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WO1999061904A1 - Packing material for chromatography having novel characteristic and method for isolation of substance using the same - Google Patents

Packing material for chromatography having novel characteristic and method for isolation of substance using the same Download PDF

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WO1999061904A1
WO1999061904A1 PCT/JP1999/002698 JP9902698W WO9961904A1 WO 1999061904 A1 WO1999061904 A1 WO 1999061904A1 JP 9902698 W JP9902698 W JP 9902698W WO 9961904 A1 WO9961904 A1 WO 9961904A1
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chromatography
poly
copolymer
temperature
packing material
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PCT/JP1999/002698
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French (fr)
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Teruo Okano
Akihiko Kikuchi
Yasuhisa Sakurai
Hideko Kanazawa
Yoshikazu Matsushima
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GE Healthcare Japan Corp
Original Assignee
Amersham Pharmacia Biotech KK
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Publication date
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    • B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/52—Physical parameters
    • G01N30/54—Temperature

Definitions

  • the present invention relates to a charged polymer or copolymer capable of changing the effective charge density or hydrophilic / hydrophobic balance of a stationary phase surface in an aqueous system by an external signal (for example, temperature).
  • the present invention relates to a novel method for separating a substance that separates substances such as metal elements, pharmaceuticals, and biological components by chromatography using the same. Background art
  • Liquid chromatography varies widely depending on the combination of stationary and mobile phases and the mode of interaction involved in the separation. Liquid chromatography is important for the separation of metal elements, the separation and purification of pharmaceuticals, and the separation of peptides, proteins and nucleic acids in the biochemical field. Furthermore, as the application to biopharmaceuticals such as recombinant proteins produced by genetic engineering techniques, which has been remarkably advanced recently, has become active, the demand for efficient separation methods for the separation and purification of these has been increasing. Currently widely used chromatographs include ion exchange chromatography and reverse phase chromatography.
  • ion exchange chromatography separation is performed by reversibly adsorbing a counter ion present in a mobile phase using an electrolyte on the surface of an insoluble carrier as a stationary phase.
  • Silica, cellulose-dextran, a copolymer of styrene and divinylbenzene, and the like are often used as the support.
  • ion exchange groups such as sulfonic acid groups and quaternary ammonium groups into these carriers are commercially available as ion exchangers.
  • the solute dissociates into cations, anions, and zwitterions according to the hydrogen ion concentration in the solution, and when this solution flows through the ion exchange column, it competes with the solvent ion for the oppositely charged exchange group on the surface of the carrier, and binds. Partition at a constant rate between the solution and the ion exchanger surface. Separation is performed by utilizing the fact that the moving speed in the column varies depending on the strength of the bond. This distribution can be varied in several ways. For example, it can be varied by the concentration of competing ionic species in the mobile phase. Also, it changes the hydrogen ion concentration of the solution and changes the ionization rate of the ion exchange groups on the surface of the carrier.
  • Reversed-phase chromatography consists of a hydrophobic stationary phase and a polar mobile phase.
  • the solute is partitioned and separated between the mobile and stationary phases according to its degree of hydrophobicity.
  • elution is caused by changing the hydrophobicity of the solvent of the mobile phase and changing the partition between the mobile phase and the stationary phase.
  • an organic solvent is used as the mobile phase solvent, the activity of the biological component to be separated may be impaired.
  • elution separation is basically performed by changing the solvent of the mobile phase in various ways.
  • the activity of the target sample may be impaired by the acid or organic solvent used for elution.
  • the ionizing compound is retained by the hydrophobic interaction with the hydrophobic filler in the non-ionized state.
  • ionization weakens the hydrophobic interaction with the hydrophobic filler. Separation in the case where there is a difference in the dissociation constant of the ion dissociable compound can be easily performed by ion-ion interaction by using an ion exchanger.
  • a weakly acidic ion exchange resin is suitable for separating basic proteins
  • a weakly basic ion exchange resin is suitable for separating acidic proteins.
  • poly (N-isopropylacrylamide) (PIP AAm) was copolymerized with positively charged dimethylaminopropyl acrylamide (DMA PA Am) to create a new filler with an ion exchange function. It was found that if the temperature was controlled by using the method, both reverse phase chromatography and ion exchange chromatography could be performed. In addition, they have found that the LCST of the polymer can also be controlled by the pH by using an electrically charged copolymer. The present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention uses a filler containing a charged polymer or copolymer, which can change the effective charge density of the stationary phase surface by external stimulus while keeping the mobile phase fixed in an aqueous system.
  • the present invention relates to a method for separating a substance, which comprises performing separation by chromatography.
  • the present invention provides a method in which a substance is retained on a stationary phase composed of a packing material for chromatography chemically modified with a copolymer of a polyalkylacrylamide having an amino group, a propyloxyl group, a hydroxyl group, or the like.
  • the present invention relates to a method for separating a substance, which comprises changing the balance of hydrophilicity / hydrophobicity on the surface of a stationary phase by a temperature gradient method that changes stepwise, and separating the substance by passing through the same mobile phase.
  • the present invention changes the effective charge density of the stationary phase surface by physical stimulation.
  • the present invention relates to a packing for chromatography comprising a charged copolymer.
