DE19838837A1

DE19838837A1 - Cell-specific promoter of the decoupling protein 3

Info

Publication number: DE19838837A1
Application number: DE19838837A
Authority: DE
Inventors: Harald Esterbauer; Hannes Oberkofler; Wolfgang Patsch
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH; Novo Nordisk AS
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH; Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1998-08-27
Publication date: 2000-03-02
Also published as: WO2000012696A1; CA2341051A1; JP2002534057A; EP1108022A1

Abstract

The present invention is in the field of the gene promoters which mediate the transcription of proteins which play a part in the energy management of cells and in obesity. The invention relates to DNA molecules which contain recombinant cell-specific promoters of uncoupling protein 3 (UCP 3) or functional derivatives thereof. It also relates to cells which contain these DNA molecules. The invention also relates to uses of these DNA molecules and the cells according to the invention, and processes for finding substances which are capable of influencing transcription. These processes can also be carried out by the High Throughput Screening method. Processes are also disclosed which can be used to find substances or factors which bind to the DNA molecules according to the invention.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt im Feld der Genpromoter von Proteinen, die eine Rolle im Energiehaushalt von Zellen und bei der Fettleibigkeit spielen. Gegenstand der Erfindung sind rekombinante DNS-Moleküle (DNS: Desoxyribonukleinsäure), die zellspezifische Promoter des Entkopplungsproteins 3 (Engl.: Uncoupling protein 3; UCP 3) oder funktionelle Derivate davon enthalten. Ferner betrifft die Erfindung Zellen, die diese rekombinanten DNS-Moleküle enthalten, Verwendungen dieser DNS-Moleküle und der erfindungsgemäßen Zellen, sowie Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription der erfindungsgemäßen Promoter beeinflussen oder die an die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle binden.The present invention is in the field of gene promoters of proteins that have a role in Play energy balance of cells and obesity. Subject of the invention are recombinant DNA molecules (DNA: deoxyribonucleic acid) that are cell-specific Uncoupling protein 3 (UCP 3) promoter or functional derivatives thereof. Furthermore, the invention relates to cells that contain recombinant DNA molecules, uses of these DNA molecules and the cells according to the invention, and methods for finding substances which the Affect transcription of the promoters according to the invention or those to the bind DNA molecules of the invention.

Bei der Fettleibigkeit handelt es sich um eine Krankheit, bei der sich das Fettgewebe infolge einer positiven Energiebilanz vermehrt. Dies kann Folge übermäßiger Nahrungsaufnahme oder Symptom einer Stoffwechselerkrankung sein (ROCHE Lexikon Medizin, 3. Auflage, Urban & Schwarzenberg). Fettleibigkeit ist ein häufiges ernährungsbedingtes Problem in den westlichen Industrieländern und spielt eine wichtige Rolle als Krankheits- und Todesursache (McGinnis and Foege, 1993; Manson et al., 1995). Da Fettleibigkeit durch einen ständiges Ungleichgewicht zwischen Nahrungsaufnahme und Energieumsatz verursacht wird, könnte eine chronische Reduktion des Energieumsatzes ein Risikofaktor für diesen Zustand sein. Tatsächlich ist ein geringerer Energieumsatz im Ruhezustand ein Risikofaktor für Fettleibigkeit (Ravussin et al., 1988; Griffiths et al., 1990). Genetische Faktoren tragen signifikant zu der Höhe des Energiegrundumsatzes bei (Bogardus et al., 1986; Bouchard et al., 1989). Braunes Fettgewebe (Brown Adipose Tissue; BAT) ist auf Thermogenese spezialisiert, eine der Hauptfaktoren des Energieumsatzes (Himms-Hagen, 1989). Eine zentrale Bedeutung bei der thermogenen Funktion des BAT haben die sogenannten Entkopplungsproteine 1, 2 und 3 (Engl.: uncoupling proteins; Abk.: UCPs) (Klaus et al., 1991; Boss et al., 1997; Fleury et al. 1997; Gimeno et al., 1997; Gong et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997). Diese Proteine stimulieren die Wärmeerzeugung, indem sie die Substratoxidation von der ATP-Synthese entkoppeln (Ricquier et al. 1991). Während die Wichtigkeit des BAT als ein Regulator des Körperfettspeichers für Nagetiere gezeigt wurde (Lowell et al., 1993; Kopecky et al., 1995), ist dessen Rolle bei der Fettleibigkeit des Menschen nicht klar, weil Erwachsene sehr wenig BAT besitzen (Krief et al. 1993). Ungeachtet dieser Einschränkung wurde im intraperitonealen Fettgewebe von fettleibigen Individuen ein signifikant geringerer UCP1-mRNS-Gehalt (RNS: Ribonukleinsäure; mRNS: Botenribonukleinsäure) im Vergleich zu schlanken Kontrollpersonen gefunden (Oberkofler et al., 1997). Ein großer Teil der Schwankungen der Menge der UCP1-mRNS in fettleibigen Individuen wurde durch gewöhnliche Sequenzveränderungen im UCP1- Genlokus erklärt (Esterbauer et al., im Druck). Ein Beitrag von UCP1 und BAT zum Energiegrundumsatz ist daher denkbar.Obesity is a disease that causes adipose tissue to develop a positive energy balance. This can result from excessive food intake or a symptom of a metabolic disorder (ROCHE Lexikon Medizin, 3rd edition, Urban & Schwarzenberg). Obesity is a common nutritional problem in the western industrialized countries and plays an important role as a disease and Cause of death (McGinnis and Foege, 1993; Manson et al., 1995). Because obesity through a constant imbalance between food intake and energy expenditure A chronic reduction in energy expenditure could be a risk factor for this condition. In fact, there is less energy conversion at rest Risk factor for obesity (Ravussin et al., 1988; Griffiths et al., 1990). Genetic Factors contribute significantly to the amount of energy metabolism (Bogardus et al., 1986; Bouchard et al., 1989). Brown adipose tissue (BAT) is on Specializes in thermogenesis, one of the main factors in energy turnover (Himms-Hagen, 1989). The are of central importance for the thermogenic function of the BAT so-called uncoupling proteins 1, 2 and 3 (abbr .: UCPs) (Klaus et al., 1991; Boss et al., 1997; Fleury et al. 1997; Gimeno et al., 1997; Gong et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997). These proteins stimulate the generation of heat by: Decouple substrate oxidation from ATP synthesis (Ricquier et al. 1991). While demonstrated the importance of BAT as a regulator of body fat storage for rodents (Lowell et al., 1993; Kopecky et al., 1995), its role in obesity is the People are not clear because adults have very little BAT (Krief et al. 1993). Notwithstanding this limitation, obese in the intraperitoneal adipose tissue Individuals have a significantly lower UCP1 mRNA content (RNA: ribonucleic acid; mRNA: Messenger ribonucleic acid) compared to lean controls (Oberkofler et al., 1997). Much of the fluctuation in the amount of UCP1-mRNA in obese individuals were affected by ordinary sequence changes in the UCP1 Gene locus explained (Esterbauer et al., In press). A contribution by UCP1 and BAT to Basic energy conversion is therefore conceivable.

UCP2 und UCP3, zwei andere kürzlich entdeckte Mitglieder der UCP-Familie, werden im Menschen und im Nagetier in verschiedenen Geweben exprimiert. UCP2-mRNS kann im weißen Fettgewebe, BAT, Lunge, Leber, Milz und Makrophagen gefunden werden (Fleury et al., 1997; Gimeno et al., 1997), während hohe UCP3-mRNS-Mengen im Skelettmuskel und BAT beobachtet werden (Boss et al., 1997; Gong et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997). Studien in UCP1 gendefizienten Mäusen (Enerback et al., 1997) und in schlanken Ratten, die Leptin überexprimieren (Zhou et al., 1997), unterstützen ein Modell, in dem UCP2 als ein Reservesystem für die Thermogenese fungieren kann, wenn UCP1 defizient ist und/oder sich die Menge an Leptin aufgrund von Übergewicht vergrößert. UCP3 könnte profunde Effekte auf die Energiehomöostase haben, weil Muskelgewebe einen großen Teil des Katecholamins enthält und für die ernährungsinduzierte Thermogenese sowohl in Menschen (Astrup et al., 1986) als auch in Ratten (Thurlby und Ellis, 1986) verantwortlich ist.UCP2 and UCP3, two other recently discovered members of the UCP family, are in the Humans and rodents expressed in different tissues. UCP2-mRNS can be white adipose tissue, BAT, lungs, liver, spleen and macrophages can be found (Fleury et al., 1997; Gimeno et al., 1997), while high UCP3 mRNA levels in skeletal muscle and BAT are observed (Boss et al., 1997; Gong et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997). Studies in UCP1 gene deficient mice (Enerback et al., 1997) and in slim rats, overexpressing leptin (Zhou et al., 1997) support a model in which UCP2 as a back-up system for thermogenesis can function if UCP1 is deficient and / or the amount of leptin increases due to being overweight. UCP3 could be profound Have effects on energy homeostasis because muscle tissue is a large part of the Contains catecholamines and for nutrition-induced thermogenesis in both humans (Astrup et al., 1986) as well as in rats (Thurlby and Ellis, 1986).

Die menschlichen UCP2 und UCP3-Gene wurden in der Chromosomenregion 11q13 lokalisiert (Fleury et al., 1997; Solanes et al., 1997; Boss et al., 1998). Die Untersuchung der Stammbäume der Quebec-Familienstudie lieferte sehr starke Indizien, daß diese chromosomale Region mit dem Energieumsatz im Ruhezustand, dem Körpergewichtsindex (Body mass index, BMI) und der Fettmasse in Erwachsenen assoziiert ist (Bouchard et al., 1997). Darüber hinaus ist die syntene Region auf dem Chromosom 7 der Maus für Fettleibigkeit und insulinunabhängigen Diabetes Mellitus verantwortlich (Hashimoto et al., 1994; Warden et al., 1995).The human UCP2 and UCP3 genes were located in the 11q13 chromosome region localized (Fleury et al., 1997; Solanes et al., 1997; Boss et al., 1998). The investigation the family tree of the Quebec family study provided very strong evidence that this chromosomal region with the energy turnover at rest, the body weight index (Body mass index, BMI) and fat mass in adults (Bouchard et al., 1997). In addition, the syntene region on chromosome 7 is the mouse for Obesity and insulin-independent diabetes mellitus (Hashimoto et al., 1994; Warden et al., 1995).

Im Vergleich zu schlanken Kontrollpersonen war die Menge an UCP2-mRNS im intraperitonealen Fettgewebe von krankhaft fettleibigen Personen reduziert. In Übereinstimmung mit einer Rolle bei der Pathophysiologie der Fettleibigkeit blieb die Menge der UCP2-mRNS in Patienten nach überstandener Fettleibigkeit niedrig, sowohl vor als auch nach der Gewichtsreduktion (Oberkofler et al., im Druck). Im Gegensatz dazu Unterschied sich die Menge der UCP3-mRNS im Muskelgewebe zwischen fettleibigen und schlanken Individuen nicht (Millet et al., 1997), aber diese Ergebnisse müssen mit Vorsicht interpretiert werden. Erstens wurden gewebsspezifische Unterschiede in der Regulation der UCP3-Expression in Nagetieren gefunden (Gong et al., 1997; Larkin et al., 1997; Boss et al., 1998). Zweitens wurden zwei verschiedene Isoformen (UCP3_L und UCP3_S) des menschlichen UCP3-Gens durch Klonierung der zur mRNS komplementären DNS (Engl.: complementary DNA; cDNA) gefunden. Ein Polyadenylierungssignal in Intron 6 wird in einem signifikanten Teil der UCP3-Transkripte für die Bildung von UCP3_S benützt, wobei ein zweites Polyadenylierungssignal in Exon 7 für die Bildung von UCP_L benützt wird. Der UCP3_S-Form fehlt aufgrund einer C-terminalen Trunkierung die sechste vorhergesagte Transmembrandomäne und die Purinnukleotidbindungsdomäne, die für die Inhibition der UCP-Aktivität durch Nukleotide verantwortlich gemacht wird (Jezek et al., 1994). Die Trunkierung des UCP3 Moleküls könnte auf diese Art und Weise die UCP3-Aktivität erhöhen, aber eine fehlerhafte Membraninsertion könnte die Stabilität und Funktion von UCP3 beeinflussen.Compared to lean controls, the amount of UCP2-mRNA in intraperitoneal adipose tissue from morbidly obese subjects was reduced. Consistent with a role in the pathophysiology of obesity, the amount of UCP2 mRNA in patients after surviving obesity remained low, both before and after weight loss (Oberkofler et al., In press). In contrast, the amount of UCP3 mRNA in muscle tissue did not differ between obese and lean individuals (Millet et al., 1997), but these results must be interpreted with caution. First, tissue-specific differences in the regulation of UCP3 expression in rodents were found (Gong et al., 1997; Larkin et al., 1997; Boss et al., 1998). Second, two different isoforms (UCP3 _L and UCP3 _S ) of the human UCP3 gene were found by cloning the complementary DNA (cDNA) complementary to the mRNA. A polyadenylation signal in intron 6 is used in a significant part of the UCP3 transcripts for the formation of UCP3 _S , while a second polyadenylation signal in exon 7 is used for the formation of UCP _L. Due to C-terminal truncation, the UCP3 _S form lacks the sixth predicted transmembrane domain and the purine nucleotide binding domain, which is responsible for the inhibition of UCP activity by nucleotides (Jezek et al., 1994). Truncation of the UCP3 molecule could increase UCP3 activity in this way, but incorrect membrane insertion could affect the stability and function of UCP3.

