WO1999051739A1

WO1999051739A1 - Proteinvariante des net1-locus

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Publication number: WO1999051739A1
Application number: PCT/EP1999/002224
Authority: WO
Inventors: Harald Von Melchner; Frank Wempe; Sylvia Nigro
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 1999-10-14
Anticipated expiration: 2000-10-02
Also published as: EP1066379A1; AU3703999A; DE19814861A1; CA2324656A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Proteinprodukt des NET1-Locus. Das neue Protein besitzt transformierende Aktivität im NIH3T3-Fokusbildungsassay. Das Protein eignet sich als Angriffspunkt für die therapeutische Beeinflussung der Krebsentstehung und -behandlung sowie zur Beeinflussung der Apoptose. Die klonierte DNA ermöglicht weiterhin eine Diagnosemöglichkeit für Krebs, indem Transkripte des transformierenden Proteins in Patientenmaterial nachgewiesen werden können.

Description

Proteinvariante des NET1-Locus

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein, eine Variante von NET1 , sowie die Nukleinsaure, die für das neue Protein kodiert Femer betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das neue Protein und ein Verfahren zur Diagnose, bei dem das neue Proteine nachgewiesen wird, sowie Screening-Verfahren zur Identifizierung von Molekülen mit antmeoplastischer Wirkung und/oder mit Wirkung auf Apoptosevorgange

NET1 (Neuroepithelioma-transformierendes Gen 1 ) ist ein Onkogen, das aus Neuroepithe omzellen durch cDNA-Expressionsklonierung isoliert wurde Bei diesen Untersuchungen wurde ein cDNA-Klon isoliert, der für ein 54 kDa-Protein kodiert Die nähere Analyse des cDNA-Klons zeigte, daß der Klon ein unvoll- standiges 5'-Ende enthielt Mit Hilfe des trunkierten cDNA-Klons wurde die voll- standige kodierende Sequenz des entsprechenden Gens isoliert Die Sequenzanalyse ergab, daß der vollständige Klon für zusatzliche 145 Aminosäuren am 5'- Termius kodierte Der vollständige cDNA-Klon zeigte keine transformierende Aktivität im NIH3T3-Assay, bei dem die Induktion der Fokusbildung als Indikator für die transformierende Aktivität eines Proteins gewertet wird Der am 5'-Ende verkürzte cDNA-Klon zeigte transformierende Aktivität im NIH3T3-Assay Da der verkürzte cDNA-Klon jedoch ein Klonierungsartefakt darstellte und nicht ein in vivo tatsächlich vorkommendes Transkript repräsentiert, bleibt die biologische Bedeutung des Genprodukts des NET1-Locus unklar (Vgl Chan et al 1996)

Sequenzvergleiche des NET1 -Produkts mit bekannten Proteinen zeigt eine Strukturhomologie zu den Guanm-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF) für GTPasen der Rho-Fami e Bereits in den achtziger Jahren wurde mit den humanen dbl-Protoonkogenen eine neue Klasse von Genen entdeckt, die in einer N- termmal trunkierten Form Saugerzellen transformieren (Eva A und Aaronson S 1985, Eva et al 1988, Ron et al 1988) Zu den bekannten Vertretern dieser Klasse gehören dbl BCR, vav, ect2, ost tim Tιam-1 sowie NET1 Sämtliche Gene kodieren für Guanm-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die über den Aus- tausch von GDP durch GTP eine oder mehrere GTPasen der Rho-Familie (Rho- A, -B, -C, Rad und Cdc42Hs) aktivieren (Chan et al , 1994, Chan et al , 1996, Habets et al , 1994, Hörn et al , 1994, Katzav et al , 1989, Miki et al , 1993) Obwohl die Funktionen der Rho-Familienmitglieder noch nicht ausreichend definiert sind, wird neben deren Einfluß auf das Aktmcytoskelett vor allem eine Partizipie- rung bei der Regulation des Zellzyklus vermutet (Hall 1998) Darüber hinaus haben Uberexpressionsversuche in Saugerzellen gezeigt, daß Rho-Proteine sowohl Apoptose stimulieren als auch inhibieren können (Brenner et al , 1997, Crespo et al , 1996, Na et al , 1996, Perona et al , 1997 bzw Bobak et al , 1997, Esteve et al , 1995, Henning et al , 1997, Jimenez et al , 1995) Die GEF-Faktoren spielen hierbei als Aktivatoren der Rho-Familienmitglieder eine besondere Rolle GEF- Faktoren enthalten neben der charakteristischen DH-Domane eine weitere Domäne (Pleckstrin Homology Domain, PH), die Produkte der Phosphatidyl-Inositol- 3-Kιnase (PI3K) bindet (Han et al , 1998) Auf diese Weise werden zwei unterschiedliche Signaltransduktionswege (Rho und PI3K) miteinander verbunden

Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, weitere Gene und Genprodukte zu identifizieren, die an der Regulation der Zellpro feration und/oder Apoptose beteiligt sind Diese Aufgabe wird erfmdungsgemaß gelost durch eine Proteinvariante von NET1 , umfassend die Aminosäuren 1 bis 30 der Sequenz gemäß SEQ ID Nr 1 und davon abgeleitete, durch Substitution, Addition, Insertion und/oder Deletion erhaltene Derivate, sowie durch eine Nukleinsau- re kodierend hierfür

Ein weiteres Problem bestand dann, Mittel und Wege aufzuzeigen mit denen eine Krebsfruherkennung und deregulierte Apoptosevorgange erkannt werden können Dieses Problem wird erfmdungsgemaß gelost durch das oDen angegebene Protein und die entsprechende Nukleinsaure sowie durch ein Oligonukleo- tid, das spezifisch mit einer oben angegebenen Nukleinsaure hybridisiert, sowie einem Antikörper, der spezifisch für ein oben angegebenes Protein ist Ferner wird dieses Problem gelost durch ein Diagnoseverfahren, bei dem ein oben an- gegebenes Protein oder eine oben angegebene Nukleinsaure in einer Patientenprobe nachgewiesen wird

Schließlich lag der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Verfahren anzugeben, mit denen Moleküle mit antineoplastischer Wirkung bzw mit Apoptose-beeinflussender Wirkung identifiziert werden können

Dieses Problem wird erfindungsgemaß gelost, indem die zu untersuchenden Moleküle mit einer Probe in Kontakt gebracht werden, die ein oben genanntes Protein bzw eine entsprechende Nukleinsaure enthalt

Figur 1 zeigt die schematische Darstellung der Genfallenintegration in ein alternatives Exon von NET1

Figur 2 zeigt die Induktion des erfindungsgemaßen NET1 A in IL3 entzogenen FDCP1 -Zellen

Figur 3 zeigt die Induktion von NET1A in differenzierenden embryonalen Stammzellen

Figur 4 zeigt die Restriktionskarte verschiedener Expressionsvektoren mit NET1 bzw dem erfindungsgemaßen NET1A

Das erfindungsgemaße Protein ist ein transformierendes Protein, das sich von dem nicht-transformierenden Protoonkogenprodukt NET1-cl24, dem vorbekannten Protein des NET1-Locus dadurch unterscheidet, daß es einen alternativen N- Terminus aufweist Das erfindungsgemaße Protein NET1A repräsentiert das Produkt eines alternativen Transkripts des NET1 -Locus und ist als solches, d h ohne weitere Trunkierungen transformierend im NIH3T3-Assay Ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird angenommen, daß das neue Onkogenprodukt seine transformierende Eigenschaft dadurch ausübt daß es zu einer Aktivierung des Rho-Signaltransduktionsweges fuhrt (vgl auch Hart et al 1994) Das erfin- dungsgemaße Protein betrifft somit ein neues transformierendes Genprodukt, das entweder direkt oder indirekt zur Krebsentstehung fuhren kann Darüber hinaus wurde auch gefunden, daß das NET1A wahrend der Apoptose in hamato- poetischen Zellen induziert wird Es ist daher davon auszugehen, daß es direkt oder indirekt an der Regulation des programmierten Zelltods beteiligt ist Die Induktion des Genprodukts in hamatopoetischen Zellen wahrend der Apoptose führte schließlich auch zur Identifizierung und Klonierung des Genprodukts Die Indentifizierung des alternativen NET1 -Genprodukts erfolgte mit Hilfe der Genfal- lenintegration, die zur Identifizierung transient expπmierter Gene konzipiert worden ist (vgl PCT/EP97/06816, Russ et al , 1996) Es ist davon auszugehen, daß das erfindungsgemaße Protein eine zentrale Rolle in der Regulation des Zellzy- klus einnimmt, wobei einerseits eine Deregulierung des Zellzyklus zur unkontrollierten Zellproiiferation und damit letztendlich zur Tumorentstehung, und andererseits zum gesteigerten Zelltod fuhren kann Dies bedeutet, daß die Bereitstellung der erfindungsgemaßen Proteinvariante die Möglichkeit eröffnet, durch Beeinflussung der Aktivität des erfindungsgemaßen Proteins die deregulierte Zellproiiferation wieder so zu regulieren, daß die gesteigerte Zellproiiferation und/oder der gesteigerte Zelltod wieder rückgängig gemacht werden kann