  • the packing material for chromatography of the present invention can reversibly control the charge state of ion-exchange groups present on the carrier surface by changing the surface structure of the stationary phase by external physical stimulus such as temperature. That is, the present invention provides a stationary phase capable of simultaneously performing two modes, that is, ion-exchange chromatography and reverse-phase chromatography, by using a single aqueous solvent as a mobile phase (aqueous mobile phase).
  • the present invention provides a carrier capable of freely controlling the charge of the ion exchange group on the surface of the carrier in the ion exchange chromatography mode and the balance of hydrophilicity and hydrophobicity in the reverse phase chromatography.
  • the aqueous solvent means an aqueous solution containing only water or an inorganic salt and not containing an organic solvent.
  • the separation is performed by controlling the physical properties and structure around the ion-exchange groups on the surface of the stationary phase by physical stimulation and adjusting the charge of the ion-exchange groups on the surface while the mobile phase is fixed to the aqueous system.
  • a separation and purification carrier characterized by the following. That is, according to the present invention, when the external temperature is lower than the critical temperature, the ion-exchange groups are exposed on the surface of the carrier, and the separated biological components interact with the ion-exchange groups and are separated in one mode of ion-exchange chromatography.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between temperature and retention time when aspirin, salicylic acid, methyl salicylate, and benzoic acid were separated using the two types of fillers described in Example 2.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between temperature and retention time when aspirin, salicylic acid, methyl salicylate, and benzoic acid were separated by changing pH in Example 3.
  • Figure 3 shows the relationship between temperature and retention time when aspirin, salicylic acid, methyl salicylate, and benzoic acid were separated by changing the ionic strength in Example 4. is there.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the temperature and the retention time when aspirin, salicylic acid, methyl salicylate, and benzoic acid were separated by changing the polymerization ratio of IPA Am and DMPAAm in Example 5.
  • the external physical signal in the method of the present invention is, for example, a temperature change.
  • Changing the physical properties and structure around the ion-exchange groups on the filler surface by changing the temperature can be achieved, for example, by introducing a temperature-responsive polymer onto the support surface.
  • a packing material include a packing material for chromatography in which the surface of a carrier is chemically modified with an alkylacrylamide polymer having an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, or the like at a side chain or terminal or a copolymer thereof.
  • Examples of the chemically modified filler include those obtained by modifying a silica carrier with the above-mentioned alkylacrylamide polymer or a copolymer thereof.
  • the ion exchange group can be introduced by chemically modifying the above-mentioned alkyl acrylamide with a copolymer of a comonomer having an amino group or a carboxyl group.
  • the constituent units of the polymer having a carboxyl group include acrylic acid, methacrylic acid, and (meth) acrylamide alkyl sulfonic acid as the constituent units of the polymer having a sulfonic acid.
  • a copolymer of a polymer constituent unit and an alkyl acrylate or an alkyl methacrylate is preferred.
  • poly ( ⁇ -isopropylacrylamide) has a lower critical temperature of 32 ° C
  • the carrier chemically modified with this molecule greatly changes the surface properties of hydrophilic Z hydrophobicity at this critical temperature.
  • the retention force on the sample is changed by temperature, so that the retention behavior is controlled by temperature without changing the composition of the eluate. Is possible.
  • a hydrophilic comonomer such as acrylamide, methacrylic acid, acrylic acid, dimethylacrylamide, or vinylpyrrolidone, which is a monomer that is more hydrophilic than isopropylacrylamide, is converted to N-isopropylamate. It can be adjusted by copolymerizing with acrylamide. If you want the lower critical temperature to be 32 ° C or less, It can be adjusted by copolymerization with a hydrophobic comonomer with styrene, alkyl methacrylate, alkyl acrylate, or the like, which is a primary component.
  • the lower critical temperature of poly (ethyl acrylamide) is about 30 to 32. At this temperature, the surface properties change to hydrophilic / hydrophobic, and the above poly (N-isopropylacrylamide) As in the case, the holding force on the sample can be adjusted by the temperature.
  • the novel chromatographic supports utilized in the present invention are made by chemical modification or polymer coating. As the chemical modification means, two methods, a surface graft method and a radical polymerization, can be used. As for the coating method, after making it insoluble within the applicable temperature range, coat the insoluble material.
  • a surface grafting method and a radical polymerization method can be used as a chemical modification method for introducing a temperature-responsive polymer into a carrier.
  • the surface grafting method is a method in which a temperature-responsive polymer of a certain size is first synthesized and bonded to a carrier, whereas the radical polymerization method polymerizes monomers from the monomer on the carrier surface to construct a polymer. It is a way to do it.
  • nonspecific adsorption due to interaction with silica gel on the carrier surface can be suppressed.
  • Substances that can be separated by the separation method of the present invention include metal elements (eg, Cu 2+ , ⁇ ′ ′′), pharmaceuticals (eg, steroid compounds, antipyretic analgesics, etc.), and biological components (eg, , Peptides, proteins, nucleic acids, etc.) It is particularly effective for the separation of various biological components that cannot be separated by ion exchange chromatography and reverse phase chromatography alone.
  • metal elements eg, Cu 2+ , ⁇ ′ ′′
  • pharmaceuticals eg, steroid compounds, antipyretic analgesics, etc.
  • biological components eg, , Peptides, proteins, nucleic acids, etc.
  • Example 1 Synthesis of polymer
  • An IPA Am copolymer having a carboxyl terminal group was synthesized with a molecular weight of 4000 as a guide.
