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WO1990010006A2 - NEUE β-METHOXYACRYLATE, IHRE HERSTELLUNG UND VERWENDUNG - Google Patents

NEUE β-METHOXYACRYLATE, IHRE HERSTELLUNG UND VERWENDUNG Download PDF

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WO1990010006A2
WO1990010006A2 PCT/EP1990/000280 EP9000280W WO9010006A2 WO 1990010006 A2 WO1990010006 A2 WO 1990010006A2 EP 9000280 W EP9000280 W EP 9000280W WO 9010006 A2 WO9010006 A2 WO 9010006A2
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WO
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formula
compounds
cells
methoxyacrylates
compound
Prior art date
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Application number
PCT/EP1990/000280
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Lothar Daum
Gerhard Keilhauer
Hubert Sauter
Gunda Bertram
Timm Anke
Wolfgang Weber
Wolfgang Steglich
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication of WO1990010006A3 publication Critical patent/WO1990010006A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to new ⁇ -methoxyacrylates, processes for their preparation and their use in combating
  • R 1 represents hydrogen or an optionally unsaturated hydrocarbon radical having up to 10 carbon atoms, which is represented by fluorine, chlorine, bromine, C 1-6 alkoxy, C 2-6 alkenoxy or C 2-6 alkynoxy or by an optionally fluorine, Chlorine, bromine, iodine, trifluoromethyl, C 1-4 -alkyl or C 1-4 -alkoxy substituted phenyl or phenoxy may be substituted,
  • R 2 and R 3 are the same or different and are hydrogen atoms
  • R 2 and R 3 together represent a C 2-8 alkylene group, have a better effect
  • the compounds of formula I have two centers of chirality in
  • the configuration isomers can expediently also be separated at the stage of intermediates of the formula II (see below). A separation of the configuration isomers is not necessary for the use of the compounds according to the invention.
  • the ⁇ -methoxyacrylate group can be in the E or Z configuration.
  • the compounds of formula I are preferred with
  • R 4 is a C 1-8 alkyl radical, reacted in the presence of a base and the compounds thus obtained - if R 1 is an unsaturated radical - optionally hydrogenated.
  • the reaction of the compounds II with III takes place in the sense of a Wittig-Homer reaction in the presence of a solvent and a base, such as lithium diisopropylamide, phenyllithium, butyllithium, sodium alcoholate, sodium amide, sodium hydride or potassium t-butoxide.
  • a solvent and a base such as lithium diisopropylamide, phenyllithium, butyllithium, sodium alcoholate, sodium amide, sodium hydride or potassium t-butoxide.
  • Suitable solvents for the reaction are benzene, dimethylformamide, tetrahydrofuran, diethyl ether and dimethoxyethane.
  • the reaction is useful in a
  • Sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene, diisopropylmethylamine and diisopropylethylamine are particularly suitable as auxiliary bases for the reaction V ⁇ VI.
  • Preferred solvents are dimethylformamide, tetrahydrofuran, diethyl ether, methanol, ethanol, acetonitrile and acetone.
  • the reaction V ⁇ VI works well at temperatures between 0 and 30 ° C.
  • THP protective group is then split off and the cyclization to the dioxolanes of the formula II then takes place with aldehydes of the formula R 1 -CHO in the presence of acid with removal of the water of reaction formed by distillation.
  • suitable entraining agents are benzene, toluene and chloroform and carbon tetrachloride. The following examples explain the production:
  • reaction mixture was diluted with diethyl ether and washed 1x with semi-saturated NaCl solution to remove the catalyst. After drying over MgSO 4, the ether phase was concentrated in vacuo.
  • reaction mixture was poured into semi-saturated NaCl solution, extracted with ether and dried over MgSO 4 .
  • the two diasteromers were formed in a ratio of about 1: 1.
  • Diastereomer 1 330 mg of colorless crystals
  • Diastereomer 2 308 mg colorless crystals
  • Diastereomer 1 (C 17 H 20 O 5 ) (MW 304):
  • Diastereomer 2 (C 17 H 20 O 5 ) (MW 304): 1 H-NMR (200 MHz, benzene-d 6 ):
  • the mixture was allowed to warm to room temperature and stirred for 24 h.
  • the reaction solution was poured into 15 ml of ether, washed twice with 3 ml of water and once with 3 ml of saturated NaCl solution. After drying over MgSO 4 , the mixture was evaporated.
