MXPA02002571A - Macrolidas pesticidas. - Google Patents

Abstract

Compuestos macrolidos producidos mediante el cultivo de la especie Saccharopolyspora LW 107129 (NRRL 30141) que tienen actividad insecticida y acaricida y son intermedios utiles para la preparacion de analogos de espinosina.

Description

MACROLIDAS PESTICIDAS Campo del invento La presente invención se refiere a un nuevo grupo de productos pesticidas naturales, y a una especie de Saccharopolyspora novedosa que producen los compuestos. Antecedentes del Invento El producto de fermentación A83543 es una familia de compuestos, referidos como espinosinas, que son producidos por ciertas cepas de Saccharopolyspora spinosa. Las espinosinas producidas naturalmente descritas anteriormente tienen un sistema de anillo 5, 6, 5-tricíclico, fusionado a una lactona macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutral (rhamnosa) y un azúcar amino (forosamina) (ver Kirst et al . ( 1 991 )). Las espinosinas conocidas han sido referidas como factores o componentes, y se le ha proporcionado a cada una, una letra de designación que le identifica, por ejemplo espinosina A, B, etc. Los compuestos son útiles para el control de arácnidos, nemátodos e insectos, en particular especies Lepidoptera y Díptera, y son muy convenientes para el ambiente y tienen un perfil toxicológico atractivo. La Patente Norteamericana No. 5,362,634 y la solicitud de patente Europea correspondiente No. 375316 A1 , describe espinosinas A, B, C, D, E, F, G, H, y J. El documento WO 93/09126 describe espinosinas L, M, N, Q, R, S, y T. Los documentos WO 94/20518 y la Patente Norteamericana 5,6704,486 describen espinosinas K, O, P, U, V, W, y Y, y derivados de las mismas.

Se han realizado un gran número de modificaciones sintéticas de los compuestos de espinosinas, tal como se describen en el documento WO 97/00265, aunque no ha sido factible la modificación de espinosinas en la posición C-21 . La C-21 de los compuestos conocidos es substituida con metilo o etilo. Si se pudieran descubrir medios para introducir un grupo funcional reactivo en lugar del grupo metilo ó etilo sin causar cambios no deseados en otras partes de la molécula, podrían ser abiertos para las síntesis de muchos compuestos de espinosinas adicionales. Esta ha sido una meta muy solicitada y no realizada anteriormente para los que trabajan en el campo de la síntesis de espinosinas. Sumario del Invento La presente invención proporciona una cepa aislada de una especie de Saccharopolyspora novedosa designada como LW1 071 29 (NRRL 30141 ). La presente invención, también proporciona compuestos que puedan ser producidos cultivando LW107129 en un medio de cultivo adecuado y que tienen la siguiente fórmula I ó 2 general: ( 1 ) (2) en donde: R1 es un grupo de la fórmula 2a, 2b, ó 2c R2 es H ó OH; R3 es H ó CH3; R4 en la fórmula 1 es 1-butenilo, 1 ,3-butadienilo, n-butilo, 3-hidroxi- 1-butenilo, o 1-propenilo; y R4 es etilo en la fórmula 2; y R5 es H o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas de la 4a a la 4¡ Los compuestos específicos de la fórmula 1 ó 2 que han sido preparados y aislados cultivando la cepa Saccharopolyspora LW1 07129, se identifican en la tabla I . •i f TABLA 1 Compuesto No. Fórmula R1 R2 R3 R4 R5 1 1 2a H H 1-butenilo 4a 2 1 2a H H 1-butenilo 4b 3 1 2a H H 1-butenilo 4c 4 1 2a H H 1-butenilo 4d 5 1 2b H H 1-butenilo 4a 6 1 2c H H 1-butenilo 4a 7 1 2a H Me 1-butenilo 4a 8 1 2a OH H 1-butenilo 4a 9 1 2a H H 3-hidroxi-1-butenilo 4a 10 1 2a H H 3-r.id.Oxi-1-buter.ilo 4c 11 1 2a H H 1 ,3-butadienilo 4a 12 1 2a H H 1-butenilo 4e 13 2a H H 1-butenilo 4f 14 1 2a OH H 1-butenilo 4e 15 2a OH H 1-butenilo 4g 16 2a H H 1-propenilo 4a 17 2a H H 1-butenilo H 18 2a H Me 1-butenilo H 19 2a OH H 1-butenilo H 20 1 2a H H 3-hidroxi-1-butenilo H 21 2a OH H 3-hidroxi-1 -butenilo H 22 2a H H 1 ,3-butadienilo H 23 1 2a H H n-butilo H 24 1 2a H H 1 -butenilo 4h 25 1 2a H H 1 -butenilo 4i 26 1 2a OH H 1,3-butadienilo 4a 27 1 2a OH Me 1 -butenilo 4a 28 1 2a OH H 1-propenilo 4a 29 1 2b H H 1 -butenilo H 30 1 2c H H 1 -butenilo H 31 í - 2a H H etilo 4a Todos los componentes descritos en la tabla 1 son estructuralmente distintos de las espinosinas anteriormente conocidas debido, con referencia al grupo R4, a que los compuestos de espinosinas no conocidos previamente habían tenido un grupo 1 -butenilo, 3-hidroxi-1 -butenilo, 1 ,3-butadienilo, 1 -propenilo, ó n-butilo en C-21 del macrólido. Además, varios de los compuestos de la tabla I difieren de todas las -.-i---t-i-j--.-----.it-.--» «• --- ..-- .ri-l>-fetf---§. ..... ^-. . .... ?M. iháuíé?á espinosinas previamente conocidas debido, con referencia al grupo R5, a que estos compuestos tienen nuevos grupos enlazados al oxígeno en C- 1 7 en el macrólido. R2 siempre es H en las espinosinas conocidas, por lo tanto la variación en esta posición es novedosa. Además, el compuesto 31 tiene un nuevo sistema de anillo de macrólido de 14 carbonos no conocido anteriormente en los compuestos reportados de S. spinosa. Los compuestos de la presente invención pueden reaccionar para formar sales. Las sales que son fisiológicamente aceptables también son útiles en las formulaciones y métodos de la presente invención . Las sales son preparadas utilizando procedimientos estándar para preparación de sales. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden ser neutralizados con un ácido adecuado para formar una sal con adición de ácido. Las sales con adición de ácido son particularmente útiles. Las sales con adición de ácidos adecuadas representativas incluyen sales formadas mediante reacción con ya sea un ácido orgánico o inorgánico tal como, por ejemplo, ácido sulfúrico, clorhídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleíco, fumárico, cólico, pamoíco, múcico, glutámico, camfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, táurico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinnámico y similares. Otro aspecto de la presente invención, es un proceso para producir compuestos de la fórmula 1 y 2, el cual comprende cultivar la cepa LW1 07129 de Saccharopolyspora (NRRL 30141 ) en un medio adecuado. Los compuestos de la fórmula 1 y 2 son extractados del caldo de fermentación y del micelio con solventes orgánicos polares. Los compuestos pueden ser purificados adicionalmente mediante técnicas bien conocidas en el arte, tales como cromatografía de columna. Los compuestos de la fórmula 1 y 2 en donde R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a la 4i, son útiles para el control de ácaros, garrapatas e insectos. Por lo tanto, las composiciones insecticidas y acaricidas y métodos para reducir las poblaciones de insectos, ácaros y garrapatas que utilizan estos compuestos, también son parte de la presente invención. Los compuestos de la fórmula 1 y 2 en donde R5 es hidrógeno (C 1 7-seudoaglicones) son útiles como intermediarios en la preparación de compuestos insecticidas y miticidas. Por ejemplo, estos compuestos pueden ser glicosilados en el grupo hidroxilo C-1 7. La glucosilación puede ser llevada a cabo mediante síntesis química o mediante bioconversión microbiana, utilizando procedimientos descritos, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,539,089. Descripción Detallada del Invento Descripción del Cultivo A la cepa novedosa que produce los compuestos de la presente invención se le ha proporcionado la designación LW107129. La LW1071 29 de cultivo fue aislada de una muestra de tierra compuesta de tierras recolectadas en numerosos lugares. El cultivo ha sido depositado de acuerdo con los términos del tratado de Budapest en el Centro de Investigación Regional del Área del Medio Oeste, Servicio de Investigación Agrícola, Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, 81 5 North University Street, Peoría, IL 61604. La cepa fue depositada el 9 de Junio de 1999, y se le asignó el número de depósito NRRL 30141 . Características del Cultivo La cepa LW1 071 29 de Saccharopolyspora produce micelio aerial y esporas blancas brillosas en los siguientes medios: ISP2 e ISP5 de Bennett. Las colonias tienen colores desde crema hasta marrón claro y el micelio del substrato puede tomar un color café claro, particularmente en ISP4 e ISP5. La cepa LW107129 no esporula en ISP3 e ISP4. No se produjeron pigmentos en ningún medio probado. El micelio de la cepa LW107129 pasa por fragmentación en cultivo líquido. Características Morfológicas La cepa LW1 071 29 produce esporas óvidas en cadenas de hasta 50 esporas. Las esporas son revestidas en un forro de esporas y la superficie de la espora es peluda con espinas no frecuentes. Características Fisiológicas La cepa LW1 07129 de Saccharopolyspora tiene la capacidad de producir ácido de los siguientes substratos: D-arabinosa, m-eritritol , D- fructosa, D-glucosa, glicerol , D-mannitol, D-mannosa, L-rhamnosa, D- ribosa y trehalosa. La cepa LW107129 no puede producir ácido de adonitol, L-arabinosa, dextrin, dulcitol, etanol, D-galactosa, glicogen, inositol , lactosa, maltosa, melezitosa, melibiosa, raffinosa, salicin, D- sorbitol, L-sorbosa, sacarosa, xilitol y D-xilosa. La cepa LW107129 tiene la capacidad de asimilar varios ácidos orgánicos incluyendo citrato y succinato aunque no acetato, benzoato, butirato, formato, oxalato, o tartrato. La cepa LW1 07129 tiene la capacidad de hidrolizar tirosina y urea aunque no adenina, caseína, esculina, hippurato, hipoxantina, almidón o xantina. LW1 07129 es resistente a los siguientes antibióticos: carbenicilina, cefalotina, cicloheximida, geneticina, lincomicina, ácido naladíxico, novobiocina, oxitetraciclina, polimixina B, rifampin y espectinomicina y es sensible a bacitracina , cloramfenicol , eritromicina, higromicina B, estreptomicina, tiostrepton, trimetoprin y vancomicina. Método de Producción de Metabolito Los metabolitos de la fórmula 1 y 2 son producidos mediante el cultivo de la cepa LW1 07129 en un medio de fermentación tal como se describirá más adelante. Se inocula un cultivo de LW1 071 29 en un medio vegetativo y es crecido durante 48 horas a una temperatura de 30°C agitando a 250 rpm. Se utilizan 60 mililitros de este primer cultivo de etapa madura para inocular un segundo cultivo vegetativo de un medio vegetativo de un litro en un envase de cultivo de 2 litros. Este cultivo es incubado a una temperatura de 30°C durante 48 horas agitando a 195 rpm. Se utiliza la segunda siembra de etapa madura para inocular 70 litros del medio en un envase de fermentación de tanque agitado, tal como se describen en el ejemplo 1 . La producción de los compuestos de la fórmula 1 y 2 puede seguirse durante la fermentación probando extractos del caldo de cultivo. Un método preferido para seguir la producción es el análisis de los extractos del caldo de cultivo mediante cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC). En el ejemplo 2 se describe un sistema adecuado para el análisis.

