion in vielen Fällen zur Leberzirrhose und/oder zum hepatozellulären Karzinom.
Als Indikationsgebiete für die erfindungsgemäßen Verbindungen können beispiels- weise genannt werden:
Die Behandlung von akuten und chronischen Virusinfektionen, die zu einer infektiösen Hepatitis führen können, beispielsweise die Infektionen mit Hepatitis-B- Viren. Besonders geeignet sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behand- hing von chronischen Hepatitis-B-Infektionen und die Behandlung von akuten und chronischen Hepatitis-B-Virusinfektionen.
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nichttoxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere Verbin- düngen der Formeln (I), (I a) bzw. der Beispiel-Tabelle enthalten oder die aus einem oder mehreren Wirkstoffen der Formeln (I) und (I a) bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.
Die Wirkstoffe der Formeln (I) und (I a) sollen in den oben aufgeführten pharmazeu- tischen Zubereitungen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95, Gew.-% der Zubereitungen vorhanden sein.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den Verbindungen der Formeln (I) und (I a) auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) mindestens eines der oben definierten Dihydropyrimidine, B) mindestens eines von A verschiedenen anderen antiviralen Mittels.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen A) obigen
Dihydropyrimidinen, B) HBV-Polymerase-Inhibitoren und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren.
Bevorzugte Immunmodulatoren C) umfassen beispielsweise sämtliche Interferone wie α-, ß- und γ-Interferone, insbesondere auch α-2a- und α-2b-Interferone, Interleukine wie Interleukin-2, Polypeptide wie Thymosin-α-1 und Thymoctonan, Imidazochinolin- derivate wie ®Levamisole, Immunglobuline und therapeutische Vaccine.
Die Erfindung betrifft also auch diese Kombinationen zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-Infektionen sowie ihre Verwendung zur Behandlung HBV-induzierter
Erkrankungen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombmationen bietet bei der Behandlung
HBV-induzierter Erkrankungen wertvolle Vorteile im Vergleich zur Monotherapie mit den Einzelverbindungen, nämlich hauptsächlich eine synergistische antivirale
Wirksamkeit, aber auch eine gute Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Kombinati- onen im Bereich der Toxizität, bei der 50 % der Zellen überleben („Tox-50") - im Vergleich zur Tox-50 der Einzelkomponenten.
Als HBV-Polymerase-Inhibitoren B im Sinne der Erfindung werden solche Stoffe bezeichnet, die im nachfolgend beschriebenen endogenen Polymerase-Assay, das von Ph. A. Furman et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 36 (No. 12), 2688 (1992) publiziert worden ist, zu einer Hemmung der Bildung eines HBV-DNA- Doppelstranges derart führen, dass sich maximal 50 % der Aktivität des Nullwerts ergeben:
HBV-Virionen aus Kulturüberständen bauen in vitro Nucleosid-5'-triphosphate in den Plusstrang der HBV-DNA ein. Unter Verwendung von Agarosegel-Elektro- phorese wird der Einbau von [α-32P]-Deoxynucleosid-5'-triphosphat in das virale 3.2-kb DNA-Produkt in An- und Abwesenheit einer Substanz mit potentiell HBV- Polymerase-hemmenden Eigenschaften beobachtet. HBV-Virionen werden aus dem
Zellkultur-Überstand von HepG2.2.15-Zellen durch Fällung mit Polyethylenglykol gewonnen und aufkonzentriert. 1 Volumenteil geklärter Zellkulturüberstand wird mit VΛ Volumenteil einer wässrigen Lösung enthaltend 50 Gew-% Polyethylenglykol 8000 und 0.6 M Kochsalz gemischt. Die Virionen werden durch Zentrifugieren bei 2,500 x g/15 Minuten sedimentiert. Die Sedimente werden in 2 ml Puffer enthaltend
0.05 M Tris-HCl ( H 7.5) resuspendiert und gegen den gleichen Puffer enthaltend 100 rnM Kaliumchlorid dialysiert. Die Proben können bei -80°C eingefroren werden. Jeder Reaktionsansatz (100 μl) enthält mindestens 105 HBV-Virionen; 50 rnM Tris- HCl (pH 7.5); 300mM Kaliumchlorid; 50mM Magnesiumchlorid; 0.1 % ®Nonident P-40 (nichtionisches Detergens der Fa. Boehringer Mannheim); je 10 μM dATP, dGTP und dTTP; 10 μCi [32P]dCTP (3000 Ci/mmol; Endkonzentration 33 nM) und 1 μM des potentiellen Polymerase-Inhibitors in seiner triphosphorylierten Form. Die Proben werden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert, und dann wird die Reaktion durch Zugabe von 50 rnM EDTA gestoppt. Eine 10 %-ige Gewichtsvolumen-SDS- Lösung (enthaltend 10 g SDS pro 90 ml Wasser) wird bis zu einer Endkonzentration von 1 Vol.-% (bezogen auf Gesamtvolumen) zugegeben, und Proteinase K wird bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde werden Proben mit demselben Volumen Phenol/Chloroform/Isoamyl- alkohol (Volumen- Verhältnis 25:24:1) extrahiert, und aus der wässrigen Phase wird die DNA mit Ethanol gefallt. Das DNA-Pellet wird in 10 μl Gelpuffer (Lösung von 10.8 g Tris, 5.5 g Borsäure und 0.75 g EDTA in 1 Liter Wasser (= TBE-Puffer)) resuspendiert und durch Elektrophorese in einem Agarosegel getrennt. Das Gel wird entweder getrocknet oder die darin enthaltenen Nukleinsäuren mittels Southern- Transfertechnik auf eine Membran übertragen. Danach wird die Menge des gebildeten und markierten DNA-Doppelstranges im Verhältnis zur Negativkontrolle (= Endo-Pol-Reaktion ohne Substanz oder mit Kontrollsubstanz ohne Wirkung) bestimmt. Ein HBV-Polymerase-Inhibitor liegt dann vor, wenn maximal 50 % der Aktivität der Negativkontrolle vorliegen.
