WO2007091323A1 - 液体クロマトグラフィーによる分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】迅速で正確な温度グラジエント溶出法を得る。 【解決手段】　カラム１５を断熱状態とし、移動相１を２つの移動相送液流路２ａ，２ｂから供給し混合してカラム１５に導入する。その際、一方の移動相送液流路２ａの移動相温度をカラム１５で調節しようとする温度範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定し、他方の移動相送液流路２ｂの移動相温度をカラム１５で調節しようとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定し、２つの移動相送液流路２ａ，２ｂの流量の調節により移動相の混合比率を時間的に変化させることによりカラム１５内の移動相の温度を時間的に変化させる。これにより温度グラジエント溶出法を行なう。

Description

明 細 書

液体クロマトグラフィーによる分析方法及び装置

技術分野

[0001] 本発明は分析しょうとする試料を移動相とともに分離用カラムに導入し、そのカラム で分離されて溶出した試料成分を検出器で検出する液体クロマトグラフィーに関する ものである。

背景技術

[0002] 液体クロマトグラフィーは試料成分の分析技術として広く用いられて 、る。液体クロ マトグラフィ一はカラム充填剤の表面又はキヤビラリ一内面に形成された固定相と、充 填材の間隙を流れる移動相の二つの相に対する物質の分布状態の差を利用して分 離するもので、試料中の各成分はその化学的性質に応じて異なった速度でカラムを 通過する。

[0003] 化学的性質が互いにかけ離れた複数の物質を一斉に分析する場合、分析に要す る時間が長くなることがあるが、移動相の組成が変化すると物質の分布状態が変化 することから、移動相組成を経時的に変化させて分離状態を維持しつつ分析時間を 短縮する移動相組成グラジェント溶出法がしばしば用いられる。

[0004] 図 4に移動相組成グラジェント溶出法を用いた液体クロマトグラフを示す。

移動相 la, lbを送液するための移動相送液流路 2a, 2b上にそれぞれの送液ボン プ 5a, 5bが設けられている。送液ポンプ 5a, 5bはモータの回転数を制御することに よって送液量を調節する。移動相送液流路 2a, 2bはミキサ 11で合流しており、ミキサ 11は移動相 laと lbを混合して分析流路 12に送液するようになって 、る。分析流路 1 2には試料注入部 7を介して分離カラム 15が設けられ、カラム 15の下流に検出器 19 が設けられている。

[0005] 試料注入部 7から注入された試料は、ミキサ 11で混合された移動相により分離カラ ム 15に導かれて成分ごとに分離され、分離された試料成分は検出器 19で検出され る。

送液ポンプ 5a及び 5bは制御装置 21によってそれぞれの送液量が制御され、ダラ ジェント溶出法を実現するための所定の送液プログラムに沿って送液量が変化させ られる。

[0006] このような液体クロマトグラフで、例えば、図 5に示されるように、移動相 Aを 100%、 移動相 Bを 0%という送液状態力 分析を開始し、徐々に移動相 Aの濃度を減らし、 移動相 Bの濃度を増やすように移動相組成を変化させていき、最終的に移動相 Aを 0%、移動相 Bを 100%にすることで、カラム 15での試料の保持力を変化させながら 分析する。特に、このように、複数の送液ポンプを用いて、送液ポンプの下流側で複 数の移動相を合流させるグラジェント方式は、高圧グラジェント方式と呼ばれている（ 例えば、特許文献 1参照。 ) oなお、図 6で、縦軸の A, Bの座標はそれぞれ A液 100 %、 B液 100%を示している。横軸は時間である。

[0007] 特許文献 1 :特開 2003— 98166号公報

非特許文献 1：金澤秀子「温度応答性クロマトグラフィー」ぶんせき、 2004年 6月号、 第 303— 308頁

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] し力しながら移動相組成グラジェント溶出法では、検出器が移動相の組成変化に 感応してベースラインの変動を引き起こすことがあるので、移動相の条件や検出方法 によっては分析に適用できな 、場合がある。