EJ EMPLO 1 Preparación de Metabolitos a través de Fermentación Los metabolitos de la fórmula 1 y 2 son producidos mediante el cultivo de la cepa LW1 07129 en un medio de fermentación tal como se describirá más adelante. Se descongeló 1 -mL de cultivo vegetativo congelado de LW107129, se inoculó en 1 00 mL de un medio vegetativo en un frasco Erlenmeyer de 500 mililitros y creció a una temperatura de 30°C agitando a 250 rpm durante 48 horas. Medio Vegetativo Ingediente Cantidad (g) Dextrosa 9.0 Caldo de Soya de Tripticasa 30.0 Extracto de Levadura 3.0 Sulfato de Magnesio. 7 H2O 2.0 Agua desionizada 1000.0 Se utilizaron 60 mililitros de este primer cultivo vegetativo de etapa madura para inocular un segundo cultivo vegetativo de un litro de medio vegetativo en un envase de 2 litros de cultivo. Este cultivo se incubó a una temperatura de 30°C durante 48 horas agitando a 1 95 rpm. La segunda siembra de etapa madura se utilizó para inocular 70 litros del medio de fermentación en un envase de fermentación de tanque agitado.

Medio de Fermentación (por litro de agua) Ingrediente Cantidad (g) Harina de Frijol Soya 5.0 Dextrosa 10.0 Glicerina 10.0 Almidón Soluble 5.0 Dextrina de Papa 20.0 Molasas 10.0 Extracto de Maíz 5.0 Carbonato de Calcio 3.0 Ácido Fítico 1.0 Sulfato de Magnesio 0.5 Cloruro Férrico. 4 H2O 0.1 Cloruro de Zinc 0.1 Cloruro de Manganeso. 4 H2O 0.1 Se mantuvo la fermentación a una temperatura de 30°C, a 400 rpm durante de 7 a 12 días. Se pudo extractar una jarra de fermentación madura con un solvente adecuado y se pudieron recuperar los metabolitos mediante formación de sal y/o separación cromatográfica. EJEMPLO 2 Método de Ensayo HPLC El siguiente método HPLC es útil para monitorear la fermentación para producir los compuestos de la fórmula 1 y 2: Agregaron volumen de etanol desnaturalizado igual al de una alícuota de caldo de cultivo de fermentación . Agitar la mezcla y dejarla asentar durante un mínimo de una hora. Centrifugar la muestra para remover los restos de las células residuales, posteriormente microfugar una alícuota de 1 ml . El extracto clarificado posteriormente es analizado mediante el siguiente sistema HPLC. Sistema HPLC: IAAA&Á »-* - '- a ->»--_., Fase de columna estacionaria: columna de 250- x 4.6 mm , gel de sílice desactivado en la base 5-pm C8 (Hypersil-C8-BDS). Fase Móvil: El gradiente lineal de acetato de amonio 10mM-metanol-acetonitrilo resume a continuación: Porcentaje Porcentaje Tiempo (minutos) Solvente A Solvente B 0 100 0 20 0 100 25 0 100 30 100 0 35 100 0 en donde el solvente A es acetato de amonio 1 0 mM y el solvente B es metanol-acetonitrilo ( 1 : 1 ) Rango de flujo: 1 mL/min Detección: UV a 250 nm Tiempos de retención de los factores principales son tal como se resume a continuación: Compuesto Tiempo de Retención (minutos) 7 24.6 1 24.2 3 23.7 12 22.9 15 22.8 18 22.6 8 22.5 17 22.2 13 21.6 14 21.4 19 20.2 20 19.3 21 (tanto C24-epímeros) 16.2 EJEMPLO 3 Aislamiento de Metabolitos Insecticidamente Activos del Caldo de Cultivo El siguiente ejemplo muestra como se aislaron la mayor abundancia de compuestos de la fórmula 1 de un lote típico de LW107129 cultivado. El ejemplo proporciona procedimientos específicos utilizados para aislar los compuestos 1 , 3, 7, 8, 12, 13, 14, 1 5, 1 7, 18, 19, 20, y 21 . Los compuestos 2, 4, 5, 6, 9, 10, 1 1 , 1 6, 22 y 23 al 31 , producidos mediante el organismo en menor abundancia que los compuestos descritos anteriormente, fueron aislados utilizando métodos muy similares aplicados para lotes más grandes de extracto de caldo de cultivo. Debido a que los métodos son tan similares y familiares para un experto en la materia, no se describirán en detalle. El cultivo total, por ejemplo células más caldo, procedente de la fermentación de 5 litros de un medio inoculado, tubo un volumen total de aproximadamente 3.5 litros después de que se completó la fermentación . Esta muestra fue extractada con un volumen igual de etanol desnaturalizado agitando vigorosamente, y permitiendo después que se asentara a temperatura ambiente durante 2 horas. Los restos celulares fueron removidos mediante centrifugación y se dividieron los 7 litros de 50% de extracto de etanol acuoso utilizando diclorometano (DCM: 2 x 7 litros). El extracto DCM fue concentrado para producir un aceite amarillo pálido (3.3g). El aceite fue disuelto en metanol y dividido en dos alícuotas iguales, cada una de las cuales fue cromatografíada en una columna (4 x 15cm; 32-63 pm; Biotage, Inc. , E. U.A. ) de gel de sílice. Cada columna fue eluída a 20mL/min utilizando el siguiente gradiente solvente lineal, 1-i-A-? -i ??? i-fe-á-a--,*-»-*^ j.-S-«-?l-M----. . — ----_....,..< -. ^.A^------. posteriormente fue enjuagada con una alícuota final de solvente G (1 00mL): Tipo y porcentaje del solvente Tiempo A B C D E F G (Minutos) 0 100 0 0 0 0 0 0 10 0 100 0 0 0 0 0 15 0 50 50 0 0 0 0 20 0 50 50 0 0 0 0 20.01 0 0 0 100 0 0 0 30 0 0 0 0 100 0 0 40 0 0 0 0 0 100 0 50 0 0 0 0 0 0 100 70 0 0 0 0 0 0 100 Fracciones (30 sec; 1 0mL cada una) fueron recolectadas a lo largo de la elución. Éstas fueron analizadas mediante HPLC de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 2, posteriormente las fracciones procedentes de cada perfil de la columna de gel de sílice que contiene los componentes de polaridad similar, fueron reunidas tal como sigue: En donde las composiciones solventes (% por volumen) fueron como se indica: A B C D E F G hexano 100% 99.5% tolueno 100% 50% 99.5% etilo 50% 99.5% 70% acetato metanol 20% agua 9.5% dietilamina 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% Éstas fracciones reunidas fueron secadas bajo vacío y disueltas nuevamente en metanol antes de la fracción adicional tal como se describe más adelante.