Bevorzugte HBV-Polymerase-Inhibitoren B) umfassen beispielsweise
3TC = Lamivudin =
= 4-Ammo-l-[(2R-cis)-2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin-2(lH)-on, vgl. EP-PS 382 526 (= US-PS 5 047 407) und WO 91/11186 (= US-PS 5 204466);
Adefovir Dipivoxil =
9- {2-[[Bis[(Pivaloyloxy)-methoxy]-phosphinyl]-methoxy]-ethyl} -adenin, vgl. EP-PS 481 214 (= US-PS 5 663 159 und 5 792 756), US-PS 4 724 233 und 4 808 716;
BMS 200475 = [lS-(l.α,3.α,4.ß)]-2-Amino-1.9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2- methylen-cyclopentyl]-6H-purin-6-on, vgl. EP-PS 481 754 (= US-PS 5 206 244 und 5 340 816), WO 98/09964 und 99/41275; Abacavir =
(-)-( 1 S-cis)-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten- 1 - methanol, vgl. EP-PS 349 242 (= US-PS 5 049 671) und EP-PS 434 450 (= US-PS 5 034 394);
FTC =
(2R-cis)-4-Ammo-5-fluor-l-[2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin- 2(lH)-on, vgl. WO 92/14743 (= US-PS 5 204 466, 5 210 085, 5 539 116, 5 700 937, 5 728 575, 5 814 639, 5 827 727, 5 852 027, 5 892 025, 5 914 331, 5 914400) und WO 92/18517;
ß-L-FDDC =
5-(6-Amino-2-fluor-9H-purin-9-yl)-tetrahydro-2-furanmethanol, vgl. WO 94/27616 (= US-PS 5 627 160, 5 561 120,5 631 239 und 5 830 881);
L-FMAU = 1 -(2-Deoxy-2-fluor-ß-L-arabinofuranosyl)-5-methyl-pyrimidin-2.4(lH, 3H)-dion, vgl. WO 99/05157, WO 99/05158 und US-PS 5 753 789.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia) und B) Lamivudin.
Andere bevorzugte HBV-antivirale Mittel B umfassen z.B. Phenylpropenamide der Formel
Figure imgf000020_0001
woπn
R1 und R2 unabhängig voneinander Cι-C4-Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R3 bis R12 unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Cι-C4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Cr -Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,
R13 Wasserstoff, C C4-Alkyl, Cι-C7-Acyl oder Aralkyl und
X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes Cι-C4-Alkyl
bedeuten,
und deren Salze.
Diese Phenylpropenamide und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der WO 98/33501 bekannt, auf die hiermit zum Zwecke der Offenbarung Bezug genommen wird. AT-61 ist die Verbindung der obigen Formel, worin X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten. Bevorzugte Immunmodulatoren C) umfassen beispielsweise sämtliche Interferone wie α-, ß- und γ-Interferone, insbesondere auch α-2a- und α-2b-Interferone, Interleukine wie Interleukin-2, Polypeptide wie Thymosin-α-1 und Thymoctonan, Imidazochinolin- derivate wie ®Levamisole, Immunglobuline und therapeutische Vaccine.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia), B) Lamivudin und gegebenbenfalls C) Interferon.
Testbeschreibung
Die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen gegen das Hepatitis- B-Virus wurde in Anlehnung an die von M.A. Seils et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 1005-1009 (1987) und B.E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55-70 (1992) beschriebenen Methoden untersucht.
Die antiviralen Tests wurden in 96-well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Die erste vertikale Reihe der Platte erhielt nur Wachstumsmedium und HepG2.2.15-Zellen. Sie diente als Viruskontrolle.
