DE19838837A1 - Zellspezifische Promoter des Entkopplungsproteins 3 - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung liegt im Feld der Genpromoter, die die Transkription von Proteinen vermitteln, die eine Rolle im Energiehaushalt von Zellen und bei der Fettleibigkeit spielen. Gegenstand der Erfindung sind DNS-Moleküle, die rekombinante zellspezifische Promoter des Entkopplungsproteins 3 (Engl.: Uncoupling protein 3; UCP 3) oder funktionelle Derivate davon enthalten. Ferner betrifft die Erfindung Zellen, die diese DNS-Moleküle enthalten. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verwendungen dieser DNS-Moleküle und der erfindungsgemäßen Zellen sowie Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription beeinflussen können. Diese Verfahren können auch im Hochdrucksatzmusterungsformat durchgeführt werden. Ferner werden Verfahren offenbart, die es erlauben, Substanzen oder Faktoren zu finden, die an die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle binden.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt im Feld der Genpromoter von Proteinen, die eine Rolle im Energiehaushalt von Zellen und bei der Fettleibigkeit spielen. Gegenstand der Erfindung sind rekombinante DNS-Moleküle (DNS: Desoxyribonukleinsäure), die zellspezifische Promoter des Entkopplungsproteins 3 (Engl.: Uncoupling protein 3; UCP 3) oder funktionelle Derivate davon enthalten. Ferner betrifft die Erfindung Zellen, die diese rekombinanten DNS-Moleküle enthalten, Verwendungen dieser DNS-Moleküle und der erfindungsgemäßen Zellen, sowie Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription der erfindungsgemäßen Promoter beeinflussen oder die an die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle binden.

Bei der Fettleibigkeit handelt es sich um eine Krankheit, bei der sich das Fettgewebe infolge einer positiven Energiebilanz vermehrt. Dies kann Folge übermäßiger Nahrungsaufnahme oder Symptom einer Stoffwechselerkrankung sein (ROCHE Lexikon Medizin, 3. Auflage, Urban & Schwarzenberg). Fettleibigkeit ist ein häufiges ernährungsbedingtes Problem in den westlichen Industrieländern und spielt eine wichtige Rolle als Krankheits- und Todesursache (McGinnis and Foege, 1993; Manson et al., 1995). Da Fettleibigkeit durch einen ständiges Ungleichgewicht zwischen Nahrungsaufnahme und Energieumsatz verursacht wird, könnte eine chronische Reduktion des Energieumsatzes ein Risikofaktor für diesen Zustand sein. Tatsächlich ist ein geringerer Energieumsatz im Ruhezustand ein Risikofaktor für Fettleibigkeit (Ravussin et al., 1988; Griffiths et al., 1990). Genetische Faktoren tragen signifikant zu der Höhe des Energiegrundumsatzes bei (Bogardus et al., 1986; Bouchard et al., 1989). Braunes Fettgewebe (Brown Adipose Tissue; BAT) ist auf Thermogenese spezialisiert, eine der Hauptfaktoren des Energieumsatzes (Himms-Hagen, 1989). Eine zentrale Bedeutung bei der thermogenen Funktion des BAT haben die sogenannten Entkopplungsproteine 1, 2 und 3 (Engl.: uncoupling proteins; Abk.: UCPs) (Klaus et al., 1991; Boss et al., 1997; Fleury et al. 1997; Gimeno et al., 1997; Gong et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997). Diese Proteine stimulieren die Wärmeerzeugung, indem sie die Substratoxidation von der ATP-Synthese entkoppeln (Ricquier et al. 1991). Während die Wichtigkeit des BAT als ein Regulator des Körperfettspeichers für Nagetiere gezeigt wurde (Lowell et al., 1993; Kopecky et al., 1995), ist dessen Rolle bei der Fettleibigkeit des Menschen nicht klar, weil Erwachsene sehr wenig BAT besitzen (Krief et al. 1993). Ungeachtet dieser Einschränkung wurde im intraperitonealen Fettgewebe von fettleibigen Individuen ein signifikant geringerer UCP1-mRNS-Gehalt (RNS: Ribonukleinsäure; mRNS: Botenribonukleinsäure) im Vergleich zu schlanken Kontrollpersonen gefunden (Oberkofler et al., 1997). Ein großer Teil der Schwankungen der Menge der UCP1-mRNS in fettleibigen Individuen wurde durch gewöhnliche Sequenzveränderungen im UCP1- Genlokus erklärt (Esterbauer et al., im Druck). Ein Beitrag von UCP1 und BAT zum Energiegrundumsatz ist daher denkbar.

UCP2 und UCP3, zwei andere kürzlich entdeckte Mitglieder der UCP-Familie, werden im Menschen und im Nagetier in verschiedenen Geweben exprimiert. UCP2-mRNS kann im weißen Fettgewebe, BAT, Lunge, Leber, Milz und Makrophagen gefunden werden (Fleury et al., 1997; Gimeno et al., 1997), während hohe UCP3-mRNS-Mengen im Skelettmuskel und BAT beobachtet werden (Boss et al., 1997; Gong et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997). Studien in UCP1 gendefizienten Mäusen (Enerback et al., 1997) und in schlanken Ratten, die Leptin überexprimieren (Zhou et al., 1997), unterstützen ein Modell, in dem UCP2 als ein Reservesystem für die Thermogenese fungieren kann, wenn UCP1 defizient ist und/oder sich die Menge an Leptin aufgrund von Übergewicht vergrößert. UCP3 könnte profunde Effekte auf die Energiehomöostase haben, weil Muskelgewebe einen großen Teil des Katecholamins enthält und für die ernährungsinduzierte Thermogenese sowohl in Menschen (Astrup et al., 1986) als auch in Ratten (Thurlby und Ellis, 1986) verantwortlich ist.

Die menschlichen UCP2 und UCP3-Gene wurden in der Chromosomenregion 11q13 lokalisiert (Fleury et al., 1997; Solanes et al., 1997; Boss et al., 1998). Die Untersuchung der Stammbäume der Quebec-Familienstudie lieferte sehr starke Indizien, daß diese chromosomale Region mit dem Energieumsatz im Ruhezustand, dem Körpergewichtsindex (Body mass index, BMI) und der Fettmasse in Erwachsenen assoziiert ist (Bouchard et al., 1997). Darüber hinaus ist die syntene Region auf dem Chromosom 7 der Maus für Fettleibigkeit und insulinunabhängigen Diabetes Mellitus verantwortlich (Hashimoto et al., 1994; Warden et al., 1995).

Im Vergleich zu schlanken Kontrollpersonen war die Menge an UCP2-mRNS im intraperitonealen Fettgewebe von krankhaft fettleibigen Personen reduziert. In Übereinstimmung mit einer Rolle bei der Pathophysiologie der Fettleibigkeit blieb die Menge der UCP2-mRNS in Patienten nach überstandener Fettleibigkeit niedrig, sowohl vor als auch nach der Gewichtsreduktion (Oberkofler et al., im Druck). Im Gegensatz dazu Unterschied sich die Menge der UCP3-mRNS im Muskelgewebe zwischen fettleibigen und schlanken Individuen nicht (Millet et al., 1997), aber diese Ergebnisse müssen mit Vorsicht interpretiert werden. Erstens wurden gewebsspezifische Unterschiede in der Regulation der UCP3-Expression in Nagetieren gefunden (Gong et al., 1997; Larkin et al., 1997; Boss et al., 1998). Zweitens wurden zwei verschiedene Isoformen (UCP3_L und UCP3_S) des menschlichen UCP3-Gens durch Klonierung der zur mRNS komplementären DNS (Engl.: complementary DNA; cDNA) gefunden. Ein Polyadenylierungssignal in Intron 6 wird in einem signifikanten Teil der UCP3-Transkripte für die Bildung von UCP3_S benützt, wobei ein zweites Polyadenylierungssignal in Exon 7 für die Bildung von UCP_L benützt wird. Der UCP3_S-Form fehlt aufgrund einer C-terminalen Trunkierung die sechste vorhergesagte Transmembrandomäne und die Purinnukleotidbindungsdomäne, die für die Inhibition der UCP-Aktivität durch Nukleotide verantwortlich gemacht wird (Jezek et al., 1994). Die Trunkierung des UCP3 Moleküls könnte auf diese Art und Weise die UCP3-Aktivität erhöhen, aber eine fehlerhafte Membraninsertion könnte die Stabilität und Funktion von UCP3 beeinflussen.