Ein bevorzugtes erfindungsgemaßes Protein umfaßt die ersten 30 Aminosäuren von M bis Q in der Sequenz von SEQ ID Nr 1 Diese Aminosäuren werden durch das bisher nicht bekannte alternative Exon des NET1 -Lokus kodiert Mit umfaßt sind Varianten dieses Proteins, die sich durch Substitution, Addition, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren herleiten wobei durch dieses Veränderung in der Proteinsequenz die biologische Aktivität weniger als Faktor 5, vorzugsweise weniger als Faktor 2 gegenüber dem Protein mit der Sequenz nach SEQ ID Nr 1 verändert wird Als biologische Aktivität wird dabei die Aktivität verstanden, wie sie in dem NIH3T3-fokusbιldenden Assay, wie in Baasner et al (1996) beschrieben, erhalten wird Die Herstellung der weiteren Proteinderivate ist dem Fachmann ohne weiteres geläufig Hierzu können beispielsweise Verfahren eingesetzt werden, wie ausführlich beschrieben in Maniatis et al (1989) Ein weiteres bevorzugtes Protein umfaßt die ersten 30 Aminosäuren von M bis Q gemäß der SEQ ID Nr 2 Weitere bevorzugte Proteine sind solche, die die Sequenz nach SEQ ID Nr 1 oder SEQ ID Nr 2 umfassen Eine Inversion von Proteinabschnitten wird ebenfalls erfaßt, wobei Inversionen letztlich auch als Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an den entsprechenden Positionen angesehen werden kann

Als erfindungsgemaße Nukleinsäuren werden solche angesehen, die eine Sequenz umfassen, die für ein Protein der oben beschriebenen Art kodieren Ebenfalls umfaßt sind hierzu komplementäre Nukleinsäuren Die erfindungsgemaße Nukleinsaure wird vorzugsweise ausgewählt aus a) Nukleinsauremoleku- len, die für ein Protein mit der SEQ ID Nr 1 kodiert, b) Nukleinsauremolekulen, die für ein oben angegebenes Proteinderivat kodieren, c) Nukleinsauremolekulen, die mit den Molekülen nach a) und/oder b) hybridisieren, d) Nukleinsauremolekulen, deren Sequenz aufgrund des genetischen Codes degeneriert ist im Vergleich zu den Sequenzen der unter a), b) oder c) genannten Nukleinsauremolekü- le und e) Fragmenten, Derivaten oder allelischen Varianten der unter a) bis d) genannten Nukleinsauremolekule

Eine bevorzugte Gruppe an Nukleinsauremolekulen sind solche, die mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr 3 hybridisieren und vorzugsweise für ein Protein mit der biologischen Aktivität von NET1A kodieren Besonders bevorzugt sind spezifisch mit der Sequenz ID Nr 3 hybridisierende Nukleinsäuren und dazu komplementäre Sequenzen In diesem Zusammenhang bedeutet spezifisch, daß der Fachmann die Hybπdisierungsbedingungen so einstellen kann, daß die hybridisierende Sequenz nur mit der Target-DNA gemäß SEQ ID Nr 3 ein sich von dem Hintergrund abzeichnendes Signal ergibt

Das erfindungsgemaße Oligonukleotid umfaßt mindestens 6, vorzugsweise mindestens 12 und besonders bevorzugt mindestens 18 Nukleotide und hybridisiert spezifisch mit einer der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle. Besonders bevorzugt ist ein Oligonukleotid der genannten Art, das spezifisch mit einer Nukleinsaure hybridisiert, die für die SEQ ID Nr. 1 oder 2 kodiert. Ferner sind solche Oligonukleotide bevorzugt, die mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 und/oder Nr. 4 spezifisch hybridisieren, sowie die hierzu komplementären Oligonukleotide. Ein besonderer Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen Oligonukleotide liegt in dem Nachweis von Nukleinsaure in Patientenmaterial, die für das erfindungsgemäße NETIA-Protein kodiert. Die Wahl der Hybridisierungsbedingungen zum spezifischen Nachweis der Nukleinsaure in dem Patientenmaterial liegt im fachmännischen Können. So kann er beispielsweise durch Auswahl der Oligonu- kleotidsequenz, Oligonukleotidlänge und/oder der Hybridisierungsbedingungen, wie Temperatur und Pufferzusammensetzung, die Bedingungen so wählen, daß lediglich bei Vorhandensein der nachzuweisenden Nukleinsaure in dem Patientenmaterial mit der Oligonukleotidprobe ein Signal erhalten wird. Die jeweiligen Bedingungen, wie sie beispielsweise zum Durchführen der Southern-Blot- Analyse angewendet werden, sind beispielsweise ausführlich in Maniatis et al. (1989) beschrieben. Bei einem alternativen Ansatz dient das erfindungsgemäße Oligonukleotid als Primer zum Nachweis der Nukleinsaure mittels PCR. Auch die hierfür zu wählenden Hybridisierungs- und Reaktionsbedingungen sind dem Fachmann geläufig. Die Wahl der geeigneten Oligonukleotide ist dem Fachmann ohne weiteres auf Basis der hierin beschriebenen Sequenzen möglich.