Es ist wünschenswert, bessere Behandlungsmethoden für die Fettleibigkeit zu finden. Von Vorteil sind Substanzen, die den Patienten möglichst schmerz- und nebenwirkungsfrei verabreicht werden können. Eine Möglichkeit, die Suche nach derartigen Substanzen zu vereinfachen, besteht darin, körpereigene Faktoren zu identifizieren, die eine wesentliche Rolle bei diesem Krankheitsgeschehen spielen. Diese könnten ein Zielmolekül (Engl.: target) für geeignete Substanzen sein, wobei durch die Wechselwirkung die Aktivität oder die Eigenschaften des körpereigenen Faktors in einer für den Patienten positiven Weise beeinflußt werden soll. Geeignete Zielmoleküle könnten auch definiert werden, wenn für bereits bekannte körpereigene Faktoren die Mitwirkung am krankheitsauslösenden Geschehen nachgewiesen werden kann. Diese Substanzen können nach der Identifikation eines geeigneten Zielmoleküls mit einer größeren Aussicht auf Erfolg gefunden werden, indem der Einfluß einer möglichst großen Zahl von Verbindungen auf die Aktivität oder Eigenschaften des Zielmoleküls gemessen wird. Diese Verbindungen können einer Naturstoff oder Substanzbibliothek entstammen, wobei hier auch die Kombinatorische Chemie wertvolle Beiträge liefern kann. Zur Beschleunigung dieser Verfahren werden die Analysen im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High throughput screening, HTS) durchgeführt. Naturgemäß werden nur wenige Substanzen aufgefunden, die aber als Basis für die chemische Derivatisierung und Optimierung und die anschließende pharmakologische Charakterisierung dienen können. It is desirable to find better treatments for obesity. Of Advantages are substances that make the patient as free of pain and side effects as possible can be administered. One way to start looking for such substances Simplify is to identify the body's own factors that are essential Play a role in this disease. These could be a target molecule be for suitable substances, the interaction or the activity or Properties of the body's factor in a positive way for the patient should be influenced. Suitable target molecules could also be defined if for already known body-own factors the participation in the disease-triggering Events can be demonstrated. These substances can be identified find a suitable target molecule with a greater chance of success, by the influence of as large a number of compounds as possible on the activity or Properties of the target molecule is measured. These connections can be one Natural product or library of substances originate, whereby here also the combinatorial Chemistry can make valuable contributions. To speed up these procedures, the High throughput screening (HTS) analyzes carried out. Naturally, only a few substances are found, but as a basis for chemical derivatization and optimization and the subsequent can serve pharmacological characterization.

Für das UCP3-Gen sind im Stand der Technik die aus der cDNS abgeleitete Aminosäuresequenz, die cDNS-Sequenz (GenBank Zugangsnummer U84763), die genomische DNS-Sequenz inklusive der Lage der Exons und der Introns (Boss et al., 1998) und ein Teil des 5'-nichtkodierenden Bereiches vorbekannt (GenBank-Zugangsnummer AF032871). Ferner war die Lage eines Promoters und eines TATA-Signals bekannt (Eintrag AF032871 in der Datenbank GenBank). Die genomische DNS-Sequenz des UCP3- Gens einschließlich der Introns und Exons und der 5'-Region ist übersichtshalber dieser Anmeldung beigefügt (siehe SEQ ID NO: 17).For the UCP3 gene, those derived from the cDNA are in the prior art Amino acid sequence, the cDNA sequence (GenBank accession number U84763), the genomic DNA sequence including the location of exons and introns (Boss et al., 1998) and part of the 5 'non-coding area previously known (GenBank accession number AF032871). The location of a promoter and a TATA signal was also known (Entry AF032871 in the GenBank database). The genomic DNA sequence of the UCP3- Gens including the introns and exons and the 5 'region is this for the sake of clarity Registration attached (see SEQ ID NO: 17).

Überraschenderweise wurde nun im Rahmen dieser Erfindung gefunden, daß sich im von dem TATA-Signal stromaufwärts liegenden Bereich ein zusätzlicher Promoter befindet, der präferentiell in Fettzellen aktiv ist (siehe Beispiel 1). Das UCP3-Gen wird sonst nur noch im Skelettmuskel stark exprimiert, aber dort unter Verwendung des bekannten Promoter, wie überraschenderweise im Rahmen dieser Erfindung gefunden wurde (siehe Beispiel 1). Es ist vorteilhaft, den präferentiell in Fettzellen oder in Muskelzellen aktiven Promoter zu beeinflussen, da dies zur Behandlung der Fettleibigkeit dienen könnte. Dies ist besonders vorteilhaft, weil hiermit ein Faktor moduliert werden kann, der ausschließlich in bestimmten Bereichen des Körpers aktiv ist. Dazu können nun DNS-Konstrukte hergestellt werden, die es erlauben, die fettzellspezifische oder die muskelzellspezifische Transkription des UCP3- Gens zu untersuchen und entsprechende Substanzen zu deren Modulation zu finden. Dazu muß nur der entsprechende Anteil des im anderen Zelltypus aktiven UCP3-Promoters entfernt werden.Surprisingly, it has now been found within the scope of this invention that in the TATA signal upstream area is an additional promoter is preferentially active in fat cells (see example 1). The UCP3 gene is otherwise only in the Skeletal muscle strongly expressed, but there using the known promoter, such as was surprisingly found in the context of this invention (see Example 1). It is advantageous to preferentially active in fat cells or in muscle cells promoters affect, as this could serve to treat obesity. This is special advantageous because it can be used to modulate a factor that can only be used in certain Areas of the body is active. DNS constructs can now be produced for this purpose allow the transcription of the UCP3- Examine genes and find appropriate substances for their modulation. To only the corresponding portion of the UCP3 promoter active in the other cell type must be used be removed.

Die Aufgabe der Bereitstellung eines neuen geeigneten Zielmoleküls konnte somit mit der vorliegenden Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche gelöst werden. Erfindungsgemäß werden rekombinante DNS-Moleküle mit zellspezifischen Promotern des UCP3-Gens bereitgestellt. In diesem Zusammenhang werden auch rekombinante DNS-Moleküle, die funktionelle Derivate der erfindungsgemäßen Promoter enthalten oder bestimmte Teile der 5'-Sequenz des UCP-3 Promoters umfassen, von der vorliegenden Erfindung offenbart. Weiterhin werden auch Zellen von der vorliegenden Erfindung umfaßt, die erfindungsgemäße DNS-Moleküle enthalten. In einer weiteren Ausführungsform wird die Verwendung dieser DNS-Moleküle oder der erfindungsgemäßen Zellen zur Transkription eines Gens oder zum Auffinden von Substanzen offenbart, die die Transkription beeinflussen. Weiterhin werden von der Erfindung Verfahren umfaßt, die es erlauben, Substanzen aufzufinden, die die Transkriptionsrate des beeinflussen. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High throughput screening, HTS) durchgeführt. Weiterhin werden Verfahren offenbart, die es erlauben, Substanzen oder Faktoren zu finden, die an die erfindungsgemäßen DNS- Moleküle binden.The task of providing a new, suitable target molecule could thus be met with the present invention within the scope of the description and the claims become. According to the invention, recombinant DNA molecules with cell-specific Promoters of the UCP3 gene provided. In this context, too recombinant DNA molecules, the functional derivatives of the promoters according to the invention contain or comprise certain parts of the 5 'sequence of the UCP-3 promoter from which present invention disclosed. Furthermore, cells from the present Invention includes containing DNA molecules of the invention. In another Embodiment is the use of these DNA molecules or the invention Cells for the transcription of a gene or for the discovery of substances disclosed the Affect transcription. Furthermore, the invention encompasses methods which allow substances to be found which influence the transcription rate of the. Especially the method according to the invention is preferred in high-throughput pattern format (High throughput screening, HTS). Methods are also disclosed which make it possible to find substances or factors which are linked to the DNA Bind molecules.

Durch diese Erfindung wird ein rekombinantes DNS-Molekül offenbart, das den präferentiell in Fettzellen aktiven UCP3-Promoter enthält, aber nicht den bekannten, in Muskelzellen aktiven UCP3-Promoter. Dieses rekombinante DNS-Molekül enthält die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC, nicht jedoch die SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC. Es können aber auch die Sequenzen, die für den in Muskelzellen aktiven Promoter wichtig sind, durch Punktmutation oder Deletionen oder Kombinationen davon so verändert sein, daß sie ihre Funktion in der Transkription verlieren. Zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 können 30 bis 50 Basenpaare, bevorzugt 40 bis 45 Basenpaare, besonders bevorzugt 42 Basenpaare liegen. In einer weiteren Ausführungsform ist das beschriebene DNS-Molekül weiter dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich ein RXR/PPAR- Element (Schoonjans et al., 1996) liegt, das bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 5 bevorzugt 65 bis 75 Basenpaare liegen. Eine Übersicht über wesentliche Promoterelemente wurde von Locker und Buzard (1990) gegeben. Ein weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Alu-Sequenz liegt, wobei zwischen der Sequenz SEQ ID NO: 1 und der Alu-Sequenz 255 bis 265 Basenpaare liegen können. Im Sinne der Erfindung ist unter Alu-Sequenz ein nur im menschlichen Genom vorkommender Abschnitt von etwa 300 Basenpaaren zu verstehen, der zu den hochrepetitiven DNS-Sequenzen gehört und etwa in der Mitte ein Schnittstelle für das Restriktionsenzym Alu I trägt. Das beschriebene DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich ein E2A-Element (Locker und Buzard, 1990; Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park und Walker, 1992) ist, das der Sequenz SEQ ID NO: 6 CAGATG entspricht, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6 440 bis 450 Basenpaare liegen können. Das beschriebene DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: : 1 zusätzlich eine E-Box (Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park und Walker, 1992) ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 7 CACTTG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 7 450 bis 460 Basenpaare liegen können. Das beschriebene DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine weitere E-Box (Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park und Walker, 1992) ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 8 CATTTG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 8 460 bis 470 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Oktamersequenz (Locker und Buzard, 1990) sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 9 515 bis 525 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine weitere CAAT- Box (Locker und Buzard, 1990) sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 10 CCAAT umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 10 560 bis 570 Basenpaare liegen können. Die CAAT-Box (Locker und Buzard, 1990) ist Teil einer bei vielen eukaryontischen Genen, im 5 '-flankierenden Bereich der kodierenden Region beobachteten, konservierten Basenabfolge. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine weitere CAAT-Box (Locker und Buzard, 1990) sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 11 ATTGG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 11 670 bis 680 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine CAAT-Box (Locker und Buzard, 1990) angeordnet sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 12 ATTGG umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 12 730 bis 740 Basenpaare liegen können. Das erfindungsgemäße DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 1 zusätzlich eine Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor (Engl.: USF; Locker und Buzard, 1992) angeordnet ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 13 CCACGTGC umfaßt, wobei zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 13 845 bis 855 Basenpaare liegen können.By this invention a recombinant DNA molecule is disclosed that the contains UCP3 promoters active preferentially in fat cells, but not the known one in Muscle cell active UCP3 promoter. This recombinant DNA molecule contains the Sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC, but not the SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC. But it can also Sequences that are important for the promoter active in muscle cells by point mutation or deletions or combinations thereof so modified that they function in the Lose transcription. Between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 can be 30 to 50 base pairs, preferably 40 to 45 base pairs, particularly preferably 42 Base pairs lie. In a further embodiment, the DNA molecule described is further characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 1 additionally an RXR / PPAR Element (Schoonjans et al., 1996), which preferably has the sequence SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT comprises, wherein between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 preferably 65 to 75 base pairs. An overview of essentials Promoter elements were given by Locker and Buzard (1990). Another one Embodiment of the invention is characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 there is also an aluminum sequence, with the sequence SEQ ID NO: 1 and the Alu sequence can be 255 to 265 base pairs. In the sense of the invention under the Alu sequence, a section of approximately 300 only found in the human genome To understand base pairs belonging to the highly repetitive DNA sequences and roughly in in the middle carries an interface for the restriction enzyme Alu I. The described DNS Molecule can further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 additionally an E2A element (Locker and Buzard, 1990; Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park and Walker, 1992) is that of the sequence SEQ ID NO: 6 CAGATG corresponds, with between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6 440 to 450 Base pairs can lie. The DNA molecule described can thereby further be marked that upstream of SEQ ID NO:: 1 an additional E-Box (Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park and Walker, 1992), which is preferred comprises the sequence SEQ ID NO: 7 CACTTG, with between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 7 450 to 460 base pairs. The described DNS Molecule can further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 additionally an additional E-Box (Aronheim et al., 1991; Leshkowitz et al. 1992; Park and Walker, 1992), which preferably comprises the sequence SEQ ID NO: 8 CATTTG, where between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 8 460 to 470 base pairs can. The DNA molecule according to the invention can further be characterized in that that upstream of SEQ ID NO: 1 an additional octamer sequence (Locker and Buzard, 1990), which preferably has the sequence SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT comprises, between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 9 515 to 525 Base pairs can lie. The DNA molecule according to the invention can thereby further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 an additional CAAT Box (Locker and Buzard, 1990), which preferably has the sequence SEQ ID NO: 10 CCAAT comprises, with between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 10 560 can be up to 570 base pairs. The CAAT box (Locker and Buzard, 1990) is part of it one in many eukaryotic genes, in the 5 'flanking region of the coding Region observed, conserved base sequence. The DNA molecule according to the invention can be further characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 additionally can be another CAAT box (Locker and Buzard, 1990), which prefers the sequence SEQ ID NO: 11 ATTGG, wherein between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 11 670 to 680 base pairs. The DNA molecule according to the invention can be further characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 additionally a CAAT box (Locker and Buzard, 1990) can be arranged, which preferably the Sequence SEQ ID NO: 12 ATTGG comprises, between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 12 730 to 740 base pairs. The DNS Molecule can further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 additionally a binding site for an upstream binding stimulation factor USF; Locker and Buzard, 1992), which preferably has the sequence SEQ ID NO: 13 CCACGTGC comprises, wherein between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 13 845 to 855 base pairs can lie.

