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WO2001045712A1 - Arzneimittelkombinationen gegen virale erkrankungen - Google Patents

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Publication number
WO2001045712A1
WO2001045712A1 PCT/EP2000/012570 EP0012570W WO0145712A1 WO 2001045712 A1 WO2001045712 A1 WO 2001045712A1 EP 0012570 W EP0012570 W EP 0012570W WO 0145712 A1 WO0145712 A1 WO 0145712A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alkyl
substituted
hydrogen
phenyl
optionally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2000/012570
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English (en)
French (fr)
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WO2001045712A8 (de
Inventor
Arnold Paessens
Karl Deres
Olaf Weber
Erwin Graef
Siegfried Goldmann
Thomas Krämer
Ulrich Niewöhner
Karl-Heinz Schlemmer
Jürgen Stoltefuss
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority claimed from DE2000112259 external-priority patent/DE10012259A1/de
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Priority to AU30098/01A priority Critical patent/AU3009801A/en
Publication of WO2001045712A1 publication Critical patent/WO2001045712A1/de
Publication of WO2001045712A8 publication Critical patent/WO2001045712A8/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses

Definitions

  • the invention relates to combinations of A) non-nucleoside inhibitors, e.g. Dihydropyrimidines, B) other antiviral agents and optionally C)
  • Immunomodulators a process for their preparation and their use as medicines, in particular for the treatment and prophylaxis of HBV infections.
  • “Combinations” in the sense of the invention are understood not only to be dosage forms which contain all components (so-called fixed combinations) and combination packs which contain the components separately from one another, but also components which are applied simultaneously or at different times, provided that they are used for treatment or prophylaxis of the same disease.
  • the hepatitis B virus belongs to the Hepadna virus family. It causes an acute and / or a persistent-progressive, chronic illness. Various other clinical manifestations in the clinical picture are also caused by the hepatitis B virus - in particular chronic liver inflammation, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Furthermore, co-infection with the hepatitis delta virus can have a negative impact on the course of the disease.
  • the polymerase is one of the essential and essential enzymatic activities of the HBV virus in the propagation cycle; see. Radziwill et al., J. Virol. 64: 613-620 (1990). Analogs of the natural substrates - mostly after phosphorylation by the host's own enzymes - inhibit the viral polymerase complex Polymerase activity and thus the replication of HBV in vitro and in vivo; see. e.g. Chang et al., J. Biol. Chem. 267, 13938 -13942 (1992).
  • Lamivudine has recently been used to treat patients with chronic HBV infection. However, it shows a high rebound effect after stopping the therapy and leads to resistance during long-term therapy.
  • BMS 200475 Adefovir Dipivoxil, BMS 200475 and the other inhibitors mentioned above, there is as yet no generally accessible clinical experience.
  • interferon Treatment of chronic hepatitis by interferon; however, it is only moderately effective and has undesirable side effects. Combinations of interferon with lamivudine are not synergistically effective.
  • AT-61 N - [(1E) - 2-chloro-2-phenyl-l- (l-piperidinylcarbonyl) ethenyl] benzamide, which apparently interferes with the process of packaging the pregenomic RNA into the unfinished core particles; see. King et al., Antimicrob. Agents and chemother. 42, 3179-3186 (1998). Even if the mechanism has not yet been fully elucidated, the authors seem to rule out an effect on the core protein. The in vitro combination of AT-61 and lamivudine is described as being synergistically effective.
  • the invention therefore relates to combinations A) of at least one dihydropyrimidine, B) at least one HBV-antiviral agent different from A, preferably an HBV polymerase inhibitor, and optionally C) at least one immunomodulator.
  • the invention thus relates to combinations of nucleoside and non-nucleoside inhibitors and, if appropriate, immunomodulators for the treatment and prophylaxis of HBV infections and the use of these combinations for the treatment of HB V-induced diseases.
  • the combinations according to the invention unpredictably inhibit the multiplication of the HBV virus significantly better than the agents known from the prior art or their known combinations.
  • the use of the combinations according to the invention offers valuable treatments for HBV-induced diseases
  • Preferred dihydropyrimidines A correspond, for example, to the formula
  • R phenyl, furyl, thienyl, triazolyl, pyridyl, cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms or radicals of the formulas
  • R 6 optionally halogen-substituted phenyl
  • R to R are independently hydrogen, phenyl, hydroxy-substituted phenyl, hydroxy, QC ö acyl or Ci-C ⁇ -alkyl, where the alkyl radical for its part substituted hydroxy-substituted by hydroxy, dC ö alkoxycarbonyl, phenyl or phenyl may be substituted .
  • A is a radical -O-, -S-, -SO- or -SO 2 -,
  • R is substituted and phenyl which is optionally monosubstituted to polysubstituted by identical or different substituents selected from the group halogen, nitro, trifluoromethyl, QC ö alkyl and C ⁇ -C 6 -alkoxy, mean
  • X is a single bond or oxygen
  • R 12 is hydrogen, straight-chain or branched CrC ⁇ alkoxycarbonyl, a straight-chain, branched or cyclic, saturated or unsaturated C j -C 8 hydrocarbon radical, which may be a or two identical or different hetero chain links from the group -O-, -CO-, -NH-, -N- (dC 4 -alkyl) -,
  • R 15 and R 16 independently of one another are hydrogen, benzyl or dC 6 -alkyl
  • R 13 and R 14 independently of one another are hydrogen, C 1 -C 6 -alkyl or cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms,
  • R> 3 is hydrogen, amino or a radical of the formula
  • R 17 and R 18 independently of one another are hydrogen or aryl having 6 to 10 carbon atoms, aralkyl having 6 to 10 carbon atoms or C 1 -C 6 -alkyl, which are optionally substituted by -CC 6 -alkoxycarbonyl, amino, hydroxyl, phenyl or benzyl wherein phenyl and benzyl are optionally mono- or polysubstituted, identically or differently by hydroxyl, carboxyl, C ⁇ -C6 alkyl or C ⁇ -C substituted 6 alkoxy and / or C ⁇ -C6 alkyl optionally substituted by -NH-CO- CH 3 or -NH-CO-CF 3 is substituted,
  • R 17 and R 18 together with the nitrogen atom on which they stand mean a morpholinyl, piperidinyl or pyrrolidinyl ring,
  • R optionally methoxy-substituted phenyl
  • R and R together form a radical of the formula R is hydrogen, C 1 -C 4 alkyl, C 2 -C 4 alkenyl, benzoyl or acyl having 2 to 6 carbon atoms, preferably hydrogen, methyl, benzoyl or C 2 -C 6 acyl, and
  • R 5 pyridyl, pyrimidyl or pyrazinyl, each up to 3 times, the same or different by halogen, hydroxy, cyano, trifluoromethyl, Ci-C ö alkoxy, Ci-C 6 alkyl, dC 6 alkylthio, carbalkoxy, dC 6 -acyloxy, amino, nitro, mono- or di-C 6 -C 6 -alkylamino can be substituted,
  • the compounds I and Ia include the isomers of the formulas (I) and (Ia) and mixtures thereof.
  • R 4 is hydrogen
  • the isomers (I) and (la) are in tautomeric equilibrium:
  • Preferred compounds of the formulas (I) and (Ia) are those in which
  • R 1 is phenyl, furyl, thienyl, triazolyl, pyridyl, cyclopentyl, cyclohexyl or
  • X is a single bond or an oxygen atom
  • R 12 is hydrogen, C 2 -C 4 -alkenyl, dC -alkoxycarbonyl or dC 4 -alkyl, where the alkyl radical is optionally substituted by pyridyl, cyano, phenoxy, benzyl or by a radical of the formula -NR 15 R 16 , in which
  • R 5 and R 6 are independently hydrogen, benzyl or -CC 4 alkyl
  • R 13 and R 14 independently of one another denote hydrogen, -CC alkyl or cyclopropyl, R 3 is hydrogen, amino or a radical of the formula
  • Formyl, cyano, hydroxy-substituted C 1 -C 4 alkylthio, trifluoromethyl, cyclopropyl, pyridyl or C -C alkyl means, where the alkyl radical optionally by halogen, dC 4 alkoxycarbonyl, hydroxy and / or by the group - (CO ) a-NR 17 R 18 is substituted, wherein
  • R 17 and R 18 independently of one another are hydrogen, phenyl, benzyl or Ci
  • C 4 alkyl which are optionally substituted by C 3 -C 3 -alkoxycarbonyl, amino, hydroxyl, phenyl or benzyl, phenyl and benzyl independently of one another optionally optionally one or two times, identically or differently, by hydroxyl, carboxy, Ci-d- Alkyl or -CC 3 alkoxy are substituted and dC 3 alkyl is optionally substituted by radicals of the formulas -NH-CO-CH 3 or -NH-CO-CF 3 , phenyl or
  • R 17 and R 18 together with the nitrogen atom on which they stand mean a morpholinyl, piperidinyl or pyrrolidinyl ring,
  • R 5 is pyridyl, pyrimidyl or pyrazinyl, and their salts.
  • R 1 is phenyl, furyl, thienyl, triazolyl, pyridyl, cyclopentyl, cyclohexyl or
  • the above-mentioned ring systems optionally up to two, identical or different by substituents selected from the group fluorine, chlorine, bromine, iodine, hydroxy, trifluoromethyl, nitro, -SO 2 -CF 3 , Methyl, cyano, trifluoromethoxy, carboxyl, methoxycarbonyl or residues of the formulas -CO-NH-CH 2 -C (CH 3 ) 3 , -CO-NH (CH 2 ) 2 OH, -CO-NH-CH 2 - C 6 H 5 , -CO-NH-C 6 H 5 , -CO-NH-OHj-C ö E, -O-CH 2 -C 6 H 5 or -S-pCl- C ⁇ i are substituted,
  • R 2 is a radical of the formulas -XR 12 or -NR 13 R 14 , in which
  • X is a single bond or an oxygen atom
  • R 12 is hydrogen, C 2 -C 3 alkenyl, dC 4 alkoxycarbonyl or dC 4 alkyl, in which the alkyl radical is optionally substituted by pyridyl, cyano, phenoxy, benzyl or by a radical of the formula -NR 15 R 16 , in which
  • R 15 and R 16 independently of one another are hydrogen or methyl
  • R 13 and R 14 independently of one another are hydrogen, C 3 -C 3 -alkyl or cyclopropyl
  • R 3 is hydrogen, amino or a radical of the formula
  • Formyl, cyano, trifluoromethyl, cyclopropyl, pyridyl or dC ⁇ alkyl means, where the alkyl radical is optionally substituted by fluorine, chlorine, -C-C 3 - alkoxycarbonyl or hydroxy, or R 3 optionally methoxy-substituted phenyl or
  • R 2 and R 3 together represent a radical of the formula
  • R 4 is hydrogen, methyl, vinyl or acetyl
  • R 5 is pyridyl, pyrimidyl or pyrazinyl, and their salts.
  • R 1 is phenyl or triazolyl, which are optionally substituted up to twice, identically or differently, by fluorine, chlorine, bromine or iodine,
  • R 2 straight-chain or branched alkoxycarbonyl having up to 4 carbon atoms
  • R 3 is methyl, ethyl or cyclopropyl or
  • R 2 and R 3 together represent a radical of the formula
  • R 4 is hydrogen, vinyl or acetyl
  • R 5 is pyridyl. Particularly preferred dihydropyrimidines A are listed in Table A.
  • the dihydropyrimidines A listed in Table B are very particularly preferred.
  • Particularly preferred dihydropyrimidines A are the above compounds 24, 25 and 41 to 44 of Table B.
  • the following compounds are very particularly preferred: their isomeric forms and their salts.
  • R has the meaning given above, with or without addition of base or acid, if appropriate in the presence of inert organic solvents, preferably at temperatures from 20 to 150 ° C., or
  • R 1 has the meaning given above
  • R 5 has the meaning given above and R 1 represents (dC 4 ) alkyl
  • inert organic solvents are suitable as solvents for process variants A, B, C and D.
  • These preferably include alcohols such as ethanol, methanol, isopropanol, ethers such as diethyl ether, tetrahydrofuran, dioxane,
  • Glycol monomethyl ether glycol dimethyl ether, carboxylic acids such as glacial acetic acid, or dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, pyridine and
  • reaction temperatures can be varied within a wide range. In general, the process is carried out in the range from 20 to 150 ° C., but preferably at the boiling point of the particular solvent.
  • the reaction can be carried out at normal pressure, but also at elevated pressure; generally one works under normal pressure.
  • the reaction can be carried out with or without addition of base or acid; the presence of weaker acids such as acetic acid or formic acid is preferred.
  • the aldehydes (II) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [cf. TD Harris and GP Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 2 165 260 and 2 401 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929 c, E. Adler and H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849
  • ⁇ -ketocarboxylic acid esters (TV) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [e.g. D. Borrmann,
  • the ylidene- ⁇ -keto esters (V) used as starting materials can be prepared by methods known from the literature [cf. G. Jones, "The Knoevenagel Condensation” in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
  • enaminocarboxylic acid esters (VI) and the imino ethers (VII) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [cf. S.A. Glickman and A.C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
  • the compounds (E) can be prepared by using compounds of the formula
  • R 5 has the meaning given above, as usual via the imino ethers and finally reacted with ammonium chloride in methanol [cf. see WK Fife, Heterocycles 22, 93-96 (1984); T. Sakamoto, S. Kaneda, S. Nishimura, H. Yamanaka, Chem. Pharm. Bull. 33, 565, 571 (1986)] or other methods known from the literature, such as, for example, Garigipati, Tetrahedron Lett. 1990, 1969-1972, Boere et al, J. Organomet. Chem. 1987, 331, 161, or Caton et al., J. Chem. Soc. 1967, 1204.
  • All process steps can be carried out at normal pressure and in a temperature range from 0 to 130 ° C., preferably from 20 to 100 ° C.
  • the compounds (VIII) are known or can be prepared by processes known per se, for example by using pyridines of the formula
  • TMSCN trimethylsilyl cyanide
  • Y and Z represent the substitution radicals of the pyridyl ring indicated under R, with the help of cyanides, such as potassium cyanide or copper cyanide, which exchanges chlorine for cyanide,
  • Y 'and Z' independently of one another are chlorine or bromine
  • alkali metal or ammonium fluorides preferably potassium fluoride
  • polar solvents such as, for example, polyglycols, polyglycol ethers, DMSO or sulfolane, optionally with the addition of phase transfer catalysts, in the sense of a halogen / fluorine exchange reaction.
