DE19962010A1

DE19962010A1 - Arzneimittelkombinationen gegen virale Erkrankungen

Info

Publication number: DE19962010A1
Application number: DE1999162010
Authority: DE
Inventors: Arnold Paessens; Karl Deres; Olaf Weber; Erwin Graef; Juergen Stoltefus; Siegfried Goldmann; Thomas Kraemer; Ulrich Niewoehner; Karl-Heinz Schlemmer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2001-06-28

Abstract

Kombinationen von Dihydropyrimidinen und Lamivudin hemmen die Vermehrung von HBV-Viren besser als bislang bekannte Mittel.

Description

Die Erfindung betrifft Kombinationen von nicht-nukleosidischen Hemmstoffen, wie z. B. Dihydropyrimidinen, und anderen antiviralen Mitteln, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-Infektionen.

Unter "Kombinationen" im Sinne der Erfindung werden nicht nur Darreichungs formen, die alle Komponenten enthalten (sog. Fixkombinationen), und Kombina tionspackungen, die die Komponenten voneinander getrennt enthalten, verstanden, sondern auch gleichzeitig oder zeitlich versetzt applizierte Komponenten, sofern sie zur Behandlung oder Prophylaxe derselben Krankheit eingesetzt werden.

Das Hepatitis-B-Virus gehört zur Familie der Hepadna-Viren. Es verursacht eine akute und/oder eine peristent-progrediente, chronische Erkrankung. Vielfältige andere klinische Manifestationen im Krankheitsbild werden durch das Hepatitis-B- Virus mitverursacht - insbesondere chronische Leberentzündung, Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom. Weiterhin kann eine Koinfektion mit dem Hepatitis- Delta-Virus den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen.

Zur Virushemmung sind bereits mehrere Möglichkeiten vorgeschlagen worden:
die Hemmung der Polymerase des HBV durch Analoga der Substrate dieses Enzyms wie Lamivudin, FTC, Adefovir Dipivoxil, Abacavir, β-L-FDDC, L-FMAU und BMS 200 475:

Die Polymerase ist eine der wesentlichen und im Vermehrungszyklus essentiellen enzymatischen Aktivitäten des HBV-Virus; vgl. Radziwill et al., J. Virol. 64, 613- 620 (1990). Analoga der natürlichen Substrate - zumeist nach Phosphorylierung durch die wirtseigenen Enzyme - des viralen Polymerasekomplexes hemmen die Polymeraseaktivität und somit die Replikation des HBV in vitro und in vivo; vgl. z. B. Chang et al., J. Biol. Chem. 267, 13938-13942 (1992).

Lamivudin wird seit kurzem zur Behandlung von chronisch HBV-infizierten Patienten eingesetzt. Es zeigt allerdings nach Absetzen der Therapie einen hohen Reboundeffekt und führt während der Langzeittherapie zu Resistenzen. Für Adefovir Dipivoxil, BMS 200 475 und die anderen oben erwähnten Hemmstoffe liegen noch keine allgemein zugänglichen klinischen Erfahrungen vor.

2. die Hemmung des HBV durch immunologische Prinzipien, wie z. B. die Behand lung chronischer Hepatitis durch Interferon; allerdings ist es nur mäßig wirksam und hat unerwünschte Nebenwirkungen. Kombinationen von Interferon mit Lamivudin sind nicht synergistisch wirksam.

Auch die Stimulierung wirtseigener Immunabwehr, wie z. B. mit Thymosin-α, ist bereits vorgeschlagen worden.

Die Hemmung durch andere Wirksubstanzen, deren Wirkungsweisen nicht bekannt oder Gegenstand von Spekulationen sind, wie z. B. AT-61 { = N-[(1E)-2-Chlor-2- phenyl-1-(1-piperidinylcarbonyl)-ethenyl]-benzamid}, das offenbar in den Vorgang der Verpackung der prägenomischen RNA in die unfertigen core-Partikel eingreift; vgl. King et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 42, 3179-3186 (1998). Wenn auch der Mechanismus noch nicht völlig aufgeklärt ist, scheinen die Autoren eine Wirkung auf das core-Protein auszuschließen. Die in-vitro-Kombination von AT-61 und Lamivudin wird als synergistisch wirksam beschrieben.

Bisherige Therapeutika zur Behandlung HBV-infizierter Patienten, wie z. B. Inter feron oder Lamivudin, werden als Monotherapie eingesetzt. Aus klinischen Studien ist bekannt, dass Kombinationen beider Hemmstoffe keinen Vorteil bei der Bekämpfung von HBV-Erkrankungen aufweisen.

Neue Mittel für eine bessere und wirksame Therapie sind daher wünschenswert.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Kombinationen von nicht- nukleosidischen Hemmstoffen wie Dihydropyrimidinen und anderen HBV-anti viralen Mitteln die Nachteile des Standes der Technik nicht oder nur noch teilweise aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind daher Kombinationen A) mindestens eines Dihydro pyrimidins und B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels, vorzugsweise eines HBV-Polymerase-Inhibitors. Die Erfindung betrifft also Kombi nationen von nukleosidischen und nicht-nukleosidischen Hemmstoffen zur Behand lung und Prophylaxe von HBV-Infektionen sowie ihre Verwendung zur Behandlung HBV-induzierter Erkrankungen.

Die erfindungsgemäßen Kombinationen hemmen die Vermehrung des HBV-Virus unvorhersehbar wesentlich besser als die aus dem Stand der Technik bekannten Mittel oder deren bekannte Kombinationen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationen bietet bei der Behandlung HBV-induzierter Erkrankungen wertvolle Vorteile im Vergleich zur Monotherapie mit den Einzelverbindungen, nämlich haupt sächlich eine synergistische antivirale Wirksamkeit, aber auch eine gute Ver träglichkeit der erfindungsgemäßen Kombinationen im Bereich der Toxizität, bei der 50% der Zellen überleben ("Tox-50") - im Vergleich zur Tox-50 der Einzelkompo nenten.

Bevorzugte Dihydropyrimidine A entsprechen beispielsweise der Formel

bzw. deren mesomeren Form

worin
R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlen stoffatomen oder Reste der Formeln

bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, (C₁-C₆)-Alkoxy, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl und (C₁-C₆)- Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch
-S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰, -SO₂-CF₃ und -A-CH₂-R¹¹ substituiert sind,
worin
R⁶ gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R⁷ bis R¹⁰ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy substituiertes Phenyl, Hydroxy, (C₁-C₆)-Acyl oder (C₁-C₆)-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy carbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO₂-,
R¹¹ Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Tri fluormethyl, (C₁-C₆)-Alkyl und (C₁-C₆)-Alkoxy, substituiert ist,
bedeuten,
R² einen Rest der Formeln -XR¹² oder -NR¹³R¹⁴,
worin
X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,
R¹² Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten (C₁-C₈)-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(C₁-C₄-Alkyl)-, -S- oder -SO₂- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel
-NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,
worin R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten,
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel

oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes (C₁-C₆)-Alkylthio, Trifluormethyl oder Pyridyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge sättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebe nenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, (C₁-C₆)- Alkylthio oder (C₁-C₆)-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seiner seits durch Azido, Amino, Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)_a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten, die gegebe nenfalls durch (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenen falls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₁-C₆)-Alkoxy substituiert sind und/oder (C₁-C₆)-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substituiert ist,
oder
R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
oder
R³ gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl
oder
R² und R³ gemeinsam einen Rest der Formel

R⁴ Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, (C₂-C₄)-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Benzoyl oder (C₂- C₆)-Acyl, und
R⁵ Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3-fach, gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, (C₁-C₆)- Alkoxy, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkylthio, Carbalkoxy, (C₁-C₆)-Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-(C₁-C₆)-alkylamino substituiert sein können,
bedeuten,
sowie deren Salze.