また、移動相組成グラジェント溶出法のみでは十分にその目的を達成できない場 合もある。

[0009] 一方、温度も物質の分布状態を変化させることから、移動相組成グラジェント溶出 法に代替する手段として、カラム周辺の温度を時間的に変化させる温度グラジェント 溶出法が提案されている (例えば、非特許文献 1参照。 ) oその方法では、カラム温度 を外部力も変化させることによりカラム内での移動相温度を変化させている。

し力しながら、その提案の方法では、熱媒体の熱容量、熱媒体やカラム管材質の熱 伝導率及び温度差によって熱伝導性が変わるので、迅速かつ正確に温度変化をさ せることが難しい。さらに、カラム断面方向に温度勾配が生じてピーク形状の劣化を 招きやすいという問題もある。そのため、その提案の温度グラジェント溶出法は広く普 及するには至っていない。

本発明の目的は迅速で正確な温度グラジェント溶出法を提供することである。 課題を解決するための手段

[0010] 本発明は、異なる温度の移動相を任意に混合すれば温度調節が速やかに達成さ れることに着目してなされたものであり、移動相を 2つの流路で互いに異なる一定の 温度に調節し、それを任意の混合比で混合して断熱されたカラムに流入させることに より目的を達成しょうとするものである。

[0011] すなわち、本発明の分析方法は、分析しょうとする試料を移動相とともに分離用カラ ムに導入し、そのカラムで分離されて溶出した試料成分を検出器で検出する液体ク 口マトグラフィ一による分析方法であり、カラムを断熱状態とすること、移動相を 2つの 移動相送液流路力 供給し混合してカラムに導入すること、その際に、一方の移動 相送液流路の移動相温度をカラムで調節しょうとする温度範囲の上限温度よりも高 い一定温度に設定し、他方の移動相送液流路の移動相温度をカラムで調節しようと する温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定すること、及び 2つの移動相送 液流路の流量の調節により移動相の混合比率を時間的に変化させることによりカラム 内の移動相の温度を時間的に変化させることを含み、これにより温度グラジェント溶 出を行なうものである。

[0012] 移動相の混合比率の時間的変化には、一定温度から他の一定温度へ段階的に変 化させる様式と、低温から高温又は高温から低温へと連続的に変化させる様式があ る。本発明は両方の様式を含むものである。段階的に変化させる様式は制御が簡単 であるという利点をもつ。一方、混合比率を時間的に連続して変化させる場合には力 ラム内に移動相の移動方向に沿った温度勾配を形成することができる。

[0013] 本発明では、カラム力 流出する液の温度も時間的に変化する。そのため、検出器 によっては温度によって感度が変化したり、ベースラインが変動したりすることがある。 そのような問題を避けることを目的として、カラム力 流出する液を一定温度に調節し 、その後検出器に導くことが好ましい。

[0014] また、カラムに導入される移動相の流量が変化するとピークの保持時間が変化する ので、より正確な分析を行うことを目的として、カラムに導入される移動相の流量が一 定になるように 2つの移動相送液流路の流量を調節することが好ま 、。

[0015] 移動相組成グラジェント溶出法が適用できる場合には、グラジェント溶出法の作用 を高めることを目的として、本発明による温度グラジェント溶出法に、 2つの移動相送 液流路力 供給する移動相の組成を時間的に変化させる移動相組成グラジェント溶 出法を併用することができる。