Números de Fracción Identificador 92-97 SI-1 104-112 SI-2 114-120 SI-3 121-140 SI-4 florecimiento SI-5 5 Las alícuotas de la fracción SI-1 fueron aplicadas a una columna (250 x 1 0mm; tamaño de partícula 8pm) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8). La muestra aplicada fue cromatografíada en acetato de amonio (I OmM)-metanol-acetonitrilo (30:35:35), eluyendo a 3mL/min, recolectando 0.75-mL de fracciones. Las fracciones que 10 contienen el compuesto 1 7 fueron reunidas y concentradas para secado, para proporcionar 14.9mg del Compuesto 1 7 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 18 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 1 .4mg del Compuesto 18 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 1 2 fueron reunidas y concentradas para secado, 15 para producir 4.2mg del Compuesto 1 2 puro. Las al ícuotas de la fracción SI-2 fueron aplicadas a una columna (250 x 1 0mm; tamaño de partícula 8pm) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8). La muestra aplicada fue cromatografiada utilizando el gradiente lineal de acetato de amonio ( I OmM)-metanol- 20 acetonitrilo especificado más adelante, eluyendo a 3mL/min , recolectando 0.75-mL de fracciones. 25 Tiempo (min) Porcentaje Porcentaje Solvente A Solvente B 0 60 40 5 60 40 25 0 100 30 0 100 32 60 40 40 60 40 A=acetato de amonio 10mM B=metanol-acetonitrilo (1:1 ) Las fracciones que contienen el Compuesto 20 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 1 1 .5mg del Compuesto 20 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 19 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 3.9mg del Compuesto 1 9 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 14 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 2.0mg del Compuesto 14 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 1 3, fueron reunidas y concentradas para secado para producir 4.9mg del Compuesto 13 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 1 5 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 2.3mg del Compuesto 1 5 puro. Las fracciones que contienen los dos isómeros 24-epiméricos del compuesto 21 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 15mg de una mezcla de los dos. Ésta mezcla fue disuelta en metanol y aplicada a una columna (250 x 10mm; tamaño de partícula 8pm) de gel de sílice de fase inversa (Hypersil-BDS-C8). La muestra aplicada fue cromatografiada en acetato de amonio ( 1 0mM)-metanol-acetonitrilo (85:7.5:7.5), eluyendo a 3mL/min, recolectando 3-mL de fracciones. Las fracciones que contienen el Compuesto 21 #1 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 9.8mg del Compuesto 21 #1 tiá-J-ii..-.---* .íf¿?t , puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 21 #2 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 4.7mg del Compuesto 21 #2 puro. La fracción S I-3 reunida fue disuelta en metanol y cromatografiada en una columna (4 x 7cm; 32-63pm; Biotage, Inc. , E. U .A.) de gel de sílice. La columna fue eluída a 20mL/min utilizando las siguientes condiciones de gradiente: Tiempo (min) Porcentaje Porcentaje Solvente A Solvente B 0 100 0 5 100 0 15 60 40 25 0 100 40 0 100 A=hexano-dietilamina (99.5:0.5) B=hexano-isopropanol-dietilamina (75:25:2) Se recolectaron fracciones de (80 x 0.5min; 1 0mL) y se reunieron y concentraron 46-50 para secado. La muestra seca fue disuelta en metanol y aplicada a una columna (250 x 10mm; tamaño de partícula 8Om) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C-8). La muestra aplicada fue cromatografiada en acetato de amonio ( I OmM)-metanol-acetonitrilo (20:40:40), eluyendo 3mL/min, recolectando 0.75-mL de fracciones. Las fracciones que contienen el Compuesto 1 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 24.3mg del Compuesto 1 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 7 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 1 .5mg del Compuesto 7 puro. Se disolvió la fracción SI-4 reunida en metanol y se aplicó a una columna (250 x 10mm; tamaño de partícula 8pm) de gel de sílice de fase «áétu?^btk t^ l^Z^hm A*. inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8). La muestra aplicada fue cromatografiada en el siguiente sistema de elución de gradiente lineal, en un rango de flujo de 5mL/min, recolectando 88 x 1 .25mL de fracciones: Tiempo (min) Porcentaje Porcentaje Solvente A Solvente B 0 100 0 20 0 100 25 0 100 30 100 0 35 100 0 A=acetato de amonio 10mM B=metanol-acetonitrilo (1 :1) Las fracciones que contienen el Compuesto 1 crudo reunidas y concentradas para secado, fueron como las fracciones que contienen el Compuesto 8. Las fracciones reunidas, secas anteriores fueron disueltas cada una en metanol y cromatografíadas nuevamente en una columna (250 x 1 0mm; tamaño de partícula 8pm) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8). Las muestras fueron eluídas utilizando acetato de amonio ( 1 0mM)-metanol-acetonitrilo (20:40:40), eluyendo a 3mL/min , recolectando 0.75-mL de fracciones. Las fracciones que contienen el Compuesto 8 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 5.8mg del Compuesto 8 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 1 , fueron reunidas y concentradas para secado para producir 7.3mg adicionales del Compuesto 1 puro. La fracción de enjuague de columna seca SI-5 fue disuelta en metanol y aplicada a una columna (250 x 1 0mm; tamaño de partícula 8pm) de gel de sílice de fase inversa C-8 8Hypersil-BSD-C8). La muestra aplicada fue cromatografiada en acetato de amonio (I OmM)-metanol- -tt.-_tfc-ti-.a-i_-. " «tet-fe-A-» ,-.__jJi--.- É-it e---t- i..i acetonitrilo (20:40:40), eluyendo a 3mL/min, recolectando 0.75-mL de fracciones. Las fracciones que contienen el Compuesto 7 fueron reunidas y concentradas para secado para producir 3.5mg del Compuesto 7 puro. Características Espectroscópícas Las estructuras químicas de los componentes nuevos fueron determinadas mediante métodos espectroscópicos, incluyendo espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), espectometría de masa (SM), espectroscopia ultravioleta (UV) y mediante la comparación de la espinosina A y D y análogos relacionados. Los siguientes párrafos describen las propiedades espectroscópicas de los componentes descritos anteriormente. En ésta descripción, se proporciona un análisis detallado de las propiedades espectroscópicas del Compuesto 1 . Posteriormente, esto es seguido de una descripción de las características espectroscópicas de los otros componentes relacionados, permitiendo a un experto en la materia concluir la estructura qu ímica mediante comparación con los datos del Compuesto 1 . Para la conveniencia del lector, el siguiente diagrama del Compuesto 1 proporciona las designaciones de posición de todos los datos espectrales RMN para los factores naturales presentados a continuación: ftf-- . ...-Ufc. ¿J_ ---fa--^-» ->- -iÉ--^^ - • • - - .--.-. - • - El Compuesto 1 tuvo las siguientes características: Peso molecular: 757 Formula molecular: C 3H67NO?o UV (mediante detección de formación de diodos durante el análisis LC, solvente=metanol-acetonitrilo (1 : 1 )): 244nm Electrorocío MS: m/z para >M + H=+=758.5; ion de fragmento de azúcar de forosamina a m/z 142.1 . ESI-MS exacto: m/z para >M + H=+=758.4845+/-0.0007 (teoría: 758.4843). La tabla I I resume los datos espectrales RMN de 1 H Y 13C para el Compuesto 1 en CDCL3. TABLA II Datos de Cambio Químico del Compuesto 1 Los cambios químicos son referenciados para TMS a Oppm. ?? , ... J.Ji-t-Ht,-U-.»-t .-..I.ÍíÉi---_, -.j-te-HÉ-u .