Die Verbindungen I bzw. Ia schließen die Isomeren der Formeln (I') und (Ia) sowie deren Mischungen ein. Wenn R⁴ Wasserstoff ist, liegen die Isomeren (I) und (Ia) im tautomeren Gleichgewicht vor:

Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) bzw. (Ia), worin
R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Reste der Formeln

bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, -SO₂-CF₃, Methyl, Cyano, Trifluor methoxy, Hydroxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln
-CO-NH-CH₂-C(CH₃)₃, -CO-NH(CH₂)₂OH,
-CO-NH-CH₂-C₆H₅, -CO-NH-C₆H₅, -CO-NH-(pOH)-C₆H₄,
-O-CH₂-C₆H₅ oder -S-pCl-C₆H₄ substituiert sind,
R² einen Rest der Formeln -XR¹² oder -NR¹³R¹⁴
worin
X eine Einfachbindung oder ein Sauerstoffatom,
R Wasserstoff, (C₂-C₄)-Alkenyl, (C₁-C₄)-Alkoxycarbonyl oder (C₁-C₄)- Alkyl, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR¹⁵R¹⁶ sub stituiert ist,
worin
R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder (C₁-C₄)-Alkyl bedeuten,
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl oder Cyclo propyl bedeuten,
R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel

oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes (C₁-C₄)-Alkylthio, Trifluormethyl, Cyclopropyl, Pyridyl oder (C₁-C₄)-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Halogen, (C₁-C₄)-Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe
-(CO)_a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,
worin
a Null oder 1,
R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder (C₁- C₄)-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch (C₁-C₃)-Alkoxycar bonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei unabhängig voneinander Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, (C₁-C₃)- Alkyl oder (C₁-C₃)-Alkoxy substituiert sind und (C₁-C₃)-Alkyl ge gebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substituiert ist, Phenyl oder
R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
oder
R³ gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl
oder
R² und R³ gemeinsam einen Rest der Formel

R⁴ Wasserstoff, Methyl, Vinyl oder Acetyl und
R⁵ Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl bedeuten,
und deren Salze.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) und (Ia),
worin
R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Reste der Formeln

bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxy, Trifluormethyl, Nitro, -SO₂-CF₃, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH₂-C(CH₃)₃, -CO-NH(CH₂)₂OH, -CO-NH-CH₂-C₆H₅, -CO-NH-C₆H₅, -CO-NH-(pOH)-C₆H₄, -O-CHrC₆H₅ oder -S-pCl-C₆H₄ substituiert sind,
R² einen Rest der Formeln -XR¹² oder oder -NR¹³R¹⁴,
worin
X eine Einfachbindung oder ein Sauerstoffatom,
R¹² Wasserstoff, (C₂-C₃)-Alkenyl, (C₁-C₄)-Alkoxycarbonyl oder (C₁-C₄)- Alkyl, worin der Alkylrest gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,
worin
R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl bedeuten,
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₃)-Alkyl oder Cyclo propyl bedeuten,
R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel

oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl, Pyridyl oder (C₁-C₄)-Alkyl be deutet, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Fluor, Chlor, (C₁-C₃)- Alkoxycarbonyl oder Hydroxy substituiert ist,
oder
R³ gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl oder
R² und R³ gemeinsam einen Rest der Formel

Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) und (Ia), worin
R¹ Phenyl oder Triazolyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder ver schieden durch Fluor, Chlor, Brom oder Iod substituiert sind,
R² geradkettiges oder verzweigtes Alkoxycarbonyl mit bis zu 4 Kohlenstoff atomen,
R³ Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl oder
R² und R³ gemeinsam einen Rest der Formel

R⁴ Wasserstoff, Vinyl oder Acetyl und
R⁵ Pyridyl
bedeuten.

Speziell bevorzugte Dihydropyrimidine A sind in Tabelle A aufgeführt.

Tabelle A

Ganz speziell bevorzugt sind die in Tabelle B aufgeführten Dihydropyrimidine A.

Tabelle B

Ganz besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen:

ihre mesomeren Formen und ihre Salze.

Die Verbindungen der Formeln (I), (Ia) bzw. der Tabellen A und B können herge stellt werden, indem man

[A] Aldehyde der Formel

R¹-CHO (II)

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Amidinen der Formel

worin R⁵ die oben angegebene Bedeutung hat,
und Verbindungen der Formel

R³-CO-CH₂-CO-R² (IV)

worin R² und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz umsetzt,
oder
[B] Verbindungen der Formel

worin R¹ bis R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
mit Amidinen der Formel

worin R⁵ die oben angegebene Bedeutung hat,
gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel bei Temperaturen von 20°C bis 150°C mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz umsetzt,
oder
[C] Aldehyde der Formel

R¹-CHO (II)

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Verbindungen der Formel

worin R² und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und Amidinen der Formel (III) wie oben beschrieben umsetzt,
oder
[D] Aldehyde der Formel (II) mit Verbindungen der Formel (IV) und Iminoethern der Formel

worin R⁵ die oben angegebene Bedeutung hat und R¹ für (C₁-C₄)-Alkyl steht,
in Gegenwart von Ammoniumsalzen umsetzt.

Das bevorzugte Verfahren [A] kann durch folgendes Formelschema beispielhaft erläutert werden:
[A]

Für alle Verfahrensvarianten A, B, C und D kommen als Lösemittel alle inerten organischen Lösemittel in Frage. Hierzu gehören vorzugsweise Alkohole wie Ethanol, Methanol, Isopropanol, Ether wie Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Glykolmonomethylether, Glykoldimethylether, Carbonsäuren wie Eisessig, oder Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Pyridin und Hexamethyl phosphorsäuretriamid.

Die Reaktionstemperaturen können innerhalb eines größeren Bereichs variiert werden. Im allgemeinen arbeitet man im Bereich von 20 bis 150°C, vorzugsweise jedoch bei der Siedetemperatur des jeweiligen Lösemittels.

Die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck, durchgeführt werden; im allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.

Die Umsetzung kann mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz durchgeführt werden; die Gegenwart von schwächeren Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Ameisensäure, wird bevorzugt.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aldehyde (II) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. T. D. Harris und G. P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 21 65 260 und 24 01 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929c, E. Adler und H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), E. P. Papadopoulos, M. Mardin und Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78, 2543 (1956)).

Die als Ausgangsstoffe verwendeten β-Ketocarbonsäureester (IV) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [z. B. D. Borrmann, "Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen" in "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Yliden-β-ketoester (V) können nach literatur bekannten Methoden hergestellt werden [vgl. G. Jones, "The Knoevenagel Conden sation" in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Enaminocarbonsäureester (VI) und die Imino ether (VII) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. S. A. Glickman and A. C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].

Die Verbindungen (III) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel

R⁵-CN (VIII)

worin R⁵ die oben angegebene Bedeutung hat, wie üblich über die Iminoether und abschließend mit Ammoniumchlorid in Methanol umsetzt [vgl. hierzu W. K. Fife, Heterocycles 22, 93-96 (1984); T. Sakamoto, S. Kaneda, S. Nishimura, H. Yamanaka, Chem. Pharm. Bull. 33, 565, 571 (1986)] oder andere literaturbekannte Verfahren, wie z. B. Garigipati, Tetrahedron Lett. 1990, 1969- 1972, Boere et al., J. Organomet. Chem. 1987, 331, 161, oder Caton et al., J. Chem. Soc. 1967, 1204.

Alle Verfahrensschritte können bei Normaldruck und in einem Temperaturbereich von 0 bis 130°C, vorzugsweise von 20 bis 100°C, erfolgen.

Die Verbindungen (VIII) sind bekannt oder können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, indem man beispielsweise Pyridine der Formel

R⁵-H (IX)

worin der Wasserstoff in ortho-Position zum Stickstoff steht und R⁵ die oben angegebene Bedeutung hat,
zunächst bei 50 bis 150°C, vorzugsweise bei etwa 100°C, in H₂O₂/Eisessig zu den entsprechenden N-Oxiden umsetzt und anschließend mit Trimethylsilylcyanid (TMSCN) nach literaturbekannten Verfahren, beispielsweise in den oben aufge führten inerten Lösungsmitteln, vorzugsweise Acetonitril, THF, Toluol bei Raum temperatur oder bei Rückflusstemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von Basen wie Triethylamin oder DBU, umsetzt
oder indem man in Verbindungen der Formel

worin Y und Z die unter R angegebenen Substitutionsreste des Pyridylringes dar stellen,
mit Hilfe von Cyaniden, wie Kaliumcyanid oder Kupfercyanid, das Chlor gegen Cyanid austauscht,
oder für den Fall, dass R⁵ Difluorpyridyl bedeutet, Verbindungen der Formel

worin Y' und Z' unabhängig voneinander Chlor oder Brom bedeuten,
mit Alkali- bzw. Ammoniumfluoriden, vorzugsweise Kaliumfluorid, nach literatur bekannten Verfahren in polaren Lösemitteln, wie beispielsweise Polyglykolen, Poly glykolethern, DMSO oder Sulfolan, gegebenenfalls unter Zusatz von Phasentransfer katalysatoren, im Sinne einer Halogen/Fluor-Austauschreaktion, umsetzt.