[0016] 本発明の液体クロマトグラフは、分離用カラムと、そのカラムを収容する断熱容器と 、送液ポンプ及びカラムで調節しょうとする温度範囲の上限温度よりも高 、一定温度 に設定された恒温器を備えた第 1の移動相送液流路と、前記送液ポンプとは異なる 送液ポンプ及びカラムで調節しょうとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に 設定された恒温器を備え、第 1の移動相送液流路で送液される移動相と同じ移動相 を送液する第 2の移動相送液流路と、第 1、第 2の移動相送液流路から供給された移 動相を混合してカラムに送り出す混合器と、カラムに移動相が供給される流路中に分 祈しょうとする試料を注入する試料注入器と、カラムの下流に配置され、カラムで分離 されて溶出した試料成分を検出する検出器と、第 1、第 2の移動相送液流路の送液 ポンプの流量を調節して混合器での移動相の混合比率を時間的に変化させるグラジ ェントコントローラとを備えている。これにより、カラム内の移動相の温度を時間的に変 化させて温度グラジェント溶出を行なう。

[0017] グラジェントコントローラが制御する移動相の混合比率の時間的変化には、段階的 な変化と連続的な変化とがあるが、カラム内に移動相の移動方向に沿った温度勾配 を形成するためには、グラジェントコントローラは混合比率の時間的変化が連続的に 行なわれるように第 1、第 2の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節する。

[0018] カラムと検出器の間にカラムからの流出液の温度を一定温度に調節するための恒 温器をさらに備えて 、ることが好まし 、。

グラジェントコントローラの好ましい形態は、カラムに導入される移動相の流量が一 定になるように第 1、第 2の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節するものであ る。

[0019] 第 1、第 2の移動相送液流路としては、送液する移動相の組成を時間的に変化させ る移動相組成グラジェント機構をさらに備えているようにすることができる。 試料注入器が配置される位置は、カラムに移動相が供給される流路中に試料を注 入できる位置であればよいが、例えば第 1もしくは第 2の移動相送液流路、又は混合 器とカラムの間の流路である。

[0020] 調節可能な温度範囲は移動相の組成に依存するが、移動相送液流路の恒温器に はカラムの流れ抵抗に起因する高い圧力が力かっているため、移動相の沸点上昇に よって相当の高温域までグラジェント分析することが可能である。

発明の効果

[0021] 本発明の分析方法及び液体クロマトグラフは、移動相を 2つの流路で互いに異なる 一定の温度に調節し、それを任意の混合比で混合してカラムに流入させるとともに、 カラム力 の熱の放散を遮断する方法をとつて 、るので、容易にカラム内の移動相の 温度を変化させることができ、これまで困難であった迅速な温度グラジェント溶出法 が可能になる。

また、従来のように熱媒体を介してカラムを外側から加温したり冷却したりする方法 と異なり、カラムの断面方向に温度勾配が生じないので、ピーク形状の劣化を招くこと もない。

その結果、本発明では、高速で精度に優れた温度グラジェント溶出法が可能にな る。

[0022] 本発明で混合比率の時間的変化を連続的に行なう場合には、カラム中の移動相の 流れ方向に温度勾配が生じるので、その濃縮効果によってカラム内での物質の拡散 が抑制され、効率のよい分離を達成することができる。

カラム力 流出する液を一定温度に調節し、その後検出器に導くようにすれば、示 差屈折計検出器のように温度変化に敏感な検出器であっても使用できるようになる。

[0023] カラムに導入される移動相の流量を一定にすると、ピークの保持時間の再現性が 向上し、測定精度が向上する。

本発明による温度グラジェント溶出法に移動相組成グラジェント溶出法を併用すれ ば、より効率的なグラジェント溶出法を実現することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0024] 以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。 図 1 Aは一実施例の高速液体クロマトグラフの流路図を示す。

この高速液体クロマトグラフは、移動相 1に含まれる気体を脱気する脱気装置 3を経 た移動相流路を分岐して送液する 2つの移動相送液流路 2a, 2bを備えている。一方 の移動相送液流路 2aは送液ポンプ 5a、試料注入器 7及び移動相をカラムで調節し ようとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定された恒温器 9aを備えて V、る。他方の移動相送液流路 2bは送液ポンプ 5b及び移動相をカラムで調節しようと する温度範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定された恒温器 9bを備えている。