  • R 1 is phenyl, furyl, thienyl, pyridyl, cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms or a radical of the formulas
  • Carboxyl, hydroxyl, -CC 6 alkoxy, d-C ⁇ -alkoxycarbonyl and Ci-C ⁇ -alkyl, are substituted, the alkyl radical in turn by aryl with 6 to 10th
  • Carbon atoms or halogen can be substituted, and / or the listed ring systems optionally by groups of
  • R 1 6 optionally halogen-substituted phenyl
  • R 7 to R 10 independently of one another are hydrogen, phenyl, hydroxy-substituted phenyl, hydroxy, dC 6 -acyl or dC 6 -alkyl, where the The alkyl radical in turn can be substituted by hydroxy, dC 6 -alkoxycarbonyl, phenyl or hydroxy-substituted phenyl,
  • A is a radical -O-, -S-, -SO- or -SO 2 -,
  • R 11 is phenyl which is optionally substituted one or more times, identically or differently, by substituents selected from the group consisting of halogen, nitro, trifluoromethyl, Ci-Cö-alkyl and d-Cö-alkoxy,
  • R 2 is a radical of the formulas -OR 12 or -NR 13 R 14 , wherein
  • R 12 is hydrogen, dC 6 -alkoxycarbonyl or a straight-chain, branched or cyclic, saturated or unsaturated C j -C 8 -hydrocarbon radical, which optionally contains one or two identical or different hetero-chain links from the group -O-, -CO- , -NH-, -N- (dC 4 alkyl) -, -S- and -SO 2 - and optionally by halogen, nitro, cyano, hydroxy, aryl with 6 to 10 carbon atoms or aralkyl with 6 to 10 carbon atoms .
  • Heteroaryl or a group of the formula -NR 15 R 16 is substituted, in which R 15 and R 16 independently of one another are hydrogen, benzyl or dC 6 -alkyl,
  • R 13 and R 14 independently of one another hydrogen, -CC 6 alkyl or
  • R, 3 is hydrogen, amino or a radical of the formula
  • R 17 and R 18 independently of one another are hydrogen or aryl, aralkyl having 6 to
  • Ci-Ce- alkyl 10 carbon atoms or Ci-Ce- alkyl, which are optionally substituted by dC 6 - alkoxycarbonyl, amino, hydroxyl, phenyl or benzyl, phenyl and benzyl optionally one or more times, identically or differently, by hydroxyl, carboxyl, C 1 -C 6 Alkyl or dC 6 -alkoxy are substituted and or d-C ⁇ -alkyl is optionally substituted by -NH-CO-CH 3 or -NH-CO-CF 3 ,
  • R 17 and R 18 together with the nitrogen atom on which they stand mean a morpholinyl, piperidinyl or pyrrolidinyl ring,
  • D is an oxygen or sulfur atom
  • R 5 is hydrogen, halogen or straight-chain or branched alkyl having up to 6 carbon atoms, and their salts.
  • R 1 is phenyl, furyl, thienyl, pyridyl, cyclopentyl or cyclohexyl, these ring systems optionally one or two times, identical or different by substituents, selected from the group halogen, trifluoromethyl, nitro, -SO 2 -CF 3 , methyl, cyano, Trifluoromethoxy, carboxyl, methoxycarbonyl or residues of the formulas -CO-NH-CH 2 -C (CH 3 ) 3 , -CO-NH (CH 2 ) 2 OH, - CO-NH-CH 2 -C 6 H 5 , -CO -NH-C 6 H 5 , -CO-NH- (pOH) -C 6 H 4 , -O-CH 2 -C 6 H 5 or -S-pCl-dEL; are substituted,
  • R 2 represents a radical of the formulas -OR 12 or -NR 13 R 14 , in which
  • R 12 is hydrogen, C 2 -C 4 alkenyl or dC 4 alkyl, the alkyl radical in turn optionally being substituted by pyridyl, cyano, phenoxy, benzyl or by a radical of the formula -NR 15 R 16 , in which R 15 and R l ⁇ are independently hydrogen, methyl or ethyl,
  • R 13 and R 14 independently of one another are hydrogen, methyl, ethyl or cyclopropyl
  • R 3 is hydrogen or a radical of the formula
  • Formyl, cyano, trifluoromethyl, cyclopropyl or dC 4 -alkyl means, the alkyl radical in turn optionally being represented by radicals of the formulas
  • R and R independently of one another are hydrogen, phenyl, benzyl or Ci
  • C 4 alkyl which are optionally substituted by dC 3 - alkoxycarbonyl, amino, hydroxyl, phenyl or benzyl, phenyl and benzyl independently of one another optionally optionally one or two times, identically or differently, by hydroxyl, carboxy, C 1 -C 3 - Alkyl or dC 3 -alkoxy are substituted and dC -alkyl is optionally substituted by radicals of the formulas -NH-CO-CH 3 or -NH-CO-CF 3 , phenyl or
  • R 4 is hydrogen, methyl, ethyl or acetyl
  • D is an oxygen or sulfur atom
  • R 5 is hydrogen, halogen or C ⁇ . -C 4 alkyl, and their salts.
  • R 1 is phenyl or thienyl, these ring systems optionally being substituted up to twice, identically or differently, by substituents selected from the group consisting of fluorine, chlorine, methyl, trifluoromethyl and nitro,
  • R 2 is a radical of the formulas -OR 12 or -NR 13 R 14 , wherein
  • R 12 is hydrogen or d-alkyl
  • R 13 and R 14 independently of one another denote hydrogen or methyl
  • R 3 denotes hydrogen or formyl, cyano, trifluoromethyl, cyclopropyl or dC 3 alkyl which is optionally substituted by fluorine, chlorine or hydroxyl and which in turn can be substituted up to 3 times by dC 3 alkoxycarbonyl,
  • R 4 is hydrogen or methyl
  • D is an oxygen or sulfur atom
  • R 5 is hydrogen, fluorine, chlorine or -CC 3 alkyl, and their salts.
  • R 1 is phenyl or thienyl, which are optionally substituted up to twice, identically or differently, by fluorine or chlorine,
  • R 4 is hydrogen
  • D is an oxygen or sulfur atom
  • R 5 is hydrogen, fluorine or chlorine, and their salts.
  • Preferred such 2-heterocyclically substituted dydropyrimidines include, for example, the compounds in the following table.
  • the Rr values were determined in cyclohexane / ethyl acetate (7: 3 parts by volume).
  • Cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms in the context of the invention represents cyclopropyl, cyclopentyl, cyclobutyl, cyclohexyl, preferably cyclopentyl and cyclohexyl.
  • Aryl generally represents an aromatic radical having 6 to 10 carbon atoms, preferably phenyl and naphthyl.
  • aralkyl stands for aralkyl with preferably 6 to 10, in particular 6 carbon atoms in the aryl part (preferably phenyl or naphthyl, in particular phenyl) and preferably 1 to 4, in particular 1 or 2 carbon atoms in the alkyl part, the alkyl part being linear or branched can be.
  • Preferred aralkyl radicals are benzyl and phenethyl.
  • Heteroaryl in the context of the invention represents 5- to 7-membered rings with preferably 1 to 3, in particular 1 or 2 identical or different heteroatoms from the series oxygen, sulfur and nitrogen.
  • Preferred examples include furyl, thiophenyl, pyrazolyl, imidazolyl, 1.2.3- and 1.2.4-triazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, 1.2.3-, 1.3.4-, 1.2.4- and 1.2.5-oxadiazolyl , Pyrrolyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, 1.3.5-, 1.2.4- and 1.2.3-triazinyl, 1.2.4-, 1.3.2-, 1.3.6- and
  • acyl represents a straight-chain or branched acyl radical having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms, such as, for example, acetyl and propionyl.
  • alkyl represents a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms, such as e.g. Methyl, ethyl, propyl, isopropyl, tert-butyl, n-pentyl and n-hexyl.
  • alkenyl represents a straight-chain or branched alkenyl radical having 2 to 6, preferably 3 to 5, carbon atoms, such as, for example, ethenyl,
  • alkoxy represents a straight-chain or branched alkoxy radical having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms, such as e.g. Methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, tert-butoxy, n-pentoxy and n-hexoxy.
  • alkylthio represents a straight-chain or branched alkylthio radical having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms, such as, for example, methylthio, ethylthio and propylthio.
  • alkoxycarbonyl represents a straight-chain or branched alkoxycarbonyl radical having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms, such as, for example, Methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, n-pentoxycarbonyl and n-hexoxycarbonyl.
  • Halogen in the context of the invention represents fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • the compounds I and Ia can be in stereoisomeric forms, which are either like
  • the compounds I and Ia thus include both the enantiomers and the diastereomers and their respective Mixtures. Like the diastereomers, the racemic forms can be separated into the stereoisomerically uniform constituents in a known manner.
  • the compounds I and Ia can also be present as salts.
  • physiologically acceptable salts are preferred.
  • Physiologically acceptable salts can be salts of the compounds I or Ia with inorganic or organic acids.
  • Salts of inorganic acids such as, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid or sulfuric acid, or salts of organic carboxylic or sulfonic acids, such as, for example, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, citric acid, tartaric acid, lactic acid, benzoic acid, or methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, phenylsulfonic acid , Toluenesulfonic acid or naphthalenedisulfonic acid.
  • Physiologically acceptable salts can also be metal or ammonium salts
  • Compounds I or Ia For example, particular preference is given to Sodium, potassium, magnesium or calcium salts and ammonium salts derived from ammonia or organic amines, such as ethylamine, di- or triethylamine, di- or triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, arginine, lysine, ethylenediamine or 2- Phenylethylamine.
  • ammonia or organic amines such as ethylamine, di- or triethylamine, di- or triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, arginine, lysine, ethylenediamine or 2- Phenylethylamine.
  • the compounds (I) or (Ia) can be prepared by
  • R 1 has the meaning given above
  • amidines of the formula wherein R • 5 and D have the meanings given above, with or without addition of base or acid, preferably at temperatures of 20 to 150 ° C, optionally in the presence of inert organic solvents, or
  • R 1 has the meaning given above
  • R - C C - CO-R 2
  • solvents are suitable as solvents.
  • solvents preferably include alcohols such as ethanol, methanol, isopropanol, ethers such as dioxane, diethyl ether, tetrahydrofuran, glycol monomethyl ether, glycol dimethyl ether, carboxylic acids such as glacial acetic acid, or dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, pyridine and hexamethylphosphoric acid triamide.
  • reaction temperatures can be varied within a wide range; generally one works in a range of 20 to 150 ° C, but preferably at the boiling point of the solvent.
  • the reaction can be carried out at normal pressure, but also at elevated pressure; generally one works under normal pressure.
  • the reaction can be carried out with or without addition of base or acid, preferably in the presence of weaker acids, such as, for example, acetic acid or formic acid.
  • weaker acids such as, for example, acetic acid or formic acid.
  • the aldehydes (II) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [cf. TD Harris and GP Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 2 165 260 and 2 401 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929 c, E. Adler and H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), EP Papadopoulos, M. Mardin and Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78
  • amidines (III) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [cf. "Methods of Organic Chemistry” (Houben-Weyl), Vol. 11/2, page 38 ff (1958); R.L. Shoiner and F.W.
  • ⁇ -ketocarboxylic acid esters (IV) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [e.g. D. Borrmann, "Reaction of Diketene with Alcohols, Phenols and Mercaptans", in “Methods of Organic Chemistry” (Houben-Weyl), Vol. VII / 4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano and O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
  • the ylidene- ⁇ -keto esters (V) used as starting materials can be prepared by methods known from the literature [cf. G. Jones, "The Knoevenagel Condition” in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
  • enammocarboxylic acid esters (VI) used as starting materials are known or can be prepared by methods known from the literature [cf. A.C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
  • the dihydropyrimidines A act as HBV core protein inhibitors. Combinations are therefore a further subject of the invention.
  • HBV core protein inhibitors in the sense of the invention are those non-nucleoside inhibitors which in the cell (i) at least halve the half-life of the HBV core protein or (ii) pass the binding test described below.
  • the synthesis rate and the stability of the HBV core protein can be measured by pulse chase labeling of HepG2.2.15 cells and subsequent immunoprecipitation of the HBV core protein.
  • the half-life of the core protein is used as a measure of the stability.
  • the amount of protein correlates with the built-in radioactivity and consequently that
  • Blackening of an X-ray film or the radiation intensity that can be made visible by a phosphor imager Blackening of an X-ray film or the radiation intensity that can be made visible by a phosphor imager.
  • the HepG2.2.15 cells are used in cell culture bottles (75 cm 2 ; Costar) with a density of 6 ⁇ 10 6 cells per bottle in HepG2 cell culture medium (Biochrom KG, Berlin). 100 liters of this medium consist of 74.8 liters of ®seromed RPMI 1640 medium and 14.4 liters of ⁇ seromed Medium 199 with Earle's
  • FCS fetal calf serum
  • test substance is prepared as a 50 mM stock solution in dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, Kunststoff). It is diluted in HepG2 cell culture medium and adjusted to 100 times the IC 50 concentration. 1 ml of this test substance solution is added to 19 ml of HepG2 cell culture medium. The test substance is added with the sowing in graduated dilution steps. The cells are incubated at 37 ° C and 5% CO 2 (v / v) in the incubator.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the culture medium is discarded and replaced by 20 ml of a medium from which the amino acids methionine and cystine are removed ("starvation medium").
  • MEM minimum essential medium with Earle's salts; Gibco 51091-015 - the composition is described before the examples
  • the incubation with hunger medium is carried out in the presence of the test substance (concentration as above).
  • the cells are incubated for 45 minutes at 37 ° C. and 5% CO 2 (v / v) in the incubator.
  • 16 ml of hunger medium are removed and the remaining medium is mixed with 25 ⁇ l of 35 S-Redivue Promix (2.5 mCi / 175 ⁇ l) (Amersham, AGQ 0080).