Das obige Verfahren wird bezüglich der 3,5-Difluorpyridylverbindungen beispielhaft durch das folgende Reaktionsschema erläutert:

Die obigen Verbindungen I bzw. Ia und verschiedene Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus den DE-OS 198 17 264 ( = WO 99/54 326) und 198 17 265 (= WO 99/54 312) bekannt.

Weitere bevorzugte Dihydropyrimidine A entsprechen der Formel

bzw. deren isomeren Form

worin
R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formeln

bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, (C₁-C₆)-Alkoxy, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl und (C₁-C₆)- Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰, SO₂-CF₃ und -A-CH₂-R¹¹ substituiert sind,
worin
R⁶ gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R⁷ bis R¹⁰ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-sub stituiertes Phenyl, Hydroxy, (C₁-C₆)-Acyl oder (C₁-C₆)-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO₂-,
R¹¹ Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, (C₁-C₆)-Alkyl und (C₁-C₆)-Alkoxy, substituiert ist, bedeuten,
R² einen Rest der Formeln -OR¹² oder -NR¹³R¹⁴,
worin
R¹² Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, ver zweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten (C₁-C₈)- Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, CO-, -NH-, -N-(C₁-C₄-Alkyl)-, -S- und -SO₂- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,
worin R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten,
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl oder Cyclo alkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel

oder Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes (C₁-C₄)-Alkylthio, Trifluor methyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge sättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebe nenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)-Alkoxy carbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, (C₁-C₆)-Alkylthio oder (C₁-C₆)-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)_a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten, die gegebe nenfalls durch (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenen falls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₁-C₆)-Alkoxy substituiert sind und/oder (C₁-C₆)-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder NH-CO-CF₃ substituiert ist,
oder
R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R⁵ Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
und deren Salze.

Bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I bzw. Ia,
worin
R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, SO₂-CF₃, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH₂-C(CH₃)₃, -CO-NH(CH₂)₂OH, CO-NH-CH₂-C₆H₅, -CO-NH-C₆H₅, -CO-NH-(pOH)-C₆H₄, -O-CH₂-C₆H₅ oder -S-pCl-C₆H₄ substituiert sind,
R² einen Rest der Formeln -OR 2 oder -NR¹³R¹⁴ bedeutet,
worin
R¹² Wasserstoff, (C₂-C₄)-Alkenyl oder (C₁-C₄)-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist, worin R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeuten,
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Cyclo propyl bedeuten,
R³ Wasserstoff oder einen Rest der Formel

oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder (C₁-C₄)-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Reste der Formeln SO₂CH₃, -NH-CO-CH₃, NH-CO-CF₃, Fluor, Chlor, (C₁-C₃)-Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,
worin
a Null oder 1,
R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder (C₁- C₄)-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch (C₁-C₃)-Alkoxy carbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei unabhängig voneinander Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, (C₁-C₃)-Alkyl oder (C₁-C₃)-Alkoxy substituiert sind und (C₁-C₃)- Alkyl gegebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH₃ oder NH-CO-CF₃ substituiert ist, Phenyl oder
R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
R⁴ Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Acetyl,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R⁵ Wasserstoff, Halogen oder (C₁-C₄)-Alkyl
bedeuten,
und deren Salze.

Besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I und Ia,
worin
R¹ Phenyl oder Thienyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls bis zu zwei fach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Fluor, Chlor, Methyl, Trifluormethyl und Nitro, substituiert sind,
R² einen Rest der Formeln -OR¹² oder -NR¹³R¹⁴,
worin
R¹² Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl und
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl bedeuten,
R³ Wasserstoff oder Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder gegebe nenfalls durch Fluor, Chlor, Hydroxy substituiertes (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet, das seinerseits bis zu 3-fach durch C₁-C₃-Alkoxycarbonyl substituiert sein kann,
R⁴ Wasserstoff oder Methyl,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R⁵ Wasserstoff, Fluor, Chlor oder (C₁-C₃)-Alkyl
bedeuten,
und deren Salze.

Ganz besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I und Ia, worin
R¹ Phenyl oder Thienyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder ver schieden durch Fluor oder Chlor substituiert sind,
R² Methoxy, Ethoxy oder n-Propoxy,
R³ Wasserstoff, Methyl oder Cyclopropyl,
R⁴ Wasserstoff,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R⁵ Wasserstoff, Fluor oder Chlor
bedeuten,
und deren Salze.

Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen steht im Rahmen der Erfindung für Cyclo propyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, vorzugsweise Cyclopentyl und Cyclo hexyl.

Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Phenyl und Naphthyl.

Aralkyl steht im Rahmen der Erfindung für Aralkyl mit vorzugsweise 6 bis 10, insbesondere 6 Kohlenstoffatomen im Arylteil (vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl, insbesondere Phenyl) und vorzugsweise 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2 Kohlenstoff atomen im Alkylteil, wobei der Alkylteil linear oder verzweigt sein kann. Bevorzugte Aralkylreste sind Benzyl und Phenethyl.

Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für 5- bis 7-gliedrige Ringe mit vorzugs weise 1 bis 3, insbesondere 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff. Bevorzugte Beispiele umfassen Furyl, Thiophenyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, 1.2.3- und 1.2.4-Triazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, 1.2.3-, 1.3.4-, 1.2.4- und 1.2.5-Oxadiazolyl, Pyrrolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1.3.5-, 1.2.4- und 1.2.3-Triazinyl, 1.2.4-, 1.3.2-, 1.3.6- und 1.2.6-Oxazinyl.

Acyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Acylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Acetyl und Propionyl.

Alkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkyl rest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.

Alkenyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkenylrest mit 2 bis 6, vorzugsweise 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, tert.Butenyl, n-Pentenyl und n-Hexenyl.

Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.

Alkylthio steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylthiorest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methylthio, Ethylthio und Propylthio.

Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl und n-Hexoxycarbonyl.

Halogen steht im Rahmen der Erfindung für Fluor, Chlor, Brom oder Iod.

Die Verbindungen I bzw. Ia können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere) oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Verbindungen I bzw. Ia umfassen also so wohl die Enantiomeren als auch die Diastereomeren sowie deren jeweiligen Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in be kannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.

Die Verbindungen I bzw. Ia können auch als Salze vorliegen. Im Rahmen der Er findung sind physiologisch unbedenkliche Salze bevorzugt.

Physiologisch unbedenkliche Salze können Salze der Verbindungen I bzw. Ia mit anorganischen oder organischen Säuren sein. Bevorzugt werden Salze anorganischer Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder Salze organischer Carbon- oder Sulfonsäuren, wie beispiels weise Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Benzoesäure, oder Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Phenylsulfon säure, Toluolsulfonsäure oder Naphthalindisulfonsäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze der Verbindungen I bzw. Ia sein. Besonders bevorzugt sind z. B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze sowie Ammoniumsalze, die von Ammoniak oder organischen Aminen, wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw. Triethylamin, Di- bzw. Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylen diamin oder 2-Phenylethylamin, abgeleitet sind.

Die Verbindungen der Formel I bzw. Ia können hergestellt werden, indem man
[A] Aldehyde der Formel

R¹-CHO (II)

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung hat, mit Amidinen oder deren Hydrochloriden der Formel

worin R⁵ und D die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und Verbindungen der Formel

R³-CO-CH₂-CO-R² (IV)

worin R⁵ und D die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel bei Temperaturen zwi schen 20°C und 150°C mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz umsetzt,
oder
[C] Aldehyde der Formel

R¹-CHO (II)

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung hat, mit Verbindungen der Formel

worin R² und R³ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
und Amidinen der Formel (III) wie oben beschrieben umsetzt.

Die Herstellungsverfahren können durch folgende Formelschemata beispielhaft erläutert werden:

Für alle Verfahrensvarianten A, B und C kommen als Lösemittel alle inerten orga nischen Lösemittel in Frage. Hierzu gehören vorzugsweise Alkohole wie Ethanol, Methanol, Isopropanol, Ether wie Dioxan, Diethylether, Tetrahydrofuran, Glykol monomethylether, Glykoldimethylether, Carbonsäuren wie Eisessig, oder Dimethyl formamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Pyridin und Hexamethylphosphorsäuretri amid.

