UA71997C2 - Pesticide macrolide, a method for the preparation thereof, strain saccharopolyspora producing macrolide and a mixture based thereon and a method for controlling insecticides and acaricides - Google Patents

Description

не Й ура ди що-н с о во-мкиТо м пар б в) ге рий ве ЛИ нЕоне не їй (аг 37 (48

ОН, но - кора ій я ни (4еї он ту сн, Ну

Я Шина СД іх

Ще --о гол й. с В . . вон (вв) Ще во св, : ле (4) й

Конкретні сполуки формули 1 або 2, які були приготовані і виділені при культивуванні штаму І У/107129

Засспагороїугрога, ідентифіковані у таблиці І.

Таблиця 76 71711171711111717171112с | но | но | бутенл/////// | 4а4- 27871171 2а | он | но | бутенл/////// | 4а 79711 га | нн | но | З-ідрокси-1-бутеніл

З-тідрокси-1-бутеніл 1,3-бутадієніл

З-тідрокси-1-бутеніл

З-тідрокси-1-бутеніл 1,3-бутадієніл

Всі компоненти, перераховані у таблиці І, структурно відрізняються від раніше відомих спінозинів, тому що, стосовно групи Н4, жодні раніше відомі сполуки спінозину не мали 1-бутенільну, З-гідрокси-1-бутенільну, 1,3-бутадієнільну, 1-пропенільну або н-бутильну групу у положенні С-21 макроліду. Крім того, декілька сполук в таблиці І відрізняються від усіх раніше відомих спінозинів, тому що, стосовно групи ВН, ці сполуки мають нові групи, зв'язані з киснем в положенні С-17 макроліду. У відомих спінозинах НК2 завжди представляє Н, отже, зміна в цьому положенні є новою. Крім того, сполука 31 має нову 14-вуглецеву макролідну кільцеву систему, раніше невідому у сполук, описаних у 5. 5ріпоза.

Сполуки за даним винаходом можуть реагувати з утворенням солей. Солі, які є фізіологічно прийнятними, є також придатними у сумішах і способах даного винаходу.

Солі готують, використовуючи стандартні методики для приготування солей. Наприклад, сполуки за даним винаходом можуть бути нейтралізовані підходящою кислотою з утворенням кислої додаткової солі. Кислі додаткові солі є особливо корисними. Типові придатні кислі додаткові солі включають солі, утворені реакцією з органічною або неорганічною кислотою, такою як, наприклад, сірчана, хлористоводнева, фосфорна, оцтова, бурштинова, лимонна, молочна, малеїнова, фумарова, холева, памоєва, слизова, глутамінова, камфорна, глутарова, гліколева, фталева, винна, мурашина, лауринова, стеаринова, саліцилова, метансульфонова, бензолсульфонова, сорбінова, пікринова, бензойна, корична та подібні кислоти.

Ще одним аспектом даного винаходу є процес виробництва сполук формули 1 і 2, який включає культивування бЗасспагороїзузрога штаму 1107129 (МАЕЇ 30141) у підходящому середовищі. Сполуки формули 1 і 2 екстрагують з ферментаційного живильного середовища і з міцелію полярними органічними розчинниками. Ці сполуки далі можуть бути очищені методами, добре відомими у даній галузі техніки, такими як колонкова хроматографія.

Сполуки формули 1 і 2, де Н5 є групою, яка має одну з формул 4а-4і, є корисними для контролю кліщів, іксодових кліщів і комах. Тому інсектицидні та акарицидні суміші і способи для зменшення популяцій комах, кліщів та іксодових кліщів з використанням цих сполук також є частиною даного винаходу.

Сполуки формули 1 і 2, де А5 є воднем (С17-псевдоаглікони) є корисними як проміжні сполуки у виготовленні інсектицидних і акарицидних препаратів. Наприклад, ці сполуки можуть бути глікозильовані біля 6-17 гідроксильної групи. Глікозилювання може бути здійснене шляхом хімічного синтезу або мікробної біоконверсії, з використанням методик, описаних, наприклад, у 5 5539089.

Докладний опис винаходу

Опис культури

Новий штам, що продукує сполуки за даним винаходом, одержав позначення ІМ/107129. Культура

І М/107129 була виділена із зразка грунту, скомпонованого з грунтів, відібраних з численних ділянок. Культуру передали на зберігання, відповідно до умов Будапештської угоди, у Регіональний дослідницький центр

Середнього Заходу, Служба досліджень у сільському господарстві, Департамент сільського господарства

США, 815 Мопйп Опімегейу 5ігеєї, Реогіа, І 61604. Цей штам був депонований З червня 1999р., і одержав депозитний номер МАВ. 30141.

Характеристики культури

Засспагороїузрога штам І М/107129 виробляє надземний міцелій і спори чисто білого кольору на таких середовищах: середовище Беннетта, ІБР і ІЗРБ. Колонії мають колір від вершкового до світлого жовтувато- коричневого, а субстратний міцелій може набувати світло-коричневого кольору, особливо на середовищах

ІЗРА і ІЗРБ5. Штам ІМУ/107129 не спорулює на середовищах ІЗРЗ і ІЗР4. На жодному з випробуваних середовищ не вироблялися пігменти. Міцелій штаму І М/107129 у рідкій культурі піддається фрагментації.

Морфологічні характеристики

Штам І М/107129 продукує яйцевидні спори в ланцюгах до 50 спор. Спори містяться у споровій оболонці, і поверхня спори є ворсистою з рідко розташованими шипами.

Фізіологічні характеристики

Засспагороїууєрога штам ІМ/107129 здатний виробляти кислоту з таких субстратів: О-арабінози, т- еритритолу, О-фруктози, ЮО-глюкози, гліцерину, О-манітолу, О-манози, І -рамнози, Ю-рибози і трегалози. Штам

І М/107129 не може виробляти кислоту з адонітолу, І -арабінози, декстрину, дульцитолу, етанолу, О-галактози, глікогену, інозитолу, лактози, мальтози, мелецитози, мелібіози, рафінози, саліцину, ЮО-сорбітолу, І-сорбози, сахарози, ксилітолу і О-ксилози. Штам І М/107129 здатний засвоювати декілька органічних кислот, включаючи цитрат і сукцинат, але не ацетат, бензоат, бутират, форміат, оксалат або тартрат. Штам Г/М/107129 здатний гідролізувати тирозин і сечовину, але не аденін, казеїн, ескулін, гіпурат, гіпоксантин, крохмаль або ксантин.

ЇМ/107129 нечутливий до таких антибіотиків: карбеніциліну, цефалотину, циклогексіміду, генетицину, лінкоміцину, налідіксової кислоти, новобіоцину, окситетрацикліну, поліміксину В, рифампіну і спектиноміцину, і чутливий до бацитрацину, хлорамфеніколу, еритроміцину, гідромщину В, стрептоміцину, тіострептону, триметоприму і ванкоміцину.

Спосіб одержання метаболітів

Метаболіти формули 1 і 2 одержують шляхом культивування штаму ІМ/107129 у ферментаційному середовищі, як описано нижче. Культуру ІМ/107129 засівають у вегетативне середовище і вирощують протягом 48 годин при З0"С, струшуючи при 250об/хв. Шістдесят мілілітрів цієї зрілої на першій стадії вегетативної культури використовують для засівання вторинної вегетативної культури у 1 літрі вегетативного середовища у флаконі для культивування місткістю 2л. Цю культуру інкубують при 30"С протягом 48 годин, струшуючи при 195об/хв. Зрілу на другій стадії маточну культуру використовують для засівання 70 літрів середовища у ферментаційній цистерні з мішалкою, як описано у прикладі 1.

За виробництвом сполук формули 1 і 2 можна слідкувати у процесі ферментації шляхом дослідження екстрактів рідкого середовища. Кращим методом для слідкування за виробництвом є аналіз екстрактів рідкого середовища за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Придатна для аналізу система описана у прикладі 2.

