TW565616B

TW565616B - Method and apparatus for detecting bacteria

Info

Publication number: TW565616B
Application number: TW086113749A
Authority: TW
Inventors: Takako Nogami
Original assignee: Organo Corp
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-22
Publication date: 2003-12-11
Also published as: WO1998013515A1; EP0940472A1; KR20000048673A; EP0940472A4; JP3270722B2; JPH10323178A; CN1231701A; CN1110571C; US20010006783A1

Description

經濟部中央標準局負工消费合作社印裂 565616 A7 B7 _ 五、發明説明（1 ) 技術領域本發明爲關於檢測例如大腸桿菌等細菌之方法及此檢測所使用之裝置等。背景技術以細菌爲首之微生物爲生存在所有的環境，且與人類之生活保持密切關係。然而，於微生物中亦有對人類或家畜造成疾病者，並以病原性微生物型式被注意其對人類或家畜之感染。於病原性微生物中亦特別以細菌爲增殖迅速，且難受到低溫、高溫、乾燥等環境條件所影響，而因此持續存在人類周圍，且若一旦取得良好條件則爆發性地增加數量並且成爲感染症之原因。故當然對於如食品和飮水 (包含自來水）之人類體內直接攝取者，食品製造工程所利用之水、食用器具等洗淨所利用之水、河川、湖沼、海、游泳池、澡堂、其他之園景修飾浸水利用之環境用水等、接觸人身體之水、地下水放流水等之與人有接觸機會之水，乃期望對細菌實施適切的管理。以此爲前提，對於作爲食品、飮料之自來水爲定於^ 無法檢測出大腸桿菌」之基準，於游泳池水則定於「培養 5份1 0毫升之水且大腸桿菌群陽性管爲2份以下」之基準，又對於園景修飾浸水利用之水則設定以^ 1毫升中 10個以下」，於一般排水以「1毫升中300個以下」爲期望之目標値。尙，經由細菌之感染症爲以人或動物作爲起源並且由本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