Die Reaktionstemperaturen können innerhalb eines größeren Bereichs variiert werden; im allgemeinen arbeitet man zwischen 20 und 150°C, vorzugsweise jedoch bei der Siedetemperatur des jeweiligen Lösemittels.

Die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck durchgeführt werden; im allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.

Die Umsetzung kann mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz, vorzugsweise in Gegenwart von schwächeren Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Ameisensäure, durch geführt werden.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aldehyde (1I) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden herstellt werden [vgl. T. D. Harns und G. P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 21 65 260 und 24 01 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929c, E. Adler und H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), E. P. Papadopoulos, M. Mardin und Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78, 2543 (1956)].

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Amidine (III) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. 11/2, Seite 38 ff (1958); R. L. Shoiner und F. W. Neumann, Chem. Review 35, 351 (1944)].

Die als Ausgangsstoffe verwendeten β-Ketocarbonsäureester (IV) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [z. B. D. Borrmann, "Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen", in "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Enaminocarbonsäureester (VI) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. A. C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].

Die Verbindungen I bzw. Ia, welche in 2-Stellung einen gegebenenfalls substituierten Oxazolyl- oder Thiazolylrest enthalten, und verschiedene Verfahren zu ihrer Her stellung sind aus der DE-OS 198 17 262 (= WO 99/54 329) bekannt.

Die Dihydropyrimidine A wirken als HBV-core-Protein-Inhibitoren.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb Kombinationen A) mindestens eines HBV-core-Protein-Inhibitors und B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels, vorzugsweise mindestens eines HBV-Polymerase- Inhibitors.

HBV-core-Protein-Inhibitoren im Sinne der Erfindung sind solche nicht-nukleosi dischen Hemmstoffe, die in der Zelle (i) die Halbwertszeit des HBV-core-Proteins mindestens halbieren bzw. (ii) den nachfolgend beschriebenen Bindungstest bestehen.

(i) Pulse-Chase-Markierung von HepG2.2.15-Zellen und anschließender Nachweis des HBV-core-Proteins durch Immunpräzipitation Allgemeine Beschreibung

Durch Pulse-Chase-Markierung von HepG2.2.15-Zellen und anschließende Immun präzipitation des HBV-core-Proteins wird die Syntheserate und die Stabilität des HBV-core-Proteins messbar. Als Maß der Stabilität wird die Halbwertzeit des core- Proteins herangezogen. Die Halbwertzeit des core-Proteins ist durch die Zeit defi niert, innerhalb der die core-Proteinmenge auf die Hälfte der zum Anfangszeitpunkt t₀ = 0 vorliegenden Menge reduziert worden ist.

Die Proteinmenge korreliert mit der eingebauten Radioaktivität und folglich der Schwärzung eines Röntgenfilms bzw. der Strahlungsintensität, die durch einen Phos phorimager sichtbar gemacht werden kann.

Mit Hilfe dieser Technik kann der Einfluss potentieller Inhibitoren auf die Halbwert zeit des viralen HBV-core-Proteins untersucht werden. Eine Substanz ist demnach dann ein HBV-core-Protein-Inhibitor, wenn die Halbwertzeit des HBV-core-Proteins mindestens halbiert wird; vgl. nachfolgende Testbeschreibung.

Versuchsdurchführung Einsaat der Zellen

An Tag 1 werden die HepG2.2.15-Zellen in Zellkulturflaschen (75 cm²; Costar) in einer Dichte von 6 × 10⁶ Zellen pro Flasche in HepG2-Zellkulturmedium (Fa. Biochrom KG, Berlin) eingesetzt. 100 Liter dieses Mediums bestehen aus 74,8 Litern ®seromed RPMI 1640-Medium und 14,4 Litern ®seromed Medium 199 mit Earle's Salzen (beide Medien von der Fa. Biochrom KG, Berlin; die Zusammen setzungen werden vor den Beispielen beschrieben); weiterhin werden 200 g NaHCO₃, 5 000 000 Einheiten Penicillin-G-Natrium, 5 g Streptomycin, 25 mg Amphotericin B, 30 g Aminoglykosid-Antibiotikum G418 (Fa. Sigma, München), wässrige Natriumpyruvat-Lösung (bis zu einer Natriumpyruvat-Konzentration der Gesamtlösung von 2 mM), wässrige Glutamin-Lösung (bis zu einer Glutamin-Kon zentration der Gesamtlösung von 2 mM), wässriges FCS (FCS = fötales Kälberserum; bis zu einer FCS-Konzentration der Gesamtlösung von 2% (v/v)) zugesetzt. Die Testsubstanz wird als 50 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO; Fa. Sigma, München) zubereitet. Sie wird in HepG2-Zellkulturmedium verdünnt und auf die 100-fache IC₅₀Konzentration eingestellt. 1 ml dieser Test substanzlösung wird zu 19 ml HepG2-Zellkulturmedium gegeben. Die Testsubstanz wird mit der Einsaat in abgestuften Verdünnungsschritten hinzugegeben. Die Zellen werden bei 37°C und 5% CO₂ (v/v) im Brutschrank inkubiert.

Markierung der Proteine

An Tag 3 wird das Kulturmedium verworfen und durch 20 ml eines Mediums ersetzt, dem die Aminosäuren Methionin und Cystin entzogen sind ("Hungermedium"). Das Hungermedium (500 ml) enthält MEM ( = minimum essential medium mit Earle's Salzen; Gibco 51091-015 - die Zusammensetzung wird vor den Beispielen beschrie ben), 5 ml wässrige L-Glutamin-Lösung (200 mM), 5 ml L-wässrige Leucin-Lösung (5.2 g/l), 5 ml wässrige Glucose-Lösung (100 g/l), 5 ml wässrige i-Inosit-Lösung (0.2 g/l), 5 ml wässrige L-Arginin-Lösung (12.46 g/l,) und wässriges FCS (bis zu einer FCS-Konzentration der Gesamtlösung von 2% v/v). Die Inkubation mit Hungermedium wird in Gegenwart der Testsubstanz (Konzentration wie oben) vorgenommen. Die Zellen werden für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO₂ (v/v) im Brutschrank inkubiert. Anschließend werden 16 ml Hungermedium abgenommen und das verbleibende Medium mit 25 µl ³⁵S-Redivue Promix (2,5 mCi/175 µl) (Amersham, AGQ 0080) versetzt. Die Zellen werden für weitere 10 Minuten bei 37°C und 5% CO₂ (v/v) im Brutschrank inkubiert ("Pulse"). Im Anschluss wird die Markierungslösung entfernt und durch Hungermedium plus wässrige L-Cystin- Lösung (bis zu einer Cystin-Konzentration der Gesamtlösung von 1 mM) und wässrige L-Methionin-Lösung (bis zu einer Methionin-Konzentration der Gesamt lösung von 1 mM) ("Labelstopmedium") ersetzt. Damit wird die Markierung abgestoppt. Die Inkubation mit Labelstopmedium wird ebenfalls in Gegenwart der Testsubstanz (Konzentration wie oben) vorgenommen. Das Gesamtvolumen liegt bei 20 ml pro Flasche. Die Kulturen werden bei 37°C und 5% CO₂ (v/v) im Brutschrank inkubiert ("chase "). 5 Minuten nach Zugabe des Labelstopmediums wird der Zeit wert t₀ = 0 ("0-Stunden-Wert") genommen. Weitere Versuchszeiten sind variabel im Bereich bis zu 96 Stunden. An jedem weiteren Zeitwert im Verlauf des "chase" wird ein Probensatz (behandelt/ unbehandelt) entnommen, um den core-Protein-Gehalt zu diesem Zeitpunkt zu ermitteln. Dazu wird das Medium abgenommen und die Zellen werden einmal mit PBS (phosphatgepufferte Saline ohne Ca/Mg⁺⁺) (Biochrom Nr. L1825) gewaschen. Anschließend wird der Zellrasen mit 1 ml Lysispuffer {10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1% (v/v) des nichtionischen Detergens ®Triton X-100 [Marke der Fa. Rohm & Haas, 4-(1.1.3.3-Tetramethylbutyl)-phenol-polyethoxyethanol]; 140 mM NaCl} lysiert. (Der Begriff "Tris" steht für 2-Amino-2-(hydroxymethyl)- 1.3-propandiol). Das Lysat wird in 2 ml-Eppendorfröhrchen überführt und zentrifu giert (2 Minuten; 4000 Upm). Der Überstand wird in ein neues Eppendorfröhrchen überführt, und das Sediment ( = Zellkerne) wird verworfen. Das Lysat wird bei +4°C gelagert.