  • the molecular weight of the copolymer can be set according to the amount of 3-mercaptopropionic acid (MPA) as a chain transfer agent.
  • MPA 3-mercaptopropionic acid
  • Chain transfer agent (3-mercaptopropionic acid) 0.691 g
  • the synthetic copolymer was placed in an eggplant-type kolben, dissolved in half of ethyl acetate (25 to 30 mL), N-hydroxysuccinimide and DCC were added, and the remaining ethyl acetate was added and dissolved. Next, it was immersed in ice water at 4 ° C., stirred for 2 hours at room temperature, and then placed in a thermostat set at 25 ° C. and stirred for one minute. The solution was filtered to remove by-product dicyclohexylurea and concentrated under reduced pressure. Finally, the product was purified by a jet filter, and the product was collected by filtration and dried under reduced pressure. The obtained succinylated copolymer was stored in a freezer.
  • the succinylated copolymer was reacted with aminopropyl silica gel in three times using 1,4-dioxane as a solvent.
  • the reaction was performed at room temperature (25 ° C).
  • succinylated polymer 1.0 g was dissolved in 1,4-dioxane (50 mL) and reacted overnight with aminopropyl silica gel (3 g) in a shaking thermostat.
  • the reaction solution was collected by filtration, and the new copolymer (1. Og) was dissolved again in 1,4-dioxane (50 mL) and reacted overnight. This operation was repeated once, and the one collected by filtration at the end was sufficiently washed with methanol (500 mL) and distilled water (2 L), and was dried under reduced pressure as a filler, and stored overnight.
  • Example 2 Example 2
  • V-501 4,4'-azobis (4,4'-azobis (4-cyanov alericacid) (molecular weight: 280 ⁇ 28)
  • EEDQ N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (N-Ethoxyc ar bony l—2-eth oxy—1,2-dihydroxy quinoline) (Molecular weight: 247.30)] using as a condensing agent, these and ⁇ amino propyl silica gel were reacted in DMF. This was bubbled for 30 minutes N 2 (nitrogen) gas in the dark then completely N 2 was replaced, the N 2 balloon After the reaction, the mixture was filtered and then washed with DMF, thereby introducing the polymerization initiator to the surface.
  • DMAPAAm IPA Am was added in a molar ratio of 8: 2 or 9: 1 in molar ratio.
  • Fig. 4 shows the results.
  • the retention time increased with the increase of the positively charged polymer. These results show that the retention time can be adjusted by changing the polymerization ratio.
  • the present invention has the following advantages.
  • the amount of charge of the ion exchanger exposed on the carrier surface can be freely adjusted by temperature, and separation can be performed with a single aqueous mobile phase without changing the solvent of the mobile phase.