565616 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 A7 B7五、發明説明（2 ) 細菌所引起之疾病頻度爲最高且亦易使受害擴大。因此，在管理食品、飮水、或浸水設施之環境用水上之基準乃被認爲採用調査腸內細菌，特別是大腸桿菌及大腸桿菌群有無之項目，爲極妥當。然而，對於此類食品、飮水（自來水）、游泳池水、園景修飾浸水用水之細菌檢測，先前一般以培養法進行。此類先前所進行之培養法，例如於大腸桿菌和大腸桿菌群中必須有用以區別其他一般細菌之工夫，因此，於試驗時所使用之檢測方法爲多使用令大腸桿菌和大腸桿菌群選擇性增殖之培養基，或使用若增殖則色調產生變化且在菌落顏色上產生特殊顏色之培養基。尙，與上述方法不同，提案令大腸桿菌及大腸桿菌群之試驗簡略化之專一酵素受質培養基法，即，於對大腸桿菌和大腸桿菌群所含酵素專一之受質存在下培養試料，且若爲陽性則產生特徵性顏色和螢光之方法。又’此些方法以/外亦已知P CR法（聚合酶鏈反應） ’測定AT P之方法，使用放射性同位素等之方法（特開平8 - 154700號公報）。然而，於上述先前法中具有如下之問題。例如，於前述之培養法中，經由培養之菌至增殖爲止之時間加上增殖之細菌是否爲大腸桿菌或大腸桿菌群之判定法煩雜。即培養法即使僅推定有無大腸桿菌或大腸桿菌群之污染亦需要 1天’於確定所混入者是否爲大腸桿菌、大腸桿菌群需要 2天’再者若欲進行完全的試驗則必須重覆菌體之特殊染本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 565616 A7 _B7__ 五、發明说明（3 ) 色等之試驗而至判定爲止乃耗費時間。如此，經由培養法檢測細菌乃需要時間，而擔心在取得結果更早以前產生被害並且擴大之情形。與以上不同之培養法普通爲以目視計數定量洋菜培養基上或膜濾器上所形成之顯示特殊性狀之菌落，或由顯示陽性試料之最大稀釋倍率算出原先試料所含菌數之方法，但因顯示特殊形狀之菌落判定亦以含糊部分多，而由最大稀釋倍率算出之方法不過爲算出其大約之推定値，亦具有缺乏定量性之問題〇前述之專一酵素受質培養基法爲具有大腸桿菌及大腸桿菌群之定性試驗可在2 4小時實施之優點。但是對於大腸桿菌和大腸桿菌群亦無全部檢測，且若進行定量試驗則僅以最大稀釋倍率顯示陽性之値予以算出之形式進行，具有來自測定法之界限。 P C R法雖爲感度敏銳，但除了於死亡時亦檢測出無害細菌且無法將其區別之問題以外，亦無法期待其定量性〇再者，A T P法雖具有操作簡單而且可僅將活菌專一地檢測之優點，但其檢測敏感度低（若無1 0 0 0個以上之細菌則無法檢測），且易受到外因性要因之發光強度所左右而令可適用之條件受到限制，又具有無法特定檢測細菌之問題。於前述特開平8 — 1 5 4 7 0 0號公報中記載之方法爲對噬菌體以放射性同位素（同位素）或酵素標幟供使用本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央樣準局負工消費合作杜印製 565616 A7 B7 五、發明説明（4 ) 之直接標幟法、和測定噬菌體所重組之傳達基因所產生之蛋白質之方法。此些方法由於對於地球上通常穩定條件下所生存之所有細菌，存在有以其作爲宿主之專一性的噬菌體，且噬菌體對宿主之辨識嚴謹，於宿主細菌以外之細菌爲實質上不吸附結合，故於欲檢測某特定細菌之情形中利用噬菌體，可選擇檢測特定細菌之方面而言爲優異。然而，於此特開平8 — 1 5 4 7 0 0號提案之方法中，若由實際之實施場面考慮，於處理之迅速性、處理操作之簡便性、檢測精度之高度等方面而言，則具有如下說明之極難解決之問題。即，在前者直接標幟法中使用放射性同位素之方法中，由於無法區別來自吸附細菌之噬菌體所具有之放射性同位素標幟訊號，和來自非吸附噬菌體所具有之同標幟訊號，故需要將此些吸附、非吸附噬菌體予以物理性分離之操作。又，即使進行分離操作，亦有計數對細菌（或者過濾膜等之分離手段）非專一性吸附之噬菌體之問題，另外，吸附細菌並將其核酸注入細菌內之噬菌體爲增殖且其結果令細菌溶菌，而無法正確測定。另一方面，於直接標幟法中使用酵素之方式中，除了具有與使用放射性同位素相同之問題以外，再加上因爲利用微小量之酵素，故由受質所出現之現象而以良好精確度檢測微量酵素量之方式，具有實際利用上極爲困難之問題。再者，使用前述後者之傳達基因之方式，必須調製對每細菌專一性之噬菌體另外之基因重組體的傳達基因，由本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央揉準局貝工消费合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（6 ) 總稱含有色素、螢光物質雙方之情形，且「螢光標幟核酸等」所稱之情形爲總稱含有色素標幟核酸、螢光標幟核酸雙方之情形。於前述中，噬菌體一般爲具有由DNA (單股、雙股 )所組成基因之DNA噬菌體，但並非排除具有由RNA 所組成基因之RNA噬菌體，且螢光標幟核酸等可爲 DNA、 RNA任一者均可。具有以此類螢光物質等所標幟核酸之DNA噬菌體、RNA噬菌體，可在添加對噬菌體核酸（以下稱爲「噬菌體DNA」）具有親和性之螢光物質等（色素或螢光物質）之培養基中，令感染噬菌體之細菌增殖而取得。螢光物質等若可結合至噬菌體DNA，且由噬菌體注入細菌中並令該細菌染色之物質，則無限定且可使用，若列舉其一例，則可例示以溴化乙錠、碘酸丙錠等作爲色素。可例示以4，6 —二脒基一 2 -苯基吲哚氯化氫（DAP I )作爲螢光物質。於螢光物質中，於長波長側具有吸收帶者亦可利用作爲色素，若使用以此類色素標幟之噬菌體，則即使不使用螢光顯微鏡等之螢光檢測器，亦可以顯微鏡、分光光度計等將其檢測。令螢光物質等標幟至噬菌體核酸之方法，於使用螢光物質、色素任一者之情形中，均可令對於核酸（DNA、 RNA)具有親和性之螢光物質等，利用其親和性而被物理性地埋入核酸之立體構造的空隙中，且亦可令標幟螢光物質等之核苷酸，於噬菌體核酸合成時組入其中，且經由化學性結合而進行標幟。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-9- 經濟部中央樣準局負工消費合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（7 ) 檢測中所使用之噬菌體溶液的噬菌體濃度，若爲具有對於試料液中所含之細菌，可在指定時間以內接觸至少一個噬菌體之濃度則可，且其程度因爲依據欲檢測試料液中所含之細菌數濃度（上述之飮水、環境水等）和檢測時間等而異，故不能一槪決定，但其可容易地經由實驗決定。若敘述其一例，則在檢測飮水中所含之大腸桿菌上，多爲若令試料液（受檢水）每1毫升以1 05個〜1 014左右，較佳爲1 07個〜1 014個，最適爲1 08個〜1 012 個左右即可。噬菌體溶液之噬菌體濃度若變高，則因多數個噬菌體接觸至細菌之可能性增加，檢測一個細菌色素之染色濃度增加，又因一個細菌所呈現之螢光強度可被提高，故可以更高精確度進行檢測，而爲較佳。於噬菌體爲未滿105個/ml，則噬菌體與細菌接觸之確實率降低，其結果於計測上需要長時間，且亦恐導致即使存在細菌亦無法測出之結果。相反地，若令噬菌體爲超過1 0 14個/ m 1地變得過大*則試料液之粘性增加，又因背景之螢光強度變大而導致計測敏感度降低之問題’故以上述範圍爲一般，噬菌體之感染（溶菌感染或溶原化）過程可分成吸附結合至宿主細菌，將噬菌體DNA注入宿主細胞’ 以所注入之噬菌體D N A作爲模板之噬菌體粒子之複製三階段。於本發明中使用具有螢光標幟核酸之噬菌體爲基於下列理由。即，噬菌體對於宿主細胞之專一性吸附爲如上所本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-10- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（8 ) 述，被推測成爲本發明所使用之螢光標幟核酸等爲存在於噬菌體中之情形與注入細菌內之後，在噬菌體中爲以緊密狀態塞滿，相反地在> 注入之細菌細胞內爲展開、擴散改變其形態之原因，例如螢光物質爲如後述參考例1、2所確認般，發現在所檢測之螢光強度上，產生光學可識別的有意義差，且本發明者爲著眼於此點，並完成經由利用此差異，可不需要令非吸附細菌之噬菌體予以物理性分離之 ’操作，而僅對注入噬菌體DNA之細菌予以光學地識別檢測爲其特徵之發明。本發明中所注目之其他特徵，爲著眼於許多情形中吸附於細菌之噬菌體，於宿主細菌細胞內注入噬菌體D N A 之過程乃爲依賴宿主細胞之能量狀態。即，著眼對於失去生物活性之宿主不會引起噬菌體DNA (核酸）之注入，而僅在活細胞（活菌）中發生之方面。亦即，因爲在活菌中發生噬菌體DNA之注入故可光學檢測，且其可用於明顯識別即使吸附而未注入噬菌體D NA之死菌和斷片所檢測到的光學資料。利用噬菌體之活性和注入有無之光學性可識別現象，而區別活菌和死菌之本發明之作用，係爲使用放射性同位元素和酵素等之先前方法所無法預期的，其在處理操作之簡便化和檢測精確度之提高方面乃極爲有利〇又，因爲即使具有非專一性吸附之噬菌體，亦不會發生對細菌注入噬菌體DNA，故僅檢測出經噬菌體DNA 所注入細菌之本發明方法，於可高精確度檢測方面乃爲優本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 一 -11 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，訂- ♦ 565616 A7 B7 五、發明説明（9 ) 異。再者，於通常之條件下，以螢光物質標幟之噬菌體 D N A爲經由被標幟螢光物質等而令其基因之轉錄受到阻礙，且喪失作爲基因之活性。此點亦爲本發明所注目之作用之一。即，本發明所使用之經螢光物質等所標幟之噬菌體DNA，因爲通常於注入細菌細^內亦不會發生破壞新噬菌體粒子之複製和宿主細胞且令新生成之噬菌體粒子釋出至細菌細胞外並生成酵素群，故不會引起感染過程最終階段所看見的宿主細胞之溶菌。因此，經螢光物質等所標幟之噬菌體DNA爲在宿主細胞內安定保存，因而具有處理時間之長短對檢測精確度之影響極小之優點，尙，於依據細菌之種類和環境條件，所用之螢光物質等之種類等，而有產生噬菌體核酸轉錄之可能性之情形中，亦可進行防止其積極地轉錄複製之處理。例如，若於試料液中添加 DNA合成抑制劑和蛋白質合成抑制劑，令噬菌體基因之一部分改變成無意義密碼組，使其喪失轉錄複製能力即可〇經濟部中央樣準局負工消费合作社印袈 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據此些理由，若依據本發明利用以螢光色素標幟核酸之噬菌體，且利用其對特定細菌且僅對活菌專一性地吸附之噬菌體，並將其染色或螢光染色則可檢測。經由具有螢光標幟核酸等之噬菌體吸附-核酸注入，而被色素、螢光染色之細菌可經由光學手段予以檢測。光學手段若爲可檢測色素、螢光則對其形式等並無特別限制，例如於以色素標幟之情形中’可使用通常的顯微鏡和分本纸張尺度速用中國國家標準(CNS ) A4規格（210X297公釐） ' -12 - 565616 A7 B7 五、發明説明（10 ) 光光度計等，於以螢光物質標幟之情形中，可使用螢光顯微鏡、螢光光度計、螢光檢測機等。又，可使用經由對檢測圖像進行圖像解析並檢測染色點和螢光點等之方法，使用螢光光度計檢測螢光強度差異之方法，使用流動槽檢測流動液體中之染色粒子和螢光粒子數之方法等。於使用螢光物質作爲標幟之情形中，最簡單可列舉採用具備敏銳感度之螢光檢測器。例如，將螢光標幟之噬菌體溶液和營養鹽類供給（添加）至試料液中，並經由一定時間後是否察見即使少許之螢光強度之增加，而可簡單地調査特定細菌之存否。又，在含有細菌之試料液中添加營養鹽類和過量的噬菌體溶液，並於一定時間後離心分離和膜過濾，對於細菌和噬菌體分離後之細菌部分測定螢光強度，亦可簡單地調査細菌之存否。經濟部中央樣準局貝工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 藉由使用上述方法或裝置，例如準備對各種細菌專一性之經色素或螢光物質標幟之噬菌體，並令與細菌接觸，則即使對於種類不明之細菌，亦可經由若被大腸桿菌專一之噬菌體染色則可稱其爲大腸桿菌，而若被沙門氏菌專一之噬菌體染色則可稱其爲沙門氏菌，可簡單地鑑定細菌。若依此，與先前之調査醱酵受質分解性之方法（最低需要 2曰）相比較，則爲具有可在短時間確實地進行鑑定試驗之優點。於特別要求鑑定細菌之情況，可列舉食物中毒、醫院之院內感染等之進行成爲細菌感染症原因之細菌鑑定之情況，於食品工廠等進行用水等之污染細菌鑑定之情況等，本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13 - 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（M ) 若具體而言，可列舉例如要求檢測細菌之環境水和環境空氣，於食品和自來水、地下水、醫院（特別於臨床場所）、精密機器製造工廠等中，檢測出被迴避存在之細菌之情況。若例示主要迴避細菌和噬菌體之組合，則可列舉大腸桿菌和T系噬菌體、λ噬菌體等、沙門氏菌和P系噬菌體等、假單胞菌和Ρ系噬菌體等、克雷白氏桿菌和史丹福大學60、 92之各噬菌體、梭狀芽胞桿菌和70、 71、 7 2之各噬菌體、志賀氏菌和0 8 0、史丹福大學3 7、 D 2 0、棒狀桿菌和C系噬菌體、微球菌和Ν系噬菌體、 ML 5 3 - 4 0噬菌體等，於此情況中，爲了檢測微量細菌，乃多必須進行濃縮工程。又，本發明亦有效使用於檢測有用細菌。即，於利用微生物（細菌）製造食品和醫藥品等之領域中，在使用本發明之僅可檢測活菌之方法下，可用於確認具有活性之生菌數。依此例如可使用於啤酒製造工程中之具有活性之酵母量之管理、和酸乳酪製造工程中之具有活性之乳酸菌量之管理，或者可利用於產生胺基酸等微生物之活性確認^ 尙，於檢測有用細菌之情形中，乃多必須進行將細菌濃度濃厚之溶液稀釋至適當倍率之工程。令噬菌體感染細菌之條件爲在好氣性條件下，雖依據菌之種類但於嗜熱性細菌則於0〜1 2 0°C，於一般菌則在噬菌體不失活之5 0°C以下進行。若在此範圍內，則溫度愈高者其感染速度愈快。又，攪拌試料液令細菌和噬菌體接觸效率提高亦爲較佳。本纸張尺度適用中國國家標準（CNSI A4规格（210X297公釐） " -14- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