Fällung des HBV-core-Proteins durch spezifische Immunpräzipitation

Zu dem Lysat werden 10 µl Kanichen-Normalserum (Sigma 7523) und 200 µl Sepharosekügelchen, die in PBS suspendiert sind (Protein-A-Sepharose C1-4B; Pharmacia, 17-0780-01), hinzugegeben (Alternativ kann der Komplex aus Kügelchen und Antikörper vorgeformt werden). Es folgt eine Inkubation für 2 Stunden bei 4°C auf dem Drehrad. Die Immunpräzipitate werden durch Zentrifugation abgetrennt (2 Minuten; 1000 Upm) und bei 4°C gelagert. Der Überstand wird in ein neues Eppendorfröhrchen überführt.

Anschließend werden 5 µl anti-humanes HBV-core-Kaninchen-Antiserum und 200 µl Sepharosekügelchen, die in PBS suspendiert sind (Protein-A-Sepharose C1-4B; Pharmacia, 17-0780-01) hinzugegeben (Alternativ kann der Komplex aus Kügelchen und Antikörper vorgeformt werden). Es folgt eine Inkubation (2 Stunden bei 4°C) auf dem Drehrad. Die Immunpräzipitate werden durch Zentrifugation abgetrennt (2 Minuten; 1000 Upm) und bei 4°C gelagert. Der Überstand wird in ein neues Eppendorfröhrchen überführt und bei 4°C aufgehoben.

Die Kügelchen werden dreimal mit NET-Puffer [50 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,5% (v/v) des nichtionischen Detergens ®Nonident NP-40 (Fa. Boehringer Mannheim); 150 mM NaCl; 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)) gewaschen, d. h. ab wechselnd suspendiert und abzentrifugiert (2 Minuten bei 1000 Upm). Die ge waschenen Immunpräzipitate werden bei 4°C gelagert.

SDS-Page und Visualierung der radioaktiv markierten HBV-core-Proteine (SDS = Dodecylsulfat-Natrium)

Die gewaschenen Immunpräzipitate werden durch 12 Gew.-% SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Dazu wird jede Probe mit 50 µl zweifach konzentriertem SDS-Probenpuffer (BioRad) versetzt, einmal gevortext (geschüttelt), 5 Minuten bei 95°C gekocht, auf Eis abgeschreckt und kurz zentri fugiert. In jede Geltasche werden 20 µl des Überstandes aufgetragen. Das Gel läuft 1,5 Stunden bei 120 Volt ( = 15 Volt/cm).

Das Gel wird dreimal 5 Minuten in Fixierlösung (70 Vol.-% Ethanol; 10 Vol.-% Essigsäure; 20 Vol.-% Wasser) immersiert. Anschließend wird das Gel für 20 Minuten in Enhancer (Enlightning Rapid Autoradiography Enhancer NEN Research Products Nr. NEF-974) gebadet. Das Gel wird auf Filterpapier gelegt (BioRad Nr. 165-0921) und mit Cellophan (BioRad Nr. 165-0922) abgedeckt. Diese Anordnung wird 50 Minuten mit dem BioRad Geltrockner getrocknet.

Das getrocknete Gel wird auf einen Röntgenfilm (Hyperfilm MP; Amersham RPN 2115H) gelegt und nach angemessener Expositionsdauer entwickelt. Alternativ kann das getrocknete Gel auf einem Phosphorimager (Fujix BAS 100) analysiert werden. Die Auswertung vergleicht die Halbwertzeiten des HBV-core-Proteins in An- und Abwesenheit der Testsubstanz.

(ii) Gelchromatographischer Nachweis der Bindung einer markierten Test substanz an HBV-core-Protein Allgemeine Beschreibung

Das chromatographische Verhalten eines Proteins oder eines seiner natürlich auftretenden Aggregationsformen (Dimere, Multimere) während der Gelpermeations chromatographie hängt von der Wahl des verwendeten Gelmaterials ab. Beispiels weise kann das Gelmaterial, das in Entsalzungssäulchen verwendet wird (z. B. Sephadex G-25; Pharmacia), eine Ausschlussgrenze haben, die für globuläre Proteine bei einem Molekulargewicht von 5000 Dalton liegt; d. h. alle Proteine mit einem Molekulargewicht größer als 5000 Da werden im Ausschlussvolumen eluiert.

Andererseits dringt ein globuläres Protein, das ein Molekulargewicht unter 5000 Da aufweist, in das Trennmaterial ein und wird auf der Säule zurückgehalten. Sieht man von Effekten, die nicht durch die Molekülgröße bestimmt werden (z. B. Adsorption), einmal ab, gilt in der Regel: Je geringer das Molekulargewicht eines Moleküls, desto länger dauert der Weg durch das Gelbett und desto später wird das Molekül eluiert. Diese prinzipielle Versuchsanordnung kann für einen Bindungstest genutzt werden. Der Bindungstest dient der Untersuchung, ob eine Testsubstanz an ein Protein von Interesse bindet. Dazu wird die Testsubstanz, die hinreichend unter der Ausschluss grenze liegen muss, markiert (z. B. durch Austausch eines Wasserstoffatoms gegen Tritium) und mit dem Protein (z.B dem HBV-core-Protein oder seiner Aggregations form = "Kapsid"), das hinreichend über der Ausschlussgrenze liegen muss, inkubiert. Das Material wird auf die Säule aufgetragen und mit einem Elutionspuffer (z. B. 10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) eluiert. Durch die Bindung an das Protein wird die markierte Testsubstanz wie das freie Protein im Ausschlussvolumen eluiert. Eine nicht bindende Testsubstanz oder der Testsubstanz-Überschuss wird dagegen im späten Elutionsvolumen eluiert. Zum Nachweis des Elutionsverhaltens werden einzelne Fraktionen aufgefangen und die Radioaktivität im Szintillationszähler (oder durch ein anderes geeignetes Detektionsverfahren) bestimmt.

In der Regel wird dieses Verfahren als Variante des Bindungstest so durchgeführt werden, dass man beispielsweise eine markierte Substanz, die an das HBV-core- Protein bindet ("markierte Substanz"), dazu benutzt, weitere core-Protein-Binder aufzufinden: Die markierte Substanz wird durch eine Testsubstanz ("verdrängende Substanz") direkt verdrängt (Wettbewerb um die gleiche Bindungsstelle) oder die Testsubstanz modifiziert das Protein (bzw. eines seiner Aggregatformen) derart, dass die markierte Substanz nicht länger binden kann (Modifikation der Bindungsstelle).

Versuchsdurchführung Bereitstellung der Säule

Die Sephadex-G-25-Säule (Höhe der Säule: 5 cm, Durchmesser der Säule: 1,5 cm) wird nach Standardverfahren (Herstelleranweisungen) gegossen oder fertig von einem Hersteller (z. B. PD10-Entsalzungssäulchen von Phamacia) bezogen. Die Säule wird im gewünschten Puffer (10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) äquilibriert. Eine Probe (32 µl), bestehend aus 2 µl ( = 64 µmol) markierter Substanzlösung (spezifische Aktivität einer z. B. tritiierten Verbindung liegt typischerweise im mCi/ml-Bereich), gemischt mit HBV-core-Protein (10 µg = 2,7 µmol), das in Form des Kapsids vorliegt, und mit verdrängender Substanz (100 × molarer Überschuss, bezogen auf markierte Substanz) wird auf die Säule appliziert. Der Äquilibrierungs puffer wird zur Elution verwendet. Es werden Fraktionen von 1 ml aufgefangen. Die gesamte Fraktion oder ein Aliquot davon wird mit Szintillatorflüssigkeit (Ultima Gold, Packard) gemischt und mit einem Szintillationszähler ausgemessen. Im Fall einer Verdrängung von markierter Substanz durch die Testsubstanz wird in den Fraktionen, die das Ausschlussvolumen beinhalten, eine geringere Aktivität als in Fraktionen gemessen, in denen keine Testsubstanz vorlag (Nullwert). Ein HBV-core- Protein-Inhibitor liegt dann vor, wenn maximal 50% der Aktivität des Nullwerts vorliegen.