La distinción de las características espectroscópicas RMN de otros metabolítos fueron como se indica a continuación: Los espectros RMN de estructuras que tienen la estructura de macrólido base del Compuesto 7 fueron ejemplificados por la ausencia de las señales de protón a 5.8 y 5.7ppm, y por la presencia de una nueva resonancia olefínica a 5.5ppm. Además, una resonancia de metilo a 1 .7ppm indicó la presencia de un grupo metilo olefínico. Los espectros RMN de las estructuras que tienen la estructura de macrólido base de Compuesto 8 fueron ejemplificados por un número de características. H-8 apareció como un duplicado a 4.1 5ppm, y H-9 apareció a 4.1 ppm (dd). No existió un acoplamiento medible constante entre H-8 y H-9. La señal de H-1 1 movió el campo descendente a 1 .5ppm. Se indicó hidroxilación en C-24 en cualesquiera de éstas estructuras 21 -butenilo mediante un cambio de campo descendente tanto de H-24 como de H-25, los cuales aparecieron como un múltiplo y triplicado, respectivamente. De manera concurrente, H-23 cambió a un duplicado doble. Los espectros RMN de estructuras que tienen la estructura de macrólido base del Compuesto 1 1 fueron ejemplificados mediante la adición de resonancias olefínicas a 5.1 , 5.25 y 5.6ppm, con patrones de acoplamiento consistentes con un grupo olefína terminal . Además, estuvo ausente la señal indicativa de un grupo metilo alifático terminal a 0.9-1 .0ppm. Los espectros RMN de compuestos que tienen estructura de macrólido base del Compuesto 1 6 fueron ejemplificados mediante el cambio de campo descendente de H-24 t el colapso de la estructura triplicada a un duplicado en aproximadamente 1 .4ppm. En estos casos, H-23 cambió a un duplicado de cuartetos, y el iik^- •-*«* i ittr vii-MÉ-r análisis de un espectro 2D COSY indicó el acoplamiento de éste duplicado a otro protón olefínico, indicando la presencia de un grupo propenilo. Los espectros RMN de compuestos que tienen estructura de macrólido base el Compuesto 23, fueron ejemplificados por la ausencia de los protones olefínicos de butenilo y se distinguieron de las epinosinas conocidas previamente mediante la examinación de experimentos de 2D COSY y TOCSY. El análisis de la trayectoria de acoplamiento que surge de H-25 indicó un grupo butilo de 4 carbonos conectados a C-21 . Las subestructuras glucósidas adheridas al oxígeno en C-1 7, fueron identificadas utilizando una variedad de experimentos RMN de 2 dimensiones. El triplicado de metilo H-25 y H-24 del macrólido de anillo expandido 31 , se asemejó al grupo etilo en la espinosina A. Además, H-21 movió el campo ascendente a 4.8ppm, en relación a su posición en el Compuesto 1 . Sin embargo, aún estuvieron presentes los protones olefínicos. Un espectro 2D COSY mostró que tanto el grupo etilo como el grupo la olefína estuvieron acoplados a H-21 indicando que el enlace doble en este compuesto estuvo dentro del anillo. Esto fue consistente con el hecho de que éste compuesto es un isómero del Compuesto 1 , con base en su peso molecular el cual es de 758, a partir del espectro de masa. En la tabla l l l que se encuentra a continuación, se muestra una lista de todos los metabolítos con el ion de aducto molecular observado en ESI-MS, del cual se dedujo el peso molecular: t Lá?É?ti???. a¿ t?f?ta?í'-" -»aa^---to-«-.

TABLA Compuesto No. Espectro de Masa Clave Datos1 (m/z) 1 758.5 [M+HJ+ 2 774.5 [M+H]+ 3 744.5 [M+H]+ 4 774.4 [M+HJ+ 5 744.8 [M+H]+ 6 744.8 [M+HJ+ 7 772.5 [M+H]+ 8 774.5 [M+H]+ 9 774.7 [M+H]+ 10 760.5 [M+H]+ 11 756.5 [M+H]+ 15 808.5 [M+NH4]+ 16 744.5 [M+H]+ 17 617.4 [M+H]+ 18 631.4 [M+H]+ 19 633.4 [M+H]+ 20 650.4 [M+NH4]+ 22 615.4 [M+H]+ 23 636.5 [M+NH4]+ 24 744.4 [M+H]+ 25 758.4 [M+H]+ 26 772.4 [M+H]+ 27 788.7 [M+H]+ 28 760.4 [M+H]+ 29 620.3 [M+NH4]+ 31 758.4 [M+H1+ 11ones de aducto molecular observados utilizando LC/MS con ionización de electrorocío. 2Dos isómeros, ambos tuvieron las mismas características MS.

Actividad Insecticida v Acaricida Los compuestos de la presente invención (diferentes a aquellos en donde R5 es H) son útiles para el control de insectos, ácaros y ??.?.?.i.iuiU^u?i ------ -te. oisé? ij garrapatas. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención está dirigido a métodos para inhibir un insecto, acaro, ó garrapata, en donde el método comprende aplicar al locus del insecto, acaro ó garrapata, una cantidad para inhibir insectos, ácaros ó garrapatas de un compuesto de la formula 1 ó 2 en donde R5 es un grupo que tiene una de las formulas de la 4a a la 4i . El "locus" del insecto, acaro ó garrapata se refiere al ambiente en el cual el insecto, acaro ó garrapata vive ó en donde sus huevos están presentes, incluyendo el aire que lo rodea, el alimento que come, u objetos con los cuales está en contacto. Por ejemplo, los insectos ó ácaros que ingieren plantas pueden ser controlados aplicando el compuesto activo a partes de la planta que comen ó habitan los insectos ó ácaros, particularmente el follaje. Por el termino "inhibir un insecto, acaro ó garrapata" se entiende que existe una disminución en el número de insectos, ácaros ó garrapatas vivos, ó una disminución en el número de huevos. La extensión de la reducción lograda por un compuesto depende, por supuesto, del rango de aplicación del mismo, el compuesto utilizado en particular, y la especie de insecto, acaro ó garrapata objetivo. Se debe utilizar al menos una cantidad para desactivar insectos, desactivar ácaros ó desactivar garrapatas. Por el termino "cantidad para desactivar" se entiende que se utiliza una cantidad del compuesto para causar una reducción medible en la población de insectos, ácaros ó garrapatas. Normalmente se utiliza de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1 ,000ppm (ó de 0.01 a 1 kg/acre) del compuesto.