Stammlösungen der Testverbindungen (50 mM) wurden zunächst in DMSO gelöst, weitere Verdünnungen wurden in Wachstumsmedium der HepG2.2.15 hergestellt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in der Regel in einer Testkonzentration von 100 μM (1. Testkonzentration) jeweils in die zweite vertikale Testreihe der Mikrotiterplatte pipettiert und anschließend in Zweierschritten 210-fach in Wachsrumsmedium plus 2 Gew.-% fötales Kälberserum verdünnt (Volumen 25 μl).
Jeder Napf der Mikrotiterplatte erhielt dann 225 μl einer HepG2.2.15-Zellsuspension (5 x 104 Zellen/ml) in Wachstumsmedium plus 2 Gew.-% fötales Kälberserum. Der Testansatz wurde 4 Tage bei 37°C und 5 % CO2 (v/v) inkubiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und verworfen, und die Näpfe erhielten 225 μl frisch zubereitetes Wachstumsmedium. Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden jeweils erneut als 10-fach konzentrierte Lösung in einem Volumen von 25 μl zugefügt. Die Ansätze wurden weitere 4 Tage inkubiert.
Vor der Ernte der Überstände zur Bestimmung des antiviralen Effektes wurden die HepG2.2.15-Zellen lichtmikroskopisch oder mittels biochemischer Nachweisverfahren (z.B. Alamar-Blue-Färbung oder Trypanblau-Färbung) auf zytotoxische Veränderungen untersucht.
Anschließend wurden die Überstände und/oder Zellen geerntet und mittels Vakuum auf mit Nylonmembran bespannten 96-Napf-Dot-Blot-Karnmern (entsprechend den Herstellerangaben) gesogen.
Zytotoxizitätsbestimmung
Substanzinduzierte zytotoxische oder zytostatische Veränderungen der HepG2.2.15- Zellen wurden z.B. lichtmikroskopisch als Änderungen der Zellmorphologie ermittelt. Derartige Substanz-induzierte Veränderungen der HepG2.2.15-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen wurden z.B. als Zellyse, Vakuolisierung oder verän- derte Zellmorphologie sichtbar. 50 % Zytotoxizität (Tox.-50) bedeuten, dass 50 % der Zellen eine der entsprechenden Zellkontrolle vergleichbare Morphologie aufweisen.
Die Verträglichkeit einiger der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde zusätzlich auf anderen Wirtszellen wie z.B. HeLa-Zellen, primäre periphere Blutzellen des
Menschen oder transformierte Zellinien wie H-9-Zellen, getestet.
Es konnten keine zytotoxischen Veränderungen bei Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindungen von >10 μM festgestellt werden. Bestimmung der antiviralen Wirkung
Nach Transfer der Überstände oder lysierten Zellen auf die Nylon-Membran der Blot-Apparatur (s.o.) wurden die intra- oder extrazellulären Überstände der HeρG2.2.15-Zellen denaturiert (1.5 M NaCl 0.5 N NaOH), neutralisiert (3 M NaCl/0.5 M Tris HC1, pH 7.5) und gewaschen (2 x SSC). Anschließend wurde die
DNA durch Inkubation der Filter bei 120°C 2-4 Stunden an die Membran gebacken.
Hybridisierung der DNA
Der Nachweis der viralen DNA von den behandelten HepG2.2.15-Zellen auf den Nylonfiltern wurde in der Regel mit nichtradioaktiven, Digoxigenin-markierten
Hepatitis-B-spezifischen DNA-Sonden durchgeführt, die jeweils nach Herstellerangabe mit Digoxigenin markiert, gereinigt und zur Hybridisierung eingesetzt wurden.
Die Prähybridisierung und Hybridisierung erfolgten in 5 x SSC, 1 x Blockierungsreagenz, 0.1 Gew.-% N-Lauroylsarcosin, 0.02 Gew.-% SDS und 100 μg Sperma-DNA des Herings. Die Prähybridisierung erfolgte 30 Minuten bei 60°C, die spezifische Hybridisierung mit 20 bis 40 ng/ml der digoxigenierten, denaturierten HBV- spezifischen DNA (14 Stunden, 60°C). Anschließend wurden die Filter gewaschen.
Nachweis der HB V-DNA durch Digoxigenin- Antikörper
Der immunologische Nachweis der Digoxigenin-markierten DNA erfolgte nach
Herstellerangaben:
Die Filter wurden gewaschen und in einem Blockierungsreagenz (nach Herstellerangabe) prähybridisiert. Anschließend wurde mit einem Anti-DIG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war, 30 Minuten hybridisiert. Nach einem Waschschritt wurde das Substrat der alkalischen Phosphatase, CSPD, zugefügt, 5 Minuten mit den Filtern inkubiert, anschließend in Plastikfolie eingepackt und wei- tere 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Chemilumineszenz der Hepatitis-B-spezifi- schen DNA-Signale wurde über eine Exposition der Filter auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht (Inkubation je nach Signalstärke: 10 Minuten bis 2 Stunden).
Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50, inhibitorische Konzentration 50 %) wurde als die Konzentration bestimmt, bei der gegenüber einer unbehandelten Probe die intra- oder extrazelluläre Hepatitis-B-spezifische Bande durch die erfindungsgemäße Verbindung um 50 % reduziert wurde.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen eine nicht vorhersehbare Wirkung gegen Viren. Sie sind überraschenderweise antiviral gegen Hepatitis B (HBV) wirksam und sind somit zur Behandlung von virusinduzierten Erkrankungen, insbesondere von akut und chronisch persistenten Virusinfektionen des HBV geeignet. Eine chronische Viruserkrankung, hervorgerufen durch das HBV, kann zu unterschiedlich schweren Krankheitsbildern führen; bekanntermaßen führt die chronische Hepatitis-B-Virusinfektion in vielen Fällen zur Leberzirrhose und/oder zum hepato- zellulären Karzinom.
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht- toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere Verbin- düngen (I) bzw. (Ia) bzw. eine erfmdungsgemäße Kombination, enthalten oder die aus einem oder mehreren Wirkstoffen (I) bzw. (Ia) bzw. aus einer erfindungsgemäßen Kombination bestehen.
Die Wirkstoffe (I) bzw. (Ia) sollen in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-% der Gesamtmischung, vorhanden sein.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den Verbindungen (I) bzw. (Ia) auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten. Das Mengenverhältnis der Komponenten A, B und gegebenenfalls C der erfindungsgemäßen Kombinationen kann innerhalb weiter Grenzen schwanken; vorzugsweise beträgt es 5 bis 500 mg A / 10 bis 1000 mg B, insbesondere 10 bis 200 mg A / 20 bis 400 mg B.
Die gegebenenfalls mitzuverwendende Komponente C kann in Mengen von vorzugsweise 1 bis 10 Millionen, insbesondere 2 bis 7 Millionen I.E. (internationale Einheiten), etwa dreimal wöchentlich über einen Zeitraum bis zu einem Jahr angewandt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Kombinationen sollen in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise etwa 0,5 bis 95, Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen kann auf übliche Weise nach bekannten Methoden, z.B. durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen, erfolgen.
Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise von 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 1 bis 30 mg/kg Körpergewicht. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Objekts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation des Arzneimittels, sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die oben definierten Verbindungen und Kombinationen zur Bekämpfung von Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der oben definierten Verbindungen oder Kombinationen und gegebenenfalls einen oder mehrere weitere pharmazeutische(n) Wirkstoff(e).
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben definierten Verbindungen und Kombinationen bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe der oben beschriebenen Erkrankungen, vorzugsweise von Viruserkrankungen, insbesondere von Hepatitis B.
Die Prozentangaben der nachfolgenden Beispiele beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, jeweils auf das Gewicht. Die Verhältnisse von Lösemitteln in Löse- mittelgemischen beziehen sich j eweils auf das Volumen.
Beispiele
A. Ausgangsverbindungen
Beispiel I 3-Fluorpyridin-N-oxid
Figure imgf000027_0001
Zu einer Lösung von 11,10 g (114,324 mmol) 3-Fluorpyridin in 74,00 ml Essigsäure gibt man 22,20 ml H2O2 (30%ig) und läßt 7 Stunden bei 100°C Badtemperatur rühren. Danach wird bis auf 30 ml eingeengt, 30 ml Wasser zugefügt und wieder auf 30 ml eingeengt. Die Lösung wird mit Dichlormethan verrührt, durch Zugabe von K2CO3 basisch gestellt, getrennt, die wässrige Phase zweimal mit Dichlormethan ausgeschüttelt, getrocknet und eingeengt. Ausbeute: 11,5 g (88,9 %)
Fp.: 66-68°C
Beispiel II 2-Cyano-3-fluorpyridin
Figure imgf000027_0002
5,20 g (45,980 mmol) der Verbindung aus Beispiel I werden in 50 ml Acetonitril gelöst. Unter Argon werden 13,70 g (138,092 mmol) Trimethylsilyrnitril zugegeben und langsam 12,80 ml Triethylamin zulaufen gelassen. Die Lösung wird 7 Stunden unter Rückfluß und danach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem
Einengen mit einer Wasserstrahlpumpe wird in Dichlormethan aufgenommen, zweimal mit 50 ml 2 N wäßriger Natriumcarbonatlösung geschüttelt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt.