565616 A7 B7 五、發明説明（12 ) 檢測細菌之試料液，若爲水系試料則可直接供於檢測。於試料液爲含有油分之液狀試料情形中，若油分少則可經非離子性界面活性劑令油分分散後，與水系試料同樣地供於檢測。於油分爲多之情形中，則加水並將細菌萃取至水層，以所得之水層作爲試料液，與水系試料同樣地供於檢測。於試料爲固體之情形中，則加水磨碎後，令固形成分經離心分離和過濾等予以分離後，以所得之上淸液作爲試料液，與水系試料同樣供於檢測。於試料液含有色素、螢光色素之情形中，例如對生理食鹽水進行透析除去色素後進行檢測爲較佳。於必須以微濾器濃縮之情形中，可使用一邊於濃縮後相同之濃縮槽中加入生理食鹽水，一邊以液體交換之方法進行取代之方法。經由光學手段所檢測之資料，例如以螢光強度超越一定値之點視爲細菌予以計數之方法，則可測定細菌之有無、細菌數。此類裝置可經由使用微電腦（MPU)等之畫像處理技術所構成。經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製广锖先閲讀背面之注意事項存填寫本寅〕本案申請專利範圍第2項之檢測方法之發明爲，令空氣或液中所含之細菌以過濾或吸附等之捕捉手段將其捕捉，同時令核酸以色素或螢光物質標幟之噬菌體接觸該捕捉之細菌，並以光學檢測手段檢測經色素標幟核酸或螢光標幟核酸所注入之細菌爲其特徵，申請專利範圍第1 6項之細菌檢測裝置之發明爲，具備令空氣或液體中所含之細菌捕捉至膜上之捕捉手段，令含有核酸以色素或螢光物質標幟之噬菌體的噬菌體溶液接觸該捕捉細菌之噬菌體溶液接 ____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS >A4規格（210X297公釐） -15- 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（13 ) 觸手段，和檢測經色素標幟核酸或螢光標幟核酸所注入細菌之光學檢測手段爲其特徵。上述之捕捉手段可例示活性炭、和中空纖維膜、微濾器、超濾器、逆滲透膜等之濾膜，吸附手段可使用非織造布、纖維狀濾材、離子交換樹脂、砂濾材等之可吸附細菌之物質。若依據本發明，例如於水處理裝置中所設備之過濾用濾紙中通過被處理水而將細菌捕捉於濾紙上，並令此濾紙直接接觸噬菌體溶液，或者將濾紙浸於含有生理食鹽水或營養源之水中，並以不會破壞細菌程度之超音波將細菌剝離，以所得之上淸液作爲試料液並供給噬菌體溶液，則可檢測、鑑定被處理水中之細菌。又，因爲細菌爲在以膜等過濾手段捕捉後而進行光學檢測，故可確實檢測細菌。特別合適使用於迅速性要求較低，但要求以高精確度下簡易檢測之情形。尙，令附著於膜上之細菌於液中剝離後添加噬菌體溶液之方法，因可令細菌與噬菌體邂逅機會於液相中以高比率進行，故比令附著於膜狀態之細菌接觸噬菌體液之情形更佳。本發明之方法除了如上述可利用於檢測試料液（被檢水）中之細菌以外，亦可利用於檢測空氣中之浮游細菌。例如將細菌浮游之氣體（空氣），於水中吹氣（起泡）將細菌捕捉於水中作成樣品液，且亦可將抽吸空氣以濾紙過濾並同上述捕捉在濾紙上，且令濾紙直接接觸噬菌體溶液本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

• 16· 565616 A7 B7 五、發明説明（14 ) ，或者令濾紙浸於生理食鹽水等使細菌剝離，並對所得之上淸液供給噬菌體溶液.即可。若依據此方法，則適合使用於例如於檢査空調和其他空氣淸淨設備內所設置之過濾器，調査成爲醫院、食品工廠等細菌污染問題之環境空間之狀態。本案申請專利範圍第3項之檢測方法之發明爲，於稀薄含有欲檢測細菌之試料溶液中令該細菌濃縮，同時以該細菌作爲宿主且令核酸以螢光物質等標幟之噬菌體供給至前述細菌濃縮之液中，接觸宿主細菌，並使用光學手段檢測經螢光標幟核酸等所注入之細菌爲其特徵，申請專利範圍第1 7項之檢測裝置之發明爲，具備令試料液中之細菌濃縮之手段，令含有核酸以螢光物質等標幟之噬菌體的噬菌體溶液供給至前述濃縮試料液之噬菌體溶液供給手段，和檢測經色素標幟核酸或螢光標幟核酸所注入細菌之光學檢測手段爲其特徵。經濟部中央揉準局負工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於上述中，可例如使用膜進行濃縮，且若爲阻止受檢體細菌通過之膜，則對膜之種類，材質並無特別限定均可使用。尙，於進行含有受檢體樣品液之過濾時，以使用令細菌通過但阻止比其更大之S S通過之膜進行前述過濾較佳。使用此類細菌濃縮法之裝置的具體例可例示例如，將流動之樣品水以一定時間各以一定量自動地採水並置入具膜之槽中，自動地濃縮，且將濃縮之樣品水自動地取出並進行自動計測。若依據本發明，則可將試料溶液中稀薄存在之細菌濃本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X 297公釐） " -17 - 565616 A7 _^_B7_ 五、發明説明（15 ) 縮並有效地進行檢測。上述細菌之濃縮可對液體全體進行細菌濃縮，或者令液中細菌部分普遍存在之部分進行濃縮亦可，且本案申請專利範圍第4項之發明爲在經由膜分離或離心分離濃縮細菌之液中，供給核酸以螢光物質等標幟之噬菌體爲其特徵〇濃縮細菌之其他方法爲如申請專利範圍第5項之發明，可在試料溶液中之狹窄區域供給欲檢測特定細菌之誘發物質，且亦可如申請專利範圍第6項之發明，使用.毛細管供給誘發物質。前述之誘發物質可列舉例如絲胺酸、天冬胺酸等之胺基酸、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、核糖等之糖類、檸檬酸、蘋果酸等之有機酸。又，上述有機物質以外亦可列舉成爲呼吸鏈電子受體之氧、反丁烯二酸、硝酸等〇經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用誘發物質濃縮細菌之具體方法可例示以下之方法。①：於試驗溶液中，使用毛細管供給絲胺酸等誘發物質和具有螢光標幟核酸等之噬菌體共存之液體，並於毛細管尖端附近令細菌濃縮並與噬菌體接觸。②：使用毛細管於試驗溶液中供給誘發物質，並以顯微鏡等確認該毛細管尖端附近之細菌濃縮後，使用另外的毛細管供給前述之噬菌體。③：於試驗溶液中供給前述之噬菌體後，使用毛細管供給誘發物質。本案申請專利範圍第7項之發明爲，將含有濃厚欲檢測細菌之試料液稀釋，以該細菌作爲宿主且將核酸以色素本紙張尺度適用中國國家揉準(CNS ) A4規格（210X297公釐） • 18- 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印裝 565616 A7 B7 _ 五、發明説明（16 ) 或螢光物質標幟之噬菌體供給至前述之細菌稀釋試料液中，接觸宿主細菌，並使用光學檢測手段檢測經色素標幟核酸或螢光標幟核酸所注入之細菌爲其特徵。於試料液之稀釋上，可使用適當的稀釋液注入裝置。若依據此發明，因爲可檢測、測定含有濃厚細菌之溶液中之具有活性之細菌數，故例如於使用有用細菌之食品製造工程等中，可利用於細菌之活性管理等。本案申請專利範圍第8項之發明爲，令核酸以色素或螢光物質標幟之噬菌體於試料液中接觸宿主細菌，並經由流動細胞計測法檢測經色素標幟核酸或螢光標幟核酸所注入之細菌爲其特徵，而申請專利範圍第2 1項之檢測裝置之發明爲，具備令試料液於流動槽中連續通過之通液手段，令含有核酸以色素或螢光物質標幟之噬菌體之噬菌體溶液於前述流動槽之前段中添加至試料液之噬菌體溶液添加手段，和檢測流動槽中經色素標‘幟核酸或螢光標幟核酸所注入之細菌之光學檢測手段爲其特徵。若依據此些發明，則可檢測通過流動槽之流動溶液中的螢光粒子數，即細菌數，且可連續進行經由流線之實時處理的檢測。本案申請專利範圍第9項之檢測方法之發明爲，於上述任一種方法發明中，令噬菌體對宿主細菌感染初期之吸附-核酸注入所必須之營養源，對該宿主細胞供給爲其特徵，而申請專利範圍第2 3項之檢測裝置之發明爲，設置具有將噬菌體對宿主細菌感染初期之吸附一核酸注入所必 ^紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公裴) " -19- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