Durch diese Erfindung wird ein weiteres rekombinantes DNS-Molekül offenbart, das nicht den präferentiell in Fettzellen aktiven UCP3-Promoter enthält, aber den in Muskelzellen aktiven Promoter. Dieses rekombinante DNS-Molekül enthält die Sequenzen SEQ ID NO: 3 TATAAGA und SEQ ID NO: 4 CAATCC, nicht jedoch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 TATATTAAA und SEQ ID NO: 2 CACCTC. Es können aber auch die Sequenzen, die für den in Fettzellen aktiven Promoter wichtig sind, durch Punktmutation oder Deletionen oder Kombinationen davon so verändert sein, daß sie ihre Funktion in der Transkription verlieren. Zwischen den Sequenzen SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 können 45 bis 70 Basenpaare, bevorzugt 52 bis 58 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt 55 Basenpaare liegen. In einer weiteren Ausführungsform ist das beschriebene DNS-Molekül weiter dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich ein RXR/PPAR- Element liegt, das bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT umfaßt. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Alu-Sequenz ist. Das beschriebene DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich ein E2A-Element ist, das der Sequenz SEQ ID NO: 6 CAGATG entspricht. Das beschriebene DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine E-Box ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 7 CACTTG umfaß. Das beschriebene DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine weitere E-Box ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 8 CATTTG umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS- Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Oktamersequenz sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine weitere CAAT- Box sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 10 CCAAT umfaß. Die CAAT-Box ist Teil einer bei vielen eukaryontischen Genen, im 5'-flankierenden Bereich der kodierenden Region beobachteten, konservierten Basenabfolge. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine weitere CAAT-Box sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 11 ATTGG umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine CAAT-Box angeordnet sein kann, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 12 ATTGG umfaßt. Das erfindungsgemäße DNS-Molekül kann weiter dadurch gekennzeichnet sein, daß stromaufwärts von SEQ ID NO: 3 zusätzlich eine Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor angeordnet ist, die bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO: 13 CCACGTGC umfaßt. This invention discloses another recombinant DNA molecule that is not contains the UCP3 promoter, which is preferentially active in fat cells, but that in muscle cells active promoter. This recombinant DNA molecule contains the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC, but not the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC. But it can also be the sequences for the promoters active in fat cells are important, by point mutation or deletions or Combinations of these can be modified so that they function in transcription to lose. Between the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 there can be 45 to 70 Base pairs, preferably 52 to 58 base pairs, very particularly preferably 55 base pairs lie. In a further embodiment, the DNA molecule described is wider characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 3 additionally an RXR / PPAR Element lies, which preferably the sequence SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT includes. Another embodiment of the invention is characterized in that is an aluminum sequence upstream of SEQ ID NO: 3. The described DNS Molecule can further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 is additionally an E2A element which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 6 CAGATG. The DNA molecule described can be further characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 is additionally an E-Box, which preferably has the sequence SEQ ID NO: 7 CACTTG includes. The DNA molecule described can further be characterized by this be that upstream of SEQ ID NO: 3 there is an additional E-Box, the preferably comprises the sequence SEQ ID NO: 8 CATTTG. The DNS Molecule can further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 can additionally be an octamer sequence, which preferably has the sequence SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT includes. The DNA molecule according to the invention can thereby further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 an additional CAAT Box can be, which preferably comprises the sequence SEQ ID NO: 10 CCAAT. The CAAT box is part of one of many eukaryotic genes, in the 5'-flanking region of the coding region observed, conserved base sequence. The invention DNA molecule can further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 can additionally be a further CAAT box, which preferably has the sequence SEQ ID NO: 11 ATTGG includes. The DNA molecule according to the invention can thereby further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 an additional CAAT box can be arranged, which preferably comprises the sequence SEQ ID NO: 12 ATTGG. The DNA molecule according to the invention can further be characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 an additional binding site for an upstream binding stimulation factor is arranged, which preferably has the sequence SEQ ID NO: 13 CCACGTGC includes.

Weiter werden von der Erfindung auch DNS-Moleküle umfaßt, die die Sequenz SEQ ID NO 14 oder eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO 14 hybridisiert, enthalten. Unter stringenten Bedingungen versteht der Fachmann Bedingungen, die für mehr als 85%, bevorzugt mehr als 90% Homologie selektieren (Sambrook et al., 1989). Die Hybridisierungen werden in 6×SSC/5×Denhardt's Lösung/ 0,1% SDS (SDS: Natriumdodekylsulfat) bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringenz wird im Waschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 85% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,2×SSC/ 0,01% SDS/65°C und für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 90% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1×SSC/0,01% SDS/65°C geeignet. Die Zusammensetzung der Reagenzien wird in Sambrook et al. (1989) beschrieben.The invention also encompasses DNA molecules which have the sequence SEQ ID NO 14 or a sequence that is linked to SEQ ID NO 14 under stringent conditions hybridized, included. The skilled person understands stringent conditions as conditions who select for more than 85%, preferably more than 90% homology (Sambrook et al., 1989). The hybridizations are in 6 × SSC / 5 × Denhardt's solution / 0.1% SDS (SDS: Sodium dodecyl sulfate) at 65 ° C. The degree of stringency is in the Wash step set. For selection for DNA sequences with approx. 85% or more homology the conditions 0.2 × SSC / 0.01% SDS / 65 ° C and for one Selection for DNA sequences with approximately 90% or more homology the conditions 0.1 × SSC / 0.01% SDS / 65 ° C suitable. The composition of the reagents is given in Sambrook et al. (1989).

Weiterhin werden von der Erfindung funktionelle Derivate der erfindungsgemäßen, DNS- Moleküle mit den zellspezifischen UCP3-Promotern umfaßt. Im Sinne der Erfindung werden unter funktionellen Derivate alle DNS-Sequenzen verstanden, die durch Punktmutationen oder Deletionen oder Kombinationen von Punktmutationen oder Deletionen aus der Ursprungssequenz hervorgegangen sind. Diese funktionellen Derivate haben erfindungsgemäß die gemeinsame Eigenschaft, die Transkription eines am 3'-Ende des funktionellen Derivats fusionierten Gen zu vermitteln. Es liegt im Können eines Durchschnittsfachmanns, diese funktionellen Derivate durch zielgerichtete oder zufällige Mutagenese oder durch die Einführung von Deletionen aus den erfindungsgemäßen Sequenzen herzustellen. Genaue Verfahren werden von Sambrook et al. (1989) beschrieben. Es können z. B. Oligonukleotid-gerichtete oder zufällige Mutageneseverfahren verwendet werden. Für das letztere Verfahren kann auch die Polymerase-Kettenreaktion benützt werden, die ungenau arbeitet, wenn sie unter suboptimalen Bedingungen durchgeführt wird (Lin-Goerke et al., 1997). Die Einführung von Deletionen kann z. B. durch die Verwendung von Oligonukleotiden mit Methoden der zielgerichteten Mutagenese oder bevorzugt durch Amplifikation gewünschter Bereiche mittels Polymerase-Kettenreaktion erfolgen. Der Durchschnittsfachmann kann ein funktionelles Derivat ermitteln, indem er die Aktivität eines am 3'-Ende des funktionellen Derivats fusionierten Reportergens, wie z. B. Luciferase, bestimmt. Besonders bevorzugt wird die Aktivität eines funktionellen Derivats durch den Chloramphenicoltransferase-Test bestimmt (engl.: "CAT-Assay"), der nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt wird. Als ein funktionelles Derivat wird der Durchschnittsfachmann eine durch Punktmutation oder Deletion oder Kombination der beiden Veränderungen Sequenz erachten, die in einem der beiden vorgenannten Tests ein über dem Hintergrund liegendes Signal ergibt.Furthermore, the invention uses functional derivatives of the DNA Molecules with the cell-specific UCP3 promoters included. In the sense of the invention functional derivatives are understood to mean all DNA sequences which are caused by Point mutations or deletions or combinations of point mutations or Deletions have arisen from the original sequence. These functional derivatives according to the invention have the common property, the transcription of one at the 3 'end of the functional derivative fused gene. It is in the skill of one Average professional, these functional derivatives by targeted or random Mutagenesis or by introducing deletions from the invention Create sequences. Precise procedures are described by Sambrook et al. (1989). It can e.g. B. oligonucleotide-directed or random mutagenesis methods are used become. The polymerase chain reaction can also be used for the latter method that works inaccurately when done under sub-optimal conditions (Lin-Goerke et al., 1997). The introduction of deletions can e.g. B. through use of oligonucleotides using methods of targeted mutagenesis or preferably by The desired regions are amplified by means of the polymerase chain reaction. The One of ordinary skill in the art can determine a functional derivative by monitoring the activity of a reporter gene fused at the 3 'end of the functional derivative, e.g. B. luciferase, certainly. The activity of a functional derivative is particularly preferred by the Chloramphenicol transferase test determined ("CAT assay"), which according to Sambrook et al. (1989). The average professional is considered a functional derivative one by point mutation or deletion or a combination of the two changes Consider sequence in one of the two aforementioned tests one above the background lying signal results.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegen die erfindungsgemäßen DNS- Moleküle in Form von Vektoren vor, insbesondere von Expressionsvektoren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNS-Molekül ein Plasmid. In einer anderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNS-Molekül ein viraler Vektor.In a preferred embodiment of the invention, the DNA Molecules in the form of vectors, especially expression vectors. In a the DNA molecule according to the invention is a particularly preferred embodiment Plasmid. In another embodiment, the DNA molecule according to the invention is a viral vector.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNS-Moleküle offenbart, die zusätzlich zu der DNS-Sequenz der erfindungsgemäßen Promoter noch weitere Gene enthalten, die funktionell mit den erfindungsgemäßen Promoteren verknüpft sind. Im Sinne dieser Erfindung soll unter funktionell verstanden werden, daß die Verknüpfung in einer Weise vorgenommen werden soll, die es ermöglicht, entweder das Gen zu transkribieren oder das Gen zu transkribieren und dessen Translationsprodukt zu erhalten. Bei den Genen kann es sich um die cDNS oder die genomischer Sequenz des Entkopplungsproteins 3 oder um Reportergene handeln. Bei den Translationsprodukten der Reportergene handelt es sich bevorzugt um Proteine, deren Menge durch Bestimmung der Aktivität, Absorption, Luminiszenz oder Fluoreszenz leicht bestimmt werden kann, wie z. B. dem grün fluoreszierenden Protein (Engl.: Green Fluorescent Protein; GFP), der Chloramphenicol- acetyl-transferase, der β-Galactosidase, der sekretierten Alkalischen Phosphatase oder der Luziferase. Im Sinne dieser Erfindung sollen unter grün fluoreszierenden Protein auch alle Varianten verstanden werden, die in anderen Wellenlängenbereichen fluoreszieren, aber sich von der Aminosäuresequenz des grün fluoreszierenden Proteins ableiten. Besonders bevorzugt handelt es sich um bei den durch das Reportergen kodierten Proteinen um Enzyme, die eine Reaktion katalysieren, deren Endprodukt leicht quantitativ zu bestimmen ist. So wird z. B. von dem Enzym Luziferase eine chemische Reaktion katalysiert, bei der durch Luminiszenz Licht emittiert wird, das in einem Luminometer bestimmt werden kann. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein DNS-Molekül, das die Sequenz SEQ ID NO 15 oder eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an SEQ ID NO 15 hybridisiert, enthält. Unter stringenten Bedingungen versteht der Fachmann Bedingungen, die für mehr als 85%, bevorzugt mehr als 90% Homologie selektieren (Sambrook et al., 1989). Die Hybridisierungen werden in 6×SSC/5×Denhardt's Lösung/ 0,1% SDS bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringenz wird im Waschschritt festgelegt. So sind für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 85% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,2×SSC/0,01% SDS/65°C und für eine Selektionierung auf DNS-Sequenzen mit ca. 90% oder mehr Homologie die Bedingungen 0,1×SSC/0,01% SDS/65°C geeignet. Die Zusammensetzung der beschriebenen Reagenzien ist auch in Sambrook et al. (1989) beschrieben.In a further preferred embodiment, DNA molecules are disclosed which in addition to the DNA sequence of the promoters according to the invention, further genes contain functionally linked to the promoters of the invention. For the purpose of this invention is to be understood by functionally that the linkage in a Should be done in a way that makes it possible to either transcribe the gene or to transcribe the gene and obtain its translation product. With the genes it can be the cDNA or the genomic sequence of the decoupling protein 3 or are reporter genes. The translation products of the reporter genes are preferably proteins, the amount of which by determining the activity, absorption, Luminance or fluorescence can be easily determined, such as. B. the green fluorescent protein (Engl .: Green Fluorescent Protein; GFP), the chloramphenicol acetyl transferase, the β-galactosidase, the secreted alkaline phosphatase or the Luciferase. For the purposes of this invention, all of the fluorescent protein should also be green Variants are understood that fluoresce in other wavelength ranges, but themselves derived from the amino acid sequence of the green fluorescent protein. Especially the proteins encoded by the reporter gene are preferred Enzymes that catalyze a reaction, the end product of which can be easily quantified is. So z. B. catalyzed by the enzyme luciferase a chemical reaction in which light is emitted by luminance, which can be determined in a luminometer. Another aspect of the invention is a DNA molecule that has the sequence SEQ ID NO 15 or a sequence that hybridizes to SEQ ID NO 15 under stringent conditions, contains. The skilled person understands stringent conditions as conditions that apply to more select more than 85%, preferably more than 90% homology (Sambrook et al., 1989). The Hybridizations are performed in 6 × SSC / 5 × Denhardt's solution / 0.1% SDS at 65 ° C carried out. The degree of stringency is determined in the washing step. So are for one Selection for DNA sequences with approximately 85% or more homology the conditions 0.2 × SSC / 0.01% SDS / 65 ° C and for selection on DNA sequences with approx. 90% or more homology the conditions 0.1 x SSC / 0.01% SDS / 65 ° C are suitable. The Composition of the reagents described is also in Sambrook et al. (1989) described.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Wirtszelle, in die ein erfindungsgemäßes DNS- Molekül eingeführt wurde. Dies kann eine eine eukaryontische Wirtszelle sein, bevorzugt eine Hefe- oder eine Säugerzelle. Besonders bevorzugt als Wirtszellen sind Adipozyten in Primärkultur, bevorzugt aus dem Menschen oder aus der Maus, Adipozytenzellinien wie z. B. NIH-3T3L1 (eine Mausadipozytenzellinie), Muskelzellen in Primärkultur, Muskelzellinien wie z. B. C2C12 (eine Muskelzellinie aus der Maus) oder Zellinien wie HEK293 oder HeLa. Dem Durchschnittsfachmann ist es bekannt, wie er durch Standardmethoden geeignete DNS-Moleküle in bestimmte Zellen einführen kann. Diese Methoden sind in Sambrook et al. (1989) beschrieben. Für eukaryontische Zellen wird er bevorzugt die Kalzium-Präzipitationsmethode, die Lipofektion oder die Elektroporation verwenden. Es liegt auch im Können des Durchschnittsfachmanns Parameter aus der Literatur zu entnehmen oder ohne unzumutbaren Aufwand zu entwickeln, die eine erfolgreiche Durchführung der Methoden zum Einbringen von DNS-Moleküle in diese Zellen ermöglicht.Another aspect of the invention is a host cell into which a DNA Molecule was introduced. This can be a eukaryotic host cell, preferred a yeast or mammalian cell. Adipocytes in are particularly preferred as host cells Primary culture, preferably from humans or from mice, adipocyte cell lines such as e.g. B. NIH-3T3L1 (a mouse adipocyte cell line), muscle cells in primary culture, Muscle cell lines such as B. C2C12 (a muscle cell line from the mouse) or cell lines like HEK293 or HeLa. The average person skilled in the art knows how to get through Standard methods can insert suitable DNA molecules into certain cells. This Methods are described in Sambrook et al. (1989). For eukaryotic cells it becomes prefers the calcium precipitation method, lipofection or electroporation use. It also lies in the skill of the average professional To take literature or to develop without unreasonable effort, the one successful implementation of the methods for inserting DNA molecules into them Cells.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen DNS- Moleküls mit den genannten zellspezifischen Promotern zur Transkription eines Gens. Zur Herstellung geeigneter DNS-Moleküle wird der Fachmann molekularbiologische Methoden verwenden, wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben, die er unter Kenntnis der Sequenz der erfindungsgemäßen DNS-Moleküle, der Sequenz des zu transkribierenden Gens und weiterer Elemente wählen wird. Der Nachweis der Transkripte oder des Translationsproduktes erfolgt bevorzugt mit Standardmethoden, wie z. B. Nachweis von RNS durch sequenzspezifische Hybridisierung (Northern Blot), Nachweis des Translationsproduktes durch Antikörper (z. B. Western Blot) oder durch dessen Aktivität in geeigneten Nachweissystemen. Das Translationsprodukt kann auch enzymatische Aktivität haben. Die Methoden hierzu sind von Sambrook et al. (1989) beschrieben.Another aspect of the invention is the use of a DNA Molecule with the cell-specific promoters mentioned for the transcription of a gene. For Those skilled in the art will be able to produce suitable DNA molecules using molecular biological methods use as described by Sambrook et al. (1989), which he is aware of the sequence the DNA molecules according to the invention, the sequence of the gene to be transcribed and will choose other elements. Evidence of the transcripts or the Translation product is preferably carried out using standard methods, such as. B. Evidence of RNA by sequence-specific hybridization (Northern blot), detection of the Translation product by antibody (e.g. Western blot) or by its activity in suitable detection systems. The translation product can also have enzymatic activity to have. The methods for this are described by Sambrook et al. (1989).