Ausbeute (roh): 5,3 g (Öl)
Säulenchromatographie: Methylenchlorid bis Methylenchlorid/Essigester (10:1)
Beispiel III 2-Amidino-3-fluo yridin-hydrochlorid
Figure imgf000028_0001
Eine Lösung von 10,30 g (84,355 mmol) der Verbindung aus Beispiel II in 30 ml
Methanol wird mit einer Natriummethylat-Lösung aus 0,40 g (17,391 mmol) Natrium und 65 ml Methanol versetzt und 72 Stunden bei 20°C gerührt. 5,44 g (101,682 mmol) Ammoniumchlorid (pulverisiert) und 17,39 mmol (1,04 ml) Essigsäure werden zugegeben, 28 Stunden bei 40°C nachgerührt und abgekühlt. Es wird vom nicht löslichen Salz abgesaugt (1,78 g), eingeengt, mit Aceton eingeengt, anschließend mit Aceton verrührt, abgesaugt und gewaschen. Ausbeute: 10,6 g Fp.: * 150°C Zers.
Beispiel IV 2-Cyano-3,5-dichlor-pyridin
Figure imgf000028_0002
Methode 1:
Eine Lösung von 26 g (0,158 mol) 3,5-Dichlor-pyridin-l-oxid (Johnson et al., J.Chem.Soc.B, 1967, 1211) in 80 ml Dichlormethan wird nacheinander mit 21,8 ml (0,174 mol) Trimethylsilylcyanid und 14,6 ml (0,158 mol) Dimethylcarbamid- säurechlorid versetzt und 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird mit 100 ml einer 10 %igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung versetzt und 10 Minuten intensiv gerührt. Nach Trennung der Phasen wird einmal mit Dichlormethan ausgeschüttelt; die vereinigten organischen Phasen werden getrocknet und eingeengt.
Der Rückstand wird mit Dichlormethan an Kieselgel chromatographiert und aus wenig Methanol umkristallisiert. Man erhält 11 g (40,2 %) 2-Cyano-3,5-dichlor-pyridin (Fp.: 102°C).
Methode 2:
Analog Troschuetz, R. et al., J. Heterocycl. Chem. 33, 1815-1821 (1996) werden 150 ml Diethylenglykoldimethylether, 47,68 g (0,261 mol) 2,3,5-Trichlorpyridin, 2,0 g (0,005 mol) Tetraphenylphosphoniumbromid, 4,0 g (0,024 mol) feingepulvertes Kaliumiodid und 75,0 g (0,838 mol) Kupfer(I)cyanid unter Stickstoff zusammengegeben und 24 Stunden bei Rückfluss gerührt. Anschließend weitere 100 ml Diethylenglykoldimethylether, 2,0 g (0,005 mol) Tetraphenylphosphoniumbromid, 4,0 g (0,024 mol) feingepulvertes Kaliumiodid und 75 g (0,838 mol) Kupfer(I)cyanid hinzugegeben und man rührt weitere 89 Stunden bei Rückflußtemperatur. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird abgesaugt und das Filtrat destillativ weitgehend von Diethylenglykoldimethylether befreit. Der Rückstand wird in Toluol aufgenommen und mit einer wässrigen Lösung von Mohr'schem Salz- und dann mit wäßriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen (Peroxidtest). Dann wird mit Wasser frei von Diethylenglykoldimethylether gewaschen. Man filtriert über ®Cellit, trock- net das Filtrat über Magnesiumsulfat und engt die Lösung ein.
Man erhält 18,0 g (40,0 %) 2-Cyano-3,5-dichlorpyridin. Beispiel V 2-Cyano-3,5-difluor-pyridin
Figure imgf000030_0001
50 g (0,29 mol) 2-Cyano-3,5-dichlorρyridin aus Beispiel IV, 33,6 g (0,58 mol)
Kaliumfluorid und 10 g Polyethylengykol 8000 werden mit 125 ml DMSO versetzt und 30 Minuten auf 160°C erhitzt. Nach Abkühlung wird das Produkt zusammen mit dem DMSO im Hochvakuum abdestilliert, das Destillat auf Wasser gegeben, mit Toluol extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wird als Toluol- lösung weiter umgesetzt.
Rf-Wert: 0,43 (Cyclohexan/Essigester = 7:3)
Beispiel VI 3 ,5-Difiuor-2-pyridincarboximidamid-Hydrochlorid
Figure imgf000030_0002
Zu einer auf 0 bis 5°C gekühlten Suspension von 33,4 g (0,624 mol) Ammoniumchlorid in 1 1 Toluol werden 328 ml Trimethylaluminium (2 M in Hexan, 0,624 mol) getropft; die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt, bis die Methanentwicklung beendet ist. Danach wird die toluolische Lösung von 2-Cyano-3,5-dichlor-pyridin aus Beispiel V zugetropft und anschließend über Nacht bei 80°C nachgerührt. Nach Kühlung auf 0 bis -5°C wird Methanol bis zum Ende der Gasentwicklung zugetropft, die Salze abgesaugt und zweimal mit wenig Methanol gewaschen. Das Lösungsmittel wird abgezogen, der Rückstand in 500 ml Dichlormethan/Methanol (9:1) gelöst und nochmals von anorganischen Salzen abgesaugt. Nach Abziehen des Lösungsmittels verbleiben 23,6 g (39,1 %) 3,5-Difluor-2-pyridincarboximidamid- Hydrochlorid (Fp.:183°C).
