ES2228605T3 - Macrolidos pesticidas. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula (1) ó (2): **(Fórmulas)** o una de sus sales, en la que R1 es un grupo de fórmula 2a, 2b, o 2c **(Fórmulas)** R2 es H u OH; R3 es H o CH3 R4 en la fórmula 1 es 1-butenil, 1, 3-butadienil, n-butil, 3-hidroxi-1-butenil, o 1-propenil; y R4 es etilo en la fórmula 55 y R5 es H o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas 4a a 4i **(Fórmulas)**

Description

Macrólidos pesticidas.

Esta invención se refiere a una nuevo grupo de productos pesticidas naturales, y a una nueva especie Saccharopolyspora que produce los compuestos.

El producto de fermentación A83543 es una familia de compuestos, a los que se denomina espinosinas, que producen ciertas variedades de Saccharopolyspora spinosa. Las espinosinas producidas de forma natural previamente descritas tienen un sistema de anillo 5,6,5-tricíclico condensado a una lactona macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutro (ramnosa) y un amino-azúcar (forosamina) (véase Kirst et al. (1991)). Las espinosinas conocidas se han denominado como factores o componentes y se le ha dado a cada uno una designación de letra de identificación, es decir espinosina A, B, etc. Los compuestos son útiles para el control de arácnidos, nematodes e insectos, en particular especies Lepidóptera y Díptera, y son bastante amigos del medio ambiente y tienen un perfil toxicológico interesante.

La patente de EE.UU. nº 5.362.634 y la Solicitud de Patente Europea correspondiente nº 375316 A1 describen espinosinas A, B, C, D, E, F, G, H y J. La patente internacional WO 93/09126 describe espinosinas L, M, N, Q, R, S y T. La patente internacional WO 94/20518 y la patente de EE.UU. 5.6704.486 describe las espinosinas K, O, P, U, V, W e Y y sus derivados.

Se han realizado un gran número de modificaciones sintéticas a compuestos de espinosina, como se describe en la patente internacional WO 97/00265, pero no ha sido factible la modificación de espinosinas en la posición C-21. La posición C-21 de los compuestos conocidos se sustituye con metilo o etilo. Si se pueden encontrar medios para introducir un grupo funcional reactivo en lugar del grupo metilo o etilo sin provocar cambios no deseados en otras porciones de la molécula, se abriría el camino para la síntesis de muchos compuestos adicionales de espinosina. Esta ha sido una larga búsqueda y previo objetivo no realizado de los que trabajan en el campo de la síntesis de espinosina.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una variedad aislada de una nueva especie de Saccharopolyspora designada LW107129 (NRRL 30141).

La invención también proporciona compuestos que pueden producirse por cultivo de LW107129 en un medio de cultivo adecuado que tienen la fórmula general siguiente 1 ó 2:

1

en la que

R1 es un grupo de fórmula 2a, 2b, o 2c

2

R2 es H u OH;

R3 es H o CH3;

R4 en la fórmula 1 es 1-butenil, 1,3-butadienil, n-butil, 3-hidroxi-1-butenil, o 1-propenil; y R4 es etilo en la fórmula 2;

y R5 es H o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas 4a a 4i

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3

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6

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En la tabla I se identifican los compuestos específicos de fórmula 1 ó 2 que se han preparado y aislado mediante cultivo de la variedad Saccharopolyspora LW107129.

TABLA I

7

Todos los componentes enumerados en la Tabla I son estructuralmente distintos de las espinosinas previamente conocidas debido a que, en relación al grupo R4, los compuestos de espinosina conocidos previamente no tenían un grupo 1-butenilo, 3-hidroxi-1-butenilo, 1,3-butadienilo, 1-propenilo, o n-butilo en la posición C-21 del macrólido. Además, algunos de los compuestos de la Tabla I difieren de todas las espinosinas conocidas previamente en que, con referencia al grupo R5, estos compuestos tienen nuevos grupos enlazados al oxígeno en la posición C-17 del macrólido. R2 siempre es H en las espinosinas conocidas, y por tanto la variación en esta posición es nueva. Adicionalmente, el compuesto 31 tiene un nuevo sistema de anillo de macrólido de 14 carbonos no conocido previamente en los compuestos que dependen de S. spinosa.

Los compuestos de la invención pueden reaccionar para formar sales. Las sales que son fisiológicamente aceptables son también útiles en las formulaciones y métodos de esta invención. Las sales se preparan usando procedimientos estándar para la preparación de sales. Por ejemplo, los compuestos de la invención se pueden neutralizar con un ácido apropiado para formar una sal de adición de ácido. Las sales de adición de ácido son particularmente útiles. Sales de adición de ácido adecuadas representativas incluyen sales formadas por reacción con un ácido orgánico o bien un ácido inorgánico, tales como, por ejemplo, ácido sulfúrico, clorhídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, cólico, pamoico, múcico, glutámico, camfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, laúrico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico, benzoico y cinnámico.

Otro aspecto de esta invención es un procedimiento para producir compuestos de las fórmulas 1 y 2, que comprenden cultivar la cepa Saccharopolyspora LW107129 (NRRL 30141) en un medio adecuado. Los compuestos de las fórmulas 1 y 2 se extrajeron del caldo de fermentación y del micelio con disolventes orgánicos polares. Los compuestos se pueden purificar además mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como cromatografía en columna.

Los compuestos de las fórmulas 1 y 2 en los que R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a 4i son útiles para el control de ácaros, pulgones e insectos. Por lo tanto, también forman parte de esta invención las composiciones y métodos acaricidas e insecticidas para reducir las poblaciones de insectos, ácaros y pulgones que usan estos compuestos.

Los compuestos de las fórmulas 1 y 2 en los que R5 es hidrógeno (C-17-pseudoagliconas) son útiles como compuestos intermedios en la preparación de compuestos insecticidas y miticidas. Por ejemplo, estos compuestos se pueden glicosilar en el grupo hidroxilo C-17. La glicosilación puede realizarse por síntesis química o por bioconversión microbiana, usando procedimientos descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 5.539.089.

Descripción detallada de la invención Descripción del cultivo

A la nueva cepa que produce los compuestos de la invención se le dio la denominación LW107129. El cultivo LW107129 se aisló de una muestra de tierra compuesta de tierras recogidas en numerosas zonas. El cultivo fue depositado de acuerdo con los términos del tratado de Budapest del Midwest Area Northern Regional Research Center, Agricultural Research Service (Servicio de Investigación Agronómica), United States Department of Agriculture (Ministerio de Agricultura de los EE.UU.), 815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604. La cepa se depositó el 9 de junio de 1999, y se le asignó el número de depósito NRRL 30141.

Características del cultivo

La cepa LW107129 de Saccharopolyspora produce micelios aéreos y esporas de color blanco brillante en los siguientes medios: Bennett's, ISP2 e ISP5. Las colonias son de color crema a tostado claro y el micelio sustrato puede asumir un color marrón claro, particularmente en ISP4 & ISP5. La cepa LW107129 no se esporula en ISP3 ni ISP4. No se produjeron pigmentos en ningún medio ensayado. El micelio de la cepa LW107129 sufrió fragmentación en el líquido de cultivo.

Características morfológicas

La cepa LW107129 produjo esporas oblongas en cadenas de hasta 50 esporas. Las esporas se encajonan en una vaina de espora y la superficie de la espora está recubierta con espinas infrecuentes.