565616 A7 ___B7___ 五、發明説明（17 ) 須之營養源，供給至試料液之營養源供給手段爲其特徵。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述操作在試料液中之營養鹽類等（主要爲碳源）已充分存在之情形中乃爲不必要的。然而，於營養鹽類爲不足之情形中，因爲細菌無代謝，其結果成爲感染不良而噬菌體DNA無法進行注入細菌，故經由上述發明可解除此問題。本案申請專利範圍第1 1項之發明爲，於上述各發明中，令種類不同之噬菌體核酸分別以色相不同之色素或激發波長或螢光波長不同之螢光物質標幟，並添加至含有此些種類不同的噬菌體爲分別專一性吸附之複數種類細菌之試料液中，且同時檢測複數細菌爲其特徵。若依據此發明之方法，則可對於例如大腸桿菌、沙門氏菌、，其他細菌爲混合存在之液體等，使用對此各菌可專一性吸附且分別以激發波長或螢光波長不同之螢光物質標幟核酸之噬菌體，同時且一槪進行用以檢測此些菌之操作。麵濟部中夬棣準局員工消費合作社印装本案申請專利範圍第1 2項之發明爲，於上述各發明中，令種類不同的噬菌體核酸以相同之色素或相同之螢光物質標幟，並添加至含有此些種類不同的噬菌體爲分別專一性吸附之複數種類細菌之試料液中’且檢測複數細菌之總數爲其特徵。若依據此發明之方法，則可輕易測定例如欲檢測之複數細菌是否存在於對象液等之中。以上各發明之方法，特別於衛生試驗等中，檢測鑑定本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -20- 565616 A7 B7 五、發明説明（18 ) 病原性細菌時爲有效。例如，成爲主要食物中毒原因之病原性腸內細菌之大腸桿菌、大腸桿菌群細菌、赤痢菌、霍亂菌、沙門氏菌、弧菌、肉毒桿菌、魏氏桿菌、葡萄球菌等，可使用以相同或不同的色素、螢光物質標幟核酸，且以此些細菌作爲宿主之噬菌體而輕易地檢測。上述各發明亦可適用於成爲食物中毒以外感染症原因之細菌，例如，結核菌、肺炎雙球菌、綠膿桿菌、 Legionella菌、其他之細菌，又，於採集細菌菌落並於噬菌體溶液中懸浮，以螢光染色之有無，鑑定細菌之確認試驗中亦可有效地使用。經濟部中央樣準局貝工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本案申請專利範圍第1 3項之發明爲，於上述各方法發明中，計測經螢光標幟核酸所注入細菌之螢光強度或螢光光源之大小，並將此計測値與預定之閾値比較，檢測超越閾値光源之細菌爲其特徵。又，申請專利範圍第1 4項之發明爲，使用光學檢測手段計測螢光強度或螢光光源之大小，除去預定螢光強度閾値或光源大小閾値以下之光源進行畫像處理後，由處理後之畫像檢測細菌之有無或細菌數爲其特徵。再者，申請專利範圍第2 1項之發明爲，於上述之各裝置發明中，裝置以光學檢測手段作爲照像手段，並以此照像手段所得之照像畫像除去預定之螢光強度閾値以下或螢光光源大小閾値以下光源之畫像處理手段。若依據這些發明，則在螢光物質注入細菌時之例如光源之大小，因爲比該螢光物質存在於噬菌體中時之光源大小具有有意義差並可區別，故可以面積和長度等所示之大本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " • 21- 565616 A7 ____B7_ 五、發明説明（19 ) 小作爲指標，並以比前者更小且比後者更大之値，以預定閾値作爲基準並計數細菌之有無和數目。又，對於照像之畫像，若除去閾値以下大小之光源進行畫像處理，則可取得僅發出螢光之細菌畫像，可以高精確度檢測，又亦有效於設計檢測之自動化。尙，所謂「除去」閾値以下大小之光源進行畫像處理，意指例如閾値以下之光源則視爲與背景相同。與此閾値比較之光源大小並無限定，且可使用光源之螢光強度同樣地進行。本案申請專利範圍第24、 25項之攜帶型細菌檢測用組件之發明爲，由含有檢測對象菌可營養化碳源之細菌檢測用助劑、核酸以色素或螢光物質標幟之噬菌體試劑，及用以添加測定對象試料所準備之反應容器所組成。上述之細菌檢測用助劑、噬菌體試藥，例如可在各別之容器中充塡準備。經濟部中央樣準局貝工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述之細菌檢測用助劑爲含有至少菌可營養化之碳源，此類碳源可使用例如葡萄糖等之單糖類〜二、三糖之糖類等之碳氫化合物，又亦可添加令噬菌體之吸附性提高之色胺酸等。若依據此發明，則可不需要調製材料之工夫且即使在無該檢測所必要設備之實驗室等中亦可有效率的進行作業。又，於上述組件中亦可組合攜帶型之光學檢測手段。攜帶型之光學檢測手段可列舉小型之顯微鏡、分光光度計、螢光光度計等。此情形，於屋外檢測作業時可在該場所進行檢測，且可有效率的進行作業。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） • 22· 565616 A7 B7 五、發明説明（20 ) 尙，本發明並非限定於以上之方法及裝置之構成，且視需要亦可附加其他構成。例如可添加作爲助劑之令噬菌體對細菌吸附性提高之色胺酸、鎂、鈣等之二價陽離子等實施發明之形態其次說明上述檢測方法及用於實施之檢測裝置。實施形態1 經濟部中央揉率局貝工消费合作社印袈 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖1爲示出用以實施本發明方法裝置之一例槪要流程圖，於此圖中，1爲示出欲檢測細菌之^試料液（以下稱爲「受檢水」）流動之流線，且在其下游中，令受檢水中添加噬菌體溶液之液體混合之線圈狀反應器2，其次爲檢測細菌之螢光檢測裝置3順次連接。又，於前述流線1之反應器2上游側，分別連接用以供給含有胺基酸、糖類、無機鹽類等之培養濃縮液（營養源溶液）4之泵4 1，及用以供給含有核酸以螢光物質（色素或螢光物質）標幟之噬菌體溶液（以下稱爲「噬菌體溶液」）5之泵51。若說明關於本例使用此裝置之檢測細菌之操作，則首先於欲檢測細菌之受檢水所流動之水系統線1中，分別經由泵4 1、5 1連續添加前述之培養濃縮液4、和噬菌體溶液5 ^ 被添加上述各液之受檢水一邊於流線1流動，一邊與二種添加液混合，並進入保持於微生物反應最適環境之本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210><297公釐） -23· 565616 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（21 ) 3 7 t的線圈狀反應器2，且在受檢水中存在特定細菌之情形中，噬菌體和該特定細菌反應，並將色素標幟或螢光標幟之噬菌體核酸（例如噬菌體DNA)注入細菌細胞內〇其次，流出反應器2之細菌爲流入其下游所設置之色素檢測用顯微鏡、分光光度計或螢光檢測用之螢光檢測裝置等之檢測裝置3，並於此處進行經由噬菌體核酸注入而被螢光物質等所染色之特定細菌之檢測。此檢測裝置3之形式可爲如顯微鏡和螢光顯微鏡般檢測靜止試料液中經染色粒子之方式，且亦可檢測流動槽中流動之染色粒子，且於靜止、流動任一情形中均可使用以CCD照像機等照像裝置攝影試料液之畫像並取得光電變換訊號之方式。又，亦可將此檢測裝置3作爲照像裝置檢測所得之光電變換訊號，送至已輸入定量特定細菌存否和量之程式的 MP U (未予圖示）等演算處理裝置，檢測出細菌之有無或其細菌數。尙，若利用如流動細胞計測器般，測定流動槽中螢光粒子數形式之螢光檢測裝置，則可設計令自來水、地下水、飮水、淸涼飮料水等之製造、處理所相關之線路水中之細菌數進行連續檢測之測定裝置。「流動細胞計測器」爲所謂測定通過流動槽之發出螢光粒子數之流動細胞檢測法中所用的裝置。此裝置可區別螢光強度並測定、表示粒子數。本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -24· 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 565616 A7 ____B7 _ 五、發明説明（22 ) 實施形態2 圖2爲示出本發明另外裝置之一例槪要流程圖，本例之特徵爲除了以內裝濾紙7之反應器6，取代前述圖1之線圈狀反應器2以外，爲與實施形態1之相同構成爲其特徵。因此，因爲其他之構成爲與前述實施形態1相同，故對於相同之構成則附以相同符號並且省略說明。若說明關於使用此裝置之檢測細菌之操作，則與實施形態1同樣地，於欲檢測細菌之受檢水所流動之水系备線 1中，分別經由泵4 1、5 1連續添加前述之培養濃縮液 4、和噬菌體溶液5。其後，令被添加此培養濃縮液4、和噬菌體溶液5之受檢水，一邊與二種添加液混合，一邊通過保持於3 7 °C 之反應器6中所設置之濾紙7。此濾紙7係使用捕捉細菌但令噬菌體透過之物質，例如以孔徑0 · 2 //m〜 0.45#m者爲較佳使用。於受檢水中存在檢測對象細菌之情形中，於流線1中或者於被捕捉在濾紙7上，使核酸經色素或螢光物質標幟之噬菌體與細菌接觸反應，並於細菌內注入噬菌體DN A 。將一定量之受檢水過濾後，取出濾紙，以顯微鏡和螢光顯微鏡觀察，或者經由測定螢光強度之其他檢測裝置’即可判定特定細菌存在之有無等。尙，於本例中，噬菌體溶液5之加料量以流量計5 2 計測並令以進料或回料控制加料泵5 1之流量。其乃因爲儘可能令細菌之檢測條件恆定化爲較佳’流量控制可適當本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-25- 565616 A7 B7 五、發明説明（23 ) 選擇採用恆定控制之方法。對應於螢光物質之激發螢光發生能量之經時性變化而令加料量增、減控制之方法。實施形態3 圖3爲示出本發明再另外之裝置之一例槪要流程圖，本例與前述實施形態2相比較，其差異在於不對流線1進行噬菌體溶液之添加，而因爲其他之構成爲與實施形態2 相同，故對於相同之構成則附以相同符號並且省略說明。 4若說明關於使用此裝置之檢測細菌之操作，則於欲檢測細菌之受檢水所流動之水系統線1中添加培養濃縮液4 ，並令一定量之受檢水以保持在3 7 °C之反應器6內之濾紙7過濾。其次，經過指定時間後取出濾紙7，並令濾液7所捕捉之細菌接觸噬菌體溶液（例如將此濾紙浸於噬菌體溶液 )。其後，於指定時間後，於色素標幟之情形爲使用顯微鏡、於螢光物質標幟之情形爲使用螢光顯微鏡觀察該濾紙並計數染色粒子數，或使用照像裝置攝影畫像。經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本例之方式因爲令捕捉在濾紙上之細菌增殖並檢測，故對於因極爲微小量而在確認特定細菌存在有無上必須以大量試料液作爲對象之情形乃爲有效。實施形態4 將上述使用圖3說明之實施形態3之捕捉細菌之濾紙 7，浸於含有細菌營養源之液體中，同時攪拌或離心分離本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） : -26 - 565616 A7 B7_ 五、發明説明（24 ) 該液，令細菌由濾紙7剝離，且於除去濾紙7後之液中添加噬菌體溶液，並以顯微鏡和螢光顯微鏡等檢測裝置進行觀察，或使用測定螢光強度之其他檢測裝置測定螢光強度〇噶若依據本例，因爲在含有濾紙所剝離之細菌之液相中進行細菌與噬菌體之接觸，且倂用攪拌操作等使細菌和噬菌體之接觸機會高，故可比實施形態3更確實的檢測細菌實施形態5 本例爲示出令環境空氣抽吸通氣之氣體流通系，取代上述使用圖3說明之實施形態3之水系流線1，以濾紙7 捕捉空氣中浮游細菌之例。但，於此情形中省略培養濃縮液4及加料泵41。經濟部中央橾準局負工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如上述處理捕捉空氣中浮游細菌之濾紙7爲與實施形態3同樣地，令濾紙直接與噬菌體溶液接觸，或者與實施形態4同樣地，令細菌由濾紙剝離後接觸噬菌體溶液，檢測空氣中浮游之細菌。實施形態6 圖4所示之本例爲示出使用細菌無法透過之濾紙’濃縮試料液情形之例。即，例如採集指定量之欲檢測特定細菌存否之試料液 100，並充塡至密閉之壓力容器101，同時令加壓氣本纸張尺度適用中國國家橾率（CNS ) A4规格（210X297公嫠） -27 - 565616 A7 B7 五、發明説明（25 ) 體（例如加壓空氣或加壓氮氣等）作用於該壓力容器 1 0 1之試料液1 0 0下，透過毛細管1 0 2將試料液 1 0 0以少量移送至次段之壓力槽1 0 3，且於此次段壓力槽1 0 3中通過微濾器1 0 4將水濾過，並經此作成細菌爲被濃縮之濃縮液1 0 5。所得之液體視爲細菌經濃縮之受檢水。對此細菌濃縮液1 0 5添加噬菌體溶液後，例如使用顯微鏡和螢光顯微鏡檢測細菌。尙，於此圖4中， 1 0 6爲表示對壓力容器1 0 1供給加壓氣體之管嘴、 1 0 7爲表示通過微濾器1 0 4所流出液體之排水系。若依據此例，則可對經由膜過濾使細菌呈濃縮狀態之試料液，進行添加噬菌體溶液之操作，可高效率實現本發明重要之細菌與噬菌體之接觸機會。實施形態7 圖5所示之本例爲示出使用誘發物質令細菌於受檢水中濃縮並提高檢測敏感度例。經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本例爲在玻片2 0 2之下面，令添加營養鹽類之受檢水20 1以液滴狀附著（參照圖5 (b))，並將其裝接在玻片架203，例如承載在顯微鏡台205上，透過顯微鏡之透鏡2 0 4檢測細菌時，由玻片2 0 3之側面以毛細管2 0 6之尖端，於受檢水之透鏡焦點位置供給含有例如絲胺酸、天冬胺酸、葡萄糖、半乳糖等作爲誘發物質和噬菌體之溶液。尙，期望令玻片之受檢水附著面被粗面化，使受檢水附著量變多。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） " -28 - 565616 A7 B7 五、發明説明（26 ) 經由以上之操作，於注入含有誘發物質溶液之位置（顯微鏡之透鏡焦點位置）聚焦細菌，與誘發物質共同供給之噬菌體爲吸附至此細菌且以色素或螢光物質所標幟之® 菌體DNA爲注入細菌內，共於毛細管尖端附近觀察到細胞聚集之狀態。尙，本例中所謂於玻片2 0 2下面令受檢水2 0 1以液滴狀附著，係因爲於觀察玻片上滴下受檢水之方法中以蓋玻片覆蓋受檢水，但卻因此令受檢水中立即呈現氧氣不足且因爲細菌較誘發物質具有更強受到周圍空氣誘發之傾向，故期望以開放狀態觀察受檢水。尙，因爲誘發物質使細菌誘發速度爲非常迅速*故受檢水之乾燥無特別問題。本例爲如圖7 ( a )所示以一根毛細管2 0 6將誘發物質和噬菌體共同供給至受檢水，但其如圖7 ( b )所示，使用二根毛細管供給誘發物質，並以顯微鏡確認細菌聚集後供給噬菌體溶液亦可。實施形態8 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖6爲示出使用倒立顯微鏡，於玻片2 0 2上面附著之受檢水2 0 1中，與實施形態7同樣地使用毛細管 2 0 6供給誘發物質和噬菌體溶液之例。2 0 7爲倒立顯微鏡之透鏡。若依據此例，則因爲以玻片2 0 2之上面附著受檢水之方式，故具有可附著較大量受檢水之優點。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公嫠） -29- 565616 A7 B7_ 五、發明説明（27 ) 實施形態9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本例爲示出例如圖1〜圖3之流線1中流動之受檢水 (試料液）爲使用含有濃厚細菌之溶液以數十倍〜數千倍之指定稀釋倍率進行稀釋之受檢水，用以檢測細菌之操作爲與上述實施形態同樣地進行。若依據此例，則例如於使用微生物（細菌）代謝活性取得指定產物之製造設備等中，可管理所利用微生物之活性狀態。實施形態1 0 經濟部中央揉準局貝工消費合作杜印裝本例爲示出例如圖8所示，例如，對進行與圖1同樣處理所得之試料液6 0照射來自螢光激發光源6 1之光源光，且將此激發光照射下，具有來自噬菌體所注入之螢光物質標幟核酸之細菌所呈現之螢光，例如以設置具有螢光顯微鏡機能之照像裝置6 2予以照像，且令此照像資料於畫像處理裝置（一般爲電腦）6 3中進行指定的畫像處理，而以機械地、自動地檢測經螢光物質所染色之細菌之例〇尙，本例之方法並非限定於依上述說明之螢光檢測之檢測方法，且可以標幟物質和檢測方式不同之方法實施，以下列舉其數例。 ①：以c c d照像機等所照像之畫像於X y方向以指定解像度分解並區別背景和螢光點且檢測各挖槽（畫素），同時令各螢光點之光強度，例如以階調性分析法之一般所用本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） ^ 565616 A7 B7 五、發明説明（28 ) 的0〜2 5 5之階段將各挖槽分類，並與預定光強度之閾値比較，超過閾値之光源視爲細菌。此時，超過閾値之光源挖槽爲連續時則判定爲一個細菌。 ② ：以C C D照像機等所照像之畫像於X y方向以指定解像度分解，並將各挖槽（畫素）分別檢測出背景和螢光點，並演算以螢光點被檢測出之挖槽的X方向和y方向之連續長度和面積，且將此演算結果與預定長度和面積之閾値比較，撿測細菌。 ③ ：以C C D照像機等所照像之指定色相的分光畫像於X y方向以指定解像度分解，並將各挖槽（畫素）分別檢測出背景和色素檢測點，並演算以色素檢測點被檢測出之挖槽的X方向和y方向之連續長度和面積，且將此演算結果與預定長度和面積之閾値比較，檢測細菌。 ④ ：於上述①〜③之螢光檢測點或色素檢測點中，以閾値以上之挖槽視爲檢測點，剩餘共同與閾値以下之挖槽視與背景相同並除去（視與背景相同程度）進行畫像處理。經濟部中央樣準局貝工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 尙，圖8之例爲僅圖示作爲構成光學檢測手段之螢光激發光源6 1和照像裝置6 2，但其他之透鏡系列和濾鏡等當然可視需要而設置。又，上述之畫像處理等可使用已知之電腦和畫像處理技術予以進行。實施例參考例1 使用依據下述（1-1)之噬菌體調製例所調製之大本紙張只j交適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -31 - 565616 A7 ____B7_ 五、發明説明（29 ) 腸桿菌專一性，噬菌體T 4之核酸以螢光標幟之噬菌體，且爲了確認與噬菌體核酸爲充塡在噬菌體粒子內狀態之情形相反，於由粒子釋出並擴散狀態之情形中其螢光強度增加，乃進行以下之試驗。即，分別測定濃度3 X 1 0 8/毫升之噬菌體溶液（具有螢光標幟核酸之噬菌體溶液）樣品I、和與其同濃度之噬菌體溶液且以界面活性劑和鹸處理破壞之樣品Π溶液之螢光強度。其結果，樣品I溶液之螢光強度爲24 . 4，而樣品 Π溶液之螢光強度爲5 2 . 3，可知經螢光標幟之噬菌體核酸經由擴散而使螢光強度增加2倍以上。參考例2 令大腸桿菌以1 0 8/毫升分別懸浮於生理食鹽水和營養培養基，另外將假單胞菌亦以相同濃度懸浮於營養培養基。經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其次，於各樣品中，將參考例1所用之具有螢光標幟核酸之大腸桿菌專一性噬菌體T4，以3 X 1 09/毫升添加，並於1 3 7°C放置1 0分鐘後，測定各螢光強度。結果，於生理食鹽水中懸浮之大腸桿菌樣品之螢光強度爲2 5 . 2，於營養培養基中懸浮之大腸桿菌樣品之螢光強度爲1 19 · 2，於營養培養基中懸浮之假單胞菌樣品之螢光強度爲2 8 · 7。由此可知，於生理食鹽水中懸浮之大腸桿菌樣品由於 ^紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' • 32 - 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 大腸桿菌之營養不足（代謝能量不足），故即使發生噬菌體吸附至大腸桿菌亦無法引起噬菌體核酸注入大腸桿菌中，其螢光強度爲與參考例1均同樣之値並無增加螢光強度 Ο 另外，於營養培養基中懸浮之大腸桿菌樣品，發生菌體及吸附一噬菌體核酸注入大腸桿菌（釋出-擴散），故螢光強度顯著增加。又，於營養培養基中懸浮之假單胞菌樣品，不發生大腸桿菌專一性噬菌體T 4對假單胞菌之吸附，又因亦未發生噬菌體核酸之釋出，故可知並無有意義差之螢光強度增由以上之結果可知，經由在指定營養源存在之具代謝活性細菌中，接觸具有螢光標幟核酸之細菌專一性噬菌體後，測定營光強度，則可簡便且確實地進行此噬菌體專一性細菌存否之判定。又，例如經由使用預先確認螢光強度和細菌數關係之檢量線，亦可進行特定細菌之定量。 (1 )實施例1 使用噬菌體T4檢測大腸桿菌 (1 - 1 )調製具有螢光標幟核酸之噬菌體將大腸桿菌B株於L -肉汁培養基（1公升中含有細菌胰蛋白腺1 0克、酵母萃取物5克、氯化鈉5克）中， 3 7 °C下好氣培養，且在對數增殖期中期添加取自I F0 (Institution for fermentation，Osaka)之嚇菌體 T 4 ’ 令本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公羡) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