1H-NMR (DMSO-D6):
8,3-8,45 (m, 1H) ppm; 8,8 (d, J = 2 Hz, 1H) ppm; 9,7 (s, breit, 4H) ppm.
Beispiel VII 2-Acetyl-3-(2-chlor-4-fluorphenyl)-acrylsäuremethylester
Figure imgf000031_0001
Eine Lösung von 50 g (315 mmol) 2-Chlor-4-fiuor-benzaldehyd und 36,6 g (315 mmol) Acetessigsäuremethylester in 150 ml Isopropanol wird mit 1,7 ml Piperidinacetat versetzt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird mit Dichlormethan verdünnt, mit Wasser ausgeschüttelt und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Produkt wird roh als cis/trans-Gemisch weiter umgesetzt.
Beispiel VIII
2-Acetyl-3-(2-brom-4-fluorphenyl)-acrylsäuremethylester
Figure imgf000032_0001
Diese Verbindung wurde in Analogie zu Beispiel VII ausgehend von 2-Brom-4- fluorbenzaldehyd und Acetessigsäuremethylester hergestellt.
Beispiel IX Isopropoxyacetessigsäuremethylester
Figure imgf000032_0002
8 g (200 mmol) 60 %-iges Natriumhydrid in Mineralöl werden unter Argon in 150 ml THF suspendiert und mit einer Lösung von 6,01 g (100 mmol) Isopropanol in 50 ml THF tropfenweise unter leichter Kühlung versetzt. Nach 1 -stündigem Nach- rühren wird eine Lösung von 15,06 g (100 mmol) Chloracetessigsäuremethylester in 50 ml THF zugetropft, wobei die Temperatur auf 45°C ansteigen darf. Es wird über Nacht gerührt, tropfenweise unter Eiskühlung mit 100 ml 10 %-iger Essigsäure versetzt und unter vermindertem Druck vom THF befreit. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgenommen, die resultierende Lösung mit gesättigter wäßriger
Natriumchlorid-Lösung ausgeschüttelt, die organische Phase getrocknet und eingeengt. Die Reinigung erfolgt über eine Kieselgelsäule mit Toluol Essigester-Gemi- schen. Man erhält 10,2 g (58,6 %) farbloses Öl. Beispiel X
4-(2-Brom-4-fluorphenyl)-2-(3,5-difluorpyridin-2-yl)-l,4-dihydro-6-methyl- pyrimidin-5-carbonsäuremethylester
Figure imgf000033_0001
Eine Lösung von 6,02 g (20 mmol) 2-Acetyl-3-(2-brom-4-fluorphenyl)-acrylsäure- methylester (Beispiel VIII), 3,87 g (20 mmol) 3,5-Difluor-2-pyridincarboximidamid- hydrochlorid (Beispiel VI) und 1,64 g (20 mmol) Natriumacetat in 120 ml Isopropanol wird 6 Stunden unter leichtem Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wird eingeengt, der Rückstand in 100 ml I N Salzsäure und Diethylether gelöst, die
Phasen getrennt und die organische Phase zweimal mit je 30 ml I N Salzsäure extrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen werden mit wässrigem Ammoniak basisch gestellt, zweimal mit Ethylacetat extrahiert, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird über eine Kieselgelsäule mit Dichlormethan/Ethylacetat (10:1) als Laufmittel chromato- graphiert und durch Kristallisation aus Diethylether weiter gereinigt. Ausbeute: 5,92 g (67,2 % d.Th.) Fp.: 123-126°C
Beispiel XI
4-(2-Brom-4-fluo henyl)-6-brommethyl-2-(3,5-difluoφyridin-2-yl)-l,4-dihydro- pyrimidin-5-carbonsäuremethylester
Figure imgf000034_0001
1,8 g (4,089 mmol) 4-(2-Brom-4-fluorphenyl)-2-(3,5-difluor-pyridin-2-yl)-l,4- dihydro-6-methyl-pyrimidin-5-carbonsäuremethylester (Beispiel X) werden in 50 ml Dichlormethan gelöst und mit 0,8 g (4,5 mmol) N-Bromsuccinimid versetzt, 2 Stunden zum leichten Sieden erhitzt, abgekühlt und eingeengt. Nach grober Reinigung über eine Kieselgelsäule erhält man 1,4 g (66 %) leicht gelbe Kristalle vom Schmelzpunkt 115 bis 116°C.