  • the raw product was with
  • Diastereomer 1 (C 29 H 32 O 7 , MW 492):
  • Diastereomer 1 (C 32 H 36 O 7 , MW 532):
  • Distereomer 2 (C 32 H 36 O 7 , MW 532):
  • the new compounds in particular the compounds of Examples 1 to 16 - show good antiviral, antiproliferative and cytotoxic activity.
  • the following examples explain the effects of the new substances:
  • the oxygen consumption was measured polarographically in an airtight container (3 ml volume, with magnetic stirrer) with an oxygen electrode.
  • the test mushroom was grown from a spore suspension to a mycelium weight of 10-20 mg mycelium wet weight / ml. The measurements were carried out with a mycelium concentration of 25-30 mg mycelium wet weight / ml in 1% glucose solution. After a short constant course of breathing, the compounds (0.3 mg / ml) dissolved in methanol were added to the suspension and the 02 consumption was recorded. The experiment was carried out using strobilurin A as a comparative compound. The results of the percent breathing inhibition are shown in Table 1. Table 1
  • HeLa-S3 cells were on a 96-well titer plate with a cell density of 4 x 105 cells / ml in medium F12 with 10% fetal calf serum
  • the cells were spread out on the surface and the medium was changed.
  • the cells were incubated with the medium containing the test compounds (10, 1, 0.1 or 0.01 ⁇ g per ml medium) for 72 h (37 ° C., 5% CO 2 ). After 72 hours, the normally epithelial-like growing cells were fibroblast-like
  • Morphology From a 45% growth inhibition, the change in morphology is significantly visible through the action of the substances.
  • the experiment was carried out using strobilurin A as a comparative compound.
  • the cell density was measured by determining the total protein content per hole.
  • the values given show the results after three days of incubation with the test substances and are listed in Table 2 as a percentage of the total protein of the untreated control.
  • Antiviral effect in HEp-2 cells on VSV The determination of the antiviral activity of a test compound is based on the measurement of the protection of human HEp-2 cells as indicator cells against the cytopathic effect (CPE) of Vesicular Stomatitis Virus (VSV).
  • CPE cytopathic effect
  • the percentage of protected cells in the cultures treated with the test compounds and subsequently infected with VSV was determined by means of crystal violet staining / the measure of the antiviral activity based on 0 and 100% protection was determined as the sample concentration, which leads to 50% protection.
  • Table 3 lists the test substances with the concentration which 50% protects the HEp-2 cells against the cytopathic effect of VSV.
  • Example 1 In contrast to rHuIFN- ⁇ , the substance of Example 1 also showed an antiproliferative effect under these test conditions compared to cell control. The antiviral and antiproliferative activities The substances of Example 1 ran in parallel and correlated with a morphological change in the cells, ie the cells were elongated compared to the cell control and had neurite-like processes.
  • Example D The substances of Example 1 ran in parallel and correlated with a morphological change in the cells, ie the cells were elongated compared to the cell control and had neurite-like processes.
  • tumor cells of different tissue origin 5637-6: human bladder carcinoma; HT-29: human colon carcinoma; B-16: murine melanoma
  • 1 to 2 ⁇ 103 exponential growth tumor cells were plated in 96-well plates in complete growth medium (RPMI 1640 x 10% fetal calf serum) and incubated overnight under standard culture conditions (37 ° C, 5% carbon dioxide, water vapor-saturated atmosphere). The substance was added the next day, serial titrations of substances 1 B1 and 1 B2 being carried out over a concentration range of 10 -4 to 10 -9 M. After a further incubation of 72 h under standard conditions, the cell number was determined by staining with crystal violet and a subsequent photometric

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Abstract

Es werden β-Methoxyacrylate der Formel (I), worin R?1, R2 und R3¿ die in der Beschreibung angegebenen Bedeutungen besitzen, sowie deren Herstellung beschrieben. Die Verbindungen eignen sich zur Bekämpfung von Krankheiten.

Description

Neue ß-Methoxyacrylate, ihre Herstellung und Verwendung
Beschreibung Die vorliegende Erf indung betrifft neue ß-Methoxyacrylate, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung bei der Bekämpfung von
Krankheiten.