Es ist wünschenswert, bessere Behandlungsmethoden für die Fettleibigkeit zu finden. Von Vorteil sind Substanzen, die den Patienten möglichst schmerz- und nebenwirkungsfrei verabreicht werden können. Eine Möglichkeit, die Suche nach derartigen Substanzen zu vereinfachen, besteht darin, körpereigene Faktoren zu identifizieren, die eine wesentliche Rolle bei diesem Krankheitsgeschehen spielen. Diese könnten ein Zielmolekül (Engl.: target) für geeignete Substanzen sein, wobei durch die Wechselwirkung die Aktivität oder die Eigenschaften des körpereigenen Faktors in einer für den Patienten positiven Weise beeinflußt werden soll. Geeignete Zielmoleküle könnten auch definiert werden, wenn für bereits bekannte körpereigene Faktoren die Mitwirkung am krankheitsauslösenden Geschehen nachgewiesen werden kann. Diese Substanzen können nach der Identifikation eines geeigneten Zielmoleküls mit einer größeren Aussicht auf Erfolg gefunden werden, indem der Einfluß einer möglichst großen Zahl von Verbindungen auf die Aktivität oder Eigenschaften des Zielmoleküls gemessen wird. Diese Verbindungen können einer Naturstoff oder Substanzbibliothek entstammen, wobei hier auch die Kombinatorische Chemie wertvolle Beiträge liefern kann. Zur Beschleunigung dieser Verfahren werden die Analysen im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High throughput screening, HTS) durchgeführt. Naturgemäß werden nur wenige Substanzen aufgefunden, die aber als Basis für die chemische Derivatisierung und Optimierung und die anschließende pharmakologische Charakterisierung dienen können.

Für das UCP3-Gen sind im Stand der Technik die aus der cDNS abgeleitete Aminosäuresequenz, die cDNS-Sequenz (GenBank Zugangsnummer U84763), die genomische DNS-Sequenz inklusive der Lage der Exons und der Introns (Boss et al., 1998) und ein Teil des 5'-nichtkodierenden Bereiches vorbekannt (GenBank-Zugangsnummer AF032871). Ferner war die Lage eines Promoters und eines TATA-Signals bekannt (Eintrag AF032871 in der Datenbank GenBank). Die genomische DNS-Sequenz des UCP3- Gens einschließlich der Introns und Exons und der 5'-Region ist übersichtshalber dieser Anmeldung beigefügt (siehe SEQ ID NO: 17).

Überraschenderweise wurde nun im Rahmen dieser Erfindung gefunden, daß sich im von dem TATA-Signal stromaufwärts liegenden Bereich ein zusätzlicher Promoter befindet, der präferentiell in Fettzellen aktiv ist (siehe Beispiel 1). Das UCP3-Gen wird sonst nur noch im Skelettmuskel stark exprimiert, aber dort unter Verwendung des bekannten Promoter, wie überraschenderweise im Rahmen dieser Erfindung gefunden wurde (siehe Beispiel 1). Es ist vorteilhaft, den präferentiell in Fettzellen oder in Muskelzellen aktiven Promoter zu beeinflussen, da dies zur Behandlung der Fettleibigkeit dienen könnte. Dies ist besonders vorteilhaft, weil hiermit ein Faktor moduliert werden kann, der ausschließlich in bestimmten Bereichen des Körpers aktiv ist. Dazu können nun DNS-Konstrukte hergestellt werden, die es erlauben, die fettzellspezifische oder die muskelzellspezifische Transkription des UCP3- Gens zu untersuchen und entsprechende Substanzen zu deren Modulation zu finden. Dazu muß nur der entsprechende Anteil des im anderen Zelltypus aktiven UCP3-Promoters entfernt werden.

Die Aufgabe der Bereitstellung eines neuen geeigneten Zielmoleküls konnte somit mit der vorliegenden Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche gelöst werden. Erfindungsgemäß werden rekombinante DNS-Moleküle mit zellspezifischen Promotern des UCP3-Gens bereitgestellt. In diesem Zusammenhang werden auch rekombinante DNS-Moleküle, die funktionelle Derivate der erfindungsgemäßen Promoter enthalten oder bestimmte Teile der 5'-Sequenz des UCP-3 Promoters umfassen, von der vorliegenden Erfindung offenbart. Weiterhin werden auch Zellen von der vorliegenden Erfindung umfaßt, die erfindungsgemäße DNS-Moleküle enthalten. In einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung dieser DNS-Moleküle oder der erfindungsgemäßen Zellen zur Transkription eines Gens oder zum Auffinden von Substanzen offenbart, die die Transkription beeinflussen. Weiterhin werden von der Erfindung Verfahren umfaßt, die es erlauben, Substanzen aufzufinden, die die Transkriptionsrate des beeinflussen. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High throughput screening, HTS) durchgeführt. Weiterhin werden Verfahren offenbart, die es erlauben, Substanzen oder Faktoren zu finden, die an die erfindungsgemäßen DNS- Moleküle binden.

Durch diese Erfindung wird ein rekombinantes DNS-Molekül offenbart, das den präferentiell in Fettzellen aktiven UCP3-Promoter enthält, aber nicht den bekannten, in Muskelzellen aktiven UCP3-Promoter. Dieses rekombinante DNS-Molekül enthält die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC, nicht jedoch die SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC. Es können aber auch die Sequenzen, die für den in Muskelzellen aktiven Promoter wichtig sind, durch Punktmutation oder Deletionen oder Kombinationen davon so verändert sein, daß sie ihre Funktion in der Transkription verlieren. Zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 können 30 bis 50 Basenpaare, bevorzugt 40 bis 45 Basenpaare, besonders bevorzugt 42 Basenpaare liegen. In einer weiteren Ausführungsform ist das beschriebene DNS-Molekül weiter dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich ein RXR/PPAR- Element (Schoonjans et al., 1996) liegt, das bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 bevorzugt 65 bis 75 Basenpaare liegen. Eine Übersicht über wesentliche Promoterelemente wurde von Locker und Buzard (1990) gegeben. Ein weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Alu-Sequenz liegt, wobei zwischen der Sequenz SEQ ID NO: 1 und der Alu-Sequenz 255 bis 265 Basenpaare liegen können. Im Sinne der Erfindung ist unter Alu-Sequenz ein nur im menschlichen Genom vorkommender Abschnitt von etwa 300 Basenpaaren zu verstehen, der zu den hochrepetitiven DNS-Sequenzen gehört und etwa in der Mitte ein Schnittstelle für das Restriktionsenzym Alu I trägt. Das beschriebene DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich ein E2A-Element (Locker und Buzard, 1990; Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park und Walker, 1992) ist, das der Sequenz SEQ ID NO: 6 CAGATG entspricht, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6 440 bis 450 Basenpaare liegen können. Das beschriebene DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: : 1 zusätzlich eine E-Box (Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park und Walker, 1992) ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 7 CACTTG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 7 450 bis 460 Basenpaare liegen können. Das beschriebene DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine weitere E-Box (Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park und Walker, 1992) ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 8 CATTTG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 8 460 bis 470 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Oktamersequenz (Locker und Buzard, 1990) sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 9 515 bis 525 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine weitere CAAT- Box (Locker und Buzard, 1990) sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 10 CCAAT umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 10 560 bis 570 Basenpaare liegen können. Die CAAT-Box (Locker und Buzard, 1990) ist Teil einer bei vielen eukaryontischen Genen, im 5 '-flankierenden Bereich der kodierenden Region beobachteten, konservierten Basenabfolge. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine weitere CAAT-Box (Locker und Buzard, 1990) sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 11 ATTGG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 11 670 bis 680 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine CAAT-Box (Locker und Buzard, 1990) angeordnet sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 12 ATTGG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 12 730 bis 740 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor (Engl.: USF; Locker und Buzard, 1992) angeordnet ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 13 CCACGTGC umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 13 845 bis 855 Basenpaare liegen können.