Приклад 1

Приготування метаболітів у процесі ферментації

Метаболіти формули 1 і 2 одержують шляхом культивування штаму ІМ/107129 у ферментаційному середовищі, як описано нижче. 1мл замороженої вегетативної культури І М/107129 відтавали, засівали у 100мл вегетативного середовища у колбі Ерленмейєра місткістю 5б0О0мл і вирощували при 30"С, струшуючи при 250об/хв. протягом 48 годин. оДекстроза.ї//-/-/-:7777771 111190

Бк ківі ШИ середовище 30,0

Шістдесят мілілітрів цієї зрілої на першій стадії вегетативної культури використовували для засівання вторинної вегетативної культури у 1 літрі вегетативного середовища у флаконі для культивування місткістю 2л. Цю культуру інкубували при 307"С протягом 48 годин, струшуючи при 195об/хв. Зрілу на другій стадії маточну культуру використовували для засівання 70 літрів ферментаційного середовища у ферментаційній цистерні з мішалкою.

Бродіння підтримували при 30"С, 400об/хв. протягом 7-12 днів.

Зрілу ферментаційну брагу можна екстрагувати підходящим розчинником і виділити метаболіти шляхом утворення солі і/або хроматографічного розподілу.

Приклад 2

Метод аналізу ВЕРХ

Наступний метод ВЕРХ є корисним для контролю ферментації при одержанні сполук формули 1 і 2:

Додати об'єм денатурованого етанолу, який дорівнює об'єму аліквоти ферментаційного середовища.

Струснути суміш і дати постояти протягом, щонайменше, однієї години. Центрифугувати пробу для видалення основної маси клітинних уламків, потім мікроцентрифугувати аліквоту об'ємом 1мл. Освітлений екстракт потім аналізують за допомогою такої системи ВЕРХ:

Система ВЕРХ:

Нерухома фаза в колонці: колонка розміром 250х4,бмм, носій - дезактивований силікагель С8 з діаметром частинок 5мкм (Нурегвії-С8-ВО5).

Рухома фаза: 10мМ амонію ацетат-метанол-ацетонітрил, лінійний градієнт наведений нижче: (хвилини) розчинника А розчинника В (0) 100 (0) (0) 100 (0) 100

Зо 100 (0) 100 (9) де розчинник А є 10мМ амонію ацетатом, а розчинник В є сумішшю метанол-ацетонітрил (1:1).

Швидкість потоку рухомої фази: 1мл/хв.

Детектування: УФ при 250нм.

Часи утримання основних сполук наведені нижче: 7 24,6

1 24,2

З 23,7 12 22,9 15 22,8 18 22,6 8 22,5 17 22.2 13 21,6 14 21,4 19 20,2 20 19,3 21(обидва С24-епімери 16,2

Приклад З

Виділення інсектицидно активних метаболітів із культурального середовища Наступний приклад показує, як з типової порції культивованого І М/107129 був виділений найвищий вміст сполук формули І. Цей приклад надає конкретні методики, використані для виділення сполук 1, 3, 7, 8, 12, 13, 14,15, 17, 18, 19,20 і 21. Сполуки 2,4,5,6,9, 10, 11, 16, 22 і 23-31, які вироблялися мікроорганізмами з меншим відносним вмістом, ніж сполуки, перераховані вище, були виділені з використанням дуже схожих методів, застосованих до більших порцій екстракту рідкого середовища. Оскільки ці способи є дуже схожими і добре відомими фахівцям у даній галузі техніки, детально вони тут не описані.

Сукупна культура, тобто клітини плюс рідке живильне середовище, починаючи з ферментації п'яти літрів засіяного середовища, мала загальний об'єм приблизно 3,5 літрів після завершення ферментації. Цю пробу екстрагували рівним об'ємом денатурованого етанолу, енергійно струшуючи і потім даючи постояти при кімнатній температурі протягом 2 годин. Клітинні уламки видаляли центрифугуванням, і 7 літрів 5095 водного етанольного екстракту розподіляли, використовуючи дихлорметан (ДХМ: 2х7 літрів). Дихлорметановий екстракт концентрували з одержанням масла блідо-жовтого кольору (3,3г). Масло розчиняли в метанолі і ділили на дві рівні аліквоти, кожну з яких хроматографували на колонці (4х15см, 32-63мкм; Віогаде, Іпс., США) з силікагелем. З кожної колонки проводили елюювання зі швидкістю 20мл/хв., використовуючи наступні лінійні градієнти розчинників і потім промиваючи кінцевою аліквотою розчинника С (100мл): о Часїхвилилн)ї/// | А | В | с | 0 | є | в | с (0) 100 (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0) 100 (0) (0) (0) (0) (0) (0) 50 50 (0) (0) (0) (0) (0) 50 50 (0) (0) (0) (0) 20,01 (0) (0) (0) 100 (0) (0) (0)

Зо (0) (0) (0) (0) 100 (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0) 100 (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0) 100 70 (9) (9) (9) (9) (9) (9) 100 111117 Г1А ЇЇ в | с | 0 | ЕЕ | в | с гексан 10095 99,59 толуол 10095 БО 99,59 етилацетат БО 99,59 7090 метанол 2090 вода 9,590 діетиламін 0,59 0,59 0,59 0,59

Фракції (30 секунд; їОмл кожна) збирали протягом всього елюювання. Вони були досліджені методом

ВЕРХ відповідно до методики, описаної у прикладі 2, і потім фракції з вертикального перерізу кожної колонки з силікагелем, які містили компоненти, близькі за полярністю, об'єднували, як показано нижче: 92-97 5І-1 104-112 5І-2 114-120 ЗІ-З 121-140 51-4 змиви 5І-5

Ці об'єднані фракції висушували під вакуумом і знову розчиняли в метанолі перед подальшим фракціонуванням, як описано нижче.

Аліквоти фракції 5І-ї-4 вносили у колонку (250х10мм; розмір частинок мкм) з обернено-фазовим силікагелем С-8 (Нурегзі-80О5-С8). Нанесену пробу хроматографували в суміші ацетат амонію (10мМ)- метанол-ацетонітрил (30:35:35), елююючи зі швидкістю Змл/хв., і збираючи фракції об'ємом 0,75мл. Фракції, які містили сполуку 17, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 14,9мг чистої сполуки 17.

Фракції, які містили сполуку 18, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 1,4мг чистої сполуки 18. Фракції, які містили сполуку 12, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 4,2мг чистої сполуки 12.

Аліквоти фракції 5І-- вносили у колонку (250х10мм; розмір частинок мкм) з обернено-фазовим силікагелем С-8 (Нурегзі-8ВО5-С8). Нанесену пробу хроматографували, використовуючи лінійний градієнт ацетату амонію (10мМ)-метанолу-ацетонітрилу, вказаний нижче, елююючи зі швидкістю Змл/хв., і збираючи фракції об'ємом 0,75мл. хвилини розчинника А розчинника В (0) бо 40 бо 40 25 (0) 100

Зо (0) 100 32 бо 40 40 бо 40

А « ацетат амонію (10ММ)

В - суміш метанол-ацетонітрил (1:1)

Фракції, які містили сполуку 20, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 11,5мг чистої сполуки 20. Фракції, які містиш сполуку 19, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 3,9мг чистої сполуки 19. Фракції, які містили сполуку 14, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 2,0мг чистої сполуки 14. Фракції, які містили сполуку 13, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 4,9мг чистої сполуки 13. Фракції, які містили сполуку 15, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 2,3мг чистої сполуки 15. Фракції, які містили два 24-епімерних ізомери сполуки 21, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 15мг суміші двох ізомерів. Цю суміш розчиняли в метанолі і вносили у колонку (250х10мм; розмір частинок 8мкм) з обернено-фазовим силікагелем С-8 (Нурег5іІ-805-С8). Нанесену пробу хроматографували в суміші ацетат амонію (10мМ)-метанол-ацетонітрил (85:7,5:7,5), елююючи зі швидкістю Змл/хв., і збираючи фракції об'ємом Змл. Фракції, які містили сполуку 21

Ме1, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 9,8мг чистої сполуки 21 Мое1. Фракції, які містили сполуку 21 Ме2, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 4,7мг чистої сполуки 21

Мо2.