[0025] 2つの移動相送液流路 2a, 2bは混合器 11に接続されて!ヽる。混合器 11からの流 路 12には試料を成分に分離するための分離用カラム 15が接続され、カラム 15の下 流には、恒温器 17を介して、カラム 15で分離されて溶出した試料成分を検出する検 出器 19が接続されている。恒温器 17は検出器 19によっては、省略することができる

[0026] 混合器 11とカラム 15は、熱の放散が遮断されるように断熱容器 13に収納されてい る。この図に示すように、恒温器 9a, 9bの出口力もカラム 15の出口までが断熱容器 1 3に収納されて 、ることが好まし 、。

[0027] 送液ポンプ 5a, 5bはグラジェントコントローラ 21に接続されており、グラジェントコン トローラ 21によって移動相送液流路 2a, 2bの送液ポンプ 5a, 5bの流量が調節され、 混合器 11での移動相の混合比率が時間的に変化するように移動相送液流路 2a, 2 bの送液量が調整される。

[0028] 恒温器 9a, 9b, 17にはステンレスなどの熱伝導率の高い材質によるチューブが収 納され、アルミブロック又は空気を媒体として加熱又は冷却される。混合器 11及び力 ラム 15、並びにその配管の材質はポリエーテルエーテルケトン（PEEK)のような熱伝 導率の低いものを用いる。

[0029] 図 1Aの流路構成において、移動相 1は脱気装置 3を経ることによって気泡が脱気 された後、 2つの流路 2aと 2bに分配される。流路 2aでは送液ポンプ 5aにより、流路 2 bでは送液ポンプ 5bにより、それぞれグラジェントコントローラ 21によって任意の流量 比に設定されて送液される。両流路 2aと 2bでは、移動相はそれぞれの恒温器 9a, 9 bで各々異なった温度に調節された後、混合器 11で混合され、カラム 15に供給され る。通常は混合後の移動相流量が一定になるように各々の送液ポンプ 5a, 5bの流量 が設定され、恒温器 9aの温度は調節したい温度の下限値より低ぐ恒温器 9bでは調 節したい温度の上限値より高く設定される。例えば、カラム 15での移動相の流量を 1. OmLZ分とし、 30°Cから 70°Cの直線的な温度グラジェント溶出を実施する場合、恒 温器 9aを 25°Cに、恒温器 9bを 75°Cに設定し、送液ポンプ 5aの流量を 1分間で 0. 9 mLZ分から 0. lmLZ分に向力つて変化させ、同時に送液ポンプ 5bの流量を 1分 間で 0. lmLZ分から 0. 9mLZ分に向かって変化させる。この流量変化はグラジェ ントコントローラ 21により制御される。このとき、液体クロマトグラフが理想的な状態で 稼動すれば、移動相の温度は 1分間で 30°Cから 70°Cに経時的に直線的に連続して 変化することになる。

カラム 15により分離された試料成分は、恒温器 17を経て一定温度に調節され、検 出器 19で検出される。

[0030] 次に、この高速液体クロマトグラフィーをさらに具体的に説明する。

カラム 15には、例えば、逆相クロマトグラフィー用カラム Shim-PackFC— ODS (登 録商標）（内径 3mm、長さ 100mm)が用いられる。ただし、カラム 15はカラム管として PEEKなどの熱伝導率の低!、材質が用いられて!/ヽれば、どのようなものであってもよ い。

[0031] また、検出器 19には吸光度検出器、蛍光検出器、示差屈折計検出器、蒸発光散 乱検出器などを使用でき、必要であれば質量分析計をさらに接続してもよい。

移動相には、一例として、水とァセトニトリルの混合液を用いる。ただし、移動相は 分析すべき物質に応じて選択するものであって、その種類や温度、 pHなどに何らの 制約はない。