Im Journal of Antibiotics, 32 (1979) 1113 und 36 (1983) 661 sowie in "Cellular Regulation and Malignant Growth", Springer Verlag, Berlin 1985, Seiten 169-176 sind bestimmte ß-Methoxyacrylate, nämlich Strobilurin und Oudemansin und deren Derivate beschrieben. Diese Verbindungen zeichnen sich durch eine starke antifungische und cytostatische Aktivität aus. Die Strobilurine A, B und C sowie die Oudemansine A und B wurden aus den Gattungen Strobilurus, Oudemansiella, Xerula, Cyphellopsis, Hydropus und Mycena isoliert. Alle Verbindungen hemmen die Atmung von Eukaryonten und dadurch das Wachstum von Pilzen und Zellen. Die Strobilurine und
Oudemansine binden reversibel an das bt-Zentrum von Cytochrom b in
Komplex III der mitochondrialen Atmungskette.
Es wurde nun gefunden, daß ß-Methoxyacrylate der Formel I
Figure imgf000003_0001
worin
R1 Wasserstoff oder einen gegebenenfalls ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, der durch Fluor, Chlor, Brom, C1-6-Alkcxy, C2-6-Alkenoxy oder C2-6-Alkinoxy oder durch einen gegebenenfalls durch Fluor, Chlor, Brom, Iod, Trifluormethyl, C1-4-Alkyl oder C1-4-Alkoxy substituierten Phenyl- oder Phenoxyrest substituiert sein kann,
R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome,
C1-6--Alkylgruppen oder C3-7-Cycloalkylgruppen oder
R2 und R3 zusammen eine C2-8-Alkylengruppe bedeuten, eine bessere Wirkung besitzen Die Verbindungen der Formel I besitzen zwei Chiralitätszentren im
Dioxolanring (bei R1 = H nur eins). Sie können daher in verschiedenen enantiomeren und/oder diastereomeren Konfigurationen auftreten, die sich in üblicher Weise auftrennen und isolieren lassen. Die Auftrennung der Konfigurationsisomeren kann zweckmäßig auch auf der Stufe von Zwischenprodukten der Formel II (s. unten) erfolgen. Für die erfindungsgemäße Anwendung der Verbindungen ist eine Auftrennung der Konfigurationsisomeren nicht erforderlich. Weiterhin kann die ß-Methoxyacrylatgruppe in der E- oder Z-Konfiguration vorliegen . Bevorzugt sind die Verbindungen der Formel I mit
E-Konfiguration.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I werden hergestellt, indem man einen Aldehyd der Formel II
Figure imgf000004_0001
worin R1, R2 und R3 die oben genannten Bedeutungen haben, mit einem
Phosphonester der Formel III
Figure imgf000004_0002
worin R4 einen C1-8-Alkylrest bedeutet, in Gegenwart einer Base umsetzt und die so erhaltenen Verbindungen - falls R1 ein ungesättigter Rest ist - gegebenenfalls hydriert.
Die Umsetzung der Verbindungen II mit III erfolgt im Sinn einer Wittig-Homer-Reaktion in Gegenwart eines Lösungsmittels und einer Base, wie Lithium-diisopropylamid, Phenyllithium, Butyllithium, Natriumalkoholat, Natriumamid, Natriumhydrid oder Kalium-t-butylat. Als Lösungsmittel eignen sich für die Umsetzung Benzol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Diethylether und Dimethoxyethan. Die Reaktion wird zweckmäßig bei einer
Temperatur von 0 - 25°C durchgeführt.
Eine sich gegebenenfalls anschließende Hydrierung erfolgt in üblicher Weise katalytisch. Die Herstellung von Verbindungen der Formel III ist in EP 20 360
beschrieben. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Zwischenprodukte der Formel II erfolgt nach folgendem Syntheseschema:
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000005_0004
Hierzu wird zunächst ein bekanntes Keton der Formel IV, worin X = Br oder Cl ist, Liebigs Anm. Chem. 724 (1969) 128, in üblicher Weise unter
Säurekatalyse bei 0 - 30°C zum geschützten Tetrahydropyranyl (2)-Derivat V und dieses mit 3,4-Dihydroxybenzaldehyd in Gegenwart von 0,2 - 1,2
Äquivalenten einer Hilfsbase und vorzugsweise eines protischen oder dipolaren, aprotischen Lösungsmittels zu VI umgesetzt.
Als Hilfsbase für die Umsetzung V→ VI eignen sich insbesondere Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en, Diisopropylmethylamin und Diisopropylethylamin. Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Diethylether, Methanol, Ethanol, Acetonitril und Aceton in Betracht. Die Umsetzung V → VI gelingt gut bei Temperaturen zwischen 0 und 30°C.