  • the cells are incubated for a further 10 minutes at 37 ° C. and 5% CO 2 (v / v) in the incubator (“pulse”).
  • the marking solution is then removed and fed with starving medium plus aqueous L-cystine solution (up to a cystine concentration of the total solution of 1 mM) and aqueous L-methionine solution (up to a methionine concentration of the total solution of 1 mM) ) ("Labelstopmedium”) replaced. This stops the marking. Incubation with label stop medium is also carried out in the presence of the test substance (concentration as above). The total volume is 20 ml per bottle. The cultures are at
  • the medium is removed and the cells are washed once with PBS (phosphate-buffered saline without Ca / Mg **) (biochrome No. L1825).
  • the cell lawn is then washed with 1 ml of lysis buffer ⁇ 10 mM Tris-HCl pH 7.5; 1% (v / v) of the nonionic detergent ⁇ Triton X-100 [trademark of Rohm & Haas, 4- (1.1.3.3-tetramethylbutyl) -phenol-polyethoxyethanol]; 140 mM NaCl ⁇ lysed.
  • Tris stands for 2-amino-2- (hydroxymethyl) -1,3-propanediol.
  • Precipitation of the HBV core protein by specific immunoprecipitation To the lysate are added 10 ul Kanichen normal serum (Sigma 7523) and 200 ul Sepharose beads suspended in PBS (Protein-A-Sepharose C1-4B; Pharmacia, 17-0780-01) (Alternatively, the complex of beads and antibodies are preformed). This is followed by incubation for 2 hours at 4 ° C on the rotary wheel. The immunoprecipitates are separated by centrifugation (2 minutes; 1000 rpm) and stored at 4 ° C. The supernatant is transferred to a new Eppendorf tube.
  • the beads are washed three times with NET buffer [50 mM Tris-HCl pH 7.4; 0.5% (v / v) of the nonionic detergent ⁇ Nonident NP-40 (Boehringer Mannheim); 150 mM NaCl; 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)], i.e. alternately suspended and centrifuged (2 minutes at 1000 rpm).
  • NET buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.4; 0.5% (v / v) of the nonionic detergent ⁇ Nonident NP-40 (Boehringer Mannheim); 150 mM NaCl; 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)], i.e. alternately suspended and centrifuged (2 minutes at 1000 rpm).
  • NET buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.4; 0.5% (v / v) of the nonionic detergent ⁇ Nonident NP-40 (Boehringer Mannheim); 150 mM
  • the gel is immersed three times for 5 minutes in fixing solution (70 vol.% Ethanol; 10 vol.% Acetic acid; 20 vol.% Water). The gel is then bathed in an enhancer (Enlightning Rapid Autoradiography Enhancer NEN Research Products No. NEF-974) for 20 minutes. The gel is placed on filter paper (BioRad No. 165-0921) and covered with cellophane (BioRad No. 165-0922). This arrangement is dried for 50 minutes with the BioRad gel dryer.
  • the dried gel is placed on an X-ray film (Hyperfilm MP; Amersham RPN 2115H) and developed after an appropriate exposure period.
  • the dried gel can be analyzed on a phosphor imager (Fujix BAS 100). The evaluation compares the half-lives of the HBV core protein in the presence and absence of the test substance.
  • chromatographic behavior of a protein or one of its naturally occurring forms of aggregation (dimers, multimers) during gel permeation chromatography depends on the choice of the gel material used.
  • the gel material used in desalination columns e.g. Sephadex G-25; Pharmacia
  • Molecular weight is 5000 daltons; ie all proteins with a molecular weight greater than 5000 Da are eluted in the exclusion volume.
  • a globular protein that has a molecular weight below 5000 Da penetrates the separation material and is retained on the column.
  • the rule of thumb is: the lower the molecular weight of a molecule, the longer it will take the way through the gel bed and the later the molecule is eluted.
  • This basic test arrangement can be used for a binding test. The binding test is used to examine whether a test substance binds to a protein of interest.
  • the material is applied to the column and eluted with an elution buffer (eg 10 mM Tris pH 7.4 and 1 mM EDTA).
  • an elution buffer eg 10 mM Tris pH 7.4 and 1 mM EDTA.
  • the labeled test substance like the free protein, is eluted in the exclusion volume.
  • a non-binding test substance or the excess of the test substance is eluted in the late elution volume.
  • individual fractions are collected and the radioactivity is determined in the scintillation counter (or by another suitable detection method).
  • this method is carried out as a variant of the binding test in such a way that, for example, a labeled substance that binds to the HBV core protein (“labeled substance”) is used to find further core protein binders: the labeled one Substance is directly displaced by a test substance ("displacing substance”) (competition for the same binding site) or the
  • Test substance modifies the protein (or one of its aggregate forms) in such a way that the labeled substance can no longer bind (modification of the binding site).
  • the Sephadex G-25 column (height of the column: 5 cm, diameter of the column: 1.5 cm) is cast according to standard procedures (manufacturer's instructions) or obtained from a manufacturer (e.g. PDIO desalting columns from Phamacia).
  • the column is equilibrated in the desired buffer (10 mM Tris pH 7.4 and 1 mM EDTA).
  • test substance displaces labeled substance, less activity is measured in the fractions containing the exclusion volume than in fractions in which no test substance was present (zero value).
  • An HBV core protein inhibitor is present when a maximum of 50% of the activity of the zero value is present.
  • the half-life test (i) described above usually gives the more accurate values; however, it is time consuming. If many substances are to be tested, the binding test (ii) will be chosen because of the higher test speed; it is also suitable for screening, which can then be followed by a half-life test (i) for selected compounds.
  • HBV core protein inhibitors in the sense of the invention are those which pass at least the half-life test (i) described above.
  • a particular embodiment of the invention relates to combinations of A) the above dihydropyrimidines (I) or (Ia), B) HBV polymerase inhibitors and, if appropriate, C) immunomodulators.
  • HBV polymerase inhibitors B in the sense of the invention are substances which are described in the endogenous polymerase assay described below, which was described by Ph. A. Furman et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 36 (No. 12), 2688 (1992), lead to an inhibition of the formation of an HBV-DNA double strand in such a way that there is a maximum of 50% of the activity of the zero value: HBV virions from culture supernatants incorporate nucleoside 5'-triphosphates into the plus strand of HBV DNA in vitro.
  • HBV virions are obtained from the cell culture supernatant of HepG2.2.15 cells by precipitation with polyethylene glycol and concentrated. 1 volume of clarified cell culture supernatant is mixed with 1 volume of an aqueous solution containing 50% by weight of 8000 polyethylene glycol and 0.6 M sodium chloride. The virions are sedimented by centrifugation at 2,500 xg / 15 minutes. The sediments are contained in 2 ml of buffer
  • Tris-HCl P H 7.5
  • the samples can be frozen at -80 ° C.
  • Each reaction mixture 100 ⁇ l contains at least 10 5 HBV virions; 50 mM Tris-HCl (p H 7.5); 300mM potassium chloride; 50mM magnesium chloride; 0.1% ® Nonident P-40 (non-ionic detergent from Boehringer Mannheim); 10 ⁇ M each of dATP, dGTP and dTTP; 10 ⁇ Ci [ 32 P] dCTP (3000 Ci / mmol; final concentration 33 nM) and 1 ⁇ M of the potential polymerase inhibitor in its triphosphorylated form.
  • samples are incubated at 37 ° C for one hour and then the reaction is stopped by adding 50 mM EDTA.
  • a 10% weight volume SDS solution (containing 10 g SDS per 90 ml water) is added to a final concentration of 1% by volume (based on total volume) and Proteinase K is added to a final concentration of 1 mg / ml added.
  • samples are extracted with the same volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (volume ratio 25: 24: 1), and the DNA is precipitated from the aqueous phase with ethanol.
  • the DNA pellet is dissolved in 10 ⁇ l gel buffer (solution of
  • HBV polymerase inhibitor is present when a maximum of 50% of the activity of the negative control is present.
  • Preferred HBV polymerase inhibitors B) include, for example
  • FTC (2R-cis) -4-amino-5-fluoro-l- [2- (hydroxymethyl) -1.3-oxathiolan-5-yl] pyrimidine -
  • L-FMAU 1 - (2-deoxy-2-fluoro-ß-L-arabinofuranosyl) -5-methyl-pyrimidine-2.4 (1H, 3H) -dione, cf. WO 99/05157, WO 99/05158 and US Pat. No. 5,753,789.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to combinations of A) above dihydropyrimidines (I) or (Ia) and B) lamivudine.
  • HBV antiviral agents B include e.g. Phenylpropenamide the
  • R 1 and R 2 independently of one another denote dC -alkyl or together with the nitrogen atom on which they are located form a ring having 5 to 6 ring atoms which comprise carbon and / or oxygen,
  • R 3 -R 12 independently of one another are hydrogen, halogen, C 1 -C 4 -alkyl, optionally substituted C 1 -C 4 -alkoxy, nitro, cyano or trifluoromethyl,
  • R 13 is hydrogen, -CC 4 alkyl, -C 7 -acyl or aralkyl and X is halogen or optionally substituted dC 4 alkyl, and their salts.
  • AT-61 is the compound of the above formula wherein X is chlorine, A 1-piperidinyl and Y and Z are each phenyl. Our own studies have shown that AT-61 is not an HBV core protein inhibitor in the sense of this invention (test see above).
  • Preferred immunomodulators C) include, for example, all interferons such as ⁇ , ⁇ and ⁇ interferons, in particular also ⁇ -2a and ⁇ -2b interferons, interleukins such as interleukin-2, polypeptides such as thymosin- ⁇ -1 and thymoctonan, Imidazoquinoline derivatives such as ⁇ Levamisole, immunoglobulins and therapeutic vaccines.
  • interferons such as ⁇ , ⁇ and ⁇ interferons, in particular also ⁇ -2a and ⁇ -2b interferons, interleukins such as interleukin-2, polypeptides such as thymosin- ⁇ -1 and thymoctonan, Imidazoquinoline derivatives such as ⁇ Levamisole, immunoglobulins and therapeutic vaccines.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to combinations of A) above dihydropyrimidines (I) or (Ia), B) lamivudine and optionally C) interferon.
  • the present invention includes pharmaceutical preparations which, in addition to non-toxic, inert pharmaceutically suitable excipients, contain one or more combinations according to the invention or which consist of a combination according to the invention, and methods for producing these preparations.
  • the quantitative ratio of components A, B and optionally C of the combinations according to the invention can vary within wide limits; it is preferably 5 to 500 mg A / 10 to 1000 mg B, in particular 10 to 200 mg A / 20 to 400 mg B.
  • Component C which may optionally be used, can be used in amounts of preferably 1 to 10 million, in particular 2 to 7 million IE (international units), applied approximately three times a week over a period of up to one year.
  • the combinations according to the invention should generally be present in the pharmaceutical preparations listed above in a concentration of about 0.1 to 99.5, preferably about 0.5 to 95,% by weight of the total mixture.
  • the pharmaceutical preparations listed above can also contain further active pharmaceutical ingredients.
  • compositions listed above can be prepared in a customary manner by known methods, e.g. by mixing the active ingredient or ingredients with the carrier (s).
  • a single dose contains the active ingredient or active ingredients preferably in amounts of about 1 to about 80, in particular 1 to 30 mg / kg body weight.
  • the doses mentioned may be necessary to deviate from the doses mentioned, depending on the type and body weight of the object to be treated, the type and severity of the disease, the type of preparation and administration of the drug, and the period or Interval within which the administration takes place.
  • the combinations according to the invention are antiviral against hepatitis B viruses
  • HBV virus-induced diseases
  • a chronic viral disease caused by HBV can lead to different degrees of severity Cause clinical pictures;
  • chronic hepatitis B virus infection in many cases leads to cirrhosis of the liver and / or hepatocellular carcinoma.
  • the indication areas for the combinations according to the invention include:
  • prophylactic / therapeutic treatment for transplants such as Liver transplants.
  • the invention therefore also relates to the combinations defined above for combating diseases.
  • the invention further relates to medicaments containing at least one of the combinations defined above and optionally further pharmaceuticals
  • Another object of the invention is the use of the combinations defined above for the manufacture of a medicament for the treatment and prophylaxis of the diseases described above, preferably viral diseases, in particular hepatitis B.
  • the antiviral effect of the combinations according to the invention was based on that of M. A. Seils et al., Proc. Natl. Acad. Be. 84, 1005-1009 (1987) and B.E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55-70 (1992).
  • the combinatorial test of the test substances was carried out by means of checkerboard titration.
  • the antiviral tests were carried out in 96 well microtiter plates.
  • the first vertical row of the plate only received HepG2.2.15 cells in growth medium. It served as a virus cone.
  • test compounds 50 mM were first dissolved in DMSO; further dilutions were made in growth medium. The remaining wells contained the combinations according to the invention or their individual components in the test concentrations of e.g. 5 ⁇ M to 0.01 ⁇ M, starting from A2 to Hl 1 der
  • test mixture was incubated for 8 days at 37 ° Celsius and 5% CO 2 (v / v). On day 4, the medium was replaced by fresh inhibitor-containing medium.
  • the HepG2.2.15 cells were examined for light-microscopic changes or by means of biochemical detection methods (e.g. Alamar blue staining or trypan blue staining) for cytotoxic changes.
  • biochemical detection methods e.g. Alamar blue staining or trypan blue staining
  • Substance-induced cytotoxic or cytostatic changes in the HepG2.2.15 cells were e.g. determined by light microscopy as changes in cell morphology. Such substance-induced changes in the HepG2.2.15 cells compared to untreated cells were e.g. visible as cell lysis, vacuolization or altered cell morphology. 50% cytotoxicity ("Tox.-50") means that 50% of the cells have a morphology comparable to the corresponding cell control.
  • the nucleic acids contained therein were denatured (1.5 M NaCl / 0.5 N NaOH), neutralized (3 M NaCl 0.5 M Tris Hcl, pH 7.5) and washed (2 x SSC). The DNA was then baked onto the membrane by incubating the filters at 120 ° C. for 2-4 hours.
