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WO2014181796A1 - 精製装置及び精製方法 - Google Patents

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WO2014181796A1
WO2014181796A1 PCT/JP2014/062249 JP2014062249W WO2014181796A1 WO 2014181796 A1 WO2014181796 A1 WO 2014181796A1 JP 2014062249 W JP2014062249 W JP 2014062249W WO 2014181796 A1 WO2014181796 A1 WO 2014181796A1
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WO
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temperature
binding
target substance
polyamino acid
substance
Prior art date
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PCT/JP2014/062249
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English (en)
French (fr)
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啓介 渋谷
惟 杉田
良一 芳賀
勝 難波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
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Publication date
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Priority to US14/787,428 priority patent/US9981205B2/en
Priority to DK14794907.7T priority patent/DK2995945T3/en
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
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    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column

Definitions

  • the present invention relates to a purification apparatus and a purification method.
  • Useful substances produced by culturing are used in various fields.
  • antibody drugs can be mentioned as useful substances.
  • the antibody drug can be obtained by culturing animal cells and purifying the culture solution.
  • useful substances When culturing animal cells, useful substances are secreted extracellularly. Therefore, useful substances are purified using chromatography after removing cells. On the other hand, when culturing microorganisms, useful substances are secreted into cells. Therefore, useful substances are purified using chromatography after disrupting cells and removing solids.
  • An antibody drug which is an example of a useful substance, is generally purified through a crude purification step, a middle purification step, and a final purification step using a plurality of chromatography.
  • affinity chromatography is used in the crude purification step
  • hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, or the like is used in the intermediate purification step and the final purification step.
  • Patent Documents 1 to 4 can be cited as background art in this technical field.
  • an object of the present invention is to provide a purification apparatus and a purification method capable of purifying a useful substance without using an acidic eluent.
  • a carrier, a temperature-responsive polyamino acid bound to the carrier, and a binding substance bound to the temperature-responsive polyamino acid specifically bind to a useful substance (target substance). It has been found that by using a column packed with a packing material containing a binding substance, the target substance can be purified by temperature control without using an acidic eluent.
  • the target substance can be purified without using an acidic eluent.
  • FIG. 1 shows a preferred embodiment of a purification apparatus according to the present invention.
  • An example of a temperature-responsive polyamino acid is shown.
  • the structural change of a temperature-responsive polyamino acid is shown.
  • An example of the synthesis of temperature-responsive polyglutamic acid is shown.
  • An example of the synthesis of temperature-responsive polyasparagine is shown.
  • the binding reaction between a binding substance (N-terminal: Cys) and a polyamino acid (C-terminal: thiol) is shown.
  • the difference in the purification method between the temperature-responsive column and the conventional column is shown.
  • the resin plate which gave the amino group process to the surface is shown.
  • the result of adsorption / desorption evaluation by temperature control is shown.
  • the present invention is a purification comprising a column packed with a packing comprising a carrier, a temperature-responsive polyamino acid bound to the carrier, and a binding substance specifically bound to the target substance bound to the temperature-responsive polyamino acid. Relates to the device.
  • the carrier is not particularly limited as long as it can bind a temperature-responsive polyamino acid.
  • a carrier packed in a general affinity chromatography column can be used.
  • the carrier may have been subjected to a chemical treatment for allowing the surface to bind to the temperature-responsive polyamino acid.
  • the temperature-responsive polyamino acid can change its three-dimensional structure in response to a change in temperature. Since the change in the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid due to the temperature change affects the binding between the binding substance and the target substance, the binding of the target substance to the binding substance and the binding substance to the target substance Can be separated.
  • the temperature-responsive polyamino acid forms a three-dimensional structure that allows the target substance to bind to the binding substance (protein A) at 20 ° C. or lower, and binds to the binding substance at 37 ° C.
  • a three-dimensional structure that separates target substances can be formed.
  • the change in the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid due to a temperature change since the change in the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid due to a temperature change is used, it is not necessary to use an acidic eluent. Therefore, purification of the target substance can be performed under neutral conditions, and aggregation of the target substance and a decrease in activity can be avoided. As a result, the quality and productivity of the target substance can be improved. In addition, since the change in the three-dimensional structure is reversible, the temperature-responsive polyamino acid can be reused.
  • phase transition The change in the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid can be observed as a phase transition, for example.
  • phase transition examples include sol-gel transition.
  • the change in the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid preferably occurs, for example, in the range of 0 to 60 ° C, and particularly preferably in the range of 4 to 40 ° C.
  • a temperature range deterioration of the target substance can be suppressed.
  • freezing of the buffer used for eluting the target substance, precipitation of salts in the buffer, and the like can be avoided.
  • temperature-responsive polyamino acid examples include polylysine, polyglutamic acid, polyasparagine and the like. Side chains may be introduced into these polyamino acids.
  • the temperature at which the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid changes can be appropriately adjusted by changing the molecular weight, side chain, etc. of the polyamino acid.
  • the preferred molecular weight of the temperature-responsive polyamino acid varies depending on the type of polyamino acid, but is, for example, 1 to 20 kilodalton (kDa), preferably 2 to 18 kDa, and particularly preferably 3 to 16 kDa.
  • the side chain of the temperature-responsive polyamino acid examples include an amphiphilic group, a hydrophobic group, and a hydrophilic group.
  • the temperature-responsive polyamino acid preferably has an amphiphilic group as a side chain.
  • the temperature-responsive polyamino acid preferably has both a hydrophobic group and a hydrophilic group as side chains.
  • amphiphilic groups include valeric acid groups and butyric acid groups.
  • hydrophobic group include an alkylamine group, more specifically a dodecylamine group.
  • hydrophilic group include an amino alcohol group, more specifically, a 3-aminopropanol group.
  • Examples of the temperature-responsive polyamino acid having a side chain include polyasparagine containing a monomer unit having a dodecylamine side chain and a monomer unit having an amino alcohol side chain, as shown in FIG. .
  • n represents the degree of polymerization of polyasparagine
  • x represents the number of carbon atoms of the alkylene group.
  • the polyasparagine having a side chain can be synthesized, for example, by introducing an amino alcohol side chain or the like into polysuccinimide as shown in FIG. Moreover, the polyglutamic acid which has a side chain is compoundable by introduce
  • the bond between the temperature-responsive polyamino acid and the carrier only needs to have a binding strength that does not separate under the purification conditions of the target substance.
  • Examples of such a bond include a covalent bond, more specifically, an amide bond and an ester bond.
  • the binding substance is not particularly limited as long as it has an ability to specifically bind to a specific target substance. Therefore, a binding substance can be appropriately selected or produced according to the type of target substance. Although not particularly limited, it is preferable to use a protein, more specifically, protein A as the binding substance.
  • the binding between the binding substance and the temperature-responsive polyamino acid only needs to have a binding strength that does not separate under the purification conditions of the target substance.
  • a bond include a covalent bond, more specifically, an amide bond and an ester bond.
  • the target substance is not particularly limited.
  • the target substance is preferably a low-molecular compound or a high-molecular compound having physiological activity, preferably a protein such as an antibody or an enzyme, and particularly preferably an antibody that can be used as a medicine.