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen DNS-Moleküle zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription der erfindungsgemäßen UCP3-Promoter beeinflussen. Dazu werden DNS-Moleküle bereitgestellt, die die Sequenz der erfindungsgemäßen Promoter, die Sequenz SEQ ID NO 14 oder SEQ ID NO 15 umfassen. Diese können auch funktionelle Derivate davon enthalten. Bevorzugt werden diese DNS-Moleküle mit anderen DNS-Molekülen verknüpft, die die Sequenzen für Gene enthalten, die einen leichten Nachweis des Genproduktes gestatten (Reportergene). Bei diesen Reportergenen kann es sich z. B. um das Luziferasegen oder das grün fluoreszierende Protein (Engl.: green fluorescent protein, Abk.: GFP) handeln. Es kann auch die vom erfindungsgemäßen Promoter transkribierte RNS bestimmt und quantifiziert werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden hier auch Zellen verwendet, die mit den erfindungsgemäßen DNS-Molekülen transformiert wurden.A particularly preferred embodiment of the invention is the use of the DNA molecules according to the invention for locating substances which are transcriptional influence the UCP3 promoter according to the invention. To do this, DNA molecules provided the sequence of the promoters according to the invention, the sequence SEQ ID NO 14 or SEQ ID NO 15. These can also be functional derivatives thereof contain. These DNA molecules are preferably linked to other DNA molecules, which contain the sequences for genes that allow easy detection of the gene product allow (reporter genes). These reporter genes can be e.g. B. the Lucifera gene or the green fluorescent protein (abbr .: GFP) act. The RNA transcribed by the promoter according to the invention can also be determined and be quantified. In a further embodiment of the invention, here also used cells that transformed with the DNA molecules of the invention were.

Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription des präferentiell in Fettzellen oder präferentiell in Muskelzellen aktiven UCP3-Promoter beeinflussen können und in dem die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle benützt werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einem zellfreien oder einem zellbasierten System durchgeführt werden.A preferred aspect of the invention is a method for finding substances that the transcription of the preferentially active in fat cells or preferentially active in muscle cells UCP3 promoters can influence and in which the DNA molecules of the invention can be used. The inventive method can in a cell-free or a cell-based system.

Eine Ausführungsform eines solchen Verfahrens besteht in einem zellfreien in-vitro- Transkriptionssystem, das als Komponenten mindestens Zellextrakt, Ribonukleotide und ein erfindungsgemäßes DNS-Molekül enthält. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, die Transkriptionsrate des eingesetzten Promoters in Anwesenheit einer Testsubstanz zu messen und mit der Transkriptionsrate in Abwesenheit der Testsubstanz zu vergleichen. Liegt die Menge der pro Zeiteinheit transkribierten RNS in Anwesenheit der Testsubstanz niedriger als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so inhibiert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test. Liegt die Menge der pro Zeiteinheit transkribierten RNS in Anwesenheit der Testsubstanz höher als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so steigert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test.One embodiment of such a method consists of a cell-free in vitro Transcription system that contains at least cell extract, ribonucleotides and a component DNA molecule according to the invention contains. A preferred embodiment is the transcription rate of the promoter used in the presence of a test substance measure and compare with the transcription rate in the absence of the test substance. Is the amount of RNA transcribed per unit of time in the presence of the test substance lower than the comparison value (i.e. absence of the test substance), the inhibits Test substance the transcription in this test. Is the amount of per time unit transcribed RNA in the presence of the test substance higher than the comparison value (i.e. Absence of the test substance), the test substance increases the transcription in it Test.

Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens zum Auffinden von Substanzen, die die Transkription des erfindungsgemäßen Promoters beeinflussen können, besteht darin, die Veränderung der Aktivität eines am 3'-Ende eines erfindungsgemäßen DNS-Moleküls fusionierten Reportergens zu messen, z. B. dem Luziferasegen oder dem grün fluoreszierenden Protein. Ein solches Verfahren kann in einem zellfreien System durchgeführt werden. Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die nach in-vitro-Transkription in Gegenwart einer Testsubstanz erhaltene RNS durch in-vitro-Translation in Proteine zu überführen, deren Menge, Aktivität, Absorption, Luminiszenz oder Fluoreszenz bestimmt wird. Die erhaltene RNS wird in Proteine überführt, die eine enzymatische Reaktion katalysieren, deren Produkt einfach bestimmt werden kann. Ganz besonders bevorzugt ist hier die Verwendung von Luziferase oder des grün fluoreszierenden Proteins.Another embodiment of the method for finding substances that the Can influence transcription of the promoter according to the invention is that Change in the activity of a 3'-end of a DNA molecule according to the invention measure merged reporter gene, e.g. B. the Luciferasegen or the green fluorescent protein. Such a procedure can be done in a cell-free system be performed. There is an embodiment of the method according to the invention therein the RNA obtained after in vitro transcription in the presence of a test substance to convert in vitro translation into proteins, their amount, activity, absorption, Luminance or fluorescence is determined. The RNA obtained is converted into proteins transferred, which catalyze an enzymatic reaction, the product of which is simply determined can be. The use of luciferase or of is very particularly preferred here green fluorescent protein.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes zellbasiertes Verfahren, bei dem Zellen, die ein erfindungsgemäßes DNS-Molekül enthalten, in Gegenwart einer Testsubstanz wachsen und unter Bedingungen, unter denen von den erfindungsgemäßen UCP3-Promotern transkribiert wird. Das Prinzip des Verfahrens beruht darauf, die erfindungsgemäßen UCP3-Promoter zur Expression eines Reportergens zu benützen, um die Auswirkungen von hinzugefügten Testsubstanzen zu untersuchen. Die Expression des Reportergens simuliert auf diese Weise die Expression des UCP3-Gens. Die erfindungsgemäßen Promoter-Reporterkonstrukte können in Tests benützt werden, nachdem sie in die Zelle eingeführt wurden oder eine Zellinie hergestellt wurde, die diese Konstrukte stabil in das Genom integriert hat. Bevorzugt wird zu einem gewissen Zeitpunkt die Menge, Aktivität, Luminiszenz oder Fluoreszenz des Translationsprodukts des an das 3'-Ende der erfindungsgemäßen, zellspezifischen UCP3-Promoter fusionierten Reportergens bestimmt, wobei die Zellen eventuell vorher lysiert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Verfahrens besteht darin, die Ergebnisse in Anwesenheit einer Testsubstanz zu messen und mit Ergebnissen in Abwesenheit der Testsubstanz zu vergleichen. Liegt die Menge, Aktivität, Absorption, Luminiszenz oder Fluoreszenz des pro Zeiteinheit in Anwesenheit der Testsubstanz produzierten Reporterproteins niedriger als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so inhibiert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test. Liegt die Menge, die Aktivität, Absorption oder Fluoreszenz des pro Zeiteinheit in Anwesenheit der Testsubstanz produzierten Reporterproteins höher als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), so steigert die Testsubstanz die Transkription in diesem Test. Die Signalhöhe ist ein Maß für die Aktivität des UCP3- Promoters.A particularly preferred embodiment is a cell-based one according to the invention Method in which cells which contain a DNA molecule according to the invention in Presence of a test substance grow and under conditions under which of the UCP3 promoters according to the invention is transcribed. The principle of the process is based on the UCP3 promoters according to the invention for expression of a reporter gene use to investigate the effects of added test substances. The Expression of the reporter gene thus simulates the expression of the UCP3 gene. The promoter-reporter constructs according to the invention can be used in tests, after they have been inserted into the cell or a cell line has been made that Has integrated constructs stably into the genome. It is preferred at some point the amount, activity, luminance or fluorescence of the translation product of the to the 3 'end of the cell-specific UCP3 promoters according to the invention fused Reporter gene determined, the cells may be lysed beforehand. A preferred one Embodiment of such a method is to present the results in the presence to measure a test substance and with results in the absence of the test substance to compare. Is the amount, activity, absorption, luminance or fluorescence of the pro Unit of time in the presence of the test substance produced reporter protein lower than that Comparative value (i.e. absence of the test substance), the test substance inhibits the Transcription in this test. Lies the amount, the activity, absorption or fluorescence of the reporter protein produced per unit of time in the presence of the test substance than the comparison value (i.e. absence of the test substance), the test substance increases the Transcription in this test. The signal level is a measure of the activity of the UCP3- Promoters.

In der Praxis könnten die erfindungsgemäßen Promoter in Plasmide kloniert werden, die Reportergene beherbergen, wie z. B. Luziferase, β-Galactosidase, Chloramphenicol-acetyl- transferase oder sekretierte alkalische Phosphatase. Plasmide, die ein Reportergen enthalten, sind z. B. die kommerziell erhältlichen pGL2basic oder pGL3basic (Promega, Madison, Wisconsin, USA) und pSEAP2basic oder pßgal-basic (Clontech, Heidelberg, Deutschland). Auf gleiche Weise könnten Zellen benützt werden, die die genannten DNS-Konstrukte stabil in das Genom integriert haben. Zellen, die für die Durchmusterungstest benützt werden können, sind z. B. primäre Zellkulturen z. B. von Adipozyten oder Muskelgewebe, oder Zellinien wie HEK293, HeLa, C2C12 oder NIH-3T3. Werden primäre Zellkulturen für längere Zeit kultiviert, so geht die UCP3-Expression verloren. Auch in einigen Zellinien ist keine UCP3-Expression nachweisbar. Jedoch sind diese Zellinien geeignet, um Aktivatoren der UCP3-Transkription zu finden, da diese auch in Zellen aktivatorisch wirken werden, die UCP3 exprimieren. Besonders Aktivatoren der UCP-3-Transkription im Muskelgewebe können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung der Fettleibigkeit verwendet werden. Für diese Zwecke können jedoch auch Aktivatoren der UCP-3-Transkription im Fettgewebe verwendet werden.In practice, the promoters of the invention could be cloned into plasmids that Home to reporter genes, such as B. luciferase, β-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase or secreted alkaline phosphatase. Plasmids containing a reporter gene are z. B. the commercially available pGL2basic or pGL3basic (Promega, Madison, Wisconsin, USA) and pSEAP2basic or pßgal-basic (Clontech, Heidelberg, Germany). In the same way, cells could be used which stably construct the named DNA constructs have integrated into the genome. Cells used for the screening test can, for. B. primary cell cultures z. B. adipocytes or muscle tissue, or Cell lines such as HEK293, HeLa, C2C12 or NIH-3T3. Are primary cell cultures for Cultivated for a long time, the UCP3 expression is lost. It is also in some cell lines no UCP3 expression was detectable. However, these cell lines are suitable for activators of the UCP3 transcription, since these will also have an activating effect in cells that Express UCP3. Especially activators of UCP-3 transcription in muscle tissue can be used in the manufacture of medicines to treat obesity become. However, activators of UCP-3 transcription can also be used for these purposes Adipose tissue to be used.