Der oben beschriebene Halbwertzeittest (i) ergibt in der Regel die genaueren Werte; er ist jedoch zeitaufwendig. Sollen viele Substanzen getestet werden, so wird man wegen der höheren Testgeschwindigkeit den Bindungstest (ii) wählen; er ist auch zu einem Screening geeignet, woran sich dann ein Halbwertzeittest (i) für ausgewählte Verbindungen anschließen kann. HBV-core-Protein-Inhibitoren im Sinne der Erfin dung sind solche, die mindestens den weiter oben beschriebenen Halbwertszeit-Test (i) bestehen.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia) und B) HBV-Polymerase-Inhibitoren.

Als HBV-Polymerase-Inhibitoren B im Sinne der Erfindung werden solche Stoffe bezeichnet, die im nachfolgend beschriebenen endogenen Polymerase-Assay, das von Ph. A. Furman et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 36 (No. 12), 2688 (1992) publiziert worden ist, zu einer Hemmung der Bildung eines HBV-DNA- Doppelstranges derart führen, dass sich maximal 50% der Aktivität des Nullwerts ergeben:

HBV-Virionen aus Kulturüberständen bauen in vitro Nucleosid-5'-triphosphate in den Plusstrang der HBV-DNA ein. Unter Verwendung von Agarosegel-Elektropho rese wird der Einbau von [α-³²P]-Deoxynucleosid-5'-triphosphat in das virale 3.2-kb DNA-Produkt in An- und Abwesenheit einer Substanz mit potentiell HBV-Polyme rase-hemmenden Eigenschaften beobachtet. HBV-Virionen werden aus dem Zell kultur-Überstand von HepG2.2.15-Zellen durch Fällung mit Polyethylenglykol ge wonnen und aufkonzentriert. 1 Volumenteil geklärter Zellkulturüberstand wird mit ¼ Volumenteil einer wässrigen Lösung enthaltend 50 Gew-% Polyethylenglykol 8000 und 0.6 M Kochsalz gemischt. Die Virionen werden durch Zentrifugieren bei 2,500 × g/15 Minuten sedimentiert. Die Sedimente werden in 2 ml Puffer enthaltend 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5) resuspendiert und gegen den gleichen Puffer enthaltend 100 mM Kaliumchlorid dialysiert. Die Proben können bei -80°C eingefroren werden. Jeder Reaktionsansatz (100 µl) enthält mindestens 10⁵ HBV-Virionen; 50 mM Tris- HCl (pH 7.5); 300mM Kaliumchlorid; SOmM Magnesiumchlorid; 0.1% ®Nonident P-40 (nichtionisches Detergens der Fa. Boehringer Mannheim); je 10 µM dATP, dGTP und dTTP; 10 µCi [³²P]dCTP (3000 Ci/mmol; Endkonzentration 33 nM) und 1 µM des potentiellen Polymerase-Inhibitors in seiner triphosphorylierten Form. Die Proben werden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert, und dann wird die Reaktion durch Zugabe von 50 mM EDTA gestoppt. Eine 10%-ige Gewichtsvolumen-SDS- Lösung (enthaltend 10 g SDS pro 90 ml Wasser) wird bis zu einer Endkonzentration von 1 Vol.-% (bezogen auf Gesamtvolumen) zugegeben, und Proteinase K wird bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde werden Proben mit demselben Volumen Phenol/Chloroform/Isoamyl alkohol (Volumen-Verhältnis 25 : 24 : 1) extrahiert, und aus der wässrigen Phase wird die DNA mit Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 10 µl Gelpuffer (Lösung von 10.8 g Tris, 5.5 g Borsäure und 0.75 g EDTA in 1 Liter Wasser ( = TBE-Puffer)) resuspendiert und durch Elektrophorese in einem Agarosegel getrennt. Das Gel wird entweder getrocknet oder die darin enthaltenen Nukleinsäuren mittels Southern- Transfertechnik auf eine Membran übertragen. Danach wird die Menge des gebil deten und markierten DNA-Doppelstranges im Verhältnis zur Negativkontrolle ( = Endo-Pol-Reaktion ohne Substanz oder mit Kontrollsubstanz ohne Wirkung) be stimmt. Ein HBV-Polymerase-Inhibitor liegt dann vor, wenn maximal 50 % der Aktivität der Negativkontrolle vorliegen.

Bevorzugte HBV-Polymerase-Inhibitoren B) umfassen beispielsweise
3TC = Lamivudin =
= 4-Amino-1-[(2R-cis)-2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin-2(1H)-on, vgl. EP-PS 382 526 ( = US-PS 5 047 407) und WO 91/11186 ( = US-PS 5 204 466);
Adefovir Dipivoxil =
9-{2-[[Bis[(Pivaloyloxy)-methoxy]-phosphinyl]-methoxy]-ethyl}-adenin, vgl. EP-PS 481 214 (= US-PS 5 663 159 und 5 792 756), US-PS 4 724 233 und 4 808 716;
BMS 200 475 =
[1S-(1.α,3.α,4.β)]-2-Amino-1.9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2- methylen-cyclopentyl]-6H-purin-6-on, vgl. EP-PS 481 754 ( = US-PS 5 206 244 und 5 340 816), WO 98/09964 und 99/41275;
Abacavir =
(-)-(1S-cis)-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1- methanol, vgl. EP-PS 349 242 ( = US-PS 5 049 671) und EP-PS 434 450 (= US-PS 5 034 394);
FTC =
(2R-cis)-4-Amino-5-fluor-1-[2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin- 2(1H)-on, vgl. WO 92/14743 ( = US-PS 5 204 466, 5 210 085, 5 539 116, 5 700 937, 5 728 575, 5 814 639, 5 827 727, 5 852 027, 5 892 025, 5 914 331, 5 914 400) und WO 92/18517;
β-L-FDDC =
5-(6-Amino-2-fluor-9H-purin-9-yl)-tetrahydro-2-furanmethanol, vgl. WO 94/27616 ( = US-PS 5 627 160, 5 561 120, 5 631 239 und 5 830 881);
L-FMAU = 1-(2-Deoxy-2-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-methyl-pyrimidin-2.4(1H, 3H)-dion, vgl. WO 99/05157, WO 99/05158 und US-PS 5 753 789.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia) und B) Lamivudin.

Andere bevorzugte HBV-antivirale Mittel B umfassen z. B. Phenylpxopenamide der Formel

worin
R¹ und R² unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R³-R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, C₁-C₄-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C₁-C₄-Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,
R¹³ Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₇-Acyl oder Aralkyl und
X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes C₁-C₄-Alkyl
bedeuten,
und deren Salze.

Diese Phenylpropenamide und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der WO 98/33501 bekannt, auf die hiermit zum Zwecke der Offenbarung Bezug genommen wird. AT-61 ist die Verbindung der obigen Formel, worin X Chlor, A 1- Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten. Eigene Untersuchungen haben ge zeigt, dass AT-61 kein HBV-core-Protein-Inhibitor im Sinne dieser Erfindung ist (Test s. oben).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der ge nannten Kombinationen, wonach man die Komponenten A und B in geeigneter Weise kombiniert oder herrichtet.

Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht- toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfin dungsgemäße Kombinationen enthalten oder die aus einer erfindungsgemäßen Kombi nation bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.

Das Mengenverhältnis der Komponenten A und B der erfindungsgemäßen Kombi nationen kann innerhalb weiter Grenzen schwanken; vorzugsweise beträgt es 5 bis 500 mg A/10 bis 1000 mg B, insbesondere 10 bis 200 mg A/20 bis 400 mg B.

Die erfindungsgemäßen Kombinationen sollen in den oben aufgeführten pharma zeutischen Zubereitungen im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise etwa 0,5 bis 95, Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungs gemäßen Kombinationen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen kann in üb licher Weise nach bekannten Methoden erfolgen, z. B. durch Mischen des Wirkstoffs oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.

Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Kombinationen in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergeb nisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den Wirkstoff oder die Wirkstoffe vor zugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 1 bis 30 mg/kg Körper gewicht. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzu weichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behan delnden Objekts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt.