[0032] 図 1Bは他の実施例を示したものである。図 1 Aの実施例と比較すると、試料注入器 7の位置が異なっている。この実施例では試料注入器 7は流路 12中で混合器 11と力 ラム 15の間に配置されている。

試料注入器 7はまた、恒温器 9a又は 9bと混合器 11の間に配置してもよ 、。

[0033] 測定条件は次の通りである。

(1)分析条件 カラム： Shim- PackFC— ODS (登録商標）（内径 3mm、長さ 100mm) 移動相： 水とァセトニトリルの混合液 (容量比で 1対 1)

流量 ： l.OmLZ分

温度 ： 30°Cから 70°Cまでの 1分間の温度グラジェント

[0034] (2)検出条件

検出器： 吸光度検出器

検出波長： 260nm

[0035] 図 1 Aの高速液体クロマトグラフを使用して、この測定条件でメチルパラベン、ェチ ルパラベン、プロピルパラベン及びブチルパラベンを含むアルキルパラベン混合標 準試料を分析した結果のクロマトグラムを図 2に示す。横軸は時間、縦軸は検出強度 を示す吸光度 (mAU)である。温度は 30°Cから 70°Cに向力つて時間に対して直線 的に上昇している。

[0036] この結果によれば、メチルパラベン、ェチルパラベン、プロピルパラベン及びブチル ノラベンが 1分以内に溶出し、し力も互いに良好に分離されている。このように、本発 明の温度グラジェント溶出法によって迅速に分離されていることがわかる。

[0037] さらに他の実施例を図 3A及び図 3Bを参照しながら説明する。

これらの実施例は、本発明の温度グラジェント溶出法に移動相の組成を時間的に 変化させる移動相組成グラジェント機構をさらに備えたものである。

[0038] 移動相 la, lbはそれぞれ流量調整可能な弁 4a, 4bを備えた流路 6a, 6bに接続さ れている。流路 6a, 6bは脱気装置 3aを経て、分岐された 2つの移動相流路 2a, 2b に接続されている。弁 4a, 4bもグラジェントコントローラ 21に接続され、移動相 la, 1 bの組成が時間的に調節される。

移動相流路 2a, 2b及びそれらから下流の構成は図 1 A, IBと同じである。

[0039] 図 3A, 3Bの流路構成において、移動相 la, lbは弁 4a, 4bの開口比に従って所 定流量比に設定され、混合された後の移動相は脱気装置 3により脱気された後、混 合され、 2つの移動相流路 2a, 2bに分配される。その後は、図 1A, 1Bの実施例と同 じく温度グラジェントが実行される。

[0040] 図 3A, 3Bに示す流路構成の場合、例えば移動相 laと lbの組成による分配係数 が大きく異なり、さらに温度による分配係数も大きく異なる場合、両方の性質の相乗 効果によって分配係数がさらに大きく異なるという効果がある。そのため、よりグラジェ ント効果が大きいクロマトグラフィーを提供することができる。

図面の簡単な説明

[0041] [図 1A]—実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。

[図 1B]他の実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。

[図 2]—実施例による温度グラジェント溶出を行なったときのクロマトグラフを示す波 形図である。

[図 3A]さらに他の実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。

[図 3B]本発明のさらに他の実施例の高速液体クロマトグラフを示す流路図である。

[図 4]従来の移動相組成グラジェント機構を備えた高速液体クロマトグラフを示す流 路図である。

[図 5]移動相組成グラジェント動作における移動相組成変化を示すグラフである。 符号の説明

[0042] 1, la, lb 移動相

2a, 2b 移動相送液流路

3 脱気装置

5a, 5b 送液ポンプ

7 試料注入器

9a, 9b, 17 恒温器

11 混合器

12 分析流路

13 断熱器

15 カラム

19 検出器

21 グラジェントコントローラ

Claims

請求の範囲

[1] 分析しょうとする試料を移動相とともに分離用カラムに導入し、そのカラムで分離さ れて溶出した試料成分を検出器で検出する液体クロマトグラフィーによる分析方法お いて、