Об'єднану фракцію 51-3 розчиняли у метанолі і хроматографували на колонці (4х7см; 32-63мкм; Віоїаде,

Іпс., США) з силікагелем. З колонки проводили елюювання зі швидкістю 20мл/хв., використовуючи такі умови для градієнту: хвилини розчинника А розчинника В (0) 100 (0) 5 100 (0) бо 40 25 (0) 100 40 (9) 100

А - суміш гексан-діетиламін (99,5:0,5)

В - суміш гексан-ізопропанол-діетиламін (75:25:2)

Фракції збирали (80х0,5хв.; 10мл), фракції 46-50 об'єднували і концентрували до сухого залишку. Суху пробу розчиняли у метанолі і вносили у колонку (250х10мм; розмір частинок вмкм) з обернено-фазовим силікагелем С-8 (Нурегзі-80О5-С8). Нанесену пробу хроматографували в суміші ацетат амонію (10мМ)- метанол-ацетонітрил (20:40:40), елююючи зі швидкістю Змл/хв., і збираючи фракції об'ємом 0,75мл. Фракції, які містили сполуку 1, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 24,3мг чистої сполуки 1.

Фракції, які містили сполуку 7, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 1,5мг чистої сполуки 7.

Об'єднану фракцію 51-4 розчиняли у метанолі і вносили у колонку (250х10мм; розмір частинок мкм) з обернено-фазовим силікагелем С-8 (Нурегзіі-80О5-С8). Нанесену пробу хроматографували у наступній системі з лінійним градієнтом елюювання, при швидкості потоку 5мл/хв., збираючи 88 фракцій об'ємом 1,25мл: хвилини розчинника А розчинника В (0) 100 (0) (0) 100 (0) 100

Зо 100 (0) 100 (9)

А « ацетат амонію (10ММ)

В - суміш метанол-ацетонітрил (1:1)

Фракції, які містили неочищену сполуку 1, об'єднували і концентрували до сухого залишку, так само, як фракції, які містили неочищену сполуку 8. Кожну з об'єднаних висушених фракцій, зазначених вище, розчиняли у метанолі і знову хроматографували на колонці (250х10мм; розмір частинок Змкм) з обернено-

фазовим силікагелем С-8 (НурегвіІ-8ВО5-С8). Проби елюювали, використовуючи суміш ацетат амонію (10мМ)- метанол-ацетонітрил (20:40:40), зі швидкістю Змл/хв., і збираючи фракції об'ємом 0,75мл. Фракції, які містили сполуку 8, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 5,8мг чистої сполуки 8. Фракції, які містили сполуку 1, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи надалі 7,Змг чистої сполуки 1.

Висушену промивну колонкову фракцію 51І-5 розчиняли у метанолі і вносили у колонку (250х10мм; розмір частинок мкм) з обернено-фазовим силікагелем С-8 (НурегзіІ-80О5-С8). Нанесену пробу хроматографували у суміші ацетат амонію (10мМ)-метанол-ацетонітрил (20:40:40), елююючи зі швидкістю Змл/хв., і збираючи фракції об'ємом 0,75мл. Фракції, які містили сполуку 7, об'єднували і концентрували до сухого залишку, одержуючи 3,5мг чистої сполуки 7.

Спектроскопічні характеристики

Хімічні структури нових компонентів були визначені за допомогою спектроскопічних методів, включаючи спектроскопію ядерного магнітного резонансу (ЯМР), мас-спектрометрію (МС), ультрафіолетову спектроскопію (УФ) і шляхом порівняння зі спінозином А і О та спорідненими аналогами. Наступні абзаци описують спектроскопічні властивості компонентів, описаних вище. У цьому обговоренні наводиться детальний аналіз спектроскопічних властивостей сполуки 1. Далі це супроводжується обговоренням спектроскопічних особливостей для інших споріднених компонентів, даючи можливість фахівцеві в даній галузі техніки зробити висновок про хімічну структуру шляхом порівняння з даними для сполуки 1. З метою зручності для читача, наступна схема сполуки 1 надає позначення положень для всіх спектральних даних ЯМР для природних факторів, представлених нижче:

ХМ ій 9 дво най 7 до ки они о клю о зх 22 о н та вв Н

Сполука 1 має такі характеристики:

Молекулярна маса: 757

Емпірична формула: СазНе7МО о

УФ (детектування за допомогою діодної матриці під час аналізу методом ВЕРХ, розчинник - суміш метанол-ацетонітрил (1:1)): 244нм.

МС з електророзпиленням: т/2 для (МАНІ - 758,5; фрагмент-іон форозамінового цукру при т/2 1421.

Точна Ме з іонізацією електророзпиленням: т/2 для (МАНІ - 758,4845-0,0007 (теоретично: 758,4843).

Таблиця І! підсумовує спектральні дані /Н і ІЗС ЯМР для сполуки 1 у СОСІз.

Таблиця ЇЇ

Дані хімічного зсуву для сполуки 1 (СОСІз) 1-1 11111122 550 | 1280 нини ВИ я По У я ПО ОК СТО ПОЛ То Я: ПОЇ 00811115 | 1287 | (77777717! 11111761 587 | 1253 | -(БкБ їй 7 | 486 | 954 11108 1177117111111711192 1 362 | - 2гоМе | 348 | 5950 ( 18511111 346 | 810 001187. 1 430 | 760 | щ - зОоМе | 348 | 576 11111184 11111171 1711111114оМме | 356 | 609 я1111111111090 1 460 | Ю.Й 5. .ЮБм... | 355 | щю 679 11102712 77711111 286 | 494 | щ-хЖ 6 щ-Б | 128 | 78 22181111 677 | 475 Ї11111111111111111111111Ї11111Ї1 ших о я ПЕ ЕХ Я Ох КО НО ЗУ я НО НОЯ І 15111111 - 00112028 17171711 1198 | 309 ши ли Ех У ДЯ ПО ПО НАТО ОО 002718 7777111117160 11342 | 77777771 1150 | 777. 12111111 «-ММе?//// | 223 | 407 21111111 504 | 763 | щ-хмБ 6 (| 126 | 88

Хімічні зсуви посилаються на пристрій вимірювання передачі при О ррт.