Die Indikationsgebiete für die erfindungsgemäßen Kombinationen umfassen:

1. die Behandlung von akuten und chronischen Virusinfektionen, die zu einer infektiösen Hepatitis führen können, vorzugsweise die Behandlung von akuten und chronischen Hepatits-B-Virus-Infektionen;
2. die Behandlung von akuten und chronischen HBV-Infektionen bei Koin fektion mit dem Hepatitis-Delta-Virus;
3. die Behandlung von akuten und chronischen HBV-Infektionen bei Koin fektion mit anderen Viren, wie z. B. HIV oder HCV, und
4. die prophylaktische/therapeutische Behandlung bei Transplantationen, wie z. B. Lebertransplantationen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die oben definierten Kombinationen zur Verwendung als Arzneimittel.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der oben definierten Kombinationen und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln, wonach man mindestens eine der oben definierten Kombinationen, gegebenenfalls unter Verwendung von üblichen Hilfs- und Trägerstoffen, in eine geeignete Applikationsform überführt.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben definierten Kombinationen zur Herstellung eines Arzneimittels.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben definierten Kombinationen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe der oben beschriebenen Erkrankungen, vorzugsweise von Viruserkrankungen, insbesondere von Hepatitis B.

Zusammensetzung (mg/l) des aus ®seromed RPMI 1640 hergestellten 1x-Mediums:

NaCl	6000
KCl	400
Na₂HPO₄ × 7 H₂O	1512
MgSO₄ × 7 H₂O	100
Ca(NO₃)₂ × 4 H₂O	100
D-Glucose	2000
Phenolrot	5
NaHCO₃	2000
Phenolrot	5
NaHCO₃	2000

L-Arginin	200
L-Asparagin	50
L-Asparaginsäure	20
L-Cystin	50
L-Glutamin	300
L-Glutaminsäure	20
Glycin	10
L-Histidin	15
L-Hydroxyprolin	20
L-Isoleucin	50
L-Leucin	50
L-Lysin × HCl	40
L-Methionin	15
L-Phenylalanin	15
L-Prolin	20
L-Serin	30
L-Threonin	20
L-Tryptophan	5
L-Tyrosin	20
L-Valin	20

Glutathion	1
Biotin	0,2
Vitamin B₁₂	0,005
D-Ca-Pantothenat	0,25
Cholinchlorid	3
Folsäure	1
i-Inosit	35
Nicotinamid	1
p-Aminobenzoesäure	1
Pyridoxin × HCl	1
Riboflavin	0,2
Thiamin × HCl	1

Zusammensetzung (mg/l) des aus ®seromed Medium 199 mit Earle's Salzen hergestellten 1x-Mediums:

NaCl	6800
KCl	400
NaH₂PO₄ × H₂O	140
MgSO₄ × 7 H₂O	200
CaCl₂	200
D-Glucose	1000
Phenolrot	17
NaHCO₃	2200

DL-Alanin	50
L-Arginin × HCl	70
DL-Asparaginsäure	60
L-Cystein × HCl	0,1
L-Cystin	20
L-Glutamin	100
DL-Glutaminsäure × H₂O	150
AL=L<Glycin
L-Histidin × HCl	50
L-Hydroxyprolin	20
DL-Isoleucin	10
DL-Leucin	40
L-Lysin × HCl	120
DL-Methionin	70
DL-Phenylalanin	30
L-Prolin	50
DL-Serin	40
DL-Threonin	50
DL-Tryptophan	60
L-Tyrosin	20
DL-Valin	40
Glutathion	50
Natriumacetat	0,05
Fe(NO₃)₃	50
®Tween 80*	0,1
20
Adeninsulfat	10
Guanin × HCl	0,3
Hypoxanthin	0,3
Thymin	0,3
Uracil	0,3
Xanthin	0,3

* Marke der Atlas Chemie

ATP,Na₂	1
AMP	0,2
Ascorbinsäure	0,05
Biotin	0,01
Calciferol	0,1
D-Ca-Pantothenat	0,01
Cholinchlorid	0,5
Folsäure	0,01
i-Inosit	0,05
Menadion	0,01
Nicotinsäure	0,025
Nicotinsäureamid	0,025
p-Aminobenzoesäure	0,05
Pyridoxal × HCl	0,025
Pyridoxin × HCl	0,025
Riboflavin	0,01
Thiamin × HCl	0,01
DL-a-Tocopherolphosphat-Na₂	0,01
Vitamin A	0,1
Cholesterin	0,2
2-Desoxy-D-Ribose	0,5
D-Ribose	0,5

Mediumzusammensetzung (mg/l) der aus Gibco 51091-015 hergestellten MEM-lx- Lösung:

CaCl₂ × 2 H₂O	264
KCl	400
MgSO₄ × 7 H₂O	200
NaCl	6800
NaHCO₃	2200
NaH₂PO₄× 2 H₂O	158
Phenolrot	10

L-Histidin × HCl × H₂O	41,92
L-Isoleucin	52,46
L-Lysin × HCl	73,06
L-Phenylalanin	33,02
L-Threonin	47,64
L-Tryptophan	10,20
L-Tyrosin	36,22
L-Valin	46,86
D-Ca-Pantothenat	1,00
Cholinchlorid	1,00
Folsäure	1,00
Nicotinamid	1,00
Pyridoxal × HCl	1,00
Riboflavin	0,10
Thiamin × HCl	1,00

Beispiele HBV in Zellkultur

Die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Kombinationen wurde in Anlehnung an die von M. A. Seils et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1005-1009 (1987) und B. E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55-70 (1992) beschriebenen Methoden durchgeführt.

Die Tests der kombinatorischen Prüfung der Prüfsubstanzen wurde mittels Schach brett-Titration (Chequerboardtitration) durchgeführt.

Die antiviralen Tests wurden in 96 weIl Mikrotiterplatten durchgeführt. Die erste vertikale Reihe der Platte erhielt nur HepG2.2.15-Zellen in Wachstumsmedium. Sie diente als Viruskontrolle.

Stammlösungen der Testverbindungen (50 mM) wurden zunächst in DM50 gelöst; weitere Verdünnungen wurden in Wachstumsmedium hergestellt. Die übrigen Näpfe enthielten die erfindungsgemäßen Kombinationen oder deren Einzelkomponenten in den Testkonzentrationen von z. B. 5 µM bis 0,01 µM, ausgehend von A2 bis H11 der 96-weil Mikrotiterplatte.

Stammlösungen der zu testenden Substanzen wurden auf separaten 96-well Platten vorbereitet und anschließend auf die Testplatte mit HepG2.2.15-Zellen zusammen pipettiert. Damit waren Testkonzentrationen im Bereich von ca. 10-50 fach ober- und unterhalb der IC-50 Konzentrationen abgedeckt.

Der Testansatz wurde 8 Tage bei 37°Celsius und 5% CO₂ (v/v) inkubiert. Am Tag 4 wurde das Medium durch frisches inhibitorhaltiges Medium ersetzt.

Zytotoxizitätsbestimmung

Vor der Ernte der Überstände/Zell-Lysate zur Bestimmung des antiviralen Effektes wurden die HepG2.2.15-Zellen lichtmikroskopisch oder mittels biochemischer Nach weisverfahren (z. B. Alamar-Blue-Färbung oder Trypanblau-Färbung) auf zyto toxische Veränderungen untersucht.

Substanzinduzierte zytotoxische oder zytostatische Veränderungen der HepG2.2.15- Zellen wurden z. B. lichtmikroskopisch als Änderungen der Zellmorphologie er mittelt. Derartige Substanzinduzierte Veränderungen der HepG2.2.15-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen wurden z. B. als Zellyse, Vakuolisierung oder veränderte Zellmorphologie sichtbar. 50% Zytotoxizität ("Tox.-50") bedeuten, dass 50% der Zellen eine der entsprechenden Zellkontrolle vergleichbare Morphologie aufweisen.

Die Verträglichkeit einiger erfindungsgemäßer Kombinationen wurde zusätzlich auf anderen Wirtszellen, wie z. B. HeLa-Zellen, primären peripheren Blutzellen des Menschen oder transformierten Zellinien wie H-9 Zellen, ausgetestet.

Es konnten keine Zell-zytotoxischen Veränderungen im Test-Konzentrationsbereich festgestellt werden.

Bestimmung der antiviralen Wirkung

Anschließend wurden die Überstände/Zell-Lysate geerntet und mittels vermindertem Druck auf mit Nylonmembran bespannten 96-Napf-Dot-Blot-Kammern (ent sprechend den Herstellerangaben) gesogen.