  • a target substance can be produced, for example, by culturing using animal cells, plant cells, insect cells, yeasts, bacteria, fungi, algae and the like.
  • the bond between the target substance and the binding substance only needs to have a binding force that can be separated by a change in the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid.
  • binding include interactions acting between substances such as ion affinity, adsorption affinity, and hydrophobic affinity.
  • the purification apparatus may further include a temperature adjusting means for changing the temperature of the temperature-responsive polyamino acid in the range of, for example, 0 to 60 ° C., preferably 4 to 40 ° C.
  • a temperature adjusting means for changing the temperature of the temperature-responsive polyamino acid in the range of, for example, 0 to 60 ° C., preferably 4 to 40 ° C.
  • the temperature adjusting means By providing the temperature adjusting means, the three-dimensional structure of the temperature-responsive polyamino acid can be changed, and the target substance can be bound to the binding substance and the target substance can be separated from the binding substance. Further, by providing the temperature adjusting means, the temperature can be controlled so that the target substance does not deteriorate. Examples of such temperature adjusting means include a heater that heats a tank that stores an eluent, and a heater that heats a column.
  • the purification apparatus may further include means for further purifying the target substance purified by the column.
  • examples of such means include an anion exchange column filled with an anion exchange resin and a cation exchange column filled with a cation exchange resin.
  • the purification device may further include virus inactivation / removal means for the target substance purified by the column.
  • virus inactivation / removal means include an ultra (UF) filtration device, a nano filter (NF) filtration device, a liquid heat treatment device, and an organic solvent / surfactant (S / D) treatment device.
  • UF ultra
  • NF nano filter
  • S / D organic solvent / surfactant
  • FIG. 1 A preferred embodiment of a purification apparatus according to the present invention is shown in FIG.
  • an anion exchange column 3, a cation exchange column 4, a UF filtration device 5, and a sterilization filter 8 are sequentially installed downstream of the affinity column 2.
  • the column containing the temperature-responsive polyamino acid and the binding substance of the present invention is used as the affinity column 2.
  • a culture medium receiving tank 1, a cooling device 7 and an eluent tank 6 are installed upstream of the affinity column 2.
  • the cooling device 7 is a device for cooling the culture solution cultured at a constant temperature (for example, 37 ° C.) to 20 ° C. or less in the culture process.
  • the cooling method is a method by circulation of water, but is not limited to this method.
  • a fraction tank 9 that separates and stores a plurality of components contained in a solution treated in each column, and a receiving tank that receives and stores the solution. 10 is arbitrarily installed as needed.
  • the present invention also relates to a method for purifying a target substance including a binding step, a washing step, a separation step, and an elution step.
  • a filler comprising: a carrier; a temperature-responsive polyamino acid bound to the carrier; and a binding substance that is bound to the temperature-responsive polyamino acid and specifically binds to the target substance.
  • a solution containing the target substance and impurities is passed through the packed column to bind the target substance to the binding substance.
  • the carrier the temperature-responsive polyamino acid, the binding substance, and the target substance is as described above.
  • the solution containing the target substance and impurities include a culture solution obtained by culturing using animal cells, plant cells, insect cells, yeast, bacteria, fungi, algae, and the like.
  • the temperature in the binding step may be any temperature at which the temperature-responsive polyamino acid forms a three-dimensional structure that allows the target substance to bind to the binding substance.
  • the bonding step is preferably performed at 0 to 60 ° C., preferably 2 to 20 ° C., particularly preferably 4 to 10 ° C.
  • the pH in the binding step is, for example, 5 to 9, preferably 6 to 8.
  • the column is washed by washing away impurities without separating the target substance bound to the binding substance.
  • the solvent used in the washing step is not particularly limited as long as it does not adversely affect the binding between the binding substance and the target substance.
  • the temperature and pH in the washing step are preferably the same conditions as in the binding step.
  • As a solvent used in the washing step for example, 20 mM sodium phosphate having pH 7.5, 0.8 M ammonium sulfate, or the like can be used.
  • the temperature-responsive polyamino acid is subjected to a temperature change to separate the target substance bound to the binding substance.
  • the temperature in the separation step may be a temperature at which the temperature-responsive polyamino acid forms a three-dimensional structure that separates the target substance bound to the binding substance.
  • the separation step is preferably performed at 0 to 60 ° C., preferably 20 to 50 ° C., particularly preferably 35 to 40 ° C.
  • the pH in the separation step is, for example, 5 to 9, preferably 6 to 8.
  • the separated target substance is eluted.
  • the solvent used for elution of the target substance may be the same as or different from the solvent used in the washing step.
  • the temperature and pH in the elution step are preferably the same conditions as in the separation step.
  • the purification method may include a step of further purifying the target substance eluted in the elution step using an anion exchange column and / or a cation exchange column.
  • the purification method includes a step of performing virus inactivation / removal treatment on the target substance eluted in the elution step or the target substance further purified using an ion exchange column. Also good. It is preferable to perform the step of performing virus inactivation / removal treatment twice or more.
  • the step of performing the virus inactivation / removal process can be performed by the virus inactivation / removal means already described.
  • the temperature-responsive polylysine can be prepared, for example, as follows. Water-soluble carbodiimide (WSC) (290 mg), N-hydroxysuccinimide (NHS) (170 mg), and valeric acid (130 ⁇ l) in distilled water or phosphate buffer (PBS) (pH 5.8) in a glass container (pH 5.8) ( 4 ml). The resulting solution is cooled to 4 ° C., polylysine (140 mg) is added and allowed to react overnight (may be reacted at 37 ° C. for 2 hours). Next, this reaction solution is stirred for 24 hours in pure water at room temperature using a dialysis membrane (cut-off molecular weight 2000, manufactured by Spectra / Pore) to remove unreacted substances, followed by isolation and purification.
  • WSC Water-soluble carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • valeric acid 130 ⁇ l
  • PBS phosphate buffer
  • PBS phosphate buffer
  • PBS phosphate
  • the temperature-responsive polyasparagine can be prepared, for example, as follows. N, N-dimethylformamide (DMF) (34 g) is placed in a separable flask (stirrer, thermometer), and polysuccinimide (PSI) (9.7 g, 0.1 mol) is dissolved. Then dodecylamine (6.5 g, 0.035 mol) and 2-methoxyethylamine (4.9 g, 0.065 mol) are added to the solution and reacted at 70 ° C. for 6 hours. And this reaction liquid is put into a lot of acetonitrile, and deposits are collect
  • DMF N-dimethylformamide
  • PSI polysuccinimide
  • the binding between the binding substance and the temperature-responsive polyamino acid can be performed, for example, as follows.
  • the N-terminus of the binding substance is cysteine (Cys)
  • the binding substance and the polyamino acid can be bound by adding a thiol group to the C-terminus of the polyamino acid (see FIG. 6).
  • R in FIG. 6 is, for example, H.
  • the two substances are linked by reaction of the C-terminal thioester of the polyamino acid with the N-terminal cysteine of the binding substance.
  • the thiol group in the side chain of cysteine selectively reacts with the carbonyl carbon of the thioester group (chemoselective reaction), and a thioester bond initial intermediate is generated by thiol exchange reaction.