Características fisiológicas

La cepa LW107129 de Saccharopolyspora es capaz de producir ácido a partir de los siguientes sustratos: D-arabinosa, m-eritritol, D-fructosa, D-glucosa, glicerol, D-manitol, D-manosa, L-ramnosa, D-ribosa y trehalosa. La cepa LW107129 no puede producir ácido a partir de adonitol, L-arabinosa, dextrina, dulcitol, etanol, D-galactosa, glicógeno, inositol, lactosa, maltosa, melezitosa, melibiosa, rafinosa, salicina, D-sorbitol, L-sorbosa, sacarosa, xilitol y D-xilosa. La cepa LW107129 es capaz de asimilar diversos ácidos orgánicos que incluyen citrato y succinato, pero no acetato, benzoato, butirato, formato, oxalato o tartrato. La cepa LW107129 es capaz de hidrolizar tirosina y urea pero no adenina, caseína, esculina, hipurato, hipoxantina, almidón o xantina. La LW107129 es resistente a los siguientes antibióticos: carbenicilina, cefalotina, cicloheximida, geneticina, lincomicina, ácido naladíxico, novobiocina, oxitetraciclina, polimixina B, rifampina y espectinomicina, y es sensible a bacitracina, cloramfenicol, eritromicina, higromicina B, estreptomicina, tiostrepton, trimetoprima y vancomicina.

Método de producción del metabolito

Los metabolitos de las fórmulas 1 y 2 se producen mediante el cultivo de la cepa LW107129 en un medio de fermentación, según se describe a continuación. Un cultivo de LW107129 se inoculó en un medio vegetativo y creció durante 48 horas a 30ºC sacudiéndose a 250 rpm. Sesenta mililitros de este cultivo vegetativo maduro en primera fase se usa para inocular un cultivo vegetativo secundario de medio vegetativo de 1 litro en un matraz de cultivo de 2 litros. Este cultivo se incubó a 30ºC durante 48 horas sacudiéndose a 195 rpm. La semilla madura de la segunda fase se usó para inocular 70 litros de medio en una vasija de tanque agitado, como se describe en el Ejemplo 1.

La producción de los compuestos de las fórmulas 1 y 2 puede seguirse durante la fermentación ensayando extractos del caldo. Un método preferido para seguir la producción es el análisis de los extractos de caldo por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). En el Ejemplo 2 se describe un sistema adecuado de análisis.

Ejemplo 1 Preparación de metabolitos a través de la fermentación

Los metabolitos de las fórmulas 1 y 2 se producen mediante el cultivo de la cepa LW107129 en un medio de fermentación, según se describe a continuación. Se descongeló 1 mL de un medio de cultivo vegetativo congelado de LW107129, se inoculó en 100 mL de medio vegetativo en un matraz Erlenmeyer de 500-mL y creció a 30ºC agitándose a 250 rpm durante 48 horas.

Medio vegetativo

Ingrediente	Cantidad (g)
Dextrosa	9,0
Caldo de soja Trypticase	30,0
Extracto de levadura	3,0
Sulfato de Magnesio. 7 H2O	2,0
Agua desionizada	1000,0

Sesenta mililitros de este cultivo vegetativo maduro en primera fase se usa para inocular un cultivo vegetativo secundario de medio vegetativo de 1 litro en un matraz de cultivo de 2 litros. Este cultivo se incubó a 30ºC durante 48 horas sacudiéndose a 195 rpm. La semilla madura de la segunda fase se usó para inocular 70 litros de medio en una vasija de tanque agitado.

Medio de fermentación (por litro de agua)

Ingrediente	Cantidad (g)
Harina de soja	5,0
Dextrosa	10,0
Glicerina	10,0
Almidón soluble	5,0
Dextrina de Patata	20,0
Melazas	10,0
Polvo de remojo de maíz	5,0
Carbonato de calcio	3,0
Ácido fítico	1,0
Sulfato de Magnesio	0,5
Cloruro férrico. 4 H2O	0,1
Cloruro de cinc	0,1
Cloruro de manganeso.4
H2O	0,1

La fermentación se mantuvo a 30ºC, 400 rpm durante 7-12 días.

La cerveza de fermentación madura se puede extraer con un disolvente adecuado y los metabolitos se recuperan por formación de sal y/o separación cromatográfica.

Ejemplo 2 Método de ensayo por HPLC

El siguiente método de HPLC es útil para controlar la fermentación en cuanto a la producción de compuestos de las fórmulas 1 y 2:

Añadir un volumen de etanol desnaturalizado igual al de una alícuota del caldo de fermentación. Sacudir la mezcla y dejarla reposar durante un mínimo de una hora. Centrifugar la muestra para eliminar residuos celulares, a continuación centrifugar una alícuota de 1-mL. El extracto clarificado se analizó entonces mediante el siguiente sistema de HPLC.

Sistema de HPLC:

Columna de fase estacionaria: Columna de 250- x 4,6-mm, gel de sílice de base desactivada de 5-\mum C8 (Hypersil-C8-BDS).

Fase móvil: Gradiente lineal de acetato-metanol-acetonitrilo de amino-10 mM resumido a continuación:

Tiempo (min)	Porcentaje de disolvente A	Porcentaje de disolvente B
0	100	0
20	0	100
25	0	100
30	100	0
35	100	0

Donde el disolvente A es acetato de amonio 10 mM y el disolvente B es

metanol-acetonitrilo (1:1)

Caudal: 1 mL/min

Detección: UV a 250 nm

Tiempos de detección de los factores principales según se resume a continuación:

Compuesto	Tiempo de retención (min)
7	24,6
1	24,2
3	23,7
12	22,9
15	22,8
18	22,6
8	22,5
17	22,2
13	21,6
14	21,4
19	20,2
20	19,3
21 (ambos epímeros C24)	16,2

Ejemplo 3 Aislamiento de metabolitos insecticídamente activos del caldo de cultivo

El siguiente ejemplo muestra como se aisló mayor abundancia de compuestos de fórmula 1 a partir de un lote de cultivo LW107129. El ejemplo dio procedimientos específicos usados para aislar los compuestos 1, 3, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20 y 21. Los compuestos 2, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 16, 22 y 23-31, producidos por el organismo en menor cantidad que los compuestos enumerados anteriormente, se aislaron usando métodos muy similares a los aplicados para lotes más grandes de extracto de caldo. Puesto que los métodos tanto similares como familiares para el experto en la técnica, no se describirán con detalle en este documento.

El cultivo total, es decir, células más caldo, a partir de la fermentación de cinco litros de medio inoculado tuvo un volumen total de aproximadamente 3,5 litros cuando se finalizó la fermentación. Esta muestra se extrajo con un volumen igual de etanol desnaturalizado agitando vigorosamente y dejando reposar después a temperatura ambiente durante dos horas. La célula sobrante se eliminó por centrifugado y los 7 litros del extracto de etanol acuoso al 50% se repartieron usando diclorometano (DCM: 2 x 7 litros). El extracto de DCM se concentró para dar un aceite amarillo pálido (3,3 g). El aceite se disolvió en metanol y se dividió en dos alícuotas iguales, cada una de las cuales se cromatografió en una columna de gel de sílice (4 x 15 cm; 32-63 \mum; Biotage, Inc., U.S.A.). Cada columna se eluyó a 20 mL/min usando el siguiente gradiente de disolvente lineal y a continuación se combinó con una alícuota final de disolvente G (100 mL):

9

Donde las composiciones de disolvente (% en volumen) fueron como sigue:

10

Se recogieron fracciones (30 s; 10 mL cada una) durante la elución. Éstas se analizaron por HPLC según el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, y después las fracciones de cada perfil de columna de gel de sílice que contenían componentes de polaridad similar se combinaron como se muestra a continuación:

Número de fracción	Identificador
92-97	SI-1
104-112	SI-2
114-120	SI-3
121-140	SI-4
resto	SI-5

Estas fracciones combinadas se secaron a vacío y se redisolvieron en metanol antes del fraccionamiento adicional, según se describe a continuación.