In Kürze: Nach Transfer der Überstände oder Gesamtzell-Lysate auf die Nylon- Membran der Blot-Apparatur (s.o.) wurden die darin enthaltenen Nukleinsäuren denaturiert (1.5 M NaCh 0.5 N NaOH), neutralisiert (3 M NaCh 0.5 M Tris HCl, pH 7.5) und gewaschen (2 × SSC). Anschließend wurde die DNA durch Inkubation der Filter bei 120°C, 2-4 Stunden, an die Membran gebacken.

Hybridisierung der DNA

Der Nachweis der viralen DNA von den behandelten HepG2.2.15-Zellen auf den Nylonfiltern wurde in der Regel mit nichtradioaktiven, Digoxigenin-markierten Hepatitis-Bspezifischen DNA-Sonden durchgeführt, die jeweils nach Hersteller angabe mit Digoxigenin markiert, gereinigt und zur Hybidisierung eingesetzt wurden.

Kurz: Die Prähybidisierung und Hybidisierung erfolgten in 5 x SSC, 1 × Blockierungsreagenz, 0.1% N-Lauroylsarcosin, 0.02% SDS und 100 µg Sperma- DNA des Herings. Die Prähybridisierung erfolgte 30 Minuten bei 60°C, die spezi fische Hybridisierung mit 20-40 ng/ml der digoxigenierten, denaturierten HBV spezifischen DNA (14 Stunden, 60°C). Anschließend wurden die Filter gewaschen.

Nachweis der HBV-DNA durch Digoxigenin-Antikörper

Der immunologische Nachweis der Digoxigenin-markierten DNA erfolgte nach Herstellerangaben.

Kurz: Die Filter wurden gewaschen und in einem Blockierungsreagenz (nach Herstellerangabe) prähybridisiert. Anschließend wurde mit einem Anti-DIG-Anti körper, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war, 30 Minuten hybridisiert. Nach einem Waschschritt wurde das Substrat der alkalischen Phosphatase, CSPD, zuge fügt, 5 Minuten mit den Filtern inkubiert, anschließend in Plastikfolie eingepackt und weitere 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Chemilumineszenz der Hepatitis-B spezifischen DNA-Signale wurde über eine Exposition der Filter mittels Biolumin eszenz auf einem Röntgenfilm oder mit einem Lumi-Imager sichtbar gemacht (Inkubation je nach Signalstärke: ca. 2 Minuten bis ca. 2 Stunden) und der Grad der Schwärzung vermessen.

Die Hemmwerte wurden entsprechend den Cut-Off-Werten aus den internen Test kontrollen in %-Hemmwerte umgerechnet. Zur Analyse der synergistischen Wirk samkeit der Kombinationen wurden die Differenzwerte von errechneten und ge messenen Hemmwerten jeder Kombination ermittelt; vgl. Prichard et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37, 540-545 (1993).

Die Behandlung von HBV mit den erfindungsgemäßen Kombinationen wirkt anti viral besser als die Einzelbehandlung; die Behandlung der Hepatits-B-Virus produ zierenden HepG2.2.15-Zellen mit den erfindungsgemäßen Kombinationen führte zu einer stärkeren Reduktion der intrazellulären viralen DNA; die Kombinations behandlung ist synergistisch wirksam.

Claims

1. Kombinationen mindestens eines Dihydropyrimidins und B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels.

2. Kombinationen nach Anspruch 1, worin das Dihydropyrimidin A der Formel
bzw. deren mesomeren Form
worin
R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Reste der Formeln
oder
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, (C₁-C₆)-Alkoxy, (C₁-C₆)- Alkoxycarbonyl und (C₁-C₆)-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkyl rest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann, und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch
-S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰, -SO₂-CF₃ und -A-CH₂-R¹¹ substituiert sind,
worin
R⁶ gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R⁷ bis R¹⁰ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy substituiertes Phenyl, Hydroxy, (C₁-C₆)-Acyl oder (C₁-C₆)- Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, (C₁-C₆)- Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO₂ -,
R¹¹ Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder ver schieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, (C₁-C₆)-Alkyl und (C₁-C₆)- Alkoxy, substituiert ist, bedeuten,
R² einen Rest der Formeln -XR¹² oder -NR¹³R¹⁴,
worin
X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,
R¹² Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes (C₁-C₆)-Alkoxy carbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten (C₁-C₈)-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(C₁- C₄-Alkyl)-, -S- oder -SO₂- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel
-NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,
worin R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten,
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes (C₁-C₆)-Alkylthio, Trifluor methyl oder Pyridyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7- gliedrigen heterocyclischen Ring, (C₁-C₆)-Alkylthio oder (C₁-C₆)- Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino, Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)_a-NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₁- C₆)-Alkoxy substituiert sind und/oder (C₁-C₆)-Alkyl gege benenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substi tuiert ist,
oder
R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
oder
R³ gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl
oder
R² und R³ gemeinsam einen Rest der Formel
R⁴ Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, (C₂-C₄)-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Benzoyl oder (C₂-C₆)-Acyl, und
R⁵ Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3-fach, gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, (C₁-C₆)-Alkoxy, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkylthio, Carbalkoxy, (C₁- C₆)-Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-(C₁-C₆)-alkylamino sub stituiert sein können,
bedeuten,
sowie deren Salze.

3. Kombinationen nach Anspruch 1, worin das Dihydropyrimidin A der Formel
bzw. deren isomeren Form
entspricht, worin
R¹ Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoff atomen oder einen Rest der Formeln
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, (C₁-C₆)-Alkoxy, (C₁-C₆)- Alkoxycarbonyl und (C₁-C₆)-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R⁶, -NR⁷R⁸, -CO-NR⁹R¹⁰,
-SO₂-CF₃ und -A-CH₂-R¹¹ substituiert sind,
worin
R⁶ gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R⁷ bis R¹⁰ unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy substituiertes Phenyl, Hydroxy, (C₁-C₆)-Acyl oder (C₁-C₆)- Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, (C₁-C₆)- Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO₂-,
R¹¹ Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder ver schieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, (C₁-C₆)-Alkyl und (C₁-C₆)- Alkoxy, substituiert ist, bedeuten,
R² einen Rest der Formeln -OR¹² oder -NR¹³R¹⁴
worin
R¹² Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl oder einen gerad kettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge sättigten (C₁-C₈)-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-,
-CO-, -NH-, -N-(C₁-C₄-Alkyl)-, -S- und -SO₂- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR¹⁵R¹⁶ substituiert ist,
worin R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten,
R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R³ Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes (C₁-C₄)-Alkylthio, Tri fluormethyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen hetero cyclischen Ring, (C₁-C₆)-Alkylthio oder (C₁-C₆)-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)_a- NR¹⁷R¹⁸ substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R¹⁷ und R¹⁸ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder (C₁-C₆)-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, (C₁-C₆)-Alkyl oder (C₁- C₆)-Alkoxy substituiert sind und/oder (C₁-C₆)-Alkyl gegebe nenfalls durch -NH-CO-CH₃ oder -NH-CO-CF₃ substituiert ist,
oder
R¹⁷ und R¹⁸ gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
R⁴ Wasserstoff, (C₁-C₄)-Alkyl, Acetyl oder Benzoyl,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R⁵ Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
und deren Salze.

4. Kombinationen nach Ansprüchen 1 und 2, worin das Dihydropyrimidin A den Formeln
und/oder ihren mesomeren Formen und/oder ihren Salzen entspricht.

5. Kombinationen A) mindestens eines HBV-core-Protein-Inhibitors und B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels.

6. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 5, worin Komponente B ein HBV- Polymerase-Inhibitor ist.

7. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis S. worin Komponente B Lamivudin ist.

8. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 5, worin Komponente B aus den Verbindungen der Formel
worin
R¹ und R² unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R³-R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, C₁-C₄-Alkyl, gegebe nenfalls substituiertes C₁-C₄-Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluor methyl,
R¹³ Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₇-Acyl oder Aralkyl und
X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes C₁-C₄-Alkyl
bedeuten,
und deren Salzen ausgewählt ist.

9. Kombinationen nach Anspruch 8, worin
X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten.

10. Verfahren zur Herstellung der Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponenten A und B in geeigneter Weise kombiniert oder herrichtet.

11. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 9 zur Verwendung als Arzneimittel.

12. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Kombination gemäß Ansprüchen 1 bis 9 und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.

13. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln nach Anspruch 12, wonach man mindestens eine Kombination gemäß Ansprüchen 1 bis 9, gegebenenfalls unter Verwendung von üblichen Hilfs- und Trägerstoffen, in eine geeignete Applikationsform überführt.

14. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels.

15. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen.

16. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis B.