Der Durchschnittsfachmann kann einen solchen Test durchführen (siehe Beispiel 2), indem er auf Standardmethoden und fertig zusammengestellte Reagenzien zurückgreift, wie sie z. B. von Promega (Madison, Wisconsin, USA) fertig zusammengestellt (Luciferase Assay System) angeboten werden. Dazu erhält er auch Vorschriften, wie der Test mit den kommerziell erhältlichen Reagenzien durchzuführen ist. Der Fachmann stellt dazu mit Standardmethoden geeignete Konstrukte her und transfiziert diese in geeignete Zellkulturen (Sambrook et al., 1989). Nach Wachstum in Gegenwart der zu testenden Substanz wird optional gewaschen und die Zellen anschließend lysiert. Nach Zentrifugation zur Entfernung der Zelltrümmer wird der Überstand mit dem Luciferin enthaltenden Testreagens versetzt und das emittierte Licht in einem Luminometer gemessen.The average person skilled in the art can carry out such a test (see Example 2) by he uses standard methods and ready-made reagents, like them e.g. B. compiled by Promega (Madison, Wisconsin, USA) (Luciferase Assay System). He also receives regulations, such as the test with the commercially available reagents is to be carried out. The specialist provides information on this Constructs suitable standard methods and transfected them into suitable cell cultures (Sambrook et al., 1989). After growth in the presence of the substance to be tested optionally washed and then the cells lysed. After centrifugation for removal the cell debris is added to the supernatant with the test reagent containing luciferin and measured the emitted light in a luminometer.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Verfahren im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High throughput screening, HTS) ausgeführt. Dabei wird in einer geeigneten Anordnung eine große Anzahl von Testsubstanzen gleichzeitig geprüft. Ein solches HTS-Verfahren kann vorteilhaft voll- oder teilautomatisiert sein und die Auswertung durch elektronische Datenverarbeitung erfolgen. Vorteilhaft wird eine Testsubstanz, die im zellfreien System eine steigernde Wirkung zeigte, zusätzlich in einem zellbasierten System geprüft. Das im vorherigen Abschnitt beschriebene Verfahren kann von einem Fachmann ohne erfinderische Tätigkeit an die Erfordernisse im Hochdurchsatz- Musterungs-Format angepaßt werden.In a preferred embodiment, a method according to the invention is carried out in High throughput screening (HTS) format. Here a large number of test substances simultaneously in a suitable arrangement checked. Such a HTS process can advantageously be fully or partially automated the evaluation is carried out by electronic data processing. One will be advantageous Test substance that showed an increasing effect in the cell-free system, additionally in one cell-based system checked. The procedure described in the previous section may vary from a specialist without inventive step to the requirements in high throughput Pattern format can be adjusted.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, die erfindungsgemäßen DNS- Moleküle zur Identifizierung weiterer Faktoren oder Substanzen zu benützen, die an sie binden. Bevorzugt werden Faktoren gesucht, die die Transkription eines am 3'-Ende fusionierten Gens vermitteln, erniedrigen oder erhöhen (Transkriptionsfaktoren). Dazu können die erfindungsgemäßen DNS-Moleküle auf unlöslichen Trägern gebunden werden und mit einem Gemisch aus verschiedenen Faktoren oder Substanzen, wie z. B. einem Kernextrakt oder einer Naturstoffbibliothek, unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht werden. Nach ein oder mehreren Waschschritten, eventueller Wiederholung des Bindungsprozesses werden die gebundenen Faktoren oder Substanzen durch geeignete Methoden, wie z. B. Aminosäuresequenzierung, Massenspektroskopie, Gelelektrophorese, identifiziert.A further embodiment of the invention consists in Use molecules to identify other factors or substances attached to them tie. It is preferred to look for factors that have a transcription at the 3 'end mediate, decrease or increase fused gene (transcription factors). To the DNA molecules according to the invention can be bound on insoluble supports and with a mixture of various factors or substances, such as. B. one Core extract or a natural product library, in contact under suitable conditions to be brought. After one or more washing steps, possibly repeating the The binding factors or substances are bound by suitable binding processes Methods such as B. amino acid sequencing, mass spectroscopy, gel electrophoresis, identified.

Unter DNS-Molekülen im Sinne dieser Erfindung sind alle Moleküle zu verstehen, die aus natürlich vorkommenden Desoxyribonukleotiden bestehen. Dabei sollen aber auch erfindungsgemäß Moleküle erfaßt werden, die nach chemischer Derivatisierung den grundsätzlichen chemischen Charakter der DNS behalten haben. Zu den möglichen Derivatisierungen zählt z. B. die Derivatisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, Veränderungen im Rückgrat wie der Ersatz von Sauerstoffatomen gegen Schwefelatome zur Stabilisierung oder das Überführen des DNS-Moleküls in peptidische Nukleinsäuren (Engl.: Peptide nucleic acids; Abk.: PNA). For the purposes of this invention, DNA molecules are to be understood to mean all molecules which consist of naturally occurring deoxyribonucleotides. But also should According to the invention, molecules are detected which, after chemical derivatization have retained the basic chemical character of the DNA. To the possible Derivatization counts e.g. B. the derivatization with fluorescent dyes, changes in the backbone like the replacement of oxygen atoms with sulfur atoms for stabilization or converting the DNA molecule into peptidic nucleic acids nucleic acids; Abbr .: PNA).

Examples Example 1 - Identification of two transcription start sites in the 5 'region of the UCP3 gene Subjects, fetal tissue samples from the skeletal muscle and from the abdominal cavity

Insgesamt wurden 63 nicht verwandte Patienten, 38 krankhaft fettleibige Personen, 10 Personen mit überstandener Fettleibigkeit und 15 nicht fettleibige Personen untersucht. Gewebeproben wurden vom Musculus rectus abdominis und in der Bauchhöhle vom Fettgewebe des Bauchnetzes von krankhaft fettleibigen Personen entnommen, bei denen der Magen zur Gewichtsreduktion chirurgisch bandagiert wurde. Kontrollpersonen und Personen mit überstandener Fettleibigkeit unterzogen sich bestimmten operativen Eingriffen wie der Entfernung der Gallenblase, Leistenbruchoperationen und Regulierung oder Entfernung des Bandes um den Magen. Die Versuchspersonen hatten nach einer Belehrung in die Studie eingewilligt, die auch von der Ethikkommission des Institutes genehmigt worden war. Die Personen wurden im nüchternen Zustand durch schnell wirkende Barbiturate anästhesiert und durch Alfentanil-Hydrochlorid ((INN); JUPAC: N-{1-[2-(4- Ethyl-5-oxo-2-tetrazolin-1-yl)ethyl]-4-methoxy-methyl-4-piperidyl}-propionanilid) in der Narkose gehalten. Gewebeproben wurden bei Beginn des chirurgischen Eingriffs entnommen, in Aliquots aufgeteilt und bei -70°C eingefroren. Das Verhältnis des Gewichts zur Größe wurde nach Messungen des Gewichts und der Größe bestimmt (Engl. Body mass index; BMI).A total of 63 unrelated patients, 38 morbidly obese, 10 Subjects with survived obesity and 15 non-obese subjects were examined. Tissue samples were taken from the rectus abdominis muscle and in the abdominal cavity from Adipose tissue from the abdominal network taken from morbidly obese people, for whom the Stomach was surgically bandaged for weight loss. Control persons and People with surviving obesity have undergone certain surgical procedures such as gallbladder removal, inguinal hernia surgery and regulation or Removal of the band around the stomach. The subjects had after instruction consented to the study, which was also approved by the institute's ethics committee had been. The people were sober by fast-acting Anesthetized barbiturates and by alfentanil hydrochloride ((INN); JUPAC: N- {1- [2- (4- Ethyl-5-oxo-2-tetrazolin-1-yl) ethyl] -4-methoxy-methyl-4-piperidyl} propionanilide) in the Anesthesia held. Tissue samples were taken at the start of the surgery removed, divided into aliquots and frozen at -70 ° C. The ratio of weight the size was determined after measurements of weight and size (Engl. Body mass index; BMI).

UCP-3 gene structure

Eine λ-EMBL3-SP6/T7 genomische Bibliothek aus der menschlichen Plazenta (Hersteller: Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA) wurde durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde durchmustert, die fast der vollständigen, 1049 Basenpaar langen UCP3-cDNS entsprach und die Nukleotide +159 bis +1207 (GenBank Zugangsnummer U84763) umfaßte. Drei überlappende Klone mit einer Größe von etwa 16,5 kBp und mit dem kompletten menschlichen UCP3 Gen wurden isoliert und in das ZERO-Background™ Klonierungssystem (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) subkloniert. Die Sequenzierung der Plasmid-DNS wurde mit fertig zusammengestellten, kommerziell erhältlichen Reagenzien (PRISM™ Ready Reaction dRhodamine Terminator Kit, Hersteller Perkin Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) unter Verwendung von dRhodamin-Terminatoren und einem ABI PRISMT™ 310 DNS-Sequenzierautomaten durchgeführt (Perkin Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA), wobei sukzessive, jeweils passende Oligonukleotide zur Durchführung der Sequenzierungsreaktionen synthetisiert wurden ("Wandern auf der DNS", "Primer walking").A λ-EMBL3-SP6 / T7 genomic library from the human placenta (manufacturer: Clontech, Palo Alto, California, USA) was under plaque hybridization Screened using a probe that is almost the full 1049 base pair long UCP3 cDNA corresponded and nucleotides +159 to +1207 (GenBank accession number U84763) included. Three overlapping clones with a size of about 16.5 kbp and with the entire human UCP3 gene was isolated and included in the ZERO-Background ™ Cloning system (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) subcloned. The Sequencing of the plasmid DNA was completed using, commercially available reagents (PRISM ™ Ready Reaction dRhodamine Terminator Kit, manufacturer Perkin Elmer-Applied Biosystems, Foster City, California, USA) using dRhodamine terminators and an ABI PRISMT ™ 310 DNA sequencer carried out (Perkin Elmer-Applied Biosystems, Foster City, California, USA), whereby successive, respectively suitable oligonucleotides for carrying out the Sequencing reactions were synthesized ("walking on the DNA", "primer walking ").

RNA isolation, experiments for rapid amplification of the 5 'and 3' cDNA ends (Rapid amplification of cDNA ends; abbr .: RACE)

Gesamt-RNS wurde aus 0,5 g menschlichem Skelettmuskelgewebe nach der Methode von Chumczynski und Sacchi (1987) isoliert. Die Integrität der RNS-Proben wurde durch Analyse ihres elektrophoretischen. Laufverhaltens in Formaldehydgelen sichergestellt (Sambrook et al., 1989). RNS-Konzentrationen wurden durch Absorptionsmessungen bei 260 nm bestimmt. 5' und 3' RACE wurden durchgeführt wie von Frohman et al. (1988) beschrieben. Für die 5'-RACE wurden 3 µg Gesamt-RNS aus menschlichem Skelettmuskel mit der Superscript™ II Reversen Transkriptase (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, Großbritannien) und eines UCP3 genspezifischen Oligonukleotid aus dem Intron 1 (5'- TACACCTGCT TGACGGAG-3') revers transkribiert. Nach Ribonuklease H Verdau (Hersteller Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA) und Verlängerung des polyA-Schwanzes (engl.: polyA-tailing) mit terminaler Transferase (Hersteller Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA) wurde die Erststrang-cDNS der Polymerase- Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction; Abk.: "PCR") unterworfen mit 5'- GCTGTGTCCA GTGGAAAGGT AACGAGGTCA GCAA-3' als genspezifischem Oligonukleotid und 5'-GAGGACTCGA GCTCAAGCT₍₂₀₎-3' als Adapter-Oligonukleotid. Die PCR-Produkte wurde erneut amplifiziert unter Verwendung von 5"-GAGGACTCGA GCTCAAGC-3" als Anker-Oligonukleotid und 5'-TGGGAGGCAC GTCTGAAG-3^' als internes (Engl.: nested) genspezifisches Oligonukleotid. (Für die 3^'RACE wurden 3 µg menschliche Skelettmuskel-RNS revers transkribiert unter Verwendung des oben angeführten polyA-spezifischem Adapter-Oligonukleotids. Das Anker-Oligonukleotid und zwei interne (Engl.: nested) Oligonukleotide im kodierenden Strang 5'-CCTCGACTGT ATGATAAAGA TG- 3' (+921 bis +942) und 5'-CCTCCTGGGC CACCATCTT-3' (+937 bis +955, GenBank Zugangsnummer U84763) wurden für die Amplifizierung benützt). 5' und 3' RACE-PCR-Produkte wurden unter Verwendung von dem Durchschnitts fachmann bekannten Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) in einen gängigen Vektor subkloniert und sequenziert, nachdem sie über ein Gel gereinigt worden waren. Total RNA was isolated from 0.5 g of human skeletal muscle tissue using the method of Chumczynski and Sacchi (1987). The integrity of the RNA samples was checked by analyzing their electrophoretic. Behavior in formaldehyde gels ensured (Sambrook et al., 1989). RNA concentrations were determined by absorption measurements at 260 nm. 5 'and 3' RACE were performed as described by Frohman et al. (1988). For the 5'-RACE, 3 µg total RNA from human skeletal muscle with the Superscript ™ II reverse transcriptase (GibcoBRL Life Technologies, Paisley, Great Britain) and a UCP3 gene-specific oligonucleotide from intron 1 (5'-TACACCTGCT TGACGGAG-3 ') reverse transcribed. After ribonuclease H digestion (manufacturer Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA) and extension of the polyA tail (English: polyA-tailing) with terminal transferase (manufacturer Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA), the first strand became cDNA of the polymerase chain reaction (abbr .: "PCR") subjected to 5'- GCTGTGTCCA GTGGAAAGGT AACGAGGTCA GCAA-3 'as a gene-specific oligonucleotide and 5'-GAGGACTCGA GCTCAAGCT ₍₂₀₎ -3' as an adapter Oligonucleotide. The PCR products were re-amplified using 5 "-GAGGACTCGA GCTCAAGC-3" as anchor oligonucleotide and 5'-TGGGAGGCAC GTCTGAAG-3 ^' as internal (nested) gene specific oligonucleotide. (For the 3 ^' RACE, 3 µg of human skeletal muscle RNA was reverse transcribed using the polyA-specific adapter oligonucleotide listed above. The anchor oligonucleotide and two internal (nested) oligonucleotides in the coding strand 5'-CCTCGACTGT ATGATAAAGA TG - 3 '(+921 to +942) and 5'-CCTCCTGGGC CACCATCTT-3' (+937 to +955, GenBank accession number U84763) were used for the amplification). 5 'and 3' RACE-PCR products were subcloned and sequenced into a common vector using standard techniques known to those of ordinary skill in the art (Sambrook et al., 1989) after being gel purified.