  • Separation can be performed without using acids or organic solvents, and separation is possible without impairing the activity of biological components.

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Description

明 細 書
新規な特性を有するクロマトグラフィ一用充填剤
およびそれを用いた物質の分離方法 技術分野
本発明は、 水系で固定相表面の有効荷電密度あるいは親水性ノ疎水性のバラン スを外的信号 （例えば、 温度） によって変化させることが可能である、 荷電を有 する重合体あるいは共重合体を含む充填剤およびそれをを用いて金属元素、 医薬 品、 および生体成分などの物質をクロマトグラフィーにより分離する物質の新規 な分離方法に関する。 背景技術
液体クロマトグラフィ一は固定相と移動相との組み合わせや分離にあずかる相 互作用の様式により多種多様である。液体クロマトグラフィ一は金属元素の分離、 医薬品の分離精製、 生化学分野のペプチドや蛋白質、 核酸などの分離に重要であ る。 さらには最近進歩の著しい遺伝子工学手法により生産される組換え蛋白質な どのバイオ医薬への応用が盛んになるにつれ、 これらの分離精製のための効率的 な分離法の要求がさらに強まりつつある。 現在広く用いられているクロマトグラ フィ一として、 イオン交換クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー等があ る。
イオン交換クロマトグラフィ一は不溶性保持担体表面の電解質を固定相として 移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う。 保持担 体にはシリカ、 セルロースゃデキストラン、 スチレンとジビニルベンゼンとの共 重合体などが多く用いられている。 これら担体にスルホン酸基、 四級アンモニゥ ム基などのイオン交換基を導入したものをイオン交換体として市販されている。 溶液中の水素イオン濃度に応じて溶質はカチオン、 ァニオン、 両性イオンに解離 し、 この溶液をイオン交換カラムに流した時担体表面の逆電荷の交換基に溶媒ィ オンと競合して結合し、 溶液とイオン交換体表面の間に一定の割合で分配する。 この結合の強さによりカラム内を移動する速度が異なることを利用して分離する。 この分配はいくつかの方法により変化させることができる。 例えば、 移動相中の 競合するイオン種の濃度により、 変化させることができる。 また、 溶液の水素ィ オン濃度を変化させ、 担体表面のイオン交換基のイオン化の割合を変化させる。 したがって、 イオン交換クロマトグラフィーでは移動相のイオン強度や水素ィォ ン濃度を調節して溶質の順序を変化させ分離することが一般的に行われている。 また、 逆相クロマトグラフィーでは疎水性の固定相と極性の移動相から成り立 つている。 溶質はその疎水性度に応じて移動相と固定相との間で分配され分離さ れる。 これらの場合にも移動相の溶媒の疎水性度を変化させ移動相と固定相との 間の分配を変化させ溶出している。 また、 移動相の溶媒には有機溶媒を用いるた めに分離対象になる生体成分の活性を損なう恐れがある。
いずれにしてもイオン交換クロマトグラフィーでも、 逆相クロマトグラフィー でも基本的には移動相の溶媒を様々に変化させて溶出分離を行っている。 溶出に 用いている溶媒の酸や有機溶媒により、 目的のサンプルの活性を損なう可能性が ある。
また、一つの担体で一つのクロマトグラフィ一のモードを採用しているために、 それぞれのクロマトグラフィ一で分離を行う場合にはそれぞれ別々の操作でク口 マトグラフィ一を別々に行う必要がある。 これらの問題を解決するために 1種類 の担体でしかも 1種類の物理刺激でイオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ク ロマトグラフィ一を行い得る担体を開発することにより、 短時間で効率よい分離 が可能となり、 従来分離し得ないものも分離可能になる。
また、 生体成分には電荷を持たないものや持つものなど多種多様である。 一般 に、 イオン化する化合物は、 イオン化していない状態では疎水性充填剤に対して 疎水性相互作用によって保持される。 しかしイオン化されると疎水性充填剤に対 して疎水性相互作用は弱まる。 イオン解離性化合物の解離定数に差がある場合の 分離は、 イオン交換体を用いることによりイオン一イオン相互作用によって容易 に行うことができる。
一般に、 塩基性のタンパク質の分離には弱酸性のイオン交換樹脂が、 酸性の夕 ンパク質の分離には弱塩基性のイオン交換樹脂が適していることが知られている。 このようにィォン交換性の置換基を導入することにより、 イオンーィォン相互作 用による分離により、 疎水性が同程度で分子量に差がなく疎水性相互作用のみで は分離が困難な化合物および夕ンパク質や核酸オリゴマーなどの生体分子などの 多くの物質への応用が広がることが期待できる。
しかしながら、 1種類の担体でしかも 1種類の物理刺激でイオン交換クロマ卜 グラフィ一および逆相ク口マトグラフィーを行い得る担体や疎水性が同程度で分 子量に差がなく疎水性相互作用のみでは分離が困難な化合物およびタンパク質や 核酸オリゴマーなどの生体分子などの多くの物質を効率的に分離することが可能 な担体はこれまで存在しなかった。 発明の開示
そこで、 本発明者らは上記の課題を解決すべく種々の観点から検討および開発 を行った。 その結果、 ポリ （N—イソプロピルアクリルアミド） （P I P AAm) に正電荷を持つジメチルァミノプロピルアクリルアミド （DMA P A Am) を共 重合させることでイオン交換機能をもった新しい充填剤を作製し、 これを用いて 温度によるコントロールを行えば逆相クロマトグラフィーとイオン交換クロマト グラフィ一の双方を行い得ることを見いだした。 また、 共重合体に電荷を持つも のを用いたことでポリマーの L C S Tを p Hによってもコントロールできること を見いだした。 本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