Die Abspaltung der THP-Schutzgruppe und die Cyclisierung zu den Dioxolanen der Formel II erfolgt dann mit Aldehyden der Formel R1-CHO in Gegenwart von Säure unter destillativer Entfernung des entstehenden Reaktionswassers. Als Schleppmittel eignen sich bespielsweise Benzol, Toluol sowie Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff. Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung:
Beispiel 1 A. Herstellung des Ausgangsmaterials: a) Herstellung des Chlorketons der Formel V (R2, R3 = CH3, x = Cl)
683 mg (5 mmol) 1-Chlor-3-hydroxy-3-methyl-butanon-(2) IV (R2,
R3 = CH3) wurden in 20 ml absoluten Dichlormethan gelöst und nach
Zugabe von 630 mg (7 mmol) 3,4-Dihydro-2H-pyran und 125 mg (0,7 mmol) Pyridinium-tosylat bei Raumtemperatur gerührt.
Nach 3 h wurde das Reaktionsgemisch mit Diethylether verdünnt und 1x mit halbgesättigter NaCl-Lösung gewaschen, um den Katalysator zu entfernen. Die Etherphase wurde nach dem Trocknen über MgSO4 im Vakuum eingeengt.
Man erhielt 980 mg (4,5 mmol) eines farblosen Öls.
Ausbeute: 90 %
C10H17ClO3 (MG 220)
IR:
2990, 2950, 2860, 1730 (cm-1)
1H-NMR (90 MHz, CDCl3):
1,30-1,96 (12) m; 3,20-3,50 (1) m; 3,73-4,07 (1) m;
4,47-4,73 (3) m (δ ppm) b) Herstellung der Verbindung der Formel VI
440 mg (2 mmol) Chlorketon V (R2, R3 = CH3) und 276 mg (2 mmol) 3,4-Dihydroxybenzaldehyd wurden in 10 ml absolutem Aceton gelöst und nach Zugabe von 13 mg (1 mmol) K2CO3 über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde abgezogen, der Rückstand mit Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die vereinigten Etherphasen wurden mit gesättigter Na2CO3-Lösung und Wasser gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Es wurde im Vakuum eingeengt und das Rohproduktgemisch mit Petrolether/Ethylacetat (3:1) als Laufmittel an Kieselgel chromatographiert.
Man erhielt 402 mg (62 %) der Verbindung der Formel VI (R2, R3 = CH3) in Form eines farblosen, zähen Öls, das bei 0 - 5°C kristallisierte, Fp. 86 - 90°C. 1H-NMR (200 MHZ, CDCI3):
9,81 (1)s; 7,50-7,35 (2) m; 7,10-6,90 (1) m; 5,85-5,70 (1) m;
5,05-4,95 (1) m; 4,40-4,20 (1) m; 4,10-3,90 (1) m; 3,60-3,45 (1) m; 1,95-1,30 (12) m (δ ppm)
IR (CHCI3):
3500, 3250, 2995, 2940, 2840, 2710, 1680, 1600, 1580, 1500 cm-1 Herstellung der diastereomeren Verbindungen der Formel II
(R1 = 2,2-Dimethylvinyl, R2, R3 = CH3)
1,15 g (3,6 mmol) der Verbindung der Formel VI (R2, R3 = CH3) und 90 mg (0,45 mmol) Pyridiniumtosylat wurden in 50 ml Benzol gelöst und nach Zugabe von 0,5 ml (5 mmol) 3-Methylcrotonaldehyd 15 h unter Ar-Atmosphäre am Wasserabscheider zum Rückfluß erhitzt. Zur
Aufarbeitung wurde das Reaktionsgemisch in halbgesättigter NaCl-Lösung gegeben, mit Ether extrahiert und über MgSO4 getrocknet.
Die beiden Diasteromere entstanden laut NMR-Kontrolle des Rohproduktes etwa im Verhältnis 1:1.
Das Rohprodukt wurde mit Hexan/Ethylacetat (10:1) als Laufmittel an Kieselgel chromatographiert, wobei sich die beiden Diastereomeren trennten.