Die erfindungsgemäße rekombinate Nukleinsaure enthält eine Nukleinsaure oder ein Oligonukleotid, wie oben beschrieben. Vorzugsweise handelt es sich sowohl bei der rekombinanten Nukleinsaure wie auch bei der erfindungsgemäßen Nukleinsaure sowie dem erfindungsgemäßen Oligonukleotid um eine DNA. Als rekombinate Nukleinsäuremoleküle kommen die üblichen Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren in Betracht. Dabei wird als rekombinate Nukleinsaure eine jede Nukleinsaure angesehen, bei der eine Nukleinsaure bzw. ein Oligonukleotid wie oben beschrieben mit einer weiteren Nukleinsaure verbunden ist, wobei die weitere Nukleinsaure in der natürlichen Umgebung der erfindungsgemäßen Nukleinsaure üblicherweise nicht vorliegt. Geeignete Vektorsysteme zum Kombinie- ren mit der erfindungsgemaßen Nukleinsaure bzw dem Oligonukleotid sind ebenfalls in Maniatis et al (1989) beschrieben

Der erfindungsgemaße Kit enthalt die Materialien, die notwendig sind zum Nachweis des erfindungsgemaßen Proteins und/oder der dafür kodierenden Nukleinsaure in einem vorgegebenen Probenmaterial Vorzugsweise handelt es sich bei dem Probenmaterial um Patientenmateπai, in dem das Protein bzw die entsprechende Nukleinsaure, insbesondere das NET1A-Transkrιpt, beispielsweise zum Erstellen einer Diagnose nachgewiesen werden soll Bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform enthalt der Kit Oligonukleotide, die als Pπmer geeignet sind zum Nachweis der erfindungsgemaßen Nukleinsaure mittels PCR Bei einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform kann der Kit auch einen Antikörper enthalten, der spezifisch ist für das erfindungsgemaße Protein Der Kit ist dann beispielsweise geeignet zum Nachweis von NET1 A in Patientenmateπal durch We- stern-Blotting

Die Herstellung des erfindungsgemaßen Antikörpers liegt im fachmannischen Können Einerseits kann ein polyklonales Antiserum hergestellt werden durch Verabreichen des erfindungsgemaßen Proteins an einen Sauger Bevorzugt sind jedoch monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemaße Protein Diese Antikörper lassen sich beispielsweise nach dem von Kohler und Milstein entwickelten Verfahren herstellen

Bei einer weiteren, besonders bevorzugten Ausfuhrungsform richtet sich der Antikörper gegen einen Proteinabschnitt aus dem Aminoterminus des erfindungsgemaßen Proteins Bei einer weiteren, besonders bevorzugten Ausfuhrungsform reagiert der Antikörper mit dem Proteinabschnitt von Position 1 bis 30 in der Sequenz nach SEQ ID Nr 1

Die erfindungsgemaßen Proteine, Nukleinsäuren bzw Antikörper finden vorzugsweise Einsatz als Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung Falls es die Indikation anzeigt, den körpereigenen NET1A-Proteιnspιegel anzu- heben, so kann das erfindungsgemaße Protein im Rahmen einer pharmazeutischen Zusammensetzung direkt verabreicht werden Alternativ kann auch durch gentherapeutische Maßnahmen der Spiegel an N ET 1 -Transkript gesteigert werden Hierzu kann die erfindungsgemäße Nukleinsaure unter der Kontrolle eines starken Promotors an den Patienten verabreicht werden