本発明は、 移動相を水系に固定したままで、 固定相表面の有効荷電密度を外的 刺激によって変化させることが可能である、 荷電を有する重合体あるいは共重合 体を含む充填剤を用いてクロマトグラフィ一による分離を行うことを特徴とする 物質の分離方法に関する。
また、 本発明は、 アミノ基、 力ルポキシル基、 或いは水酸基等を有するポリア ルキルアクリルアミドの共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤よ りなる固定相に物質を保持させた後、 外部温度を段階的に変化させる温度グラデ イエント法により固定相表面の親水性/疎水性のバランスを変化させ、 同一の移 動相を通過させることによって物質を分離することを特徴とする物質の分離方法 に関する。
さらに、 本発明は、 固定相表面の有効荷電密度を物理刺激によって変化させる ことが可能である、 荷電を有する共重合体を含むクロマトグラフィー用充填剤に 関する。
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、 固定相の表面構造を温度などの外的 な物理刺激で変化させることにより、 担体表面に存在するイオン交換基の荷電状 態を可逆的に制御しうる。すなわち、本発明は、単一の水系溶媒である移動相（水 系移動相） によって、 2つのモード、 即ちイオン交換クロマトグラフィーと逆相 クロマトグラフィーを同時に行い得る固定相を提供するものであり、 しかもィォ ン交換クロマトグラフィーのモードにおいては担体表面のイオン交換基の荷電を、 逆相クロマトグラフィ一では親水性ノ疎水性のバランスを自由に制御が可能な担 体を提供するものである。 なお、 ここでいう水系溶媒とは水のみ、 あるいは無機 塩類を含む水溶液であって、 有機溶媒を含まないものを意味する。
本発明は移動相を水系に固定したまま、 固定相の表面のイオン交換基周辺の物 性や構造を物理刺激により、 制御して表面のイオン交換基の電荷を調節すること によって分離を行うことを特徴とする分離精製担体を提供するものである。即ち、 本発明によれば、外部温度を臨界温度以下ではイオン交換基が担体表面に表出し、 分離する生体成分はイオン交換基との相互作用し、 イオン交換クロマトグラフィ 一のモードで分離する。 外部温度が臨界温度以上では表面に荷電が弱まり、 疎水 性が増大し、 逆相クロマトグラフィーのモードで分離が可能になる。 外部温度に より担体表面の親水性 Z疎水性バランスを可逆的に自由に変化することが可能と なる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 2に記載された 2種類の充填剤を用いてアスピリン、 サリチル 酸、 サリチル酸メチル、 安息香酸を分離した場合の温度と保持時間の関係を示す グラフである。
図 2は、 実施例 3において p Hを変えてアスピリン、 サリチル酸、 サリチル酸 メチル、 安息香酸を分離した場合の温度と保持時間の関係を示すグラフである。 図 3は、 実施例 4においてイオン強度を変えてアスピリン、 サリチル酸、 サリ チル酸メチル、 安息香酸を分離した場合の温度と保持時間の関係： ある。
図 4は、 実施例 5において I P A Amと D MA P AAmの重合比率を変えてァ スピリン、 サリチル酸、 サリチル酸メチル、 安息香酸を分離した場合の温度と保 持時間の関係を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法における外的な物理信号とは、 例えば温度変化である。 温度変化 により、 充填剤表面のイオン交換基周辺の物性や構造を変化させることは、 例え ば担体表面に温度応答性ポリマ一を導入することで達成される。 このような充填 剤は、 例えば、 担体表面を、 側鎖あるいは末端にアミノ基、 カルボキシル基、 あ るいは水酸基等を有するアルキルアクリルアミド重合体あるいはその共重合体で 化学修飾したクロマトグラフィ一用充填剤が挙げられる。 化学修飾した充填剤に は、 例えばシリカ担体に前記のアルキルアクリルアミド重合体あるいはその共重 合体で修飾したものを挙げることが出来る。 また、 イオン交換基の導入には前記 のアルキルアクリルアミドとァミノ基やカルボキシル基を有するコモノマーとの 共重合体で化学修飾することで得られる。
アミノ基を有するポリマーの構成単位としてジアルキルアミノアルキル（メタ） アクリルアミド、 ジアルキルアミノアルキル （メタ） ァクリレート、 アミノアル キル （メタ） ァクリレ一卜、 アミノスチレン、 アミノアルキルスチレン、 ァミノ アルキル （メタ） アクリルアミド、 アルキルォキシアルキルトリメチルアンモニ ゥム塩、 （メタ） アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニゥム塩等が挙げら れる。 また、 カルボキシル基を有するポリマーの構成単位としてアクリル酸、 メ タクリル酸、 スルホン酸を有するポリマーの構成単位として （メタ） アクリルァ ミドアルキルスルホン酸等が挙げられる。
本発明の方法において使用するポリアルキルアクリルアミドとしては、 下記に 示すポリ （N—イソプロピルアクリルアミド） 、 ポリジェチルアクリルアミド、 ポリ （N—プロピルアクリルアミド） およびポリアクリロイルピロリジンのいず れか一種、 或いはこれらのポリマーの構成単位とアルキルァクリレートもしくは アルキルメタクリレー卜との共重合体が望ましい。 化学式 1
ボリ一アルキルアクリルアミ ド
Figure imgf000008_0001
略号 ボリ（N -イソプロピルアクリルアミ ド） -CH<^3 ポリ（ΙΡΑΑΠΙ)
3
ポリ〔Ν,Ν' -ジェチルアクリルアミ ド） — ¾¾ — C2H5 ポリ（DEAAnu ボリ（ァク リ ロイルピロリ ジン） ボリ Py)
Figure imgf000008_0002
ポリ （N—プロピルアクリルアミ ド） -C3H7 ポリ （PWm)
化学式 2 共重合体
Figure imgf000009_0001
A ： 5 0〜6 0 %含有