Ausbeute:
Diastereomer 1: 330 mg farblose Kristalle
Diastereomer 2: 308 mg farblose Kristalle Diastereomer 1 (C17H20O5) (MG 304):
1H-NMR (200 MHz, Benzol-d6):
9,60 (1)s; 7,51 (1) d, J = 2 Hz; 7,10 (1) dd, J1 = 2 Hz, J2 = 8 Hz; 6,81 (1) d, J = 8 Hz; 6,12 (1) d, J = 7 Hz; 5,35 (1) d/Septett, J1 = 7 Hz, 32 = 1 Hz; 3,98 (1), J = 11 Hz; 3,40 (1), J = 11 HZ; 1,43 (3) d, J = 1 HZ; 1,32 (3) d, J = 1 Hz; 1,31 (3) S; 0,94 (3) S (δ ppm)
IR (KBr):
3040, 2980, 2940, 2910, 2830, 2800, 2730, 1680, 1580, 1500 cm-1
Diastereomer 2 (C17H20O5) (MG 304): 1H-NMR (200 MHZ, Benzol-d6):
9, 56 (1) s; 7,49 (1) d, J = 2 Hz, 7,09 (1) dd, J1 = 2 Hz, J2 = 8 Hz;
6,79 (1) d, 3 = 8 Hz; 5,92 (1) d, 3 = 7 Hz; 5,53 (1) d/septett, J1 = 7
Hz, J2 = 1 Hz; 3,86 (1) d, J = 11 Hz; 3,48 (1) d, 3 = 11 Hz; 1,41 (3) d, J = 1 Hz; 1,38 (3) d, J = 1 Hz; 1,26 (3) s; 0,83 (3) s ( ppm)
IR (KBr):
3060, 2990, 2940, 2840, 2740, 1680, 1600, 1580, 1500 cm-1
B. Herstellung des diastereomeren Endprodukts (Formel I,
R1 = 2,2-Dimethylvinyl, R2, R3 = CH3) a) 60 mg (2 mmol) NaH wurden unter Schutzgasatmosphäre (Ar) in 1 ml
absoluten Tetrahydrofuran suspendiert.
Dann wurde bei 0°C eine Lösung von 608 mg (2 mmol) Diastereomer 1 der Verbindung der Formel II (R = 2,2-Dimethylvinyl, R2, R3 = CH3) [vgl. 1 Ac] und 6,28 g (2 mmol) des Phosphonsäureesters der Formel III
(R4 = -CH3) in 5 ml absolutem Tetrahydrofuran zugetropft.
Man ließ auf Raumtemperatur erwärmen und rührte 24 h. Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in 15 ml Ether gegeben, 2x mit 3 ml Wasser und 1x mit 3 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Trocknen über MgSO4 wurde einrotiert. Das Rohprodukt wurde mit
Hexan/Ethylacetat (5:1) als Laufmittel an einer Kieselgelsäule chromatographiert.
Man erhielt 540 mg (55 %) eines weißen, erstarrten Öls, das nur das Diastereomer 1 enthielt.
Diastereomer 1 (C29H32O7, MG 492):
1H-NMR (200 MHZ, Benzol-d6):
7,65-7,25 (6) m; 7,05-6,90 (4) m; 6,18 (1) d, J = 7,5 Hz; 5,39 (1) d/Septett, J1 = 7,5 Hz, J2 = 1 Hz; 4,05 (1) d, 3 = 11 Hz; 3,59 (1) d, J = 11 Hz; 3,40 (3) s; 2,80 (3) s; 1,46 (3) d, 3 = 1 Hz; 1,36 (3) s; 1,35 (3) d, J = 1 Hz; 1,01 (3) s (δ ppm) IR (KBr):
3060, 3020, 2980, 2940, 1710, 1630, 1585, 1510, 1435 cm-1 b) in entsprechender Weise wurde aus dem Diastereomer 2 der Verbindung der Formel II (R = 2,2-Dimethylvinyl, R2, R3 = CH3) das Diastereomer 2 (C29H32O7, MG 492) hergestellt.
1H-NMR (200 MHZ, Benzol-d6):
7,60-7,20 (6) m; 7,00-6,88 (4) m; 5,97 (1) d, J = 7,5 Hz; 5,61 (1) d/Septett, J1 = 7,5 Hz, J2 = 1 Hz; 3,94 (1) d, J = 11 Hz; 3,67 (1) d, J = 11 Hz; 3,40 (3) s; 2,81 (3) s; 1,45 (3) d, J = 1 Hz, 1,42 (3) d, J = 1 Hz; 1,32 (3) s; 0,92 (3) s (δ ppm)
IR (KBr):
3060, 3020, 2980, 2940, 2840, 1710, 1630, 1585, 1510, 1435 cm-1
Beispiel 2
Analog Beispiel 1 erhielt man aus den Diasteromeren der Formel II
(R1 = 2,2-Dimethylvinyl,
Figure imgf000009_0001
die entsprechenden Diastereomeren der Formel I :
Diastereomer 1 (C32H36O7, MG 532) :
1H-NMR ( 200 MHZ, Benzol-d6 ) :
7,64-7,31 (6) m; 7,15-6,94 (5) m; 6,18 (1) d, J = 7,5 Hz; 5,39 (1) d/Septett, J 1 = 7,5 Hz, J2 = 1 Hz; 4,06 (1) d, J = 11 Hz; 3,68 (1) d, J =
11 Hz; 3,40 (3) s; 2,80 (3) s; 2,39-2,25 (1) m, 1,90-1,45 (5) m; 1,44 (3) d, J = 1 Hz; 1,33 (3) d, 3 = 1 Hz; 1,27-0,85 (4) m.