Відмітні ЯМР спектроскопічні особливості інших метаболітів були такими:

ЯМР спектри структур, які мають основну макролідну структуру сполуки 7, ілюструвалися відсутністю протонних сигналів при 5,8 і 5,7 ррт, і присутністю нового алкенового резонансу при 5,5 ррт. Крім того, метальний резонанс при 1,7 ррт вказував на присутність алкенової метальної групи. ЯМР спектри структур, які мають основну макролідну структуру сполуки 8, ілюструвалися рядом особливостей. Н-8 виявлявся як дублет при 4,15 ррт, а Н-9 виявлявся при 4,1 ррт (дд). Між Н-8 і Н-9 не було ніякої вимірної константи взаємодії. Сигнал для Н-11 зсунувся у нижню ділянку до 1,5 ррт. Гідроксилювання біля С-24 в будь-якій з цих 21-бутенільних структур було показане зсувом у нижню ділянку як Н-24, так і Н-25, які виявлялися як мультиплет і триплет, відповідно. Одночасно Н-23 змінився на подвійний дублет. ЯМР спектри структур, які мають основну макролідну структуру сполуки 11, ілюструвалися додаванням алкенових резонансів при 5,1, 5,25 і 5,6 ррт, з конфігураціями зв'язку, які узгоджуються з кінцевою алкеновою групою. Крім того, сигнал, що вказує на кінцеву аліфатичну метильну групу при 0,9-1,0 ррт, був відсутній. ЯМР спектри сполук, які мають основну макролідну структуру сполуки 16, ілюструвалися зсувом у нижню ділянку Н-24 і руйнуванням триплетної структури до дублету при приблизно 1,4 ррт. У цих випадках Н-23 змінювався до дублету квартетів, і аналіз двовимірного кореляційно-спектроскопічного спектра показав зв'язування цього дублету з іншим алкеновим протоном, що вказує на присутність пропенілової групи. ЯМР спектри сполук, які мають основну макролідну структуру сполуки 23, ілюструвалися відсутністю бутенілових алкенових протонів і були відрізнені від раніше відомих спінозинів шляхом аналізу двовимірного кореляційно-спектроскопічного і повного спектроскопічного кореляційного експериментів. Аналіз напрямку зв'язування, що витікає з Н-25, виявив 4- вуглецеву бутильну групу, зв'язану з 0-21. Глікозидні підструктури, приєднані до кисню біля С-17, були ідентифіковані з використанням великої кількості двовимірних ЯМР експериментів.

Метальний триплет Н-25 і Н-24 розширеного кільця макроліду 31 нагадує етильну групу у спінозині А. Крім того, Н-21 перемістився у верхню ділянку до 4,8 ррт, відносно його положення у сполуці 1. Однак алкенові протони все ще були присутніми. Двовимірний кореляційно-спектроскопічний спектр показав, що як етильна група, так і алкен були з'єднані з Н-21, що вказує на те, що подвійний зв'язок у цій сполуці знаходився у межах кільця. Це узгоджувалося з даною сполукою, яка була ізомером сполуки 1, грунтуючись на її молекулярній масі, яка складала 758 (з даних мас-спектра).

Перелік усіх метаболітів з молекулярними аддукт-іонами, що спостерігалися при МС з іонізацією електророзпиленням, з яких була виведена молекулярна маса, наведений у таблиці І:

Таблиця ПІ 1 758,5 (МАНІ! 2 774,5 (МАНІ

З 744,5 (МАНІ 4 774 А (МАНІ 744,8 (МАНІ (5) 744,8 (МАНІ! 7 772,5 (МАНІ! 8 774,5 (МАНІ! 9 7747 (МАНІ! 760,5 (МАНІ 11 756,5 (МАНІ 12 748,5 (МАМНАГ 13 810,5 |(МАМНАЇ" 14 764,5 |ІМАМНАЇ" 808,5 |МАМНАЇ" 16 744,5 (МАНІ! 17 617,4 (МАНІ 18 631,4 (МАНІ 19 633,4 (МАНІ 650,4 |МАМНАЇ" 212 666,4 |МАМНАГ" 22 615,4 (МАНІ 23 636,5 (МАМНА|" 24 744,4 (МАНІ! 758,4 (МАНІ! 26 772.4 МАНІ" 27 788,7 (МАНІ 28 760,4 (МАНІ 23 620,3 |ІМАМНАГ" 620,3 (МАМНАГ 31 158,4 (МАНІ 1 Молекулярні адцукт-іони спостерігали, використовуючи РХ/МС з іонізацією електророзпиленням. 2 Два ізомери, обидва мали однакові МС характеристики.

Інсектицидна та акарицидна активність

Сполуки за даним винаходом (інші, ніж ті, де А5 представляє Н) є корисними для контролю чисельності комах, кліщів та іксодових кліщів. Тому наступний аспект даного винаходу спрямований на способи пригнічення комах, кліщів або іксодових кліщів, які включають застосування до місцеположення комах, кліщів або іксодових кліщів такої кількості, яка пригнічує комах, кліщів або іксодових кліщів, сполуки формули 1 або 2,

де Н5 є групою, що має одну з формул 4а-4ї. "Місцеположення" комах, кліщів або іксодових кліщів відноситься до навколишнього середовища, в якому комаха, кліщ або іксодовий кліщ живе, або де присутні його яйця, включаючи повітря, що його оточує, їжу, яку він споживає, або об'єкти, з якими він контактує. Наприклад, комах або кліщів, які харчуються рослинами, можна контролювати, наносячи активну сполуку на ті частини рослини, які комахи або кліщі їдять або де вони живуть, особливо листя.

Під терміном "пригнічення комах, кліщів або іксодових кліщів" розуміють зменшення кількості живих комах, кліщів або іксодових кліщів, або зменшення кількості яєць. Ступінь зменшення, досягнутий сполукою, залежить, звичайно, від норми витрати сполуки, конкретної застосовуваної сполуки, і цільових видів комах, кліщів або іксодових кліщів. Щонайменше, має бути використана кількість сполуки, що інактивує комах, кліщів або іксодових кліщів. Під терміном "кількість, що інактивує" розуміють, що використовується така кількість сполуки, яка спричиняє вимірне зменшення в обробленій популяції комах, кліщів або іксодових кліщів.

Звичайно використовують від приблизно 1 до приблизно 1000 ррт (або від 0,01 до 1Ткг/акр) сполуки.

Сполуки демонструють активність проти великої кількості комах, кліщів та іксодових кліщів. Більш конкретно, сполуки показують активність проти членів ряду І ерідорієга (комахи), таких як бурякові похідні черв'яки, тютюнова совка, яблунева плодожерка і капустяна совка. До інших типових членів цього ряду належать південні похідні черв'яки, озима совка, платтяна міль, вогнівка комірна південна, листокрутки, совка бавовникова американська, совка бавовникова, метелик кукурудзяний, завезена капустяна гусінь, рожевий коробковий черв'як бавовнику, мішечниці, коконопряд кільчастий американський, лугові метелики і осінні похідні черв'яки.

Сполуки також показують активність проти членів ряду СоіІеорієга (жуків і довгоносиків, таких як колорадський жук, жук-блішка одинадцятицятковий, жук-блішка смугастий, хрущик японський і довгоносик бавовниковий) і Оірієга (мух справжніх, таких як муха домашня, комарі, дрозофіли, жигалки осіння і коров'яча мала, і молі-мінери вузькокрилі).

Дані сполуки також показують активність проти членів ряду Нетіріега (клопів справжніх, таких як клопи- сліпняки, клопи-щитники і клопи-наземники), Ноторієга (таких як тлі, цикадки, дельфациди, білокрилки, щитівки і червці), МаПорнада (пухоїдів), Апорішга (вошей), Тпузапорієга (трипсів), Оппорієга (таких як таргани, сарана, коники і цвіркуни), бірпопарієга (бліх), Ізорієга (термітів), і членів ряду Нутепорієга Еоптісідає (мурах).

Дані сполуки також показують активність проти кліщів та іксодових кліщів ряду Асаїї, наприклад, кліщика павутинного двоплямистого. Інші типові члени цього ряду включають паразитів рослин, таких як кліщик червоний цитрусовий, кліщик павутинний і кліщик плоский цитрусовий, і паразитів тварин, таких як коростяний кліщ, кліщ кінський, кліщ овечий, кліщ кровосисний пташиний, кліщ мінливий, кліщ пташиний і залозниця собача.