  • This intermediate spontaneously undergoes intramolecular rearrangement (spontaneous transition) to form a natural amide bond at the linking site while regenerating cysteine side chain thiols.
  • Raney nickel is used to selectively desulfurize (selectively desulfurize) the thiol group of the product to generate a natural target sequence (ie, the binding substance and the temperature-responsive polyamino acid can be bound).
  • reaction between binding substance and temperature-responsive polyamino acid can be performed, for example, as follows.
  • peptide eg, polyamino acid
  • Cys-peptide eg, protein A
  • Methods for adding a thioester to the C-terminus of a polyamino acid and adding Cys to the N-terminus of a binding substance are described separately.
  • a DNA encoding the target protein (binding substance) gene is inserted into the multicloning site (eg, SalI-PstI) of the pTYB21 vector.
  • the multicloning site eg, SalI-PstI
  • a target protein in which a tag composed of intein and chitin-binding domain (CBD) is fused to the N-terminus can be produced.
  • the produced target protein is bound to chitin beads, and the target protein (binding substance) with cysteine added to the N-terminus is cleaved from the beads with a thiol reagent (dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanesulfonic acid). N-terminal cysteine added protein (binding substance) can be recovered.
  • a thiol reagent dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanesulfonic acid
  • DNA encoding a polyamino acid sequence is inserted into a multi-cloning site (eg, Ndel-SalI or Spel) of the pTXB1 vector.
  • a multi-cloning site eg, Ndel-SalI or Spel
  • a polyamino acid in which a tag composed of intein and chitin-binding domain (CBD) is fused to the C-terminus can be produced.
  • the produced polyamino acid is bound to chitin beads, and the polyamino acid having a thioester added to the C-terminus can be cleaved from the beads with a thiol reagent (DTT or 2-mercaptoethanesulfonic acid). Amino acids can be recovered.
  • a thiol reagent DTT or 2-mercaptoethanesulfonic acid
  • thermoresponsive polyamino acid can be immobilized on a carrier in the same manner as other ligand proteins.
  • immobilization on a carrier is given, but other immobilization methods can also be implemented.
  • the blocking buffer (6 ml) is fed into the column at a flow rate of 1 drop / second (or 1-2 ml / min).
  • wash buffer (6 ml) is fed into the column at a flow rate of 1 drop / second (or 1-2 ml / min).
  • blocking buffer (6 ml) is fed into the column at a flow rate of 1 drop / second (or 1-2 ml / min) and left at room temperature for 15-30 minutes or at 4 ° C. for 4 hours.
  • 500 mM monoethanolamine of pH 8.3 was demonstrated here as a blocking buffer
  • 500 mM sodium chloride can also be used.
  • cleaning buffer was demonstrated, 500 mM sodium chloride can also be used.
  • the equilibration buffer is fed into the column at a flow rate of 1 drop / second (or 1 to 2 ml / min), and the ligand-immobilized column (temperature-responsive polyamino acid-immobilized column (temperature-responsive specific adsorption / desorption column)) is used.
  • the ligand-immobilized column temperature-responsive polyamino acid-immobilized column (temperature-responsive specific adsorption / desorption column)
  • a equilibration buffer for example, a 0.1 M phosphate buffer solution having a pH of 7.4 can be used.
  • a method of improving the amount of adsorption per unit volume of the carrier by aligning the orientation of the ligand (temperature-responsive polyamino acid) on the carrier is also possible.
  • a temperature-responsive specific adsorption / desorption column prepared as described above that is, a carrier, a temperature-responsive polyamino acid bound to the carrier, and a target substance bound to the temperature-responsive polyamino acid
  • Column containing a binding substance to be flowed
  • a culture / recovery solution having a temperature of 20 ° C. or lower is allowed to flow
  • the antibody protein as the target substance is adsorbed onto the column.
  • a buffer solution (20 mM phosphate, pH 7.0) heated to 37 ° C. is passed through the column to elute the antibody protein.
  • FIG. 7 shows the difference between a temperature-responsive specific adsorption / desorption column and a conventional protein A column (a column containing a carrier to which protein A is bound).
  • the purification comprises a binding step (FIG. 7 (a) binding), a washing step (FIG. 7 (b) washing), and a separation / elution step (FIG. 7 (c) separation, (d) elution).
  • the culture solution containing the antibody and impurities is passed through the column.
  • the column is packed with protein A binding beads, and antibodies bind to the beads but not impurities. Thoroughly remove impurities by washing.
  • the separation / elution step the antibody is separated from the protein A binding bead by weakening the binding force between the antibody and the protein A binding bead.
  • the binding step and the washing step are performed at neutral pH and room temperature, and the separation and elution step are performed at room temperature and low pH, thereby increasing the binding force between the antibody and the protein A binding beads.
  • Weaken and elute antibody when the antibodies are exposed to a low pH, the antibodies bind to each other to form an aggregate (aggregate induction). This is not preferable because the yield of high-quality antibodies is reduced.
  • the binding step and the washing step are performed at low temperatures (for example, 20 ° C. or lower), the binding force is changed by performing the separation / elution step at a higher temperature, and the antibody is eluted (for example, 37 ° C.). That is, in the purification apparatus according to the present invention, all steps are performed at a neutral pH, and the temperature change is performed within a range that does not denature the antibody. Therefore, the purification apparatus according to the present invention can be obtained without aggregating the antibody. In addition, the purification apparatus according to the present invention can increase the yield of high-quality antibodies.
  • Temperature-responsive polylysine was prepared according to the following procedure. 1-ethyl-3-carbodiimide (WSC) (290 mg), N-hydroxysuccinimide (NHS) (170 mg), and valeric acid (130 mg) were dissolved in pure water (4 ml), and this solution was cooled to 4 ° C. and stirred. ⁇ polylysine (mixed with various molecular weights) (140 mg) was added. After stirring at room temperature for 2 hours, the mixture was further stirred for 24 hours using a dialysis membrane to remove unreacted low molecular weight substances.
  • WSC 1-ethyl-3-carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • valeric acid 130 mg
  • temperature-responsive polylysine having a molecular weight of 3.5 kDa or more Three types of temperature-responsive polylysine having a molecular weight of 3.5 kDa or more, temperature-responsive polylysine having a molecular weight of 10 kDa or more, and temperature-responsive polylysine having a molecular weight of 20 kDa or more were prepared depending on the type of dialysis membrane.
  • the above-mentioned conventional method is a method in which an injection-molded polystyrene plate is treated for 3 minutes by generating high-frequency and low-temperature plasma while ventilating oxygen gas under reduced pressure, and then 10% methanol solution of ⁇ -aminopropyltrimethoxysilane. After being immersed in the substrate and allowed to stand for 16 hours for aminosilane treatment, it is washed with distilled water and dried to form amino groups on the surface.
  • Blocking was performed with 5% skim milk so that non-specific adsorption of proteins other than protein A did not occur in the wells of the resin plate.
  • Each well was washed 3 times with wash buffer (200 ⁇ l), 50 ⁇ l of biotinylated antibody was added, and incubated at 4 ° C. overnight.