Beispiel XII 4-(2-Brom-4-fluoφhenyl)-6-brommethyl-2-(3,5-difluoφyridin-2-yl)- 1 ,4-dihydro-pyrimidin-5 -carbonsäuremethylester
Figure imgf000034_0002
Eine Lösung von 1,8 g (4,089 mmol) 4-(2-Brom-4-fiuoφhenyl)-2-(3,5-difluor- pyridin-2-yl)-l,4-dihydro-6-methyl-pyrimidin-5-carbonsäuremethylester in 50 ml Dichlormethan wird mit 0,8 g (4,5 mmol) N-Bromsuccinimid versetzt, 2 Stunden zum leichten Sieden erhitzt, abgekühlt und eingeengt. Nach grober Reinigung über eine Kieselgelsäule erhält man 1,4 g (66 %) leicht gelbe Kristalle vom Schmelzpunkt 115 - 116°C. B. Herstellungsbeispiele
Beispiel 1 4-(2-Chlor-4-fluoφhenyl)-2-(3,5-difluor-2-pyridinyl)-6-(isopropoxy- methyl)- 1 ,4-dihy dropyrimidin- 5 -carbonsäuremethy lester
Figure imgf000035_0001
Eine Lösung von 348,4 mg (2,0 mmol) der Verbindung aus Beispiel VIII in 20 ml Methanol wird mit 317,1 mg (2,0 mmol) 2-Chlor-4-fluorbenzaldehyd und 554,5 mg
(2,0 mmol) der Verbindung aus Beispiel VI (als Bis-acetat) versetzt und 16 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen wird eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat und verdünnter wäßriger Ammoniak-Lösung aufgenommen, die organische Phase mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohpro- dukt wird durch Kristallisation aus Diethylether gereinigt.
Ausbeute: 50 mg (5,5% d.Th.) Fp.: 152-153°C
Die in der folgenden Tabelle aufgeführten Herstellungsbeispiele wurden in analoger Weise hergestellt.
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Die Wirkdaten sind für einige erfindungsgemäße Verbindungen in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:
Figure imgf000045_0001
Die Behandlung der Hepatitis-B-Virus produzierenden HepG2.2.15-Zellen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen führte überraschenderweise zu einer Reduktion intra- und/oder extrazellulärer viraler DNA.

Claims

Patentansprüche
1. Dihydropyrimidine der Formel
Figure imgf000046_0001
bzw. deren isomerer Form
Figure imgf000046_0002
worin
R1 Dihalogenphenyl,
R2 Methyl oder Ethyl,
R3 eine Gruppe der Formel -CH2-R8m-Xn-R9
worin
R8 die Gruppe -CR10Rn-,
X Sauerstoff,
R9 gegebenenfalls verzweigtes C1-C4-Alkyl, das durch Azido substituiert sein kann, R10 Wasserstoff, Hydroxyl oder Methyl,
R11 Wasserstoff oder Methyl,
R4 Wasserstoff,
R5 Pyridyl, das bis zu zweifach gleich oder verschieden durch Halogen substituiert ist, oder Thiazolyl,
m Null oder 1 und
n Null oder 1 bedeuten
mit den Maßgaben, daß
R3 mindestens ein Sauerstoffatom enthält, n = 1, wenn m = Null, und n = Null, wenn m = 1 und R10 = Hydroxyl,
und deren Salze.
2. Dihydropyrimidine nach Anspruch 1 , worin
R1 2.4- oder 3.4-Dihalogenphenyl,
R2 Methyl oder Ethyl,
R3 eine Gruppe der Formel -CH2-R8 m-Xπ-R9,
worin R8 -CH2- , -CH(OH)- oder -C(OH)(CH3)- ,
X Sauerstoff,
R9 Methyl, Ethyl, n-oder i-Propyl, das jeweils durch Azido substituiert sein kann,
R >*4 Wasserstoff,
R5 Pyrid-2-yl, das in 2-Position durch Halogen substituiert oder in 2.4- Position gleich oder verschieden durch Halogen substituiert ist, oder Thiazolyl,
m Null oder 1 und
n Null oder 1 bedeuten
mit den Maßgaben, daß
R3 mindestens ein Sauerstoffatom enthält, n = 1, wenn m = Null, und n = Null, wenn m = 1 und R10 = Hydroxyl,
und deren Salze.
3. Dihydropyrimidine nach Anspruch 1, worin
R1 Phenyl, das in 2.4- oder 3.4-Position gleich oder verschieden durch Fluor, Chlor oder Brom disubstituiert ist, R2 Methyl oder Ethyl,
R3 eine Gruppe der Formel -CH2-R8 m-Xn-R9,
worin
R8 -CH2- , -CH(OH)- oder -C(OH)(CH3)- ,
X Sauerstoff,
R9 Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl oder C2H4-Azido,
R4 Wasserstoff,
R5 Pyrid-2-yl, das durch Fluor bzw. Chlor in 2-Position monosubstituiert oder in 2.4-Position gleich oder verschieden disubstituiert ist, oder Thiazolyl,
m Null oder 1 und
n Null oder 1 bedeuten
mit den Maßgaben, daß
R3 mindestens ein Sauerstoffatom enthält, n = 1 , wenn m = Null, und n = Null, wenn m = 1 und R10 = Hydroxyl,
und deren Salze.