Las partes alícuotas de la fracción SI-1 se aplicaron a una columna (250 x 10 mm; 8 mm de tamaño de partícula) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8TM). La muestra aplicada se cromatografíó en acetato de amonio (10 mM)-metanol-acetonitrilo (30:35:35), eluyéndose en 3 mL/min, recogiendo fracciones de 0,75-mL. Las fracciones que contienen el Compuesto 17 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 14,9 mg de Compuesto 17 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 18 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 1,4 mg de Compuesto 18 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 12 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 4,2 mg de Compuesto 12 puro.

Las partes alícuotas de la fracción SI-2 se aplicaron a una columna (250 x 10 mm; 8\mum de tamaño de partícula) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8TM). La muestra aplicada se cromatografíó usando el gradiente lineal de acetato de amonio (10 mM)-metanol-acetonitrilo especificado a continuación, eluyéndose en 3 mL/min, recogiendo fracciones de 0,75-mL.

Tiempo (min)	Porcentaje disolvente A	Porcentaje disolvente B
0	60	40
5	60	40
25	0	100
30	0	100
32	60	40
40	60	40
A = acetato de amonio 10 mM
B = metanol-acetonitrilo (1:1)

Las fracciones que contienen el Compuesto 20 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 11,5 mg de Compuesto 20 puro.

Las fracciones que contienen el Compuesto 19 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 3,9 mg de Compuesto 19 puro.

Las fracciones que contienen el Compuesto 14 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 2,0 mg de Compuesto 14 puro.

Las fracciones que contienen el Compuesto 13 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 4,9 mg de Compuesto 13 puro.

Las fracciones que contienen el Compuesto 15 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 2,3 mg de Compuesto 15 puro.

Las fracciones que contienen los dos isómeros epiméricos 24 del Compuesto 21 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 15 mg de una mezcla de los dos. La mezcla se disolvió en metanol y se aplicó a una columna (250 x 10 mm; 8 \mum de tamaño de partícula) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8TM). La muestra aplicada se cromatografíó en acetato de amonio (10 mM)-metanol-acetonitrilo (85:7,5:7,5), eluyéndose en 3 mL/min, recogiendo fracciones de 3-mL. Las fracciones que contienen el Compuesto 21 #1 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 9,8 mg de Compuesto 21 #1 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 21 #2 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 4,7 mg de Compuesto 21 #2 puro.

La fracción combinada SI-3 se disolvió en metanol y se cromatografió en una columna (4 x 7 cm; 32-63 \mum; Biotage, Inc., U.S.A.). La columna se eluyó a 20 mL/min usando los siguientes estados de gradiente:

Tiempo (min)	Porcentaje de disolvente A	Porcentaje de disolvente B
0	100	0
5	100	0
15	60	40
25	0	100
40	0	100
A = hexano-dietilamina (99,5:0,5)
B = hexano-isopropanol-dietilamina (75:25:2)

Las fracciones (80 x 0,5 min; 10 mL) se recogieron y se combinaron las 46-50 y se concentraron hasta sequedad. La mezcla seca se disolvió en metanol y se aplicó a una columna (250 x 10 mm; 8 \mum de tamaño de partícula) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8TM). La muestra aplicada se cromatografíó en acetato de amonio (10 mM)-metanol-acetonitrilo (20:40:40), eluyéndose en 3 mL/min, recogiendo fracciones de 0,75-mL. Las fracciones que contienen el Compuesto 1 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 24,3 mg de Compuesto 1 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 7 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 1,5 mg de Compuesto 7 puro.

La fracción combinada SI-4 se disolvió en metanol y se cromatografió en una columna (250 x 10 cm; 8 \mum de tamaño de partícula) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8TM). La muestra aplicada se cromatografió en siguiente sistema de elución de gradiente lineal, a una velocidad de flujo de 5 mL/min, recogiendo fracciones de 88 x 1,25 mL:

Tiempo (min)	Porcentaje disolvente A	Porcentaje disolvente B
0	100	0
20	0	100
25	0	100
30	100	0
35	100	0
A = acetato de amonio 10 mM
B = metanol-acetonitrilo (1:1)

Las fracciones que contienen el Compuesto 1 bruto se concentraron hasta sequedad, así como las fracciones que contienen el Compuesto 8 bruto. Las fracciones combinadas, secas anteriores se disolvieron cada una en metanol y se recromatografiaron en una columna (250 x 10 mm; 8 \mum de tamaño de partícula) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8TM). Las muestras aplicadas se cromatografiaron en acetato de amonio (10 mM)-metanol-acetonitrilo (20:40:40), eluyéndose a 3 mL/min, recogiendo fracciones de 0,75-mL. Las fracciones que contienen el Compuesto 8 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 5,8 mg de Compuesto 8 puro. Las fracciones que contienen el Compuesto 1 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 7,3 mg de Compuesto 1 puro.

La fracción seca del resto de la columna SI-5 se disolvió en metanol y se aplicó a una columna (250 x 10 mm; 8 \mum de tamaño de partícula) de gel de sílice de fase inversa C-8 (Hypersil-BDS-C8TM). La muestra aplicada se cromatografíó en acetato de amonio (10 mM)-metanol-acetonitrilo (20:40:40), eluyéndose a 3 mL/min, recogiendo fracciones de 0,75-mL. Las fracciones que contienen el Compuesto 7 se combinaron y se concentraron hasta sequedad para dar 3,5 mg de Compuesto 7 puro.

Características espectroscópicas

Las estructuras químicas de los nuevos componentes se determinaron mediante métodos espectroscópicos, que incluyen espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR), espectrometría de masas (MS), espectroscopía ultravioleta (UV) y por comparación con la espinosina A y D y análogos relacionados. Los siguientes párrafos describen las propiedades espectroscópicas de los componentes descritos anteriormente. En esta descripción, se da un análisis detallado de las propiedades espectroscópicas del Compuesto 1. Se continúa después con una descripción de los caracteres espectroscópicos de los otros componentes relacionados que facilitan al experto en la técnica concluir la estructura química en comparación con los datos para el Compuesto 1. Por conveniencia del lector, el siguiente diagrama del Compuesto 1 proporciona las designaciones de posiciones de todos los datos espectrales de NMR para los factores naturales presentados a continuación:

11

El compuesto 1 tiene las siguientes características:

Peso molecular: 757

Fórmula molecular: C43H67NO10

UV (por detección por red de diodos durante análisis LC, disolvente = metanol -acetonitrilo (1:1)): 244 nm

Electropulverización MS:m/z para [M+H]+ = 758,5; ión de fragmento de forosamina-azúcar a m/z 142,1.

Precisión ESI-MS: m/z para [M+H]+ = 758,4845 +/- 0,0007 (teoría: 758,4843).

La Tabla II resume los datos espectrales de NMR de 1H y 13C para el Compuesto 1 en CDCl3.