  • Each well was washed three times using a washing buffer (200 ⁇ l) while maintaining at 4 ° C., and 50 ⁇ l of streptavidin-peroxidase conjugate was added and incubated at 4 ° C. overnight.
  • wash buffer 200 ⁇ l
  • streptavidin-peroxidase conjugate was added and incubated at 4 ° C. overnight.
  • the measurement results of absorbance are shown in FIG.
  • the molecular weight of polylysine is ⁇ 3.5 kDa and ⁇ 10 kDa
  • the absorbance is higher at 4 ° C. than at 37 ° C. (binding at 4 ° C. and separation at 37 ° C.).
  • the binding power of protein A to the antibody (IgG) is high, and the binding power is particularly high when the molecular weight is ⁇ 10 kDa.
  • the molecular weight is ⁇ 20 kDa, there is no difference between the conditions of 4 ° C. and 37 ° C., and the binding by temperature control is not changed.
  • SYMBOLS 1 Medium receiving tank, 2 ... Affinity column, 3 ... Anion exchange column, 4 ... Cation exchange column, 5 ... UF filtration apparatus, 6 ... Eluent tank, 7 ... Cooling device, 8 ... Sanitization filter, 9 ... Fraction tank, 10 ... Receiving tank

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Abstract

本発明は、酸性の溶離液を用いることなく有用物質を精製することのできる精製装置を提供することを課題とする。前記課題は、カラムと、当該カラムに充填された充填剤とを備える、標的物質の精製装置であって、前記充填剤が、担体と、当該担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、当該温度応答性ポリアミノ酸に結合した結合性物質であり、標的物質に特異的に結合する結合性物質と、を含む、精製装置によって解決することができる。

Description

精製装置及び精製方法
　本発明は精製装置及び精製方法に関する。
　培養により生産した有用物質は、様々な分野で利用されている。例えば、有用物質として抗体医薬を挙げることができる。抗体医薬は、動物細胞を培養し、培養液を精製することにより得ることができる。
　動物細胞を培養する場合、有用物質は細胞外に分泌される。そのため、有用物質は、細胞を除去した後にクロマトグラフィーを用いて精製される。一方、微生物を培養する場合、有用物質は細胞内に分泌される。そのため、有用物質は、細胞を破砕し、固形物を除去した後にクロマトグラフィーを用いて精製される。
　有用物質の一例である抗体医薬は、一般的に、複数のクロマトグラフィーを用いた粗精製工程、中間精製工程、及び最終精製工程を経て精製される。ここで、粗精製工程ではアフィニティークロマトグラフィーが使用され、中間精製工程及び最終精製工程では疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等が使用される。
　なお、本技術分野の背景技術としては、特許文献１～４等を挙げることができる。
国際公開第０１／０７４４８２号パンフレット 特開２００２－１１９８５４号公報 国際公開第０８／１５６１２４号パンフレット 特表２００９－５２０６９１号公報
　特許文献１～４に記載されているアフィニティークロマトグラフィーなどを用いて有用物質を精製する場合、酸性の溶離液を用いて有用物質を溶出させる。しかし、酸性の溶離液を用いると、有用物質の凝集化や活性の低下が引き起こされ、品質が低下するおそれがある。
　そこで、本発明は、酸性の溶離液を用いることなく有用物質を精製することのできる精製装置及び精製方法を提供することを目的とする。
　本発明者らが鋭意検討した結果、担体と、担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、温度応答性ポリアミノ酸に結合した結合性物質であり、有用物質（標的物質）に特異的に結合する結合性物質と、を含む充填剤を充填したカラムを使用することにより、酸性の溶離液を用いることなく、温度制御によって標的物質を精製できることを見出した。
　本発明によれば、酸性の溶離液を用いることなく標的物質を精製することができる。
本発明に係る精製装置の好ましい実施形態を示す。 温度応答性ポリアミノ酸の一例を示す。 温度応答性ポリアミノ酸の構造変化を示す。 温度応答性ポリグルタミン酸の合成の一例を示す。 温度応答性ポリアスパラギンの合成の一例を示す。 結合性物質（Ｎ末端：Ｃｙｓ）とポリアミノ酸（Ｃ末端：チオール）との結合反応を示す。 温度応答性カラムと従来カラムとの精製方法の違いを示す。 表面にアミノ基処理を施した樹脂プレートを示す。 温度制御による吸脱着評価の結果を示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
＜精製装置＞
　本発明は、担体と、担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、温度応答性ポリアミノ酸に結合した、標的物質に特異的に結合する結合性物質とを含む充填剤を充填したカラムを備える精製装置に関する。
　担体は、温度応答性ポリアミノ酸を結合できるものであれば特に限定されない。例えば、一般的なアフィニティークロマトグラフィー用のカラムに充填されている担体を使用することができる。担体は、表面が温度応答性ポリアミノ酸との結合を可能にするための化学的処理が施されたものであってもよい。
　温度応答性ポリアミノ酸は、温度の変化に応じてその立体構造を変化させることができる。温度変化による温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化が、結合性物質と標的物質との間の結合に影響を与えるため、結合性物質に標的物質を結合させること、及び結合性物質から標的物質を分離させることが可能となる。
　例えば、図３に示すように、温度応答性ポリアミノ酸は、２０℃以下では結合性物質（プロテインＡ）に標的物質が結合できるような立体構造を形成し、３７℃では結合性物質に結合した標的物質を分離させるような立体構造を形成することができる。
　本発明では温度変化による温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化を利用するため、酸性の溶離液を使用する必要はない。そのため、標的物質の精製を中性条件下で行うことができ、標的物質の凝集化や活性の低下を回避することができる。この結果、標的物質の品質及び生産性を向上させることができる。また、立体構造の変化は可逆的であるため、温度応答性ポリアミノ酸は再利用することが可能である。
　温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化は、例えば、相転移として観察することができる。このような相転移としては、例えば、ゾル－ゲル転移を挙げることができる。