IR (KBr):
3060, 3020, 2930, 2860, 1700, 1630, 1580, 1505, 1450 1430 cm-1. Distereomer 2 (C32H36O7, MG 532):
1H-NMR (200 MHZ, Benzol-d6):
7,62-7,28 (4) m; 7,20-6,92 (6) m; 5,94 (1) d, J = 7,5 Hz; 5,63 (1) d/Septett, J1 = 7,5 Hz, J2 = 1 Hz; 3,98 (1) d, J = 11 Hz; 3,77 (1) d, J = 11 Hz; 3,40 (3) s; 2,81 (3) s; 2,38-2,22 (1) m, 1,85-1,50 (5) m;
1,45 (3) d, J = 1 Hz; 1,42 (3) d, J = 1 Hz; 1,37-0,80 (4) m.
IR (KBr):
3060, 3020, 2930, 2860, 1700, 1630, 1580, 1505, 1450, 1430 cm-1. Beispiel 3
Analog Beispiel 1 B.a) erhielt man die Verbindung der Formel I
(R1 = 2,6-Dimethyl-1,5-heptadienyl (1), R2, R3 = CH3, C34H40O7, MG 560),
1H-NMR (200 H2, Benzol-d6):
7,65-6,90 (10) m; 6,22 (1) d, 3 = 7,5 Hz; 5,48 (1) d/Septett,
J1 = 7,5 Hz, J2 = 1 Hz; 5,15-5,02 (1) m, 4,04 (1) d, 3 = 11 Hz;
3,59 (1) d, J = 11 Hz; 3,45 (3) s; 2,81 (3) s; 2,08-1,85 (4) m;
1,61 (3) d, 3 = 11 Hz; 1,47 (3) s; 1,43 (3) d, 3 = 1 Hz;
1,36 (3) s; 1,02 (3) s.
IR (CHCI3):
3020, 2980, 2940, 2850, 1700, 1625, 1585, 1505, 1430 cm-1.
Beispiele 4 - 16
Analog Beispiel 1Ac lassen sich folgende Zwischenprodukte der Formel II herstellen (R2, R3 = CH3):
Rl = H,
Methyl,
n-Butyl,
Methoxymethyl,
Trifluormethyl,
Trichlormethyl,
2,2-Dimethylpropyl,
3,3-Dimethylbutenyl(1),
1,3-Pentadieny1(1),
2,6-Dimethyl-5-heptenyl(1),
2-Methylpropyl,
2-Phenyl-vinyl,
Phenoxymethyl. Analog Beispiel 1B können daraus folgende Wirkstoffe der Formel I hergestellt werden (R2, R3 = CH3):