Test for Protection of the UCP3-5 'Transcript Region from Ribonuclease Degradation RNAse Protection Assay)

Eine das 425 bp lange Intron 1 überdeckende Probe (+6816 bis +9074; Sequenz SEQ ID NO 17) wurde durch reverse Transkriptions-PCR (Abk.: RT-PCR) mit den Oligonukleotiden 5'-CCTCACCAGC CAGCCTCTTG TC-3' (+ 6816 bis +6837) und 5'- GCTGTGTCCA GTGGAAAGGTA-3' (+9054 bis +9074), jeweils im kodierenden und im nicht kodierenden Bereich, hergestellt. Die PCR-Produkte wurden in den pZERO™ Plasmidvektor kloniert und die Sequenz durch Sequenzierung mit farbstoffgekoppelten Terminatoren (Engl.: Dye-Terminator cycle sequencing) verifiziert.A sample covering the 425 bp long intron 1 (+6816 to +9074; sequence SEQ ID NO 17) was by reverse transcription PCR (abbr .: RT-PCR) with the Oligonucleotides 5'-CCTCACCAGC CAGCCTCTTG TC-3 '(+ 6816 to +6837) and 5'- GCTGTGTCCA GTGGAAAGGTA-3 '(+9054 to +9074), each in the coding and in the non-coding area. The PCR products were in the pZERO ™ Plasmid vector cloned and the sequence by sequencing with dye-coupled Terminators (Dye-Terminator cycle sequencing) verified.

³²P-markierte Gegenstrang-RNS wurde mit einem Kombinationssystem, das den SP6 und den T7-Promoter verwendet (Riboprobe Combination System SP6/T7; Hersteller: Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA), und α³²P-dUTP (3000 Ci/mmol; Hersteller: Amersham Life Science, Buckingshamshire, Großbritannien) nach den Angaben des Herstellers erhalten. In vitro transkribierte RNS wurde über ein Gel gereinigt und die inkorporierte Radioaktivität durch Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt (Hersteller: Wallac 1450 Microbeta PLUS, EG Berthold, Bad Wildbach, Deutschland). Nach der Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten wurden Aliquots der ³²P-markierten RNS mit einer Aktivität von 8×10⁴ cpm (Engl.: cpm: counts per minute), mit 5 µg Gesamt-RNS aus menschlichem Muskel oder 15 µg Gesamt-RNS aus Fettgewebe bei 43°C über Nacht hybridisiert. Nicht geschützte RNS wurde mit 0,5 Einheiten Ribonuklease A und 20 Einheiten Ribonuklease T1 (Ambion RPAII Kit; Ambion Inc., Austin, Texas, USA) bei 37°C für 30 Minuten in einem Gesamtvolumen von 220 µl verdaut. Die Ribonuklease-Inaktivierungs-/Prä zipititationsmischung, die vom Hersteller mitgeliefert wurde, wurde hinzugefügt, um die ³²P-markierten RNS-RNS-Hybride zu präzipitieren. Die Präzipitate wurden mit 70% Ethanol gewaschen und geschützte Fragmente durch Elektrophorese in 4% Polyacrylamid- Harnstoffgelen aufgetrennt (Sambrook et al., 1989). ³² P-labeled counter-strand RNA was used with a combination system that uses the SP6 and the T7 promoter (Riboprobe Combination System SP6 / T7; manufacturer: Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) and α ³² P-dUTP (3000 Ci / mmol; manufacturer: Amersham Life Science, Buckingshamshire, Great Britain) according to the manufacturer's instructions. RNA transcribed in vitro was purified using a gel and the incorporated radioactivity was determined by liquid scintillation counting (manufacturer: Wallac 1450 Microbeta PLUS, EG Berthold, Bad Wildbach, Germany). After denaturation at 95 ° C for 5 minutes, aliquots of the ³² P-labeled RNA with an activity of 8 × 10 ⁴ cpm (English: cpm: counts per minute), with 5 µg total RNA from human muscle or 15 µg Total RNA from adipose tissue hybridized at 43 ° C overnight. Unprotected RNA was digested with 0.5 units of ribonuclease A and 20 units of ribonuclease T1 (Ambion RPAII kit; Ambion Inc., Austin, Texas, USA) at 37 ° C. for 30 minutes in a total volume of 220 μl. The ribonuclease inactivation / precipitation mixture provided by the manufacturer was added to precipitate the ³² P-labeled RNA-RNA hybrids. The precipitates were washed with 70% ethanol and protected fragments separated by electrophoresis in 4% polyacrylamide-urea gels (Sambrook et al., 1989).

Identification of two transcription start sites

Das 5^'-Ende der UCP3-mRNS aus dem Skelettmuskel wurde durch 5^'-RACE-Experimente unter Verwendung eines Gegenstrangoligonukleotids aus dem Intron 1 bestimmt. Zwei bestimmte PCR-Fragmente wurden erhalten und durch Sequenzierung charakterisiert. Die Produkte gingen jeweils 184 bp und 331 bp in 5'-Richtung über den Transkriptionsstart hinaus, was durch zwei transkriptionelle Startstellen erklärt werden kann (Abb. 1A). Der Gebrauch der am weitesten entfernten Initiationsstelle wurde durch RT-PCR gezeigt (Daten nicht gezeigt).The 5 ^' end of the skeletal muscle UCP3 mRNA was determined by 5 ^' RACE experiments using an intron 1 counter-stranded oligonucleotide. Two specific PCR fragments were obtained and characterized by sequencing. The products each went 184 bp and 331 bp in the 5 'direction beyond the start of transcription, which can be explained by two transcriptional start points ( Fig. 1A). The use of the most distant initiation site was shown by RT-PCR (data not shown).

Ribonuklease-Schutztests (Engl.: RNAse protection assay) zeigten, daß der Großteil der Transkripte im Muskelgewebe mehrerer fettleibiger und schlanker Personen an der stromabwärts gelegenen Stelle bei -184 gestartet wurde. Der Anteil der UCP3-mRNS, der von der stromaufwärts gelegenen Stelle bei -331 stammt, war weniger als 5%. Jedoch wurde die stromaufwärts gelegene Stelle vornehmlich, wenn nicht ausschließlich, im Fettgewebe benützt (Abb. 1B). Ähnliche Ergebnisse wurden im Fettgewebe von 10 fettleibigen und 4 schlanken Individuuen gefunden (Daten nicht gezeigt). Diese Experimente zeigen, daß bestimmte Promoterbereiche im Fettgewebe und im Skelettmuskel benutzt werden. Eine Computeranalyse der zu den alternativen Startstellen benachbarten Sequenzen erbrachte, daß beide Regionen eukaryontische Konsensussequenzen für die Transkriptionsinititation enthalten. Man findet zwei TATA ähnliche Sequenzen (Locker und Buzard, 1990), 29 bis 36 BP stromaufwärts, und zwei konservierte Stellen, an die ein modifizierter 7-Methylguanosinrest an die transkribierte RNS angehängt werden (Engl.: cap site; Locker und Buzard, 1990), 16 bis 33 BP stromabwärts von der entsprechenden Startstelle. Von der Transkriptionsstartstelle durch eine Alu-Sequenz getrennt wurden durch Sequenzvergleich grundlegende Promoterelemente wie CAAT-Boxen bei -749, -861 und -922 relativ zu der stromabwärts gelegenen Transkriptionsstartstelle, ein Oktamermotiv bei -713 und eine konservierte Bindungsstelle für einen stromaufwärts bindenden Stimulationsfaktor (Engl.: Upstream activating factor, Abk.: USF) bei -1038 gefunden (Abb. 1A). Zusätzlich wurden drei aufeinanderfolgende E-Box-Elemente bei -653, -640 und -631, ein putatives Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor/Retinoid-X- Rezeptor beeinflußtes Element (PPAR/RXR) bei -265 und ein putatives Thyroid beeinflußtes Element (TRE) (Locker und Buzard, 1990) an Position -3340, lokalisiert in einer Alu-Sequenz von -3396 bis -3094.Ribonuclease protection tests (English: RNAse protection assay) showed that the majority of the transcripts in the muscle tissue of several obese and slim people was started at the downstream site at -184. The proportion of UCP3 mRNA originating from the upstream site at -331 was less than 5%. However, the upstream site was primarily, if not exclusively, used in the adipose tissue ( Fig. 1B). Similar results were found in the adipose tissue of 10 obese and 4 lean individuals (data not shown). These experiments show that certain promoter areas are used in adipose tissue and in skeletal muscle. A computer analysis of the sequences adjacent to the alternative starting points showed that both regions contain eukaryotic consensus sequences for the initiation of transcription. There are two TATA-like sequences (Locker and Buzard, 1990), 29 to 36 BP upstream, and two conserved sites to which a modified 7-methylguanosine residue is attached to the transcribed RNA (English: cap site; Locker and Buzard, 1990 ), 16 to 33 BP downstream of the corresponding starting point. Basic promoter elements such as CAAT boxes at -749, -861 and -922 were separated from the transcription start site by an aluminum sequence by sequence comparison, relative to the downstream transcription start site, an octamer motif at -713 and a conserved binding site for an upstream binding stimulation factor .: Upstream activating factor, abbr .: USF) found at -1038 ( Fig. 1A). In addition, three consecutive E-box elements at -653, -640 and -631, a putative peroxisome proliferator-activated receptor / retinoid-X receptor-affected element (PPAR / RXR) at -265 and a putative thyroid-affected element ( TRE) (Locker and Buzard, 1990) at position -3340, localized in an Alu sequence from -3396 to -3094.

Example 2 - Screening Test to Find Substances That Contain Modulate transcription of the UCP3 promoter

Der Durchschnittsfachmann führt einen solchen Test durch, indem er auf Standardmethoden und fertig zusammengestellte Reagenzien zurückgreift, wie sie z. B. von Promega (Madison, Wisconsin, USA) als "Luciferase Assay System" angeboten werden. Zu diesem System erhält er auch Vorschriften, wie der Test mit den kommerziell erhältlichen Reagenzien durchzuführen ist. Er kann aber auch auf die Lehre aus dem Beispiel 1 des US-Patentes 5,283,179 zurückgreifen, in dem die Durchführung eines solchen Testes beschrieben ist.The average professional performs such a test using standard methods and uses ready-made reagents such as z. B. from Promega (Madison, Wisconsin, USA) as the "Luciferase Assay System". About this system he also receives instructions such as testing with the commercially available reagents is to be carried out. However, he can also refer to the teaching from Example 1 of the US patent 5,283,179, in which the implementation of such a test is described.

Durch eine Kombination geeigneter Klonierungstechniken und PCR-Techniken wird die Sequenz SEQ ID NO 16 hergestellt (Sambrook et al., 1989), die nicht mehr den muskelzellspezifischen UCP3-Promoter enthält. Diese DNS-Sequenz wird mit Standardmethoden über geeignete Restriktionsschnittstellen in den Vektor pGL2basic oder pGL3basic (Promega, Madison, Wisconsin, USA) insertiert. Dieser Vektor wird mit Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) in primäre humane Adipozytenzellkulturen transfiziert, die wie in Beispiel 1 beschrieben von fettleibigen Personen gewonnen werden, die sich einer chirurgischen Behandlung unterziehen müssen. Diese Zellkultur wird unter Standardbedingungen in Standardzellkulturmedium in einer Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 100 mm angezogen. Danach werden die Zellen in Gegenwart einer wässrigen Lösung oder einer Lösung in Dimethylsulfoxid einer zu testenden Substanz für eine bestimmte Zeit kultiviert. Bei Raumtemperatur wird für etwa 2 bis 5 min 1 ml eines Puffers zugegeben, der die Zellen lysiert (25 mM Tris-Phosphat pH 7,8, 2 mM Dithiothreitol, 10% Glycerin, 1% Triton® X-100, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mM Cyclohexylendiamintetraacetat (CDTA)), und die Zelltrümmer werden durch kurze Zentrifugation entfernt. Optional kann vorher das Wachstumsmedium der kultivierten Zellen entfernt werden und die Zellen ein bis zweimal mit PBS-Puffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, pH 7.3; Mg²⁺- and Ca²⁺-frei) gewaschen werden. Ein Teil des Überstandes wird mit dem fünffachen Volumen an Testreagens (20 mM Tricin (N-tris-(hydroxymethyl)-methylglycin) pH 7,8, 33,3 mM Dithiothreitol (DTT), 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,53 mM Adenosintriphosphat (ATP), 0,47 mM Luciferin (eine polyheterozyklische organische Säure: D-(-)-2-(6'-hydroxy-2'- benzothiazolyl)+Δ²-thiazolin-4-arbonsäure) und 0,27 mM Koenzym A (CoA)) vermischt und das emittierte Licht in einem Luminometer gemessen. Das Volumen des Testreagens kann bis zu dem 25fachen Volumen der zu testenden Lösung betragen. Danach wird das Signal mit dem Signal einer Kontrolle (wässrige Lösung oder Dimethylsulfoxidlösung ohne zu testende Substanz) verglichen.The sequence SEQ ID NO 16 (Sambrook et al., 1989), which no longer contains the muscle cell-specific UCP3 promoter, is produced by a combination of suitable cloning techniques and PCR techniques. This DNA sequence is inserted into the vector pGL2basic or pGL3basic (Promega, Madison, Wisconsin, USA) using suitable restriction sites. This vector is transfected by standard methods (Sambrook et al., 1989) into primary human adipocyte cell cultures, which, as described in Example 1, are obtained from obese persons who have to undergo surgical treatment. This cell culture is grown under standard conditions in standard cell culture medium in a cell culture dish with a diameter of 100 mm. The cells are then cultured in the presence of an aqueous solution or a solution in dimethyl sulfoxide of a substance to be tested for a certain time. At room temperature, 1 ml of a buffer which lyses the cells (25 mM Tris-phosphate pH 7.8, 2 mM dithiothreitol, 10% glycerol, 1% Triton® X-100, 1 mg / ml) is added for about 2 to 5 min Bovine serum albumin, 2 mM cyclohexylenediaminetetraacetate (CDTA)) and the cell debris are removed by brief centrifugation. Optionally, the growth medium of the cultured cells can be removed beforehand and the cells once or twice with PBS buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na ₂ HPO ₄ , 1.4 mM KH ₂ PO ₄ , pH 7.3; Mg ²⁺ - and Ca ²⁺ -free). Part of the supernatant is mixed with five times the volume of test reagent (20 mM tricine (N-tris (hydroxymethyl) methylglycine) pH 7.8, 33.3 mM dithiothreitol (DTT), 8 mM Mg ²⁺ , 0.13 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.53 mM adenosine triphosphate (ATP), 0.47 mM luciferin (a polyheterocyclic organic acid: D - (-) - 2- (6'-hydroxy-2'-benzothiazolyl) + Δ ² -thiazoline- 4-arbonic acid) and 0.27 mM coenzyme A (CoA)) mixed and the emitted light measured in a luminometer. The volume of the test reagent can be up to 25 times the volume of the solution to be tested. The signal is then compared with the signal from a control (aqueous solution or dimethyl sulfoxide solution without substance to be tested).