　温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化は、例えば、０～６０℃の範囲で生じることが好ましく、４～４０℃の範囲で生じることが特に好ましい。このような温度範囲では、標的物質の劣化を抑制することができる。また、このような温度範囲では、標的物質を溶出させるために使用する緩衝液の凍結、緩衝液中の塩の析出等を回避することができる。
　温度応答性ポリアミノ酸としては、例えば、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン等を挙げることができる。これらのポリアミノ酸には側鎖が導入されていてもよい。
　温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化が生じる温度は、ポリアミノ酸の分子量、側鎖等を変更することによって適宜調節することができる。
　温度応答性ポリアミノ酸の好ましい分子量は、ポリアミノ酸の種類によって異なるが、例えば、１～２０キロダルトン（ｋＤａ）であり、好ましくは２～１８ｋＤａであり、特に好ましくは３～１６ｋＤａである。
　温度応答性ポリアミノ酸の側鎖としては、両親媒性基、疎水性基、及び親水性基を挙げることができる。具体的には、温度応答性ポリアミノ酸が、側鎖として両親媒性基を有することが好ましい。また、温度応答性ポリアミノ酸が、側鎖として疎水性基及び親水性基を共に有することが好ましい。
　両親媒性基としては、例えば、吉草酸基、酪酸基等を挙げることができる。疎水性基としては、例えば、アルキルアミン基、より具体的にはドデシルアミン基等を挙げることができる。親水性基としては、例えば、アミノアルコール基、より具体的には３－アミノプロパノール基等を挙げることができる。
　側鎖を有する温度応答性ポリアミノ酸としては、例えば、図２に示すような、ドデシルアミン側鎖を有するモノマー単位と、アミノアルコール側鎖を有するモノマー単位と、を含むポリアスパラギンを挙げることができる。なお、図２中のｎはポリアスパラギンの重合度を示し、ｘはアルキレン基の炭素数を示す。
　側鎖を有するポリアスパラギンは、例えば、図５に示すように、ポリスクシンイミドにアミノアルコール側鎖等を導入することにより合成することができる。また、側鎖を有するポリグルタミン酸は、例えば、図４に示すように、ポリグルタミン酸にアミノアルコール側鎖等を導入することにより合成することができる。なお、図５及び図４中のｎは、ポリ(γ－グルタミン酸)の重合度を示す。
　温度応答性ポリアミノ酸と担体との間の結合は、標的物質の精製条件において分離しない程度の結合力を有していればよい。このような結合としては、例えば、共有結合、より具体的には、アミド結合、エステル結合等を挙げることができる。
　結合性物質は、特定の標的物質に特異的に結合する能力を有するものであれば特に限定されない。そのため、標的物質の種類に応じて、結合性物質を適宜選択又は作製することができる。特に限定するものではないが、結合性物質としてタンパク質、より具体的にはプロテインＡを使用することが好ましい。
　結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸との間の結合は、標的物質の精製条件において分離しない程度の結合力を有していればよい。このような結合としては、例えば、共有結合、より具体的には、アミド結合、エステル結合等を挙げることができる。
　標的物質は特に限定されない。例えば、標的物質は、生理活性を有する低分子化合物や高分子化合物などであることが好ましく、抗体、酵素等のタンパク質であることが好ましく、医薬として使用可能な抗体であることが特に好ましい。このような標的物質は、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌、真菌、藻類等を用いた培養によって生産することができる。
　標的物質と結合性物質との間の結合は、温度応答性ポリアミノ酸の立体構造の変化によって分離する程度の結合力を有していればよい。このような結合としては、例えば、イオン親和力、吸着親和力、疎水性親和力等の物質間に働く相互作用を挙げることができる。
　本発明の一実施形態において、精製装置は、温度応答性ポリアミノ酸の温度を、例えば、０～６０℃、好ましくは４～４０℃の範囲で変化させる温度調節手段を更に備えていてもよい。温度調節手段を備えることにより、温度応答性ポリアミノ酸の立体構造を変化させることができ、結合性物質に標的物質を結合させること、及び結合性物質から標的物質を分離させることが可能となる。また、温度調節手段を備えることにより、標的物質が劣化しないように温度を制御することができる。このような温度調節手段としては、例えば、溶離液を貯蔵するタンクを加温する加温器、カラムを加温する加温器等を挙げることができる。
　本発明の一実施形態において、精製装置は、前記カラムで精製した標的物質を更に精製するための手段を更に備えていてもよい。このような手段として、例えば、陰イオン交換樹脂を充填した陰イオン交換カラム、陽イオン交換樹脂を充填した陽イオン交換カラム等を挙げることができる。本発明においては酸性の溶離液を使用する必要がないため、酸性の溶離液によるイオン交換カラムの損傷を回避することができる。
　本発明の一実施形態において、精製装置は、前記カラムで精製した標的物質に対するウイルス不活性化・除去手段を更に備えていてもよい。ウイルス不活性化・除去手段としては、例えば、限外（ＵＦ）濾過装置、ナノフィルター（ＮＦ）濾過装置、液状加熱処理装置、有機溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理装置等を挙げることができる。従来の精製装置では、酸性の溶離液の使用によってウイルスが不活性化されるため、ウイルス不活性化・除去手段を１つ備えていればよい。しかし、本発明では中性の溶離液が使用されるため、ウイルスは不活性化されない。そのため、精製装置は、ウイルス不活性化・除去手段を２つ以上備えていることが好ましい。
　本発明に係る精製装置の好ましい実施形態を図１に示す。図１では、アフィニティーカラム２の下流に、陰イオン交換カラム３、陽イオン交換カラム４、ＵＦ濾過装置５、及び除菌フィルター８が順に設置されている。本発明の温度応答性ポリアミノ酸と結合性物質を含むカラムは、アフィニティーカラム２として使用するものである。アフィニティーカラム２の上流には、培地受けタンク１、冷却装置７及び溶離液タンク６が設置されている。なお、冷却装置７は、培養工程において一定温度（例えば３７℃）で培養された培養液を２０℃以下に冷却するための装置である。冷却方法は、水の循環による方式であるが、その方法に限定はされない。また、図１に示すように、各カラムで処理した溶液に含まれている複数の成分を分離させて各成分に分けて溜めておく画分タンク９や、溶液を受けて溜めておく受けタンク１０が必要に応じて任意に設置されている。
＜精製方法＞
　本発明は、結合工程、洗浄工程、分離工程、及び溶出工程を含む標的物質の精製方法にも関する。
　結合工程では、担体と、担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、温度応答性ポリアミノ酸に結合した結合性物質であり、標的物質に特異的に結合する結合性物質と、を含む充填剤を充填したカラムに、標的物質と不純物とを含む溶液を通し、標的物質を結合性物質に結合させる。
　担体、温度応答性ポリアミノ酸、結合性物質、及び標的物質についての説明は上述の通りである。標的物質と不純物とを含む溶液としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌、真菌、藻類等を用いた培養によって得られる培養液等を挙げることができる。
　結合工程における温度は、温度応答性ポリアミノ酸が、結合性物質に標的物質が結合できるような立体構造を形成する温度であればよい。例えば、０～６０℃、好ましくは２～２０℃、特に好ましくは４～１０℃で結合工程を行うことが好ましい。また、結合工程におけるｐＨは、例えば、５～９、好ましくは６～８である。このような条件で結合工程を行うことにより、標的物質を劣化させることなく、結合性物質に結合させることができる。