Los compuestos muestro una actividad contra un número - de insectos, ácaros y garrapatas. Más específicamente, los compuestos muestran actividad contra miembros de insectos del orden de Lepidóptera, tales como gusano de polilla, parásito de algodón de tabaco, pijota de polilla y larva de col . Otros miembros típicos de éste orden incluyen, gusano de polilla sureño, larva de mariposa nocturna, polilla, polilla de harina India, rollos de hojas, larva de mazorca, larva de algodón , coleóptera de Europea, gusano de col importada, larva rosa, gusano de bolsa, oruga del este, larva de césped, gusano de polilla. Los compuestos también muestran actividad contra miembros del orden Coleóptera (los escarabajos y gorgojos tales como el escarabajo de papa de Colorado, los escarabajos de pepino manchados y rayados, escarabajo Japonés y gorgojos de cápsula) y Díptera (las moscas reales tales como la mosca domestica, mosquitos, moscas de fruta, mosca de establos y de cuernos y minerales de hojas). Los compuestos también muestran actividad contra miembros del orden de Hempitera (bichos reales, tales como bichos de plantas, bichos por malos olores y bichos, chinches, Homóptera, grillos), Siphonaptera (pulgas), Isoptera (termitas), y miembros de la Hymenoptera del orden Formicidae (hormigas). Los compuestos también muestran actividad contra ácaros y garrapatas del orden Acari, por ejemplo, el acaro de araña de dos manchas. Otros miembros típicos de este orden incluyen, parásitos de plantas tales como el acaro rojo de los cítricos, acaro rojo Europeo, acaro plano de los cítricos, y parásitos de animales tales como ácaros de sarna, acaro de la roña, acaro de la roña en las ovejas, acaro de los pollos, acaro de patas con piel escamosa, ácaros desplumadores y ácaros de folículos de perro. Las pestes antrópodas representativas específicas que pueden ser controladas por los compuestos actuales incluyen las siguientes: Amblyomma americanum (garrapata de estrella solitaria), Amblyoma maculatum (garrapata de la Costa del Golfo), Argas persicus (garrapata de aves de corral), Boophilus microplus (garrapata del ganado), Chorioptes spp. (ácaros de la sarna), Demodex bovis (ácaros del folículo del ganado), Demodex canis (ácaros de folículo de perros), Dermacentor andersoni (garrapata manchada de la Fiebre de las Montañas Rocallosas), Dermacentor variabilis (garrapata de perro Americano), Dermanyssus gallinae (ácaros de pollos), Ixodes ricinus (garrapata común de las ovejas), Knemidokoptes gallinae (ácaros desplumadores), Knemidokoptes mutans (ácaros de patas de piel escamosas), Otobius megnini (garrapata de las orejas), Psoroptes equi (garrapata de la roña), Psoroptes ovis (garrapata de la roña), Rhipicephalus sanguineus (garrapata de perro café), Sarcoptes scabiei (ácaros de la sarna), Aedes (mosquitos), Anopheles (mosquitos), Culex (mosquitos), Culiseta, Bovicola bovis (piojo que pica al ganado), Callitroga homnivorax (moscarda), Chrysops spp. (mosca del venado), Cimex lectularius (chiches de cama), Cochliomyia spp. (gusano tornillo), Ctenocephalides canis (pulgas de perro), Ctenocephalides felis (pulgas de gato), Culicoides spp. (mosca enana, jején, etc.), Damalinia ovis (piojo que pica a las ovejas), Dermatobia spp. (rezno), Gasterophilus haemorrhoidalis (larva de mosca de nariz), Gasterophilus intestinalis (larva de mosca común de caballo), Gasterophilus nasalis (mosca china), Glossina spp. (mosca tsetse), Haematobia irritans (mosca de cuernos, mosca de búfalos), Haematopinus asini (piojo de leche de caballo), Haematopinus eurysternus (piojo de ganado de nariz corta), Haematopinus ovillus (piojo del cuerpo), Haematopinus suis (piojo de marranos), Hydrotaea irritans (mosca de cabeza), Hypoderma bovis (mosca bomba), Hypoderma lineatum (mosca del talón), Linognathus ovillus (piojo del cuerpo), Linognathus pedalis (piojo de las patas), Linognathus vituli (piojo de ganado de nariz larga), Lucilia spp. (mosca de gusano), Melophagus ovinus, Musca spp. (mosca doméstica, mosca de cara), Oestrus ovis (larva de mosca de nariz), Pediculus spp. (piojo), Phlebotomus spp. (jején), Phormia regina (moscarba), Psorophora spp. (mosquito), Pthirus spp. (piojo), Reduvius spp. (chinche asesina), Simulium spp. (mosca negra), Solenopotes capilatus (piojo pequeño azul del ganado), Stomoxys calcitrans (mosca estable), Tabanus spp. (mosca del caballo), Tenebrio spp. (gusanos de alimento), Triatoma spp. (chinche besadora). Los compuestos son útiles para reducir las poblaciones de insectos, ácaros y garrapatas y son usados en un método para la inhibición de una población de insectos, ácaros o garrapatas el cual comprende la aplicación en un lugar del insecto, acaro o garrapata de una cantidad efectiva para inactivar los ácaros-insectos, o garrapatas de un compuesto activo de la invención. En una modalidad preferida, la presente invención se enfoca a un método para la inhibición de insectos susceptibles del orden Lepidóptera que comprende la aplicación a una planta de una _fr .? . íif11fffif-iif I .GT G ¡mi I I i?? Hiniff-t?i cantidad efectiva inactivadora de insectos de un compuesto activo de la invención. Otra modalidad preferida de la invención está enfocada en un método para la inhibición de moscas mordedoras del orden Díptera en animales el cual comprende la administración de una cantidad efectiva inhibidora de la peste de un compuesto, por administración oral , parenteral o tópica al animal . Otra modalidad preferida de la invención está enfocada a un método de inhibición de ácaros o garrapatas del orden Acariña el cual comprende la aplicación en un lugar del acaro o garrapata de una cantidad inhibidora de ácaros o garrapatas de un compuesto activo de la invención. Los compuestos aquí descritos no solamente son útiles en la producción de productos agrícolas, las sales de adición de ácidos de estos compuestos, en donde es posible también son productos útiles. Estas sales son útiles, por ejemplo, para separar y purificar los compuestos de la fórmula 1 y 2. Además, algunas de estas sales pueden tener una solubilidad en el agua aumentada. Las sales de adición de ácido pueden ser preparadas a partir de los compuestos descritos en la fórmula 1 en donde R5 es una molécula de azúcar que contiene nitrógeno básico tal como forosamina. Las sales de los compuestos son preparados utilizando tecnología estándar para la preparación de sales que es bien conocida para aquellos expertos en la técnica . Las sales de adición de ácido que son particularmente útiles incluyen , pero no están limitadas a, sales formadas mediante las reacciones estándar con tanto ácidos orgánicos como inorgánicos tales como ácido sulfúrico, clorhídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, cólico, üi i ii ii n üniin i i ÍJ---MH pamoico, múcico, glutámico, camfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, laurico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinámico y ácidos similares. Ejemplo 4 Selecciones de Insectos A. Pócima Neonata de Gusano del Tabaco (Heliothis virescens). Para comparar las actividades insecticidas de los compuestos de la fórmula 1 en las larvas neonatales (< 6 horas posteriores a la eclosión) del Heliothis virescens, se prepararon primero 1 Efcj/OL de solución de acetona de cada uno de los metabolitos. Las soluciones de acetona fueron diluidas entonces con H2O de Milliporo que contiene 0.025% de tensioactivo Tritón X-1 00 para producir tratamientos de 25 ó 50 ppm. Entonces se envasaron en pipetas un mililitro de cualquier concentración de cada uno de los metabolitos directamente y sobre un papel de filtro de calidad Whatman 1 diámetro 100 mm circular, sobre el cual habían sido colocadas suavemente las larvas neonatales del gusano de tabaco. Cada papel de filtro tratado y sus larvas asociadas fueron colocadas entonces en un plato de petri plástico desechable de 20mm X 100mm. Una hora después, se colocó una porción de 1 cm3 de dieta lepidoptera basada en agar (dieta Shorey modificada, Southland Products, Lake Village, AR) dentro de cada plato como una fuente de alimentación para las larvas. Los platos de petri fueron mantenidos en una temperatura de 27°C durante 24 horas y posteriormente se determinó el porcentaje de mortalidad de las larvas en cada tratamiento. Los resultados se presentan más adelante en la tabla IV.

B. Ensayo Tópico del Gusano de Remolacha (Spodootera littoralis). Una medición adicional de las actividades insecticidas relativas de los compuestos de la fórmula 1 fue generada utilizando una solución de 1 pg/pL de metanol de ca a compuesto aplicado en 1 EL por larva de Spodoptera littoralis, de laboratorio (peso promedio de 43 mg). Cada compuesto fue aplicado a lo largo del dorso de cada una de las seis larvas. Las larvas tratadas se mantuvieron durante cinco días a una temperatura de 21 °C, 60% RH en platos de cultivo de plástico de seis depósitos. Cada una de las larvas fueron suministradas con 1 cm3 de dieta lepidoptera basada en agar para mantenerlos durante un intervalo de 5 días posteriores a la exposición . El porcentaje de mortalidad fue determinado al final de un período de cinco días. Los resultados se presentan en la tabla IV. * -"^ff-F f t^' J?mi??U -.. ti.fo__.Afa TABLA IV Pócima Neonatal de Gusano de Remolacha Gusano de Tabaco Tópico (24 hrs.) ( 120 hrs.) índice Mortalidad índice Mortalidad Compuesto (ppm) (%) (ug arva) (%) 1 50 100 1 100 2 50 100 1 100 3 - NT 1 100 4 50 100 1 100 5 - NT NT 6 - NT NT 7 50 100 i 100 8 - NT 1 100 9 50 100 33 10 50 100 0 1 1 50 100 100 12 50 100 1 50 13 25 45 0 14 25 100 NT 15 25 100 67 16 50 100 100 17 25 10 0 18 25 0 0 19 25 93 0 20 25 20 0 21 No. 1 25 4 0 21 No. 2 25 7 1 0 23 - NT NT 24 50 100 1 50 25 50 100 1 1 7 26 50 100 1 100 27 50 100 1 100 28 50 100 1 1 7 29 - NT NT 30 - NT NT 31 50 100 1 100 Composiciones Insecticidas Los compuestos son aplicados en la forma de composiciones, los cuales también son una parte de la presente invención. Estas composiciones comprenden una cantidad inactivadora de insectos o ácaros o garrapatas de un compuesto de la invención en un vehículo inerte fitológicamente aceptable. El (los) ingrediente(s) activo(s) puede estar presente como un compuesto simple, una mezcla de dos o más compuestos o una mezcla de uno o más compuestos de la invención junto con la porción seca del medio de fermentación en el cual es producido. Las composiciones son preparadas de acuerdo con los procedimientos y fórmulas que son convencionales en la técnica del control de pestes o agrícola, pero los cuales son nuevos e importantes debido a la presencia de uno o más de los compuestos de la presente invención. Las composiciones pueden ser formulaciones concentradas las cuales son dispersadas en agua o pueden encontrarse en la forma de un polvo, carnada o formulación granular usada sin tratamiento adicional. Las dispersiones en las cuales son aplicados el material seco crudo o los compuestos generalmente son suspensiones o emulsiones acuosas preparadas a partir de las formulaciones concentradas de los compuestos o el material crudo. Las formulaciones solubles en agua o suspensión- agua o emulsificables ya sea sólidas, polvos que se pueden humedecer, o líquidos conocidos como concentrados emulsificables o suspensiones acuosas. Los polvos que se pueden humedecer pueden ser aglomerados o compactados para formar granulos dispersables en agua. Estos granulos comprenden mezclas del compuesto o el material crudo seco, vehículos inertes y tensioactivos. La concentración del compuesto o el material crudo seco, generalmente es entre aproximadamente 0.1 % a aproximadamente el 90% en peso. El vehículo inerte generalmente son arcillas de atapulgita, arcillas de montmorilonita, y tierras diatomacias o silicatos purificados.