Um Substanzen zu finden, die die Transkription des muskelzellspezifischen UCP3- Promoters beeinflussen, kann der Fachmann ein DNS-Molekül herstellen, das nicht mehr den fettzellspezifischen UCP3-Promoter enthält. Dazu entfernt er die Nukleotide 6739 bis 6795, die den fettzellspezifischen Teil enthalten, aus der DNS-Sequenz SEQ ID NO: 14 durch Standardmethoden (Sambrook et al., 1989) und kloniert diese in die oben genannten Vektoren. Weiterhin geht er nach der oben geschilderten Vorgehensweise vor, nur daß er Muskelzellen in Primärkultur oder geeignete Zellinien verwendet.To find substances that transcribe the muscle cell-specific UCP3- Influencing promoters, the expert can produce a DNA molecule that no longer contains the fat cell-specific UCP3 promoter. To do this, he removes nucleotides 6739 bis 6795, which contain the fat cell-specific part, from the DNA sequence SEQ ID NO: 14 by standard methods (Sambrook et al., 1989) and cloned them into the above Vectors. Furthermore, he follows the procedure outlined above, except that he Muscle cells used in primary culture or suitable cell lines.

Generelle Aktivatoren des UCP3-Promoters werden mit der gleichen experimentellen Vorgehensweise gefunden, wobei die Sequenz SEQ ID NO: 14, die beide Promoter enthält, verwendet werden kann. Es werden hier auch Zellen eingesetzt, in denen keine oder nur eine sehr geringe UCP3-Expression zu finden ist, wie z. B. die Zellinie HEK293.General activators of the UCP3 promoter are experimented with the same Procedure found, the sequence SEQ ID NO: 14, which contains both promoters, can be used. Cells are also used here in which none or only a very low UCP3 expression can be found, e.g. B. the cell line HEK293.

Der Fachmann kann einen solchen Test ohne erfinderische Tätigkeit an die Gegebenheiten im Mikrotiterplattenformat anpassen. The person skilled in the art can carry out such a test without inventive step adjust in microtiter plate format.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Illustrations

Abb. 1: Charakterisierung der UCP3-Promoterregion und Evidenz für verschiedene Transkriptionsinitiationsstellen im Skelettmuskel und im Fettgewebe Fig. 1: Characterization of the UCP3 promoter region and evidence for various transcription initiation sites in skeletal muscle and in adipose tissue

A) part of the nucleotide sequence of the human UCP3 gene; basic Promoter elements such as B. CAAT box, octamer motifs and upstream Binding sites for stimulation factor as well as putative transcription factor binding sites like e-boxes and a PPAR / RXR element (PPAR / RXR response element) highlighted by small frames. Half an aluminum sequence is by a large one Outline highlighted. TATA-like sequences are printed in bold and underlined, conserved areas where a modified 7-methylguanosine residue on the transcribed RNS are appended (bold: cap site), are printed in bold italics. The two transcription start points are indicated by arrows and that The translation start codon is printed in bold. Part of the sequence of intron 1 is in small Letters shown.
B) Autoradiogram of the ribonuclease protection test (RNAse protection assay) of RNA from human skeletal muscle and adipose tissue. The size of the protected Fragments calculated for transcripts initiated at the upstream or at the downstream site, is 425 and 316 nucleotides, respectively, as on the right margin noted.

Allocation of the gel

M: Endmarkierter Größenstandard mit den angegebenen Größen
1: unverdaute 32P-UCP3 Gegenstrangprobe von Nukleotid 6816 bis 9074 (Sequenz SEQ ID NO 17)
2: ³² M: End-marked size standard with the specified sizes
1: Undigested 32P-UCP3 counter strand sample from nucleotide 6816 to 9074 (sequence SEQ ID NO 17)
^2:32

P-UCP3-Gegenstrang-Probe an Hefe-RNS hybridisiert und Ribonukleaseverdau unterworfen
3-5: Ribonuklease-Schutztest von 5 µg von Gesamt-RNS aus dem Skelettmuskel von drei Individuen
6-7: Ribonuklease-Schutztest von 15 µg Gesamt-RNS aus intraperitonealen Fettgewebe von zwei Individuen P-UCP3 counter-strand sample hybridized to yeast RNA and subjected to ribonuclease digestion
3-5: Ribonuclease protection test of 5 µg of total RNA from the skeletal muscle of three individuals
6-7: Ribonuclease protection test of 15 µg total RNA from intraperitoneal adipose tissue from two individuals

literature

Aronheim, A., Ohlsson, H., Park, C. W., Edlund, T., und Walker, M. D. (1991). Nucleic Acids Res 19, 3893-3899.Astrup, A., Bulow, J., Christensen, N. J., Madsen, J., und Quaade, F. (1986) Am. J. Physiol. 250, E226-E229.
Bogardus, C., Lillioja, S., Ravussin, E., Abbott, W., Zawadzki, J. K., Young, A., Knowler, W. C., Jacobowitz, R. und Moll, P. P. (1986). N. Engl. J. Med. 315, 96-100.
Boss, O., Giacobino, J. P., und Muzzin, P. (1998) Genomics 47, 425-426.
Boss, O., Samec, S., Kuhnc, F., Bijlenga, P., Assimacopoulos-Jeannet, F., Seydoux, J.,
Giacobino, J. P., und Muzzin, P. (1998) J. Biol. Chem. 273, 5-8.
Boss, O., Samec, S., Paoloni-Giacobino, A., Rossier, C., Dulloo, A., Seydoux, J., Muzzin, P., und Giacobino, J. P. (1997) FEBS Lett. 408, 39-42.
Bouchard, C., Perussc, L., Chagnon, Y. C., Warden, C., und Ricquier, D. (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 1887-1889.
Bouchard, C., Tremblay, A., Nadeau, A., Despres, J. P., Theriault, G., Boulay, M. R., Lortie, G., Leblanc, C. und Fournier, G. (1989). Metabolism 38, 364-370.
Chomczynski, P., und Sacchi, N. (1987). Anal. Biochem. 162, 156-159.
Enerback, S., Jacobsson, A., Simpson, E. M., Guerra, C., Yamashita, H., Harper, M. E., und Kozak, L. P. (1997) Nature 387, 90-94.
Esterbauer, H., Oberkofler, H., Liu, Y. M., Breban, D., Hell, E., Krempler, F., und Patsch, W. (1998) J. Lipid Res. (im Druck).
Fleury, C., Neverova, M., Collins, S., Raimbault, S., Champigny, O., Levi-Meyruis, C., Bouillaud, F., Seldin, M. F., Surwit, R. S., Ricquier, D. und Warden, C. H. (1997). Nat. Gen. 15, 269-272.
Frohman, M. A., Dush, M. K., und Martin, G. R. (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002.
Gimeno, R. E., Dembski, M., Wenig, X., Deng, N., Shyjan, A. W., Gimeno, C. J., Iris, F., Ellis, S. J., Woolf, E. A., und Tartaglia, L. A. (1997) Diabetes 46, 900-906.
Gong, D. W., He, Y., Karas, M., und Reitman, M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 24129-24132.
Griffiths, M., Payne, P. R., Stunkard, A. J., Rivers, J. P. und Cox, M. (1990). Lancet 336, 76-78.
Hashimoto, L., Habita, C., Beressi, J. P., Delepine M., Besse, C., Cambon-Thomsen, A., Deschamps, I., Rotter, J. I., Djoulah, S., James, M. R., und et al. (1994) Nature 371, 161-164.
Himms-Hagen, J. (1989). Prog. Lipid Res. 28, 67-115.
Jezek, P., Orosz, D. E., Modriansky, M., und Garlid, K. D. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26184-26190.
Klaus, S., Casteilla, L., Bouillaud, F. und Ricquier, D. (1991). Int. J. Biochem. 23, 791-801.
Kopecky, J., Clarke; G., Enerback, S., Spiegelman, B., und Kozak, L. P. (1995) J. Clin. Invest. 96, 2914-2923.
Krief, S., Lonnquist, F., Raimbault, S., Baude, B., Van Spronsen, A., Arner, P., Strosberg, A. D., Ricquier, D., und Emorine, L. J. (1993) J. Clin. Invest. 91, 344-349.
Larkin, S., Mull, E., Miao, W., Pittner, R., Albrandt, K., Moore, C., Young, A., Denaro, M., und Beaumont, K. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 222-227.
Leshkowitz, D., Aronheim, A., und Walker, M. D. (1992). DNA Cell Biol 11, 549-558.
Lin-Goerke, JL, Robbins, DJ, und Burczak, JD (1997). Biotechniques 23, 409-412.
Locker, J., und Buzard, G. (1990). DNA Seq 1(1), 3-11.
Lowell, B. B., S-Susulic, V., Hamann, A., Lawitts, J. A., Himms-Hagen, J., Boyer, B. B., Kozak, L. P., und Flier, J. S. (1993) Nature 366, 740-742.
Manson, J. E., Willett, W. C., Stampfer, M. J., Colditz, G. A., Hunter, D. J., Hankinson, S. E., Hennekens, C. H. und Speizer, F. E. (1995). N. Engl. J. Med. 333, 677-685.
McGinnis, J. M. and Foege, W. H. (1993). JAMA 270, 2207-2212.
Millet, L., Vidal, H., Andreclli, F., Larrouy, D., Riou, J. P., Ricquier, D., Laville, M., und Langin, D. (1997) J. Clin. Invest. 100, 2665-2670.
Oberkofler, H., Dallinger, G., Liu, Y. M., Hell, E., Krempler, F., und Patsch, W. (1997) J. Lipid Res. 38, 2125-2133.
Oberkofler, H., Liu, Y. M., Esterbauer, H., Hell, E., Krempler, F., und Patsch, W. (1998) Diabetologia (im Druck).
Park, C. W., und Walker, M. D. (1992). J. Biol. Chem. 267, 15642-15649.
Ravussin, E., Lillioja, S., Knowler, W. C., Christin, L., Freymond, D., Abbott, W. G., Boyce, V., Howard, B. V. und Bogardus, C. (1988). N. Engl. J. Med. 318, 467-472.
Ricquier, D., Casteilla, L., und Bouillaud, F. (1991) FASEB J. 5, 2237-2242.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.
Schoonjans, K., Staels, B., und Auwerx, J. (1996). J. Lipid Res. 37, 907-925.
Solanes; G., Vidal-Puig, A., Grujic, D., Flier, J. S., und Lowell, B. B. (1997) J. Biol. Chem. 272, 25433-25436.
Thurlby, P. L. and Ellis, R. D. (1986) Can J. Physiol. Pharmacol. 64, 1111-1114.
Vidal-Puig, A., Solanes, G., Grujic, D., Flier, J. S., und Lowell, B. B. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 235, 79-82.
Warden, C. H., Fisler, J. S., Shoemaker, S. M., Wen, P. Z., Svenson, K. L., Pace, M. J., und Lusis, A. J. (1995) J. Clin. Invest. 95, 1545-1552.
Zhou, Y. T., Shimabukuro, M., Koyama, K., Lee, Y., Wang, M. Y., Trieu, F., Newgard, C B., und Unger, R. H. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6386-6390.Aronheim, A., Ohlsson, H., Park, CW, Edlund, T., and Walker, MD (1991). Nucleic Acids Res 19, 3893-3899. Astrup, A., Bulow, J., Christensen, NJ, Madsen, J., and Quaade, F. (1986) Am. J. Physiol. 250, E226-E229.
Bogardus, C., Lillioja, S., Ravussin, E., Abbott, W., Zawadzki, JK, Young, A., Knowler, WC, Jacobowitz, R. and Moll, PP (1986). N. Engl. J. Med. 315, 96-100.
Boss, O., Giacobino, JP, and Muzzin, P. (1998) Genomics 47, 425-426.
Boss, O., Samec, S., Kuhnc, F., Bijlenga, P., Assimacopoulos-Jeannet, F., Seydoux, J.,
Giacobino, JP, and Muzzin, P. (1998) J. Biol. Chem. 273, 5-8.
Boss, O., Samec, S., Paoloni-Giacobino, A., Rossier, C., Dulloo, A., Seydoux, J., Muzzin, P., and Giacobino, JP (1997) FEBS Lett. 408, 39-42.
Bouchard, C., Perussc, L., Chagnon, YC, Warden, C., and Ricquier, D. (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 1887-1889.
Bouchard, C., Tremblay, A., Nadeau, A., Despres, JP, Theriault, G., Boulay, MR, Lortie, G., Leblanc, C. and Fournier, G. (1989). Metabolism 38, 364-370.
Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987). Anal. Biochem. 162, 156-159.
Enerback, S., Jacobsson, A., Simpson, EM, Guerra, C., Yamashita, H., Harper, ME, and Kozak, LP (1997) Nature 387, 90-94.
Esterbauer, H., Oberkofler, H., Liu, YM, Breban, D., Hell, E., Krempler, F., and Patsch, W. (1998) J. Lipid Res. (In press).
Fleury, C., Neverova, M., Collins, S., Raimbault, S., Champigny, O., Levi-Meyruis, C., Bouillaud, F., Seldin, MF, Surwit, RS, Ricquier, D. and Warden, CH (1997). Nat. Gene. 15, 269-272.
Frohman, MA, Dush, MK, and Martin, GR (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002.
Gimeno, RE, Dembski, M., Wenig, X., Deng, N., Shyjan, AW, Gimeno, CJ, Iris, F., Ellis, SJ, Woolf, EA, and Tartaglia, LA (1997) Diabetes 46, 900-906.
Gong, DW, He, Y., Karas, M., and Reitman, M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 24129-24132.
Griffiths, M., Payne, PR, Stunkard, AJ, Rivers, JP and Cox, M. (1990). Lancet 336, 76-78.
Hashimoto, L., Habita, C., Beressi, JP, Delepine M., Besse, C., Cambon-Thomsen, A., Deschamps, I., Rotter, JI, Djoulah, S., James, MR, and et al. (1994) Nature 371, 161-164.
Himms-Hagen, J. (1989). Prog. Lipid Res. 28, 67-115.
Jezek, P., Orosz, DE, Modriansky, M., and Garlid, KD (1994) J. Biol. Chem. 269, 26184-26190.
Klaus, S., Casteilla, L., Bouillaud, F. and Ricquier, D. (1991). Int. J. Biochem. 23, 791-801.
Kopecky, J., Clarke; G., Enerback, S., Spiegelman, B., and Kozak, LP (1995) J. Clin. Invest. 96, 2914-2923.
Krief, S., Lonnquist, F., Raimbault, S., Baude, B., Van Spronsen, A., Arner, P., Strosberg, AD, Ricquier, D., and Emorine, LJ (1993) J. Clin . Invest. 91, 344-349.
Larkin, S., Mull, E., Miao, W., Pittner, R., Albrandt, K., Moore, C., Young, A., Denaro, M., and Beaumont, K. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 222-227.
Leshkowitz, D., Aronheim, A., and Walker, MD (1992). DNA Cell Biol 11, 549-558.
Lin-Goerke, JL, Robbins, DJ, and Burczak, JD (1997). Biotechniques 23, 409-412.
Locker, J., and Buzard, G. (1990). DNA Seq 1 (1), 3-11.
Lowell, BB, S-Susulic, V., Hamann, A., Lawitts, JA, Himms-Hagen, J., Boyer, BB, Kozak, LP, and Flier, JS (1993) Nature 366, 740-742.
Manson, JE, Willett, WC, Stampfer, MJ, Colditz, GA, Hunter, DJ, Hankinson, SE, Hennekens, CH and Speizer, FE (1995). N. Engl. J. Med. 333, 677-685.
McGinnis, JM and Foege, WH (1993). JAMA 270, 2207-2212.
Millet, L., Vidal, H., Andreclli, F., Larrouy, D., Riou, JP, Ricquier, D., Laville, M., and Langin, D. (1997) J. Clin. Invest. 100, 2665-2670.
Oberkofler, H., Dallinger, G., Liu, YM, Hell, E., Krempler, F., and Patsch, W. (1997) J. Lipid Res. 38, 2125-2133.
Oberkofler, H., Liu, YM, Esterbauer, H., Hell, E., Krempler, F., and Patsch, W. (1998) Diabetologia (in press).
Park, CW, and Walker, MD (1992). J. Biol. Chem. 267, 15642-15649.
Ravussin, E., Lillioja, S., Knowler, WC, Christin, L., Freymond, D., Abbott, WG, Boyce, V., Howard, BV and Bogardus, C. (1988). N. Engl. J. Med. 318, 467-472.
Ricquier, D., Casteilla, L., and Bouillaud, F. (1991) FASEB J. 5, 2237-2242.
Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.
Schoonjans, K., Staels, B., and Auwerx, J. (1996). J. Lipid Res. 37, 907-925.
Solanes; G., Vidal-Puig, A., Grujic, D., Flier, JS, and Lowell, BB (1997) J. Biol. Chem. 272, 25433-25436.
Thurlby, PL and Ellis, RD (1986) Can J. Physiol. Pharmacol. 64, 1111-1114.
Vidal-Puig, A., Solanes, G., Grujic, D., Flier, JS, and Lowell, BB (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 235, 79-82.
Warden, CH, Fisler, JS, Shoemaker, SM, Wen, PZ, Svenson, KL, Pace, MJ, and Lusis, AJ (1995) J. Clin. Invest. 95, 1545-1552.
Zhou, YT, Shimabukuro, M., Koyama, K., Lee, Y., Wang, MY, Trieu, F., Newgard, C B., and Unger, RH (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6386-6390.