ト （t=l~20)
ート（t=l~20)
Figure imgf000009_0002
ポリ （Ν—イソプロピルアクリルアミド） は 3 2 °Cに下限臨界温度を有するの で、 該分子で化学修飾した担体はこの臨界温度で親水性 Z疎水性の表面物性を大 きく変化させるため、 これをクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフトもし くはコ一ティングして使用した場合、 試料に対する保持力が温度によって変化さ せられる結果溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によってコントロール することが可能である。 下限臨界温度を 3 2 °C以上にするためには、 イソプロピ ルァクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、 アクリル酸、 ジメチルアクリルアミド、 ビニルピロリ ドンなどの親水性のコモノ マーを N—イソプロピルァクリルアミドと共重合させることによって調整するこ とが可能である。 また、 下限臨界温度を 3 2 °C以下にしたいときは、 疎水性モノ マ一であるスチレン、 アルキルメタクリレート、 アルキルァクリレートなどとの 疎水性のコモノマーとの共重合によって調整することができる。
また、 ポリジェチルアクリルアミドの下限臨界温度は、 約 3 0 〜3 2でであ り、 この温度を境として親水性/疎水性に表面物性が変化し、 前述のポリ （N— イソプロピルアクリルアミド） の場合と同様に、 試料に対する保持力を温度によ つて調整することができる。 本発明で利用される新規なクロマトグラフィー用担 体は、 化学修飾或いは高分子のコーティングによって作製される。 化学修飾手段 としては表面グラフト法とラジカル重合の 2つの方法を用いることができる。 ま たコーティング方法としては、 適用温度範囲内で不溶とした後、 不溶なものをコ 一ティングする。
上記したように、 温度応答性高分子を担体へ導入するための化学修飾法は表面 グラフト法とラジカル重合法を用いることができる。 表面グラフト法は一定の大 きさの温度応答性高分子を始めに合成して、 担体に接合する方法であるのに対し て、 ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方 法である。 表面グラフト法に比較し、 担体表面に密に温度応答性高分子を導入す ることが可能である。 担体表面の疎水性度を増大させ、 保持時間をコントロール しゃすくなる。 また、 担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着 を抑えることができる。
本発明の分離方法によって分離することができる物質としては、 金属元素 （例 えば、 C u 2+， Μ η '"等） 、 医薬品 （例えば、 ステロイド化合物、 解熱鎮痛剤等） 、 生体成分 （例えば、 ペプチド、 タンパク質、 核酸等） 等が挙げられる。 特に、 ィ オン交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーそれぞれ単独では分離す ることができない種々の生体成分の分離に有効である。 実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれによって 何ら限定されるものではない。 実施例 1 1. ポリマーの合成
1 - 1 ) ポリ （ I P AAm— DMAP AAm) (DMAP AAm： N, N—ジメ チルァミノプロピルアクリルアミド）
1 - 1 - a) カルボキシル末端基を持つ I P A Am共重合体の作製
カルボキシル末端基を持つ I P A Am共重合体を分子量 4000を目安として 合成した。 ここで共重合体の分子量は、連鎖移動剤である 3—メルカプトプロピ オン酸 （MPA) の量によって設定することができる。 分子量 4000の共重合 体を作製するには、 モル比で MP AZ ( I P AAm + DMAP AAm) =0. 0 28となるように MP Aの量を調整した。
精製モノマー I PAAm : 25. 0 g
カチオン性モノマー I P AAmに対しモル比で DMAP AAm5 %： 1. 7 2 g
ラジカル開始剤 2， 2 ' ーァゾビス （イソプチロニトリル） （A I BN) ： 0. 145 g
連鎖移動剤 （3—メルカプトプロピオン酸） 0. 691 g
DMF (N, N—ジメチルホルムアミド） 50m l
上表にある物質を重合管に人れ、 三方活栓を取り付け輪ゴムで固定した。 そし て、 コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中に入れ完全に凍結させ、 次にコッ クを開いて真空ポンプを用いて脱気した。 次に再びコックを閉じて重合管をメタ ノール中に入れ管内のサンプルを完全に溶解させた。 この操作を 3回繰り返した (凍結融解脱気法） 。 このように、 充分脱気したサンプルで減圧状態になってい る重合管を 70°Cの振とう恒温槽に入れ、 2時間ラジカル重合反応させ片末端に カルボキシル基を持つ共重合体を合成した。 反応後、 室温になるまで放置し、 溶 媒 （DMF) を 4 Otで減圧蒸留し濃縮し、 残留物を氷冷したジェチルエーテル に滴下しポリマーを得た。 得たポリマーを濾取し、 常温で一晩減圧乾燥し、 その 乾燥物をアセトンに溶かし再びジェチルェ一テルで精製した。 これによつて得た ポリマーを再び濾取しこれを常温で一晩減圧乾燥した。 ここで得たポリマ一を 5 % (w/v) の溶液になるように精製水にとかした。 これを分画分子量 500 の透析膜に移し 3日間透析を行った。 これによつて、 分子量のそろった純度の高 い共重合体を得た。
1 - 1 -b) I PA Am共重合体の担体への導入
(a) 活性エステル （スクシニル） 化法
合成した共重合体をスクシニル化するにあたり、 モル比で合成共重合体： N, N' —ジシクロへキシルカルボジイミド （N， N' — D i c y c 1 o h e xy 1 c a r bocl i im i d e (DCC) ) ： N—ヒドロキシスクシンイミド （N— Hyd r oxy s u c c i n imi d e) = 1 ： 2. 5 ： 2の割合になるように 調整した。