Конкретні типові членистоногі шкідники, які можуть бути контрольовані за допомогою даних сполук, включають: Атріубтта атегісапит (І опе-віаг ск), Атріуотта тасшашт (кліщ плямистий), Агда5 регзісив (кліщ персидський), Воорпіте тісгоріив (кліщ кільчастий), Спогіорієз 5рр. (кліщ коростяний), Оетодех ромів (залозниця бичача), Оетодех сапів (залозниця собача), Оеппасепіог апаеггопі (кліщ Андерсена), Оеппасепіог магіаріїв (іксодовий кліщ мінливий), Оепптапузвив даїїйпає (кліщ кровосисний пташиний), Іходез гісіпив (кліщ овечий звичайний), Кпетідокорієз даїпає (кліщ пташиний), Кпетідокорієв тиїапе (кліщ мінливий), Стобіив тедпіпі (кліщ аргасовий), Рзогорієз едиї (кліщ кінський), Рзогорієв омі5 (кліщ кінський), НАПірісерпав запдиіпеив (кліщ собачий коричневий), Загсорієз 5сабієї (кліщ коростяний), Аєдез (комарі), Апорпеїез (комарі малярійні), Сшех (комарі), Сиїїзейа, Вомісоїа роміз (воша бичача), СаПйгода Потпімогах (падальна муха),

Спгузорз зрр. (оленяча муха), Сітех Іесішапив (клоп постільний), Соспіютуіа рр. (личинка м'ясної мухи),

Стієпосерпаїїдев5 сапіз (блоха собача), Сіепосерпаїїадез Геїїз (блоха котяча), Сшісоїдез 5рр. (галиці, мошки або мокреці), Сатаїйнпіа омі5 (воша овеча), Оєпптаїйобіа 5рр. (гедзь підшкірний), Савіегорніше паєто/тпоїааїїв5 (гедзь червонохвостий), Савіегорпіи5 іпіезіїпаїйє (гедзь шлунковий великий), Савіегорпіїш5 паваїї5 (гедзь носовий оленячий), С1іоззіпа зрр. (муха цеце), Наєтаїйобіа іпіапе (жигалка коров'яча мала), Наєтайріпиз авіпі (воша ослина), Наетаїйоріпих епгувієттив (воша великої рогатої худоби коротконоса кровосисна), Наєтаїйоріпив омійш5 (воша головна), Наєтайріпиз 5ці5 (воша свиняча), Нуагоїаєа іпіапв (головна муха), Нуродепта ромів (гедзь бичачий підшкірний), Нуродегта Іпеашт (гедзь бичачий смугастий), І іподпаїйиз оміив5 (воша головна),

Іподпаїпив редаїїз (воша ступнева), І іподпаїпиє мішії (воша великої рогатої худоби довгоноса кровосисна),

І исійа зрр. (личинка м'ясної мухи), МеІорпадивз оміпиз (рунець овечий), Мигса рр. (домашня муха), Оеєвіги5 оміз (гедзь червонохвостий), Редісшив рр. (воші), Рпїероїотив 5рр. (мошка), Рпогтіа гедіпа (м'ясна муха),

Резогорнога 5рр. (комар), Ріпігаз 5рр. (воші), Недимійв 5рр. (клопи-хижаки), ЗітиіШт зрр. (мошка), ЗоІепороїев сарійашве (воша великої рогатої худоби мала блакитна), Біотохуз саісйгапе (жигалка осіння), Тарапив зрр. (гедзь), Тепебіо зрр. (личинки хрущаків), Тіаюта 5рр. (кізвіпд ридв).

Сполуки є корисними для зменшення популяцій комах, кліщів та іксодових кліщів, і використовуються у способі пригнічення комах, кліщів або іксодових кліщів, який включає застосування до місцеположення комахи, кліща або іксодового кліща ефективної кількості активної сполуки за винаходом, що інактивує комах, кліщів або іксодових кліщів. У одному переважному втіленні даний винахід спрямований на спосіб пригнічення сприйнятливих комах з ряду Іерідорієгта, який включає нанесення на рослину ефективної кількості що інактивує комах, активної сполуки за даним винаходом. Інше переважне втілення даного винаходу спрямоване на спосіб пригнічення кусючих мух із ряду Оірієга у тварин, який включає пероральне, парентеральне введення або локальне нанесення тварині ефективної кількості, що пригнічує шкідників, даної сполуки. Ще одне переважне втілення даного винаходу спрямоване на спосіб пригнічення кліщів або іксодових кліщів ряду

Асагіпа, який включає застосування до місцеположення кліща або іксодового кліща такої кількості активної сполуки за винаходом, що інактивує кліщів або іксодових кліщів.

Не лише сполуки, розкриті тут, є корисними у виробництві сільськогосподарських продуктів, але і кислі додаткові солі цих сполук, де це можливо, також є корисними продуктами. Ці солі є корисними, наприклад, в розділенні і очищенні сполук формули 1 і 2. Крім того, деякі з цих солей можуть мати підвищену розчинність у воді. Кислі додаткові солі можуть бути приготовані із сполук, розкритих у формулі 1, де В5 є основною азотовмісною молекулою цукру, такого як форозамін. Солі цих сполук готують, використовуючи стандартну методику для приготування солей, яка є добре відомою фахівцям у даній галузі техніки. Кислі додаткові солі, які є особливо корисними, включають, але не обмежуються ними, солі, утворені при стандартних реакціях як з органічними, так і з неорганічними кислотами, такими як сірчана, хлористоводнева, фосфорна, оцтова, бурштинова, лимонна, молочна, малеїнова, фумарова, холева, памоєва, слизова, глутамінова, камфорна, глутарова, гліколева, фталева, винна, мурашина, лауринова, стеаринова, саліцилова, метансульфонова, бензолсульфонова, сорбінова, пікринова, бензойна, корична та подібні кислоти.

Приклад 4

Відбір комах

А. Дослідження змочування новонароджених личинок тютюнової совки (Неїоїпів мігезсепв).

Для порівняння інсектицидної активності сполук формули 1 у новонароджених («6 годин після вилуплення) личинок Неїоїйпіє мігезсеп5 спочатку були приготовані ацетонові розчини кожного з метаболітів із концентрацією 1мкг/мкл. Ацетонові розчини потім були розведені водою МіПШроге, яка містила 0,02590 поверхнево-активної речовини Топ Х-100, даючи в результаті розчини для обробки з концентрацією 25 або 50 ррт. Один мілілітр кожної концентрації кожного метаболіту потім наносили за допомогою піпетки безпосередньо над і на фільтр діаметром 100мм з якісного ватманівського фільтрувального паперу Ме1, на якому були обережно розміщені 20 новонароджених личинок тютюнової совки. Кожен оброблений фільтрувальний папір і розміщені на ньому личинки потім вміщували у одноразові пластикові чашки Петрі розміром 20ммхіО0Омм. Через одну годину порцію об'ємом 1 см? корму для Іерідорієга на основі агару (модифікована дієта ЗПпогеу, Зошійіапа Ргодисіє Гаке Мійаде, АР) вміщували у кожну чашку як джерело харчування для личинок. Чашки Петрі витримували при 27"С протягом 24 годин і потім визначали процент смертності личинок при кожній обробці. Результати представлені нижче у таблиці ІМ.

В. Дослідження місцевого нанесення на бурякових похідних черв'яків (Зродоріега ІПогаїїв).

Додатковий критерій відносної інсектицидної активності сполук формули 1 був вироблений при використанні метанольного розчину кожної сполуки з концентрацією 1мкг/мкл, нанесеного в кількості їмкл на личинку вирощених в лабораторних умовах бродорієга ІШогаїїз (середня вага личинки 4Змг). Кожну сполуку наносили вздовж дорсальної частини кожної з шести личинок. Оброблені личинки потім витримували протягом п'яти днів при 21 "С, відносній вологості 6095 у шестиямкових пластикових культуральних планшетах. Кожну личинку забезпечили 1см? корму, для харчування протягом 5-денного після-експозиційного періоду. Процент смертності був визначений у кінці 5-денного періоду. Результати представлені в таблиці ІМ.