TABLA II

Datos de desplazamiento químico para el Compuesto 1 (CDCl_{3})

12

Desplazamiento químicos referenciados con TMS a 0 ppm

Las características espectroscópicas de NMR que los distinguen de otros metabolitos son como sigue:

El espectro de NMR de las estructuras que tienen la estructura macrólida base del Compuesto 7 se ejemplifican por la ausencia de las señales protónicas a 5,8 y 5,7 ppm, y en ausencia de una nueva resonancia olefínica a 5,5 ppm. Adicionalmente, una resonancia metílica a 1,7 ppm indica la presencia de un grupo metilo olefínico. El espectro de NMR de las estructuras que tienen la estructura macrólida base del Compuesto 8 se ejemplifican mediante un número de caracteres. H-8 aparece como un doblete a 4,15 ppm y H-9 aparece a 4,1 ppm (dd). No había constante de acoplamiento medible entre H-8 y H-9. La señal para H-11 se movió campo abajo a 1,5 ppm. La hidroxilación en C-24 en cualquiera de estas estructuras 21-butenilo se indicó mediante un desplazamiento campo abajo en ambos H-24 y H-25, que apareció como un multiplete o triplete, respectivamente. Al mismo tiempo, H-23 cambió a un doblete doble. El espectro de NMR de las estructuras que tienen la estructura macrólida base del Compuesto 11 se ejemplifican por la adición de resonancias olefínicas a 5,1, 5,25, y 5,6 ppm, con patrones de acoplamiento consistentes en un grupo olefínico terminal. Adicionalmente, está ausente la señal indicativa de un grupo metilo alifático terminal a 0,9-1,0 ppm. El espectro de NMR de los compuestos que tienen la estructura macrólida base del Compuesto 16 se ejemplifican mediante el desplazamiento campo abajo de H-24 y el colapso de la estructura del triplete a un doblete a aproximadamente 1,4 ppm. En estos casos, H-23 cambió a un doblete de cuartetos, y el análisis de un espectro 2D COSY indicaba el acoplamiento de este doblete al otro protón olefínico, indicando la presencia de un grupo propenilo. El espectro de NMR de los compuestos que tienen la estructura macrólida base del Compuesto 23 se ejemplifican por la ausencia de protones olefínicos de butenilo y se distinguen de las espinosinas previamente conocidas por el examen de los experimentos COSY 2D y TOCSY. El análisis del rastro de acoplamiento que surge de H-25 indicaba un grupo butilo de 4-carbonos conectado a C-21. Las estructuras glicósidas unidas al oxígeno en la posición C-17 se identifican usando una variedad de experimentos de NMR bidimensional.

El triplete metilo H-25 y H-24 de la macrólida de anillo expandido 31 se parecía al grupo etilo en la espinosina A. Adicionalmente, H-21 se movió campo arriba a 4,8 ppm, en relación a su posición en el compuesto 1. Sin embargo, los protones olefínicos aún estaban presente. Un espectro de COSY 2D mostró que tanto el grupo metilo como la olefina se acoplaron a H-21 indicando que el enlace doble en este compuesto estaba dentro del anillo. Esto consistía en que este compuesto era un isómero del compuesto 1, basado en su peso molecular, que era 758, del espectro de
masas.

Una lista de todos los metabolitos con el aducto molecular observado en ESI-MS, del que se dedujo el peso molecular, se muestra en la Tabla III:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA III

13

1 Iones moleculares de aducto observados usando LC/MS con ionización por electropulverización.

2 Dos isómeros, teniendo ambos las mismas características de MS

Actividad insecticida y acaricida

Los compuestos de la invención (otros distintos a aquellos en los que R5 es H) son útiles para el control de insectos, ácaros y pulgones. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se dirige a métodos para inhibir un insecto, ácaro o pulgón, que comprende aplicar al locus del insecto, ácaro, o pulgón, una cantidad inhibidora de insectos, ácaros, o pulgones de un compuesto de la fórmula 1 ó 2 en el que R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a 4i.

El "locus" de los insectos, ácaros, o pulgones se refiere al entorno en el que viven los insectos, ácaros o pulgones, o en el que están presentes sus huevos, incluyendo el aire que los circunda, el alimento que comen o los objetos con los que entran en contacto. Por ejemplo, los insectos o ácaros que ingieren plantas pueden ser reprimidos aplicando el compuesto activo a las partes de la planta que comen o habitan los insectos o ácaros, en particular el follaje.

La expresión "inhibición de un insecto, ácaro o pulgón" se refiere a que hay un descenso del número de insectos, ácaros o pulgones vivos o a una disminución del número de huevos. El alcance de la reducción conseguida por un compuesto depende, desde luego, de la tasa de aplicación del compuesto, del compuesto usado en particular, y de la especie diana de insecto, ácaro o pulgón. Ha de usarse al menos una cantidad inactivadora de insectos, inactivadora de ácaros, o inactivadora de pulgones. Con la expresión "cantidad inactivadora" se quiere decir que se usa una cantidad de compuesto para provocar una reducción observable en la población de insectos, ácaros o pulgones tratada. Generalmente, se usa de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 ppm (o 0,01 a 1 kg/ha) de compuesto.

Los compuestos muestran actividad frente a un cierto número de insectos, ácaros, y pulgones. Más específicamente, los compuestos presentan actividad contra miembros del orden de insectos Lepidoptera tales como la noctua de la remolacha, la torcedora del capullo del tabaco, polilla de la manzana y la oruga geometra del repollo. Otros miembros típicos de este orden son la noctua del sur, las agrotis podadoras, las polillas de la ropa, la polilla de la harina de la India, los gorgojos de las hojas, el gusano de la mazorca de maíz, la oruga de la cápsula del algodón, la oruga taladradora europea, la oruga del repollo importada, el gusano rosado del algodonero, orugas de bolsón, oruga de tienda del este, palomilla del césped y noctua de otoño.

Los compuestos también muestran actividad contra miembros del orden de Coleóptera (los escarabajos y gorgojos tales como el escarabajo de la patata de Colorado, escarabajos rayado y manchado del pepino, escarabajo japonés, y gorgojo de la cápsula) y Díptera (las moscas genuinas tales como la mosca doméstica, mosquitos, moscas de la fruta, moscas del establo y de los cuernos, y minadores de las hojas)

Los compuestos también muestran actividad contra miembros del orden Hempitera (chinches genuinos tales como chinches de plantas, chiches hediondas y chinches de los cereales), Homoptera (tales como los áfidos, saltamontes de las hojas, saltamontes de las plantas, mosca blanca, escamas y chinches harinosas), Mallophaga (piojo masticador), Anoplura (piojo chupador), Thysanoptera (tripsos), Orthoptera (tales como cucarachas, saltamontes de césped, y grillos), Siphonaptera (pulgas), Isoptera (termitas), y miembros de la familia Formicidae del orden Hymenoptera (hormigas).

Los compuestos también muestran actividad contra los ácaros y pulgones del orden Acari, por ejemplo, dos ácaros de araña moteada. Otros miembros típicos de este orden incluyen parásitos de plantas tales como el ácaro rojo de los cítricos, ácaro rojo europeo, y el ácaro plano de los cítricos, y parásitos de los animales tales como ácaro de la sarna, ácaro de la roña, ácaro de la sarna de oveja, ácaro de los pollos, ácaro de escamas, ácaro de la desplumación y ácaro del folículo de perros.