  • the detection of the viral DNA from the treated HepG2.2.15 cells on the nylon filters was generally carried out using non-radioactive, digoxigenin-labeled hepatitis B-specific DNA probes, which were labeled with digoxigenin according to the manufacturer's instructions, purified and used for hybidization ,
  • the prehybidization and hybidization were carried out in 5 x SSC, 1 x blocking reagent, 0.1% N-lauroylsarcosine, 0.02% SDS and 100 ⁇ g sperm DNA of the herring.
  • the pre-hybridization took place at 60 ° C for 30 minutes, the specific hybridization with 20 - 40 ng / ml of the digoxigenized, denatured HBV-specific DNA (14 hours, 60 ° C). The filters were then washed.
  • the digoxigenin-labeled DNA was detected immunologically according to the manufacturer's instructions.
  • the filters were washed and prehybridized in a blocking reagent (according to the manufacturer's instructions). The mixture was then hybridized for 30 minutes with an anti-DIG antibody which was coupled with alkaline phosphatase. After a washing step, the substrate of alkaline phosphatase, CSPD, was added, 5
  • the treatment of HBV with the combinations according to the invention has an antiviral effect better than the individual treatment; the treatment of the HepGits 2.2 virus-producing HepG2.2.15 cells with the combinations according to the invention led to a greater reduction in the intracellular viral DNA; the combination treatment is synergistically effective.

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Abstract

Kombinationen von Dihydropyrimidinen, Lamivudin und gegebenenfalls Interferon hemmen die Vermehrung von HBV-Viren besser als bislang bekannte Mittel.

Description

Arzπeimittelkombinationen gegen virale Erkrankungen
Die Erfindung betrifft Kombinationen von A) nicht-nukleosidischen Hemmstoffen, wie z.B. Dihydropyrimidinen, B) anderen antiviralen Mitteln und gegebenenfalls C)
Immunmodulatoren, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-Infektionen.
Unter „Kombinationen" im Sinne der Erfindung werden nicht nur Darreichungsfor- men, die alle Komponenten enthalten (sog. Fixkombinationen), und Kombinationspackungen, die die Komponenten voneinander getrennt enthalten, verstanden, sondern auch gleichzeitig oder zeitlich versetzt applizierte Komponenten, sofern sie zur Behandlung oder Prophylaxe derselben Krankheit eingesetzt werden.
Das Hepatitis-B-Virus gehört zur Familie der Hepadna- Viren. Es verursacht eine akute und/oder eine peristent-progrediente, chronische Erkrankung. Vielfältige andere klinische Manifestationen im Krankheitsbild werden durch das Hepatitis-B- Virus mitverursacht - insbesondere chronische Leberentzündung, Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom. Weiterhin kann eine Koinfektion mit dem Hepatitis- Delta- Virus den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen.
Zur Virushemmung sind bereits mehrere Möghchkeiten vorgeschlagen worden:
1. die Hemmung der Polymerase des HBV durch Analoga der Substrate dieses Enzyms wie Lamivudin, FTC, Adefovir Dipivoxil, Abacavir, ß-L-FDDC,
L-FMAU und BMS 200475:
Die Polymerase ist eine der wesentlichen und im Vermehrungszyklus essentiellen enzymatischen Aktivitäten des HBV- Virus; vgl. Radziwill et al., J. Virol. 64, 613 - 620 (1990). Analoga der natürlichen Substrate - zumeist nach Phosphorylierung durch die wirtseigenen Enzyme - des viralen Polymerasekomplexes hemmen die Polymeraseaktivität und somit die Replikation des HBV in vitro und in vivo; vgl. z.B. Chang et al., J. Biol. Chem. 267, 13938 -13942 (1992).
Lamivudin wird seit kurzem zur Behandlung von chronisch HBV-infizierten Patien- ten eingesetzt. Es zeigt allerdings nach Absetzen der Therapie einen hohen Reboundeffekt und führt während der Langzeittherapie zu Resistenzen. Für Adefovir Dipi- voxil, BMS 200475 und die anderen oben erwähnten Hemmstoffe liegen noch keine allgemein zugänglichen klinischen Erfahrungen vor.
2. die Hemmung des HBV durch immunologische Prinzipien, wie z.B. die
Behandlung chronischer Hepatitis durch Interferon; allerdings ist es nur mäßig wirksam und hat unerwünschte Nebenwirkungen. Kombinationen von Interferon mit Lamivudin sind nicht synergistisch wirksam.
Auch die Stimulierung wirtseigener Immunabwehr, wie z.B. mit Thymosin-α, ist bereits vorgeschlagen worden.
3. die Hemmung durch andere Wirksubstanzen, deren Wirkungsweisen nicht bekannt oder Gegenstand von Spekulationen sind, wie z.B. AT-61 = N-[(1E)- 2-Chlor-2-phenyl-l-(l-piperidinylcarbonyl)-ethenyl]-benzamid, das offenbar in den Vorgang der Verpackung der prägenomischen RNA in die unfertigen core-Partikel eingreift; vgl. King et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 42, 3179 - 3186 (1998). Wenn auch der Mechanismus noch nicht völlig aufgeklärt ist, scheinen die Autoren eine Wirkung auf das core-Protein auszu- schließen. Die in-vitro-Kombination von AT-61 und Lamivudin wird als synergistisch wirksam beschrieben.
Bisherige Therapeutika zur Behandlung HBV-infizierter Patienten, wie z.B. Interferon oder Lamivudin, werden als Monotherapie eingesetzt. Aus klinischen Studien ist bekannt, dass Kombinationen beider Hemmstoffe keinen Vorteil bei der Bekämpfung von HB V-Erkrankungen aufweisen. Neue Mittel für eine bessere und wirksame Therapie sind daher wünschenswert.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Kombinationen von A) nicht- nukleosidischen Hemmstoffen wie Dihydropyrimidinen, B) anderen HBV-antiviralen
Mitteln und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren die Nachteile des Standes der Technik nicht oder nur noch teilweise aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind daher Kombinationen A) mindestens eines Dihydro- pyrimidins, B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels, vorzugsweise eines HBV-Polymerase-Inhibitors, und gegebenenfalls C) mindestens eines Immunmodulators. Die Erfindung betrifft also Kombinationen von nukleosidischen und nicht-nukleosidischen Hemmstoffen und gegebenenfalls Immunmodulatoren zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-Infektionen sowie die Verwendung dieser Kombinationen zur Behandlung HB V-induzierter Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Kombinationen hemmen die Vermehrung des HBV- Virus unvorhersehbar wesentlich besser als die aus dem Stand der Technik bekannten Mittel oder deren bekannte Kombinationen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationen bietet bei der Behandlung HBV-induzierter Erkrankungen wertvolle
Vorteile im Vergleich zur Monotherapie mit den Einzelverbindungen, nämlich hauptsächlich eine synergistische antivirale Wirksamkeit, aber auch eine gute Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Kombinationen im Bereich der Toxizität, bei der 50 % der Zellen überleben („Tox-50") - im Vergleich zur Tox-50 der Einzelkomponenten.
Bevorzugte Dihydropyrimidine A entsprechen beispielsweise der Formel
Figure imgf000005_0001
bzw. deren isomerer Form
Figure imgf000005_0002
wonn
R Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Reste der Formeln
Figure imgf000005_0003
oder
Figure imgf000005_0004
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, -Cö-Alkoxy, d-Ce-Alkoxycarbonyl und -Cö-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch
-S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10, -SO2-CF3 und -A-CHrR11 substituiert sind, worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R bis R unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substitu- iertes Phenyl, Hydroxy, Q-Cö-Acyl oder Ci-Cβ-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, d-Cö-Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2 -,
Ru Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, Q-Cö-Alkyl und Cι-C6-Alkoxy, substituiert ist, bedeuten,
einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14,
worin
X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,
R12 Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes CrCδ-Alkoxycarbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Cj-C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(d-C4-Alkyl)-,
-S- oder -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist,
worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder d-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C6-Alkyl oder Cyclo- alkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R >3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH, oder
Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes Cι-C6-Alkylthio, Trifluormethyl oder Pyridyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge- sättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, Cι-C6- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, d-C6- Alkylthio oder d-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seiner- seits durch Azido, Amino, Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Ci- C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch Cι-C6-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, Cι-C6-Alkyl oder Cι-C6-Alkoxy substituiert sind und/oder Cι-C6-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO- CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
oder
R gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl
oder
R und R gemeinsam einen Rest der Formel
Figure imgf000008_0001
R Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, C2-C4-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Benzoyl oder C2-C6- Acyl, und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3 -fach, gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, Ci-Cö-Alkoxy, Ci- C6-Alkyl, d-C6-Alkylthio, Carbalkoxy, d-C6-Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-Cι-C6-alkylamino substituiert sein können,
bedeuten, sowie deren Salze.
Die Verbindungen I bzw. Ia schließen die Isomeren der Formeln (I) und (la) sowie deren Mischungen ein. Wenn R4 Wasserstoff ist, liegen die Isomeren (I) und (la) im tautomeren Gleichgewicht vor:
Figure imgf000009_0001
( da)
Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) bzw. (Ia), worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder
Reste der Formeln
Figure imgf000009_0002
oder
Figure imgf000010_0001
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, -SO2-CF3, Methyl, Cyano, Trifluor- methoxy, Hydroxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln - CO-NH-CH2-C(CH3)3, -CO-NH(CH2)2OH, -CO-NH-CH2-C6H5, -CO-NH-C6H5, -CO-NH-(pOH)-C6H ,
-O-CH2-C6H5 oder -S-pCl-C6B ι substituiert sind,
einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14, worin
X eine Einfachbindung oder ein Sauerstoffatom,
R12 Wasserstoff, C2-C4-Alkenyl, d-C -Alkoxycarbonyl oder d-C4-Alkyl, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin
R 5 und R 6 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder Cι-C4-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C -Alkyl oder Cyc- lopropyl bedeuten, R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH,
oder
Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes C1-C4-Alkylthio, Trifluormethyl, Cyclopropyl, Pyridyl oder C -C -Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Halogen, d-C4-Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist, worin
a Null oder 1,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder Ci-
C4-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch Cι-C3-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei unabhängig voneinander Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, Ci-d-Alkyl oder Cι-C3-Alkoxy substituiert sind und d-C3-Alkyl gegebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist, Phenyl oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
oder
gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl oder
R und gemeinsam einen Rest der Formel
°^
R > Wasserstoff, Methyl, Vinyl oder Acetyl und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl bedeuten, und deren Salze.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) und (Ia), worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder
Reste der Formeln
Figure imgf000012_0001
oder
Figure imgf000012_0002
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxy, Trifluormethyl, Nitro, -SO2-CF3, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH2-C(CH3)3, -CO-NH(CH2)2OH, -CO-NH-CH2- C6H5, -CO-NH-C6H5, -CO-NH- OHj-CöE , -O-CH2-C6H5 oder -S-pCl- CβΑi substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14, worin
X eine Einfachbindung oder ein Sauerstoffatom,
R12 Wasserstoff, C2-C3-Alkenyl, d-C4-Alkoxycarbonyl oder d-C4-Alkyl, worin der Alkylrest gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin
R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C3-Alkyl oder Cyc- lopropyl bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH3 oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl, Pyridyl oder d-C^Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Fluor, Chlor, Cι-C3- Alkoxycarbonyl oder Hydroxy substituiert ist, oder R3 gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, Methyl, Vinyl oder Acetyl und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl bedeuten, und deren Salze.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) und (Ia), worin
R1 Phenyl oder Triazolyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Fluor, Chlor, Brom oder Iod substituiert sind,
R2 geradkettiges oder verzweigtes Alkoxycarbonyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen,
R3 Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, Vinyl oder Acetyl und
R5 Pyridyl bedeuten. Speziell bevorzugte Dihydropyrimidine A sind in Tabelle A aufgeführt.
Tabelle A:
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Ganz speziell bevorzugt sind die in Tabelle B aufgeführten Dihydropyrimidine A.
Tabelle B:
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Besonders bevorzugte Dihydropyrimidine A sind die obigen Verbindungen 24, 25 und 41 bis 44 der Tabelle B. Ganz besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen:
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0002
ihre isomeren Formen und ihre Salze.
Die Verbindungen der Formeln (I), (Ia) bzw. der Tabellen A und B können hergestellt werden, indem man
[A] Aldehyde der Formel
R^CHO (II)
worin R die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Arnidinen der Formel
Figure imgf000036_0001
worin R • 5 die oben angegebene Bedeutung hat,
und Verbindungen der Formel
R3-CO-CH2-CO-R2 (TV)
worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel umsetzt oder
[B] Verbindungen der Formel
Figure imgf000036_0002
worin R > 1 - bui.s, r R>3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit Amidinen der Formel
Figure imgf000036_0003
worin R die oben angegebene Bedeutung hat, mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, umsetzt, oder
[C] Aldehyde der Formel
R^CHO (II)
worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Verbindungen der Formel
R— C=C — CO-R2 (VI)
H
NU,
worin R und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und Amidinen der Formel (III) wie oben beschrieben umsetzt oder
[D] Aldehyde der Formel (IT) mit Verbindungen der Formel (IV) und Iminoethern der Formel
Figure imgf000037_0001
worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat und R1 für (d-C4)-Alkyl steht,
in Gegenwart von Ammoniumsalzen umsetzt.
Das bevorzugte Verfahren [A] kann durch folgendes Formelschema beispielhaft erläutert werden: [A]
Figure imgf000038_0001
NaOAc
Figure imgf000038_0002
Für die Verfahrensvarianten A, B, C und D kommen als Lösemittel alle inerten organischen Lösemittel in Frage. Hierzu gehören vorzugsweise Alkohole wie Ethanol, Methanol, Isopropanol, Ether wie Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan,
Glykolmonomethylether, Glykoldimethylether, Carbonsäuren wie Eisessig, oder Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Pyridin und
Hexamethylphosphorsäuretriamid.
Die Reaktionstemperaturen können innerhalb eines größeren Bereichs variiert werden. Im allgemeinen arbeitet man im Bereich von 20 bis 150°C, vorzugsweise jedoch bei der Siedetemperatur des jeweiligen Lösemittels.
Die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck, durchgeführt werden; im allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.