Таблиця ІМ

Сполука змочування (24 години) (120 годин) 1 50 100 1 100 2 50 100 1 100

З - МТ 1 100 4 50 100 1 100 - Мт - Мт (5) - МТ - МТ 7 50 100 1 100 8 - МТ 1 100 9 50 100 1 33 50 100 1 (0) 11 50 100 1 100 12 50 100 1 50 13 25 45 1 (0) 14 25 100 - МТ 25 100 1 67 16 50 100 1 100 17 25 10 ! о 18 25 (0) 1 (0) 19 25 93 1 (0) 20 1 (0) 21 Ме1 25 4 1 (0) 21 Ме2 25 7 1 (0) 23 - МТ - МТ 24 50 100 1 50 25 50 100 1 17 26 50 100 1 100

27 50 100 1 100 28 50 100 1 17 29 - МТ - МТ

Зо - Мт - Мт 31 50 100 1 100

Інсектицидні суміші

Дані сполуки застосовують у формі сумішей, які також є частиною даного винаходу. Ці суміші включають кількість сполуки за даним винаходом, що інактивує комах, кліщів або іксодових кліщів, у фітологічно прийнятному інертному носії. Діюча речовина (речовини) можуть бути представлені як одна сполука, суміш двох або більше сполук або як суміш однієї або більше сполук даного винаходу разом з висушеною частиною ферментаційного середовища, в якому вони продукуються.

Суміші готують відповідно до методик і формул, які є загальноприйнятими у галузі сільського господарства або боротьби з шкідниками, але які є новими і важливими через присутність однієї або більше сполук даного винаходу. Суміші можуть бути концентрованими препаративними формами, які диспергують у воді, або можуть бути у формі дусту (пилу), пасток (принад) або гранул, використовуваних без подальшої обробки.

Дисперсійні системи, в яких застосовують дані сполуки або неочищений висушений матеріал, звичайно є водними суспензіями або емульсіями, приготованими з концентрованих препаративних форм цих сполук або неочищеного матеріалу. Водорозчинні або водосуспендовані або емульговані препаративні форми є або твердими речовинами, змочувальними порошками, або рідинами, відомими як концентрати емульсій або водні суспензії. Змочувальні порошки можуть бути агломеровані або спресовані з утворенням вододиспергованих гранул. Ці гранули містять суміші сполуки або неочищеного висушеного матеріалу, інертних носіїв і поверхнево-активних речовин. Концентрація сполуки або неочищеного висушеного матеріалу звичайно складає від приблизно 0,195 до приблизно 9095 за масою. Інертний носій є звичайно атапульгітовою глиною, монтморилонітом і кізельгуром або очищеними силікатами.

Поверхнево-активні речовини становлять звичайно від приблизно 0,595 до приблизно 1095 від маси змочувального порошку, де поверхнево-активними речовинами звичайно є сульфоновані лігніни, конденсовані нафталін-сульфонати, нафталін-сульфонати, алкіл-бензилсульфонати, алкілсульфонати або неїіонні поверхнево-активні речовини, такі як етиленоксидні аддукти алкілфенолів, або їхні суміші.

Концентрати емульсій заявлених сполук звичайно знаходяться в межах від приблизно 50 до приблизно 500 грамів сполуки на літр рідини, що еквівалентне від приблизно 595 до приблизно 5095, розчиненої в інертному носії, який є сумішшю розчинника, що не змішується з водою, і емульгаторів. Органічні розчинники включають органічні, такі як ксилоли, і нафтові фракції, такі, як високо киплячі нафталінові і олефінові фракції нафти, які включають важкі і ароматичні бензиново-лігроїнові фракції. Можуть також використовуватися інші органічні розчинники, такі як терпенові розчинники - похідні каніфолі, аліфатичні кетони, такі яке циклогексанон, і складні спирти. Емульгаторами для концентратів емульсії є звичайно змішані іонні і/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як ті, що тут згадані, або їхні еквіваленти.

Можуть бути приготовані водні суспензії, які містять водонерозчинні сполуки за даним винаходом, де ці сполуки дисперговані у водному носії в концентраціях звичайно від приблизно 5956 до приблизно 5095 за масою. Суспензії готують дрібними розмелюванням сполуки і енергійним змішуванням її з водним носієм, поверхнево-активними речовинами і диспергаторами, як тут обговорювалося. Можна також застосовувати інертні інгредієнти, такі як неорганічні солі і синтетичні або природні смоли, для збільшення густини і/або в'язкості водного носія, якщо це є бажаним.

Осаджені плинні препаративні форми можуть бути приготовані шляхом розчинення активної молекули у розчиннику, що змішується з водою, і поверхнево-активних речовинах або поверхнево-активних полімерах.

Коли ці препаративні форми змішують з водою, діюча речовина осаджується з поверхнево-активною речовиною, яка контролює розмір одержаного у результаті мікрокристалічного осаду. Розмір кристалу можна контролювати шляхом вибору специфічних сумішей полімеру і поверхнево-активної речовини.

Сполуки можна також застосовувати у вигляді гранулярної суміші, яку вносять у грунт. Гранулярна суміш звичайно містить від приблизно 0,595 до приблизно 10905 сполуки (за масою). Сполуку диспергують у інертному носії яким є звичайно глина або еквівалентна речовина. Загалом гранулярні суміші готують, розчиняючи сполуку у підходящому розчиннику і наносячи її на гранулярний носій, який був попередньо подрібнений до бажаного розміру частинок. Розмір частинок звичайно складає від приблизно 0,5мм до Змм. Гранулярні суміші можна також приготувати формуванням тістоподібної маси або пасти носія зі сполукою, висушуванням комбінованої суміші, і подрібненням тістоподібної маси або пасти до бажаного розміру частинок.

Дані сполуки можна також поєднати з підходящим органічним розчинником. Органічний розчинник є звичайно м'яким мінеральним маслом, яке широко застосовується у сільськогосподарському виробництві. Ці комбінації звичайно використовують у вигляді спреїв. Більш типово, ці сполуки застосовують у вигляді дисперсії у рідкому носії, де рідким носієм є вода. Ці сполуки можна також застосовувати у формі аерозольної суміші. Дані сполуки розчиняють у інертному носії, який є стиснутою сумішшю. Цю аерозольну суміш вміщують у контейнер, де суміш диспергується за допомогою розпилювального клапана. Стиснуті аерозольні суміші містять або низько киплячі галоїдовуглеці, які можуть бути змішані з органічними розчинниками, або водні суспензії, де підвищений тиск створюється інертними газами або газоподібними вуглеводнями.

Кількість сполуки, застосовуваної до місцеположення комах, кліщів та іксодових кліщів не є критичною і легко може бути визначена фахівцями у даній галузі техніки. Загалом, бажаний контроль забезпечують концентрації сполук від приблизно 10 ррт до приблизно 5000 ррт. Для культур, таких як соя і бавовник, норма витрати складає від приблизно 0,01 до приблизно кг/га, де сполуку застосовують у вигляді спрея при витраті від 5 до 5бгалонів/акр. Сполуки можна застосовувати до будь-якого місцеположення, населеного комахами, кліщами або іксодовими кліщами. Таким місцеположенням звичайно є бавовник, соя і овочеві культури, фруктові і горіхові дерева, виноградна лоза, домашні та декоративні рослини.

Сполуки за даним винаходом є також корисними для обробки тварин з метою боротьби з членистоногими, тобто комахами і павукоподібними, які паразитують на тваринах. Ці членистоногі паразити звичайно атакують своїх хазяїнів на зовнішній поверхні ("екто"); речовини, які контролюють таких шкідників, називають "ектопаразитицидами". Всі тварини є об'єктами для уражень такими шкідниками, хоча ці проблеми є більш тяжкими серед хребетних тварин. Люди є потенціальними хазяїнами для багатьох паразитів, і в тропічних регіонах та регіонах з мінімальною санітарією паразитарні інфекції є постійною проблемою у лікарській практиці. Дуже поширеним об'єктом ураження паразитами є також численна домашня худоба, така як велика рогата худоба, вівці, свині, кози, буйволи, водяні буйволи, олені, кролики, кури, індики, качки, гуси, страуси та їм подібні. Коні та інші тварини, яких тримають для задоволення, є об'єктом паразитичного ураження, так само як норка та інші тварини, яких вирощують заради їхнього хутра, і щури, миші та інші тварини, яких використовують в лабораторних дослідженнях. Домашні тварини, такі як собаки і коти, є дуже схильними до ураження паразитами, і через тісні стосунки цих тварин з людьми такий паразитизм створює проблеми для тих людей, які спілкуються з такими тваринами. Риби, ракоподібні та ніші водні види також є об'єктом паразитичного ураження. Коротко кажучи, паразитизм включає у якості хазяїнів, по суті, цілий ряд тварин.