Schließlich eröffnet die vorliegende Erfindung auch die Möglichkeit, die Expres- sionsspiegel des Proteins und/oder dessen biologische Wirkung zu erniedrigen Hierzu kann beispielsweise eine erfindungsgemaße Nukleinsaure, die in Antisinn-Onentierung unter der Kontrolle eines starken Promotors steht, in den Organismus eingebracht werden. Die Expression der erfindungsgemaßen Nukleinsaure in Antisinn-Onentierung führt dazu, daß in vivo die Translation des NET1 A- Transkπpts blockiert und somit weniger erfindungsgemaßes Protein hergestellt wird. Alternativ kann die biologische Wirkung des Proteins durch Verabreichen eines Antikörpers, der spezifisch gegen das Protein gerichtet ist, erniedrigt werden.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Pra- disposition für Krebs oder der Diagnose von Krebs bereit Wie oben ausgeführt, besitzt das erfindungsgemaße Protein transformierende Aktivität im NIH3T3- Fokusbildungstest Wie ebenfalls oben ausgeführt, wird davon ausgegangen, daß das Protein maßgeblich an der Deregulation des Zellzyklus beteiligt ist Danach kann die (Uber-)expressιon von NET1 A zu einer unkontrollierten Zellproiiferation fuhren, wobei letztere schließlich zum Auftreten von Krebs führen kann Im Rahmen dieser Diagnose kann der Nachweis der Menge an erfindungsgemaßem Protein in einer Patientenprobe einen Hinweis auf das Risiko und/oder die Schwere einer Krebserkrankung geben Neben αem erfindungsgemaßen Protein kann auch die hierfür kodierende Nukleinsaure als diagnostischer Marker eingesetzt werden Dabei kann insbesondere die Menge an Transkript, die für ein Protein mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr 1 kodiert, ein Maß dafür sein, wie hoch das Risiko bzw wieweit fortgeschritten eine Krebserkrankung ist Der diagnostische Marker NETIA-Protein bzw allelische Varianten hiervon laßt sich beispielsweise mit Hilfe immunologischer Nachweisreaktionen ermitteln Zu diesem Zweck können beispielsweise die Proteine des Patientenmateπals elek- trophoretisch aufgetrennt und auf einen festen Trager übertragen werden Der Nachweis des diagnostischen Markers NET1A erfolgt dann beispielsweise durch Zugabe des erfindungsgemaßen Antikörpers, wie beim Westem-Blot-Verfahren Bei einem alternativen Diagnoseverfahren dient die erfindungsgemaße Nukleinsaure als diagnostischer Marker Dabei kann beispielsweise das Transkript, das für das erfindungsgemaße Protein kodiert, im Rahmen von Southern-Blot- Analysen nachgewiesen werden Dabei laßt sich beispielsweise das erfindungsgemaße Transknpt neben weiteren, gegebenenfalls auch vom NET1-Locus stammenden Transkripten nachweisen, indem eine Probe eingesetzt wird, die spezifisch ist für den die ersten 30 Aminosäuren kodierenden Abschnitt Dieser Nukleinsaureabschnitt entspricht dem ersten alternativen Exon, wie schematisch in Figur 1 angegeben Das erfindungsgemaße Transknpt für NET1 A laßt sich auch über die Große von dem nicht-transformierenden NET1 -Transknpt unterscheiden Das erfindungsgemaße Transknpt ist ca 150 Nukieotide kurzer als das nicht-transformierende NET1 -Transknpt Letzteres kodiert für ein Proteinprodukt, das ca 53 Aminosäuren langer ist als NET1A

Die erfindungsgemaße Nukleinsaure als diagnostischer Marker laßt sich auch spezifisch durch PCR nachweisen Zu diesem Zweck kann beispielsweise ein Primer eingesetzt werden, der spezifisch ist für die das alternative Exon umfassende Nukleinsaure, wahrend der zweite Primer beliebig innerhalb der Gesamtsequenz wahlbar ist Bei dieser Pπmerkombination wird lediglich das das alternative Exon enthaltende Transknpt amplifiziert und somit nachgewiesen Ein Nachweis des erfindungsgemaßen Transkripts über seine geänderte Transkπpt- lange ist auf diesem Wege ebenfalls möglich Schließlich bietet die zusätzliche Spaltung der amplifizierten Nukleinsaure mit Restriktionsenzymen eine weitere Möglichkeit zwischen dem erfindungsgemaßen Transknpt und den weiteren Transkripten der Zelle zu unterscheiden Desweiteren eröffnet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, Moleküle mit an- tineopiastischer Wirkung zu identifizieren Dabei kann das zu untersuchende Molekül mit einer Probe in Kontakt gebracht werden, die das erfindungsgemaße Protein und/oder die erfindungsgemaße Nukleinsaure enthalt Wie oben ausgeführt, spielt das erfindungsgemaße Protein eine Rolle bei der neoplastischen Transformation, wobei davon auszugehen ist, daß das Risiko einer neoplasti- schen Transformation zunimmt mit der gesteigerten Expression des Proteins In dem erfindungsgemaßen Screening-Verfahren lassen sich somit also beispielsweise Moleküle austesten, die einen Einfluß auf die Expressionsspiegel des erfindungsgemaßen Proteins zeigen Im einfachsten Fall wird die Expressionsrate des erfindungsgemaßen Proteins einer nicht behandelten Zelle verglichen mit der Expressionsrate einer Zelle nach Kontakt mit dem zu testenden Molekül