Die Umsetzung kann mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz durchgeführt werden; die Gegenwart von schwächeren Säuren, wie z.B. Essigsäure oder Ameisensäure, wird bevorzugt. Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aldehyde (II) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. T.D. Harris und G.P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 2 165 260 und 2 401 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929 c, E. Adler und H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849
(1961), E.P. Papadopoulos, M. Mardin und Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78, 2543 (1956)).
Die als Ausgangsstoffe verwendeten ß-Ketocarbonsäureester (TV) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [z.B. D. Borrmann,
„Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen" in „Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Yliden-ß-ketoester (V) können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. G. Jones, „The Knoevenagel Condensation" in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Enaminocarbonsäureester (VI) und die Iminoether (VII) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. S.A. Glickman and A.C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
Die Verbindungen ( E) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel
R5-CN (VIII)
worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat, wie üblich über die Iminoether und abschließend mit Ammoniumchlorid in Methanol umsetzt [vgl. hierzu W.K. Fife, Heterocycles 22, 93-96 (1984); T. Sakamoto, S. Kaneda, S. Nishimura, H. Yamanaka, Chem. Pharm. Bull. 33, 565, 571 (1986)] oder andere literaturbekannte Verfahren, wie z.B. Garigipati, Tetrahedron Lett. 1990, 1969- 1972, Boere et al, J. Organomet. Chem. 1987, 331, 161, oder Caton et al., J. Chem. Soc. 1967, 1204.
Alle Verfahrensschritte können bei Normaldruck und in einem Temperaturbereich von 0 bis 130°C, vorzugsweise von 20 bis 100°C, erfolgen.
Die Verbindungen (VIII) sind bekannt oder können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, indem man beispielsweise Pyridine der Formel
5
R -H (IX)
5 worin der Wasserstoff in ortho-Position zum Stickstoff steht und R die oben angegebene Bedeutung hat,
zunächst vorzugsweise bei 50 bis 150°C, insbesondere bei etwa 100°C, in H2O /Eis- essig zu den entsprechenden N-Oxiden umsetzt und anschließend mit Trimethyl- silylcyanid (TMSCN) nach literaturbekannten Verfahren, beispielsweise in den oben aufgeführten inerten Lösungsmitteln, vorzugsweise Acetonitril, THF, Toluol bei Raumtemperatur oder bei Rückflusstemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von Basen wie Triethylamin oder DBU, umsetzt oder indem man in Verbindungen der Formel
Figure imgf000040_0001
worin Y und Z die unter R angegebenen Substitutionsreste des Pyridylringes darstellen, mit Hilfe von Cyaniden, wie Kaliumcyanid oder Kupfercyanid, das Chlor gegen Cyanid austauscht,
oder für den Fall, dass R Difluorpyridyl bedeutet, Verbindungen der Formel
Figure imgf000041_0001
worin Y' und Z' unabhängig voneinander Chlor oder Brom bedeuten,
mit Alkali- bzw. Ammoniumfluoriden, vorzugsweise Kaliumfluorid, nach literaturbekannten Verfahren gegebenenfalls in polaren Lösemitteln, wie beispielsweise Polyglykolen, Polyglykolethem, DMSO oder Sulfolan, gegebenenfalls unter Zusatz von Phasentransfer-katalysatoren, im Sinne einer Halogen/Fluor-Austauschreaktion, umsetzt.
Das obige Verfahren wird bezüglich der 3,5-Difluorpyridylverbmdungen beispielhaft durch das folgende Reaktionsschema erläutert:
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
Die obigen Verbindungen I bzw. Ia und verschiedene Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus den DE-OS 198 17 264 (= WO 99/54 326)-und 198 17 265 (= WO 99/54 312) bekannt.
Weitere bevorzugte Dihydropyrimidine A entsprechen der Formel
Figure imgf000042_0003
bzw. deren isomerer Form
Figure imgf000042_0004
worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formeln
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy,
Carboxyl, Hydroxyl, Cι-C6-Alkoxy, d-Cβ- Alkoxycarbonyl und Ci-Cβ-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10
Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der
Formeln -S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10,
-SO2-CF3 und -A-CH2-Rπ substituiert sind, worin
R 16 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substituiertes Phenyl, Hydroxy, d-C6-Acyl oder d-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, d-C6- Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, Ci-Cö-Alkyl und d-Cö-Alkoxy, substituiert ist, bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14, worin
R12 Wasserstoff, d-C6-Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, ver- zweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Cj-C8-Koh- lenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(d-C4-Alkyl)-, -S- und -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen,
Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder d-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C6-Alkyl oder
Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R ,3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH3 oder Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes C1-C4-Alkylthio, Trifluormethyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge- sättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, d-C6- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, Cι-C6-Alkylthio oder d-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die
Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis
10 Kohlenstoffatomen oder Ci-Ce- Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-C6- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, Cι-C6- Alkyl oder d-C6-Alkoxy substituiert sind und oder d-Cβ-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, und deren Salze.
Bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I bzw. Ia, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, -SO2-CF3, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH2-C(CH3)3, -CO-NH(CH2)2OH, - CO-NH-CH2-C6H5, -CO-NH-C6H5, -CO-NH-(pOH)-C6H4, -O-CH2-C6H5 oder -S-pCl-dEL; substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14 bedeutet, worin
R12 Wasserstoff, C2-C4-Alkenyl oder d-C4-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin R15 und Rlδ unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl bedeuten,
R3 Wasserstoff oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH, oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder d-C4-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Reste der Formeln -
SO2CH3, -NH-CO-CH3,
-NH-CO-CF3, Fluor, Chlor, d-C3- Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist, worin
a Null oder 1,
17 1 X
R und R unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder Ci-
C4-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-C3- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei unabhängig voneinander Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder zwei- fach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, Cι-C3- Alkyl oder d-C3-Alkoxy substituiert sind und d-C -Alkyl gegebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist, Phenyl oder
17 1 X R und R gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen
Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
R4 Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Acetyl,
D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder Cτ.-C4-Alkyl bedeuten, und deren Salze.
Besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I und Ia, woπn
R1 Phenyl oder Thienyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Fluor, Chlor, Methyl, Trifluormethyl und Nitro, substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14, worin
R12 Wasserstoffoder d-GrAlkyl und
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl bedeuten,
R3 Wasserstoff oder Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder gegebe- nenfalls durch Fluor, Chlor, Hydroxy substituiertes d-C3-Alkyl bedeutet, das seinerseits bis zu 3-fach durch d-C3-Alkoxycarbonyl substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff oder Methyl,
D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Fluor, Chlor oder Cι-C3-Alkyl bedeuten, und deren Salze.
Ganz besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I und Ia, worin
R1 Phenyl oder Thienyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Fluor oder Chlor substituiert sind,
R >2 Methoxy, Ethoxy oder n-Propoxy, R Wasserstoff, Methyl oder Cyclopropyl,
R4 Wasserstoff,
D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Fluor oder Chlor bedeuten, und deren Salze.
Bevorzugte solche 2-heterocyclisch substituierte D ydropyrimidine umfassen beispielsweise die Verbindungen der folgenden Tabelle.
Tabelle C:
Die Rr Werte wurden in Cyclohexan/Essigsäureethylester (7:3 Volumenteile) bestimmt.
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen steht im Rahmen der Erfindung für Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, vorzugsweise Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Phenyl und Naphthyl.
Aralkyl steht im Rahmen der Erfindung für Aralkyl mit vorzugsweise 6 bis 10, insbe- sondere 6 Kohlenstoffatomen im Arylteil (vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl, insbesondere Phenyl) und vorzugsweise 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2 Kohlenstoffatomen im Alkylteil, wobei der Alkylteil linear oder verzweigt sein kann. Bevorzugte Aralkyl- reste sind Benzyl und Phenethyl.
Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für 5- bis 7-gliedrige Ringe mit vorzugsweise 1 bis 3, insbesondere 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff. Bevorzugte Beispiele umfassen Furyl, Thiophenyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, 1.2.3- und 1.2.4-Triazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, 1.2.3-, 1.3.4-, 1.2.4- und 1.2.5-Oxadiazolyl, Pyrrolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1.3.5-, 1.2.4- und 1.2.3-Triazinyl, 1.2.4-, 1.3.2-, 1.3.6- und
1.2.6-Oxazinyl. Acyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Acylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Acetyl und Propionyl.
Alkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
Alkenyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkenylrest mit 2 bis 6, vorzugsweise 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Ethenyl,
Propenyl, Isopropenyl, tert.Butenyl, n-Pentenyl und n-Hexenyl.
Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Alkylthio steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylthiorest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methylthio, Ethylthio und Propylthio.
Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert- Butoxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl und n-Hexoxycarbonyl.
Halogen steht im Rahmen der Erfindung für Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Die Verbindungen I bzw. Ia können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie
Bild und Spiegelbild (Enantiomere) oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild Diastereomere) verhalten, existieren. Die Verbindungen I bzw. Ia umfassen also sowohl die Enantiomeren als auch die Diastereomeren sowie deren jeweiligen Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.
Die Verbindungen I bzw. Ia können auch als Salze vorliegen. Im Rahmen der Er- findung sind physiologisch unbedenkliche Salze bevorzugt.
Physiologisch unbedenkliche Salze können Salze der Verbindungen I bzw. Ia mit anorganischen oder organischen Säuren sein. Bevorzugt werden Salze anorganischer Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder Salze organischer Carbon- oder Sulfonsäuren, wie beispielsweise Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Benzoesäure, oder Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Phenylsulfon- säure, Toluolsulfonsäure oder Naphthalindisulfonsäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammomumsalze der
Verbindungen I bzw. Ia sein. Besonders bevorzugt sind z.B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze sowie Ammoniumsalze, die von Ammoniak oder organischen Arninen, wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw. Triethylamin, Di- bzw. Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethy- lendiamin oder 2-Phenylethylamin, abgeleitet sind.
Die Verbindungen (I) bzw. (Ia) können hergestellt werden, indem man
[A] Aldehyde der Formel
R^CHO (II)
worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Amidinen oder deren Hydrochloriden der Formel
Figure imgf000055_0001
worin R5 und D die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und Verbindungen der Formel
R3-CO-CH2-CO-R2 (IV)
worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel, umsetzt oder
[B] Verbindungen der Formel
Figure imgf000055_0002
worin R1 bis R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit Amidinen der Formel
Figure imgf000055_0003
worin R • 5 und D die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel, umsetzt oder
[C] Aldehyde der Formel
R^CHO (II)
worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Verbindungen der Formel
R— C=C — CO-R2
H (VI)
NH
worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und Amidinen der Formel (III) wie oben beschrieben umsetzt.
Die Herstellungsverfahren können durch folgende Formelschemata beispielhaft erläutert werden:
[A]
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000057_0002
[B]
Figure imgf000057_0003
Figure imgf000057_0004
[C]
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000058_0002
Für alle Verfahrensvarianten A, B und C kommen als Lösemittel alle inerten organischen Lösemittel in Frage. Hierzu gehören vorzugsweise Alkohole wie Ethanol, Methanol, Isopropanol, Ether wie Dioxan, Diethylether, Tetrahydrofuran, Glykol- monomethylether, Glykoldimethylether, Carbonsäuren wie Eisessig, oder Dimethyl- formarnid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Pyridin und Hexamethylphosphorsäuretri- amid.
Die Reaktionstemperaturen können innerhalb eines größeren Bereichs variiert werden; im allgemeinen arbeitet man in einem Bereich von 20 bis 150°C, vorzugsweise jedoch bei der Siedetemperatur des jeweiligen Lösemittels.
Die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck durchgeführt werden; im allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.
Die Umsetzung kann mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz, vorzugsweise in Gegenwart von schwächeren Säuren, wie z.B. Essigsäure oder Ameisensäure, durchgeführt werden. Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aldehyde (II) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden herstellt werden [vgl. T.D. Harris und G.P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 2 165 260 und 2 401 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929 c, E. Adler und H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), E.P. Papadopoulos, M. Mardin und Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78,
2543 (1956)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Amidine (III) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. „Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. 11/2, Seite 38 ff (1958); R.L. Shoiner und F.W.
Neumann, Chem. Review 35, 351 (1944)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten ß-Ketocarbonsäureester (IV) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [z.B. D. Borrmann, „Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen", in „Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Yliden-ß-ketoester (V) können nach literaturbe- kannten Methoden hergestellt werden [vgl. G. Jones, „The Knoevenagel Conden- sation" in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Enammocarbonsäureester (VI) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. A.C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
Die Verbindungen I bzw. Ia, welche in 2-Stellung einen gegebenenfalls substituierten Oxazolyl- oder Thiazolylrest enthalten, und verschiedene Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der DE-OS 198 17262 (= WO 99/54 329) bekannt.
Die Dihydropyrimidine A wirken als HBV-core-Protem-Inhibitoren. Weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb Kombinationen
A) mindestens eines HBV-core-Protein-Inbibitors,
B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels, vorzugsweise mindestens eines HBV-Polymerase-Inhibitors, und gegebenenfalls C) mindestens eines Immunmodulators.
HBV-core-Protein-Inhibitoren im Sinne der Erfindung sind solche nicht-nukleosi- dischen Hemmstoffe, die in der Zelle (i) die Halbwertszeit des HBV-core-Proteins mindestens halbieren bzw. (ii) den nachfolgend beschriebenen Bindungstest bestehen.
(i) Pulse-Chase-Markierung von HepG2.2.15-Zellen und anschließender Nachweis des HBV-core-Proteins durch Immunpräzipitation:
Allgemeine Beschreibung
Durch Pulse-Chase-Markierung von HepG2.2.15-Zellen und anschließende Immunpräzipitation des HBV-core-Proteins wird die Syntheserate und die Stabilität des HBV-core-Proteins messbar. Als Maß der Stabilität wird die Halbwertzeit des core-Proteins herangezogen. Die Halbwertzeit des core-Proteins ist durch die Zeit definiert, innerhalb der die core-Proteinmenge auf die Hälfte der zum Anfangszeitpunkt to=0 vorliegenden Menge reduziert worden ist.
Die Proteinmenge korreliert mit der eingebauten Radioaktivität und folglich der
Schwärzung eines Röntgenfilms bzw. der Strahlungsintensität, die durch einen Phos- phorimager sichtbar gemacht werden kann.