Значними є економічні втрати від ектопаразитарних інвазій. У галузі тваринництва у тварин, які страждають від паразитів, зменшується ефективність споживання корму і темпи приросту. Страждає виробництво молока і вовни, і існує збиток для овечого руна, шкірсировини і невироблених шкір тварин.

Тварини стають сприйнятливими до вторинних мікробіологічних інфекцій і до подальших атак паразитів.

Ектопаразити викликають також суттєвий дискомфорт, навіть коли вони не завдають значної шкоди здоров'ю та виробництву.

Хоча у вжитку знаходиться велика кількість засобів для знищення паразитів, вони страждають від різноманітних проблем, включаючи обмежений спектр активності, токсичність для навколишнього середовища, необхідність повторної обробки, і, у багатьох випадках, стійкість до них ектопаразитів. Тому існує постійна потреба у нових ектопаразитицидах.

Сполуки за даним винаходом забезпечують новий інструмент у обладнанні для боротьби з ектопаразитами. У цьому втіленні даний винахід спрямований на спосіб пригнічення або знищення членистоногих паразитів на тварині-хазяїні, який включає контактування шкідника з ефективною кількістю сполуки за даним винаходом.

Ектопаразитицидна активність даних сполук досягається при контакті сполук із шкідниками. Контакт може відбуватися з яйцями, личинками, дорослими особинами або іншими життєвими стадіями шкідника. "Контакт" включає проковтування сполуки шкідником.

Приклад 5

Дослідження іп мімо: миші/дорослі жигалки осінні

У 0 день дослідження по шість білих лабораторних мишей (Ми тивсци5) вагою Зог (вік 8-10 тижнів, самки лінії ІСА, Напап-5ргадне-бам/еєу, Іпс., Іпаіапароїїв, ІМ.) у кожній групі одержали досліджувану речовину або розчинник (9095 етил олеат/1095 ДМСО), або перорально, або місцево. В 1 день дослідження по дві миші з кожної обробленої групи одержали анестезію шляхом внутрішньом'язової ін'єкції (0,25мл) комбінації 1,0мл кетаміну (Роїї Оодде, КеїазеїФ), кетамін гідрохлорид для ін'єкцій, 10Омг/мл) і 1,О0мл ксилазину (Вауег, Нотрипф), 20мг/мл, для ін'єкцій) у 4,5мл стерильної води. Анестезовані миші були поміщені у бокси з мухами, які містили по 30 дорослих жигалок осінніх. Анестезованих мишей залишали у боксах протягом періоду до 60 хвилин і мухам давали можливість без перешкод кусати тварин до крові. Після видалення з боксів із мухами миші, які перебували у непритомному стані, були негайно піддані евтаназії з СС». Бокси з мухами витримували протягом усього періоду дослідження при 12-годинному денному/12-годинному нічному циклі. Температура у кімнаті, в якій проводилося дослідження, становила 68-72" і відносна вологість складала 50-60905. Ці процедури точно повторювали на 2 і З дні дослідження з експериментальними мишами, які залишилися.

Кожного дня записували кількість мертвих мух і бокси з мухами вибраковували. Загальний процент смертності мух визначали для кожної обробки і порівнювали із смертністю мух для дорослих жигалок осінніх, яких постійно годували і для дорослих жигалок осінніх, які кусали мишей контрольної групи, оброблених розчинником. Результати випробування сполук 1 і 8 є такими:

День 1 о РозчинниктбОгкгГ///7777777771111111Ї711717611111 17111110 |71л1о |7771о о Сполукаї. 77777711 Ї11116 17711153 | 186 | 2 щ 86 Ф (

Приклад 6

Дослідження іп міо: пакетний тест з личинками іксодового кліща

Титровані концентрації досліджуваних сполук розчиняли у суміші оливкової олії і трихлоретилену, і наносили за допомогою піпетки на квадрати лабораторного фільтрувального паперу. Після того, як трихлоретилену давали випаритися протягом однієї години, шматочки фільтрувального паперу згинали навпіл і дві сторони закріплювали затискачами, утворюючи пакети. Приблизно 100 личинок кліщів (Атріуотта атегісаппит) поміщали всередину кожного пакету, і сторону, яка залишалася відкритою, закріплювали затискачем. Пакети інкубували протягом 24 годин при приблизно 72"Е і 9595 вологості. Кожен пакет відкривали окремо і визначали кількість живих і мертвих личинок. Процент смертності визначали для кожної сполуки.

Результати випробування сполук 1 і 8 є такими:

77877117 177771711111лобв 77111111 69876111 1247611

Приклад 7

Дослідження іп міо: дорослі жигалки осінні

Зубні тампони просочували сироваткою, яка містила титровані концентрації досліджуваних сполук, починаючи з 100 ррт. Зубні тампони вміщували у чашки Петрі разом 10 дорослими особинами жигалки осінньої (Біотохуз саїЇсігапе), попередньо охолодженими для більш легкого маніпулювання. Процент смертності визначали через 24 і 48 годин інкубації при приблизно 257С і 75-85905 вологості, в порівнянні з чашкою, де містився тампон лише з контрольною сироваткою. Результати випробування сполук 1 і 8 є такими: о Стола | 000одеьо | бордо ото лУЄ 00-аводии 12020205 2 2З2---50--ФИ---ї0--- о-ви ОО «ЛИ 4вгодин// | 100 | 802 2 | 0 | 0 "

Приклад 8

Дослідження іп міо: личинки мухи падальної

Фільтри-вкладки вміщували кожен окремо у 96б-ямкові титраційні мікропланшети. Кожну вкладку просочували бичачою сироваткою, об'єднаною з титрованими концентраціями досліджуваних сполук, починаючи з 100 ррт. Приблизно 30 личинок мухи падальної весняної (Ріоптіа гедіпа) поміщали в кожну ямку і весь мікропланшет запечатували. Планшети інкубували протягом періоду до 48 годин при приблизно 25" і вологості 75-8596, після чого визначали ефективність сполук, візуально перевіряючи кожну ямку на наявність рухів личинок. Результати випробування сполук 1 і 8 є такими (обидві сполуки були активними при концентрації вище 5 ррт): 78 | А ЇЇ м Ї! мМ її м її м ЇЇ м

А вказує на смертність, що показана відсутністю рухів у личинок.

М вказує, що спостерігалися рухи личинок.

Способи доставки ектопаразитицидів добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Загалом, дану сполуку наносять на зовнішню поверхню тіла тварини, за допомогою чого вона контактує зі шкідниками, уже присутніми на тілі хазяїна, так само як з тими, які потраплять на тіло тварини в межах періоду ефективності сполуки. Звичайно сполуку вводять до складу рідкої препаративної форми, яку розбризкують на поверхню тіла тварини або якою орошають поверхню тіла тварини. Ще одним традиційним способом обробки є "занурення", за допомогою чого обробляють велику рогату худобу, по суті, занурюючи її у розведений розчин ектопаразитициду. Для деяких організмів-хазяїнів і шкідників препаративною формою є дуст (пил), яким посипають поверхню тіла тварини-хазяїна, або шампунь чи крем, який застосовують при купанні тварини.