Claims

1. Recombinant DNA molecule that contains the DNA sequence of UCP-3 active in fat cells Promoter contains but no functional sequence of UCP-3 active in muscle cells Promoters.

2. Recombinant DNA molecule according to claim 1, which has the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC contains, but not the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC.

3. Recombinant DNA molecule according to claim 1, which has the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 contains CACCTC and by point mutations derivatives of the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC, whereby the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 function in lose transcription.

4. Recombinant DNA molecule according to claim 1, which has the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC contains and deletions Derivatives of the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC, whereby the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 function in the Lose transcription.

5. Recombinant DNA molecule according to claim 1, which has the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC contains and by combinations of Point mutations and deletions of derivatives of the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC, whereby the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 lose their function in transcription.

6. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 5, characterized characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 30 to 50 base pairs, preferably 40 to 45 base pairs, very particularly preferably 42 Base pairs lie.

7. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 6, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 an additional RXR / PPAR Element is arranged.

8. Recombinant DNA molecule according to claim 7, characterized in that the RXR / PPAR element comprises the sequence SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT.

9. Recombinant DNA molecule according to claim 8, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 65 to 75 base pairs lie.

10. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 9, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 an additional aluminum sequence is arranged.

11. Recombinant DNA molecule according to claim 10, characterized in that between the sequence SEQ ID NO: 1 and the Alu sequence 255 to 265 base pairs lie.

12. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 11, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 an additional E2A element is arranged.

13. Recombinant DNA molecule according to claim 12, characterized in that the E2A element comprises the sequence SEQ ID NO: 6 CAGATG.

14. Recombinant DNA molecule according to claim 13, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6 440 to 450 base pairs lie.

15. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 14, characterized characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 1 is also an E-Box.

16. Recombinant DNA molecule according to claim 15, characterized in that the E- Box comprises the sequence SEQ ID NO: 7 CACTTG.

17. Recombinant DNA molecule according to claim 16, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 7 450 to 460 base pairs lie.

18. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 17, characterized characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 1 is also an E-Box.

19. Recombinant DNA molecule according to claim 18, characterized in that the E- Box includes the sequence SEQ ID NO: 8 CATTTG.

20. Recombinant DNA molecule according to claim 19, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 8 460 to 470 base pairs lie.

21. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 20, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 an additional octamer sequence is.

22. Recombinant DNA molecule according to claim 21, characterized in that the Octamer sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT.

23. Recombinant DNA molecule according to claim 22, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 9 515 to 525 base pairs lie.

24. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 23, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 there is also a CAAT box.

25. Recombinant DNA molecule according to claim 24, characterized in that the CAAT box comprises the sequence SEQ ID NO: 10 CCAAT.

26. Recombinant DNA molecule according to claim 25, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 10 560 to 570 base pairs lie.

27. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 26, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 there is also a CAAT box.

28. Recombinant DNA molecule according to claim 27, characterized in that the CAAT box comprises the sequence SEQ ID NO: 11 ATTGG.

29. Recombinant DNA molecule according to claim 28, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 11 670 to 680 base pairs lie.

30. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 29, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 there is also a CAAT box.

31. Recombinant DNA molecule according to claim 30, characterized in that the CAAT box comprises the sequence SEQ ID NO: 12 ATTGG.

32. Recombinant DNA molecule according to claim 31, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 12 730 to 740 base pairs lie.

33. Recombinant DNA molecule according to one of claims 2 to 32, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 1 an additional binding site for an upstream binding stimulation factor.

34. Recombinant DNA molecule according to claim 33, characterized in that the Binding site for an upstream binding stimulation factor, the sequence SEQ ID NO: 13 CCACGTGC.

35. Recombinant DNA molecule according to claim 34, characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 13 845 to 855 base pairs lie.

36. Recombinant DNA molecule that contains the DNA sequence of UCP-3 active in muscle cells Promoters contains but no functional sequence of UCP-3 active in fat cells Promoters.

37. Recombinant DNA molecule according to claim 36, which has the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC contains, but not the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC.

38. Recombinant DNA molecule according to claim 37, which has the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 contains CAATCC and by point mutations derivatives of the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC, whereby the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 function in lose transcription.

39. Recombinant DNA molecule according to claim 37, which has the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 contains CAATCC and deletions Derivatives of the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC, whereby the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 function in the Lose transcription.

40. Recombinant DNA molecule according to claim 37, which has the sequences SEQ ID NO: 3 TATAAGA and SEQ ID NO: 4 CAATCC contains and by combinations of Point mutations and deletions of derivatives of the sequences SEQ ID NO: 1 TATATTAAA and SEQ ID NO: 2 CACCTC, whereby the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 lose their function in transcription.

41. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 40, characterized characterized in that between the sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 45 to 70 base pairs, preferably 52 to 58 base pairs, very particularly preferably 55 Base pairs lie.

42. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 41, characterized characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 3 additionally an RXR / PPAR Element is arranged.

43. Recombinant DNA molecule according to claim 42, characterized in that the RXRI PPAR element comprises the sequence SEQ ID NO: 5 TGACCTTTGGACT.

44. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 43, characterized characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 3 additionally an aluminum sequence is arranged.

45. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 44, characterized characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 3 additionally an E2A element is arranged.

46. Recombinant DNA molecule according to claim 45, characterized in that the E2A element comprises the sequence SEQ ID NO: 6 CAGATG.

47. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 46, characterized characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 3 is also an E-Box.

48. Recombinant DNA molecule according to claim 47, characterized in that the E- Box comprises the sequence SEQ ID NO: 7 CACTTG.

49. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 48, characterized characterized in that an upstream of SEQ ID NO: 3 is also an E-Box.

50. Recombinant DNA molecule according to claim 49, characterized in that the E- Box includes the sequence SEQ ID NO: 8 CATTTG.

51. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 50, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 an additional octamer sequence is.

52. Recombinant DNA molecule according to claim 51, characterized in that the Octamer sequence comprises the sequence SEQ ID NO: 9 ATGAAAATGT.

53. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 52, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 there is also a CAAT box.

54. Recombinant DNA molecule according to claim 53, characterized in that the CAAT box comprises the sequence SEQ ID NO: 10 CCAAT.

55. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 54, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 there is also a CAAT box.

56. Recombinant DNA molecule according to claim 55, characterized in that the CAAT box comprises the sequence SEQ ID NO: 11 ATTGG.

57. Recombinant DNA molecule according to one of claims 37 to 56, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 there is also a CAAT box.

58. Recombinant DNA molecule according to claim 57, characterized in that the CAAT box comprises the sequence SEQ ID NO: 12 ATTGG.

59. Recombinant DNA molecule according to any one of claims 37 to 58, characterized characterized in that upstream of SEQ ID NO: 3 an additional binding site for an upstream binding stimulation factor.

60. Recombinant DNA molecule according to claim 59, characterized in that the Binding site for an upstream binding stimulation factor, the sequence SEQ ID NO: 13 CCACGTGC.

61. Recombinant DNA molecule containing the sequence SEQ ID NO: 14.

62. Recombinant DNA molecule that contains a sequence that is under stringent Conditions hybridized to the sequence SEQ ID NO 14.

63. Recombinant DNA molecule, which is a functional derivative of a DNA molecule according to one of claims 1 to 62, characterized in that it functional derivatives have the property of transcribing a gene convey.

64. Recombinant DNA molecule according to claim 63, characterized in that the functional derivatives were made by deletions.

65. Recombinant DNA molecule according to claim 63, characterized in that the functional derivatives were produced by point mutations.

66. Recombinant DNA molecule according to claim 63, characterized in that the functional derivatives through combinations of point mutations and deletions were manufactured.

67. Recombinant DNA molecule according to one of claims 1 to 66, characterized characterized in that the DNA molecule contains an additional gene that is functional Way is linked.

68. Recombinant DNA molecule according to claim 67, characterized in that it the additional gene is the gene of the decoupling protein 3.

69. Recombinant DNA molecule according to claim 67, characterized in that it the additional gene is a reporter gene.

70. Recombinant DNA molecule according to claim 69, characterized in that it the reporter gene is the luciferase gene or the green fluorescent protein contains.

71. Recombinant DNA molecule containing the sequence SEQ ID NO 15.

72. Recombinant DNA molecule containing a sequence that is under stringent Conditions hybridized to the sequence SEQ ID NO 15.

73. A cell comprising a recombinant DNA molecule according to any one of claims 1 to 72 contains.

74. Use of a recombinant DNA molecule according to one of claims 1 to 72 for the transcription of a gene.

75. Use of a recombinant DNA molecule according to one of claims 1 to 72 to find substances that can affect transcription.

76. Use of a cell according to claim 73 for the detection of substances which Can affect transcription.

77. Methods of finding substances that can affect transcription characterized in that a recombinant DNA molecule according to one of the Claims 1 to 72 or a cell according to claim 73 is used.

78. The method according to claim 77, characterized in that it is a cell-free or a is a cell-based process.

79. The method according to claim 78, characterized in that the transcription rate in Presence of a test substance is measured.

80. The method according to claim 79, characterized in that the transcription rate in Presence of a test substance is measured in a cell-free in vitro system that according to at least cell extract, ribonucleotides and a recombinant DNA molecule contains one of claims 1 to 72.

81. The method according to claim 79, characterized in that the amount, activity, Luminance or fluorescence of a reporter protein is measured, which in Presence of a test substance is produced.

82. The method according to claim 81, characterized in that in the presence of a Test substance RNS is transcribed in vitro, then translated in vitro and the amount of reporter protein produced is determined.

83. The method according to claim 81, characterized in that the amount of a Reporter protein is measured, which from a cell according to claim 73 in Presence of a test substance is produced.

84. The method according to any one of claims 81 to 83, characterized in that it is with the reporter protein around the luciferase or the green fluorescent protein acts.

85. Method for finding a modulator of the UCP3 promoter, characterized in that

a) a host cell according to claim 73 is cultivated in the presence of a test substance,
b) the transcription rate of the UCP3 promoter is measured,
c) the transcription rate thus obtained is compared with the transcription rate which was obtained in the absence of the test substance.

86. The method according to any one of claims 77 to 85, characterized in that it is in a high throughput screening (HTS) format is performed.

87. Use of a recombinant DNA molecule according to one of claims 1 to 72 to find factors or substances that bind to the DNA molecule.

88. Use according to claim 87, characterized in that the recombinant DNA Molecule is bound on a support with a mixture of different substances or factors are contacted, is subjected to one or more washing steps and the bound substances or factors are identified.

89. A method for identifying substances or factors that bind to a recombinant DNA molecule according to one of claims 1 to 72, characterized in that:

1. the recombinant DNA molecules are bound to a carrier,
2. are contacted with a mixture of different substances,
3. undergo one or more washing steps,
4. The bound factors are identified.