Plagas específicas de artrópodos representativas que pueden ser controladas por los presentes compuestos incluyen: Amblyomma americanum (ácaro americano), Amblyomma maculatum (ácaro de la costa del Golfo), Argas persicus (ácaro aviar), Boophilus microplus (ácaro del ganado), Chorioptes spp. (mange mite), Demodex bovis (ácaro del folículo del ganado), Demodex canis (ácaro del folículo del perro), Dermacentor andersoni (ácaro de la madera de las Montañas Rocosas), Dermacentor variabilis (ácaro de perros americana), Dermanyssus gallinae (ácaro de los pollos), Ixodes ricinus (ácaro de la oveja común), Knemidokoptes gallinae (ácaro de la desplumación), Knemidokoptes mutans (ácaro de escamas), Otobius megnini (ácaro del oído), Psoroptes equi (arador de la roña), Psoroptes ovis (arador de la roña), Rhipicephalus sanguineus (ácaro pardo de perros), Sarcoptes scabiei (arador de la sarna), Aedes (mosquitos), Anopheles (mosquitos), Culex (mosquitos), Culiseta, Bovicola bovis (piojo mordedor del ganado), Callitroga homnivorax (mosca azul de la carne), Chrysops spp. (mosca del venado), Cimex lectularius (chinche de la cama), Cochliomyia spp. (gusano barrenador), Ctenocephalides canis (pulguilla de perros), Ctenocephalides felis (pulguilla de gatos), Culicoides spp. (cecidomias, moscas de arena, punkies, o no-se-ven), Damalinia ovis (piojo de los lanares), Dermatobia spp. (tábano), Gasterophilus haemorrhoidalis (estro), Gasterophilus intestinalis (estro del caballo común), Gasterophilus nasalis (mosquito del mentón), Glossina spp. (mosca tsetse), Haematobia irritans (mosca de los cuernos, mosca de los búfalos), Haematopinus asini (piojo chupador de los caballos), Haematopinus eurysternus (piojo de la trompa corta del ganado), Haematopinus ovillus (piojo corporal), Haematopinus suis (piojo de los lechones), Hydrotaea irritans (mosca de la cabeza), Hypoderma bovis (mosca de la bomba), Hypoderma lineatum (mosca del talón), Linognathus ovillus (piojo corporal), Linognathus pedalis (piojo del pie), Linognathus vituli (piojo de la trompa larga del ganado), Lucilia spp. (mosca de larva), Melophagus ovinus (garrapata de la oveja), Musca spp. (mosca del caballo, mosca facial), Oestrus ovis (estro), Pediculus spp. (piojos), Phiebotomus spp. (mosca de la arena), Phormia regina (mosca azul de la carne), Psorophora spp(mosquito), Pthirus spp. (piojos), Reduvius spp. (insecto asesino), Simulium spp. (mosca negra), Solenopotes capillatus (pequeño piojo azul de los vacunos), Stomoxys calcitrans (mosca del establo), Tabanus spp. (mosca del caballo), Tenebrio spp. (gusanos de la harina), Triatoma spp. (chiches picudos).

Los compuestos son útiles para reducir las poblaciones de insectos, ácaros y pulgones y se usan en un método para inhibir una población de insectos, ácaros o pulgones que comprende aplicar a un lugar del insecto, ácaro o pulgón una cantidad eficaz inactivadora de insectos, de ácaros o de pulgones de un compuesto activo de la invención. En una realización preferida, la presente invención se dirige a un método para inhibir un insecto susceptible del orden Lepidoptera que comprende aplicar a una planta una cantidad eficaz inactivadora de insectos de un compuesto activo de la invención. Otra realización preferida de la invención se dirige a un método para inhibir inhibir moscas mordedoras del orden Diptera en animales que comprende administrar una cantidad inhibidora de pestes eficaz de un compuesto activo oralmente, parenteralmente o tópicamente al animal. Otra realización preferida de la presente invención se dirige a un método para inhibir ácaros o pulgones del orden Acarina que comprende aplicar al lugar del ácaro o pulgón una cantidad inactivadora de ácaros o de pulgones de un compuesto activo de la invención.

No sólo son útiles para la producción de productos agrícolas los compuestos descritos en esta invención, sino que, en lo posible, también son útiles las sales de adición de ácido de estos compuestos. Estas sales son útiles, por ejemplo, en la separación y purificación de los compuestos de las fórmulas 1 y 2. Además, algunas de estas sales pueden tener una solubilidad en agua acrecentada. Las sales de adición de ácido se pueden preparar a partir de los compuestos descritos en la fórmula 1, en los que R5 es un nitrógeno básico que contiene molécula de azúcar, tal como forosaminaLas sales de los compuestos se pueden preparar usando tecnologías estándares para la preparación de sales que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Las sales de adición de ácidos adecuadas representativas incluyen sales formadas por reacción con un ácido orgánico o bien un ácido inorgánico, tales como, por ejemplo, ácido sulfúrico, clorhídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, cólico, pamoico, múcico, glutámico, camfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, laúrico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico, benzoico y cinnámico y ácidos similares.

Ejemplo 4 Redes contra los insectos A. Ensayo de las orugas de las yemas del tabaco neonatas (Heliothis virescens)

Para comparar la actividad insecticida de los compuestos de la fórmula 1 en larvas neonatas de Heliothis virescens (< 6 horas post-eclosion), se prepararon primero 1 \mug/\muL de disoluciones de acetona de cada uno de los metabolitos. Las disoluciones de acetona se disolvieron después con Millipore H2O que contienen 0,025% de tensioactivo Triton X-100TM para producir tratamientos de 25 ó 50 ppm. Un mililitro de la concentración de cada metabolito se pipeteó después directamente sobre y en un círculo de papel de filtro cualitativo Whatman nº1 de 100 mm de diámetro en la que se han depositado suavemente hasta 20 larvas neonatas de la oruga del tabaco. Cada papel de filtro tratado y sus larvas asociadas se situaron después en una placa petri de plástico desechable de 20mm X 100mm. Una hora después, se añade a cada placa un pequeño fragmento de 1 cm3 de dieta de lepidópteros basada en agar (suspensión modificada, Southland Products, Lake Village, AR) como fuente de alimento de las larvas. Las placas petri se calentaron a 27ºC durante 24 horas y después se evaluó el porcentaje de mortalidad de las larvas en cada tratamiento. Los resultados se muestran más adelante en la Tabla IV.

B. Ensayo tópico de la nectua de la remolacha (Spodoptera littoralis)

Una medida adicional de las actividades insecticidas relativas de los compuestos de la fórmula 1 se generó usando una disolución de 1 \mug/gl de metanol de cada compuesto aplicado a 1 \muL por larva de Spodoptera criadas en laboratorio, (media en peso de 43 mg). Cada compuesto se aplicó a lo largo del dorso de cada una de seis larvas. Las larvas tratadas se calentaron durante cinco días a 21ºC, 60% RH en placas de cultivo de plástico de seis pocillos. Se suministró a cada una de las larvas 1 cm^{3} de una dieta de lepidópteros basada en agar para el sustento durante el intervalo de 5 días posterior a la exposición.

Se determinó el porcentaje de mortalidad al final del período de cinco días. Los resultados se muestran en la Tabla IV.

TABLA IV

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Composiciones insecticidas

Los compuestos de esta invención se aplican en forma de composiciones, que también son parte de esta invención. Estas composiciones comprenden una cantidad inactivadora de insectos, de ácaros o de pulgones de un compuesto de la invención en un excipiente inerte aceptable fitológicamente. El ingrediente (s) activo(s) puede(n) estar presente(s) como un compuesto simple, o una mezcla de dos o más compuestos de la invención, junto con la porción seca del medio de fermentación en que se produce.

Las composiciones se preparan según procedimientos y fórmulas que son convencionales en la técnica agrícola o en el control de pestes, pero que son nuevos e importantes debido a la presencia de uno o más de los compuestos de esta invención. Las composiciones pueden ser formulaciones concentradas que se dispersan en agua para su aplicación o bien polvo, o bien formulaciones granulares que se aplican sin tratamiento adicional.

Las dispersiones en las que se aplican el compuesto o material seco crudo son suspensiones o emulsiones acuosas preparadas a partir de formulaciones concentradas de los compuestos o material crudo. Las formulaciones solubles en agua, suspendibles en agua o emulsionables son sólidos conocidos como polvos humectables líquidos, conocidos usualmente como concentrados emulsionables o suspensiones acuosas. Los polvos humectables, que pueden compactarse o aglomerarse para formar gránulos dispersables en agua. Estos gránulos comprenden mezclas del compuesto o material seco crudo, excipientes inertes y tensioactivos. La concentración del compuesto o material seco crudo es usualmente de aproximadamente del 0,1% a aproximadamente el 90% en peso. El excipiente inerte son típicamente arcillas atapulgitas, arcillas montmorillonitas, tierras de diatomeas o silicatos purificados.