　洗浄工程では、結合性物質に結合した標的物質を分離させることなく、不純物を洗い流してカラム内を洗浄する。洗浄工程で使用する溶媒は、結合性物質と標的物質との結合に悪影響を与えるものでなければ特に限定されない。洗浄工程における温度及びｐＨは、結合工程と同様の条件であることが好ましい。洗浄工程で使用する溶媒としては、例えば、ｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．８Ｍ硫酸アンモニウムなどを用いることができる。
　分離工程では、温度応答性ポリアミノ酸に温度変化を与え、結合性物質に結合した標的物質を分離させる。分離工程における温度は、温度応答性ポリアミノ酸が、結合性物質に結合した標的物質を分離させるような立体構造を形成する温度であればよい。例えば、０～６０℃、好ましくは２０～５０℃、特に好ましくは３５～４０℃で分離工程を行うことが好ましい。また、分離工程におけるｐＨは、例えば、５～９、好ましくは６～８である。このような条件で分離工程を行うことにより、標的物質を劣化させることなく、結合性物質から分離させることができる。
　溶出工程では、分離した標的物質を溶出する。標的物質の溶出に使用する溶媒は、洗浄工程で使用した溶媒と同じものでもよいし、異なるものでもよい。溶出工程における温度及びｐＨは、分離工程と同様の条件であることが好ましい。
　本発明の一実施形態において、精製方法は、溶出工程において溶出した標的物質を、陰イオン交換カラム及び／又は陽イオン交換カラムを用いて更に精製する工程を含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態において、精製方法は、溶出工程において溶出した標的物質、又はイオン交換カラムを用いて更に精製した標的物質に対して、ウイルス不活性化・除去処理を行う工程を含んでいてもよい。ウイルス不活性化・除去処理を行う工程を２回以上行うことが好ましい。ウイルス不活性化・除去処理を行う工程は、既に説明しているウイルス不活性化・除去手段によって行うことができる。
＜温度応答性ポリリシンの調製＞
　温度応答性ポリリシンの調製は、例えば次のようにして行うことができる。
　水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）（２９０ｍｇ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１７０ｍｇ）、及び吉草酸（１３０μｌ）を、ガラス容器に入れた蒸留水又はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ５．８）（４ｍｌ）に溶解させた。得られた溶液を４℃に冷却し、ポリリシン（１４０ｍｇ）を加え、一晩反応させる（３７℃で２時間反応させてもよい）。次いで、この反応液を透析膜（ｃｕｔ－ｏｆｆ分子量２０００、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒｅ製）を用いて、室温で純水中、２４時間撹拌して未反応物を除去し、単離・精製する。
＜温度応答性ポリアスパラギンの調製＞
　温度応答性ポリアスパラギンの調製は、例えば次のようにして行うことができる。
　セパラブルフラスコ(スターラー、温度計)にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３４ｇ）を入れ、ポリスクシンイミド（ＰＳＩ）（９．７ｇ、０．１ｍｏｌ）を溶解させる。次いで、ドデシルアミン（６．５ｇ、０．０３５ｍｏｌ）及び２－メトキシエチルアミン（４．９ｇ、０．０６５ｍｏｌ）を前記溶液に添加し、７０℃で６時間反応させる。そして、この反応液を大量のアセトニトリルに入れ、フィルターを用いて沈殿物を回収する。回収した沈殿物（回収率９２％、１９．４ｇ）を６０℃で２４時間乾燥する。
＜結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸の結合＞
　結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸の結合は、例えば次のようにして行うことができる。
　結合性物質のＮ末端がシステイン（Ｃｙｓ）の場合、ポリアミノ酸のＣ末端にチオール基を付加しておくことにより、結合性物質とポリアミノ酸とを結合させることができる（図６参照。なお、図６中のＲは、例えば、Ｈである。）。ポリアミノ酸のＣ末端チオエステルと結合性物質のＮ末端システインとの反応によってふたつの物質を結合させる。システインの側鎖のチオール基がチオエステル基のカルボニル炭素と選択的に反応し（化学選択的反応）、チオール交換反応により、チオエステル結合初期中間体が生成する。この中間体は、自発的に分子内転位して（自然転移）、連結部位に天然アミド結合が形成される一方で、システイン側鎖チオールを再生させる。結合後、ラネーニッケルを使って生成物の前記チオール基を選択的に脱硫（選択的脱硫）すると、天然の標的配列が生成する（つまり、結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸を結合させることができる。）。
　以下に、手順を示す。
［試薬の調製］
（１）ストック溶液５０ｍｌ：
　（ａ）０．１Ｍ　Ｎａ2ＨＰＯ4（リン酸水素二ナトリウム）又はＮａＨ2ＰＯ4（リン酸二水素ナトリウム）（１．４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）
　（ｂ）６Ｍ　ＧｕＨＣｌ（グアニジン塩酸塩）（２８．７ｇ、３００ｍｍｏｌ）
　（ａ）、（ｂ）の順番で溶媒（水）へ溶かす。このストック溶液は４℃で数ヶ月保存することができる。ＧｕＨＣｌはペプチド反応体を可溶化するために使用する。Ｎａ2ＨＰＯ4又はＮａＨ2ＰＯ4はストック溶液のｐＨを６．８～７に中和するために使用する。
（２）ＮＣＬ　ｂｕｆｆｅｒの調製
　シンチレーションバイアルに下記溶質を入れ、フィルター処理（０．２μｍシリンジフィルター）したストック溶液（５ｍｌ）を添加する。
　５０ｍＭ　ＭＰＡＡ（４２．１ｇ、０．２６ｍｍｏｌ)
（ＭＰＡＡ：４－メルカプトフェニル酢酸（Sigma-Aldrich, Cat. #:653152））
　２０ｍＭ　ＴＣＥＰ（ＨＣｌ代用可）（２８．７ｇ、０．１ｍｍｏｌ）
（ＴＥＣＰ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Sigma-Aldrich,Cat. #:C4706））
（３）ＮＣＬ　ｂｕｆｆｅｒのｐＨ調整
　２Ｍ　ＮａＯＨ又は１Ｍ　ＨＣｌを用いて前記（２）で調整したＮＣＬ　ｂｕｆｆｅｒのｐＨを７．１に合わせる。
［結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸との反応］
　結合性物質と温度応答性ポリアミノ酸との反応は、例えば次のようにして行うことができる。
（１）ペプチド（例えば、ポリアミノ酸）－チオエステル及びＣｙｓ－ペプチド（例えば、プロテインＡ）を正確に計りチューブへ入れる。ポリアミノ酸のＣ末端へのチオエステルの付加及び結合性物質のＮ末端へのＣｙｓ付加の方法は別に記載する。ＮＣＬ　ｂｕｆｆｅｒ（５ｍｌ）に対して各ペプチドを１～５ｍＭ使用する。なお、１５００Ｄａ以下のペプチドの場合は３ｍＭで約５ｍｇとなる。
（２）ペプチド－チオエステル及びＣｙｓ－ペプチドの入ったチューブにＮＣＬ　ｂｕｆｆｅｒを添加し、すばやくペプチドを溶かす。当該ペプチドを溶かした溶液のｐＨを測定し、必要であればｐＨ７．０に合わせる。この場合、低濃度（０．２Ｍ等）ＮａＯＨを使用してｐＨを調整するのが好ましい。なお、ｐＨが７より上であると、ペプチドは加水分解される。
（３）液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣＭＳ）又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化法－飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）を用いて反応をみる。ペプチドにＮＣＬ　ｂｕｆｆｅｒを加えて０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間で反応をみる。通常１～１６時間の間に反応が起こる。各時間でマイクロチューブに１０μｌとり、１９０μｌのＡｃＣＮ：Ｈ2Ｏ（０．０８％：０．１％　ＴＦＡ　ｖ／ｖ）＝１：１溶液を加えて２０倍希釈し、反応を止める（確実に反応を止めるには１Ｍ　ＨＣｌでｐＨ４まで下げる）。