Durch diese Erfindung wird ein weiteres rekombinantes DNS-Molekül offenbart, das nicht den präferentiell in Fettzellen aktiven UCP3-Promoter enthält, aber den in Muskelzellen aktiven Promoter. Dieses rekombinante DNS-Molekül enthält die Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC, nicht jedoch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC. Es können aber auch die Sequenzen, die für den in Fettzellen aktiven Promoter wichtig sind, durch Punktmutation oder Deletionen oder Kombinationen davon so verändert sein, daß sie ihre Funktion in der Transkription verlieren. Zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 können 45 bis 70 Basenpaare, bevorzugt 52 bis 58 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt 55 Basenpaare liegen. In einer weiteren Ausführungsform ist das beschriebene DNS-Molekül weiter dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich ein RXR/PPAR- Element liegt, das bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT umfaßt. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Alu-Sequenz ist. Das beschriebene DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich ein E2A-Element ist, das der Sequenz SEQ ID NO: 6 CAGATG entspricht. Das beschriebene DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine E-Box ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 7 CACTTG umfaß. Das beschriebene DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine weitere E-Box ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 8 CATTTG umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Oktamersequenz sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine weitere CAAT- Box sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 10 CCAAT umfaß. Die CAAT-Box ist Teil einer bei vielen eukaryontischen Genen, im 5'-flankierenden Bereich der kodierenden Region beobachteten, konservierten Basenabfolge. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine weitere CAAT-Box sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 11 ATTGG umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine CAAT-Box angeordnet sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 12 ATTGG umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor angeordnet ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 13 CCACGTGC umfaßt.

Weiter werden von der Erfindung auch DNS-Moleküle umfaßt, die die Sequenz SEQ ID NO 14 oder eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO 14 hybridisiert, enthalten. Unter stringenten Bedingungen versteht der Fachmann Bedingungen, die für mehr als 85%, bevorzugt mehr als 90% Homologie selektieren (Sambrook et al., 1989). Die Hybridisierungen werden in 6×SSC/5×Denhardt's Lösung/ 0,1% SDS (SDS: Natriumdodekylsulfat) bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringenz wird im Waschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 85% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,2×SSC/ 0,01% SDS/65°C und für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 90% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1×SSC/0,01% SDS/65°C geeignet. Die Zusammensetzung der Reagenzien wird in Sambrook et al. (1989) beschrieben.

Weiterhin werden von der Erfindung funktionelle Derivate der erfindungsgemäßen, DNS- Moleküle mit den zellspezifischen UCP3-Promotern umfaßt. Im Sinne der Erfindung werden unter funktionellen Derivate alle DNS-Sequenzen verstanden, die durch Punktmutationen oder Deletionen oder Kombinationen von Punktmutationen oder Deletionen aus der Ursprungssequenz hervorgegangen sind. Diese funktionellen Derivate haben erfindungsgemäß die gemeinsame Eigenschaft, die Transkription eines am 3'-Ende des funktionellen Derivats fusionierten Gen zu vermitteln. Es liegt im Können eines Durchschnittsfachmanns, diese funktionellen Derivate durch zielgerichtete oder zufällige Mutagenese oder durch die Einführung von Deletionen aus den erfindungsgemäßen Sequenzen herzustellen. Genaue Verfahren werden von Sambrook et al. (1989) beschrieben. Es können z. B. Oligonukleotid-gerichtete oder zufällige Mutageneseverfahren verwendet werden. Für das letztere Verfahren kann auch die Polymerase-Kettenreaktion benützt werden, die ungenau arbeitet, wenn sie unter suboptimalen Bedingungen durchgeführt wird (Lin-Goerke et al., 1997). Die Einführung von Deletionen kann z. B. durch die Verwendung von Oligonukleotiden mit Methoden der zielgerichteten Mutagenese oder bevorzugt durch Amplifikation gewünschter Bereiche mittels Polymerase-Kettenreaktion erfolgen. Der Durchschnittsfachmann kann ein funktionelles Derivat ermitteln, indem er die Aktivität eines am 3'-Ende des funktionellen Derivats fusionierten Reportergens, wie z. B. Luciferase, bestimmt. Besonders bevorzugt wird die Aktivität eines funktionellen Derivats durch den Chloramphenicoltransferase-Test bestimmt (engl.: "CAT-Assay"), der nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt wird. Als ein funktionelles Derivat wird der Durchschnittsfachmann eine durch Punktmutation oder Deletion oder Kombination der beiden Veränderungen Sequenz erachten, die in einem der beiden vorgenannten Tests ein über dem Hintergrund liegendes Signal ergibt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegen die erfindungsgemäßen DNS- Moleküle in Form von Vektoren vor, insbesondere von Expressionsvektoren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNS-Molekül ein Plasmid. In einer anderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNS-Molekül ein viraler Vektor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNS-Moleküle offenbart, die zusätzlich zu der DNS-Sequenz der erfindungsgemäßen Promoter noch weitere Gene enthalten, die funktionell mit den erfindungsgemäßen Promoteren verknüpft sind. Im Sinne dieser Erfindung soll unter funktionell verstanden werden, daß die Verknüpfung in einer Weise vorgenommen werden soll, die es ermöglicht, entweder das Gen zu transkribieren oder das Gen zu transkribieren und dessen Translationsprodukt zu erhalten. Bei den Genen kann es sich um die cDNS oder die genomischer Sequenz des Entkopplungsproteins 3 oder um Reportergene handeln. Bei den Translationsprodukten der Reportergene handelt es sich bevorzugt um Proteine, deren Menge durch Bestimmung der Aktivität, Absorption, Luminiszenz oder Fluoreszenz leicht bestimmt werden kann, wie z. B. dem grün fluoreszierenden Protein (Engl.: Green Fluorescent Protein; GFP), der Chloramphenicol- acetyl-transferase, der β-Galactosidase, der sekretierten Alkalischen Phosphatase oder der Luziferase. Im Sinne dieser Erfindung sollen unter grün fluoreszierenden Protein auch alle Varianten verstanden werden, die in anderen Wellenlängenbereichen fluoreszieren, aber sich von der Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins ableiten. Besonders bevorzugt handelt es sich um bei den durch das Reportergen kodierten Proteinen um Enzyme, die eine Reaktion katalysieren, deren Endprodukt leicht quantitativ zu bestimmen ist. So wird z. B. von dem Enzym Luziferase eine chemische Reaktion katalysiert, bei der durch Luminiszenz Licht emittiert wird, das in einem Luminometer bestimmt werden kann. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein DNS-Molekül, das die Sequenz SEQ ID NO 15 oder eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO 15 hybridisiert, enthält. Unter stringenten Bedingungen versteht der Fachmann Bedingungen, die für mehr als 85%, bevorzugt mehr als 90% Homologie selektieren (Sambrook et al., 1989). Die Hybridisierungen werden in 6×SSC/5×Denhardt's Lösung/ 0,1% SDS bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringenz wird im Waschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 85% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,2×SSC/0,01% SDS/65°C und für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 90% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1×SSC/0,01% SDS/65°C geeignet. Die Zusammensetzung der beschriebenen Reagenzien ist auch in Sambrook et al. (1989) beschrieben.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Wirtszelle, in die ein erfindungsgemäßes DNS- Molekül eingeführt wurde. Dies kann eine eine eukaryontische Wirtszelle sein, bevorzugt eine Hefe- oder eine Säugerzelle. Besonders bevorzugt als Wirtszellen sind Adipozyten in Primärkultur, bevorzugt aus dem Menschen oder aus der Maus, Adipozytenzellinien wie z. B. NIH-3T3L1 (eine Mausadipozytenzellinie), Muskelzellen in Primärkultur, Muskelzellinien wie z. B. C2C12 (eine Muskelzellinie aus der Maus) oder Zellinien wie HEK293 oder HeLa. Dem Durchschnittsfachmann ist es bekannt, wie er durch Standardmethoden geeignete DNS-Moleküle in bestimmte Zellen einführen kann. Diese Methoden sind in Sambrook et al. (1989) beschrieben. Für eukaryontische Zellen wird er bevorzugt die Kalzium-Präzipitationsmethode, die Lipofektion oder die Elektroporation verwenden. Es liegt auch im Können des Durchschnittsfachmanns Parameter aus der Literatur zu entnehmen oder ohne unzumutbaren Aufwand zu entwickeln, die eine erfolgreiche Durchführung der Methoden zum Einbringen von DNS-Moleküle in diese Zellen ermöglicht.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen DNS- Moleküls mit den genannten zellspezifischen Promotern zur Transkription eines Gens. Zur Herstellung geeigneter DNS-Moleküle wird der Fachmann molekularbiologische Methoden verwenden, wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben, die er unter Kenntnis der Sequenz der erfindungsgemäßen DNS-Moleküle, der Sequenz des zu transkribierenden Gens und weiterer Elemente wählen wird. Der Nachweis der Transkripte oder des Translationsproduktes erfolgt bevorzugt mit Standardmethoden, wie z. B. Nachweis von RNS durch sequenzspezifische Hybridisierung (Northern Blot), Nachweis des Translationsproduktes durch Antikörper (z. B. Western Blot) oder durch dessen Aktivität in geeigneten Nachweissystemen. Das Translationsprodukt kann auch enzymatische Aktivität haben. Die Methoden hierzu sind von Sambrook et al. (1989) beschrieben.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen DNS-Moleküle zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription der erfindungsgemäßen UCP3-Promoter beeinflussen. Dazu werden DNS-Moleküle bereitgestellt, die die Sequenz der erfindungsgemäßen Promoter, die Sequenz SEQ ID NO 14 oder SEQ ID NO 15 umfassen. Diese können auch funktionelle Derivate davon enthalten. Bevorzugt werden diese DNS-Moleküle mit anderen DNS-Molekülen verknüpft, die die Sequenzen für Gene enthalten, die einen leichten Nachweis des Genproduktes gestatten (Reportergene). Bei diesen Reportergenen kann es sich z. B. um das Luziferasegen oder das grün fluoreszierende Protein (Engl.: green fluorescent protein, Abk.: GFP) handeln. Es kann auch die vom erfindungsgemäßen Promoter transkribierte RNS bestimmt und quantifiziert werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden hier auch Zellen verwendet, die mit den erfindungsgemäßen DNS-Molekülen transformiert wurden.

Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription des präferentiell in Fettzellen oder präferentiell in Muskelzellen aktiven UCP3-Promoter beeinflussen können und in dem die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle benützt werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einem zellfreien oder einem zellbasierten System durchgeführt werden.

Eine Ausführungsform eines solchen Verfahrens besteht in einem zellfreien in-vitro- Transkriptionssystem, das als Komponenten mindestens Zellextrakt, Ribonukleotide und ein erfindungsgemäßes DNS-Molekül enthält. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, die Transkriptionsrate des eingesetzten Promoters in Anwesenheit einer Testsubstanz zu messen und mit der Transkriptionsrate in Abwesenheit der Testsubstanz zu vergleichen. Liegt die Menge der pro Zeiteinheit transkribierten RNS in Anwesenheit der Testsubstanz niedriger als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so inhibiert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test. Liegt die Menge der pro Zeiteinheit transkribierten RNS in Anwesenheit der Testsubstanz höher als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so steigert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test.

Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription des erfindungsgemäßen Promoters beeinflussen können, besteht darin, die Veränderung der Aktivität eines am 3'-Ende eines erfindungsgemäßen DNS-Moleküls fusionierten Reportergens zu messen, z. B. dem Luziferasegen oder dem grün fluoreszierenden Protein. Ein solches Verfahren kann in einem zellfreien System durchgeführt werden. Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die nach in-vitro-Transkription in Gegenwart einer Testsubstanz erhaltene RNS durch in-vitro-Translation in Proteine zu überführen, deren Menge, Aktivität, Absorption, Luminiszenz oder Fluoreszenz bestimmt wird. Die erhaltene RNS wird in Proteine überführt, die eine enzymatische Reaktion katalysieren, deren Produkt einfach bestimmt werden kann. Ganz besonders bevorzugt ist hier die Verwendung von Luziferase oder des grün fluoreszierenden Proteins.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes zellbasiertes Verfahren, bei dem Zellen, die ein erfindungsgemäßes DNS-Molekül enthalten, in Gegenwart einer Testsubstanz wachsen und unter Bedingungen, unter denen von den erfindungsgemäßen UCP3-Promotern transkribiert wird. Das Prinzip des Verfahrens beruht darauf, die erfindungsgemäßen UCP3-Promoter zur Expression eines Reportergens zu benützen, um die Auswirkungen von hinzugefügten Testsubstanzen zu untersuchen. Die Expression des Reportergens simuliert auf diese Weise die Expression des UCP3-Gens. Die erfindungsgemäßen Promoter-Reporterkonstrukte können in Tests benützt werden, nachdem sie in die Zelle eingeführt wurden oder eine Zellinie hergestellt wurde, die diese Konstrukte stabil in das Genom integriert hat. Bevorzugt wird zu einem gewissen Zeitpunkt die Menge, Aktivität, Luminiszenz oder Fluoreszenz des Translationsprodukts des an das 3'-Ende der erfindungsgemäßen, zellspezifischen UCP3-Promoter fusionierten Reportergens bestimmt, wobei die Zellen eventuell vorher lysiert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Verfahrens besteht darin, die Ergebnisse in Anwesenheit einer Testsubstanz zu messen und mit Ergebnissen in Abwesenheit der Testsubstanz zu vergleichen. Liegt die Menge, Aktivität, Absorption, Luminiszenz oder Fluoreszenz des pro Zeiteinheit in Anwesenheit der Testsubstanz produzierten Reporterproteins niedriger als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so inhibiert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test. Liegt die Menge, die Aktivität, Absorption oder Fluoreszenz des pro Zeiteinheit in Anwesenheit der Testsubstanz produzierten Reporterproteins höher als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so steigert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test. Die Signalhöhe ist ein Maß für die Aktivität des UCP3- Promoters.

In der Praxis könnten die erfindungsgemäßen Promoter in Plasmide kloniert werden, die Reportergene beherbergen, wie z. B. Luziferase, β-Galactosidase, Chloramphenicol-acetyl- transferase oder sekretierte alkalische Phosphatase. Plasmide, die ein Reportergen enthalten, sind z. B. die kommerziell erhältlichen pGL2basic oder pGL3basic (Promega, Madison, Wisconsin, USA) und pSEAP2basic oder pßgal-basic (Clontech, Heidelberg, Deutschland). Auf gleiche Weise könnten Zellen benützt werden, die die genannten DNS-Konstrukte stabil in das Genom integriert haben. Zellen, die für die Durchmusterungstest benützt werden können, sind z. B. primäre Zellkulturen z. B. von Adipozyten oder Muskelgewebe, oder Zellinien wie HEK293, HeLa, C2C12 oder NIH-3T3. Werden primäre Zellkulturen für längere Zeit kultiviert, so geht die UCP3-Expression verloren. Auch in einigen Zellinien ist keine UCP3-Expression nachweisbar. Jedoch sind diese Zellinien geeignet, um Aktivatoren der UCP3-Transkription zu finden, da diese auch in Zellen aktivatorisch wirken werden, die UCP3 exprimieren. Besonders Aktivatoren der UCP-3-Transkription im Muskelgewebe können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung der Fettleibigkeit verwendet werden. Für diese Zwecke können jedoch auch Aktivatoren der UCP-3-Transkription im Fettgewebe verwendet werden.