Los tensioactivos comprenden generalmente de aproximadamente el 0.5% a aproximadamente el 1 0% del polvo que se puede humedecer, en donde los tensioactivos son generalmente ligninas sulfonadas, sulfonatos naftaleno condensados, los sulfonatos naftaleno, alquil-benenosulfonatos, alquilsulfonatos o tensioactivos no iónicos tales como aductos de óxido de etileno de alquilfenoles o mezclas de los mismos. Los concentrados emulsificables de los compuestos reivindicados se encuentran generalmente en un rango de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 gramos del compuesto por litro del líquido, equivalente a una cantidad de aproximadamente el 10% a aproximadamente 50%, disueltos en un vehículo inerte el cual es una mezcla de un solvente no miscible en agua y emulsifícadores. Los solventes orgánicos incluyen orgánicos tales como xilenos, y fracciones de petróleo tales como porciones naftalénicas y olefínicas de alta ebullición de petróleo las cuales incluyen nafta aromática y pesada. También se pueden utilizar otros compuestos orgánicos tales como derivados de rosina de solventes terpénicos, cetonas alifáticas tales como ciciohexanona y alcoholes complejos. Los emulsificadores para los concentrados que se pueden emulsificar generalmente son tensioactivos iónicos y/o no iónicos mezclados tales como aquellos mencionados en la presente descripción o sus equivalentes. Las suspensiones acuosas pueden ser preparadas conteniendo compuestos insolubles en agua de esta invención, en donde los compuestos son dispersados en un vehículo acuoso en una concentración que generalmente se encuentra en un rango de entre aproximadamente J?Aé??^^?tiik?.hti?it?^.^?ii 5% y aproximadamente 50% en peso. Las suspenciones son preparadas moliendo finamente el compuesto y mezclándolo vigorosamente dentro de un vehículo de agua, tensioactivos, y dispersantes tal y como se explicó anteriormente. Los ingredientes son inertes tales como las sales inorgánicas y las gomas sintéticas o naturales también pueden ser empleados para aumentar la densidad y/o viscosidad del vehículo acuoso, conforme sea deseado. Se pueden preparar precipitados con capacidad de fluir disolviendo la molécula activa en un solvente miscible en agua y tensoactivos o pol ímeros activos de superficie. Cuando estas formulaciones son mezcladas con agua, el compuesto activo se precipita con el tensoactivo controlando en tamaño del precipitado microcristalino resultante. El tamaño del cristal puede ser controlado a través de la selección de mezclas de polímeros y surfactantes específicos. Los compuestos también pueden ser aplicados en la forma de composiciones granulares que son aplicadas al terreno. La composición granular generalmente contiene de aproximadamente 0.5% a aproximadamente el 1 0% en peso del compuesto. El compuesto es dispersado en un vehículo inerte el cual generalmente es arcilla o una substancia equivalente. Generalmente, las composiciones granulares son preparadas disolviendo el compuesto en un solvente adecuado y aplicándolo a un vehículo granular el cual ha sido previamente formado para el tamaño de partícula deseado. El tamaño de partícula generalmente es entre aproximadamente 0.5 mm y 3 mm. Las composiciones granulares también pueden ser preparadas formando una t- ,..--... ,.^ .j^_i-»---a ,. dona o pasta del vehículo y el compuesto, secando la muestra combinada y moliendo la pasta al tamaño de partícula deseado. Los compuestos también pueden ser combinados con un solvente orgánico apropiado. El solvente orgánico es generalmente un aceite de petróleo blando que es ampliamente usado en la industria agrícola. Estas combinaciones generalmente son usadas en la forma de un rocío. Más generalmente, los compuestos son aplicados en la forma de una dispersión en un vehículo líquido, en donde el vehículo líquido es agua. Los compuestos también pueden ser aplicados en la forma de un aerosol. El compuesto es disuelto en un vehículo inerte, el cual es una mezcla de impulsor que genera presión. La composición del aerosol es empacada en un recipiente, en donde la mezcla es dispersada a través de una válvula atomizadora. Las mezclas de impulsores contienen ya sea halocarburos de baja ebullición los cuales pueden ser mezclados con los solventes orgánicos o suspensiones acuosas presurizadas con gases inertes o hidrocarburos gaseosos. La cantidad del compuesto aplicada al lugar de los insectos, ácaros y garrapatas no es crítica y puede ser fácilmente determinada por aquellos expertos en la técnica. Generalmente, la concentración es de aproximadamente 1 0 ppm a aproximadamente 5,000 ppm de los compuestos para proporcionar el control deseado. Para cosechas tales como frijol de soya y algodón, la cantidad de aplicación es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 kg/ha, en donde el compuesto es aplicado en una formulación de rocío de 5 a 50 gal/A. Los compuestos pueden ser aplicados en cualquier lugar habitado por un insecto, acaro o garrapata. Dichos lugares generalmente son cosechas de algodón , frijol de soya y vegetales, frutas y árboles de nueces, viñedos, casas o plantas ornamentales. Los compuestos de la presente invención también son útiles para el tratamiento de animales para controlar los artrópodos, es decir, insectos y arácnidos, los cuales son pestes en los animales. Estas pestes de artrópodos generalmente atacan a sus huéspedes en la superficie externa ("ecto"); los agentes que controlan dichas pestes son a los que nos referimos como "ectoparasiticidas". Todos los animales están sujetos al ataque de dichas pestes, por lo que los problemas son más severos entre los huéspedes vertebrados. Los seres humanos son huéspedes potenciales para muchos parásitos, y en áreas tropicales y en áreas con condiciones sanitarias mínimas, las infecciones por parásitos son un problema regular en la práctica médica. Los sujetos altamente expuestos al ataque de los parásitos son numerosos animales de las granjas tales como el ganado, ovejas, cerdos, cabras, búfalos, búfalos de agua, venados, conejos, pollos, pavos, patos, gansos, avestruces y similares. Los caballos y otros animales están sujetos a los ataques de los parásitos, como lo están el mink y otros animales criados por su piel, y las ratas, ratones y otros animales utilizados en los laboratorios y establecimientos de investigación . Los animales domésticos tales como los perros y los gatos están altamente sujetos al ataque de los parásitos, y debido a su relación cercana con los humanos, dichos parásitos implican problemas para los humanos con los cuales están asociados dichos animales. Los peces, crustáceos y otras especies acuáticas lili í il IIÉ lÜÉiihiiÉÜi-iiiTii r"— - • • , n T l? IÍ Ü-ri-JlÉ-M.. ¡1.1 r también están sujetas a los ataques de los parásitos. Brevemente, el parasitismo comprende como huésped esencialmente al rango completo de animales. El costo económico de las infestaciones ectoparasíticas es grande. En el reino del ganado, los animales sufren una eficiencia reducida de la alimentación y los índices de crecimiento. La leche y los productos de la lana sufren, y existe un daño para la lana, la piel y el pellejo. Los animales se hacen susceptibles a infecciones microbiológicas secundarias, y al ataque adicional de los parásitos. Los ectoparásitos también causan una incomodidad considerable aún cuando no son severamente dañinos para la salud y la producción . Aunque se encuentran en uso una cantidad de parasiticidas, ellos sufren de una variedad de problemas, incluyendo un espectro de actividad limitado, toxicidad ambiental, la necesidad de un tratamiento repetitivo y en muchos casos, la resistencia por parte de los ectoparásitos. Por lo tanto, existe una necesidad continua de nuevos ectoparasiticidas. Los compuestos de la invención proporcionan una herramienta nueva en el armamento para el control de los ectoparásitos. En esta modalidad , la presente invención está enfocada a un método para inhibir o aniquilar a una peste artrópoda en un animal huésped el cual comprende poner en contacto a la peste con una cantidad efectiva del compuesto de la presente invención . La actividad ectoparasiticida de los compuestos actuales es lograda cuando los compuestos se ponen en contacto con las pestes. El contacto puede ser con el huevo, la larva, y las etapas adultas u otras etapas de la vida. "Contacto" incluye la ingestión del compuesto por la peste. EJEMPLO 5 Ensayo de la Mosca Estable en Ratón/Adulto In vivo (ASF) En el día 0 del estudio, seis ratones de laboratorio blancos de 30 gramos (Mus Musculus) (de una edad de 8 a 10 semanas, hembras ICR, Harlan-Sprague-Dawley, Inc. , Indianapolis, IN .) por tratamiento fueron dosificados con el artículo de prueba o solvente (90% de oleato etílo/1 0% de DMSO), ya sea oralmente o tópicamente. En el día 1 del estudio, dos ratones de cada tratamiento fueron anestesiados con 0.25 ml de inyección intramuscular de una combinación de cetamina de 1 .0 ml (Fort Dodge, Ketaset®, HCl de cetamina en inyección, 100 mg/ml) y 1 .0 ml de xilazina (Bayer, Rompun®, 20 mg/ml inyectable) en 4.5 ml de agua estéril . Los ratones anestesiados fueron colocados en las cajas de moscas que contenían 30 moscas estables adultas. Los ratones anestesiados se dejaron en las cajas por un período de hasta 60 minutos, y se permitió que las moscas obtuvieran un alimento de la sangre sin perturbarlas. Después de la remoción de las cajas de moscas, los ratones inconscientes fueron eutanizados inmediatamente con CO2. Las cajas de moscas fueron expuestas a un ciclo de 12 horas día/12horas noche por el período completo del estudio. La temperatura en esta habitación de ensayo, fue de 68 a 72°F, y la humedad fue del 50 al 60%. Estos procedimientos se repitieron exactamente en los días 2 y 3 del estudio con los ratones tratados restantes. Cada día se registró el número de moscas muertas y fueron descartadas las cajas de moscas. El porcentaje ???Í . ^»é &»^ttd^^^2M*^-^^^« ^« jg ^ >,,¿^.¿ Jt total de mortalidad de las moscas fue determinado por cada tratamiento y comparado con la mortalidad de las moscas de un ASF alimentado continuamente, y ASF alimentado en los ratones de control tratados con solvente. Los resultados de los compuestos de prueba del 1 y 8 son los siguientes: EJ EMPLO 6 Ensayo In vitro de una Prueba de Empaque de Larvas de Garrapata (LPT) Los niveles titulados de los compuestos experimentales fueron disueltos en una combinación de aceite de oliva y tricloroetileno y envasados en pipetas en cuadros de papel de filtro de laboratorio. Después de permitir aproximadamente una hora para que se evaporara el tpcloroetileno, los papeles filtro fueron doblados en mitades y dos lados fueron asegurados con abrazaderas, formando paquetes. Aproximadamente se colocaron 1 00 larvas de garrapata (Amblyomma americannum) dentro de cada paquete, y el lado abierto restante fue asegurado con una abrazadera . Los paquetes fueron incubados durante 24 horas a una temperatura de aproximadamente 72°F y el 95% de humedad . Cada paquete fue abierto por separado y se determinó el número de larvas vivas y muertas. El porcentaje de mortalidad fue determinado por cada compuesto. Los resultados de los compuestos de pruebas 1 y 8 son los siguientes: EJEMPLO 7 Ensayo In vitro de Mosca Estable Adulta Se saturaron hilos dentales con suero con un contenido de los niveles titulados de los compuestos experimentales iniciando con 1 00 ppm . Los hilos dentales fueron colocados en platos de petri junto con 100 moscas estables adultas (Stomoxys calcitrans) previamente enfriadas para un manejo más fácil. El porcentaje de mortalidad fue determinado después de 24 y 48 horas de incubación a una temperatura de aproximadamente 25°C y una humedad del 75 al 85% cuando fueron comparados con los platos que contienen el hilo con el suero de control solamente. Los resultados de la prueba de los compuestos 1 y 8 son los siguientes: EJEMPLO 8 Ensayo In vitro de Moscarda en Larva Los insertos del filtro fueron colocados individualmente, en placas de microtitulación de 96 depósitos. Cada inserto fue saturado con suero bovino combinado con los niveles titulados de los compuestos experimentales iniciando con 1 00 ppm . Se colocaron aproximadamente 30 moscardas en larva (Phormia regina) en cada depósito, y la placa t i in n i i intriii i i-nüMil ¡gi g, ¿L.- *M-*- Al. completa fue sellada. Las placas fueron incubadas hasta por 48 horas de incubación a una temperatura de aproximadamente 25°C y una humedad del 75 al 85%, después de lo cual se determinó la eficacia mediante la inspección visual del movimiento de las larvas de cada depósito. Los resultados de las pruebas de los compuestos 1 y 8 son los siguientes (ambos compuestos fueron activos arriba de 5 ppm): "A" indica la mortalidad indicada por la ausencia de movimiento de las larvas. "N" indica que se observó el movimiento de la larva. Las técnicas para administrar los ectoparasiticidas son bien conocidas para aquellos expertos en el arte. En general , el compuesto presente es aplicado a la superficie exterior de un animal, por medio de la cual se ponen en contacto las pestes ya presentes en el huésped así como aquellas que lleguen al cuerpo del huésped dentro del período de eficacia del compuesto. Generalmente, el compuesto es generado en una formulación l íquida la cual es rociada sobre la superficie del animal o vertida sobre la superficie del animal. Otro tratamiento convencional es una "inmersión" en donde el ganado es tratado siendo sumergido substancialmente en una solución diluida de un ectoparasiticida . Para algunos huéspedes y pestes, la formulación puede ser en polvo, el cual es salpicado sobre el huésped , o un shampoo o crema el cual es empleado para bañar al animal. También se emplean collares en gatos y ! t perros como medio de administracié? de un ectoparasiticida directamente a la superficie del animal . En otra modalidad, los compuestos de la invención pueden ser administrados a los animales utilizando etiquetas de los oídos, un método de administración descrito en la Patente Norteamericana No. 4,265,876. En otra técnica, un ectoparasiticida es aplicado en los lugares frecuentados por los animales, de modo que las pestes se ponen en contacto de este modo con el compuesto aún en la forma de una aplicación directa a un huésped . La aplicación al lecho de la mascota es bien conocida, ya que es la aplicación para el alfombrado. Para el ganado, las bolsas de polvo son bien conocidas. Éstas son colocadas en una entrada de una puerta en donde inevitablemente se frota el ganado contra la bolsa y las pestes son puestas en contacto por el compuesto presente. Todavía en otra modalidad, los compuestos presentes pueden ser utilizados para controlar las pestes antrópodas en las feces del ganado y otros animales. En esta modalidad, los compuestos son administrados oralmente, y el compuesto viaja a través del aparato intestinal y emerge en las feces. El control de las pestes en las feces protege indirectamente a los animales de las pestes. Los compuestos son formulados para utilizarse como ectoparasiticidas de los modos conocidos por aquellos expertos en la técnica. En general , una formulación incluirá un compuesto de la presente invención, y uno o más adyuvantes fisiológicamente aceptables. Las formulaciones incluyen versiones concentradas, en las cuales el agente activo presente se encuentra en una concentración de aproximadamente 0.001 a 98.0 por ciento, siendo el contenido restante los vehículos fisiológicamente aceptables. Dichas formulaciones, especialmente aquellas con menos del 50% del compuesto presente, algunas veces pueden ser usadas directamente, pero estas formulaciones también pueden ser diluidas con otros vehículos fisiológicamente aceptables para formar formulaciones de tratamiento más diluidas. Estas últimas formulaciones pueden incluir el agente activo en concentraciones menores de aproximadamente 0.001 a 0.1 por ciento. Los compuestos de la invención también son útiles como farmacéuticos humanos para controlar los parásitos, por ejemplo, los piojos. Los compuestos pueden ser utilizados, por ejemplo, en las formulaciones para el control de los piojos que son descritas en el documento WO 00/01 347. La Anoplura o piojo de leche son parásitos encontrados casi en todos los grupos de mamíferos. De las 1 5 familias reconocidas de Anoplura, dos familias, la Pediculidae y la Pthiridae, tienen especies que se encuentran en los humanos Pediculus humanus es la única especie de la familia Pediculidae que infecta a los humanos. Está incluye un piojo de cabeza, Pediculus humanus capitis; y el piojo del cuerpo o la ropa, Pediculus humanus humanus, algunas veces llamado Pediculus corporis. El piojo ladilla, Pthirus pubis, es una especie distinta, y es el único miembro de la familia Prhiridae que infecta a los humanos. Tal y como se usa en la presente descripción, el término "piojos o piojo humano" incluye un miembro del Pediculus humanus o Pthirus pubis. ni Por consiguiente, en uno de sus aspectos, la invención proporciona formulaciones pediculicidas/ovicidas (anti-piojo) para controlar la infectación por piojos en un humano que comprende como ingrediente activo una espinosina, o un derivado fisiológicamente aceptable o sal del mismo, y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las formulaciones especialmente útiles de la presente invención, son formulaciones para el cuidado del cabello. Las formulaciones para el cuidado del cabello especialmente útiles son shampoos. La presente invención también proporciona métodos para usar estas formulaciones para controlar las especies de piojos humanos. Estas formulaciones y métodos controlan los piojos de una manera más efectiva y segura que las formulaciones y métodos anti-piojos anteriormente conocidos. Las formulaciones anti-piojos de la presente invención pueden ser formuladas de diferentes maneras. Las formulaciones particularmente útiles son shampoos, acondicionadores y lociones del tipo que se describen en el documento WO 00/01 347. Cuando son usados en una formulación de shampoo, formulación de acondicionador de cabello o loción, el componente de espinosina está presente en un nivel de aproximadamente el 0.1 % aproximadamente el 30%, preferentemente de aproximadamente el 1 % aproximadamente el 10%. Con respecto a la actividad anti-piojos, las modalidades específicas de la invención incluyen las siguientes: A. Una formulación para controlar una infestación por piojos en un humano que comprende como ingrediente activo un compuesto de la fórmula 1 ó 2 en donde R5 es un guipo que tiene una de las fórmulas del 4a al 4i, o un derivado fisiológicamente aceptable o sal del mismo, y un vehículo fisiológicamente aceptable. B. Una formulación de la modalidad A que se encuentra en una formulación para el cuidado del cabello. C. Un shampoo pediculicida que comprende: (a) de aproximadamente 0.1 % aproximadamente el 30% de un compuesto de la fórmula 1 ó 2 en donde R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas del 4a al 4i, o un derivado fisiológicamente aceptable o sal del mismo; (b) de aproximadamente el 5% aproximadamente el 30% de un tensioactivo sintético; (c) de aproximadamente el 1 % aproximadamente el 7% de una amida; y (d) agua. D. Un shampoo de la modalidad C en donde el tensioactivo sintético es aniónico, anfotérico, catiónico, zwiteriónico, o no-iónico, o mezclas de los mismos. E. Un shampoo de la modalidad D en donde la amida es monoetanolamida de coco, dietalonamida de coco, o una mezcla de los mismos. F. Un shampoo de la modalidad D el cual comprende adicionalmente desde el 1 % aproximadamente el 1 0% de un material de silicona no volátil.