（４）反応終了後すぐに１Ｍ　ＧｕＨＣｌ（０．１％　ＴＦＡ（ｓｏｌｖｅｎｔ　Ａ）使用）で溶液を希釈し、ｐＨを下げて反応を止める。
＜結合性物質のＮ末端にシステインを付加する方法＞
　結合性物質のＮ末端がシステインでない場合、次の方法で結合性物質のＮ末端にシステインを付加することが可能である。
　目的タンパク質（結合性物質）の遺伝子がコードされているＤＮＡをｐＴＹＢ２１ベクターのマルチクローニングサイト（例：ＳａｌＩ－ＰｓｔＩ）に挿入する。挿入したｐＴＹＢ２１ベクターをＥ.Ｃｏｌｉ Ｓｔｒａｉｎ ＥＲ２５６６に導入し、培養することでＮ末端にインテインとキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）から構成されるタグが融合した目的タンパク質を産生させることができる。産生させた目的タンパク質をキチンビーズに結合させ、チオール試薬（ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は２－メルカプトエタンスルホン酸）により、Ｎ末端にシステインが付加された目的タンパク質（結合性物質）をビーズから切断することができ、Ｎ末端システイン付加タンパク質（結合性物質）を回収することができる。
＜ポリアミノ酸のＣ末端にチオエステルを付加する方法＞
　ポリアミノ酸の配列をコードしたＤＮＡをｐＴＸＢ１ベクターのマルチクローニングサイト（例：Ｎｄｅｌ－ＳａｌＩ又はＳｐｅｌ）に挿入する。挿入したｐＴＸＢ１ベクターをＥ.Ｃｏｌｉ Ｓｔｒａｉｎ ＥＲ２５６６に導入し、培養することでＣ末端にインテインとキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）から構成されるタグが融合したポリアミノ酸を産生させることができる。産生させたポリアミノ酸をキチンビーズに結合させ、チオール試薬（ＤＴＴ又は２－メルカプトエタンスルホン酸）により、Ｃ末端にチオエステルが付加されたポリアミノ酸をビーズから切断することができ、Ｃ末端チオエステル付加ポリアミノ酸を回収することができる。
＜温度応答性ポリアミノ酸の担体への結合＞
　温度応答性ポリアミノ酸は、他のリガンドタンパク質と同様の操作で担体へ固定することが可能である。ここでは、担体への固定の一例を挙げるが、この他の固定化の方法も実施可能である。
［ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－活性化ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎ（１ｍＬ）への固定方法］
（１）カラムの準備
　カラムに気泡を入れないように注意しながらシリンジを接続し、１ｍＭ　ＨＣｌ（５ｍｌ）を流速１滴／秒（又は０．２～１ｍｌ／ｍｉｎ）で送液する。
（２）カップリング反応
　リガンドタンパク質（温度応答性ポリアミノ酸）を含む溶液（１ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は０．２～１ｍｌ／ｍｉｎ）で送液し、カラム出口を付属のストッププラグで密閉し、室温で１５～３０分間、又は４℃で４時間放置する。その後、カップリングバッファー（３ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は０．２～１ｍｌ／ｍｉｎ）で送液する。なお、ここではカップリングバッファーとしてｐＨ８．３の１００ｍＭ炭酸水素ナトリウムを用いる例を説明したが、５００ｍＭ塩化ナトリウムを用いることもできる。
（３）未反応活性基のブロッキング
　カップリングバッファーの送液を終了した後、ブロッキングバッファー（６ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は１～２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液する。次いで、洗浄バッファー（６ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は１～２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液する。そして、ブロッキングバッファー（６ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は１～２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液し、室温で１５～３０分間、又は４℃で４時間放置する。なお、ここではブロッキングバッファーとしてｐＨ８．３の５００ｍＭモノエタノールアミンを用いる例を説明したが、５００ｍＭ塩化ナトリウムを用いることもできる。また、洗浄バッファーとしてｐＨ４．０の１００ｍＭ酢酸ナトリウムを用いる例を説明したが、５００ｍＭ塩化ナトリウムを用いることもできる。
（４）カラムの洗浄と平衡化
　洗浄バッファー（６ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は１～２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液する。次いで、ブロッキングバッファー（６ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は１～２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液する。次いで、洗浄バッファー（６ｍｌ）をカラム内に流速１滴／秒（又は１～２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液する。そして、平衡化バッファーをカラム内に流速１滴／秒（又は１～２ｍｌ／ｍｉｎ）で送液し、リガンド固定カラム（温度応答性ポリアミノ酸固定カラム（温度応答性特異的吸脱着カラム））の作製を完了する。なお、平衡化バッファーとしては、例えば、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液を用いることができる。
　前記したものの他にも担体上にリガンド（温度応答性ポリアミノ酸）の配向性を揃えて、担体の単位体積あたりの吸着量を向上させる方法も可能である。例えば、タンパク質中の特定の部位に特異的に結合するペプチドを創製し、これを用いてタンパク質の配向を結合しやすい向きに揃え、担体の単位体積あたりの吸着量を向上させることも可能である。
＜温度応答性特異的吸脱着カラムを用いた精製方法＞
　次に、温度応答性特異的吸脱着カラムを用いた精製方法の一例について説明する。
　前記したようにして作製した温度応答性特異的吸脱着カラム（すなわち、担体と、当該担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、当該温度応答性ポリアミノ酸に結合した、標的物質に特異的に結合する結合性物質とを含むカラム）に、温度を２０℃以下とした培養回収液を流し、標的物質である抗体タンパク質をカラムに吸着させる。その後、３７℃に加温した緩衝液（２０ｍＭ　リン酸塩、ｐＨ７．０）をカラムに流し、抗体タンパク質を溶出する。
　図７に、温度応答性特異的吸脱着カラムと、従来のプロテインＡカラム（プロテインＡを結合させた担体を含むカラム）との相違を示す。精製は、結合工程（図７の（ａ）結合）、洗浄工程（図７の（ｂ）洗浄）、分離・溶出工程（図７の（ｃ）分離、（ｄ）溶出）からなる。まず抗体と不純物を含む培養液をカラムに通す。カラムにはプロテインＡ結合ビーズが充填されており、抗体は前記ビーズに結合するが、不純物は結合しない。洗浄により、不純物をよく取り除く。分離・溶出工程では抗体とプロテインＡ結合ビーズとの結合力を弱めることで抗体をプロテインＡ結合ビーズから分離する。
　図７に示すように、従来法では、結合工程、洗浄工程を中性ｐＨ、室温で行い、分離・溶出工程を室温、低ｐＨで行うことで、抗体とプロテインＡ結合ビーズとの結合力を弱め、抗体を溶出する。しかし、抗体は低いｐＨに曝されると、抗体同士が結合し、凝集体となる（凝集体誘導）。このようになると、良質な抗体の収量が減ってしまうので好ましくない。