Auf ähnliche Weise können auch Moleküle identifiziert werden, die die Apoptose- vorgange in Zellen beeinflussen Wie oben ausgeführt, wird NET1A wahrend der Apoptose in hamatopoetischen Zellen induziert und ist an der Regulation des programmierten Zelltods beteiligt Demzufolge können im Rahmen der vorliegenden Erfindung Substanzen auf ihren möglichen Einfluß auf Apoptosevorgange getestet werden, indem untersucht wird, inwieweit die Moleküle zu einer veränderten Expression des erfindungsgemaßen Proteins oder zu einer veränderten biologischen Aktivität des Proteins fuhren

Schließlich ermöglicht die vorliegende Erfindung auch die Bereitstellung des erfindungsgemaßen Proteins in großen Mengen indem die für die rekombinante Herstellung erforderlichen Mittel bereitgestellt werden Zu diesem Zweck wird eine rekombinante Nukleinsaure, die für das gewünschte Protein kodiert, in einer Wirtszelle expπmiert Hierfür kommen die üblichen prokaryontischen sowie eu- karyontischen Wirtsorganismen und Expressionssysteme in Betracht Die einzelnen Maßnahmen zur rekombinanten Herstellung eines Proteins sind dem Fachmann geläufig und finden sich beispielsweise in Maniatis et al (1989)

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung 11

Klonierunq des erfindungsgemaßen Proteins mit Hilfe der Genfallenintegration in ein alternatives Exon von NET1

Das Prinzip der Genfallenintegration ist ausführlich in PCT/EP97/06816 sowie Russ et al. (1996) beschrieben. Bei den hierin durchgeführten Untersuchungen mit hämatopoetischen Zellen wurde ein Transknpt identifiziert, das ein neues 5'- Exon enthält. Dieser Vorgang ist schematisch in Figur 1 dargestellt. Das bekannte Produkt des NET1 -Locus unterscheidet sich von dem erfindungsgemaßen Produkt durch den 5'-Termιnus, indem beim vorbekannten Produkt dieser 5'- Terminus durch ein anderes Exon kodiert wird Die Genfallenintegration zeigt weiterhin, daß das identifizierte alternative Transkript tatsachlich in Zellen, d.h. in vivo, vorliegt und nicht das Ergebnis eines Klonierungsartefakts ist.

Induktion von NET1A in IL3-entzoqenen FDCP1 -Zellen

Zur Untersuchung der Induzierbarkeit von NET1 A-Transkripten während der Apoptose wurden zwei zellulare Modelle eingesetzt. Zum einen wurde FDCP1- Zellen, der Wachstumsfaktor IL3 für 0,5 bis 12 Stunden entzogen, und ausgewählte mRNAs mittels RT-PCR nachgewiesen. Zum anderen wurden embryonale Stammzellen der Maus (ES-Zellen) zum Differenzieren induziert und mRNAs nach 1 bis 7 Tagen auf Northern-Blots mit der alternativen NET1 A-Exonsequenz hybridisiert In beiden Modellen wird unter den oben angegebenen Bedingungen Apoptose induziert Figur 2 zeigt, daß schon nach 0,5 Stunden nach IL3-Entzug NET1 A induziert wird. Dies wird aus Figur 2 ersichtlich, bei der GAPDH-PCR mit 21 Zyklen und die NET1- und NET1A-PCRs jeweils mit 33 Zyklen durchgeführt wurden. Die Pπmer fur die Spleißvarianten NET1 und NET1A waren für die alternativen Exons spezifisch. Die PCR-Reaktionsansatze von GAPDH, NET1 und NET1A wurden für die jeweiligen Zeitpunkte miteinander zu gleichen Teilen ge- poolt und in 2 % Agarosegelen aufgetrennt Im Gegensatz zu dem Ergebnis für NET1A wird die bekannte NET1 -Variante nicht induziert Dies zeigt, daß NET1A nicht hingegen NET1 , eine direkte oder indirekte Rolle bei der Regulation der 12

Apoptose spielt Dieses Ergebnis wurde in einem weiteren Versuch mit differenzierenden ES-Zellen bestätigt Diese Versuche zeigten, daß NET1A im Stadium der "embryoid body"-Bildung (Tag 7) (vgl auch Dotschmann et al , 1985) induziert wird Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt Bei diesen Versuchen wurde eine Northern-Blot-Hybndisierung mit P³²-markιerten NET1A- (oben) und L32- (unten) Sonden durchgeführt Die NET1A-Sonde enthielt nur das alternative Exon 1 In dem genannten Differenzierungsstadium von ES-Zellen findet bekanntlich vermehrte Apoptose statt