G. Un shampoo de la modalidad F en donde la silicona no volátil es un siloxano polialquilo, siloxano polialquilarilo, co-polímero poliéter siloxano, o una mezcla de los mismos, cuya viscosidad es de aproximadamente 100 centipoises aproximadamente 150,000,000 de centipoises a una temperatura de 25°. H . Un shampoo de la modalidad G que comprende adicionalmente desde aproximadamente el 0.5% aproximadamente el 5% de un agente de suspensión seleccionado del grupo consistente de materiales anfifílicos cristalinos que tienen estructuras similares a agujas o plaquetas, materiales polímericos, arcillas, óxidos de metal ahumado, y mezclas de los mismos. I . Un shampoo de la modalidad H en donde el agente de suspensión es un material anfifílico cristalino seleccionado del grupo consistente de derivados acilo C?ß-C22 de cadena larga, alcanolamida Ci6-C22 de cadena larga de ácidos grasos y mezclas de los mismos. J . Un shampoo de la modalidad I en donde el agente de suspensión es un diéster de etilénglicol. K. Un shampoo de la modalidad D en donde la cantidad de espinosina, o derivado o sal de la misma, se encuentra en un nivel de aproximadamente 0.25% aproximadamente 1 .5%. L. Un método para controlar una infestación por piojos en un humano el cual comprende la administración tópica de una formulación de la modalidad A al humano. M. El método de la modalidad L en donde la infestación por piojos es Pediculus humanus capitis. ^^ &^ . toÍ. ? N. El método de la modalidad L en donde la infestación por piojos es Pediculus humanus humanus. O. El método de la modalidad L en donde la infestación por piojos es Pthirus pubis. P. Un método para tratar el cabello de un humano para aniquilar y facilitar la remoción de los piojos o sus huevos el cual comprende los pasos de: (a) aplicar de aproximadamente 1 0g aproximadamente 30g de una formulación que comprende un compuesto de la fórmula 1 ó 2 en donde R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas del 4a al 4i, o un derivado o sal fisiológicamente aceptable del mismo, y un vehículo fisiológicamente aceptable para humedecer el cabello; (b) hacer trabajar la formulación a través del cabello y el cuero cabelludo; (c) dejar la formulación en el cabello y cuero cabelludo por un período de aproximadamente 6 a 10 minutos; (d) remover la formulación del cabello enjuagándolo con agua. Q. el uso de un compuesto de la fórmula 1 ó 2, en donde R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas del 4a al 4i, o un derivado o sal fisiológicamente aceptable del mismo, o una formulación que contiene cualquier entidad para la fabricación de un medicamento para el control de los piojos en un humano. - --á-i--t -i------. _á .| ---