Der Durchschnittsfachmann kann einen solchen Test durchführen (siehe Beispiel 2), indem er auf Standardmethoden und fertig zusammengestellte Reagenzien zurückgreift, wie sie z. B. von Promega (Madison, Wisconsin, USA) fertig zusammengestellt (Luciferase Assay System) angeboten werden. Dazu erhält er auch Vorschriften, wie der Test mit den kommerziell erhältlichen Reagenzien durchzuführen ist. Der Fachmann stellt dazu mit Standardmethoden geeignete Konstrukte her und transfiziert diese in geeignete Zellkulturen (Sambrook et al., 1989). Nach Wachstum in Gegenwart der zu testenden Substanz wird optional gewaschen und die Zellen anschließend lysiert. Nach Zentrifugation zur Entfernung der Zelltrümmer wird der Überstand mit dem Luciferin enthaltenden Testreagens versetzt und das emittierte Licht in einem Luminometer gemessen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Verfahren im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High throughput screening, HTS) ausgeführt. Dabei wird in einer geeigneten Anordnung eine große Anzahl von Testsubstanzen gleichzeitig geprüft. Ein solches HTS-Verfahren kann vorteilhaft voll- oder teilautomatisiert sein und die Auswertung durch elektronische Datenverarbeitung erfolgen. Vorteilhaft wird eine Testsubstanz, die im zellfreien System eine steigernde Wirkung zeigte, zusätzlich in einem zellbasierten System geprüft. Das im vorherigen Abschnitt beschriebene Verfahren kann von einem Fachmann ohne erfinderische Tätigkeit an die Erfordernisse im Hochdurchsatz- Musterungs-Format angepaßt werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, die erfindungsgemäßen DNS- Moleküle zur Identifizierung weiterer Faktoren oder Substanzen zu benützen, die an sie binden. Bevorzugt werden Faktoren gesucht, die die Transkription eines am 3'-Ende fusionierten Gens vermitteln, erniedrigen oder erhöhen (Transkriptionsfaktoren). Dazu können die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle auf unlöslichen Trägern gebunden werden und mit einem Gemisch aus verschiedenen Faktoren oder Substanzen, wie z. B. einem Kernextrakt oder einer Naturstoffbibliothek, unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht werden. Nach ein oder mehreren Waschschritten, eventueller Wiederholung des Bindungsprozesses werden die gebundenen Faktoren oder Substanzen durch geeignete Methoden, wie z. B. Aminosäuresequenzierung, Massenspektroskopie, Gelelektrophorese, identifiziert.

Unter DNS-Molekülen im Sinne dieser Erfindung sind alle Moleküle zu verstehen, die aus natürlich vorkommenden Desoxyribonukleotiden bestehen. Dabei sollen aber auch erfindungsgemäß Moleküle erfaßt werden, die nach chemischer Derivatisierung den grundsätzlichen chemischen Charakter der DNS behalten haben. Zu den möglichen Derivatisierungen zählt z. B. die Derivatisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, Veränderungen im Rückgrat wie der Ersatz von Sauerstoffatomen gegen Schwefelatome zur Stabilisierung oder das Überführen des DNS-Moleküls in peptidische Nukleinsäuren (Engl.: Peptide nucleic acids; Abk.: PNA).

Beispiele Beispiel 1 - Identifizierung von zwei Transkriptionsstartstellen im 5'-Bereich des UCP3-Gens Versuchspersonen, Fetigewebeproben aus dem Skelettmuskel und aus dem Bauchraum

Insgesamt wurden 63 nicht verwandte Patienten, 38 krankhaft fettleibige Personen, 10 Personen mit überstandener Fettleibigkeit und 15 nicht fettleibige Personen untersucht. Gewebeproben wurden vom Musculus rectus abdominis und in der Bauchhöhle vom Fettgewebe des Bauchnetzes von krankhaft fettleibigen Personen entnommen, bei denen der Magen zur Gewichtsreduktion chirurgisch bandagiert wurde. Kontrollpersonen und Personen mit überstandener Fettleibigkeit unterzogen sich bestimmten operativen Eingriffen wie der Entfernung der Gallenblase, Leistenbruchoperationen und Regulierung oder Entfernung des Bandes um den Magen. Die Versuchspersonen hatten nach einer Belehrung in die Studie eingewilligt, die auch von der Ethikkommission des Institutes genehmigt worden war. Die Personen wurden im nüchternen Zustand durch schnell wirkende Barbiturate anästhesiert und durch Alfentanil-Hydrochlorid ((INN); JUPAC: N-{1-[2-(4- Ethyl-5-oxo-2-tetrazolin-1-yl)ethyl]-4-methoxy-methyl-4-piperidyl}-propionanilid) in der Narkose gehalten. Gewebeproben wurden bei Beginn des chirurgischen Eingriffs entnommen, in Aliquots aufgeteilt und bei -70°C eingefroren. Das Verhältnis des Gewichts zur Größe wurde nach Messungen des Gewichts und der Größe bestimmt (Engl. Body mass index; BMI).

UCP-3 Genstruktur

Eine λ-EMBL3-SP6/T7 genomische Bibliothek aus der menschlichen Plazenta (Hersteller: Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA) wurde durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde durchmustert, die fast der vollständigen, 1049 Basenpaar langen UCP3-cDNS entsprach und die Nukleotide +159 bis +1207 (GenBank Zugangsnummer U84763) umfaßte. Drei überlappende Klone mit einer Größe von etwa 16,5 kBp und mit dem kompletten menschlichen UCP3 Gen wurden isoliert und in das ZERO-Background™ Klonierungssystem (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) subkloniert. Die Sequenzierung der Plasmid-DNS wurde mit fertig zusammengestellten, kommerziell erhältlichen Reagenzien (PRISM™ Ready Reaction dRhodamine Terminator Kit, Hersteller Perkin Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) unter Verwendung von dRhodamin-Terminatoren und einem ABI PRISMT™ 310 DNS-Sequenzierautomaten durchgeführt (Perkin Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA), wobei sukzessive, jeweils passende Oligonukleotide zur Durchführung der Sequenzierungsreaktionen synthetisiert wurden ("Wandern auf der DNS", "Primer walking").

RNS Isolierung, Experimente zur schnellen Amplifizierung der 5' und 3' cDNS Enden (Engl.: Rapid amplifiction of cDNA ends; Abk: RACE)