•33· 565616 A7 B7 五、發明説明（31 ) 噬菌體增殖。噬菌體增殖培養中所使用之培養基若爲營養豐富之培養基則無特別限定。爲了調製螢光標幟DNA之噬菌體粒子，於培養基中加入噬菌體同時地，將4，6 -二脒基一 2 —苯基吲哚氯化氫（DAP I )以培養基每1公升添加1毫克，作爲螢光色素。尙，螢光色素若爲對噬菌體DNA具有親和性之物質則無特別限定。於噬菌體爲在大腸桿菌細胞內增殖，將細胞溶解並釋出培養基中爲止，在3 7°C下繼續好氣性培養。其後，將含有噬菌體之培養液低速離心（3000 rpm 1 0分鐘）除去細胞殘渣，並加入溶解1M氯化鈉，且再加入溶解1 0%之聚乙二醇，於4 °C下放置一晚。放置後所產生之凝集物以離心（15000rpm 20分鐘）回收，並將沈澱物懸浮於少量含有5mM硫酸鎂之2 0 OmM T r i 1緩衝液中。於懸浮液加入等量之氯仿，於3 0秒鐘劇烈攪拌後，離心分離氯仿層和水層。採集含有噬菌體之水層，並以30000rpm、 30分鐘之離經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 心回收噬菌體。令所得之沈澱物懸浮於少量之5 mM硫酸鎂一20mM Tris—HC1緩衝液中。將此懸浮液置於密度爲57%、 46%、 33%之氯化铯不連續密度梯度上，以水平旋轉器3 0 0 0 0 r pm 、4 °C下離心3小時。採集所形成之噬菌體帶，透析除去氯化铯，作成螢光標幟噬菌體之精製樣品。所得之噬菌體精製樣品之濃度爲1 0 12個/毫升。 ^紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4规福T210X297公釐1 " •34- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 565616 A7 B7 五、發明説明（32 ) (1一2)大腸桿菌之檢測將前述螢光標幟噬菌體精製樣品對於含有培養大腸桿菌溶液（大腸桿菌濃度爲108個/毫升）1毫升添加2微升並於螢光顯微鏡下觀察時，可確認大腸桿菌細胞被營光染色。尙，對於噬菌體之含有大腸桿菌溶液以落射螢光顯微鏡BH2 — RFL ( OLINPAS公司製）照像螢光畫像之顯微鏡照片示於圖9 (a)，且演算此畫像中螢光點X-y方向之連續性長度，並除去預定閾値以下之螢光點進行畫像處理之結果示於圖9 (b)。另外，於其他細菌株中即使添加前述螢光標幟噬菌體精製樣品，其細菌細胞亦未被螢光染色。由此可確認噬菌體之宿主辨識嚴謹。又，將大腸桿菌進行氯殺菌，並添加前述螢光標幟噬菌體精製樣品時，未觀察到螢光染色。由此結果可確認已死亡之大腸桿菌（大腸桿菌死菌）並不被螢光染色，噬菌體D N A僅注入活菌中。依據以上之結果，若依據本發明，可確認若使用具有螢光標幟核酸之大腸桿菌噬菌體，則可專一性地檢測僅具有生物活性之大腸桿菌細胞。 (2 )實施例2 以流動細胞計測器測定大腸桿菌數