Beispiel R1
4 H,
5 Methyl,
6 n-Butyl,
7 E-Methoxymethyl,
8 Trifluormethyl,
9 Trichlormethyl,
10 2,2-Dimethylpropyl,
11 3,3-Dimethylbutenyl(1),
12 1,3-Pentadienyl(1),
13 2,6-Dimethyl-5-heptenyl(1),
14 2-Methylpropyl,
15 2-Phenyl-vinyl,
16 Phenoxymethyl.
Die neuen Verbindungen - insbesondere die Verbindungen der Beispiele 1 bis 16 - zeigen eine gute antivirale, antiproliferative und zytotoxische Aktivität. Folgende Beispiele erläutern die Wirkung der neuen Substanzen:
Beispiel A
Atmungshemmende Wirkung bei Penicillium notatum
Der Sauerstoffverbrauch wurde in einem luftdicht abgeschlossenen Gefäß (3 ml Volumen, mit Magnetrührer) mit einer Sauerstoffelektrode polarographisch gemessen. Der Testpilz wurde aus einer Sporensuspension auf ein Mycelgewicht von 10 - 20 mg Mycelfeuchtgewicht/ml angezogen. Die Messungen wurden mit einer Mycelkonzentration von 25 - 30 mg Mycelfeuchtgewicht/ml in 1 %iger Glucoselösung durchgeführt. Nach kurzem konstanten Atmungsverlauf wurden die in Methanol gelösten Verbindungen (0,3 mg/ml) der Suspension zugegeben und der 02-Verbrauch aufgezeichnet. Der Versuch wurde unter Verwendung von Strobilurin A als Vergleichsverbindung durchgeführt. Die Ergebnisse der prozentualen Hemmung der Atmung sind in Tabelle 1 genannt. Tabelle 1
Verbindung Atmungshemmung in % der Kontrolle Beispiel 1 B1 95
Beispiel 1 B2 95
Strobilurin A 93
Beispiel B
Cytostatische und morphologische Wirkung auf HeLa-S3-Zellen
Bei Inkubation von HeLa-S3 und anderen Zellen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen wurde innerhalb kurzer Zeit die Zellteilung gehemmt.
Zusätzlich veränderte sich die Morphologie der Zellen.
HeLa-S3-Zellen wurden auf einer 96-Lochtiterplatte mit einer Zelldichte von 4 x 105 Zellen/ml in Medium F12 mit 10 % fötalem Kälberserum
aufgebracht. Nach 24 h waren die Zellen auf der Oberfläche ausgebreitet, und es erfolgte ein Wechsel des Mediums. Die Zellen wurden mit dem die Testverbindungen enthaltenden Medium (10, 1, 0,1 bzw. 0,01 μg pro ml Medium) 72 h inkubiert (37°C, 5 % CO2). Nach 72 h besaßen die normalerweise epithelartigen wachsenden Zellen eine fibroblastenartige
Morphologie. Die Morphologieänderung ist ab einer 45 %igen Wachstumshemmung durch die Einwirkung der Substanzen signifikant sichtbar.
Der Versuch wurde unter Verwendung von Strobilurin A als Vergleichsverbindung durchgeführt. Die Zelldichte wurde über die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes pro Loch gemessen. Die angeführten Werte zeigen die Ergebnisse nach dreitätiger Inkubation mit den Testsubstanzen und sind als Prozentsatz des Gesamtproteins der unbehandelten Kontrolle in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2:
Verbindung Proteingehalt in Prozent der Kontrolle
(μg/ml)
10μg 1μg 0,1μg 0,01μg Beispiel 1 B1 20 21 23 55
Beispiel 1 B2 38 38 50 70
Strobilurin A 23 55 92 100 Beispiel C
Antivirale Wirkung bei HEp-2-Zellen auf VSV Die Bestimmung der antiviralen Aktivität einer Testverbindung basiert auf der Messung des Schutzes von menschlichen HEp-2-Zellen als Indikatorzellen vor dem cytopathischen Effekt (CPE) von Vesicular Stomatitis Virus (VSV).
Hierzu wurden 100 μl Kulturmedium mit 2 x 10* HEp-2-Zellen in die
Vertiefungen einer 96-Loch-Flachbodenplatte gegeben und über Nacht bei 37°C und 5 % (V/V) Kohlendioxid inkubiert. Am nächsten Tag wurden 100 μl der Probelösung zu den konfluenten Zellkulturen gegeben und seriell 2x titriert. Auf der Kulturplatte wurden zusätzlich eine Zellkontrolle
(= unbehandelte, nicht mit Virus infizierte Zellen) und eine Virus-kontrolle (= unbehandelte, mit Virus infizierte Zellen) mitangelegt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 24 h bei 37°C und 5 % (V/V) CO2 wurden die Kulturen mit 50 μl einer VSV-Suspension in Kulturmedium infiziert und bei 37°C und 5 % (V/V) CO2 inkubiert. Nach zwei Tagen war die virusbedingte Zellzerstörung (CPE) in den ungeschützten Kulturen (= Virus-kontrolle) abgelaufen. Der Prozentsatz geschützter Zellen in den mit den Testverbindungen behandelten und anschließend mit VSV infizierten Kulturen wurde mittels Kristallviolettfärbung bestimmt/ Als Maß für die antivirale Aktivität wurde bezogen auf 0 und 100 % Schutz die Probenkonzentration, die zu 50 % Schutz führt, ermittelt. Als Kontrolle für die antivirale Aktivität einer Verbindung wurde rekombinantes humanes
Interferon-ɤ (rHuIFN-ɤ) mituntersucht.