Gesamt-RNS wurde aus 0,5 g menschlichem Skelettmuskelgewebe nach der Methode von Chumczynski und Sacchi (1987) isoliert. Die Integrität der RNS-Proben wurde durch Analyse ihres elektrophoretischen. Laufverhaltens in Formaldehydgelen sichergestellt (Sambrook et al., 1989). RNS-Konzentrationen wurden durch Absorptionsmessungen bei 260 nm bestimmt. 5' und 3' RACE wurden durchgeführt wie von Frohman et al. (1988) beschrieben. Für die 5'-RACE wurden 3 µg Gesamt-RNS aus menschlichem Skelettmuskel mit der Superscript™ II Reversen Transkriptase (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, Großbritannien) und eines UCP3 genspezifischen Oligonukleotid aus dem Intron 1 (5'- TACACCTGCT TGACGGAG-3') revers transkribiert. Nach Ribonuklease H Verdau (Hersteller Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA) und Verlängerung des polyA-Schwanzes (engl.: polyA-tailing) mit terminaler Transferase (Hersteller Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA) wurde die Erststrang-cDNS der Polymerase- Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction; Abk.: "PCR") unterworfen mit 5'- GCTGTGTCCA GTGGAAAGGT AACGAGGTCA GCAA-3' als genspezifischem Oligonukleotid und 5'-GAGGACTCGA GCTCAAGCT₍₂₀₎-3' als Adapter-Oligonukleotid. Die PCR-Produkte wurde erneut amplifiziert unter Verwendung von 5"-GAGGACTCGA GCTCAAGC-3" als Anker-Oligonukleotid und 5'-TGGGAGGCAC GTCTGAAG-3^' als internes (Engl.: nested) genspezifisches Oligonukleotid. (Für die 3^'RACE wurden 3 µg menschliche Skelettmuskel-RNS revers transkribiert unter Verwendung des oben angeführten polyA-spezifischem Adapter-Oligonukleotids. Das Anker-Oligonukleotid und zwei interne (Engl.: nested) Oligonukleotide im kodierenden Strang 5'-CCTCGACTGT ATGATAAAGA TG- 3' (+921 bis +942) und 5'-CCTCCTGGGC CACCATCTT-3' (+937 bis +955, GenBank Zugangsnummer U84763) wurden für die Amplifizierung benützt). 5' und 3' RACE-PCR-Produkte wurden unter Verwendung von dem Durchschnitts­ fachmann bekannten Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) in einen gängigen Vektor subkloniert und sequenziert, nachdem sie über ein Gel gereinigt worden waren.

Test auf Schutz der UCP3-5'-Transkriptregion vor Abbau durch Ribonuklease (Engl.: RNAse Protection Assay)

Eine das 425 bp lange Intron 1 überdeckende Probe (+6816 bis +9074; Sequenz SEQ ID NO 17) wurde durch reverse Transkriptions-PCR (Abk.: RT-PCR) mit den Oligonukleotiden 5'-CCTCACCAGC CAGCCTCTTG TC-3' (+ 6816 bis +6837) und 5'- GCTGTGTCCA GTGGAAAGGTA-3' (+9054 bis +9074), jeweils im kodierenden und im nicht kodierenden Bereich, hergestellt. Die PCR-Produkte wurden in den pZERO™ Plasmidvektor kloniert und die Sequenz durch Sequenzierung mit farbstoffgekoppelten Terminatoren (Engl.: Dye-Terminator cycle sequencing) verifiziert.

³²P-markierte Gegenstrang-RNS wurde mit einem Kombinationssystem, das den SP6 und den T7-Promoter verwendet (Riboprobe Combination System SP6/T7; Hersteller: Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA), und α³²P-dUTP (3000 Ci/mmol; Hersteller: Amersham Life Science, Buckingshamshire, Großbritannien) nach den Angaben des Herstellers erhalten. In vitro transkribierte RNS wurde über ein Gel gereinigt und die inkorporierte Radioaktivität durch Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt (Hersteller: Wallac 1450 Microbeta PLUS, EG Berthold, Bad Wildbach, Deutschland). Nach der Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten wurden Aliquots der ³²P-markierten RNS mit einer Aktivität von 8×10⁴ cpm (Engl.: cpm: counts per minute), mit 5 µg Gesamt-RNS aus menschlichem Muskel oder 15 µg Gesamt-RNS aus Fettgewebe bei 43°C über Nacht hybridisiert. Nicht geschützte RNS wurde mit 0,5 Einheiten Ribonuklease A und 20 Einheiten Ribonuklease T1 (Ambion RPAII Kit; Ambion Inc., Austin, Texas, USA) bei 37°C für 30 Minuten in einem Gesamtvolumen von 220 µl verdaut. Die Ribonuklease-Inaktivierungs-/Prä­ zipititationsmischung, die vom Hersteller mitgeliefert wurde, wurde hinzugefügt, um die ³²P-markierten RNS-RNS-Hybride zu präzipitieren. Die Präzipitate wurden mit 70% Ethanol gewaschen und geschützte Fragmente durch Elektrophorese in 4% Polyacrylamid- Harnstoffgelen aufgetrennt (Sambrook et al., 1989).

Identifizierung von zwei Transkriptionsstartstellen

Das 5^'-Ende der UCP3-mRNS aus dem Skelettmuskel wurde durch 5^'-RACE-Experimente unter Verwendung eines Gegenstrangoligonukleotids aus dem Intron 1 bestimmt. Zwei bestimmte PCR-Fragmente wurden erhalten und durch Sequenzierung charakterisiert. Die Produkte gingen jeweils 184 bp und 331 bp in 5'-Richtung über den Transkriptionsstart hinaus, was durch zwei transkriptionelle Startstellen erklärt werden kann (Abb. 1A). Der Gebrauch der am weitesten entfernten Initiationsstelle wurde durch RT-PCR gezeigt (Daten nicht gezeigt).

Ribonuklease-Schutztests (Engl.: RNAse protection assay) zeigten, daß der Großteil der Transkripte im Muskelgewebe mehrerer fettleibiger und schlanker Personen an der stromabwärts gelegenen Stelle bei -184 gestartet wurde. Der Anteil der UCP3-mRNS, der von der stromaufwärts gelegenen Stelle bei -331 stammt, war weniger als 5%. Jedoch wurde die stromaufwärts gelegene Stelle vornehmlich, wenn nicht ausschließlich, im Fettgewebe benützt (Abb. 1B). Ähnliche Ergebnisse wurden im Fettgewebe von 10 fettleibigen und 4 schlanken Individuuen gefunden (Daten nicht gezeigt). Diese Experimente zeigen, daß bestimmte Promoterbereiche im Fettgewebe und im Skelettmuskel benutzt werden. Eine Computeranalyse der zu den alternativen Startstellen benachbarten Sequenzen erbrachte, daß beide Regionen eukaryontische Konsensussequenzen für die Transkriptionsinititation enthalten. Man findet zwei TATA ähnliche Sequenzen (Locker und Buzard, 1990), 29 bis 36 BP stromaufwärts, und zwei konservierte Stellen, an die ein modifizierter 7-Methylguanosinrest an die transkribierte RNS angehängt werden (Engl.: cap site; Locker und Buzard, 1990), 16 bis 33 BP stromabwärts von der entsprechenden Startstelle. Von der Transkriptionsstartstelle durch eine Alu-Sequenz getrennt wurden durch Sequenzvergleich grundlegende Promoterelemente wie CAAT-Boxen bei -749, -861 und -922 relativ zu der stromabwärts gelegenen Transkriptionsstartstelle, ein Oktamermotiv bei -713 und eine konservierte Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor (Engl.: Upstream activating factor, Abk.: USF) bei -1038 gefunden (Abb. 1A). Zusätzlich wurden drei aufeinanderfolgende E-Box-Elemente bei -653, -640 und -631, ein putatives Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor/Retinoid-X- Rezeptor beeinflußtes Element (PPAR/RXR) bei -265 und ein putatives Thyroid beeinflußtes Element (TRE) (Locker und Buzard, 1990) an Position -3340, lokalisiert in einer Alu-Sequenz von -3396 bis -3094.

Beispiel 2 - Durchmusterungstest zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription des UCP3-Promoters modulieren

Der Durchschnittsfachmann führt einen solchen Test durch, indem er auf Standardmethoden und fertig zusammengestellte Reagenzien zurückgreift, wie sie z. B. von Promega (Madison, Wisconsin, USA) als "Luciferase Assay System" angeboten werden. Zu diesem System erhält er auch Vorschriften, wie der Test mit den kommerziell erhältlichen Reagenzien durchzuführen ist. Er kann aber auch auf die Lehre aus dem Beispiel 1 des US-Patentes 5,283,179 zurückgreifen, in dem die Durchführung eines solchen Testes beschrieben ist.