實施例1之（1 一 1 )所得之螢光標幟T4噬菌體’ 以 pH7.5、2〇mM Tris - HCl、5mM 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4. -35- 565616 A7 B7 五、發明説明（33 )

Mg S〇4溶液稀釋成1 01°個/毫升濃度，使用流動細胞計測法以流動細胞計測器（Bio-Rad製：BRYTE HS )測定時，幾乎未檢測到螢光粒子。相對地，使用上述流動細胞計測器，於含有同數噬菌體之噬菌體溶液中除了加入該噬菌體之宿主大腸桿菌以外，以完全相同之條件下進行測定試驗時，在螢光強度強之區域中檢測出許多螢光粒子。由此些未添加噬菌體粒子以外之螢光物質之二個測定試驗結果可知，新加入大腸桿菌時所出現的螢光強度強之粒子爲來自經噬菌體所注入之噬菌體D N A所螢光染色之大腸桿菌。經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 尙，於前述裝置中未添加大腸桿菌之噬菌體溶液中未檢測出螢光者，雖然無法明確其必然爲由於具有該噬菌體 DNA之噬菌體粒子極爲微細，或者由於來自噬菌體中存在之噬菌體DNA形態，但認爲其係因在該裝置之檢測界限能力以下。因此，藉由所使用之光學檢測裝置可檢測噬菌體中及細菌中任一者之螢光標幟噬菌體D N A且可使用依據其螢光強度之差異判斷兩者狀態不同方式之光學手段和資料處理手段。又，爲了經由以上之噬菌體DNA確認大腸桿菌之螢光檢測，則不使用噬菌體而直接以螢光色素使大腸桿菌呈螢光並測定。尙，大腸桿菌之直接的螢光染色爲將 DAP I以1 μ g/m 1加至培養大腸桿菌’使大腸桿菌之D N A染色。本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） • 36 - 565616 A7 B7 五、發明説明（34 ) 其結果，幾乎同數檢測出與噬菌體螢光時所出現者顯示相同螢光強度之粒子。依據上述，若依據本發明方法，則可與將大腸桿菌直接以螢光色素標幟之先前法檢測出同程度之螢光，而且若依據本發明之以噬菌體將細菌螢光染色，則與直接以螢光色素染色細菌之方法不同，可達到嚴密地僅選擇性地對特定之細菌進行專一性染色之優點，使細菌之定量性大幅地改善。 (3 )實施例3 以噬菌體T4選擇性檢測大腸桿菌於本例中，由環境單離出腸內細菌並試驗是否可經由噬菌體T 4進行鑑定。以大阪府之地下水作爲受檢水，並塗布於脫氧膽酸鹽洋菜培養基（榮硏化學股份有限公司）。因爲以此洋菜培養基，含有大腸桿菌及大腸桿菌群之細菌爲形成紅色菌落，故可與其他之一般細菌區別。經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於地下水直接塗布之此洋菜培養基上所產生之菌落中，選出5 0個被認爲含有大腸桿菌及大腸桿菌群之紅色菌落，並以DAP I標幟之噬菌體T4，調査螢光性和/3 -葡萄糖苷酸酶之活性。-葡萄糖苷酸酶爲對大腸桿菌專一之酵素，藉由此酵素之有無可區別出大腸桿菌群和大腸桿菌（自來水試驗法；特定酵素氣質培養基法）。又同時地，進行以BIOTEST 1號（榮硏化學股份有限公司）所編號之菌種鑑定。結果示於下表1。表1爲被認爲本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐） • 37_ 565616 A7 B7 五、發明説明（35 含有大腸桿菌及大腸桿菌群之細菌進行菌鑑定之結果 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央橾準局負工消费合作社印裝本紙张尺度逍用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38· 565616 五、發明説明（36 ) A7B7 表1:由地下水所單離之菌試驗（形成紅色菌落之菌) 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製