Los tensioactivos constituyen típicamente de alrededor del 0,5% a aproximadamente el 10% del polvo humectable, en los que los tensioactivos son usualmente ligninas sulfonadas, naftalenosulfonatos condensados, naftalenosulfonatos, alquilbencenosulfonatos, alquilsulfatos o tensioactivos no iónicos tales como aductos de óxido de etileno de alquilfenoles, o mezclas de los mismos.

Los concentrados emulsionables de los compuestos reivindicados oscilan típicamente de alrededor de 50 a alrededor de 500 gramos de compuesto por litro de líquido, equivalente a alrededor del 10% a alrededor del 50%, disuelto en un excipiente inerte que es una mezcla de un disolvente orgánico inmiscible con agua y emulsionantes. Los disolventes orgánicos incluyen disolventes orgánicos tales como xilenos, y fracciones de petróleo tales como porciones de petróleo naftalénicas y olefínicas de alto punto de ebullición que incluyen nafta pesada y aromática. Pueden usarse también otros disolventes orgánicos, tales como disolventes terpénicos derivados de resina, cetonas alifáticas tales como ciclohexanona y alcoholes complejos. Los emulsionadores adecuados para concentrados emulsionables son típicamente tensioactivos no iónicos y/o iónicos convencionales, tales como los mencionados aquí anteriormente, o sus equivalentes.

Se pueden preparar suspensiones acuosas que comprenden compuestos insolubles en agua de esta invención, en las que los compuestos están dispersos en un vehículo acuoso en una concentración típicamente en el intervalo de alrededor del 5% a aproximadamente el 50% en peso. Las suspensiones se preparan moliendo finamente el compuesto y mezclándolo vigorosamente en un vehículo constituido por agua, tensioactivos, y dispersantes según se describe en la presente memoria. También pueden emplearse ingredientes inertes, tales como sales inorgánicas y gomas sintéticas o naturales, para aumentar la densidad y viscosidad del vehículo acuoso según se desee.

Los fluidos precipitados se pueden preparar disolviendo la molécula activa en un disolvente miscible en agua y tensioactivos o polímeros superficialmente activos. Cuando estas formulaciones se mezclan con agua, el compuesto activo se precipita con el tensioactivo controlando el tamaño del precipitado microcristalino resultante. El tamaño del cristal se puede controlar a través de la selección de polímeros y mezclas tensioactivas específicas.

Los compuestos también pueden aplicarse como una composición granular que se puede aplicar al terreno. La composición granular contiene habitualmente de alrededor del 0,5% a alrededor del 10% en peso del compuesto. El compuesto se dispersa en un excipiente inerte que consiste típicamente en arcilla o una sustancia similar. Generalmente, las composiciones granulares se preparan disolviendo el compuesto en un disolvente adecuado y aplicándolo a un excipiente granular que se ha preformado al tamaño de partículas apropiado. El tamaño de partícula está típicamente entre aproximadamente 0,5 a 3 mm. Las composiciones granulares también pueden prepararse fabricando una masa o pasta del excipiente y compuesto, secando la mezcla combinada, y triturando la masa o pasta para obtener el tamaño de partículas granulares deseado.

Los compuestos también se pueden combinar con un disolvente orgánico apropiado. El disolvente orgánico es normalmente un aceite de petróleo blando que se usa ampliamente en química agrícola. Estas combinaciones se usan usualmente como una pulverización. Más típicamente, los compuestos se aplican en forma de una dispersión en un excipiente líquido, en el que el excipiente líquido es agua. Los compuestos también se pueden aplicar en forma de una composición en aerosol. El compuesto activo se disuelve en un excipiente inerte, que es una mezcla propulsora generadora de presión. La composición en aerosol se envasa en un recipiente desde el que se dispersa la mezcla a través de una válvula atomizadora. Las mezclas propulsoras comprenden halocarburos de bajo punto de ebullición, que pueden mezclarse con disolventes orgánicos, o suspensiones acuosas presurizadas con gases inertes o hidrocarburos gaseosos.

La cantidad de compuesto a aplicar a los lugares de insectos, ácaros o pulgones no es crítica y puede determinarse fácilmente por los expertos en la técnica. En general, las concentraciones de alrededor de 10 ppm a aproximadamente 5.000 ppm de los compuestos proporcionan el control deseado. Para cultivos de campo, tales como soja y algodón, una proporción de aplicación es de alrededor de 0,01 a aproximadamente 1 kg/ha, en la que el compuesto se aplica en una formulación de pulverización de 19 a 190 L/A. Los compuestos se pueden aplicar en cualquier lugar habitado por un insecto, ácaro o pulgón. Tales lugares son normalmente cultivos de algodón, de soja y vegetales, árboles frutales y de nueces, viñedos y plantas domésticas y ornamentales.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de animales para el control de artrópodos, es decir, insectos y arácnidos, que son pestes en animales. Estas pestes artrópodas atacan típicamente a su hospedante en la superficie externa ("ecto"); los agentes que controlan tales pestes se denominan "ectoparasiticidas". Todos los animales son susceptibles de ser atacados por tales pestes, aunque el problema es más grave en los hospedantes vertebrados. Los seres humanos son hospedantes potenciales para muchos parásitos, y en áreas tropicales y en áreas de mínimas condiciones sanitarias, las infecciones parasitarias son un problema normal en la práctica médica. Altamente susceptibles de ser atacados por parásitos son también los numerosos animales de crianza, tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, búfalos, búfalos de agua, ciervos, conejos, pollos, pavos, patos, gansos, gallinas, y similares. Los caballos y otros animales de recreo son susceptibles de ataques parasitarios, como son visones y otros animales criados por su pelo, y ratas, ratones y otros animales usados en laboratorio y en investigación. Los animales de compañía tales como los perros y gatos son muy susceptibles de ser atacados por parásitos, y debido a su cercana relación con los humanos, tal parasitismo crea problemas a los humanos con los que se asocian. Los peces, crustáceos, y otras especies acuáticas también están sometidas a ataques parasitarios. En definitiva, el parasitismo implica como hospedantes a todo el conjunto de animales.

La importancia económica de las infestaciones ectoparasitarias es grande. En lo que se refiere al ganado, los animales sufren reducida eficacia de la alimentación y velocidades de crecimiento. La producción de leche y lana sufre, y se produce daño del vellón, cueros y pieles. Los animales quedan susceptibles a infecciones microbiológicas secundarias y a otros ataques de parásitos. Los ectoparásitos también causan incomodidades considerables incluso cuando no son perjudiciales de forma severa a la salud y producción.

Aunque están en uso un número de parasiticidas, son objeto de una variedad de problemas, incluyendo un espectro limitado de actividad, toxicidad medioambiental, la necesidad de repetir el tratamiento, y, en muchos casos, resistencia del ectoparásito. Por lo tanto, hay una continua necesidad de nuevos ectoparasiticidas.

Los compuestos de la invención proporcionan una nueva herramienta en el armamento para controlar ectoparásitos. En esta realización, la presente invención se dirige a un método para inhibir o exterminar una peste artrópoda en un animal hospedante, que comprende poner en contacto la peste con una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención.

La actividad ectoparasitaria de los presentes compuestos se logra cuando los compuestos entran en contacto con las pestes. El contacto puede ser en los huevos, larvas, adultos, u otros estados de vida. El "contacto" incluye la ingesta del compuesto por la peste.