Transformation von NIH3T3-Zellen zur Uberexpression von NET1A

NET1- und NET1A-kodιerende Regionen wurden mit Exon-1 -spezifischen und gemeinsamen 3'-Prιmem aus differenzierenden ES-Zellen amplifiziert und in den retroviralen Expressionsvektor MLDelSM401 (vgl Hildinger et al , 1998) kloniert Die spezifischen Pnmer waren wie folgt

Exon 1-NET1A 5'-GTGTAGTCATGCAGTGATCCGTACAGGATCCGTAAAGCATGGTGGCGC-3'

Exon 1-NET1A 5'-GTGTAGTCATGCAGTGATCGTACAGGATCCGGACATGGAGCC-3'

C-termιnal-NET1

5'-TTACGGACACTAGCACTTCGACGGATCCTTACACCAAAGTCTCTTTC^"

TGC-3'

Die Amplifikation der NET1 -Varianten erfolgte mit der pfu-Polymerase (Strata- gene) nach Anleitung des Herstellers Die Konstrukte pMLdelAstopl (enthalt NET1A, vgl Figur 4A) und pMLdelBstop4 (enthalt NET1 , vgl Figur 4B) wurden in ekotrope φnx-Verpackungszellen transfiziert (vgl Pear et al , 1993) Nach 24- stundiger Inkubation wurden die NIH3T3-Zellen mit φnx-Virusuberstanden infiziert Stabile NET1A- und NET1-exprιmιerende Klone wurden über "limiting 13

dilution" isoliert und expandiert Zur Untersuchung der transformierenden Wirkung der beiden Spleißvarianten wurden mit den einzelnen Klonen Kontaktinhibitionsversuche ("focus forming assays") durchgeführt (Baasner et al , 1996) Den oben angegebenen retroviralen Expressionsvektoren liegt das Plasmid pUC19 zugrunde

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt

TABELLE 1

Fokusbildung durch NET1A- und NET1-exprιmιerende Klone

Zel nie¹ Foci' Expression^"3

3T3 0 ND

NET1A1 200 +++

NET1A4 400 ++

NET1A7 40 +

NET1 B2 0 +

NET1 B6 0 ++

NET1 B9 0 ++

¹ NET1A, NET1A4 und NET1A7 sind Klone, die die neue Spleißva aπte (NETΪA) exprimieren NET1 B2, NET1 B6 und NET1 B9 sind Klone, die die bekannte Spleißvanante (NET1 ) exprimieren

² Die "focus forming assays" wurden, wie früher beschrieben durchgeführt (Baasner et al 1996)

³ Die Expression der transduzierten NET -Varianten wurde über Dot-blot nachgewiesen

Zellkultur

Die FDCP1 -Zellen wurden bei Konzentrationen von 1 x 10⁶ Zellen pro ml in Dul becco's modifiziertem Eagles Medium (DMEM Gibco) ergänzt mit 10% (v/v) 14

fötalem Kälberserum (Hyclone, Utah, USA) und 5 ng/ml rekombinaten Mäuse-IL3 (Novartis) gezüchtet. Zur Apoptoseinduktion wurden die Zellen unter gleichen Bedingungen ohne IL3 inkubiert.

D3 ES-Zellen (von Melchner et al., 1992) wurden auf bestrahlten (32Gy) Feeder- Zellen in DMEM, 15% FKS (Linaris, Bettingen), 100 mM nicht-essentielle Aminosäuren (GibcoBRL), 0,1 mM ß-Mercaptoethanol (Sigma), 1000 U/ml LIF (Esgro®; GibcoBRL) gezüchtet. Differenzierung wurde in DMEM, 20% FCS, 0,3 mM ß-Mercaptoethanol und 100 mM nicht-essentielle Aminosäuren in Abwesenheit von LIF und Feeder-Zellen in bakteriellen Petrischalen induziert. Unter diesen Bedingungen bilden sich sogenannte "embryoid bodies" (Doetschman et. al, 1985).

RT-PCR

Gesamt-RNA wurde nach der Methode von Chirgwin et al. (1979) isoliert. Semiquantitative RT-PCR: Je 1 μg Gesamt-RNA wurde durch reverse Transkription (RT) in cDNA umgeschrieben. Als Primer wurden randomisierte Oligonukleotid- Hexamere (rHex) benutzt.