No. BIOTEST Code 菌種 yS-葡萄糖苷酸酶螢光標幟噬菌體 1 0611517 — + 2 9241407 大腸桿菌一土 3 0651517 一 + 4 0211517 大腸桿菌一 + 5 0201537 大腸桿菌* 一 + 6 0241407 大腸桿菌 — 土 7 0211517 大腸桿菌一 + 8 0201507 大腸桿菌 — + 9 0201507 大腸桿菌* :;志賀氏菌種一 + 10 0251527 — + 11 0251407 — + 12 0201537 大腸桿菌* - + 13 0611517 大腸桿菌* 一 + 14 0001517 沙門氏菌一 + 15 1241407 大腸桿菌 - + 16 0211517 大腸桿菌 — + 17 0241407 大腸桿菌 — + 18 0211517 大腸桿菌 - + 19 0201517 大腸桿菌*:志賀氏菌種 - + 20 0201517 大腸桿菌*;志賀氏菌種 - + 21 6135535 檸樣酸菌一一 22， 4117377 一一 23 0101507 腸桿菌* * :沙門氏菌 - + 24 0241417 大腸桿菌 — + 25 0241407 大腸桿菌一 + 26 0201517 大腸桿菌*;志賀氏菌種 - + 27 0201517 大腸桿菌*:志賀氏菌種一土 28 0201407 大腸桿菌一 + 29 0251517 一 + 30 0201517 大腸桿菌*:志賀氏菌種 - + 31 0347777 克雷白桿菌 — + 32 0757777 一一 33 2261535 大腸桿菌*** + + 34 0201517 大腸桿菌*;志賀氏菌種 — 士 35 0201517 大腸桿菌* — 土 36 2271535 大腸桿菌* + 37 0201407 大腸桿菌 - + 38 0201407 大腸桿菌一 - 39 2261537 大腸桿菌* * * + + 40 2271535 大腸桿菌 + 一 41 6105577 檸檬酸菌 - + 42 2261537 大腸桿菌* * * + + 43 2107777 克雷白桿菌一 - 44 2201735 腸桿菌 + 一 45 2261537 大腸桿菌*** + + 46 2271535 大腸桿菌* + + 47 4101577 檸檬酸菌一 + 48 0241417 大腸桿菌 — 士 49 0271535 大腸桿菌 — - 50 0347777 克雷白桿菌 — 士 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39· 565616 A7 B7 五、發明説明（37 ) 尙，表1中「+ J爲表示具有活性反應（陽性）、「 -」爲表示無活性反應（陰性）。又’菌種攔之空攔爲意指生物試驗中未看見該編號之菌，且菌.種名後面所記述之「*」意指於***所示之菌種爲1 0%以上之適合率， **爲1%以上，*爲0 · 2%以上’無記號爲未滿 0 . 2 %之適合率。由前述表1之結果，可知/5 -葡萄糖苷酸酶之活性反應方法與生物試驗之適合率爲1 6%，而依據本發明之方法與生物試驗之適合率則爲9 4%。由此，可確認依據本發明之方法之定量性乃比先前法格外提高。 (4)實施例4 經由誘發物質濃縮細菌經濟部中夬橾準局負工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 準備含有培養大腸桿菌（大腸桿菌濃度1 0 8個/毫升 )之受檢水0 . 1毫升，於實施例2調製之具有螢光標幟核酸之噬菌體T 4之精製樣品，和含有1 mM濃度之絲胺酸作爲誘發物質之誘發物質溶液，並如實施形態7處理令受檢水附著在玻片下面並安裝至螢光顯微鏡，且於此受檢水中，使用毛細管（以燃燒器將玻璃管熱拉延所作成之毛細管）注入T4噬菌體精製樣品及誘發物質溶液並以螢光顯微鏡觀察。其觀察結果示於圖7。圖7 ( a )爲示出將T4噬菌體精製樣品及誘發物質溶液混合並以一根毛細管注入受檢水情形之結果，同（b )爲示出T4噬菌體精製樣品和誘本紙張又度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -40- 565616 A7 _B7_ 五、發明説明（38 ) 發物質溶液以分別之毛細管注入情形之結果。如由此些結果所得知，細菌爲聚集在毛細管尖端附近，並確認可以較佳敏感度檢測。 (5)實施例5 使用二種以波長不同之二種螢光色素標幟之噬菌體同時檢測二種細菌 (5-1)調製具有螢光標幟核酸之噬菌體與上述實施例1(1一1)之噬菌體調製操作相比較，除了將螢光色素由DAP I變更爲吖啶橙以外，依據同樣之操作調製以吖啶橙標幟之大腸桿菌專一性噬菌體T 4 ，又，同樣與實施例1(1一1)之噬菌體調製操作相比較，除了將噬菌體變更爲取自I F 0之沙門氏菌專一性噬菌體P22 (N〇20023)以外，依據同樣之操作調製以DAP I標幟之沙門氏菌專一性噬菌體P 2 2。經濟部中央樣率局貝工消费合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述之以吖啶橙標幟之大腸桿菌專一性噬菌體T 4，若於螢光顯微鏡下以激發波長4 9 2 nm觀察則可觀察到黃綠色之螢光粒子，而以DAP I標幟之沙門氏菌專一性噬菌體P 2 2若以激發波長3 4 5 nm觀察則可觀察到藍色的螢光粒子。又，即使將此些噬菌體混合並觀察，則亦因各別之螢光色素的激發波長及螢光波長不同，故不會相互干擾觀察。 (5 - 2 )大腸桿菌和沙門氏菌之檢測將以營養培養液分別培養之菌體濃度109個/毫升之本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） '~ •41- 經濟部中央標率局負工消费合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（39 ) 大腸桿菌和沙門氏菌等量混合者作爲試驗液，且於其中分別加入1 01()個/毫升之以吖啶橙標幟之大腸桿菌專一性噬菌體T 4及以DAP I標幟之沙門氏菌專一性噬菌體 P22，並於37 °C下靜置10分鐘後，於螢光顯微鏡下觀察，並於激發波長4 9 7 nm下確認經由吖啶橙標幟之噬菌體T 4所染色之大腸桿菌，於激發波長3 4 5 nm下確認經由DAP I標幟之噬菌體P 2 2所染色之沙門氏菌，並分別計數1 0個視野菌之數目。於激發波長4 9 2 nm下所察見之大腸桿菌數爲20、· 15、27、22、 28、 42、 30、 18、 22、 22,其平均爲 24 · 6。於激發波長345nm下所察見之沙門氏菌數爲 19、33、27、35、38、14、48、25、 18、22，其平均爲27 · 9，所觀察到的菌體數，與最初以菌體比1:1混合之試驗液之比極爲一致。由以上之結果，於使用波長（激發波長或螢光波長）不同之二種（或其以上）螢光色素所染色之二種（或其以上）之噬菌體，確認可同時檢測二種（或其以上）之特定菌。 (6 )實施例6 以相同螢光色素染色之二種噬菌體測定二種細菌之總數 (6 - 1 )調製具有螢光標幟核酸之噬菌體以實施例1 (1 一 1)所調製之以DAP I標幟之大腸桿菌專一性噬菌體T4,和實施例5 (5 - 1)所調製本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Awi. -42· 565616 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) 之DAP I標幟之前述沙門氏菌專一性噬菌體P 2 2作爲具有螢光標幟核酸之噬菌體。 (6 — 2 )大腸桿菌和沙門氏菌之檢測將以營養培養液所分別培養之菌體濃度1 0 8個/毫升之大腸桿菌和沙門氏菌等量混合者作爲試驗液，且於其中分別加入1 0 1()個/毫升之上述螢光標幟之噬菌體T 4及噬菌體P22，並於37 °C下靜置10分鐘後，以流動細胞計測器測定菌體數。此螢光粒子之測定値爲8 X 1 0 7/ 毫升。相對地，將大腸桿菌培養液及不含沙門氏菌之培養液等量混合之液體，同樣處理並以流動細胞計測器測定菌體數時，其螢光粒子數之測定値爲3 X 1 07/毫升，又將沙門氏菌培養液及不含大腸桿菌之培養液等量混合之液體，同樣處理並以流動細胞計測器測定菌體數時，其螢光粒子數之測定値爲3 X 1 07/毫升，極爲一致於對分別含有上述兩菌之試驗液所進行菌體數測定値之約一半。經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由此些結果可知，藉由令二種以上之噬菌體之相同色素標幟，可求出二種以上特定細菌之總數。 (7)實施例7 添加之噬菌體濃度對檢測結果之影響藉由變化所添加之噬菌體濃度，進行確認對於所檢測之細菌個數和至可檢測爲止之時間是否產生影響之試驗。本纸張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4规格（210XW7公釐） • 43· 經濟部中央標準局貝工消费合作社印袈 565616 A7 B7__ 五、發明説明（41 ) (7 — 1 )將大腸桿菌於L 一肉汁中調製成1 〇6個/毫升，並於此含有培養大腸桿菌之溶液中’分別以噬菌體濃度 104個/毫升、108個/毫升、1〇9個/毫升、 1 Ο1。個/毫升添加實施例1 ( 1 一 1 )所得之螢光標幟 Τ 4噬菌體。 (7 — 2 )於3 7 t下培養，並於每一定時間採集一定量 (6 0微升）之樣品，並以流動細胞計測器進行大腸桿菌之計測。噬菌體濃度101()個/毫升，1〇9個/毫升之樣品於培養1 5分鐘後，計測顯著的螢光粒子，其計測値均爲 1 0 6個/毫升，與最初調製之培養大腸桿菌濃度極爲一致。於此些樣品中即使延長培養時間，亦不會令以上測定値變化。噬菌體濃度1 08個/毫升之樣品於培養1 5分鐘後之時點下，其顯著的螢光粒子測定値爲1 05個/毫升，僅爲實際値之1 0%左右之個數。然而，於此樣品中，若於培養3 0分鐘之時點計測則亦可計測到約1 〇 6個/毫升之粒子數。噬菌體濃度1 04個/毫升之樣品即使於培養1 5分鐘之時點或3 0分鐘之時點均可確認無顯著的螢光粒子。即使再與延長培養時間，亦可確認無顯著的螢光粒子。由以上之結果，顯示若於樣品中添加之噬菌體濃度爲稀薄，則在檢測上需要時間，又增加無法檢測之細菌個數本^張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公藿1 --------------------#1-----1T------#1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -44- 565616 A7 _B7 五、發明説明（42 ) 產業上之可利用性本發明爲經由利用噬菌體爲專一性地辨識宿主細菌，且僅在保持生物活性之宿主細胞（活菌）中注入DNA之性質，而使具有核酸以色素或螢光物質標幟之噬菌體 DNA之噬菌體，僅接觸特定細菌並可將細菌染色，而且此經染色之細菌以分光分析或螢光檢測，即可將具有噬菌體DNA之噬菌體和細菌予以光學有意義地識別，故可達成不需要令經染色之細菌與噬菌體進行物理性分離操作之優點，且對於特定之細菌且僅爲活菌，可在迅速且簡單之操作下檢測、鑑定，例如可達成檢測環.境水、環蟑空氣、食品和自來水、地下水、醫院、精密機械工廠、食品製造加工工廠之用水和空氣中所迴避存在之微量細菌之效果。又，若依據本案申請專利範圍第2、 16項之發明，經濟部中央橾率局貝工消費合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 則因爲注入膜上所捕捉細菌之噬菌體D NA爲經由螢光物質之結合（標幟）而抑制基因之轉錄，且不生成令新噬菌體粒子之複製和將細菌溶菌之酵素群，則可將細菌安定地保持於螢光染色狀態，故可不受處理時間影響並達成可以高精確檢測之效果。若依據本案申請專利範圍第3〜6、 17〜19項之發明，則因爲將細菌濃縮檢測，故可實現高精確度之確實的檢測。若依據本案申請專利範圍第7、 20項之發明，則可本*^尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公着) ' -45 - 565616 A7 B7____ 五、發明説明（43 ) 達成可利用於食品製造工廠和藥品製造工廠中所用之有用細菌的活性管理。若依據本案申請專利範圍第8、 21項之發明，則可達成在實時處理中連續檢測、鑑定流動池中所流動之受檢水中細菌之有無或細菌數。若依據本案申請專利範圍第9、 23項之發明，添加視需要之營養鹽類，將細菌保持於進行代謝狀態，則可使螢光標幟之噬菌體D NA確實地注入該細菌。若依據本案申請專利範圍第1 0項之發明，則使噬菌體接觸細菌之可能性增加，且經由所檢測之一種細菌之色素而增加染色濃度，又可增加一種細菌所呈現之螢光強度。因此，可達成以更高精確度檢測之效果。經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項存填寫本貢) 若依據本案申請專利範圍第1 1項之發明，於含有種類不同之噬菌體爲分別專一性地吸附之複數種類細菌之試料中，添加核酸以不同激發波長或螢光波長之螢光物質標幟之對各細菌專一之噬菌體，則因爲可在各激發波長或各螢光波長檢測各細菌，故可同時進行檢測不同種類之複數細菌之操作。若依據本案申請專利範圍第1 2項之發明，則因爲將對於不同種類之複數細菌分別專一性吸附之噬菌體，以相同之螢光物質標幟，故例如可輕易地調査欲檢査細菌是否存在於檢査對象之液中。若依據本發明申請專利範圍第13、 14、 22項之發明，基於所照像之畫像，以預定之閾値作爲基準則可明本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •46- 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 565616 A7 B7 五、發明説明（45 ) 狀態之顯微鏡照片，（b)爲該顯微鏡照片經畫像處理後之圖。符號之說明 1 ......流線， 2，6 ......反應器， 3……檢測裝置 4……培養濃縮液， 5……噬菌體溶液， 7……濾紙，· 4 1、5 1 ......栗， 5 2……流量計， 6 0……試料液， 6 1……螢光激發光源， 6 2……照像裝置， 6 3……畫像處理裝置， 2 0 0……受檢水， 2 0 2……玻片， 203……玻片架， 2 0 4……螢光顯微鏡之鏡片， 2 0 5……螢光顯微鏡之台， 206……毛細管， 2 0 7……倒立顯微鏡之鏡片。本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —------—·---IT------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -48·