Нашийники на котах і собаках також використовують у способі доставки ектопаразитициду безпосередньо до поверхні тіла тварини.

У іншому втіленні сполуки за даним винаходом можуть бути доставлені до тварин з використанням вушних бирок, спосіб доставки, розкритий у 05 4265876.

У іншому методі ектопаразитицид застосовують у місцях, які часто відвідують тварини, так що шкідники таким чином контактують зі сполукою, навіть як при прямому нанесенні на поверхню тіла хазяїна. Добре відоме застосування до підстилки домашніх тварин (котів або собак), так само як застосування до килимового покриття підлоги. Для великої рогатої худоби добре відомі пилові мішки. їх розміщують у дверному отворі, де худоба неминуче зачіпає цей мішок, і паразити контактують з даною сполукою.

У ще одному втіленні винаходу дані сполуки можна використовувати для контролю членистоногих паразитів у випорожненнях великої рогатої худоби та інших тварин. У цьому втіленні, сполуки вводять перорально, і вони проходять крізь шлунково-кишковий тракт і з'являються у випорожненнях. Контроль паразитів у випорожненнях непрямим чином захищає тварину від паразитів.

Сполуки для використання у якості ектопаразитицидів виготовляють способами, відомими фахівцям у даній галузі техніки. Загалом, препаративна форма включатиме сполуку за даним винаходом і один або більше фізіологічно прийнятних ад'ювантів. Препаративні форми включають свої концентровані варіанти, в яких наявна діюча речовина представлена у концентрації від 0,001 до 98,0 процентів, а решту вмісту займають фізіологічно прийнятні носії. Такі препаративні форми, особливо ті, що містять менше 5095 даної сполуки, іноді можна використовувати без розведення, хоча ці препаративні форми можна також розводити іншими фізіологічно прийнятними носіями з утворенням більш розведених розчинів для обробки. Ці останні розчини можуть включати діючу речовину у менших концентраціях від 0,001 до 0,1 процента.

Сполуки за даним винаходом також корисні як лікарські препарати для людини для боротьби з паразитами, наприклад, вошами. Ці сполуки можна використовувати, наприклад, у препаратах для боротьби з вошами, які розкриті у УМО 00/01347.

Апорішга, або сисні воші, є паразитами, що виявляються майже у всіх груп ссавців. З 15 визнаних родин

Апорішйга, дві родини, Реаісціідає і Рійіпдає, мають види, які паразитують на людях. Реадісшив Ппитапив є єдиним видом у родині Реадісцїйдає, який уражає людей. Він включає головну вошу, Редісшив питапив сарійів; і платтяну вошу, Редісшив Нитапиє питапивх, яку іноді називають Реаісшив согрогіз. Лобкова воша, Ріпіги5 рибріз, є окремим видом і єдиним членом родини Ріпійдає, який уражає людей. У значенні, в якому тут використаний, термін "людські воші або воша" включає представників видів Редісшив питапив або Ріпіги5 рибів.

Відповідно, в одному з своїх аспектів даний винахід надає педикуліцидні/овіцидні (протипедикульозні) суміші для боротьби з зараженням вошами у людини, які включають у якості діючої речовини спінозин або його фізіологічно прийнятне похідне, або його сіль, і фізіологічно прийнятний носій. Особливо корисними сумішами за даним винаходом є суміші для догляду за волоссям. Особливо корисними сумішами для догляду за волоссям є шампуні. Даний винахід також представляє способи використання цих сумішей для боротьби з видами людських вошей. Ці суміші і способи контролюють вошей більш безпечно і ефективно, ніж раніше відомі протипедикульозні суміші і способи.

Протипедикульозні суміші за даним винаходом можуть бути виготовлені кількома способами. Особливо корисними сумішами є шампуні, кондиціонери і лосьйони типу, розкритого в УУО 00/01347.

При застосуванні у складі шампуню, кондиціонеру для волосся або лосьйону спінозиновий компонент присутній на рівні від приблизно 0,195 до приблизно 3095, переважно від приблизно 195 до приблизно 1095.

Що стосується активності проти вошей, конкретні втілення даного винаходу включають наступні:

А. Суміш для контролю зараження вошами у людини, яка містить у якості діючої речовини сполуку формули 1 або 2, де НА5 є групою, що має одну з формул 4а-4ї, або її фізіологічно прийнятне похідне або її сіль, і фізіологічно прийнятний носій.

В. Суміш за втіленням А, яка є сумішшю для догляду за волоссям.

С. Протипедикульозний шампунь, який містить: (а) від приблизно 0,195 до приблизно 3095 сполуки формули 1 або 2, де А5 є групою, що має одну з формул 4а-4ї, або її фізіологічно прийнятного похідного або її солі; (5) від приблизно 595 до приблизно 3095 синтетичної поверхнево-активної речовини; (с) від приблизно 195 до приблизно 795 аміду; і (4) воду.

О. Шампунь за втіленням С, де синтетична поверхнево-активна речовина є аніонною, амфотерною, катіонною, цвіттеріонною або неіонною, або їхньою сумішшю.

Е. Шампунь за втіленням О, де амід є кокосовим моноетаноламідом, кокосовим діетаноламідом, або їхньою сумішшю.

ЕР. Шампунь за втіленням О, який додатково включає від приблизно 1956 до приблизно 1095 нелеткої силіконової речовини.

С. Шампунь за втіленням РЕ, де нелетким силіконом є поліалкілсилоксан, поліалкіларилсилоксан, поліефірний силоксан співполімер, або їхня суміш, де в'язкість складає від приблизно 100 сантипуазів до приблизно 150000000 сантипуазів при 2570.

Н. Шампунь за втіленням С, який додатково містить від приблизно 0,595 до приблизно 595 суспендуючої речовини, вибраної з групи, що складається з кристалічних амфіфільних речовин, які мають голкоподібні або пластинчасті структури, полімерних матеріалів, глин, твердих частинок (діаметром менше 1мкм) оксидів металів, і їхніх сумішей.

Ї. Шампунь за втіленням Н, де суспендуюча речовина є кристалічною амфіфільною речовиною, вибраною з групи, що складається з довголанцюгових С16-Сг2 ацильних похідних, довголанцюгових С16-Сг2 алканоламідів жирних кислот, і їхніх сумішей.

У. Шампунь за втіленням І, де суспендуючою речовиною є діефір етиленгліколю.

К. Шампунь за втіленням 0, де кількість спінозину, або його похідного, або його солі знаходиться на рівні від приблизно 0,2595 до приблизно 1,590.

І. Спосіб для контролю зараження вошами у людини, який включає місцеве застосування суміші за втіленням А у людини.

М. Спосіб за втіленням Г, де зараження викликане вошами Редісцив питапиз саріїйв.

М. Спосіб за втіленням ГІ, де зараження викликане вошами Редісшив питапиє питапив.

О. Спосіб за втіленням Г, де зараження викликане вошами Ріпігив рибів.

Р. Спосіб для обробки волосся людини з метою знищення і полегшення видалення вошей та їхніх яєць, який включає стадії: (а) нанесення від приблизно 10г до приблизно З0г суміші, яка містить сполуку формули 1 або 2, де Н5 є групою, що має одну з формул 4а-4і, або її фізіологічно прийнятне похідне або її сіль, і фізіологічно прийнятний носій, на мокре волосся; (Б) втирання суміші у волосся та шкіру голови; (с) залишення суміші на волоссі і шкірі голови протягом приблизно 6-10 хвилин; (4) видалення суміші з волосся промиванням його водою.

О. Використання сполуки формули 1 або 2, де АБ є групою, що має одну з формул 4а-4і, або її фізіологічно прийнятного похідного або її солі, або суміші, що містить будь-яку з цих категорій, для виробництва лікарського засобу для боротьби з вошами у людини.