Mit Hilfe dieser Technik kann der Einfluss potentieller Inhibitoren auf die Halbwert- zeit des viralen HBV-core-Proteins untersucht werden. Eine Substanz ist demnach dann ein HBV-core-Protein-Inhibitor, wenn die Halbwertzeit des HBV-core-Proteins mindestens halbiert wird; vgl. nachfolgende Testbeschreibung.
Versuchsdurchführung
Einsaat der Zellen:
An Tag 1 werden die HepG2.2.15-Zellen in Zellkulturflaschen (75 cm2; Costar) in einer Dichte von 6xl06 Zellen pro Flasche in HepG2-Zellkulturmedium (Fa. Biochrom KG, Berlin) eingesetzt. 100 Liter dieses Mediums bestehen aus 74,8 Litern ®seromed RPMI 1640-Medium und 14,4 Litern ©seromed Medium 199 mit Earle's
Salzen (beide Medien von der Fa. Biochrom KG, Berlin; die Zusammensetzungen werden vor den Beispielen beschrieben); weiterhin werden 200 g NaHCO3, 5 000 000 Einheiten Penicillin-G-Natrium, 5 g Streptomycin, 25 mg Amphotericin B, 30 g Aminoglykosid- Antibiotikum G418 (Fa. Sigma, München), wässrige Natriumpyru- vat-Lösung (bis zu einer Natriumpyruvat-Konzentration der Gesamtlösung von 2 mM), wässrige Glutamin-Lösung (bis zu einer Glutamin-Konzentration der Gesamtlösung von 2 mM), wässriges FCS (FCS = fötales Kälberserum; bis zu einer FCS- Konzentration der Gesamtlösung von 2 % (v/v)) zugesetzt. Die Testsubstanz wird als 50 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO; Fa. Sigma, München) zubereitet. Sie wird in HepG2-Zellkulturmedium verdünnt und auf die 100-fache ICsoKon- zentration eingestellt. 1 ml dieser Testsubstanzlösung wird zu 19 ml HepG2-Zell- kulturmedium gegeben. Die Testsubstanz wird mit der Einsaat in abgestuften Verdünnungsschritten hinzugegeben. Die Zellen werden bei 37°C und 5 % CO2 (v/v) im Brutschrank inkubiert.
Markierung der Proteine:
An Tag 3 wird das Kulturmedium verworfen und durch 20 ml eines Mediums ersetzt, dem die Aminosäuren Methionin und Cystin entzogen sind ("Hungermedium"). Das Hungermedium (500 ml) enthält MEM (= minimum essential medium mit Earle's Salzen; Gibco 51091-015 - die Zusammensetzung wird vor den Beispielen beschrieben), 5 ml wässrige L-Glutamin-Lösung (200 mM), 5 ml L-wässrige Leucin-Lösung (5.2 g/1), 5 ml wässrige Glucose-Lösung (100 g/1), 5 ml wässrige i-Inosit-Lösung (0.2 g/1), 5 ml wässrige L-Arginin-Lösung (12.46 g/1) und wässriges FCS (bis zu einer FCS-Konzentration der Gesamtlösung von 2 % v/v). Die Inkubation mit Hungermedium wird in Gegenwart der Testsubstanz (Konzentration wie oben) vorgenommen. Die Zellen werden für 45 Minuten bei 37°C und 5 % CO2 (v/v) im Brutschrank inkubiert. Anschließend werden 16 ml Hungermedium abgenommen und das verbleibende Medium mit 25 μl 35S-Redivue Promix (2,5 mCi/175 μl) (Amersham, AGQ 0080) versetzt. Die Zellen werden für weitere 10 Minuten bei 37°C und 5 % CO2 (v/v) im Brutschrank inkubiert ("Pulse"). Im Anschluss wird die Markierungslösüng entfernt und durch Hungermedium plus wässrige L-Cystin-Lösung (bis zu einer Cystin-Kon- zentration der Gesamtlösung von 1 mM) und wässrige L-Methionin-Lösung (bis zu einer Methionin-Konzentration der Gesamtlösung von 1 mM) ("Labelstopmedium") ersetzt. Damit wird die Markierung abgestoppt. Die Inkubation mit Labelstopmedium wird ebenfalls in Gegenwart der Testsubstanz (Konzentration wie oben) vorge- nommen. Das Gesamtvolumen liegt bei 20 ml pro Flasche. Die Kulturen werden bei
37°C und 5 % CO2 (v/v) im Brutschrank inkubiert ("chase "). 5 Minuten nach Zugabe des Labelstopmediums wird der Zeitwert to=0 ("O-Stunden-Wert") genommen. Weitere Versuchszeiten sind variabel im Bereich bis zu 96 Stunden. An jedem weiteren Zeitwert im Verlauf des "chase" wird ein Probensatz (behandelt/ unbehan- delt) entnommen, um den core-Protein-Gehalt zu diesem Zeitpunkt zu ermitteln.
Dazu wird das Medium abgenommen und die Zellen werden einmal mit PBS (phosphatgepufferte Saline ohne Ca/Mg**) (Biochrom Nr. L1825) gewaschen. Anschließend wird der Zellrasen mit 1 ml Lysispuffer {10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1 % (v/v) des nichtionischen Detergens ©Triton X-100 [Marke der Fa. Rohm & Haas, 4- (1.1.3.3-Tetramethylbutyl)-ρhenol-polyethoxyethanol]; 140 mM NaCl} lysiert. (Der
Begriff „Tris" steht für 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1.3-propandiol). Das Lysat wird in 2 ml-Eppendorfröhrchen überführt und zentrifugiert (2 Minuten; 4000 Upm). Der Überstand wird in ein neues Eppendorfröhrchen überführt, und das Sediment (= Zellkerne) wird verworfen. Das Lysat wird bei +4°C gelagert.
Fällung des HBV-core-Proteins durch spezifische Immunpräzipitation Zu dem Lysat werden 10 μl Kanichen-Normalserum (Sigma 7523) und 200 μl Sepharosekügelchen, die in PBS suspendiert sind (Protein- A-Sepharose C1-4B; Pharmacia, 17-0780-01), hinzugegeben (Alternativ kann der Komplex aus Kügelchen und Antikörper vorgeformt werden). Es folgt eine Inkubation für 2 Stunden bei 4°C auf dem Drehrad. Die Immunpräzipitate werden durch Zentrifugation abgetrennt (2 Minuten; 1000 Upm) und bei 4°C gelagert. Der Überstand wird in ein neues Eppen- dorfröhrchen überführt.
Anschließend werden 5 μl anti-humanes HBV-core-Kaninchen-Antiserum und 200 μl Sepharosekügelchen, die in PBS suspendiert sind (Protein-A-Sepharose C1-4B; Pharmacia, 17-0780-01) hinzugegeben (Alternativ kann der Komplex aus Kügelchen und Antikörper vorgeformt werden). Es folgt eine Inkubation (2 Stunden bei 4°C) auf dem Drehrad. Die Immunpräzipitate werden durch Zentrifugation abgetrennt (2 Minuten; 1000 Upm) und bei 4°C gelagert. Der Überstand wird in ein neues Eppen- dorfröhrchen überführt und bei 4°C aufgehoben.
Die Kügelchen werden dreimal mit NET-Puffer [50 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,5 % (v/v) des nichtionischen Detergens ©Nonident NP-40 (Fa. Boehringer Mannheim); 150 mM NaCl; 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)] gewaschen, d.h. abwechselnd suspendiert und abzentrifugiert ( 2 Minuten bei 1000 Upm). Die gewaschenen Immunpräzipitate werden bei 4°C gelagert.
SDS-Page und Visualierung der radioaktiv markierten HBV-core-Proteine (SDS = Dodecylsulfat-Natrium)
Die gewaschenen Immunpräzipitate werden durch 12 Gew.-% SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Dazu wird jede Probe mit 50 μl zweifach konzentriertem SDS-Probenpuffer (BioRad) versetzt, einmal gevortext (geschüttelt), 5 Minuten bei 95°C gekocht, auf Eis abgeschreckt und kurz zentrifu- giert. In jede Geltasche werden 20 μl des Überstandes aufgetragen. Das Gel läuft 1,5 Stunden bei 120 Volt (= 15 Volt/cm).
Das Gel wird dreimal 5 Minuten in Fixierlösung (70 Vol.-% Ethanol; 10 Vol.-% Essigsäure; 20 Vol.-% Wasser) immersiert. Anschließend wird das Gel für 20 Minuten in Enhancer (Enlightning Rapid Autoradiography Enhancer NEN Research Products Nr. NEF-974) gebadet. Das Gel wird auf Filterpapier gelegt (BioRad Nr.165-0921) und mit Cellophan (BioRad Nr.165-0922) abgedeckt. Diese Anordnung wird 50 Minuten mit dem BioRad Geltrockner getrocknet.
Das getrocknete Gel wird auf einen Röntgenfilm (Hyperfilm MP; Amersham RPN 2115H) gelegt und nach angemessener Expositionsdauer entwickelt. Alternativ kann das getrocknete Gel auf einem Phosphorimager (Fujix BAS 100) analysiert werden. Die Auswertung vergleicht die Halbwertzeiten des HBV-core-Proteins in An- und Abwesenheit der Testsubstanz.
(ii) Gelchromatographischer Nachweis der Bindung einer markierten Testsubstanz an HBV-core-Protein
Allgemeine Beschreibung
Das chromatographische Verhalten eines Proteins oder eines seiner natürlich auftretenden Aggregationsformen (Dimere, Multimere) während der Gelpermeationschro- matographie hängt von der Wahl des verwendeten Gelmaterials ab. Beispielsweise kann das Gelmaterial, das in Entsalzungssäulchen verwendet wird (z.B. Sephadex G- 25; Pharmacia), eine Ausschlussgrenze haben, die für globuläre Proteine bei einem
Molekulargewicht von 5000 Dalton liegt; d.h. alle Proteine mit einem Molekulargewicht größer als 5000 Da werden im Ausschlussvolumen eluiert. Andererseits dringt ein globuläres Protein, das ein Molekulargewicht unter 5000 Da aufweist, in das Trennmaterial ein und wird auf der Säule zurückgehalten. Sieht man von Effekten, die nicht durch die Molekülgröße bestimmt werden (z.B. Adsorption), einmal ab, gilt in der Regel: Je geringer das Molekulargewicht eines Moleküls, desto länger dauert der Weg durch das Gelbett und desto später wird das Molekül eluiert. Diese prinzipielle Versuchsanordnung kann für einen Bindungstest genutzt werden. Der Bindungstest dient der Untersuchung, ob eine Testsubstanz an ein Protein von Interesse bindet. Dazu wird die Testsubstanz, die hinreichend unter der Ausschlussgrenze liegen muss, markiert (z.B. durch Austausch eines Wasserstoffatoms gegen Tritium) und mit dem Protein (z.B dem HBV-core-Protein oder seiner Aggregationsform = "Kapsid"), das hinreichend über der Ausschlussgrenze liegen muss, inkubiert. Das Material wird auf die Säule aufgetragen und mit einem Elutionspuffer (z.B. 10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) eluiert. Durch die Bindung an das Protein wird die markierte Testsubstanz wie das freie Protein im Ausschlussvolumen eluiert. Eine nicht bindende Testsubstanz oder der Testsubstanz-Überschuss wird dagegen im späten Elutionsvolumen eluiert. Zum Nachweis des Elutionsverhaltens werden einzelne Fraktionen aufgefangen und die Radioaktivität im Szintillationszähler (oder durch ein anderes geeignetes Detektionsverfahren) bestimmt.
In der Regel wird dieses Verfahren als Variante des Bindungstest so durchgeführt werden, dass man beispielsweise eine markierte Substanz, die an das HBV-core- Protein bindet („markierte Substanz"), dazu benutzt, weitere core-Protein-Binder aufzufinden: Die markierte Substanz wird durch eine Testsubstanz („verdrängende Substanz") direkt verdrängt (Wettbewerb um die gleiche Bindungsstelle) oder die
Testsubstanz modifiziert das Protein (bzw. eines seiner Aggregatformen) derart, dass die markierte Substanz nicht länger binden kann (Modifikation der Bindungsstelle).
Versuchsdurchführung Bereitstellung der Säule:
Die Sephadex-G-25-Säule (Höhe der Säule: 5 cm, Durchmesser der Säule: 1,5 cm) wird nach Standardverfahren (Herstelleranweisungen) gegossen oder fertig von einem Hersteller (z.B. PDIO-Entsalzungssäulchen von Phamacia) bezogen. Die Säule wird im gewünschten Puffer (10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) äquilibriert. Eine Probe (32 μl), bestehend aus 2 μl (= 64 pmol) markierter Substanzlösung
(spezifische Aktivität einer z.B. tritiierten Verbindung liegt typischerweise im mCi/ml-Bereich), gemischt mit HBV-core-Protein (10 μg = 2,7 pmol), das in Form des Kapsids vorliegt, und mit verdrängender Substanz (100 x molarer Überschuss, bezogen auf markierte Substanz) wird auf die Säule appliziert. Der Äquilibrierungs- puffer wird zur Elution verwendet. Es werden Fraktionen von 1 ml aufgefangen. Die gesamte Fraktion oder ein Aliquot davon wird mit Szintillatorflüssigkeit (Ultima
Gold, Packard) gemischt und mit einem Szintillationszähler ausgemessen. Im Fall einer Verdrängung von markierter Substanz durch die Testsubstanz wird in den Fraktionen, die das Ausschlussvolumen beinhalten, eine geringere Aktivität als in Fraktionen gemessen, in denen keine Testsubstanz vorlag (Nullwert). Ein HBV-core- Protein-Inhibitor liegt dann vor, wenn maximal 50 % der Aktivität des Nullwerts vorliegen.
Der oben beschriebene Halbwertzeittest (i) ergibt in der Regel die genaueren Werte; er ist jedoch zeitaufwendig. Sollen viele Substanzen getestet werden, so wird man wegen der höheren Testgeschwindigkeit den Bindungstest (ii) wählen; er ist auch zu einem Screening geeignet, woran sich dann ein Halbwertzeittest (i) für ausgewählte Verbindungen anschließen kann. HBV-core-Protein-Inhibitoren im Sinne der Erfindung sind solche, die mindestens den weiter oben beschriebenen Halbwertszeit-Test (i) bestehen.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia), B) HBV-Polymerase-Inhibitoren und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren.