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula (1) ó (2): o una sal del mismo, en donde R1 es un grupo de la fórmula 2a, 2b, ó 2c R3 es H ó CH3; R4 en la fórmula 1 es 1-butenilo, 1,3-butadienilo, n-butilo, 3-hidroxi-1- butenilo ó 1-propenilo; R4 en la fórmula 2 es etilo; y R5 es H o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas del 4a al 4i

2. Un compuesto de la reivindicación 1 o una sal del mismo, en donde R5 es un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas del 4a al 4i

3. Una composición insecticida o acaricida la cual comprende una cantidad inactivadora del insecto, acaro o garrapata de un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 2 en combinación con un vehículo fitológicamente o fisiológicamente aceptable. ._>..-.-- t g..--- -t-,..«-.--»>---j.il

4. Un método insecticida o acaricida el cual comprende la aplicación al lugar de un insecto, acaro, o garrapata de una cantidad inactivadora de un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 2.

5. Un método de protección de un lugar de la infestación por insectos, ácaros, o garrapatas el cual comprende la aplicación al lugar de un insecto, acaro o garrapata de una cantidad inactivadora de un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 2.

6. Un método para controlar una población de parásitos que infectan a un animal huésped el cual comprende la administración al animal huésped de una cantidad parasiticida de un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 2.

7. Una formulación para controlar la infestación por piojos en un humano la cual comprende como ingrediente activo un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 2, o un derivado o sal fisiológicamente aceptable del mismo, y un vehículo fisiológicamente aceptable.

8. El uso de un compuesto de la fórmula 1 ó 2, o un derivado o sal fisiológicamente aceptable del mismo, o una formulación que contiene cualquier entidad para la fabricación de un medicamento para el control de los piojos en un humano.

9. Un proceso para la preparación de un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 1 , el cual comprende el cultivo de especies Saccharopolyspora NRRL 30141 , o una cepa derivada de las mismas que produce un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 1 , en -^---..-^0,..--,,,^ ^-^ .^.t ,,¡.^1,^--*-------. r-*t-*1 ' un medio de cultivo adecuado bajo condiciones de fermentación sumergida aeróbica hasta que es producida una cantidad recuperable del compuesto tal y como se describe en la reivindicación 1 , y la recuperación de un compuesto tal y como se describe en la reivindicación 1 del medio de cultivo.

10. Un cultivo biológicamente puro de la especie Saccharopolyspora NRRL 30141 o una cepa derivada del mismo que produce un compuesto tal y como se describe 1 .