4. Dihydropyrimidine nach Anspruch 1 , worin
R1 Phenyl, das in 2.4-Position gleich oder verschieden durch Fluor, Chlor bzw. Brom oder in 3.4-Position durch Fluor disubstituiert ist,
R2 Methyl oder Ethyl,
R3 einen Rest aus der Reihe
-CH2-(CH2)m-O-CH3,
-CH2-(CH2)m-O-C2H5,
-CH2-(CH2)m-O-n-C3H7,
-CH2-(CH2)m-O-iso-C3H7,
-CH2-(CH2)m-O-C2H4-Azido, -CH2-CH(OH)-C2H5,
-CH2-CH(OH)-iso-C3H7,
-CH2-C(OH)(CH3)2,
R ,44 Wasserstoff,
R5 Pyrid-2-yl, das durch Fluor bzw. Chlor in 2-Position monosubstituiert oder durch Fluor in 2.4-Position disubstituiert ist, oder Thiazolyl, und
m Null oder 1 bedeuten,
und deren Salze.
5. Verbindungen der Beispiele 1, 4, 7, 11, 26, 38 und 41.
6. Verfahren zur Herstellung der Dihydropyrimidine nach Ansprüchen 1 bis 5, wonach man [A] Aldehyde der Formel
R'-CHO (II),
worin R1 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebene Bedeutung hat,
mit Amidinen der Formel
Figure imgf000051_0001
worin R5 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebene Bedeutung hat,
oder mit deren Salzen
und Verbindungen der Formel
R3-CO-CH2-COOR2 (TV),
worin R2 und R3 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebenen Bedeutungen besitzen,
umsetzt oder
[B] Verbindungen der Formel
Figure imgf000051_0002
worin R1, R2 und R3 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit Amidinen der Formel
Figure imgf000052_0001
worin R5 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebene Bedeutung hat,
oder mit deren Salzen umsetzt oder
[C] Aldehyde der Formel
R'-CHO (II),
worin R1 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebene Bedeutung hat,
mit Verbindungen der Formel
R3— C=C — COOR2
H (VI),
NH2
worin R und R die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebenen Bedeutungen besitzen,
und Amidinen der Formel (IJI) oder mit deren Salzen umsetzt
oder [D] Aldehyde der Formel (II) mit Verbindungen der Formel (IV) und Iminoethern der Formel (VII)
Figure imgf000053_0001
woπn
R5 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebene Bedeutung hat und
R , 113J für Cι-C4-Alkyl steht,
in Gegenwart von Ammoniumsalzen umsetzt oder auch
[E] sofern m in R3 in Formel (I) Null ist, Verbindungen der Formel
Figure imgf000053_0002
wonn
R1, R2, R4 und R5 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebenen Bedeutungen besitzen, mit Verbindungen der Formel
H-X-R9 (IX),
worin X und R9 die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebenen Bedeutungen besitzen, umsetzt.
7. Verbindungen der Formel
Figure imgf000054_0001
woπn
R , R , R und R die in den Ansprüchen 1 bis 5 angegebenen Bedeutungen besitzen.
8. Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 5 zur Bekämpfung von Erkrankungen.
9. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 5 und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.
10. Verwendung von Verbindungen der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen.
11. Verwendung von Verbindungen der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis-B-Infektionen.
12. Kombinationen
A) mindestens eines Dihydropyrimidins nach Ansprüchen 1 bis 5,
B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels und gegebebnenfalls
C) mindestens eines Immunmodulators.
13. Kombinationen nach Anspruch 12, worin die Komponente B ein HBV- Polymerase-Inhibitor ist.
14. Kombinationen nach Anspruch 12, worin die Komponente B Lamivudin ist.
15. Kombinationen nach Anspruch 12, worin die Komponente B aus den Verbindungen der Formel
Figure imgf000055_0001
worin
R1 und R2 unabhängig voneinander C1-C4-Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R3-R12 unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes CrC4-Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluor- methyl,
R13 Wasserstoff, C C4-Alkyl, C C7-Acyl oder Aralkyl und
X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes C1-C4-Alkyl
bedeuten, und deren Salzen ausgewählt ist.
16. Kombinationen nach Anspruch 15 , worin
X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten.
17. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 15, worin der Irnmunmodulator C Interferone enthält.
18. Kombinationen von A) Dihydropyrimidinen nach Ansprüchen 1 bis 5, B) Lamivudin und gegebenenfalls C) Interferon.
19. Verfahren zur Herstellung der Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Komponenten A und B in geeigneter
Weise kombiniert oder herrichtet.
20. Kombinationen nach Ansprüchen 12 bis 18 zur Bekämpfung von Erkrankungen.
21. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Kombination gemäß Ansprüchen 12 bis 18 und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.
22. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 12 bis 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen.
23. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 12 bis 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis-B-Infektionen.
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