Als HBV-Polymerase-Inhibitoren B im Sinne der Erfindung werden solche Stoffe bezeichnet, die im nachfolgend beschriebenen endogenen Polymerase- Assay, das von Ph. A. Furman et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 36 (No. 12), 2688 (1992) publiziert worden ist, zu einer Hemmung der Bildung eines HBV-DNA- Doppelstranges derart führen, dass sich maximal 50 % der Aktivität des Nullwerts ergeben: HBV-Virionen aus Kulturüberständen bauen in vitro Nucleosid-5'-triphosphate in den Plusstrang der HBV-DNA ein. Unter Verwendung von Agarosegel-Elektropho- rese wird der Einbau von [α-32P]-Deoxynucleosid-5'-triphosphat in das virale 3.2-kb DNA-Produkt in An- und Abwesenheit einer Substanz mit potentiell HBV-Polyme- rase-hemmenden Eigenschaften beobachtet. HBV-Virionen werden aus dem Zell- kultur-Überstand von HepG2.2.15-Zellen durch Fällung mit Polyethylenglykol gewonnen und aufkonzentriert. 1 Volumenteil geklärter Zellkulturüberstand wird mit lΛ Volumenteil einer wässrigen Lösung enthaltend 50 Gew-% Polyethylenglykol 8000 und 0.6 M Kochsalz gemischt. Die Virionen werden durch Zentrifiigieren bei 2,500 x g/15 Minuten sedimentiert. Die Sedimente werden in 2 ml Puffer enthaltend
0.05 M Tris-HCl (PH 7.5) resuspendiert und gegen den gleichen Puffer enthaltend 100 mM Kaliumchlorid dialysiert. Die Proben können bei -80°C eingefroren werden. Jeder Reaktionsansatz (100 μl) enthält mindestens 105 HBV-Virionen; 50 mM Tris- HCl (pH 7.5); 300mM Kaliumchlorid; 50mM Magnesiumchlorid; 0.1 % ®Nonident P-40 (nichtionisches Detergens der Fa. Boehringer Mannheim); je 10 μM dATP, dGTP und dTTP; 10 μCi [32P]dCTP (3000 Ci/mmol; Endkonzentration 33 nM) und 1 μM des potentiellen Polymerase-Inhibitors in seiner triphosphorylierten Form. Die Proben werden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert, und dann wird die Reaktion durch Zugabe von 50 mM EDTA gestoppt. Eine 10%-ige Gewichtsvolumen-SDS- Lösung (enthaltend 10 g SDS pro 90 ml Wasser) wird bis zu einer Endkonzentration von 1 Vol.-% (bezogen auf Gesamtvolumen) zugegeben, und Proteinase K wird bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde werden Proben mit demselben Volumen Phenol/Chloroform/Isoamyl- alkohol (Volumen- Verhältnis 25:24:1) extrahiert, und aus der wässrigen Phase wird die DNA mit Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 10 μl Gelpuffer (Lösung von
10.8 g Tris, 5.5 g Borsäure und 0.75 g EDTA in 1 Liter Wasser (= TBE-Puffer)) resuspendiert und durch Elektrophorese in einem Agarosegel getrennt. Das Gel wird entweder getrocknet oder die darin enthaltenen Nukleinsäuren mittels Southern- Transfertechnik auf eine Membran übertragen. Danach wird die Menge des gebilde- ten und markierten DNA-Doppelstranges im Verhältnis zur Negativkontrolle (=
Endo-Pol-Reaktion ohne Substanz oder mit Kontrollsubstanz ohne Wirkung) bestimmt. Ein HBV-Polymerase-Inhibitor liegt dann vor, wenn maximal 50 % der Aktivität der Negativkontrolle vorliegen.
Bevorzugte HBV-Polymerase-Inhibitoren B) umfassen beispielsweise
3TC = Lamivudin =
= 4-Amino-l-[(2R-cis)-2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin-2(lH)-on, vgl. EP-PS 382 526 (= US-PS 5 047 407) und WO 91/11186 (= US-PS 5 204 466);
Adefovir Dipivoxil =
9- {2-[[Bis[(Pivaloyloxy)-methoxy]-phosphinyl]-methoxy]-ethyl} -adenin, vgl. EP-PS 481 214 (= US-PS 5 663 159 und 5 792 756), US-PS 4 724 233 und 4 808 716;
BMS 200 475 = [lS-(l.α,3.α,4.ß)]-2-Amino-1.9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methy- len-cyclopentyl]-6H-purin-6-on, vgl. EP-PS 481 754 (= US-PS 5 206 244 und 5 340 816), WO 98/09964 und 99/41275;
Abacavir = (-)-(l S-cis)-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten- 1 - methanol, vgl. EP-PS 349 242 (= US-PS 5 049 671) und EP-PS 434 450 (= US-PS 5 034 394);
FTC = (2R-cis)-4-Amino-5-fluor-l-[2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin-
2(lH)-on, vgl. WO 92/14743 (= US-PS 5 204 466, 5 210 085, 5 539 116, 5 700 937, 5 728 575, 5 814 639, 5 827 727, 5 852 027, 5 892 025, 5 914 331, 5 914 400) und WO 92/18517;
ß-L-FDDC = 5-(6-Amino-2-fluor-9H-purin-9-yl)-tefrahyα^o-2-furanmethanol, vgl. WO 94/27616 (= US-PS 5 627 160, 5 561 120,5 631 239 und 5 830 881);
L-FMAU = 1 -(2-Deoxy-2-fluor-ß-L-arabinofuranosyl)-5-methyl-pyrimidin-2.4(lH, 3H)-dion, vgl. WO 99/05157, WO 99/05158 und US-PS 5 753 789.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia) und B) Lamivudin.
Andere bevorzugte HBV-antivirale Mittel B umfassen z.B. Phenylpropenamide der
Formel
Figure imgf000069_0001
worin
R1 und R2 unabhängig voneinander d-C -Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R3-R12 unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Cι-C4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Cι-C4-Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,
R13 Wasserstoff, Cι-C4-Alkyl, Cι-C7-Acyl oder Aralkyl und X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes d-C4-Alkyl bedeuten, und deren Salze.
Diese Phenylpropenamide und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der WO 98/33501 bekannt, auf die hiermit zum Zwecke der Offenbarung Bezug genommen wird. AT-61 ist die Verbindung der obigen Formel, worin X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten. Eigene Untersuchungen haben gezeigt, dass AT-61 kein HBV-core-Protein-Inbibitor im Sinne dieser Erfindung ist (Test s. oben).
Bevorzugte Immunmodulatoren C) umfassen beispielsweise sämtliche Interferone wie α-, ß- und γ-Interferone, insbesondere auch α-2a- und α-2b-Interferone, Interleu- kine wie Interleukin-2, Polypeptide wie Thymosin-α-1 und Thymoctonan, Imidazo- chinolinderivate wie ©Levamisole, Immunglobuline und therapeutische Vaccine.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia), B) Lamivudin und gegebenbenfalls C) Interferon.
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nichttoxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfindungsgemäße Kombinationen enthalten oder die aus einer erfindungsgemäßen Kombination bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.
Das Mengenverhältnis der Komponenten A, B und gegebenenfalls C der erfindungsgemäßen Kombinationen kann innerhalb weiter Grenzen schwanken; vorzugsweise beträgt es 5 bis 500 mg A / 10 bis 1000 mg B, insbesondere 10 bis 200 mg A / 20 bis 400 mg B. Die gegebenenfalls mitzuverwendende Komponente C kann in Mengen von vorzugs- weise 1 bis 10 Millionen, insbesondere 2 bis 7 Millionen I.E. (internationale Einheiten), etwa dreimal wöchentlich über einen Zeitraum bis zu einem Jahr angewandt werden. Die erfindungsgemäßen Kombinationen sollen in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise etwa 0,5 bis 95, Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungsgemäßen Kombinationen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen kann in üblicher Weise nach bekannten Methoden erfolgen, z.B. durch Mischen des Wirkstoffs oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.
Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Kombinationen in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 1 bis 100 mgkg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den Wirkstoff oder die Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 1 bis 30 mg/kg Körpergewicht. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen äb- zuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Objekts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt.
Die erfindungsgemäßen Kombinationen sind antiviral gegen Hepatitis-B-Viren
(HBV) wirksam, indem sie eine außerordentlich starke Reduktion von intra- und/oder extrazellulärer HBV-DNA verursachen. Die erfindungsgemäßen Kombinationen sind somit zur Behandlung von virusinduzierten Erkrankungen, insbesondere von akut und chronisch persistenten Virusinfektionen des HBV geeignet. Eine chronische Viruserkrankung, hervorgerufen durch das HBV, kann zu unterschiedlich schweren Krankheitsbildern führen; bekanntermaßen führt die chronische Hepatitis-B-Virusin- fektion in vielen Fällen zur Leberzirrhose und/oder zum hepatozellulären Karzinom.
Die Indikationsgebiete für die erfindungsgemäßen Kombinationen umfassen:
1. die Behandlung von akuten und. chronischen Virusinfektionen, die zu einer infektiösen Hepatitis führen können, vorzugsweise die Behandlung von akuten und chronischen Hepatits-B -Virus-Infektionen;
2. die Behandlung von akuten und chronischen HBV-Infektionen bei Koinfektion mit dem Hepatitis-Delta- Virus;
3. die Behandlung von akuten und chronischen HBV-Infektionen bei Koinfektion mit anderen Viren, wie z. B. HIV oder HCV, und
4. die prophylaktische/therapeutische Behandlung bei Transplantationen, wie z.B. Lebertransplantationen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die oben definierten Kombinationen zur Bekämpfung von Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der oben definierten Kombinationen und gegebenenfalls weitere pharmazeutische
Wirkstoffe.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben definierten Kombinationen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe der oben beschriebenen Erkrankungen, vorzugsweise von Viruserkrankungen, insbesondere von Hepatitis B.
Zusammensetzung (mg/1) des aus ©seromed RPMI 1640 hergestellten lx-Mediums: NaCl 6000
KC1 400
Na2HPO4 7 H2O 1512
MgSO4 x 7 H2O 100
Ca(NO3)2 x 4 H2O 100
D-Glucose 2000
Phenolrot 5
NaHCO3 2000
Phenolrot 5
NaHCO3 2000
L-Arginin 200
L-Asparagin 50
L-Asparaginsäure 20
L-Cystin 50
L-Glutamin 300
L-Glutaminsäure 20
Glycin 10
L-Histidin 15
L-Hydroxyprolin 20
L-Isoleucin 50
L-Leucin 50
L-Lysin x HC1 40
L-Methionin 15
L-Phenylalanin 15
L-Prolin 20
L-Serin 30
L-Threonin 20
L-Tryptophan 5
L-Tyrosin 20
L-Valin 20 Glutathion 1
Biotin 0,2
Vitamin B1 0,005
D-Ca-Pantothenat 0,25
Cholinchlorid 3
Folsäure 1 i-Inosit 35
Nicotinamid 1 p-Aminobenzoesäure 1
Pyridoxin x HC1 1
Riboflavin 0,2
Thiamin x HC1 1
Zusammensetzung (mg/1) des aus ©seromed Medium 199 mit Earle's Salzen hergestellten lx-Mediums:
NaCl 6800
KC1 400
NaH2PO4 x H2O 140
MgSO4 x 7 H2O 200
CaCl2 200
D-Glucose 1000
Phenolrot 17
NaHCO3 2200
DL-Alanin 50
L-Argininx HCl 70
DL-Asparaginsäure 60
L-Cysteinx HCl 0,1 L-Cystin 20
L-Glutamin 100
DL-Glutaminsäure x H2O 150
Glycin
L-Histidin x HCl 50
L-Hydroxyprolin 20
DL-Isoleucin 10
DL-Leucin 40
L-Lysin x HC1 120
DL-Methionin 70
DL-Phenylalanin 30
L-Prolin 50
DL-Serin 40
DL-Threonin 50
DL-Tryptophan 60
L-Tyrosin 20
DL-Valin 40
Glutathion 50
Natriumacetat 0,05
Fe(NO3)3 50
©Tween 80* 0,1
20
Adeninsulfat 10
Guanin x HC1 0,3
Hypoxanthin 0,3
Thymin 0,3
Uracil 0,3
Xanthin 0,3
ATP,Na2 1
AMP 0,2 Ascorbinsäure 0,05
Biotin 0,01
Calciferol 0,1
D-Ca-Pantothenat 0,01
Cholinchlorid 0,5
Folsäure 0,01 i-Inosit 0,05
Menadion 0,01
Nicotinsäure 0,025
Nicotinsäureamid 0,025 p-Aminobenzoesäure 0,05
Pyridoxal x HCl 0,025
Pyridoxin x HCI 0,025
Riboflavin 0,01
Thiamin x HCI 0,01
DL-α-Tocopherolphosphat-Na2 0,01
Vitamin A 0,1
Cholesterin 0,2
2-Desoxy-D-Ribose 0,5
D-Ribose 0,5 * Marke der Atlas Chemie
Mediumzusammensetzung (mg 1) der aus Gibco 51091-015 hergestellten MEM-lx- Lösung:
CaCl2 x 2 H2O 264
KC1 400 MgSO4 x 7 H2O 200
NaCl 6800
NaHCO3 2200
NaH2PO4x2H2O 158
Phenolrot 10
L-HistidinxHClxH2O 41,92
L-Isoleucin 52,46
L-LysinxHCl 73,06
L-Phenylalanin 33,02
L-Threonin 47,64
L-Tryptophan 10,20
L-Tyrosin 36,22
L-Valin 46,86
D-Ca-Pantothenat 1,00
Cholinchlorid 1,00
Folsäure 1,00
Nicotinamid 1,00
Pyridoxal x HC1 1,00
Riboflavin 0,10
Thiamin x HC1 1,00
Beispiele;
HBV in Zellkultur
Die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Kombinationen wurde in Anlehnung an die von M. A. Seils et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 84, 1005 - 1009 (1987) und B. E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55 - 70 (1992) beschriebenen Methoden untersucht.