Reaktionsansatz A: 1 μl rHex (0,2 μg/μl) 1 μl RNA (1 μg/μl) 9 μl H₂0 (RNase-frei)

Reaktionsansatz B: 6 μl 5 x RT-Puffer (GibcoBRL)

3 μl l OO mM DTT

3 μl dNTP (je 10 mM)

1 μl RNasin (Pharmacia, RNAguard, 40 U/μl)

0,4 μl Superscript II (GibcoBRL)

4,6 μl H₂0 (Rnase-frei) 15

Reaktionsansatz A wurde 10 min auf 65°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und dann zu Reaktionsansatz B gegeben. Danach wurde das Reaktionsgemisch über 15 Minuten von 30°C auf 45°C erhitzt und bei dieser Temperatur für weitere 1 ,5 Stunden inkubiert. Nach Inaktivierung bei 65°C für 30 min wurden jeweils 1 μl des re- versen Transkriptionsproduktes für die PCR eingesetzt. Die PCR wurde mit Gibco-Taq-Polymerase nach Anleitung des Herstellers in einem Perkin Eimer Thermocycler wie folgt durchgeführt: 5 min 94°C; 33 Zyklen (1 min 94°C, 1 min 61 °C, 1 min 72°C) und 15 min 72°C. die spezifischen Primer waren wie folgt:

NET1 A: S'-AAGGACACTTGTAAAGCATGGTGG-S'

S'-CGGAAGGGCTGGTTATTAACATC-S'; NET1 : 5'-GTCTCAATGCTCAGCGAGGAAC-3'

5'-CAAATCAAGGCTGCTAAGGCTTCA-3'; GAPDH: 5'-TTGAAGGGTGGAGCCAAACG-3^*

5'-AGTGGATGCAGGGATGATGTTC-3'.

Northem-Blot-Hybridisierungen wurden nach Standardmethoden mit dem ³²P- markierten alternativen Exon 1 (NET1A) und L32 (Neznanov et al., 1993) Sonden durchgeführt.

SEQUENZPROTOKOLL

Die SEQ ID Nr. 1 stellt das Humanprotein dar. Die SEQ ID Nr. 2 stellt das Mausprotein dar. Die SEQ ID Nr. 3 stellt die humane cDNA dar. Die SEQ ID Nr. 4 stellt die Maus-cDNA dar.

LITERATURSTELLEN 1 6

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Claims

19Patentansprüche

1 Proteinvariante von NET1 (NET1A), umfassend die Sequenz M bis Q an Position 1 -30 gemäß SEQ ID Nr 1 und davon durch Substitution, Addition, Insertion und/oder Deletion abgeleitete Derivate

2 Protein nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz umfaßt, ausgewählt aus SEQ ID Nr 1 und SEQ ID Nr 2

3 Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz gemäß SEQ ID Nr 1 umfaßt oder davon durch Substitution, Addition und/oder Deletion abgeleitete Derivate

4 Nukleinsaure, umfassend eine Sequenz, die für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert, oder hierzu komplementäre Nukleinsaure

5 Nukleinsaure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz umfaßt, die für die Proteinsequenz gemäß SEQ ID Nr 1 oder SEQ ID Nr 2 kodiert

6 Oligonukleotid, das spezifisch mit einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 4 bis 5 hybridisiert

7 Oligonukleotid nach Anspruch 6, das spezifisch mit einer Nukleinsaure, die für die SEQ ID Nr 1 oder 2 kodiert, oder mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr 3 oder Nr 4 hybridisiert oder hierzu komplementäres Oligonukleotid

8 Rekombinante Nukleinsaure, enthaltend eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 4 oder 5 und/oder ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 6 oder 7 20

9. Kit zum Nachweis von NET1A und/oder dafür kodierender Nukleinsaure, enthaltend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder eine Nukleinsaure und/oder ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 8.

10. Antikörper, der spezifisch ist für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 4 bis 8 und/oder einen Antikörper nach Anspruch 10.

12. Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition für und/oder von Krebs, umfassend den Schritt

- Nachweisen eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 5 oder 6 in einer Patientenprobe.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsaure durch spezifische Hybridisierung mit einer Nukleinsaure und/oder einem Oligonukleotid nachgewiesen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsaure durch PCR und gegebenenfalls anschließende Restriktionsenzymspaltung nachgewiesen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das Protein durch immunologische Nachweisreaktionen nachgewiesen wird.

16. Screening-Verfahren zum Identifizieren von Molekülen mit antineoplastischer Wirkung, umfassend den Schritt 21

- Inkontaktb ngen der zu untersuchenden Moleküle mit einer Probe, enthaltend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 4 bis 5.

17. Screening-Verfahren zum Identifizieren von Molekülen mit Wirkung auf Apoptosevorgänge, umfassend den Schritt

- Inkontaktbringen der zu untersuchenden Moleküle mit einer Probe, enthaltend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 4 bis 5.

18. Verfahren zum Herstellen eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend den Schritt

- Exprimieren einer rekombinanten Nukleinsaure nach Anspruch 8 in einer Wirtszelle.

19. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 4 oder 5 als Target in der Krebsdiagnose, Krebstherapie und/oder zur Beeinflussung der Apoptose.