Ejemplo 5 Ensayo in vivo en la mosca del establo adulta

En el Día de Estudio 0, seis ratones blancos de laboratorio (Mus musculus), de treinta gramos, (de 8-10 semanas de edad, hembras ICR, Harlan-Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, IN.) por tratamiento se trataron con el artículo de ensayo o disolvente (90% de oleato de etilo/ 10% DMSO), bien oral o tópicamente. El Día de Estudio 1, dos ratones de cada tratamiento se anestesiaron con una inyección intramuscular de 0,25 ml de una combinación de 1,0 ml de cetamina (Fort Dodge, Kecaset®, inyección de HCl de quetamina, 100 mg/ml) y 1,0 ml de xilazina (Bayer, Rompun®, 20 mg/ml inyectable) en 4,5 ml de agua estéril. Los ratones anestesiados se situaron en cajas de moscas que contienen 30 moscas de establo adultas. Los ratones anestesiados se dejaron en las cajas durante unos 60 minutos y las moscas consiguieron alimentarse de sangre sin interrupciones. Tras eliminarlos de las cajas de moscas, los ratones inconscientes asesinaron con C02. Las cajas de moscas se expusieron a un ciclo de 12 horas diarias/12 horas nocturnas para completar el periodo de estudio. La temperatura ambiente en este ensayo fue de 20-22\cdot25ºC (68-72ºF) y la humedad fue de 50-60%. Estos procedimientos se repitieron exactamente en los días 2 y 3 de Estudio con los ratones tratados restantes. Cada día se registró el número de moscas muertas y se desecharon las cajas de moscas. Se determinó para cada tratamiento el porcentaje total de mortalidad de las moscas y se comparó con la mortalidad de las moscas de ASF alimentadas continuamente y ASF alimentadas de los ratones de control tratados con disolvente. Los resultados de los compuestos de ensayo 1 y 8 son los siguientes:

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Ejemplo 6 Ensayo in vitro del test paquete de larvas de garrapata (LPT)

Se disolvieron niveles titrados de compuestos experimentales en una combinación de aceite de oliva y tricloroetileno y se pipetearon en escuadras de papel de filtro de laboratorio. Después de dejar que el tricloroetileno se evaporase durante aproximadamente una hora, se doblaron los papeles de filtro por la mitad y se aseguraron dos laterales con grapas, formando paquetes. Aproximadamente, se situaron 100 larvas de ácaros (Amblyomma americannum) se colocaron dentro de cada paquete y el lateral restante abierto se aseguró con una grapa. Los paquetes se incubaron durante 24 horas a aproximadamente 72ºF y 95% de humedad. Cada paquete se abrió separadamente y se determinó el número de larvas vivas y muertas. El porcentaje de mortalidad se determinó para cada compuesto. Los resultados de los Compuestos 1 y 8 ensayados son los siguientes.

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Ejemplo 7 Ensayo in vitro de Mosca Adulta de Establo

Se saturaron mechas dentales con suero que contiene niveles titrados de compuestos de partida experimentales a 100 ppm. Las mechas dentales se situaron en placas petri con 10 moscas de establo adultas (Stomoxys calcitrans) enfriadas previamente para facilitar su manipulación. El porcentaje de mortalidad se determinó tras 24 y 48 horas de incubación a 25ºC aproximadamente y 75-85% de humedad cuando se comparó a una placa que contiene una mecha con suero de control solamente. Los resultados de los Compuestos 1 y 8 ensayados son los siguientes.

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Ejemplo 8 Ensayo in vitro de larvas de moscarda

Se situaron injertos de filtro individualmente en placas de 96 pocillos. Cada injerto se saturó con suero bovino combinado con niveles titrados de compuestos de partida experimentales a 100 ppm. Aproximadamente, se situaron 30 larvas de moscardas (Phormia regina) en cada pocillo y se selló la placa completamente. Las placas se incubaron durante unas 48 horas a 25ºC aproximadamente y con 75-85% de humedad, tras lo cual se determinó la eficacia mediante inspección visual de cada pocillo para el movimiento de las larvas. Los resultados de los compuestos de ensayo 1 y 8 son como sigue (ambos compuestos se activaron a alrededor de 5 ppm):

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A indica mortalidad, como indicativo de ausencia de larvas en movimiento. N indica que se observó movimiento de larvas.

Las técnicas para suministrar los ectoparasiticidas son bien conocidas por los expertos en la técnica. En general, un compuesto actual se aplica a la superficie exterior de un animal, poniéndolo así con contacto con la peste ya presente en el hospedante así como a los que llegan al cuerpo del hospedante dentro del periodo de eficacia del compuesto. Típicamente, el compuesto se formula en una formulación líquida que se pulveriza sobre la superficie del animal o vertiéndola en la superficie del animal. Otro tratamiento convencional es una "inmersión", en la que el ganado se trata sumergiéndose sustancialmente en una disolución diluida de un ectoparasiticida. Para algunos hospedantes y pestes, la formulación puede ser un polvo, que se rocía en el hospedante, o un champú o crema que se emplea en el baño del animal. En perros y gatos también se emplean collares como vía de suministro de un ectoparasiticida directamente a la superficie del animal.

En otra realización, los compuestos de la invención se pueden suministrar a los animales usando marcas orejeras, un método de suministro descrito en la patente US 4.265.876.

En otra técnica, se aplica un ectoparasiticida a los lugares frecuentados por los animales, de forma que las pestes estén asimismo en contacto con el compuesto tal como en aplicación directa al hospedante. Es bien conocida la aplicación a lechos de animales domésticos, así como su aplicación en alfombrados. En el ganado bovino, son bien conocidas las bolsas de espolvoreo. Estas se posicionan en el paso de una puerta, de forma que el ganado inevitablemente se frota contra la bolsa y las plagas se ponen en contacto con el compuesto presente.

En aún otra realización, los compuestos presentes se pueden usar para controlar pestes artrópodas en las heces de ganado y otros animales. En esta realización, los compuestos se administran oralmente y los compuestos circulan a través del tracto intestinal y emergen en las heces. El control de pestes en las heces protege indirectamente a los animales de las mismas.

Los compuestos se formulan para uso como ectoparasiticidas de formas conocidas por los expertos en la técnica. En general, una formulación incluirá un compuesto de la presente invención y uno o más adyuvantes fisiológicamente aceptables. Las formulaciones incluyen versiones concentradas, en las que los agentes activos presentes están presentes en una concentración de 0,001 a 98,0 por ciento, siendo el contenido restante excipientes fisiológicamente aceptables. Tales formulaciones, específicamente aquellas con menos de 50 por ciento del presente compuesto, pueden algunas veces usarse directamente, pero estas formulaciones también se pueden diluir con otros excipientes fisiológicamente aceptables para formar formulaciones de tratamiento más diluidas. ciento. Estas últimas formulaciones pueden incluir el agente activo en menores concentraciones de 0,001 a 0,1 por.

Los compuestos de la invención también son útiles en formulaciones farmacéuticas para humanos para el control de parásitos, por ejemplo, piojos. Los compuestos se pueden usar, por ejemplo, en las formulaciones para el control de piojos que se describen en el documento WO 00/01347.

La Anoplura, o piojo chupador, son parásitos encontrados en casi todos los grupos de mamíferos. De las 15 familias reconocidas de Anoplura, dos familias, Pediculidae y Pthiridae, tienen especias que se han encontrado en humanos. Pediculus humanus es la única especia de la familia Pediculidae que afecta a los humanos. Estos incluyen los piojos de la cabeza, Pediculus humanus capitis; y los piojos corporales o de la ropa, Pediculus humanus humanus, denominado en ocasiones Pediculus corporis. El piojo ladilla, Pthirus pubis, es una especie distinta y es el único miembro de la familia Pthiridae que afecta a los humanos. Como se usa aquí, la expresión "piojo o piojos humanos" incluye un miembro de Pediculus humanus o Pthirus pubis.