In Tabelle 3 sind die Testsubstanzen mit der Konzentration, die die HEp-2-Zellen zu 50 % vor dem zytopathischen Effekt von VSV schützt, aufgeführt.
Tabelle 3:
Verbindung Antivirale Aktivität
(ng/ml)
Beispiel 1 B1 3
Beispiel 1 B2 3
Kontrolle (rHuIFN-ɤ) 0,6
Im Unterschied zu rHuIFN-ɤ zeigte die Substanz des Beispiels 1 unter diesen Testbedingungen im Vergleich zur Zellkontrolle auch eine antiproliferative Wirkung. Die antivirale und antiproliferative Aktivitäten der Substanzen des Beispiels 1 liefen parallel und korrelierten mit einer morphologischen Veränderung der Zellen, d. h. die Zellen waren im Vergleich zur Zellkontrolle langgestreckt und wiesen neuritartige Fortsätze auf. Beispiel D
Zytotoxische und antiproliferative Wirkung auf menschliche Tumorzellen Zur Bestimmung der antitumoralen Eigenschaften der Verbindungen 1 B1 und 1 B2 wurden Tumorzellen unterschiedlicher Gewebeherkunft (5637-6: humanes Blasenkarzinom; HT-29: humanes Kolonkarzinom; B-16: murines Melanom) verwendet. 1 bis 2·103 sich im exponentiellen Wachstum befindliche Tumorzellen wurden in 96-Lochplatten in komplettem Wachstumsmedium (RPMI 1640 x 10 % fötalem Kälberserum) ausplattiert und über Nacht bei Standardkulturbedingungen (37°C, 5 % Kohlendioxid, wasserdampfgesättigte Atmosphäre) inkubiert. Die Substanzzugabe erfolgte am nächsten Tag, wobei serielle Titrationen der Substanzen 1 B1 und 1 B2 über einen Konzentrationsbereich von 10-4 bis 10-9 M angelegt wurden. Nach einer weiteren Inkubation von 72 h unter Standardbedingungen erfolgte die Bestimmung der Zellzahl durch eine Färbung mit Kristallviolett und eine anschließende photometrische
Auswertung bei 540 nm mit Hilfe eines Multiphotometers.
Nur bei der sehr hohen Konzentration von 10-4 M war mikroskopisch eine Zytolyse der behandelten Zellen zu erkennen. Bei den anderen untersuchten Konzentrationen konnte eine starke, dosisabhängige Inhibition der
Zeilproliferation beobachtet werden, so daß auch bei der geringsten untersuchten Konzentration von 10-9 M die Zahl der behandelten Zellen einen Wert kleiner als 50 % der unbehandelten Zellkontrolle zeigten.
Diese starke Abnahme der proliferativen Aktivität der mit den Substanzen des Beispiels 1 behandelten Zellen ging einher mit einer morphologischen Veränderung, gekennzeichnet durch eine Streckung der Zellkörper und durch die Ausbildung von Zeilfortsätzen.

Claims

Patentansprüche
1. ß-Methoxyacrylate der Formel I ,
Figure imgf000015_0001
worin
R1 Wasserstoff oder einen gegebenenfalls ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen darstellt, der durch Fluor, Chlor, Brom, C1-6-Alkoxy, C2-6-Alkenoxy oder C2-6-Alkinoxy oder durch einen gegebenenfalls durch Fluor, Chlor, Brom, Iod, Trifluormethyl, C1-4-Alkyl oder C1-4-Alkoxy substituierten Phenyl- oder Phenoxyrest substituiert sein kann,
R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome,
C1-6-Alkylgruppen oder C3-7-Cycloalkylgruppen oder
R2 und R3 zusammen eine C2-8-Alkylengruppe bedeuten.
2. Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.
3. Verfahren zur Herstellung der ß-Methoxyacrylate der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Aldehyd der
Formel II
Figure imgf000015_0002
worin R1, R2 und R3 die oben genannten Bedeutungen haben, mit einem Phosphonester der Formel III
Figure imgf000015_0003
worin R4 einen C1-8-Alkylrest bedeutet, in Gegenwart einer Base umsetzt und die so erhaltenen Verbindungen - falls R1 ein ungesättigter Rest ist, gegebenenfalls hydriert.
4. Verbindungen der Formel II gemäß Anspruch 3.
5. Verbindung der Formel IV
Figure imgf000016_0001
worin R2 und R3 die obengenannte Bedeutung besitzen.
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