ナス型コルベンに合成共重合体を入れ、 半量の酢酸ェチル （25〜30mL) で溶かした後 N—ヒドロキシスクシンィミドと DC Cを加え残りの酢酸ェチルを 加え溶かした。 次に 4°Cの氷水に浸し 2時間ス夕一ラ一で撹拌し、 後に 25°Cに 設定した恒温槽に入れて一晚搅拌した。 溶液を濾過し、 副生成物であるジシクロ へキシル尿素を取り除き、減圧下で濃縮した。最後にジェチルェ一テルで精製し、 生成物を濾取 ·減圧乾燥して得られたスクシニル化共重合体を冷凍庫に保存した。
1一 1— c) 担体 （シリカゲル） への導入
スクシニル化した共重合体を、 溶媒に 1, 4一ジォキサンを用いて、 3回に分 けてアミノプロピルシリカゲルと反応させた。 反応温度は室温 （25°C) で行つ た。 まずスクシニル化ポリマー （1. 0 g) を 1， 4一ジォキサン （50mL) に溶かし、 振とう恒温槽中でアミノプロピルシリカゲル （3 g) と一晩反応させ た。 次に反応液を濾取したものと、 新たな共重合体 （1. O g) を再び 1， 4一 ジォキサン （50mL) に溶かし一晩反応させた。 この操作をもう一度繰り返し たり最後に濾取したものを、 メタノール （500mL) 、 蒸留水 （2L) で十分 洗浄し、 これを充填剤として減圧乾燥してデシケ一夕一に保存した。 実施例 2
1 -2) P I P AAmハイド口ゲル表面の作製
1 - 2 - a) ァミノプロピルシリカゲル表面へのゲル層の形成
はじめにァミノプロピルシリカゲルへ重合開始剤を導入するために下記の化合 物を使用した。 ァミノプロピルシリカゲル 5 g
V— 501 3. 5 g (12. 5mmo 1 )
EEDQ 6. 18 g (25. Ommo l)
DMF 50ml
上述の量で V—501 [4, 4 ' —ァゾビス （4—シァノバレリン酸 （4, 4 ' — a z o b i s ( 4-c yanov a l e r i c a c i d) ) (分子量： 28 0 · 28 ) ] を重合開始剤、 EEDQ [N—エトキシカルボニル— 2—エトキシ - 1 , 2—ジヒドロキノリン （N— E t hoxyc a r bony l— 2— e t h oxy— 1， 2-d i hyd r o qu i no l i n e) (分子量： 247. 30) ] を縮合剤として使用し、 これらとァミノプロピルシリカゲルを DMF中で反応さ せた。 これを遮光下で 30分間 N2 (窒素） ガスでバブリングしその後完全に N2 置換し、 N2風船をつけて室温で 6時間反応させた。 反応後ろ過してから DMFで 洗浄した。 これにより表面に重合開始剤を導入した。
1 - 2 -b) 表面ゲル層の形成
1— 2— aで作製した V— 501結合シリカゲル 4 g
I P AAm 10 g
B I S O. 27 g
E t OH 200ml
DMAPAAm I P A Amに対してモル比で 8 ： 2あるいは 9 ： 1にな る量を添加した。
シリカゲル、 I PAAm、 DMAPAA、 B I S [N, N' —メチレン一ビス (ァクリルアミド） （N, N' —Me t hy l e n e— b i s (a c r y 1 am i d e) ) (分子量： 154. 17) ] をエタノールに溶解させた。 これを遮光 下で 1時間 Ν2Λプリングしその後完全に N2置換し、 N2風船をつけて 70°C (油 浴） で 5時間反応させた。 これにより P I P AAm表面のゲル層を形成した。 反 応後ろ過したしてからメタノールと水で洗浄した。 これを充填剤として減圧乾燥 してデシケ一夕一に保存した。これをステンレスカラムに充填して分析に用いた。 実施例 3 正電荷ゲル （ I PA Am： DMAP AAm= 8 : 2) と I PA Amハイドロゲ ルを充填したカラムを用いて、 下記の分離条件でアスピリン（As p i r i n) , サリチル酸 （s a l i c y l i c a c i d) 、 サリチル酸メチル （me t hy 1 s a l i c y l a t e) 、 安息香酸 （b e nz o i c a c i d) を分離し た。
分離条件
カラム： （1) ポリ （I PAAm) ハイド口ゲル修飾シリカ充填カラム
(2) ポリ （I P AAm— c o— DMAP A Am) (8 ： 2) ハイド口 ゲル修飾シリカ充填カラム
緩衝液： Na2C〇3ZN aHC〇3
pH= 9. 0
イオン強度 =0. 1M
結果を図 1に示す。 I P AAmハイドロゲルを充填したカラムではアスピリン と安息香酸が分離出来ないが、 正電荷ゲル （I PAAm： DMAPAAm=8 ： 2) を充填したカラムではこれらの化合物の分離が可能となった。 特に 10 で は荷電性物質および非荷電物質を含む 4種すベての分離が 20分程度の短時間で 可能となった。 分離順序はこれらの化合物の疎水性度に依存している。 また温度 上昇に伴い、 保持時間 （r e t e n t i on t ime) がサリチル酸と安息香 酸では減少した。 これは、 温度上昇により温度応答性ポリマーの構造および物性 が変化し、 担体表面の荷電が減少して表面と溶質との相互作用が減少したことに よるものと考えられる。 電荷をもたないサリチル酸メチルでは逆に保持時間が上 昇している。 これは温度上昇により温度応答性ポリマーが疎水性に変化したため によると考えられる。 実施例 4 ： pHの変化による影響
実施例 3のポリ （ I PAAm— c 0—DMAP AAm) (8 : 2) ハイドロゲ ル修飾シリカ充填カラムを用いて、緩衝液として N a H P 04/H3C6H507 (クェ ン酸 · Η2〇 （一水和物） ） を用い、 ρΗ=7. 0とした以外は実施例 3と同じ方 法によりアスピリン、 サリチル酸、 サリチル酸メチル、 安息香酸を分離した。 結 果を図 2に示す。