Claims

6 Α8 Β8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i充公告本 •、申請專利範圍附件2··第86 1 1 3749號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國92年 1 · 一種檢測細菌之方法，其特徵爲附於檢測對象細菌之核酸受色素或螢光物 ’以1 05至1 014個/毫升之量添加於之試料液中，並使其接觸欲檢測細菌，再或波長之光學檢測方法檢測經注入色素標幟核酸之細菌。 2 · —種檢測細菌之方法，其特徵爲附之收集方法收集存.在於空氣或液體中之製作含該欲檢測細菌之試料液，隨後將以檢測對象細菌之核酸受色素或螢光物質標 1 0 5至1 0 1 4個/毫升之量添加於含有料液中，並使其接觸欲檢測細菌，再使用長之光學檢測方法檢測經注入色素標幟核酸之細菌。 3 _ —種檢測細菌之方法，其特徵爲測姻菌之欲檢測水中之細菌使用膜濃縮法離心濃縮法、蒸發濃縮法、冷凍乾燥濃縮或分離吸附濃縮法予以濃縮以作爲試料液方式吸附於檢測對象細菌之核酸受色素或噬菌體，以1 05至1 〇14個/毫升之量測細菌之試料液中，並使其接觸欲檢測細本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公釐） 10月16日修正將以特殊方式吸質標幟之噬菌體含有欲檢測細菌使用可檢測色相幟核酸或螢光標以過濾及/或吸欲檢測細菌，並特殊方式吸附於幟之噬菌體，以欲檢測細菌之試可檢測色相或波酸或螢光標幟核在含有稀薄欲檢、中空濃縮法、法、昇華濃縮法，隨後將以特殊螢光物質標幟之添加於含有欲檢菌，再使用可檢 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 565616 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍測色相或波長之光學檢測方法檢測經注入色素標幟核酸或螢光標幟核酸之細菌。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 ·如申請專利範圍第3項之檢測細菌之方法，其中 ’細菌之濃縮方式係以膜分離或離心分離進行。 5 .如申請專利範圍第3項之檢測細菌之方法，其中 ’細园之濃縮係將欲檢測特定細菌之特定誘發物質供應於試料液中之限定狹窄區域中的方法。 6 ·如申請專利範圍第5項之檢測細菌之方法，其中，係以毛細管供給誘發物質。· 7 · —種檢測細菌之方法，其特徵爲將含有濃厚欲檢測細菌之欲檢測水稀釋以作爲試料液，隨後將以特殊方式吸附於檢測對象細菌之核酸受色素或螢光物質標幟之噬菌體添加於菌試料液，並使其接觸欲檢測細菌，再使用可檢測色相或波長之光學檢測方法檢測經注入色素標幟核.酸或螢光標幟核酸之細菌。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8 . —種檢測細菌之方法，其特徵爲將以特殊方式吸附於檢測對象細菌之核酸受色素或螢光物質標幟之噬菌體 ’添加入含有欲檢測細菌之試料液，並使其接觸欲檢測細菌，再使用流動細胞計測器檢測經注入色素標幟核酸或螢光標幟核酸之細菌。 9 · 一種檢測細菌之方法’其特徵爲將以特殊方式吸附於檢測對象細菌之核酸受色素或螢光物質標幟之噬菌體 ’添加入含有欲檢測細菌之試料液，並供給對噬菌體之檢測對象細菌於感染初期之吸附-注入核酸時必要營養源之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2- 565616 A8 B8 C8 __ D8 六、申請專利範圍試料液，使其接觸欲檢測細菌，再使用可檢測色相或波長之光學檢測方法檢測經注入色素標幟核酸或螢光標幟核酸之細菌。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 1 0 ·如申請專利範圍第1至8項中任一項之檢測細菌之方法，其中，檢測對象細菌若爲多數種類時，噬菌體可使用各自以特殊方式吸附於檢測對象細菌，且經具有不同色相之色素或激發波長或螢光波長不同之螢光物質標幟之多數種不同種類之噬菌體，再檢測此些不同種類且注入有噬菌體之色素標幟核酸或螢光標幟核酸之複數細菌之總數。 1 1 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之檢測細菌之方法，其中，檢測對象細菌若爲多數種類時，噬菌體可使用各自以特殊方式吸附於檢測對象細菌，且經具有相同色相之色素或激發波長或螢光波長相同之螢光物質標幟之多數種不同種類之噬菌體，再檢測此些不同種類且注入有噬菌體之色素標幟核酸或螢光標幟核酸之複數細菌之總數。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 2 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之檢測細菌之方法，其中，注入有螢光標幟核酸之細菌的螢光強度或螢光光源之大小係以可檢測色相或波長之光學檢測方法檢測，再將檢測値與所定之臨界値比較時，並以超過臨界値之光源作爲細菌之數目。 1 3 .如申請專利範圍第1至8項中任一項之檢測細菌之方法，其中，注入有螢光標幟核酸之細菌的螢光強度本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -3- 565616 A8 BS C8 D8 、申請專利範圍或螢光光源之大小係以可檢測色相或波長檢測，其結果係以畫面顯示，螢光強度或，係以預定之螢光強度臨界値或光源大小光源爲基礎，以去除畫像之畫像處理後所測細菌之有無或作爲檢測細菌之數目方法。 1 4 · 一種如申請專利範圍第1至8 所使用之攜帶型檢測細菌用套件，其特徵象菌可營養化碳源之檢測細菌用助劑、核物質標幟之噬菌體試劑，及爲了添加測定之反應容器所組成者。 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之攜套件，其中，檢測細菌用助劑爲含有促進附之吸附助劑。之光學檢測方法螢光光源之大小之臨界値以下之得之晝像作爲檢項中任一項方法爲由含有檢測對酸以色素或螢光對象試料所準備帶型檢測細菌用 _菌體對細菌吸 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4