En consecuencia, en uno de estos aspectos, la invención proporciona formulaciones pediculicidas/ovicidas (anti-piojo) para controlar una infestación de piojo en un humano que comprende como ingrediente activo una espinosina, o un derivado fisiológicamente aceptable o una sal del mismo, y un excipiente fisiológicamente aceptable. Formulaciones especialmente útiles de esta invención son formulaciones para el cuidado del cabello. Formulaciones para el cuidado del cabello especialmente útiles son los champúes. La invención también proporciona métodos de uso de estas formulaciones para el control de las especies de piojos en humanos. Estas formulaciones y métodos controlan los piojos de una forma más segura, más efectiva que las formulaciones y métodos anti-piojos previamente conocidos.

Las formulaciones anti-piojos de esta invención se pueden formular de muchas formas. Formulaciones particularmente útiles son los champúes, acondicionadores, y lociones del tipo descrito en el documento WO 00/01347.

Cuando se usa en una formulación de champú, formulación de acondicionador de cabello, o loción, el componente de espinosina está presente en un nivel de alrededor de 0,1% a alrededor de 30%, preferiblemente de alrededor de 1% a alrededor de 10%.

Con respecto a la actividad contra los piojos, las realizaciones específicas de la invención incluyen lo siguiente:

A.

Una formulación que comprende controlar una infesta de piojo en un humano que comprende como ingrediente activo un compuesto de la fórmula 1 ó 2 en el que R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a 4i, o un derivado fisiológicamente aceptable o sal del mismo, y un excipiente fisiológicamente aceptable.

B.

Una formulación de la realización que es una formulación para el cuidado del cabello.

C.

Un champú pediculicida que comprende:

(a)

de alrededor de 0,1% a alrededor de 30% de un compuesto de la fórmula 1 ó 2 en el que R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a 4i, o un derivado o sal fisiológicamente aceptable del mismo; (de alrededor del 5% a alrededor de 30% de un tensioactivo sintético;

(c)

de alrededor del 1% a alrededor de 7% de una amida; y

(d)

agua.

D.

Un champú de la realización C en el tensioactivo sintético es aniónico, anfótero, catiónico, zwitteriónico, o no iónico, o una mezcla de los mismos.

E.

Un champú de la realización D en el que la amida es monoetanolamida de coco, dietanolamida de coco, o una mezcla de los mismos.

F.

Un champú de la realización D que comprende adicionalmente de alrededor de 1% a alrededor de 10% de un material de silicona no volátil.

G.

Un champú de la realización F, en el que la silicona no volátil es un siloxano de polialquilo, siloxano de polialquilarilo, copolímero de siloxano de poliéter, o una mezcla de los mismos, cuya viscosidad es de alrededor de 100 centipoises a alrededor de 150.000.000 centipoises a 25º.

H.

Un champú de la realización G que comprende adicionalmente de alrededor de 0,5% a alrededor de 5% de un agente de suspensión seleccionado del grupo que consta de materiales cristalinos anfífilos que tienen estructuras en forma de aguja o láminas, materiales poliméricos, arcillas, óxidos metálicos pirógenos y mezclas de los mismos.

I.

Un champú de la realización H en el que el agente de suspensión es un material cristalino anfifílico seleccionado del grupo que consta de derivados acilo C16-C22 de cadena larga, alcanolamida C16-C22 de cadena larga de ácidos grasos, y mezclas de los mismos.

J.

Un champú de la realización I en el que el agente de suspensión es un diéster de etilenglicol.

K.

Un champú de la realización D, en el que la cantidad de una espinosina, o derivado o sal de la misma está a un nivel de alrededor de 0,25% a alrededor de 1,5%.

L.

Un método para controlar una infesta de piojo en un humano que comprende administrar tópicamente al humano una formulación de la realización A.

M.

El método de la realización L, en el que la infesta de piojo es Pediculus humanus capitis.

N.

El método de la realización L, en el que la infesta de piojo es Pediculus humanus humanus.

O.

El método de la realización L, en el que la infesta de piojo es Pthirus pubis.

P.

Un método para el tratamiento del cabello humano para exterminar y eliminar fácilmente los piojos y sus huevos, que comprende las etapas de:

(a)

aplicar al cabello húmedo de alrededor de 10 g a alrededor de 30 g de una formulación que comprende un compuesto de la fórmula 1 ó 2, en el que R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a 4i, o un derivado o sal del mismo fisiológicamente aceptable, y un excipiente fisiológicamente aceptable;

(b)

extender la formulación a través del cabello y del cuero cabelludo;

(c)

dejar la formulación en el cabello y el cuero cabelludo durante alrededor de 6-10 minutos;

(d)

eliminar la formulación del cabello mediante aclarado con agua.

Q.

El uso de un compuesto de la fórmula 1 ó 2, en el que R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a 4i, o un derivado o sal fisiológicamente aceptable del mismo, o una formulación que contiene bien el conjunto, para la fabricación de un medicamento para el control de piojos en un humano.

Claims (10)

1. Un compuesto de la fórmula (1) ó (2):

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o una de sus sales, en la que

R1 es un grupo de fórmula 2a, 2b, o 2c

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R2 es H u OH;

R3 es H o CH3

R4 en la fórmula 1 es 1-butenil, 1,3-butadienil, n-butil, 3-hidroxi-1-butenil, o 1-propenil; y R4 es etilo en la fórmula 2;

y R5 es H o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas 4a a 4i

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2. Un compuesto de la reivindicación 1, o una sal del mismo, en el que R5 es un grupo que tiene una de las fórmulas 4a a 4i

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3. Una composición insecticida o acaricida que comprende una cantidad inactivadora de insecto, de pulgón, o de ácaro de un compuesto de la reivindicación 2 en combinación con un excipiente fitológica o fisiológicamente aceptable.

4. Un método acaricida o insecticida, pero que no incluye un método de terapia practicada en el cuerpo humano o animal, que comprende aplicar al locus del insecto, pulgón o ácaro, una cantidad inactivadora de un compuesto de la reivindicación 2.

5. Un método de protección, pero que no incluye un método de terapia practicada al cuerpo humano o animal, de un locus de infestación por insectos, pulgones, o ácaros, que comprende aplicar al locus una cantidad inactivadora de insectos, pulgones, o ácaros de un compuesto de la reivindicación 2.

6. El uso de un compuesto según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la preparación de una composición insecticida para uso en terapia.

7. Una formulación para controlar una infesta de piojo en un humano que comprende como ingrediente activo un compuesto de la reivindicación 2, o un derivado o sal del mismo fisiológicamente aceptable, y un excipiente fisiológicamente aceptable.

8. El uso de un compuesto de la fórmula 1 ó 2, o un derivado o sal del mismo fisiológicamente aceptable, o una formulación que comprende bien el conjunto, para la fabricación de un medicamento para controlar los piojos en un humano.

9. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de la reivindicación 1, que comprende cultivar una especie NRRL 30141 de Saccharopolyspora, o una cepa derivada de la misma que produce un compuesto de la reivindicación 1, en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones de fermentación aeróbica sumergidas hasta producir una cantidad recuperable de un compuesto de la reivindicación 1, y recuperar un compuesto de la reivindicación 1 del medio de cultivo.

10. Un cultivo biológicamente puro de especie NRRL 30141 de Saccharopolyspora o una cepa derivada de la misma que produce un compuesto de la reivindicación 1.