図 2から、 pH9. 0に比べて pH7. 0ではすベての物質において保持時間 が増大したことがわかる。 これはァニオン性化合物は pH 7. 0でより正荷電を 有する担体表面と強く相互作用するためと考えられる。 したがって、 pHにより 分離する物質の保持時間を調節することが可能であることが示された。 実施例 5 ：イオン強度による影響
実施例 3のポリ （ I PAAm— c o_DMAPAAm) (8 : 2) ハイドロゲ ル修飾シリカ充填カラムを用いて、 下記の分離条件でアスピリン、 サリチル酸、 サリチル酸メチル、 安息香酸を分離した。
分離条件
緩衝液： NaHP04ZH3C6H5〇7
pH= 7. 0
イオン強度 = 1. 01^1ぉょび0. 1M
結果を図 3に示す。 イオン強度の増大 （0. 1M→1. 0M) により、 電荷を もたないサリチル酸メチルを除くすべてにおいて、 保持時間は減少し、 サリチル 酸メチルでは保持時間が増大した。 イオン強度の増大により、 担体表面のァミノ 基のプロトン化が抑制され、 正荷電が減少したために、 ァニオン性化合物との相 互作用が弱くなつたためと考えられる。 サリチル酸メチルではイオン強度の増大 にともなって担体表面の疎水性度が増大し、 疎水性相互作用が強くなつたためと 考えられる。 実施例 6 ： I P AAmと DMAP AAmの重合比率による影響
下記の分離条件でアスピリン、 サリチル酸、 サリチル酸メチル、 安息香酸を分 離した。
分離条件
カラム： （1) ポリ （ I PAAm— c o— DMAPAAm) (9 : 1) ハイド口 ゲル修飾シリカ充填カラム
(2) ポリ （I PAAm— c o— DMAP AAm) (8 ： 2) ハイド口 ゲル修飾シリカ充填カラム
緩衝液： N a H P 04/H3C6H507
p H= 7 . 0
イオン強度 = 0 . 1 M
結果を図 4に示す。 正荷電性のポリマーの増大により保持時間は増大した。 こ の結果から、 重合比率の変化により保持時間が調整可能であることがわかる。 産業上の利用の可能性
本発明は下記に示す利点を有する。
1 ) 担体表面に表出しているイオン交換体の荷電量を温度で自由に調節し、 移 動相の溶媒を変化させずに、 単一の水系の移動相で分離が可能である。
2 ) 一回の操作で溶質の疎水性およびイオン性の違いにより、 分離が可能であ る。 2回の分離操作が 1回で済み、 効率的であり、 回収率が向上する。
3〉 イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマトグラフィーそれぞれ単独で は分離できない生体成分の分離が可能になる
4 ) 酸や有機溶媒を用いずに分離し、 生体成分の活性を損なうことなく分離が 可能になる。
5 ) 充填剤の再生が従来のイオン交換体に比べ速やかに行うことが出来る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 移動相を水系に固定したままで、 固定相表面の有効荷電密度を物理刺激に よって変化させることが可能である、 荷電を有する重合体あるいは共重合体を含 む充填剤を用いてクロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とする物質の 分離方法。
2 . 物理刺激が温度変化である請求項 1記載の分離方法。
3 . 充填剤が、 担体表面に温度応答性高分子で化学修飾したクロマトグラフィ 一用充填剤である請求項 2記載の分離方法。
4 . 充填剤が、 ラジカル重合法を用いて温度応答性高分子で化学修飾したクロ マトグラフィ一用充填剤である請求項 3記載の分離方法。
5 . 温度応答性高分子が、 担体表面を側鎖あるいは末端にアミノ基、 カルボキ シル基、 あるいは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミドの重合体および 共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤である請求項 3または 4記 載の分離方法。
6 . ポリアルキルァクリルアミドが、ポリ （N—イソプロピルァクリルアミド）、 ポリ （N—プロピルアクリルアミド） 、 ポリジェチルアクリルアミドまたはポリ ァクリロイルピロリジンのいずれか一種である請求項 5記載の分離方法。
7 . 物質が金属元素、 医薬品、 および生体成分から選択される請求項 1ないし 6のいずれか 1項記載の分離方法。
8 . アミノ基、 カルボキシル基、 或いは水酸基等を有するポリアルキルァクリ ルアミドの共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤よりなる固定相 に物質を保持させた後、 外部温度を段階的に変化させる温度ダラディエント法に より固定相表面の親水性ノ疎水性のバランスを変化させ、 同一の移動相を通過さ せることによって物質を分離することを特徴とする物質の分離方法。
9 . 移動相が水系溶媒である請求項 8記載の分離方法。
1 0 . ポリアルキルアクリルアミドが、 ポリ （N—イソプロピルアクリルアミ ド） 、 ポリ （N—プロピルアクリルアミド） 、 ポリジェチルアクリルアミドまた はポリアクリロイルビロリジンのいずれか一種である請求項 8または 9のいずれ か 1項記載の分離方法。
1 1 . 物質が金属元素、 医薬品、 および生体成分から選択される請求項 8ない し 1 0のいずれか 1項記載の分離方法。
1 2 . 固定相表面の有効荷電密度を物理刺激によって変化させることが可能で ある、荷電を有する重合体あるいは共重合体を含むクロマトグラフィー用充填剤。
1 3 . 重合体あるいは共重合体がアミノ基、 力ルポキシル基、 或いは水酸基等 を有するポリアルキルアクリルアミドの共重合体である請求項 1 2記載のクロマ トグラフィ一用充填剤。
1 4. ポリアルキルアクリルアミドが、 ポリ （N—イソプロピルアクリルアミ ド） 、 ポリ （N—プロピルアクリルアミド） 、 ポリジェチルアクリルアミドまた はポリアクリロイルピロリジンのいずれか一種である請求項 1 2または 1 3記載 のクロマトグラフィー用充填剤。
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