Durch eine Kombination geeigneter Klonierungstechniken und PCR-Techniken wird die Sequenz SEQ ID NO 16 hergestellt (Sambrook et al., 1989), die nicht mehr den muskelzellspezifischen UCP3-Promoter enthält. Diese DNS-Sequenz wird mit Standardmethoden über geeignete Restriktionsschnittstellen in den Vektor pGL2basic oder pGL3basic (Promega, Madison, Wisconsin, USA) insertiert. Dieser Vektor wird mit Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) in primäre humane Adipozytenzellkulturen transfiziert, die wie in Beispiel 1 beschrieben von fettleibigen Personen gewonnen werden, die sich einer chirurgischen Behandlung unterziehen müssen. Diese Zellkultur wird unter Standardbedingungen in Standardzellkulturmedium in einer Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 100 mm angezogen. Danach werden die Zellen in Gegenwart einer wässrigen Lösung oder einer Lösung in Dimethylsulfoxid einer zu testenden Substanz für eine bestimmte Zeit kultiviert. Bei Raumtemperatur wird für etwa 2 bis 5 min 1 ml eines Puffers zugegeben, der die Zellen lysiert (25 mM Tris-Phosphat pH 7,8, 2 mM Dithiothreitol, 10% Glycerin, 1% Triton® X-100, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mM Cyclohexylendiamintetraacetat (CDTA)), und die Zelltrümmer werden durch kurze Zentrifugation entfernt. Optional kann vorher das Wachstumsmedium der kultivierten Zellen entfernt werden und die Zellen ein bis zweimal mit PBS-Puffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, pH 7.3; Mg²⁺- and Ca²⁺-frei) gewaschen werden. Ein Teil des Überstandes wird mit dem fünffachen Volumen an Testreagens (20 mM Tricin (N-tris-(hydroxymethyl)-methylglycin) pH 7,8, 33,3 mM Dithiothreitol (DTT), 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,53 mM Adenosintriphosphat (ATP), 0,47 mM Luciferin (eine polyheterozyklische organische Säure: D-(-)-2-(6'-hydroxy-2'- benzothiazolyl)+Δ²-thiazolin-4-arbonsäure) und 0,27 mM Koenzym A (CoA)) vermischt und das emittierte Licht in einem Luminometer gemessen. Das Volumen des Testreagens kann bis zu dem 25fachen Volumen der zu testenden Lösung betragen. Danach wird das Signal mit dem Signal einer Kontrolle (wässrige Lösung oder Dimethylsulfoxidlösung ohne zu testende Substanz) verglichen.

Um Substanzen zu finden, die die Transkription des muskelzellspezifischen UCP3- Promoters beeinflussen, kann der Fachmann ein DNS-Molekül herstellen, das nicht mehr den fettzellspezifischen UCP3-Promoter enthält. Dazu entfernt er die Nukleotide 6739 bis 6795, die den fettzellspezifischen Teil enthalten, aus der DNS-Sequenz SEQ ID NO: 14 durch Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) und kloniert diese in die oben genannten Vektoren. Weiterhin geht er nach der oben geschilderten Vorgehensweise vor, nur daß er Muskelzellen in Primärkultur oder geeignete Zellinien verwendet.

Generelle Aktivatoren des UCP3-Promoters werden mit der gleichen experimentellen Vorgehensweise gefunden, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 14, die beide Promoter enthält, verwendet werden kann. Es werden hier auch Zellen eingesetzt, in denen keine oder nur eine sehr geringe UCP3-Expression zu finden ist, wie z. B. die Zellinie HEK293.

Der Fachmann kann einen solchen Test ohne erfinderische Tätigkeit an die Gegebenheiten im Mikrotiterplattenformat anpassen.

SEQUENZPROTOKOLL

Abbildungen

Abb. 1: Charakterisierung der UCP3-Promoterregion und Evidenz für verschiedene Transkriptionsinitiationsstellen im Skelettmuskel und im Fettgewebe

• A) Teil der Nukleotidsequenz des menschlichen UCP3 Gens; grundlegende Promoterelemente wie z. B. CAAT-Box, Oktamermotive und stromaufwärts gelegene Bindungsstellen für Stimulationsfaktor sowie putative Transkriptionsfaktorbindungsstellen wie E-Boxen und ein PPAR/RXR Element (Engl.: PPAR/RXR response element) sind durch kleine Umrahmungen hervorgehoben. Eine halbe Alu-Sequenz ist durch eine große Umrahmung hervorgehoben. TATA ähnliche Sequenzen sind fett gedruckt und unterstrichen, konservierte Stellen, an die ein modifizierter 7-Methylguanosinrest an die transkribierte RNS angehängt werden (Engl.: cap site), sind fett und kursiv gedruckt. Die zwei Transkriptionsstartstellen sind durch Pfeile gekennzeichnet und das Translationsstartkodon ist fett gedruckt. Ein Teil der Sequenz von Intron 1 wird in kleinen Buchstaben gezeigt.
• B) Autoradiogramm des Ribonuklease-Schutztests (Engl.: RNAse protection assay) von RNS aus menschlichem Skelettmuskel und Fettgewebe. Die Größe der geschützten Fragmente, errechnet für Transkripte initiiert an der stromaufwärts oder an der stromabwärts gelegenen Stelle, ist jeweils 425 und 316 Nukleotide, wie am rechten Rand vermerkt.

Belegung des Gels

M: Endmarkierter Größenstandard mit den angegebenen Größen
1: unverdaute 32P-UCP3 Gegenstrangprobe von Nukleotid 6816 bis 9074 (Sequenz SEQ ID NO 17)
2: ³²

P-UCP3-Gegenstrang-Probe an Hefe-RNS hybridisiert und Ribonukleaseverdau unterworfen
3-5: Ribonuklease-Schutztest von 5 µg von Gesamt-RNS aus dem Skelettmuskel von drei Individuen
6-7: Ribonuklease-Schutztest von 15 µg Gesamt-RNS aus intraperitonealen Fettgewebe von zwei Individuen

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Claims (89)

1. Rekombinantes DNS-Molekül, das die DNS-Sequenz des in Fettzellen aktiven UCP-3 Promoter enthält, aber keine funktionelle Sequenz des in Muskelzellen aktiven UCP-3 Promoters.

2. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 1, das die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC enthält, nicht jedoch die Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC.

3. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 1, das die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC enthält und durch Punktmutationen entstandene Derivate der Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC, wodurch die Sequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 ihre Funktion in der Transkription verlieren.

4. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 1, das die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC enthält und durch Deletionen entstandene Derivate der Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC, wodurch die Sequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 ihre Funktion in der Transkription verlieren.

5. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 1, das die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC enthält und durch Kombinationen von Punktmutationen und Deletionen entstandene Derivate der Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC, wodurch die Sequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 ihre Funktion in der Transkription verlieren.

6. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 30 bis 50 Basenpaare, bevorzugt 40 bis 45 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt 42 Basenpaare liegen.

7. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich ein RXR/PPAR- Element angeordnet ist.

8. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das RXR/PPAR-Element die Sequenz SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT umfaßt.

9. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 65 bis 75 Basenpaare liegen.

10. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Alu-Sequenz angeordnet ist.

11. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Sequenz SEQ ID NO: 1 und der Alu-Sequenz 255 bis 265 Basenpaare liegen.

12. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich ein E2A-Element angeordnet ist.

13. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das E2A-Element die Sequenz SEQ ID NO: 6 CAGATG umfaßt.

14. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6 440 bis 450 Basenpaare liegen.

15. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine E-Box ist.

16. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die E- Box die Sequenz SEQ ID NO: 7 CACTTG umfaßt.

17. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 7 450 bis 460 Basenpaare liegen.

18. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine E-Box ist.

19. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die E- Box die Sequenz SEQ ID NO: 8 CATTTG umfaßt.

20. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 8 460 bis 470 Basenpaare liegen.

21. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Oktamersequenz ist.

22. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Oktamersequenz die Sequenz SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT umfaßt.

23. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 9 515 bis 525 Basenpaare liegen.

24. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine CAAT-Box ist.

25. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die CAAT-Box die Sequenz SEQ ID NO: 10 CCAAT umfaßt.

26. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 10 560 bis 570 Basenpaare liegen.

27. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine CAAT-Box ist.

28. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die CAAT-Box die Sequenz SEQ ID NO: 11 ATTGG umfaßt.

29. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 11 670 bis 680 Basenpaare liegen.

30. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine CAAT-Box ist.

31. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die CAAT-Box die Sequenz SEQ ID NO: 12 ATTGG umfaßt.

32. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 12 730 bis 740 Basenpaare liegen.

33. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor ist.

34. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Ansprüch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor die Sequenz SEQ ID NO: 13 CCACGTGC umfaßt.

35. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 13 845 bis 855 Basenpaare liegen.

36. Rekombinantes DNS-Molekül, das die DNS-Sequenz des in Muskelzellen aktiven UCP-3 Promoters enthält, aber keine funktionelle Sequenz des in Fettzellen aktiven UCP-3 Promoters.

37. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 36, das die Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC enthält, nicht jedoch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC.

38. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 37, das die Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC enthält und durch Punktmutationen entstandene Derivate der Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC, wodurch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 ihre Funktion in der Transkription verlieren.

39. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 37, das die Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC enthält und durch Deletionen entstandene Derivate der Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC, wodurch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 ihre Funktion in der Transkription verlieren.

40. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 37, das die Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC enthält und durch Kombinationen von Punktmutationen und Deletionen entstandene Derivate der Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC, wodurch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 ihre Funktion in der Transkription verlieren.

41. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 45 bis 70 Basenpaare, bevorzugt 52 bis 58 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt 55 Basenpaare liegen.

42. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich ein RXR/PPAR- Element angeordnet ist.

43. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das RXRI PPAR-Element die Sequenz SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT umfaßt.

44. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Alu-Sequenz angeordnet ist.

45. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich ein E2A-Element angeordnet ist.

46. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß das E2A-Element die Sequenz SEQ ID NO: 6 CAGATG umfaßt.

47. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine E-Box ist.

48. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß die E- Box die Sequenz SEQ ID NO: 7 CACTTG umfaßt.

49. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 48, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine E-Box ist.

50. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß die E- Box die Sequenz SEQ ID NO: 8 CATTTG umfaßt.

51. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Oktamersequenz ist.

52. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß die Oktamersequenz die Sequenz SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT umfaßt.

53. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 52, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine CAAT-Box ist.

54. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß die CAAT-Box die Sequenz SEQ ID NO: 10 CCAAT umfaßt.

55. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 54, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine CAAT-Box ist.

56. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß die CAAT-Box die Sequenz SEQ ID NO: 11 ATTGG umfaßt.

57. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 56, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine CAAT-Box ist.

58. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, daß die CAAT-Box die Sequenz SEQ ID NO: 12 ATTGG umfaßt.

59. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 37 bis 58, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor ist.

60. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor die Sequenz SEQ ID NO: 13 CCACGTGC umfaßt.

61. Rekombinantes DNS-Molekül, das die Sequenz SEQ ID NO: 14 enthält.

62. Rekombinantes DNS-Molekül, das eine Sequenz enthält, die unter stringenten Bedingungen an die Sequenz SEQ ID NO 14 hybridisiert.

63. Rekombinantes DNS-Molekül, das ein funktionelles Derivat eines DNS-Moleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 62 enthält, dadurch gekennzeichnet, daß diese funktionellen Derivate die Eigenschaft besitzen, die Transkription eines Gens zu vermitteln.

64. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Derivate durch Deletionen hergestellt wurden.

65. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Derivate durch Punktmutationen hergestellt wurden.

66. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Derivate durch Kombinationen von Punktmutationen und Deletionen hergestellt wurden.

67. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 66, dadurch gekennzeichnet, daß das DNS-Molekül ein zusätzliches Gen enthält, das in funktioneller Weise verknüpft ist.

68. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zusätzlichen Gen um das Gen des Entkopplungsproteins 3 handelt.

69. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zusätzlichen Gen um ein Reportergen handelt.

70. Rekombinantes DNS-Molekül gemäß Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Reportergen um das Luziferasegen oder das grün fluoreszierende Protein enthält.

71. Rekombinantes DNS-Molekül, das die Sequenz SEQ ID NO 15 enthält.

72. Rekombinantes DNS-Molekül, das eine Sequenz enthält, die unter stringenten Bedingungen an die Sequenz SEQ ID NO 15 hybridisiert.

73. Eine Zelle, die ein rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 72 enthält.

74. Verwendung eines rekombinanten DNS-Moleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 72 zur Transkription eines Gens.

75. Verwendung eines rekombinanten DNS-Moleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 72 zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription beeinflussen können.

76. Verwendung einer Zelle gemäß Anspruch 73 zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription beeinflussen können.

77. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription beeinflussen können, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 72 oder eine Zelle gemäß Anspruch 73 verwendet wird.

78. Verfahren gemäß Anspruch 77, dadurch gekennzeichnet, daß es ein zellfreies oder ein zellbasiertes Verfahren ist.

79. Verfahren gemäß Anspruch 78, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptionsrate in Anwesenheit einer Testsubstanz gemessen wird.

80. Verfahren gemäß Anspruch 79, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptionsrate in Anwesenheit einer Testsubstanz in einem zellfreien in-vitro-System gemessen wird, das mindestens Zellextrakt, Ribonukleotide und ein rekombinantes DNS-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 72 enthält.

81. Verfahren gemäß Anspruch 79, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge, Aktivität, Luminiszenz oder Fluoreszenz eines Reporterproteins gemessen wird, das in Anwesenheit einer Testsubstanz hergestellt wird.

82. Verfahren gemäß Anspruch 81, dadurch gekennzeichnet, daß in Anwesenheit einer Testsubstanz RNS in vitro transkribiert wird, anschließend in vitro translatiert wird und die Menge des hergestellten Reporterproteins bestimmt wird.

83. Verfahren gemäß Anspruch 81, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge eines Reporterproteins gemessen wird, das von einer Zelle gemäß Anspruch 73 in Anwesenheit einer Testsubstanz hergestellt wird.

84. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 81 bis 83, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Reporterprotein um die Luziferase oder das grün fluoreszierende Protein handelt.

85. Verfahren zum Auffinden eines Modulators des UCP3-Promoters, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) eine Wirtszelle nach Anspruch 73 in Anwesenheit einer Testsubstanz kultiviert wird,
• b) die Transkriptionsrate des UCP3-Promoters gemessen wird,
• c) die so erhaltene Transkriptionsrate mit der Transkriptionsrate verglichen wird, die in Abwesenheit der Testsubstanz erhalten wurde.

86. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 77 bis 85, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem Hochdurchsatz-Musterungs- (High Throughput-Screening, HTS)-Format ausgeführt wird.

87. Verwendung eines rekombinanten DNS-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 72 zum Auffinden von Faktoren oder Substanzen, die an das DNS-Molekül binden.

88. Verwendung gemäß Anspruch 87 dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNS- Molekül auf einem Träger gebunden wird, mit einem Gemisch verschiedener Substanzen oder Faktoren kontaktiert wird, einem oder mehreren Waschschritten unterzogen wird und die gebundenen Substanzen oder Faktoren identifiziert werden.

89. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen oder Faktoren, die an ein rekombinantes DNS-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 72 binden, dadurch gekennzeichnet, daß:

• 1. die rekombinanten DNS-Moleküle an einen Träger gebunden werden,
• 2. mit einem Gemisch verschiedener Substanzen kontaktiert werden,
• 3. einem oder mehreren Waschschritten unterzogen werden,
• 4. die gebundenen Faktoren identifiziert werden.