前記カラムを断熱状態とすること、

移動相を 2つの移動相送液流路力 供給し混合して前記カラムに導入すること、そ の際に、一方の移動相送液流路の移動相温度を前記カラムで調節しょうとする温度 範囲の上限温度よりも高い一定温度に設定し、他方の移動相送液流路の移動相温 度を前記カラムで調節しょうとする温度範囲の下限温度よりも低い一定温度に設定 すること、及び

前記 2つの移動相送液流路の流量の調節により移動相の混合比率を時間的に変 化させることにより前記カラム内の移動相の温度を時間的に変化させることを含み、 これにより温度グラジェント溶出法を行なう分析方法。

[2] 前記混合比率の時間的変化を連続的に行なうことにより前記カラム内に移動相の 移動方向に沿った温度勾配を形成する請求項 1に記載の分析方法。

[3] 前記カラム力 流出する液を一定温度に調節した後に前記検出器に導く請求項 1 又は 2に記載の分析方法。

[4] 前記カラムに導入される移動相の流量が一定になるように前記 2つの移動相送液 流路の流量を調節する請求項 1から 3のいずれかに記載の分析方法。

[5] 前記 2つの移動相送液流路力 供給する移動相の組成を時間的に変化させる移 動相組成グラジェント溶出法と併用する請求項 1から 4のいずれかに記載の分析方 法。

[6] 分離用カラムと、

前記カラムを収容する断熱容器と、

送液ポンプ及び前記カラムで調節しょうとする温度範囲の上限温度よりも高い一定 温度に設定された恒温器を備えた第 1の移動相送液流路と、

前記送液ポンプとは異なる送液ポンプ及び前記カラムで調節しょうとする温度範囲 の下限温度よりも低い一定温度に設定された恒温器を備え、第 1の移動相送液流路 で送液される移動相と同じ移動相を送液する第 2の移動相送液流路と、 第 1、第 2の移動相送液流路力 供給された移動相を混合して前記カラムに送り出 す混合器と、

前記カラムに移動相が供給される流路中に分析しょうとする試料を注入する試料注 入器と、

前記カラムの下流に配置され、カラムで分離されて溶出した試料成分を検出する検 出器と、

第 1、第 2の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節して前記混合器での移動 相の混合比率を時間的に変化させるグラジェントコントローラと、を備え、

これにより前記カラム内の移動相の温度を時間的に変化させて温度グラジェント溶 出法を行なう液体クロマトグラフ。

[7] 前記カラム内に温度勾配を形成するために、前記グラジェントコントローラは前記混 合比率の時間的変化が連続的に行なわれるように第 1、第 2の移動相送液流路の送 液ポンプの流量を調節するものである請求項 6に記載の液体クロマトグラフ。

[8] 前記カラムと検出器の間にカラムからの流出液の温度を一定温度に調節する恒温 器をさらに備えている請求項 6又は 7に記載の液体クロマトグラフ。

[9] 前記グラジェントコントローラは前記カラムに導入される移動相の流量が一定になる ように第 1、第 2の移動相送液流路の送液ポンプの流量を調節するものである請求項

6から 8のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。

[10] 第 1、第 2の移動相送液流路は送液する移動相の組成を時間的に変化させる移動 相組成グラジェント機構をさらに備えて 、る請求項 6から 9の 、ずれかに記載の液体 クロマトグラフ。

[11] 前記試料注入器は第 1又は第 2の移動相送液流路に配置されている請求項 6から

10の!、ずれかに記載の液体クロマトグラフ。

[12] 前記試料注入器は前記混合器とカラムの間の流路に配置されて ヽる請求項 6から

10の!、ずれかに記載の液体クロマトグラフ。