　一方、図７に示すように、本発明に係る精製装置（前記した温度応答性特異的吸脱着カラム（図７中の「本発明」））では、結合工程、洗浄工程を低温で行い（例えば、２０℃以下）、温度を上げて分離・溶出工程を行うことで結合力を変え、抗体を溶出する（例えば、３７℃）。すなわち、本発明に係る精製装置では、すべての工程を中性ｐＨで行い、温度変化は抗体を変性させない範囲で行われる。従って、本発明に係る精製装置は、抗体を凝集させることなく得ることができる。また、本発明に係る精製装置は、良質な抗体の収量を多くすることができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
＜温度制御型プロテインＡ材料の構築＞
（１）温度応答性ポリリシンの調製
　温度応答性ポリリシンは以下の手順に従って調製した。１－エチル－３－カルボジイミド（ＷＳＣ）（２９０ｍｇ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１７０ｍｇ）、及び吉草酸（１３０ｍｇ）を純水（４ｍｌ）に溶解させ、この溶液を４℃に冷却、撹拌しながらεポリリシン（種々の分子量が混在）（１４０ｍｇ）を加えた。常温で２時間撹拌した後、透析膜を用いてさらに２４時間撹拌して未反応低分子物を除去した。透析膜の種類により、３．５ｋＤａ以上の分子量を持つ温度応答性ポリリシン、１０ｋＤａ以上の分子量を持つ温度応答性ポリリシン、２０ｋＤａ以上の分子量を持つ温度応答性ポリリシンの３種類を調製した。
（２）温度応答性ポリリシンの基盤への結合
　樹脂プレートのウェル内の表面にアミノ基を付加する処理を施し（図８）、当該ウェル内に前記調製した３種類の温度応答性ポリリシンそれぞれを以下の手順に従って共有結合させた。なお、樹脂プレートのウェル内の表面へのアミノ基の付加は、従来法にて行った。グルタルアルデヒドが２％となるように炭酸緩衝液で希釈した。そして、当該グルタルアルデヒドが２％となるように希釈した炭酸緩衝液をプレートの各ウェルに１５０μｌずつ加え、３７℃で２時間反応させた。各ウェルを純水で３回洗浄した後、温度応答性ポリリシンを各ウェルに１００μｌずつ加え、２時間反応させた。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した。なお、前記した従来法とは、射出成形したポリスチレン製プレートを、減圧下で酸素ガスを通気しながら高周波低温プラズマを発生させて３分間処理した後、γ－アミノプロピルトリメトキシシラン１０％メタノール溶液に浸漬し、１６時間放置してアミノシラン処理を行った後、蒸留水で洗浄し、乾燥して表面にアミノ基を形成させるというものである。
（３）プロテインＡの温度応答性ポリリシンへの結合
　前記（２）で作製した、ウェル内に温度応答性ポリリシンが共有結合している樹脂プレートに２％グルタルアルデヒドを加え、２時間反応させた。純水で洗浄した後、プロテインＡ（１０μｇ／ｍｌ）を各ウェルに１００μｌずつ加えて、２時間反応させた。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で各ウェルを３回洗浄した。
＜温度制御型プロテインＡ材料の抗体（ＩｇＧ）の温度制御による吸脱着評価＞
　前記で調製した温度制御型プロテインＡ材料を用い、以下の手順に従って、温度による抗体吸脱着評価を行った。
　樹脂プレートのウェル内に、プロテインＡ以外のタンパク質の非特異的吸着が生じないよう、５％スキムミルクによりブロッキングを行った。各ウェルを洗浄バッファー（２００μｌ）で３回洗浄した後、ビオチン化抗体を５０μｌずつ加え、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。４℃に保ちながら洗浄バッファー（２００μｌ）を用いて、各ウェルを３回洗浄した後、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートを５０μｌずつ加え、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。温度応答性の効果を調べるため、一方は３７℃の条件で、もう一方は４℃の条件で洗浄バッファーを用いて各ウェル２００μｌで３回洗浄した後、発色原であるＴＭＢ（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）を５０μｌずつ加え、室温で発色反応を行った。そして、波長６５０ｎｍの吸光度を測定した。
　吸光度の測定結果を図９に示す。ポリリシンの分子量が≧３．５ｋＤａ及び≧１０ｋＤａの場合、３７℃の条件よりも４℃の条件において吸光度が高い（４℃で結合し、３７℃で分離する）。４℃では抗体（ＩｇＧ）に対するプロテインＡの結合力が高く、分子量が≧１０ｋＤａの場合に特に結合力が高い。一方、分子量が≧２０ｋＤａの場合には、４℃と３７℃との条件において差異はなく、温度制御による結合が変化していない。
１・・・培地受けタンク、２・・・アフィニティーカラム、３・・・陰イオン交換カラム、４・・・陽イオン交換カラム、５・・・ＵＦ濾過装置、６・・・溶離液タンク、７・・・冷却装置、８・・・除菌フィルター、９・・・画分タンク、１０・・・受けタンク

Claims (11)

  1. 　カラムと、当該カラムに充填された充填剤とを備える、標的物質の精製装置であって、
    　前記充填剤が、担体と、当該担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、当該温度応答性ポリアミノ酸に結合した結合性物質であり、標的物質に特異的に結合する結合性物質と、を含む、精製装置。
  2. 　前記温度応答性ポリアミノ酸が、前記結合性物質に前記標的物質が結合できるような立体構造と、前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させるような立体構造との間で構造変化し、前記構造変化が０～６０℃の範囲で起こる、請求項１に記載の精製装置。
  3. 　前記温度応答性ポリアミノ酸が、ポリリシン、ポリグルタミン酸、及びポリアスパラギンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の精製装置。
  4. 　前記結合性物質がプロテインＡであり、前記標的物質が抗体である、請求項１に記載の精製装置。
  5. 　前記温度応答性ポリアミノ酸の温度を０～６０℃の範囲で変化させる温度調節手段を更に備える、請求項１に記載の精製装置。
  6. 　標的物質の精製方法であって、
    　担体と、当該担体に結合した温度応答性ポリアミノ酸と、当該温度応答性ポリアミノ酸に結合した結合性物質であり、標的物質に特異的に結合する結合性物質と、を含む充填剤を充填したカラムに、前記標的物質と不純物とを含む溶液を通し、前記標的物質を前記結合性物質に結合させる結合工程；
    　前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させることなく、不純物を取り除いて前記カラム内を洗浄する洗浄工程；
    　前記カラム内を洗浄した後、前記温度応答性ポリアミノ酸に温度変化を与え、前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させる分離工程；及び
    　分離した前記標的物質を溶出する溶出工程；
    を含む、精製方法。
  7. 　前記温度応答性ポリアミノ酸が、前記結合性物質に前記標的物質が結合できるような立体構造と、前記結合性物質に結合した前記標的物質を分離させるような立体構造との間で構造変化し、前記構造変化が０～６０℃の範囲で起こる、請求項６に記載の精製方法。
  8. 　前記温度応答性ポリアミノ酸が、ポリリシン、ポリグルタミン酸、及びポリアスパラギンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の精製方法。
  9. 　前記結合性物質がプロテインＡであり、前記標的物質が抗体である、請求項６に記載の精製方法。
  10. 　前記分離工程を０～６０℃で行う、請求項６に記載の精製方法。
  11. 　前記溶出工程をｐＨ５～９で行う、請求項６に記載の精製方法。
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