Die Tests der kombinatorischen Prüfung der Prüfsubstanzen wurde mittels Schachbrett-Titration durchgeführt.
Die antiviralen Tests wurden in 96 well Mikrotiterplatten durchgeführt. Die erste vertikale Reihe der Platte erhielt nur HepG2.2.15-Zellen in Wachstumsmedium. Sie diente als ViruskonüOlle.
Stammlösungen der Testverbindungen (50 mM) wurden zunächst in DMSO gelöst; weitere Verdünnungen wurden in Wachstumsmedium hergestellt. Die übrigen Näpfe enthielten die erfindungsgemäßen Kombinationen oder deren Einzelkomponenten in den Testkonzentrationen von z.B. 5 μM bis 0,01 μM, ausgehend von A2 bis Hl 1 der
96-well Mikrotiterplatte.
Stammlösungen der zu testenden Substanzen wurden auf separaten 96-well Platten vorbereitet und anschließend auf die Testplatte mit HepG2.2.15-Zellen zusammen- pipettiert. Damit waren Testkonzentrationen im Bereich von ca. 10 - 50 fach ober- und unterhalb der IC-50 Konzentrationen abgedeckt.
Der Testansatz wurde 8 Tage bei 37° Celsius und 5 % CO2 (v/v) inkubiert. Am Tag 4 wurde das Medium durch frisches inhibitorhaltiges Medium ersetzt. Zytotoxizitätsbestimmung
Vor der Ernte der Überstände/Zell-Lysate zur Bestimmung des antiviralen Effektes wurden die HepG2.2.15-Zellen lichtmikroskopisch oder mittels biochemischer Nachweisverfahren (z.B. Alamar-Blue-Färbung oder Trypanblau-Färbung) auf zyto- toxische Veränderungen untersucht.
Substanzinduzierte zytotoxische oder zytostatische Veränderungen der HepG2.2.15- Zellen wurden z.B. lichtmikroskopisch als Änderungen der Zellmorphologie ermit- telt. Derartige Substanz-induzierte Veränderungen der HepG2.2.15-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen wurden z.B. als Zellyse, Vakuolisierung oder veränderte Zellmorphologie sichtbar. 50 % Zytotoxizität („Tox.-50") bedeuten, dass 50 % der Zellen eine der entsprechenden Zellkontrolle vergleichbare Morphologie aufweisen.
Die Verträglichkeit einiger erfindungsgemäßer Kombinationen wurde zusätzlich auf anderen Wirtszellen, wie z.B. HeLa-Zellen, primären peripheren Blutzellen des Menschen oder transformierten Zellinien wie H-9 Zellen, ausgetestet.
Es konnten keine Zell-zytotoxischen Veränderungen im Test-Konzentrationsbereich festgestellt werden.
Bestimmung der antiviralen Wirkung
Anschließend wurden die Überstände/Zell-Lysate geerntet und mittels vermindertem
Druck auf mit Nylonmembran bespannte 96-Napf-Dot-Blot-Kammern (entsprechend den Herstellerangaben) gesogen.
In Kürze: Nach Transfer der Überstände oder Gesamtzell-Lysate auf die Nylon- Membran der Blot-Apparatur (s.o.) wurden die darin enthaltenen Nukleinsäuren denaturiert (1.5 M NaCl/ 0.5 N NaOH), neutralisiert (3 M NaCl 0.5 M Tris Hcl, pH 7.5) und gewaschen (2 x SSC). Anschließend wurde die DNA durch Inkubation der Filter bei 120°C, 2 - 4 Stunden, an die Membran gebacken.
Hybridisierung der DNA
Der Nachweis der viralen DNA von den behandelten HepG2.2.15-Zellen auf den Nylonfiltern wurde in der Regel mit nichtradioaktiven, Digoxigenin-markierten Hepatitis-B-spezifischen DNA-Sonden durchgeführt, die jeweils nach Herstellerangabe mit Digoxigenin markiert, gereinigt und zur Hybidisierung eingesetzt wurden.
Kurz: Die Prähybidisierung und Hybidisierung erfolgten in 5 x SSC, 1 x Blockierungsreagenz, 0.1 % N-Lauroylsarcosin, 0.02 % SDS und 100 μg Sperma-DNA des Herings. Die Prähybridisierung erfolgte 30 Minuten bei 60°C, die spezifische Hybridisierung mit 20 - 40 ng/ml der digoxigenierten, denaturierten HBV-spezifischen DNA (14 Stunden, 60° C). Anschließend wurden die Filter gewaschen.
Nachweis der HBV-DNA durch Digoxigenin- Antikörper
Der immunologische Nachweis der Digoxigenin-markierten DNA erfolgte nach Her- stellerangaben.
Kurz: Die Filter wurden gewaschen und in einem Blockierungsreagenz (nach Herstellerangabe) prähybridisiert. Anschließend wurde mit einem Anti-DIG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war, 30 Minuten hybridisiert. Nach einem Waschschritt wurde das Substrat der alkalischen Phosphatase, CSPD, zugefügt, 5
Minuten mit den Filtern inkubiert, anschließend in Plastikfolie eingepackt und weitere 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Chemilumineszenz der Hepatitis-B-spezifischen DNA-Signale wurde über eine Exposition der Filter mittels Biolumineszenz auf einem Röntgenfilm oder mit einem Lumi-Imager sichtbar gemacht (Inkubation je nach Signalstärke: ca. 2 Minuten bis ca. 2 Stunden) und der Grad der Schwärzung vermessen. Die Hemmwerte wurden entsprechend den Cut-Off- Werten aus den internen Testkontrollen in %-Hemmwerte umgerechnet (Tab. 1). Zur Analyse der synergistischen Wirksamkeit der Kombinationen wurden die Differenzwerte von errechneten und gemessenen Hemmwerten jeder Kombination ermittelt (Tab. 2); vgl. Prichard et al.,
Antimicrob. Agents Chemother. 37, 540 - 545 (1993).
Die Behandlung von HBV mit den erfindungsgemäßen Kombinationen wirkt antiviral besser als die Einzelbehandlung; die Behandlung der Hepatits-B-Virus produ- zierenden HepG2.2.15-Zellen mit den erfindungsgemäßen Kombinationen führte zu einer stärkeren Reduktion der intrazellulären viralen DNA; die Kombinationsbehandlung ist synergistisch wirksam.
TabeUe 1
Inhibierung der Kombination von Verbindung 43 aus Tabelle B mit Lamivudin
Figure imgf000082_0001
Tabelle 2
Kombination von Verbindung 43 aus Tabelle B mit Lamivudin; Unterschied zwischen erwarteter und erhaltener Inhibierung
Figure imgf000083_0001

Claims

Patentansprüche:
1. Kombinationen
A) mindestens eines Dihydropyrimidins,
B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels und gegebenenfalls
C) mindestens eines Immunmodulators.
2. Kombinationen nach Anspruch 1 , worin das Dihydropyrimidin A der Formel
Figure imgf000084_0001
bzw. deren isomerer Form
Figure imgf000084_0002
entspricht, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Reste der Formeln
Figure imgf000084_0003
oder
Figure imgf000085_0001
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, d-Cö-Alkoxy, Cι-C6-Alkoxy- carbonyl und d-C6-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch -S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10, -SO2-CF3 oder -A-CH2-RU substituiert sind, worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy- substituiertes Phenyl, Hydroxy, d-C6-Acyl oder d-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, d-Cö-Alkoxy- carbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, Cι-C6-Alkyl und Cι-C6-
Alkoxy, substituiert ist, bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14, worin
X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,
R12 Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes d-C6- Alkoxycarbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Cj-C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(Cι- C4-Alkyl)-,
-S- oder -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin R und R unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder d-C6- Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C6-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
R Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel H3CO
OCH3 oder
Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes d-C6- Alkylthio, Trifluormethyl oder Pyridyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, d-C6-Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, Cι-C6- Alkylthio oder Cι-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a- NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Cι-C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-C6- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, d-C6-Alkyl oder Cι-C6-Alkoxy substituiert sind und oder d-C6-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeu- ten, oder
R3 gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl
oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, C2-C4-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3-fach, gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, Ci-Cβ-Alkoxy, d-C6-Alkyl, Cι-C6-Alkylthio, Carbalkoxy, Cι-C6- Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-d-C6-alkylamino substituiert sein können,
bedeuten, sowie deren Salze.
3. Kombinationen nach Anspruch 1 , worin das Dihydropyrimidin A der Formel
Figure imgf000088_0001
bzw. deren isomerer Form
Figure imgf000089_0001
entspricht, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formeln
Figure imgf000089_0002
Figure imgf000089_0003
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, d-C6-Alkoxy, d-C6-Alkoxy- carbonyl und d-C6-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R°, -NR 7'τRι8*, -CO-NR >9yrR> 10 , -SO2-CF3 und -A-CH2-Rπ substituiert sind, worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
*7 10
R bis R unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy- substituiertes Phenyl, Hydroxy, Cι-C6-Acyl oder Cι-C-6- Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, d-C6-Alkoxy- carbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substitu- iert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder ver- schieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe
Halogen, Nitro, Trifluormethyl, d-Cβ-Alkyl und d-Cö-
Alkoxy, substituiert ist, bedeuten,
einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14, worin
R12 Wasserstoff, d-C6-Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Cχ- C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettengheder aus der Gruppe -O-,
-CO-, -NH-, -N-(d-C4-Alkyl)-, -S- und -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder d-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Cι-C6-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R >3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH3 oder
Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes Cj-C^Alkylthio, Trifluormethyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, d-C6- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen hetero- cyclischen Ring, Cι-C6-Alkylthio oder d-C6-Alkoxy (wobei der
Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a- NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder d-C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-Ce-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, d-Cö-Alkyl oder Ci- C6-Alkoxy substituiert sind und/oder d-C6-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
R4 Wasserstoff, d-C4-Alkyl, Acetyl oder Benzoyl ,
D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und
R Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten, und deren Salze.
4. Kombinationen nach Anspruch 3, worin das Dihydropyrimidin A den Formeln
Figure imgf000092_0001
und/oder
Figure imgf000093_0001
und/oder ihren isomeren Formen und/oder ihren Salzen entspricht.
5. Kombinationen nach Anspruch 3, worin die Dihydropyrimidine A der Formel
Figure imgf000093_0002
bzw. deren isomerer Form
Figure imgf000093_0003
entsprechen, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formeln
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000094_0002
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, Cι-C6-Alkoxy, CrC6- Alkoxycarbonyl und Cι-C6- Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10, -SO2-CF3 und -A-CH2-Rπ substituiert sind, worin
R gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy- substituiertes Phenyl, Hydroxy, d-C6-Acyl oder d-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, Cι-C6-Alkoxy- carbonyl, Phenyl oder Hydroxy-substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-, R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, d-C6-Alkyl und d-C6- Alkoxy, substituiert ist,
bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14, worin
R12 Wasserstoff, d-C6- Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C - C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettengheder aus der Gruppe
-O-,
-CO-, -NH-, -N-(d-C4-Alkyl)-, -S- und -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel
-NR15R16 substituiert ist, worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder d-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, d-Cö-Alkyl oder
Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH, oder Formyl, Cyano, Hydroxy-substituiertes Cj-C^Alkylthio, Trifluormethyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, Cι-C6- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen hetero- cyclischen Ring, Cι-C6- Alkylthio oder Ci-Cö-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder
Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a- NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder d-C6- Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch d-C6- Alkoxycarbonyl, Amino,
Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, d-C6-Alkyl oder Ci- C6-Alkoxy substituiert sind und/oder Ci-Ce-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und R5 Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten, und deren Salze.
6. Kombinationen nach Anspruch 3, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro,
-SO -CF3, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH2-C(CH3)3, - CO-NH(CH2)2OH5 -CO-NH-CH2-C6H5, -CO-NH-C6H5,
CO-NH-(pOH)-C6H , -O-CH2-C6H5 oder -S-ρCl-C6H4 substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14 bedeutet, worin
R12 Wasserstoff, C2-C4-Alkenyl oder C1-C4-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl bedeuten, R3 Wasserstoff oder einen Rest der Formel
H3CO
OCH,
oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder Cι-C4-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Reste der Formeln -SO2CH3, -NH-CO-CH3,
-NH-CO-CF3, Fluor, Chlor, Cι-C3-Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist, worin
a Null oder 1,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder Cι-C4-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch Cι-C3- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei unabhängig voneinander Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, d-C3-Alkyl oder d-C3-Alkoxy substituiert sind und d-d-Alkyl gegebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist, Phenyl oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
R ,4 Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Acetyl, D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder d- - Alkyl
bedeuten, und deren Salze.
7. Kombinationen nach Anspruch 3, worin
R1 Phenyl oder Thienyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Fluor oder Chlor substituiert sind,
R2 Methoxy, Ethoxy oder n-Propoxy,
R3 Wasserstoff, Methyl oder Cyclopropyl,
R4 Wasserstoff,
D ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Fluor oder Chlor
bedeuten, und deren Salze.
8. Kombinationen
A) mindestens eines HBV-core-Protein-Inhibitors,
B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels und gegebenenfalls C) mindestens eines Immunmodulators.
9. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 8, worin Komponente B ein HBV- Polymerase-Inhibitor ist.
10. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 8, worin Komponente B Lamivudin ist.
11. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 8, worin Komponente B aus den Verbindungen der Formel
Figure imgf000100_0001
worin
R1 und R2 unabhängig voneinander Cι-C4- Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R -R , 12 unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C1-C4-Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,
R13 Wasserstoff, d-C4-Alkyl, d-C7-Acyl oder Aralkyl und
X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes C1-C4-Alkyl bedeuten,
und deren Salzen ausgewählt ist.
12. Kombinationen nach Anspruch 11 , worin
X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten.
13. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 12, worin der Immunmodulator C Interferone enthält.
14. Kombinationen von A) Dihydropyrimidin, B) Lamivudin und gegebenenfalls C) Interferon.
15. Verfahren zur Herstellung der Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponenten A und B in geeigneter
Weise kombiniert oder herrichtet.
16. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 14 zur Bekämpfung von Erkrankungen.
17. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Kombination gemäß Ansprüchen 1 bis 14 und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.
18. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen.
19. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis-B-Infek- tionen.
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